脂肪组织冻存液及脂肪组织冻存方法
阅读：1040发布：2020-05-29
专利汇可以提供脂肪组织冻存液及脂肪组织冻存方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及 生物 医药技术领域，具体涉及一种脂肪组织冻存液及脂肪组织冻存方法。所述冻存液含有体积百分数为4％～6％的二甲基亚砜、 质量 百分数为0.5％～10％的羟乙基 淀粉 以及质量百分数为10％～20％的人血 白蛋白 。所述冻存方法包括：1)、对脂肪组织样本清洗后将其移入装有缓冲液的离心管中离心；2)、将脂肪组织移至新的离心管内并剪成碎 块 ，加缓冲液并离心；3)、将脂肪组织移出并与预冷的脂肪组织冻存液混合得到 混合液 ，将所述混合液冷冻后移入液氮中保存。，下面是脂肪组织冻存液及脂肪组织冻存方法专利的具体信息内容。
1.一种脂肪组织冻存方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)、对脂肪组织样本清洗后将其移入装有缓冲液的离心管中离心；
2)、将脂肪组织移至新的离心管内并剪成碎块，加缓冲液并离心；
3)、将脂肪组织移出并与预冷的脂肪组织冻存液混合得到混合液，将所述混合液冷冻后移入液氮中保存；
所述冻存液含有体积百分数为4％～6％的二甲基亚砜、质量百分数为3.5％～7％的羟乙基淀粉以及质量百分数为13％～17％的人血白蛋白；
3 3
在步骤2)中，碎块的大小为0.1mm～2mm；
所述冻存液的溶剂为复方电解质注射液；
所述复方电解质注射液含有氯化钠5.26±0.4g/L、葡萄糖酸钠5.02±0.4g/L、三水醋酸钠3.68±0.3g/L、氯化钾0.37±0.05g/L、六水氯化镁0.30±0.05g/L；
在步骤3)中，脂肪组织与预冷的脂肪组织冻存液混合的体积比为(1～2)：(1～2)。
2.根据权利要求1所述的脂肪组织冻存方法，其特征在于，所述脂肪组织样本为新鲜样本或冷藏保存的样本；
所述冷藏保存的样本保存温度为0℃～4℃，保存时间≤48h。
3.根据权利要求1所述的脂肪组织冻存方法，其特征在于，在步骤1)和步骤2)中，所述离心的条件为2800rpm～3200rpm离心5min～10min。
4.根据权利要求1所述的脂肪组织冻存方法，其特征在于，所述预冷的脂肪组织冻存液的温度为0℃～4℃。
5.根据权利要求1～4任一项所述的脂肪组织冻存方法，其特征在于，在步骤3)中，将所述混合液冷冻后移入液氮中保存的操作具体包括：
将所述混合液装于冻存管内，将所述冻存管在0℃～5℃下平衡10min～30min，然后转入-80℃冻存2h～16h，最后转入液氮保存。
6.根据权利要求5所述的脂肪组织冻存方法，其特征在于，冻存管在0℃～5℃下平衡
10min～30min的操作在装有新鲜异丙醇的程序降温盒中进行。
脂肪组织冻存液及脂肪组织冻存方法
技术领域
背景技术
[0002] 间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是干细胞家族的重要成员，源于发育早期的中胚层和外胚层。间充质干细胞是一种具有自我复制能力和多向分化潜能的成体干细胞，属于非终末分化细胞，它既有间质细胞，又有内皮细胞及上皮细胞的特征。间充质干细胞在体外特定的诱导条件下，可分化为脂肪、软骨、骨、肌肉、肌腱、神经、肝、心肌、胰岛β细胞和内皮等多种组织细胞，连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能。间充质干细胞分布广泛，被证实能够从多种组织中分离得到。由于间充质干细胞具有增殖能力强、免疫原性低、取材方便、无道德伦理问题的限制、易于规模化制备等特征，故被认为是细胞治疗中最有前景的一个方向。在临床上，MSCs目前被用于研究各种疾病，包括：移植物抗宿主病、心肌梗死、克罗恩病、多发性硬化、系统系红斑狼疮、肝硬化等，取得了良好的效果。此外，间充质干细胞还具有支持造血和促进造血干细胞植入的功用。因此，间充质干细胞为一些难治性疾病的治疗提供了全新的方案，在医学史上具有里程碑意义。
