肝脏炎症的生物标志物
专利汇可以提供肝脏炎症的生物标志物专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及对来自人的 生物 样品进行诊断研究的方法，用于诊断研究肝脏 炎症 ，尤其是肝脏 纤维 化和/或肝硬变，其中所述样品被研究作为肝脏炎症——尤其是肝脏纤维化和/或肝硬变的标志物的一种或多种 蛋白质 ，其中相对于健康状况，所述蛋白质浓度升高或者降低表明存在肝脏炎症，尤其是肝脏纤维化和/或肝硬化。所述蛋白质选自：ER6Q、 波形 蛋白、肌动蛋白α1骨骼肌蛋白、hMFAP 4、原肌球蛋白、PTGES 2、 淀粉 样P－组分、transgelin、 钙 调理蛋白1、人p20蛋白、17kDa肌球蛋白轻链、H链H Igg B12、脯 氨 酰4－羟化酶、β亚基亚甲基四氢叶酸脱氢酶1、PRO2619、 醛 脱氢酶1、纤维蛋白原α链前蛋白原、果糖－二 磷酸 －醛缩酶B、精氨酸 琥珀酸 合成酶、Eefla2、ATP 5 A1、α－2－肌动蛋白、调钙素、血清 白蛋白 、线粒体苹果酸脱氢酶、线粒体乙酰乙酰辅酶A硫解酶、或者在每一情况下，是其部分序列。，下面是肝脏炎症的生物标志物专利的具体信息内容。
1.一种方法，所述方法用于研究人肝脏炎症的生物样品，尤其是 肝脏纤维化和/或肝硬变，
样品被研究作为肝脏炎症的标志物的一种或多种蛋白质，尤其是肝 脏纤维化和/或肝硬变，
相对于健康状况，所述蛋白质浓度增加表明存在肝脏炎症，尤其是 肝纤维化和/或肝硬化，
特征在于：所述蛋白质选自：ER60、波形蛋白、肌动蛋白α1骨 骼肌蛋白、hMFAP4、原肌球蛋白、PTGES2、淀粉样P-组分、transgelin、 钙调理蛋白1、人p20蛋白、17kDa肌球蛋白轻链、H链HIgG B12、 脯氨酰4-羟化酶β亚基或其各自的部分序列。
2.如权利要求1的方法，特征在于：原肌球蛋白是肌节原肌球蛋 白κ、β原肌球蛋白、TPM 1人原肌球蛋白、或原肌球蛋白4。
3.一种方法，所述方法用于研究人肝脏炎症的生物样品，尤其是 肝脏纤维化和/或肝硬变，
样品被研究作为肝脏炎症的标志物的一种或多种蛋白质，尤其是肝 脏纤维化和/或肝硬变，
相对于健康状况，所述蛋白质浓度降低表明存在肝脏炎症，尤其是 肝脏纤维化，
特征在于：所述蛋白质选自：亚甲基四氢叶酸脱氢酶1、PRO2619、 醛脱氢酶1、纤维蛋白原α链前蛋白原、果糖-二磷酸-醛缩酶B、精氨 酸琥珀酸合成酶、Eef1a2、ATP5A1、α-2-肌动蛋白、调钙素、血清白 蛋白、线粒体苹果酸脱氢酶、线粒体乙酰乙酰辅酶A硫解酶、或者其各 自的部分序列。
4.一种方法，所述方法用于肝脏炎症的诊断，尤其是肝脏纤维化 和/或肝硬变，
特征在于
针对待研究的病人实施测定选自如下所述的至少一种蛋白质： ER60、波形蛋白、肌动蛋白α1骨骼肌蛋白、hMFAP4、原肌球蛋白、 PTGES2、淀粉样P-组分、transgelin、钙调理蛋白1、人p20蛋白、 17kDa肌球蛋白轻链、H链H IgG B12、脯氨酰4-羟化酶β亚基、亚 甲基四氢叶酸脱氢酶1、PRO2619、醛脱氢酶1、纤维蛋白原α链前蛋 白原、果糖-二磷酸-醛缩酶B、精氨酸琥珀酸合成酶、Eef1a2、ATP5A1、 α-2-肌动蛋白、调钙素、血清白蛋白、线粒体苹果酸脱氢酶、线粒体 乙酰乙酰辅酶A硫解酶、或其各自的部分序列。
5.如权利要求1至4中的任何一项所述的方法，特征在于：样品 的研究是借助诊断试剂进行的，其使用了适合该目的的生物分析方法， 例如免疫组织化学技术、抗体阵列、luminex、ELISA、免疫荧光和放射 免疫分析法。
6.如权利要求1至5中的任何一项所述的方法，特征在于：样品 的研究使用质谱法进行，例如MRM(多反应监测)或AQUA(绝对量化)， 借助质谱法，标志蛋白质可被定量确定。
7.如权利要求1至6中的任何一项所述的方法，特征在于：样品 的研究借助2-D电泳进行，在第一维度进行等电聚焦，在第二维度进 行凝胶电泳。
8.如权利要求7的方法，特征在于：凝胶电泳是SDS-聚丙烯酰 胺凝胶电泳。
9.如权利要求7或8的方法，特征在于：在进行2-D凝胶电泳之 前，使用染料进行样品的标记。
10.如权利要求9的方法，特征在于：染料是Cy2、Cy3和/或Cy5。
11.如权利要求1至10中的任何一项所述的方法，特征在于：样 品是肝脏活组织检查样品。
