结构域抗体构建体
阅读：153发布：2021-03-20
专利汇可以提供结构域抗体构建体专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供了与人TNF－α结合的结构域 抗体 构建体，所述构建体包含：(a)与人TNF－α结合的结构域抗体(dAb)；(b)经修饰的 铰链 区序列；(c)人或灵长类重链恒定区序列，其具有不多于20个残基的截短的CH1结构域，其中所述经修饰的铰链区序列包含缺失或者至少一个半胱 氨 酸残基的单氨基酸置换，所述半胱氨酸残基通常促进重和轻抗体链间二硫键的形成。，下面是结构域抗体构建体专利的具体信息内容。
1.与人TNF-α结合的结构域抗体构建体，所述构建体包含：
(a)与人TNF-α结合的结构域抗体(dAb)；
(b)经修饰的铰链区序列；
(c)人或灵长类重链恒定区序列，其具有不多于20个残基的截短 的CH1结构域，
其中所述经修饰的铰链区序列包含缺失或者至少一个半胱氨酸残 基的单氨基酸置换，所述半胱氨酸残基通常促进重和轻抗体链间二硫 键的形成。
2.权利要求1的结构域抗体构建体，其中所述具有截短的CH1结 构域的人或灵长类重链恒定区序列包含不多于10个残基。
3.权利要求2的结构域抗体构建体，其中所述具有截短的CH1结 构域的人或灵长类重链恒定区序列包含不多于5个残基。
4.权利要求3的结构域抗体构建体，其中所述具有截短的CH1结 构域的人或灵长类重链恒定区序列包含不多于单个残基。
5.权利要求1至4中任一项的结构域抗体构建体，其中CH1结构 域和铰链区的序列为XEPKSZDKTHTCPPCPA(SEQ ID No：64)，其中X 为缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸，和Z不存在或为除半胱氨酸以外的其 他氨基酸。
6.权利要求5的结构域抗体构建体，其中X为缬氨酸，和Z为丝 氨酸。
7.权利要求1至6中任一项的结构域抗体构建体，其中所述dAb 包含免疫球蛋白重链或轻链可变结构域，其中所述可变结构域包含至 少一个具有来源于新世界灵长类的序列的互补决定区(CDR)，其中所 述CDR选自YAATKLQS(SEQ ID No：1)、YEASSLQS(SEQ ID No：2)、 YEASKLQS(SEQ ID No：3)和YSASNLET(SEQ ID No：4)。
8.权利要求7的结构域抗体构建体，其中所述CDR为CDR2。
9.权利要求1至8中任一项的结构域抗体构建体，其中所述结构 域抗体具有选自下列的序列：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIDSYLHWYQQKPGKAPKLLIYSASNLETG
VPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQVVWRPFTFGQGTKVEIKR
(SEQ ID No：7)；
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQAIDSYLHWYQQKPGKAPKLLIYSASNLET
GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQVVWRPFTFGQGTKVEIKR
(SEQ ID No：8)；
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIDSYLHWYQQKPGKAPKLLIYSASNLETG
VPSRFSGSGSGTDFTLTISSLLPEDFATYYCQQVVWRPFTFGQGTKVEIKR
(SEQ ID No：9)；
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQAIDSYLHWYQQKPGKAPKLLIYSASNLET
GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLLPEDFATYYCQQVVWRPFTFGQGTKVEIKR
(SEQ ID No：10)；
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIDSYLHWYQQKPGKPPKLLIYSASNLETG
VPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQVVWRPFTFGQGTKVEIKR
(SEQ ID No：52)；
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIDSYLHWYQQKPGKAPKLLIYSASNLETG
VPSRFSGRGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQVVWRPFTFGQGTKVEIKR
(SEQ ID No：53)；
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIDSYLHWYQQKPGKAPKLLIYSASNLETG
VPSRFSGSGSGTDFTLTISSLVPEDFATYYCQQVVWRPFTFGQGTKVEIKR
(SEQ ID No：54)；和
与这些序列之一至少95％同一的序列。
10.权利要求1至9中任一项的结构域抗体构建体，其中用丝氨 酸残基置换在铰链区内的半胱氨酸残基，所述半胱氨酸残基通常促进 重和轻抗体链间二硫键的形成。
11.权利要求1至10中任一项的结构域抗体构建体，其中所述铰 链区包含序列EPKSSDKTHTCPPCPA(SEQ ID No：12)。
12.权利要求1至11中任一项的结构域抗体构建体，其中所述恒 定区包含与SEQ ID No：63所示序列至少60％同一的CH2和CH3结构域。
13.权利要求12的结构域抗体构建体，其中所述CH2和CH3结构 域与SEQ ID No：63所示序列至少80％同一。
14.权利要求13的结构域抗体构建体，其中所述CH2和CH3结构 域与SEQ ID No：63所示序列至少90％同一。
15.权利要求14的结构域抗体构建体，其中所述CH2和CH3结构 域与SEQ ID No：63所示序列至少95％同一。
16.权利要求15的结构域抗体构建体，其中所述CH2和CH3结构 域与SEQ ID No：63所示序列至少96％同一。
17.权利要求16的结构域抗体构建体，其中所述CH2和CH3结构 域与SEQ ID No：63所示序列至少97％同一。
18.权利要求17的结构域抗体构建体，其中所述CH2和CH3结构 域与SEQ ID No：63所示序列至少98％同一。
19.权利要求18的结构域抗体构建体，其中所述CH2和CH3结构 域与SEQ ID No：63所示序列至少99％同一。
20.权利要求1至19中任一项的结构域抗体构建体，其中CDR1、 CDR3或至少一个构架区被修饰以改善抗原结合。
21.权利要求1至20中任一项的结构域抗体，其中所述氨基酸序 列与SEQ ID No：11所示序列至少60％同一。
22.权利要求21的结构域抗体，其中所述氨基酸序列与SEQ ID No： 11所示序列至少80％同一。
23.权利要求22的结构域抗体，其中所述氨基酸序列与SEQ ID No： 11所示序列至少90％同一。
24.权利要求23的结构域抗体，其中所述氨基酸序列与SEQ ID No： 11所示序列至少95％同一。
25.权利要求24的结构域抗体，其中所述氨基酸序列与SEQ ID No： 11所示序列至少96％同一。
26.权利要求25的结构域抗体，其中所述氨基酸序列与SEQ ID No： 11所示序列至少97％同一。
27.权利要求26的结构域抗体，其中所述氨基酸序列与SEQ ID No： 11所示序列至少98％同一。
28.权利要求27的结构域抗体，其中所述氨基酸序列与SEQ ID No： 11所示序列至少99％同一。
29.权利要求28的结构域抗体，其中所述氨基酸序列与SEQ ID No： 11所示序列相同。
30.权利要求1至29中任一项的结构域抗体构建体，其中所述结 构域抗体在人中具有低免疫原性。
31.与人TNF-α结合的二聚结构域抗体构建体，其中该二聚体由 两个权利要求1至30中任一项的结构域抗体构建体组成。
32.权利要求31的二聚结构域抗体构建体，其中所述二聚结构域 抗体构建体是同二聚体。
33.权利要求32的二聚结构域抗体构建体，其中组成同二聚体的 所述结构域抗体构建体包含与SEQ ID No：11所示序列至少60％同一 的氨基酸序列。
34.权利要求33的二聚结构域抗体构建体，其中组成同二聚体的 所述结构域抗体构建体包含与SEQ ID No：11所示序列至少80％同一 的氨基酸序列。