[0003] 脂肪干细胞(adipose-derived stem cells，ASCs)又称脂肪来源间充质干细胞，首次由Zuk等在2001年从人类脂肪组织中分离出来，这群细胞具备多向分化潜能和稳定的增殖能力，且外形特征与间充质干细胞相符。因其具备取材容易、获得率高，创伤小和不存在伦理学争议等优势，近些年成为诸多学者的研究热点。脂肪干细胞目前已被证实能够向成骨细胞、软骨细胞、骨骼肌细胞以及神经元分化，多项动物疾病模型疗效试验充分证实其在潜在的临床应用价值。此外，脂肪干细胞在整形美容方面应用广泛，如隆胸、乳房整形、面部年轻化、以及皱纹和瘢痕修复等，是组织工程和再生医学重要的种子细胞来源。采用合适的方法冻存脂肪组织，并在组织复苏后从中获取活性良好的脂肪干细胞，将为其在临床应用上奠定基础。因此本领域迫切需要开发新颖有效的且适合脂肪组织的冻存方法。
[0004] 有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
[0005] 本发明确定了一种新可临床用脂肪组织的长期冻存方法：以供体脂肪为原料，通过脂肪样本预处理、长期组织冻存充质干细胞的方法。此法具有易于操作、可规模化、不受时间限制等优点，做到“一次吸脂、多次使用”、不限组织和细胞、更丰富用途、利于临床多种需求。与现有的直接分离脂肪间充质干细胞并进行细胞冻存更为简便，同时可以节约成本和避免在实验室长期培养带来的微生物污染和细胞分化等风险。
[0006] 为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
[0008] 本发明将具有细胞毒性但目前尚无法替代的渗透性保护剂二甲基亚砜(DMSO)的浓度大幅度的降低，从传统的10％最低降至5％，再佐以其他大分子非渗透性保护剂如羟乙基淀粉、人血白蛋白制成可直接用于保存临床软组织工程用脂肪组织的冻存液。该细胞制剂中的成分DMSO为临床级且浓度较低，通过洗涤后将最大程度的避免对人体的毒副作用，故而能够确保该冷冻保护剂保存的脂肪组织用于人体是绝对安全的。
[0009] 优选的，如上所述的脂肪组织冻存液，所述冻存液含有体积百分数为4％～6％的二甲基亚砜、质量百分数为3.5％～7％的羟乙基淀粉以及质量百分数为13％～17％的人血白蛋白。
[0011] 所述复方电解质注射液含有氯化钠5.26±0.4g/L、葡萄糖酸钠5.02±0.4g/L、三水醋酸钠3.68±0.3g/L、氯化钾0.37±0.05g/L、六水氯化镁0.30±0.05g/L。
[0012] 一种脂肪组织冻存方法，包括如下步骤：
[0013] 1)、对脂肪组织样本清洗后将其移入装有缓冲液的离心管中离心；
[0014] 2)、将脂肪组织移至新的离心管内并剪成碎块，加缓冲液并离心；
[0015] 3)、将脂肪组织移出并与预冷的脂肪组织冻存液混合得到混合液，将所述混合液冷冻后移入液氮中保存。
[0016] 脂肪组织由一系列复杂的细胞群组成，包括成熟的脂肪细胞，前体脂肪细胞，纤维细胞，动脉平滑肌细胞，内皮细胞和脂肪间充质干细胞。脂肪组织不仅能够为生物医学再生领域和细胞治疗提供大量所需的干细胞，同时还能够直接作为自体移植物用于外科整形。早在上世纪80年代末，自体脂肪移植就逐渐得到外科医生的认可并用于临床。
[0017] 脂肪移植虽是一种较为理想的软组织缺损填充手段，但通常移植后脂肪组织体积只能保持在移植时的50％左右，且移植成活率较低。因此，临床上仍需要通过少量、反复、多次移植来达到满意的填充效果。如果能实现一次抽取足够量的脂肪并进行冷冻保存，在需要时复苏，则会减轻对患者多次抽脂造成的痛苦。目前关于脂肪组织低温冻存剂的研究较少，而最佳冷冻保存条件对临床应用也具有重要的研究价值。使用无异源成分的冻存保护剂更符合未来往临床方向延伸的目标。