12.如权利要求1至10中的任何一项所述的方法，特征在于：样 品可以是血清、血浆或(全)血。
13.ER60、波形蛋白、肌动蛋白α1骨骼肌蛋白、hMFAP4、原肌 球蛋白、PTGES2、淀粉样P-组分、transgelin、钙调理蛋白1、人p20 蛋白、17kDa肌球蛋白轻链、亚甲基四氢叶酸脱氢酶1、PRO2619、醛 脱氢酶1、纤维蛋白原α-链前蛋白原、果糖二磷酸醛缩酶B、精氨酸 琥珀酸合成酶、Eef1a2、ATP5A1、α-2-肌动蛋白、调钙素、ABBOS血 清白蛋白前体、线粒体苹果酸脱氢酶、线粒体乙酰乙酰辅酶A硫解酶前 体、H链H IgG B12、脯氨酰4-羟化酶、β亚基作为标志物的用途， 用于检测肝脏炎症，尤其是肝脏纤维化和/或肝硬变。
14.权利要求13中引述的至少一种标志物蛋白质用于鉴别诊断的 用途，尤其是鉴别诊断早期识别、肝脏疾病的进程预测、严重程度的判 断、伴随治疗的进程判断、病因学和体外诊断学。
15.一种试剂盒或诊断设备，所述试剂盒或诊断设备包括根据权利 要求4的至少一种标志物蛋白质，以及检测试剂和进一步的助剂。
本发明涉及一种用于人类肝脏炎症的生物样品的诊断研究的方 法，尤其是肝脏纤维化和/或肝硬变，样品被研究因为一种或多种蛋白 质作为肝脏炎症的标记物，尤其是肝脏纤维化和/或肝硬变，蛋白质的 浓度相对于健康状况提高或降低，这表明肝脏存在炎症，尤其是肝脏 纤维化和/或肝硬变中。
全世界大约有1.7亿人慢性感染了丙型肝炎病毒(hepatitis C virus(HCV))。病人之间疾病的病程显著不同；虽然大约20％的病人 在20年内发展为肝硬化，而在其它病人中，在更长的时间期间后，仍 然没有观察到这一类型的发展。除了其它因素之外，可确定会增加肝 脏纤维化和/或肝硬变概率的一批因素有，雄性、酒精滥用、HIV或曼 氏血吸虫(Schistosoma mansoni)的共感染、遗传易感性和感染时年 龄较大。
最重要的是，肝星状细胞(hepatic stellate cells(HSC))， 其在休息状态下在正常肝脏中负责维生素A的储存，尤其是，负责肝 脏纤维化和/或肝硬变的发展。相反，在纤维化肝脏中，它们被激活， 增生，且发展为肌纤维母细胞。这些肌成纤维细胞产生大量胶原蛋白， 下调基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases(MMP))的产生， 且显示出MMP的生理抑制剂(physiological inhibitors of the MMP (TIMP))的增加性表达。随着增加胶原蛋白积聚，肝脏的纤维化进一 步发展，这最后可能导致器官功能衰竭。
尤其是，聚乙二醇化干扰素α(peg-interferon alpha)和利巴 韦林(ribavirin(三氮唑核苷))被用于慢性肝炎C的抗病毒治疗。 尽管这种方式可以成功地治疗许多病人，但该治疗在至少50％病人中 是不成功的，这些病人感染了HCV基因型1，这种HCV基因型1在西 方国家是最普遍的。这对感染了HCV基因型4的病人是类似真实的， 这种HCV基因型4在埃及频繁发生。此外，持久的抗病毒治疗的成本 很高，并且这种治疗与显著的副作用有关。在显著晚期的病人中，抗 病毒治疗不再产生期望的成功。因此，存在对能更好地诊断肝炎病人 的纤维化以及因此而言肝硬化发生的需求，以及能够为治疗医师提供 就抗病毒治疗是否可取以及是否有希望做出决断的能力的需求。
过去许多非侵入性标记物已经被用于肝脏纤维化的检测，在这些 非侵入性标记物中，有所谓的acti-test或fibro-test、III型前胶 原肽(PIIIP)、透明质酸、基质金属蛋白酶(MMP)以及它们的抑制 剂(TIMP)(T.Poynard等人，Expert Rev Mol Diagn.2005，5(1)： 15-21；V.Leroy等人，J Hep 2001，35(1)：26)。然而，所有这 些标记物仅仅表现出有限的敏感性和特异性，由于这个原因，存在对 更合适的标记物的进一步需求。
从所描述的现有技术出发，因此它自身提出此种目标，即提供研 究肝脏炎症和/或肝脏纤维化和/或肝硬变的生物样品的改进方法，其 中使用新颖的标记物。
