通过检测人类T细胞受体TCR基因在治疗前后的变化来评价治疗HIV药物疗效的方法
专利汇可以提供通过检测人类T细胞受体TCR基因在治疗前后的变化来评价治疗HIV药物疗效的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且发明 提供一种通过设计的特定引物来完成PCR反应，放大感染HIV病毒的患者的T细胞受体TCR基因在接受药物 治疗 前后的变化，进而评价药物的疗效的方法，本发明提供的技术不但填补了技术上的空白而且具有灵敏度高，准确性好的优点。，下面是通过检测人类T细胞受体TCR基因在治疗前后的变化来评价治疗HIV药物疗效的方法专利的具体信息内容。
1.通过检测人类T细胞受体TCR基因在治疗前后的变化来评价治疗HIV药物疗效的方法，其步骤为：a.血样经采集分离后，得到外周血单个核细胞，再进一步分离出CD4或CD8T细胞；b.分离和提纯出T细胞的mRNA后，通过mRNA合成得到cDNA；c.在极其靠近CDR3区段V基因区设计22个内侧Vβ基因引物和一个内侧Cβ基因引物，Cβ基因引物的5′端插入七个非模板碱基GTTTCTT，Cβ基因引物采用高灵敏度的荧光标记，所述Vβ基因引物和Cβ基因引物如下：Vβout PCR引物：Vβ1out 5′GGA GTC ACA CAA ACC CCA AAG CAC CTG 3′，Vβ2out 5′GTT ATC TGT AAG AGT GGA ACC 3′，Vβ3out 5′CTC GTA GAT GTG AAA GTA ACC CAG AG 3′，Vβ4out 5′GAT AGC CAA GTC ACC ATG ATG TTC 3′，Vβ5.1out 5′GTC GAT TCT CAG GGC GCC AGT TCT C 3′，Vβ6out 5′GAG TCT CCC AGA ACC CCA GAC ACA AG 3′，Vβ7out 5′GGT CAT GGG AAT GAC AAA TAA GAA G 3′，Vβ8out 5′CGA TAG ATG ATT CAG GGA TGC CCG AG 3′，Vβ9out 5′GAC AAG TCC ATT AAA TGT GAA C 3′，Vβ11out 5′CTG ACA TCT ACC AGA CCC CAA GAT AC 3′，Vβ12out 5′GAT ACT GAC AAA GGA GAA GTC 3′，Vβ13out 5′CAA GAC CCA GGC ATG GGG CTG AAG 3′，Vβ14out 5′GGG AGA TGT TCC TGA AGG GTA C 3′，Vβ15out 5′CTC GAC AGG CAC AGG CTA AAT TC 3′，Vβ16out 5′GAT TCT TAG CTG AAA GGA CTG GAG G 3′，Vβ17out 5′GAA GGG TAC AGC GTC TCT CGG GAG AAG 3′，Vβ18out 5′GCC GGC GTC ATG CAG AAC CCA AGA C3′，Vβ20out 5′CTC TCA GCC TCC AGA CCC CAG3′，Vβ21out 5′GCC TGT GGC TTT TTG GTG CAA TC 3′，Vβ22out 5′CAC ACA GAT GGG ACA GGA AG 3′，Vβ23out 5′CCC TGA TCG ATT CTC AGC TCA AC 3′，Vβ24out 5′CGG CCG AAC ACT TCT TTC TG 3′；Vβin PCR引物：Vβ1in 5′CTA AAC CTG AGC TCT CTG G 3′，Vβ2in 5′GCA GCT TCT ACA TCT GCA G 3′，Vβ3in 5′GAT TCT GGA GTC CGC CAG 3′，Vβ4in 5′CAG CAG CAT ATA TCT CTG C 3′，Vβ5.1in 5′GAC TCG GCC CTT TAT CTT TG 3′，Vβ6in 5′GGA GAT CCA GCG CAC AGA G 3′，Vβ7in 5′CCT GAA TGC CCC AAC AGC TC 3′，Vβ8in 5′CCA GCC CTC AGA ACC CAG G 3′，Vβ9in 5′CTG GAG CTT GGT GAC TCT GTG 3′，Vβ11in 5′CCT GGA GTC TGC CAG GCC 3′，Vβ12in 5′CTC ACT CTG GAG TCG