[0018] 目前脂肪方面的应用技术主要包括细胞提取及冻存，鲜有脂肪组织冻存。本发明联合使用渗透性保护剂和非渗透性保护剂，以保持冻存过的脂肪组织的细胞活力和生物学功能。
[0019] 优选的，所述缓冲液为生理盐水、PBS或TBS。
[0020] 优选的，如上所述的脂肪组织冻存方法，所述脂肪组织样本为新鲜样本或冷藏保存的样本；
[0021] 所述冷藏保存的样本保存温度为0℃～4℃，保存时间≤48h。
[0022] 优选的，如上所述的脂肪组织冻存方法，在步骤1)和步骤2)中，所述离心的条件为2800rpm～3200rpm离心5min～10min。
[0023] 离心后，脂肪组织中的油脂会悬于表层，每次离心后都需要把表层油脂吸去，随后再将脂肪组织转移到新的离心管或容器中进行操作，剩余液体和红细胞随离心管废弃，这是为了避免离心管内壁的油脂和其他细胞对脂肪组织的污染。
[0024] 优选的，如上所述的脂肪组织冻存方法，在步骤2)中，碎块的大小为0.1mm3～2mm3。
[0025] 优选的，如上所述的脂肪组织冻存方法，在步骤3)中，脂肪组织与预冷的脂肪组织冻存液混合的体积比为(1～2)：(1～2)。
[0026] 优选的，如上所述的脂肪组织冻存方法，所述预冷的脂肪组织冻存液的温度为0℃～4℃。
[0027] 优选的，如上所述的脂肪组织冻存方法，在步骤3)中，将所述混合液冷冻后移入液氮中保存的操作具体包括：
[0028] 将所述混合液装于冻存管内，将所述冻存管在0℃～5℃下平衡10min～30min，然后转入-80℃冻存2h～16h，最后转入液氮保存。
[0029] 优选的，冻存管在0℃～5℃下平衡10min～30min的操作在装有新鲜异丙醇的程序降温盒中进行。
[0030] 慢冻是为了防止降温过快导致细胞内外水迅速结晶化，导致细胞结构破坏、蛋白质变性、pH改变等不良后果，进而对细胞造成损害。慢冻还能使细胞缓慢失水，减少胞内结晶的形成从而保护细胞。
[0031] 本发明主要提供了一种临床用脂肪组织长期冻存方法，能够保持脂肪组织的生物活性不发生改变，同时也可在复苏后进行脂肪干细胞的分离扩增，甚至洗涤后直接进行软组织填充等外科手术的临床需求。其中我们将具有细胞毒性但目前尚无法替代的渗透性保护DMSO的浓度大幅度的降低，从传统的10％最低降至5％，再佐以其他大分子非渗透性保护剂如羟乙基淀粉、人血白蛋白和复方电解质注射液制成可直接用于临床软组织工程的脂肪组织。该细胞制剂中的成分DMSO为临床级且浓度较低，通过洗涤后将最大程度的避免对人体的毒副作用；除此之外的其他成分均采用商品化的注射液配制而成，故而能够确保该冷冻保护剂保存的脂肪组织用于人体是绝对安全的。附图说明
[0032] 为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0033] 图1为本发明实施例1中经冻存的脂肪组织复苏后分离出的脂肪间充质干细胞培养至不同代数的照片；P0：原代细胞；P1：第一次传代后的细胞；P2：第二次传代后的细胞；P3：第三次传代后的细胞；左右分别为不同放大倍数；
[0034] 图2为本发明实施例2中肌酸激酶活性试验对比分析冻存后脂肪组织和新鲜脂肪组织中细胞活力的结果图；
[0035] 图3为本发明实施例2中AO/PI双染检测第3代脂肪干细胞存活率；
[0036] 图4为本发明实施例2中经冻存的脂肪组织复苏后分离出的脂肪间充质干细胞成骨诱导染色鉴定图；
[0037] 图5为本发明实施例2中经冻存的脂肪组织复苏后分离出的脂肪间充质干细胞成脂诱导染色鉴定图。
具体实施方式
[0038] 下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