根据本发明，实现了这样的目标，即通过研究人类生物样品的肝 脏炎症，尤其是肝脏纤维化和/或肝硬变的方法，样品被研究，目标是 一种或多种蛋白质作为肝脏炎症的标记物，尤其是肝脏纤维化和/或肝 硬变，以及升高水平的所述蛋白质表明存在肝脏炎症，尤其是肝脏纤 维化和/或肝硬变，所述蛋白质选自：ER60、波形蛋白、肌动蛋白α1 骨骼肌蛋白、hMFAP4、原肌球蛋白、PTGES2、淀粉样-P-组分、 transgelin、钙调节蛋白1、人(Homo sapiens)p20蛋白、17kDa 肌球蛋白轻链、H链H IgG B12、脯氨酰4-羟化酶、β亚基。
进一步，本发明也涉及一种相应的方法，其中，降低水平的所述 蛋白质表明存在肝脏炎症，尤其是肝脏纤维化和/或肝硬变，在这种情 况下，所述蛋白质选自：亚甲基四氢叶酸脱氢酶1、PRO2619、醛脱氢 酶1、纤维蛋白原α-链前蛋白原、果糖-二磷酸-醛缩酶B、精氨酸琥 珀酸合成酶、Eef1a2、ATP5A1、α-2-肌动蛋白、调钙素、血清白蛋白、 线粒体苹果酸脱氢酶、线粒体乙酰乙酰辅酶A硫解酶。
对于上调以及下调蛋白，也根据本发明，通过确定生物标记物(也 就是：标志物蛋白)的部分序列，进行了研究。尤其是，这样的部分 序列优选包括根据本发明的生物标志物的60％的氨基酸序列，尤其是 70％和更多，80％和更多，尤其是90至95％。
在本发明的上下文中，术语肝脏炎症包括任何形式的肝炎，但尤 其是肝脏纤维化，直到肝硬变(关于这些术语，例如，请参考相关的 Pschyrembel，Klinisches[Clinical Dictionary]， 260th edition，2004，Berlin)。根据本发明，肝脏纤维化和肝硬 变是优选的。
进一步，本发明也涉及肝脏炎症的诊断，尤其是肝脏纤维化和/ 或肝硬变，针对待研究的病人实施测定选自如下的至少一种蛋白的确 定：ER60、波形蛋白、肌动蛋白α1骨骼肌蛋白、hMFAP4、原肌球蛋 白、PTGES 2、淀粉样-P-组分、transgelin、钙调节蛋白1、人p20 蛋白、17kDa肌球蛋白轻链、H链H IgG B12、脯氨酰4-羟化酶、β 亚基、亚甲基四氢叶酸脱氢酶1、PRO2619、醛脱氢酶1、纤维蛋白原 α-链前蛋白原、果糖二磷酸醛缩酶B、精氨酸琥珀酸合成酶、Eef1a2、 ATP5A1、α-2-肌动蛋白、调钙素、血清白蛋白、线粒体苹果酸脱氢酶、 线粒体乙酰乙酰辅酶A硫解酶或其各自的部分序列。
进一步，根据本发明的这些生物标志物和/或标志物蛋白对于根据 本发明的诊断是可能的。
与非纤维化组织相比，在纤维化组织的蛋白质组学分析过程中， 所引述的蛋白可被鉴定为潜在的生物标志物。为了该目的，从感染了 丙型肝炎的病人拿出肝脏活组织检查样品。在手工均质器中用裂解缓 冲液均质化样品，DNA和其它细胞材料被除去，得到蛋白质浓缩物。 使用染料标记这些蛋白质；使用等电聚焦，使蛋白质在第一个维度经 受2-D聚丙烯酰胺凝胶电泳，在第二个维度经受SDS凝胶电泳。借助 适合该目的的软件，比较纤维化和非纤维化细胞的结果，检测且量化 在纤维化样品中扩大或降低的斑，这是与非纤维化样品相比而言。例 如，来自GE Healthcare的ImageQuantTM软件以及该公司的DeCyder 软件可作为执行软件。测量且分析用来标记蛋白质的染料的散发。
借助LC-ESI-MS(液相色谱-电喷雾-质谱)完成进一步的分 析。首先，借助凝胶中的胰蛋白酶，将蛋白质分解为单一肽片段；其 中，在凝胶中，样品在之前已经被分离。借助反相HPLC，将这些片段 彼此分离，并且使用质谱法研究这些片段，以鉴定单一蛋白。当然， 其它合适的质谱法也可用于该目的，如基质辅助激光解析电离飞行时 间质谱(MALDI-TOF-MS)。
下述蛋白质能在研究中被鉴定，相对于非纤维化细胞，这些蛋白 在纤维化细胞中被上调(倍数变化正值)或下调(倍数变化负值)：
上调蛋白：
NCBI登记号 鉴定蛋白 倍数变化 IPI00025252.1 ER60蛋白 26.9 IPI00418471.5 波形蛋白 5.6 IPI00448938.1 H链H IgG B12 14.7 IPI00697648.1 肌动蛋白α1骨骼肌蛋白 6.5 IPI00022792.3 hMFAP 4 45.1