CTA C 3′，Vβ13in 5′GAG GAT TTC CCG CTC AGG C 3′，Vβ14in 5′GAG AAG AGG AAT TTC AAT TTC C 3′，Vβ15in 5′GAG TCT GCC ATC CCC AAC 3′，Vβ16in 5′CAG AAC TGG AGG ATT CTG G 3′，Vβ17in 5′CGG CCC AAA AGA ACC CGA CAG C 3′，Vβ18in 5′GTG CGA GGA GAT TCG GCA G 3′，Vβ20in 5′CAG GAC CGG CAG TTC ATC TTC 3′，Vβ21in 5′CCT GCA GAG CTT GGG GAC 3′，Vβ22in 5′CAC TCT GAA GAT CCG GTC C 3′，Vβ23in 5′GAG CTC CTT GGA GCT GGG G 3′，Vβ24in 5′CAT CCG CTC ACC AGG CCT GGG 3′；Cβout 5′CAG GCC TCG GCG CTG ACG ATC TGG GTG AC 3′，3′Cβin*5′GTT TCT TG ATC TCT GCT TCT GAT GGC TCA AAC 3′，*6-FAM labelling；d.将设计的引物和由mRNA合成的cDNA通过两次PCR反应来扩增cDNA，所述两次PCR反应的条件为：第一次反应：变性95℃，45秒；复性60℃，45秒；延伸72℃，45秒，34个循环，72℃10分钟；反应体系为：5′引物10pmol 1μl，3′引物10pmol 1μl，dNTPs 10mM 1μl，10×反应缓冲液 2.5μl，三蒸水 18.75μl，cDNA 0.5μl，Taq DNA聚合酶 0.25μl；第二次反应：变性95℃，30秒；复性60℃，30秒；延伸72℃，30秒，15个循环，72℃10分钟；反应体系为：5′引物10pmol 0.5μl，3′引物10pmol 0.5μl，dNTPs 10mM 1μl，10×反应缓冲液 2.5μl，三蒸水 19.75μl，第一次PCR产物 0.5μl，Taq DNA聚合酶 0.25μl；其中10×反应缓冲液的组分如下：Tris-HCl pH8.3 300mM，MgCl250mM，KCl 25mM，明胶 0.01％；e.将经过两次PCR反应扩增并被荧光标记的T细胞受体基因，与甲酰胺混合后94℃变性，将变性产物置于含6％丙烯酰胺的测序凝胶中，在DNA测序机上运行，得到的数据用ABIPRISMGeneScan分析软件进行分析和量化，通过比较HIV病毒感染者治疗前后CDR3基因图谱的变化，得出药物疗效的评价结果。
通过检测人类T细胞受体TCR基因在治疗前后的 变化来评价治疗HIV药物疗效的方法
技术领域
背景技术
目前普遍采用的方法是用流式细胞记数仪检测T细胞数量的改变。此种方法是采用荧光标记单克隆抗体进行跟踪观察细胞数量的改变情况。然而要观察病人体内细胞的免疫状态，只靠这一细胞表型的定量分析是远远不够的。因此采用分子生物学及分子免疫学技术来观察T细胞内部的细微变化已经成为一个重要检测手段。
T淋巴细胞是通过T细胞受体(TCR)来识别蛋白抗原的特异性的。组成T细胞受体的多肽链包括αβ异二聚γδ异二聚体。其中T细胞受体的β链因其含有非模板依赖的N区序列的插入和D区的存在(ND或NDN)，是TCR重排多样性可独特性的关键区域。因此以检测TCRβ链基因或氨基酸表达频具有临床价值。TCRβ链是由可变区基因(V基因)，多变区基因(D基因)，结合区基因(J基因)及恒区基因(C基因)编码而成的。病毒通常引起一个选择性的Vβ基因家族的改变。已建立的半定量分析方法是采用同位素标记C区基因末端引物定量每一基因家族基因表达的相对百分比。这种定量方法的灵敏度及特异性都较低，而且需要大量的T细胞(1×107细胞)。由V-D-J组成都TCR的互补决定族区(CDR3)是抗原特异的识别区。该区是TCR产生多样性和特异性的关键区。因此可利用重排的T细胞受体基因，作为T细胞克隆的标志。目前研究资料表明，CDR3区段重排或称改变几乎发生在所有的T-细胞介导的免疫病中。检测此区基因及氨基酸的变化在鉴定药物疗效上具有广阔的前景。
发明内容
本发明的上述目的可以通过如下的技术方案来实现。
1.T细胞的采集、分离血样经采集后，用Ficoll-Hypaque分层液分离，得到外周血单个核细胞(PBMC)，再以偶联有CD4或CD8抗体的磁化珠进一步分离出CD4或CD8T细胞。