35.权利要求34的二聚结构域抗体构建体，其中组成同二聚体的 所述结构域抗体构建体包含与SEQ ID No：11所示序列至少90％同一 的氨基酸序列。
36.权利要求35的二聚结构域抗体构建体，其中组成同二聚体的 所述结构域抗体构建体包含与SEQ ID No：11所示序列至少95％同一 的氨基酸序列。
37.权利要求36的二聚结构域抗体构建体，其中组成同二聚体的 所述结构域抗体构建体包含与SEQ ID No：11所示序列至少96％同一 的氨基酸序列。
38.权利要求37的二聚结构域抗体构建体，其中组成同二聚体的 所述结构域抗体构建体包含与SEQ ID No：11所示序列至少97％同一 的氨基酸序列。
39.权利要求38的二聚结构域抗体构建体，其中组成同二聚体的 所述结构域抗体构建体包含与SEQ ID No：11所示序列至少98％同一 的氨基酸序列。
40.权利要求39的二聚结构域抗体构建体，其中组成同二聚体的 所述结构域抗体构建体包含与SEQ ID No：11所示序列至少99％同一 的氨基酸序列。
41.权利要求40的二聚结构域抗体构建体，其中组成同二聚体的 所述结构域抗体构建体包含SEQ ID No：11所示的氨基酸序列。
42.分离的核酸分子，其编码权利要求1至30中任一项的结构域 抗体构建体。
43.分离的核酸分子，其包含编码与人TNF-α结合的结构域抗体 构建体的核酸序列，其中所述核酸序列与SEQ ID No：50或SEQ ID No： 51所示序列至少60％同一。
44.权利要求43的分离的核酸分子，其中所述核酸序列与SEQ ID No：50或SEQ ID No：51所示序列至少80％同一。
45.权利要求44的分离的核酸分子，其中所述核酸序列与SEQ ID No：50或SEQ ID No：51所示序列至少90％同一。
46.权利要求45的分离的核酸分子，其中所述核酸序列与SEQ ID No：50或SEQ ID No：51所示序列至少95％同一。
47.权利要求46的分离的核酸分子，其中所述核酸序列与SEQ ID No：50或SEQ ID No：51所示序列至少96％同一。
48.权利要求47的分离的核酸分子，其中所述核酸序列与SEQ ID No：50或SEQ ID No：51所示序列至少97％同一。
49.权利要求48的分离的核酸分子，其中所述核酸序列与SEQ ID No：50或SEQ ID No：51所示序列至少98％同一。
50.权利要求49的分离的核酸分子，其中所述核酸序列与SEQ ID No：50或SEQ ID No：51所示序列至少99％同一。
51.权利要求50的分离的核酸分子，其中所述核酸序列与SEQ ID No：50或SEQ ID No：51所示序列相同。
52.分离的核酸分子，其包含编码与人TNF-α结合的结构域抗体 构建体的核酸序列，其中所述核酸序列在高严紧度条件下与SEQ ID No： 50或SEQ ID No：51所示的核苷酸杂交。
53.药物组合物，其包含有效量的权利要求1至30中任一项的结 构域抗体构建体，以及药学上可接受的载体或稀释剂。
54.药物组合物，其包含有效量的权利要求31至41中任一项的 二聚结构域抗体构建体，以及药学上可接受的载体或稀释剂。
55.用于检测样品中的人TNF-α的方法，其包括将样品与有效量 的权利要求1至41中任一项的结构域抗体构建体进行接触，和检测所 结合的结构域抗体构建体的量。
56.权利要求55的方法，其中所述样品为生物样品。
57.用于在人受试者中治疗特征在于人TNF-α活性的病症的方 法，其包括给所述受试者施用有效量的权利要求55或权利要求56的 药物组合物。
58.权利要求57的方法，其中所述特征在于人TNF-α活性的病 症选自炎症，炎性疾病，脓毒症，包括败血症性休克、内毒素性休克、 革兰氏阴性脓毒症和中毒性休克综合征；自身免疫性疾病，包括类风 湿性关节炎、幼年关节炎、类风湿性脊椎炎、强直性脊椎炎、舍格伦 综合征、骨关节炎和痛风性关节炎、过敏症、多发性硬化症、自身免 疫性糖尿病、自身免疫性葡萄膜炎、银屑病、类天疱疮以及肾病综合 征；眼的炎性病况，包括黄斑变性、葡萄膜炎、贝赫切特病；感染性 疾病，包括由于感染和感染后继发的恶病质所引起的发热和肌痛；移 植物抗宿主病；肿瘤生长或转移，恶性血液病；肺部病症，包括哮喘、 成人呼吸窘迫综合征、休克肺、慢性肺部炎性疾病、肺结节病、肺纤 维化和矽肺；炎症性肠病，包括克罗恩病和溃疡性结肠炎；心脏病症， 充血性心力衰竭；血管病症，包括韦格纳病、巨细胞动脉炎；炎症性 骨病；中枢神经系统病症，例如阿尔茨海默病；周围神经系统病症， 例如坐骨神经痛；肝炎，凝血障碍，烧伤，再灌注损伤，子宫内膜异 位症，瘢痕瘤形成，和瘢痕组织形成。