IPI00455050.1 肌节原肌球蛋白κ 87.1 IPI00014581.1 TPM1人原肌球蛋白α链 28.7 IPI00220709.3 β原肌球蛋白 52.4 IPI00010779.3 原肌球蛋白4 20.6 IPI00303568.3 PTGES 2 6.1 IPI00010796.1 脯氨酰4-羟化酶，β亚基 4.6 IPI00022391.1 淀粉样P-组分，血清 7.3 IPI00216138.5 transgelin 15 IPI00021264.1 钙调节蛋白1 21.1 IPI00022433.5 Homo sapiens p20蛋白[pir B53814] 16.9 IPI00718271.2 17kDa肌球蛋白轻链 8.4
下调蛋白：
NCBI登记号 简单蛋白 倍数变化 IPI00218342.9 亚甲基四氢叶酸脱氢酶1 -9.37 IPI00745872.1 PRO2619 -3.2 IPI00218914.4 醛脱氢酶1 -7.7 IPI00029717.1 纤维蛋白原α-链前蛋白 -6.4 IPI00218407.5 果糖二磷酸醛缩酶B -16.6 IPI00020632.4 精氨酸琥珀酸合成酶 -11.0 IPI00014424.1 Eef1a2 -6.4 IPI00440493.2 ATP5A1 -5.8 IPI00708487.1 α-2-肌动蛋白；α心脏肌动 蛋白 -8.6 IPI00017551.1 调钙素(衰老标志蛋白30) -13.3 IPI00708398.1 ABBOS-血清白蛋白前体 -13.3 IPI00291006.1 线粒体苹果酸脱氢酶前体 -5.9 IPI00030363.1 线粒体乙酰乙酰辅酶A硫解酶 前体 -5.9
NCBI：国家生物技术信息中心
下面详细说明了几个鉴定蛋白的序列信息。肽序列，一方面，导 致蛋白质的鉴定，另一方面，允许蛋白质异形体的区别(也对比于本 申请所附的序列列表)，有黑色加深。
原肌球蛋白
SEQ ID NO 1 MDAIKKKMQMLKLDKENALDRAEQAEADKKAAEDRSKQLEEDIAAKEKLL
SEQ ID NO 2 MDAIKKKMQMLKLDKENALDRAEQAEADKKAAEDRSKQLEEDIAAKEKLL
SEQ ID NO 3 MDAIKKKMQMLKLDKENAIDRAEQAEADKKQAEDRCKQLEEEQQALQKKL
SEQ ID NO 4 MDAIKKKMQMLKLDKENALDRAEQAEADKKAAEDRSKQLEDELVSLQKKL
SEQ ID NO 5 ------------------------------------MAGLNSLEAVKRKI
SEQ ID NO 1 RVSEDERDRVLEELHKAEDSLLAAEEAAAKAEADVASLNRRIQLVEEELD
SEQ ID NO 2 RVSEDERDRVLEELHKAEDSLLAAEEAAAKAEADVASLNRRIQLVEEELD
SEQ ID NO 3 KGTEDEVEKYSESVKEAQEKLEQAEKKATDAEADVASLNRRIQLVEEELD
SEQ ID NO 4 KGTEDELDKYSEALKDAQEKLELAEKKATDAEADVASLNRRIQLVEEELD
SEQ ID NO 5 QALQQQADEAEDRAQGLQRELDGERERREKAEGDVAALNRRIQLFEEELD
SEQ ID NO 1 RAQERLATALQKLEEAEKAADESERGMKVIESRAQKDEEKMEIQEIQLKE
SEQ ID NO 2 RAQERLATALQKLEEAEKAADESERGMKVIESRAQKDEEKMEIQEIQLKE
SEQ ID NO 3 RAQERLATALQKLEEAEKAADESERGMKVIENRAMKDEEKMELQEMQLKE
SEQ ID NO 4 RAQERLATALQKLEEAEKAADESERGMKVIESRAQKDEEKMEIQEIQLKE
SEQ ID NO 5 RAQERLATALQKLEEAEKAADESERGMKVIENRAMKDEEKMEIQEMQLKE
SEQ ID NO 1 AKHIAEDADRKYEEVARKLVIIESDLERAEERAELSEGKCAELEEELKTV
SEQ ID NO 2 AKHIAEDADRKYEEVARKLVIIESDLERAEERAELSEGKCAELEEELKTV
