人体红细胞叶酸含量测定方法
专利汇可以提供人体红细胞叶酸含量测定方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种人体红细胞叶酸含量测定方法，本发明包括如下步骤：(1)采集 全血 标本；(2)全血标本预处理：使红细胞完全破坏，使红细胞叶酸成分被完全释放出来；(3)用 化学发光 法测定全血的叶酸含量，(4)通过全血中叶酸的含量和已知的 红细胞压积 换算出红细胞中叶酸含量。本发明通过化学发光法测定全血的叶酸含量，再通全血叶酸含量计算红细胞叶酸含量，本方法方法操作简单、灵敏度高、检测结果稳定，成本较低，没有环境污染( 放射性 污染)。完全可以取代传统的放射免疫检测方法。填补化学发光法测定红细胞叶酸含量的空白。，下面是人体红细胞叶酸含量测定方法专利的具体信息内容。
1、一种人体红细胞叶酸含量测定方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)采集全血标本；(2)全血标本预处理：使红细胞完全破坏， 使红细胞叶酸成分被完全释放出来；(3)用化学发光法测定全血 的叶酸含量，(4)通过全血中叶酸的含量和已知的红细胞压积换 算出红细胞中叶酸含量。
2、根据权利要求1所述人体红细胞叶酸含量测定方法，其特征在 于：所述步骤(2)全血标本预处理为：取容积比为20的1～1.5％ 的抗坏血酸溶液和全血标本混匀，室温放置1小时后备用。
3、根据权利要求1或2所述的人体红细胞叶酸含量测定方法，其特 征在于：所述步骤(3)包含步骤有：a取微孔板，对微孔用叶 酸的单克隆抗抗体进行包被；b然后在微孔内添加经预处理后的 全血标本、酶标记抗原和叶酸抗体，全血标本的抗原和酶标记抗 原与抗体竞相结合后，形成包被二抗-叶酸抗体-酶标记抗原复合 物，添加化学发光底物使其发射光子，计数其光子数，与同条件 下所测的已知量的标准抗原所得的专用标准曲线比较，计算出被 检全血标本中的叶酸含量。
(一)技术领域
本发明涉及一种人体红细胞叶酸含量测定方法，属于标志免疫学 范畴。
(二)背景技术
长期以来，临床检验中一般是对人血清中叶酸含量的测定，来判 断人体叶酸的缺乏与否。近年来，经研究证明红细胞中叶酸含量是血 清中叶酸的含量的10～20倍，并且血清中叶酸含量由于受饮食、疾 病等外来因素的影响，其浓度水平波动较大。而红细胞中叶酸含量受 外界因素的干扰很少，更能真实地反映组织中叶酸的浓度水平。仅仅 测定血清叶酸含量就不能满足临床医学的要求，尤其发现红细胞叶酸 水平的高低对预防人口出生缺陷有非常重要的价值，测定红细胞叶酸 含量的工作就有一种新的意义。
过去血清叶酸含量测定一般采用放射免疫检测方法γ-计数仪进 行的。该技术(简称RIA)是将放射性同位素标记技术与抗原抗体反 应结合起来的一种微量分析方法。1960年建立的经典RIA是使同位素 标记的抗原和待测未标记抗原与对应的抗体作用，在抗原过量的条件 下，两种抗原与抗体竞争结合，然后通过测定抗原抗体复合物和游离 抗原的放射性来求得待测抗原的含量。该方法测定步骤繁琐、反应时 间长、试剂稳定性差，更重要的是由于标记物是放射性同位素，对环 境污染大，对人的健康有威胁，但在相当一个时期由于涉及方法学的 特点，专业界只能不得已而为之。
(三)发明内容
本发明要解决的技术问题是：提供一种灵敏度高、准确性好、没 有环境污染的人体红细胞叶酸含量测定方法。
为了解决上述技术问题，本发明包括如下步骤：
(1)采集全血标本；(2)全血标本预处理：使红细胞完全破坏， 使红细胞叶酸成分被完全释放出来；(3)用化学发光法测定全血 的叶酸含量，(4)通过全血中叶酸的含量和已知的红细胞压积换 算出红细胞中叶酸含量。
为了使叶酸完全释放，并使叶酸不被破坏，所述步骤(2)全 血标本预处理为：取容积比为20的1～1.5％的抗坏血酸溶液和全血标 本混匀，室温放置1小时后备用。
为了操作简便，所述步骤(3)包含步骤有：a取微孔板，对微孔 用叶酸的单克隆抗抗体进行包被；b燃后在微孔内添加经预处理后的 全血标本、酶标记抗原和叶酸抗体，全血标本的抗原和酶标记抗原与 抗体竞相结合后，形成包被二抗-叶酸抗体-酶标记抗原复合物，添加 化学发光底物使其发射光子，计数其光子数，与同条件下所测的已知 量的标准抗原所得的专用标准曲线比较，计算出被检全血标本中的叶 酸含量。