59.权利要求57或权利要求58的方法，其中所述特征在于人 TNF-α活性的病症为血管生成相关的眼病症。
60.权利要求59的方法，其中所述血管生成相关的眼病症为年龄 相关性黄斑变性。
发明领域
本发明涉及可用于人类治疗的结构域抗体构建体。更具体而言， 本发明涉及与人TNF-α结合的结构域抗体构建体以及其在治疗特征 在于TNF-α活性的病症中的用途。
发明背景
肿瘤坏死因子α(TNF-α)是参与介导休克和多种人类疾病和病 症的病理生理学的一种细胞因子，所述人类疾病和病症包括脓毒症、 感染、自身免疫性疾病例如类风湿性关节炎、克罗恩病、溃疡性结肠 炎和其它肠病况、银屑病、中毒性休克、移植排斥以及移植物抗宿主 病。TNF-α主要由激活的巨噬细胞和T淋巴细胞产生，但在急性炎症 反应过程中也由嗜中性粒细胞、内皮细胞、角质形成细胞和成纤维细 胞产生。
由于其在炎症中的作用，在减轻炎性病症的症状的努力中，TNF- α已作为重要的用于抑制的靶标而显露出来。已追求了多种为了疾病 的临床治疗而抑制TNF-α的方法，特别是包括可溶性TNF-α受体和特 异于TNF-α的抗体的用途。
结构域抗体
结构域抗体(dAb)是抗体的最小功能性结合单元，并且相应于抗 体的重链可变区(VH)或轻链可变区(VL)。结构域抗体具有约13kDa 的分子量，或小于完整抗体大小的十分之一。
与常规抗体不同，结构域抗体在细菌、酵母和哺乳动物系统中良 好表达。它们的小尺寸允许更高的摩尔量/克产物，从而提供了效力/ 毫克剂量的显著增加。此外，dAb可以用作构建部件，以制备治疗产 物例如多重靶向性的包含dAb的分子，其中两个或更多个dAb结合至 两个或更多个不同的分子靶，或者可以将dAb合并入为肺或口服施用 而设计的结构中。
本发明者现在已设计出一种新的包含免疫球蛋白可变结构域的结 构域抗体构建体，所述可变结构域连接至包括有截短的CH1结构域的 恒定区。推测包含恒定区有助于延长通常具有短的持续时间的dAb的 体内半衰期。
新世界灵长类免疫球蛋白
进化上遥远的灵长类，例如新世界灵长类，足够类似于人以具有 类似于人抗体的抗体，从而使得当衍生自此类灵长类的抗体被引入人 中时，宿主不产生抗抗体免疫应答。新世界灵长类(广鼻猴下目 (Platyrrhini))包含至少53个种，其通常分成2个科：狨科 (Callithricidae)和悬猴科(Cebidae)。狨科由狨和组成。悬 猴科包括松鼠猴、青猴、蜘蛛猴、绒毛猴、悬猴、夜或枭猴和吼猴。
先前的研究已表征了表达的普通狨(Callithrix jacchus)的免 疫球蛋白重链储库(von Budingen H-C等人，Characterization of the expressed immunoglobulin IGHV repertoire in the New World marmoset Callithrix jacchus.Immunogenetics；53：557-563 (2001))。鉴定了6个IGHV亚群，其显示了与它们的人IGHV对应物 的高度序列相似性。当与互补决定区(CDR)相比较时，构架区是更保 守的，其中最高程度的可变性位于CDR3中。普通狨与人IGHV序列之 间的相似性程度小于旧世界灵长类与人之间的相似性程度。
发明概述
第一方面，本发明提供了与人TNF-α结合的结构域抗体构建体， 所述构建体包含：
(a)与人TNF-α结合的结构域抗体(dAb)；
(b)经修饰的铰链区序列；
(c)人或灵长类重链恒定区序列，其具有不多于20个残基，更优 选地不多于10个残基，更加优选地不多于5个残基和更为优选地单个 残基的截短的CH1结构域，
其中所述经修饰的铰链区序列包含缺失或者半胱氨酸残基的单氨 基酸置换，所述半胱氨酸残基通常促进重和轻抗体链间二硫键的形成。
第二方面，本发明提供了编码本发明第一方面的结构域抗体构建 体的核酸序列。
第三方面，本发明提供了分离的核酸分子，其包含编码与人TNF- α结合的结构域抗体构建体的序列，其中所述核酸分子包含与SEQ ID No：50或SEQ ID No：51所示的序列至少60％同一的，优选地至少80％ 同一的，更优选地至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一的核酸序 列，和最优选地包含SEQ ID No：50或SEQ ID No：51所示的序列。