SEQ ID NO 3 AKHIAEDSDRKYEEVARKLVILEGELERSEERAEVAESRARQLEEELRTM
SEQ ID NO 4 AKHIAEDADRKYEEVARKLVIIESDLERAEERAELSEGQVRQLEEQLRIM
SEQ ID NO 5 AKHIAEEADRKYEEVARKLVILEGELERAEERAEVSELKCGDLEEELKNV
SEQ ID NO 1 TNDLKSLEAQAEKYSQKEDRYEEEIKVLSDKLKEAETRAEFAERSVTKLE
SEQ ID NO 2 TNDLKSLEAQAEKYSQKEDRYEEEIKVLSDKLKEAETRAEFAERSVTKLE
SEQ ID NO 3 DQALKSLMASEEEYSTKEDKYEEEIKLLEEKLKEAETRAEFAERSVAKLE
SEQ ID NO 4 DQTLKALMAAEDKYSQKEDRYEEEIKVLSDKLKEAETRAEFAERSVTKLE
SEQ ID NO 5 TNNLKSLEAASEKYSEKEDKYEEEIKLLSDKLKEAETRAEFAERTVAKLE
SEQ ID NO 1 KSIDDLEDELYAQKLKYKAISEELDHALNDMTSI
SEQ ID NO 2 KSIDDLEDELYAQKLKYKAISEELDHALNDMTSI
SEQ ID NO 3 KTIDDLEETLASAKEENVEIHQTLDQTLLELNNL
SEQ ID NO 4 KSIDDLEEKVAHAKEENLSMHQMLDQTLLELNNM
SEQ ID NO 5 KTIDDLEEKLAQAKEENVGLHQTLDQTLNELNCI
Transgelin
SEQ ID NO 6 MANKGPSYGMSREVQSKIEKKYDEELEERLVEWIIVQCGPDVGRPDRGRL
SEQ ID NO 7 MANKGPSYGMSREVQSKIEKKYDEELEERLVEWIIVQRGPDVGRPDRGRL
SEQ ID NO 6 GFQVWLKNGVILSKLVNSLYPDGSKPVKVPENPPSMVFKQMEQVAQFLKA
SEQ ID NO 7 GFQVWLKNGVILSKLVNSLYPDGSKPVKVPENPPSMVFKQMEQVAQFLKA
SEQ ID NO 6 AEDYGVIKTDMFQTVDLFEGKDMAAVQRTLMALGSLAVTKNDGHYRGDPN
SEQ ID NO 7 AEDYGVIKTDMFQTVDLFEGKDMAAVQRTLMALGSLAVTKNDGHYRGDPN
SEQ ID NO 6 WFMKKAQEHKREFTESQLQEGKHVIGLQMGSNRGASQAGMTGYGRPRQII
SEQ ID NO 7 WFMKKAQEHKREFTESQLQEGKHVIGLQMGSNRG----------------
SEQ ID NO 6 S
SEQ ID NO 7 -
SEQ ID NO 1：肌节 原肌球蛋白κ，TPM1-κ；NCBI 登记号： IPI00455050.1
SEQ ID NO 2：肌节 原肌球蛋白κ；NCBI登记号：IPI00455050.1
SEQ ID NO 3：β原肌球蛋白；NCBI登记号：IPI00220709.3
SEQ ID NO 4：TPM 1人原肌球蛋白1α-链；NCBI登记号： IPI00014581.1
SEQ ID NO 5：原肌球蛋白4；NCBI登记号：IPI00010779.3
SEQ ID NO 6：transgelin；NCBI登记号：IPI00216138.5
SEQ ID NO 7：transgelin变体；NCBI登记号：IPI00216138.5
图1所示为使用2-D凝胶电泳分离的蛋白质的图片，使用了来自 总共7个病人的肝脏硬化肝实质的纤维化和非纤维化细胞，这些病人 遭遇了丙型肝炎相关的肝硬化。圆形标记表示原肌球蛋白(β)，椭圆 形标记表示hMFAP4。图片的类似性支持了结果的再现性。
尤其是，原肌球蛋白、transgelin、钙调理蛋白(calponin)、 hMFAP4和波形蛋白已经显示出是根据本发明的有希望的且优选的生 物标志物。进一步，原肌球蛋白可以是肌节原肌球蛋白κ、β原肌球 蛋白、TPM1人原肌球蛋白或原肌球蛋白4。