2.cDNA的合成淋巴细胞的mRNA的分离和提纯的方法是采用已经公布的技术(Chen，Z.W等1994 proc，Matl.Acai.Sci.Usa.91：7501-7505)，将mRNA同1μg任意的hexanucleotides(Promega，美国威斯康星州麦迪逊州)，5μl supertranscriptaseII(GibcoBRL，美国纽约长岛)在37℃混合反应后加热到70℃终止，得到cDNA。
3.TCR基因组引物的设计：首先设计5′端引物。然后在C基因区设计3′端引物。这一引物用于第一步放大之用。
为了更精确地测定当HIV病毒与TCR分子相互作用时，其CDR3区核酸或氨基酸序列的变化，我们设计了一组内侧引物用于TCR分子的CDR3区段图谱分析。在极其靠近CDR3区段V基因区设计22个内侧Vβ基因引物和一个内侧Cβ基因引物。Cβ基因引物采用高灵敏度的荧光(6-FAM)标记。我们首次在C区基因引物的5′端插入七个非模板碱基(GTTTCTT)。
4.PCR反应条件为使得PCR反应具有高度的特异性，不仅需要高度特异的引物，而且在引物浓度上也应严格控制。我们所用的引物浓度只是常规用量的十分之一到二十分之一，即在50μl反应体积中只需2.5pmol。为了防止TaqDNA酶引起的反应物的碱基错配，我们将PCR的循环次数降至15个循环(通常为35-40个循环)。
5.CDR3基因变化的分析经荧光标记的PCR产物连同尺寸标记物与甲酰胺混合后在94℃变性2分钟，将样本置于含6％丙烯酰胺的测序凝胶中，在DNA测序机上运行6小时，将得到的数据用ABIPRISMGeneScan分析软件进行分析和量化，得出相应的结果。
本发明具有如下优点：1.本发明填补了技术领域的空白，是首次用此方法来评价治疗HIV药物的疗效。
2.高度的敏感性，本发明提供的方法可以将T细胞的需求量由约1×107减少到1×105。
3.高度的特异性，本发明提供的方法所用的引物浓度只是常规用量的十分之一到二十分之一。
4.高度的可重复性，本发明提供的方法不仅在同一标本中有高度的重复性，而且在同一病人不同时间采集的样本都呈现出一致的核酸的定位。
附图说明
：图1是Vβ1基因在有效的药物治疗后展示的基因图谱。
图2是Vβ2基因在有效的药物治疗后展示的基因图谱。
图3是Vβ7基因在有效的药物治疗后展示的基因图谱。
a表示未感染HIV病毒时的基因图谱
b表示HIV病毒感染者治疗前的基因图谱c表示HIV病毒感染者治疗后的基因图谱具体实施方式：下面结合实施例详细阐述本发明的具体实施方式：将接受艾滋病药物治疗的患者和健康志愿者的血样分别采集后，用Ficoll-Hypaque分层液分离，水平式离心后，单个核细胞密集在血浆层和分层液的界面中，吸取该层细胞递经洗涤高心重悬，得到PBMC。再以偶联有CD4或CD8抗体的磁化珠进一步分离出CD4或CD8T细胞。
T细胞的mRNA的分离和提纯的方法是采用已经公布的技术(Chen，Z.W等1994 proc，Matl.Acai.Sci.Usa.91：7501-7505)，将mRNA同1μg任意的hexanucleotides(Promega，美国威斯康星州麦迪逊州)，5μl supertranscriptaseII(Gibco BRL，美国纽约长岛)总的体积控制在20μl，在37℃混合1小时后加热到70℃10分钟终止反应，得到cDNA。
引物设计如附表1所示。
PCR参数设计如下：第一次反应：变性95℃，45秒；复性60℃，45秒；延伸72℃，45秒，34个循环，72℃10分钟。
第二次反应：变性95℃，30秒；复性60℃，30秒；延伸72℃，30秒，15个循环，72℃10分钟。
其中10x反应缓冲液*的组分如下，
反应完成后，用荧光标记的PCR产物连同尺寸标记物与甲酰胺混合后在94℃变性2分钟，将样本置于含6％丙烯酰胺的测序凝胶中，在DNA测序机上运行6小时，将得到的数据通过使用ABIPRISMGeneScan分析软件进行分析，得出相应的结果。
采用此技术我们已对50例HIV病毒感染的病人与20例正常人进行比较测定，结果表明，HIV感染的病人与正常人相比其TCR基因图谱有显著性差异(P＜0.001)。图1图2图3是3个代表性Vβ基因家族在有效的药物治疗后展示的基因图谱。由图可见治疗前基因图谱为克隆化增殖，只有一个主要的峰，而经有效药物治疗后则完全恢复到正常的分布状态。由此可见，此项技术在评价药物疗效方面是十分成功的。
表1人类TCR Vβ和Cβ引物
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