第四方面，本发明提供了分离的核酸分子，其包含编码与人TNF- α结合的结构域抗体构建体的序列，其中所述核酸分子包含与SEQ ID No：50或SEQ ID No：51所示核苷酸序列在高严紧度条件下杂交的核 酸序列。
第五方面，本发明提供了药物组合物，其包含有效量的根据第一 方面的结构域抗体构建体，以及药学上可接受的载体或稀释剂。
第六方面，本发明提供了根据本发明第一方面的结构域抗体构建 体在检测人TNF-α的诊断应用中的用途。
第七方面，本发明提供了用于在人受试者中治疗特征在于人TNF- α活性的病症的方法，其包括给所述受试者施用根据本发明第二方面 的药物组合物。
附图简述
图1显示了接纳体(acceptor)dAb的氨基酸序列(SEQ ID No：5) 和核苷酸序列(SEQ ID No：6)。
图2显示了本发明的结构域抗体构建体的优选实施方案的结构， 作为(A)单体和(B)二聚体。
图3显示了十一个(11)狨和六个(6)枭猴Vκ基因区段的核苷 酸和氨基酸序列。
图4显示了接纳体dAb的氨基酸序列和核苷酸序列(两条链)。 图中标示了KpnI和SanDI的限制性消化位点，其切出包含CDR2的区 域。被除去的CDR2残基以下划线标示。
图5显示了化合物170(SEQ ID No：11)在鼠类L929细胞生存 力测定法中中和TNF-α介导的细胞毒性的能力。
图6显示了，化合物170(SEQ ID No：11)阻止TNF-α与人p55 或p75 TNF受体的相互作用。
图7显示了，表达跨膜TNF-α的NSO 27D4细胞(黑色实线)的 化合物170(SEQ ID No：11)染色显现出比不相关特异性同种型-匹 配的对照(irrelevant specificity isotype-matched control)(灰 色填充)更高的荧光强度。
图8显示了在细菌表达系统中产生的化合物170(SEQ ID No：11) 在ELISA中保持与TNF-α的结合。
图9显示了相对于特异性对照人IgG1而言，化合物170(SEQ ID No：11)在TNF介导的鼠关节炎模型中的功效。以每周一次的间隔对 小鼠进行评分(关节炎得分)(A)，和称重(B)。
图10显示了对化合物112(SEQ ID No：59)和化合物170(SEQ ID No：11)的蛋白质表达的影响。
图11显示了化合物170(SEQ ID No：11)的非还原性SDS PAGE 分析，所述化合物170来自4×10L先导细胞系(lead cell line) 发酵并经蛋白A纯化。泳道1＝测定法间对照；泳道2＝分子量标 准参照物；泳道3＝空白；泳道4＝经蛋白A纯化的在10L发酵ID (运行1)中的化合物170(SEQ ID No：11)；泳道5＝经蛋白A纯 化的在10L发酵ID(运行2)中的化合物170；泳道6＝经蛋白A 纯化的在10L发酵ID(运行3)中的化合物170；泳道7＝经蛋白A 纯化的在10L发酵ID(运行4)中的化合物170。
图12显示了化合物170(SEQ ID No：11)的还原性SDS PAGE分 析，所述化合物170来自4×10L先导细胞系(lead cell line)发 酵并经蛋白A纯化。泳道1＝测定法间对照；泳道2＝分子量标准 参照物；泳道3＝空白；泳道4＝经蛋白A纯化的在10L发酵ID (运行1)中的化合物170(SEQ ID No：11)；泳道5＝经蛋白A纯 化的在10L发酵ID(运行2)中的化合物170；泳道6＝经蛋白A 纯化的在10L发酵ID(运行3)中的化合物170；泳道7＝经蛋白A 纯化的在10L发酵ID(运行4)中的化合物170。
发明详述
本发明者已产生了结构域抗体构建体，其与人TNF-α结合并且被 推测当给人施用时展现出低免疫原性。该结构域抗体构建体包含相应 于免疫球蛋白重链或轻链可变结构域(即结构域抗体(dAb))的部分、 铰链区和相应于抗体重链恒定区的部分，但其中所述恒定区具有截短 的CH1结构域。
推测包含恒定区部分能增加dAb的体内半衰期，以及提供效应子 功能，所述效应子功能被认为是抗TNF抗体的抗炎机制的组成部分。
第一方面，本发明提供了与人TNF-α结合的结构域抗体构建体， 所述构建体包含：