所引述的hMFAP4是人微纤丝结合蛋白4(the human microfibrillar associated protein 4)。然而，除了上面提及的 上调蛋白，下调代谢酶也可被用作标志物，尤其是精氨酰琥珀酸合成 酶、亚甲基四氢叶酸脱氢酶、果糖-1，6-二磷酸醛缩酶、线粒体苹果酸 脱氢酶和线粒体乙酰乙酰辅酶A硫解酶。
下面简单讨论了一些已鉴别蛋白，这些提供于此，仅仅在于尽力 澄清，这些解释不应该理解为以任何方式对寻找专利权的客体的限制。
调钙素，也已知为衰老标志蛋白-30(sensescence marker protein-30(SMP-30))，通过浆细胞膜、微粒体和线粒体中Ca2+酶 的激活，在维持胞内Ca2+水平中起着显著的作用。与健康肝细胞相比， 调钙素在纤维化肝细胞中被下调13倍。这可能表明，就患病的肝脏组 织中的氧化应激而言，调钙素的补偿效应受到降低。
线粒体苹果酸脱氢酶和线粒体乙酰乙酰基转移酶，两者在纤维化 肝组织都被下调5.9倍。这可能说明，丙型肝炎病毒核心蛋白和蛋白 NS3和NS5与线粒体之间的相互作用导致形成活性氧(reactive oxygen species(ROS))，这可能是对纤维化细胞中所引述酶的较弱 表达的解释。
纤维化肝脏细胞中受扰线粒体酶的进一步迹象是ATP合成酶α亚 基(the ATP synthase alpha-subunit(ATP5A1))的降低表达，它 在氧化磷酸化作用中催化ATP合成。
丙型肝炎病毒核心蛋白和NS5A蛋白的进一步作用，是通过与载脂 蛋白A1(apolipoprotein A1(apoA1))或A2(apoA2)的交互作用， 与内质网的膜、高尔基体和胞内脂质蓄积的扩大有关。脂质转移蛋白 受到相当地抑制，或者VLDL(very low density lipoproteins(极 低密度脂蛋白))的合成受到干扰。在纤维化肝细胞中，能观察到乙酰 基-CoA-乙酰基转移酶的显著下调(倍数变化：-5.88)。
纤维化肝脏的代谢紊乱也表明它们本身在糖酵解酶的降低表达 上，例如果糖-1，6-二磷酸醛缩酶(倍数变化：-16.6)、烯醇酶-1(2- 磷酸二甘油酸水解酶)或乙二醛酶。
由于这些代谢功能紊乱状态，纤维化肝细胞中的蛋白合成被部分 地显著降低：血清白蛋白(倍数变化：-13.2)，其功能相当于脂肪酸、 类固醇和甲状腺激素的载体，并且稳定胞外液相体积，它仅仅仍然以 降低方式被表达。
纤维化肝细胞中肝脏再生的过程明显被亚甲基四氢叶酸脱氢酶 (倍数变化：-9.4)的弱表达削弱，其催化四氢叶酸的C-1衍生物转 化中的三个顺序反应。未降低的酶功能对正常细胞功能、生长和去分 化是重要的。
总的来说，细胞平衡、糖酵解反应途径、脂质区室化和代谢的紊 乱似乎存在于纤维化细胞中，这促进了活性氧(ROS)的产生。这些 又依次导致肝细胞和肝星状细胞中的TGF-β1合成，为肝纤维发生的 最强大的促进剂。
在扩增的可检测蛋白领域，蛋白质肌动蛋白α(倍数变化：6.5) 和肌动蛋白γ(倍数变化：9.1)能被鉴定。这些是肌细胞的细肌丝和 非肌细胞的细胞骨架的主要组分。肌动蛋白显然是HSC细胞的产物， 在丙型肝炎诱导的纤维化事件中以扩增方式发生。
进一步的鉴定蛋白是波形蛋白(倍数变化：4.6)。这被假定为一 种来自间充质的肝星状细胞的产物。
多种原肌球蛋白异构体，这些异构体显然不是由肝细胞产生的， 而是由肌成纤维性的肝脏星状细胞产生，尤其具有最高的扩增速率(倍 数变化：9.7到83.1)。
34kDa蛋白质钙调理蛋白通常也在平滑肌细胞中被特异地表达， 并且结合钙调蛋白、肌动蛋白和原肌球蛋白。考虑到肌成纤维细胞激 活的肝星状细胞，根据蛋白质组学分析的结果，钙调理蛋白(calponin) 也在纤维化细胞中被上调(倍数变化：18.5)。
Transgelin(倍数变化：15)也被假定是肝星状细胞的产物。 Transgelin是22kDa蛋白，该蛋白也被称作SM22-α，且与钙调理蛋 白有结构类似性。淀粉样成分P，是一种糖蛋白，其包括一对非共价 结合的五聚物，亚单位的尺寸为23至25kDa，在纤维化事件中比健 康组织中更强地表达(倍数变化：7.3)。直到此刻，肝纤维增生中的 生理学功能仍然是未知的，但过度表达表明了一种反常的细胞过程。