[0039] 本发明提供一种可临床用长期冻存脂肪组织的制备方法，包括如下内容：
[0040] 采用吸脂术，从供者大腿或腹部抽吸脂肪组织，用注射器抽取20ml，排尽液体，将脂肪组织收集于无菌瓶内。0～15℃低温运送至实验室；
[0042] 吸弃表层油脂，将脂肪组织转移至新的无菌离心管内，剩余液体和红细胞随离心管废弃；
[0043] 将脂肪组织剪成约0.1mm3～2mm3大小的碎块，加缓冲液，2800rpm～3200rpm离心5min～10min；
[0044] 吸弃表层油脂，将下层脂肪组织转移至新的无菌离心管内，剩余液体废弃；
[0045] 得到的脂肪组织与脂肪组织冻存液按(1～2)：(1～2)的体积比混合，制成细胞悬液后转入冻存管，将所述冻存管在0℃～5℃下平衡10min～30min，然后转入-80℃冻存2h～16h，最后转入液氮保存；
[0046] 其中，所述脂肪组织冻存液含有体积百分数为4％～6％的二甲基亚砜、质量百分数为0.5％～10％的羟乙基淀粉以及质量百分数为10％～20％的人血白蛋白；
[0047] 较好的，所述脂肪组织冻存液含有体积百分数为4％～6％的二甲基亚砜、质量百分数为3.5％～7％的羟乙基淀粉以及质量百分数为13％～17％的人血白蛋白；
[0048] 较好的，所述脂肪组织冻存液的溶剂为复方电解质注射液；
[0049] 所述复方电解质注射液含有氯化钠5.26±0.4g/L、葡萄糖酸钠5.02±0.4g/L、三水醋酸钠3.68±0.3g/L、氯化钾0.37±0.05g/L、六水氯化镁0.30±0.05g/L。
[0050] 实施例1
[0051] 本实施例提供一种脂肪组织冻存方法，包括以下步骤：
[0052] 1、脂肪组织前处理：
[0053] 采用吸脂术，从供者腹部抽吸脂肪组织20ml，排尽液体，将脂肪组织收集于无菌瓶内。0℃～15℃低温运送至实验室。脂肪组织置于4℃冰箱内暂存4h。在百级超净台内操作以下步骤：加入足量PBS，清洗脂肪组织2遍，将脂肪组织转移至无菌50ml离心管内加PBS充分浸泡，然后2800rpm离心10min。吸弃表层油脂，将脂肪组织转移至新的无菌离心管内，剩余液体和红细胞随离心管废弃。
[0054] 2、脂肪组织冻存：
[0055] 将脂肪组织剪成0.1mm3～2mm3的碎块，加PBS，2800rpm离心10min。吸弃表层油脂，将下层脂肪组织转移至新的无菌离心管内。将提前配制好冷藏在4℃的脂肪组织冻存液取出与脂肪组织体积比为1:1进行混合，将混合液分装均匀分装于冻存管内，放入装有新鲜异丙醇的程序降温盒中，在4℃下平衡10min，然后转入-80℃冰箱内冻存8小时，最后转入液氮-196℃保存2周；
[0056] 其中，所述脂肪组织冻存液含有体积百分数为5％的二甲基亚砜、质量百分数为10％的羟乙基淀粉以及质量百分数为10％的人血白蛋白；
[0057] 所述脂肪组织冻存液的溶剂为复方电解质注射液；
[0058] 所述复方电解质注射液含有氯化钠5.3g/L、葡萄糖酸钠5.42g/L、三水醋酸钠3.38g/L、氯化钾0.42g/L、六水氯化镁0.35g/L。
[0059] 3、脂肪组织复苏和脂肪间充质干细胞分离培养：
[0060] 取出储存于液氮中2周的脂肪组织冻存管，置于室温0.5min，转入37℃水浴锅中，充分摇晃加速解冻。转入百级超净台内将脂肪组织混合液移入离心管内，加入足量4℃PBS，待脂肪组织停止上移，则吸弃下层液体，重复操作2遍，将上层脂肪组织转移至无菌50ml离心管内加PBS充分浸泡，然后3000rpm离心5min。吸弃第一层油脂，将脂肪组织转移至量杯中，加入等体积量的0.1％I型胶原酶，放入37℃恒温摇床中以150rpm速度振荡消化1h。消化完全后，用100μm细胞滤网过滤，转至离心管内2000rpm离心6min。弃上清，用生理盐水混匀底部细胞，留样计数。1000rpm离心6min，得细胞，用培养液重悬混匀接种至培养瓶。在瓶身处贴上条形码，标记上培养日期，代数，瓶数等，放置于培养箱内，保持培养箱37℃，饱和温度，CO2浓度5％的状态培养。