本发明通过化学发光法测定全血的叶酸含量，再通全血叶酸含量 计算红细胞叶酸含量，本方法方法操作简单、灵敏度高、检测结果稳 定，成本较低，没有环境污染(放射性污染)。完全可以取代传统的 放射免疫检测方法。填补化学发光法测定红细胞叶酸含量的空白。
(四)具体实施方式
本具体实施例的人体红细胞叶酸含量测定方法包括如下步骤：
(1)采集全血标本；1.1病人必须空腹；1.2标本管需用聚乙 烯塑料管。血标本必须无脂血、无溶血；1.3抗凝血标本必须以肝素 (15IU/mol)抗凝；不加抗凝剂的血标本自然凝固必须彻底；1.4全 血样本必须在8小时内进行试验，或者在分装后冷冻(-20℃)保存， 但必须在7周内(以室温融解一次)使用。
(2)全血标本预处理：将全血标本与体积为其20倍的1～1.5％ 抗坏血酸溶液混匀，室温放置1小时后备用；使得红细胞完全破坏， 使红细胞叶酸成分被完全释放出来；得到溶血液。
(3)用化学发光法测定全血的叶酸含量，
试剂准备：
1.包被孔板(以叶酸单克隆抗抗体包被) 96孔板 2.酶标记抗原(以HRP标记) 1瓶 8ml/瓶 3.标准抗原(叶酸纯品配) 6瓶 0.5ml/瓶 浓度为：0、20、60、200、600、1200ng/ml 4.叶酸抗体 1瓶 8ml/瓶 5.发光底物A液(以鲁米诺配) 1瓶 8ml/瓶 6.发光底物B液(以过氧化脲配) 1瓶 8ml/瓶 5.浓缩洗涤液1瓶 1瓶 20ml/瓶 浓缩洗涤液使用时用蒸馏水稀释25倍(水应为新鲜制备的去离子水或蒸馏水)。 6全血预处理液：使用时用蒸馏水配置，应现用现配，并当天使用。
检测仪器：红细胞叶酸检测仪、标本前处理系统。
测定方法：(操作环境避免强光照射)
是利用48或96孔塑料微孔板，对微孔用叶酸的单克隆抗抗体进 行包被，然后在微孔内添加溶血液标本、用HRP标记的已知抗原和叶 酸抗体，经过抗原竞争反应结合后再添加发光底物，在酶的催化下发 光底物生成激发态的中间产物，在回到基态时释放能量并发射光子。
试剂加样测定程序表 单位：μl
抗体包被板 空白孔 标准孔 样品孔1 样品孔2 标准抗原S0-S5 溶血液标本 酶标记已知抗原 叶酸抗体 - - - 50 50 - 50 50 - - 50 50 - 50 50 50 充分振荡混匀30秒，37℃温育60分钟后，用稀释后的洗涤液洗板5次 化学发光底物A、B液各 50 50 50 50 充分振荡混匀30秒，室温(20～25℃)避光反应10分钟。 光子计数 加发光底物A、B液后的第10-60分钟内测量，在红细胞叶酸 检测仪上依序读取各孔的读数。
作出以抗体包被板上标准孔所测得的光子数据，和该标准孔所添 加的标准抗原S0-S5已知的叶酸的含量，作出光子与叶酸含量的关 系曲线，即为同条件下所测的已知量的标准抗原所得的专用标准曲 线。
根据样品孔所测得的光子，通过专用标曲线查询对应的叶酸含 量，即为所测样品的叶酸含量。
全血叶酸含量＝实测溶血液样本叶酸含量ug/ml×稀释倍数
(4)红细胞叶酸含量＝全血叶酸含量/红细胞压积％
(红细胞压积可参考血常规检查结果)
(由于血清叶酸含量很少，一般情况下都忽略不计。) 叶酸正常参考值：(各实验室应建立自己的正常参考值，下列正常值 仅供参考。)
(该正常值范围系美国DPO固相非煮沸法所荐)
血清叶酸 3～17ng/ml(6～39nmol/L)
全血叶酸 43～295ng/ml(97～668nmol/L)
红细胞叶酸 93～641ng/ml(212～1453nmol/L)
正常参考值：本实验室自己建立
本方法技术参数：
1.灵敏度：2ng/ml
2.精密性：用本方法检测低、中、高三组样品(n＝10)。
批内变异系数：CV％＜3％；批间变异系数：CV％＜5％
3.专用标准曲线线性：r＞0.9980
4.有效期：在2～8℃贮存，有效期6个月。
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