总之可以表明，可用作生物标志物的蛋白质的过度表达或者表达 异常减弱，归结于：在纤维化肝细胞中，于细胞凋亡过程中，紊乱的 细胞平衡、受损的线粒体和代谢酶、降低的细胞合成、和细胞骨架蛋 白的扩大表达。
在用作生物标志物的蛋白质样品的研究中，如上面所描述的，可 使用一种过程，其中，借助于2-D凝胶电泳，该过程包括第一维度上 的等电聚焦，和第二维度上的凝胶电泳，进行蛋白质的分离，并且通 过蛋白质模式与非纤维化对照样品的比较，证明特异蛋白质的过度表 达和/或表达不足。凝胶电泳优选是SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。分析 凝胶的相应软件是可获得的，例如，从GE Healthcare，以DeCyder 软件的形式获得。
为了检测蛋白质，在完成2-D凝胶电泳之前，使用染料，优选标 记这些样品。染料优选是荧光染料。尤其优选使用Cy2、Cy3和/或Cy5。 这些染料是可得到的，例如，从GE Healthcare，Freiburg，Germany。 这些是羧甲基靛青染料，两个吲哚分子通过有共轭双键的碳链结合在 一起。可促使相应的官能化染料与半胱氨酸侧链的硫醇基团反应，以 便将蛋白质共价连接在染料上。为了二硫桥还原的目的，首先借助合 适的还原剂还原样品，例如，借助三(2-羧乙基)膦盐酸盐(tris (2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride(TCEP))。随后，进 行与相应的官能化染料的反应，直到最后通过添加DTT终止反应。然 而，其它氨基酸残基借助染料的官能化也是可能的，例如，赖氨酸的 侧链。
使用Cy3、Cy5染料系统尤其有利，这在于，除了实际样品，在 2-D凝胶电泳过程中也可使用内标法，实际样品和内标法用不同染料 (分别用Cy3和Cy5)提供。
当然，除了所引述的染料，也可使用其它(荧光)染料，它们在 现有领域是已知的，如荧光素或四甲基罗丹明。
用作标志物的蛋白质的测定和量化，也借助进一步的蛋白质诊断 方法进行，这些方法对本技术领域的普通技术人员是已知的，尤其是， 使用放射性或荧光标记抗体。尤其是，此处引述了适合该目的的生物 分析方法，如免疫组织化学技术、抗体阵列、luminex、ELISA、免疫 荧光和放射免疫分析法。也使用适合该目的的进一步生物分析方法进 行用作标志物的蛋白质的测定和量化，如质谱法，例如，MRM(多反应 监测)或AQUA(绝对量化)，借助这些方法，标志物蛋白可被定量地 测量。
用于测定蛋白质的样品可以是肝组织样品，这些样品是借助活组 织检查拿出的。然而，也可使用(全)血、血清、或者血浆样品，这 些样品明显更易于获得。
除了所描述的方法，本发明也涉及使用所引述的蛋白质作为检测 肝炎炎症的生物标志物，尤其是肝纤维化的检测。
所引述的根据本发明的标志物蛋白也可用于进一步的实施方案 中，用于鉴别诊断，尤其是鉴别诊断早期识别、肝脏疾病的进程预测、 严重程度的判断、伴随治疗的进程判断、病因学和体外诊断学。
在进一步的实施方案中，本发明涉及用于完成根据本发明所述方 法的试剂盒或诊断设备，所述试剂盒包含至少一个根据本发明的标志 物(也可以是：标志物蛋白)，以及检测试剂和进一步的助剂。
下面实施例被用来解释本发明，但没有将本发明限定为这些实施 例。
实施例
实施例1 样品分析：
从感染了基因型1的丙型肝炎的总共7个病人拿出肝实质，这些 病人已经经受了肝移植，拿出的肝实质被立刻冷冻在冰上，且于-86 ℃储存。在显微镜下，在纤维化组织和健康部分之间分离样品组织。 沿着纤维化隔膜拿出纤维化材料。使用苏木素对2-D凝胶电泳的层染 色，其储存于-20℃。将来自微分离解剖的分离细胞放置在100μL分 解缓冲液(tris HCl 30mM；硫脲2M；尿素7M，CHAPS 4％，pH 8.0) 中，随后通过应用超声波破碎(6x10s脉冲)。
通过离心去除DNA和其它细胞残余物(12,000g进行五分钟)。 确定裂解物的蛋白质浓度。
为了制备内标，通过在1小时的时间间隔内，在黑暗中，于37℃ 下，应用2nmol三-(2-羧乙基)-膦盐酸盐(TCEP)还原3μg的组 织裂解物。使用无水DMF p.a.(2nmol/μl)稀释Cy染料(GE Healthcare，Freiburg，Germany)，将4nmol Cy3混合到借助TCEP 所还原的样品中。于37℃培养30分钟后，添加4μL DTT(1.08g/mL) 终止反应。