[0061] 4、脂肪间充质干细胞扩增培养：
[0062] 待原代细胞接种后每3天换一次液，当贴壁密度达到90％时收集旧培养液，用PBS清洗一遍，加入0.125％胰蛋白酶-EDTA消化液1.5ml，37℃下消化3min，加入旧培养基终止消化，转入离心管中1000rpm离心6min。弃上清加入生理盐水洗涤，1000rpm离心6min。
[0063] 以1:3进行扩增种瓶。待细胞贴壁密度达到90％时按照上述方法传代。每一代细胞均进行拍照记录。结果如图1所示。
[0064] 5、生物学特性研究：
[0065] (1)脂肪间充质干细胞计数和活率检测，分别取第1、2、3代细胞，制成单细胞悬液，用COUNTSTAR细胞计数仪进行计数和活率(台盼蓝染色法)的检测。
[0066] 结果：收获第1代细胞量2.8×107，第2代细胞量9.4×107，第3代细胞量3.5×108；活率分别是98％、97％、99％。
[0067] (2)流式检测表型：分别取2和3代脂肪间充质干细胞各3.0×106，分别均匀分装成9管，离心后用PBS重悬，洗涤2次。离心后留1管做空白，表型标记按每管一个标记进行添加(抗体分别为小鼠抗人CD14-FITC、CD19-PE、CD29-FITC、CD34-PE、CD45-FITC、HLA-DR-FITC、CD73-FITC、CD90-FITC和CD105-PE)。暗室孵育30min，离心后洗涤2次，然后离心后加200μl PBS重悬，上机测定。
[0068] 表1流式表型检测结果
[0069] 流式结果 CD14 CD19 CD29 CD34 CD45 CD73 CD90 CD105 HLA-DRP2细胞 0.21 0.34 95.86 0.58 0.07 96.17 98.85 96.73 1.73
P3细胞 0.18 0.10 96.02 0.51 0.06 95.03 98.92 95.61 1.77
P3细胞 0.18 0.10 96.02 0.51 0.06 95.03 98.92 95.61 1.77
[0070] 通过上述结果看出，采用本发明冻存的人脂肪组织复苏后分离的细胞经培养高表达黏附
[0071] 分子和基质细胞标记CD29、CD73、CD90、CD105，不表达造血细胞标记CD14、CD19、CD34和CD45，也不表达主要组织相容性复合物类分子HLA-DR，符合间充质干细胞特征，且纯度＞95％。
[0072] 实施例2
[0073] 1、脂肪组织前处理：
[0074] 于供者皮下注射含利多卡因和肾上腺素的生理盐水注射液后，用16号针头接50ml注射器，直接将20ml脂肪抽吸到注射器内。10℃运送至实验室。在百级超净台内操作以下步骤：加入足量生理盐水，清洗脂肪组织3遍，3200rpm离心5min。吸弃表层油脂，将脂肪组织转移至新的无菌离心管内，剩余液体和红细胞随离心管废弃。
[0075] 2、脂肪组织冻存：
[0076] 将脂肪组织剪成0.1mm3～2mm3碎块，加生理盐水，3200rpm离心5min。吸弃表层油脂，将下层脂肪组织转移至新的无菌离心管内。将提前配制好的冷藏在4℃的脂肪组织冻存液取出与脂肪组织体积比为1:2进行混合，以1.5ml/管分装于1.8ml冻存管内，在4℃下平衡30min，然后转入-80℃冰箱内冻存16小时，最后转入液氮-196℃保存2个月；
[0077] 其中，所述脂肪组织冻存液含有体积百分数为5％的二甲基亚砜、质量百分数为3.5％的羟乙基淀粉以及质量百分数为17％的人血白蛋白；
[0078] 所述脂肪组织冻存液的溶剂为复方电解质注射液；