将被研究的蛋白质的半胱氨酸氨基酸(3500纤维化细胞，2500非 纤维化细胞)，在添加4nmol Cy5之前，也通过用2nmol TCEP于 37℃在黑暗中温育1小时，而被还原。在彻底混合后，将样品在黑暗 中于37℃反应30分钟。通过添加10μL DTT终止反应。
为了准备等电聚焦，加入10μL两性电解质2-4(GE Healthcare)。在进一步彻底混合后，同时处理Cy3-标记的和Cy5- 标记的细胞。
随后，进行2-D凝胶电泳，21.25h电压梯度被用于等电聚焦。 125mM tris、40％(w/v)甘油、3％(w/v)SDS、65mM DTT、pH 6.8 被用于10分钟，作为平衡缓冲液。随后，在第二个维度进行聚丙烯酰 胺凝胶电泳。
借助合适的扫描仪(Typhoon 9400，GE Healthcare)，在完成凝 胶电泳后记录图像，并且借助ImageQuant软件和DeCyder软件(GE Healthcare)进行分析。用这种方式，能在凝胶(DIA)中进行不同的 分析，以检测且量化单一斑点。
借助酶胰蛋白酶，在10mM碳酸氢铵缓冲液(pH 7.8)中，于37 ℃将蛋白分裂过夜。使用乙腈-甲酸混合物将以该方式产生的片段提取 两次，用于进一步分割和质谱研究。这是借助与纳米-ESI-MS(电喷雾 质谱质谱法)结合的在线-RP-毛细管HPLC进行的。蛋白斑点的完整检 测也借助HPLC-MS来进行，结合且使用了合适的蛋白数据库(NCBI， 美国国家生物技术信息中心)。
实施例2：蛋白质原肌球蛋白及其在病人血清中的检测
为了该目的，使用Western斑点分析进行蛋白检测。原肌球蛋白 能在不同来源的肝硬化病人的血清中可重复性地被鉴别(图2)。
图2：下述病人血清的原肌球蛋白Western斑点：
1：(病人1)丙型肝炎(HepC)肝硬化CHILD C
2：(病人2)肝硬化CHILD C
3：(病人3)肝硬化CHILD C
4：(病人4)肝硬化CHILD C
5：(病人5)肝硬化CHILD C
6：(病人6)肝硬化CHILD A
7：(病人7)肝硬化CHILD A
8：(病人8)正常对照
9：(病人9)正常对照
10：(病人10)正常对照
11：(病人11)正常对照
12：(病人12)乙基-毒性肝硬化CHILD C
13：(病人13)乙基-毒性肝硬化CHILD C
14：(病人14)HepB纤维化
15：(病人15)HepC纤维化
16：原肌球蛋白0,005μg
这些病人，一方面，是有肝硬化和/或纤维化的感染了丙型肝炎病 人，另一方面，是有乙基-毒性肝硬化的病人，和一个有肝纤维化的乙 型肝炎病人。有肝硬化的病人被进一步划分为不同的CHILD类别，通 过引入不同的血液参数，它们提供了关于肝硬化严重程度的信息。分 类是从CHILD A进行的，其第二年的存活率为大约100％；直到CHILD C， 其存活率为大约30％。在健康对照组的病人血清中不能检测原肌球蛋白 带(图2，带8-11)。有趣的是，在有CHILD C分类的丙型肝炎病人中 能检测到原肌球蛋白(图2，带1-5)，而在有CHILD A肝硬化的硬变 病人中，不能检测到蛋白带(图2，带6-7)。此外，研究了乙基-毒性 肝硬化(CHILD C分类)，也显示了消弱形式的原肌球蛋白的信号，且 具有CHILD C分类(图2，带12-13)。进一步，原肌球蛋白带能在乙型 肝炎纤维化病人中被检测到，这在丙型肝炎纤维化病人中是不可能的。
<110>Schmiegel.Prof.Dr.Wolff
Dr.Christian
Bochum
Sipos，Dr.Bence
Prof.Dr.Günter
<120>肝脏炎症的生物标志物
<130>RUB/Meyer 32-5WO
<140>10 2006 048 249.2
<141>2006-08-10
<160>7
<170>PatentIn version 3.3
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<213>人肝细胞
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