[0079] 所述复方电解质注射液含有氯化钠4.86g/L、葡萄糖酸钠4.62g/L、三水醋酸钠3.98g/L、氯化钾0.32g/L、六水氯化镁0.25g/L。
[0080] 3、脂肪组织复苏和脂肪间充质干细胞分离培养：
[0081] 取出储存于液氮中2个月的脂肪组织冻存管，置于室温1min，转入37℃水浴锅中，充分摇晃加速解冻。转入百级超净台内将脂肪组织混合液移入离心管内，加入足量4℃PBS，洗涤2遍，将上层脂肪组织转移至无菌50ml离心管内加PBS充分浸泡，然后3000rpm离心5min。弃液体，加入等体积量的0.15％I型胶原酶，放入37℃恒温摇床中以100rpm速度振荡消化1h。消化完全后，用滤网过滤，转至离心管内2000rpm离心6min。弃上清，用培养液混匀底部细胞，留样计数。1000rpm离心6min，弃上清，用培养液重悬底部细胞，接种至培养瓶。在瓶身处贴上条形码，标记上培养日期，代数，瓶数等，放置于培养箱内，保持培养37℃，饱和温度，CO2浓度5％的状态培养。
[0082] 4、脂肪间充质干细胞扩增培养：
[0083] 待原代细胞接种后每3天换一次液，当贴壁密度达到90％时收集旧培养液，用PBS清洗一遍，加入0.125％胰蛋白酶-EDTA消化液1.5ml，37℃下消化3min，加入旧培养基终止消化，转入离心管中1000rpm离心6min。弃上清加入生理盐水洗涤，1000rpm离心6min。以1:3进行扩增种瓶。待细胞贴壁密度达到90％时按照上述方法传代。
[0084] 5、生物学特性研究：
[0085] 肌酸激酶测定法测定脂肪组织内细胞活力：肌酸激酶是脂肪组织能量代谢的关键酶，在肌酸和磷酸肌酸、ADP和ATP之间的高能磷酸键的可逆性转移过程中起到催化作用。将0.5ml新鲜脂肪组织和1.5ml生理盐水混匀后导入组织研磨器内，于冰浴中破碎细胞。离心取中间层细胞，加入等体积生理盐水，37℃条件下加入肌酸激酶测试液2.5ml。分别于2min及3min吸取1ml混合液测定OD值，平均值△OD值即为酶活力值。复苏冻存6个月的脂肪组织，测定方式同前。结果显示酶活力值相差不大。结果如图2所示。
[0086] 6、AO/PI双染检测第3代脂肪干细胞存活率：
[0087] Acridine orange(AO)为膜通透荧光染料，结合细胞核DNA发出绿色荧光，标示活细胞；Propidium iodide(PI)仅能通过死细胞膜，结合死细胞的核DNA发出红色荧光，用于标示死细胞。
[0088] 结果如图3所示，图中较小、形状规则、数量较多的代表活细胞，细胞较大、形状不规则、数量较少的代表死细胞；平均活率为95％。
[0089] 7、脂肪干细胞分化潜能测定：
[0090] 成骨诱导：取第3代脂肪干细胞进行成骨诱导试验(赛业，成人骨髓间充质干细胞成骨诱导分化培养基)，按照说明书指示，每3天更换新鲜诱导培养基，大约维持4周。诱导完毕进行茜素红染色鉴定。如图4所示：脂肪干细胞经一段时间诱导后，细胞形态发生明显变化，由成纤维细胞状变为多角形，并有钻石样的结晶出现，经茜素红染色后变为红色，确定为钙结节，证实脂肪干细胞具备分化为成骨细胞的能力。
[0091] 8、成脂诱导：
[0092] 取第3代脂肪干细胞进行成脂诱导试验(赛业，成人骨髓间充质干细胞成脂诱导分化培养基)，按照说明书指示，每3天交替更换维持液与诱导液，大约维持4周。至脂滴变得较大且圆时可进行油红O染色分析。如图5所示：脂肪干细胞经一段时间诱导后，细胞形态发生明显变化，由成纤维细胞状变得不规则，细胞中并有大片圆形脂滴出现，经油红O染色后变为红色，证实其具备分化为成熟脂肪细胞的能力。
[0093] 最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
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