(a)与人TNF-α结合的结构域抗体(dAb)；
(b)经修饰的铰链区序列；
(c)人或灵长类重链恒定区序列，其具有不多于20个残基，更优 选地不多于10个残基，更加优选地不多于5个残基和更为优选地单个 残基的截短的CH1结构域，
其中所述经修饰的铰链区序列包含缺失或者半胱氨酸残基的单氨 基酸置换，所述半胱氨酸残基通常促进重和轻抗体链间二硫键的形成。
在一个优选的实施方案中，CH1结构域和铰链区为 XEPKSZDKTHTCPPCPA，其中X为缬氨酸、亮氨酸或异亮苷酸，和Z不存 在或为除半胱氨酸以外的其他氨基酸。优选地，X为缬氨酸，和Z为 丝氨酸。
在本发明的一个优选实施方案中，所述dAb包含免疫球蛋白重链 或轻链可变结构域，其中所述可变结构域包含至少一个具有来源于新 世界灵长类的序列的互补决定区(CDR)，其中所述CDR选自YAATKLQS (SEQ ID No：1)、YEASSLQS(SEQ ID No：2)、YEASKLQS(SEQ ID No：3)和YSASNLET(SEQ ID No：4)。
在另一优选的实施方案中，所述CDR为CDR2。
在一个优选的实施方案中，dAb具有选自下列的序列：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIDSYLHWYQQKPGKAPKLLIYSASNLETG
VPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQVVWRPFTFGQGTKVEIKR
(化合物145；SEQ ID No：7)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQAIDSYLHWYQQKPGKAPKLLIYSASNLET
GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQVVWRPFTFGQGTKVEIKR
(化合物123；SEQ ID No：8)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIDSYLHWYQQKPGKAPKLLIYSASNLETG
VPSRFSGSGSGTDFTLTISSLLPHDFATYYCQQVVWRPFTFGQGTKVEIKR
(化合物100；SEQ ID No：9)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQAIDSYLHWYQQKPGKAPKLLIYSASNLET
GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLLPEDFATYYCQQVVWRPFTFGQGTKVEIKR
(化合物196；SEQ ID No：10)
DIQMTQSPSSLSASVGDRYTITCRASQSIDSYLHWYQQKPGKPPKLLIYSASNLETG
VPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQVVWRPFTFGQGTKVEIKR
(化合物134；SEQ ID No：52)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIDSYLHWYQQKPGKAPKLLIYSASNLETG
VPSRFSGRGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQVVWRPFTFGQGTKVEIKR
(化合物137；SEQ ID No：53)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIDSYLHWYQQKPGKAPKLLIYSASNLETG
VPSRFSGSGSGTDFTLTISSLVPEDFATYYCQQVVWRPFTFGQGTKVEIKR
(化合物121；SEQ ID No：54)；和
与这些序列之一至少95％，更优选地至少96％、97％、98％或99％同一的 序列。
在进一步的优选实施方案中，所述恒定区包含CH2和CH3结构域， 其一起具有下列序列：
PELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHN
AKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKG
QPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPV
LDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK；
(SEQ ID NO：63)
或者与其至少60％同一的，优选地至少80％同一的，更优选地至少90％、 95％、96％、97％、98％或99％同一的氨基酸序列。
在另一个优选的实施方案中，所述结构域抗体构建体包含与SEQ ID No：11所示的序列至少60％同一的，优选地至少80％同一的，更优 选地至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一的氨基酸序列，和最优 选地包含SEQ ID No：11所示的序列。
此处所用的术语“与......结合”意指抗原被免疫球蛋白可变区 以1μM或更低的解离常数(Kd)进行结合，如使用例如BIAcoreTM表 面等离子体共振系统和BIAcoreTM动力学评估软件(例如，2.1版)通 过表面等离子体共振分析所测量的。特异性结合相互作用的亲和力或 解离常数(Kd)优选地为约500nM或更低，更优选地约300nM或更 低，以及优选地至少300nM至50pM，200nM至50pM，和更优选地 至少100nM至50pM，75nM至50pM，10nM至50pM。此处所用的 术语“dAb”指与抗原特异性地结合的抗体单可变结构域(VH或VL)多 肽。
在本发明的一个进一步的优选实施方案中，结构域抗体构建体与 另一个根据本发明的结构域抗体构建体形成同或异二聚体。二聚化能 够增加抗原结合的强度，其中所述结合的强度与多个结合位点的结合 亲和力总和有关。为了促进二聚体的形成，结构域抗体构建体的铰链 区包含至少一个，和优选地两个半胱氨酸残基。
在本发明的一个特别优选的实施方案中，结构域抗体构建体和一 个相同的结构域抗体构建体形成同二聚体。
因此，在另一个方面中，本发明提供了与人TNF-α结合的二聚结 构域抗体构建体，其中所述二聚体由两个根据本发明的结构域抗体构 建体组成。
优选的是，二聚结构域抗体构建体为同二聚体，并且特别优选的 是，组成同二聚体的所述结构域抗体构建体包含与SEQ ID No：11所 示的序列至少60％同一的，优选地至少80％同一的，更优选地至少90％、 95％、96％、97％、98％或99％同一的氨基酸序列，和最优选地包含SEQ ID No：11所示的序列。
第二方面，本发明提供了编码本发明第一方面的结构域抗体构建 体的核酸序列。
第三方面，本发明提供了分离的核酸分子，其包含编码与人TNF- α结合的结构域抗体构建体的序列，其中所述核酸分子包含与SEQ ID No：50或SEQ ID No：51所示的序列至少60％同一的，优选地至少80％ 同一的，更优选地至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一的核酸序 列，和最优选地包含SEQ ID No：50或SEQ ID No：51所示的序列。
第四方面，本发明提供了分离的核酸分子，其包含编码与人TNF- α结合的结构域抗体构建体的序列，其中所述核酸分子包含与SEQ ID No：50或SEQ ID No：51所示核苷酸序列在高严紧度条件下杂交的核 酸序列。
在确定两个多肽序列是否落在同一性百分比限度内时，本领域技 术人员将会意识到必须进行并列比较或者序列的多重比对。在这样的 比较或比对中，差异将在不相同的残基的定位中出现，这取决于用来 进行比对的算法。在本文本中，提及两个或更多个氨基酸序列之间的 “同一性百分比”或者“相似性”应被视为分别指所述序列之间相同 的或相似的残基的数目，如用本领域技术人员已知的任何标准算法所 测定的。例如，氨基酸序列同一性或相似性可以用GAP程序进行计算 和/或用PILEUP程序(Computer Genetics Group，Inc.，University Research Park，Madison，Wisconsin，United States of America) (Devereaux等人，1984)进行比对。GAP程序使用了Needleman和 Wunsch(1970)的算法来使相同的/相似的残基的数目最大化并使在比 对中序列缺口的数目和长度最小化。备选地或者另外地，当比较多于 两个的氨基酸序列时，可以使用Thompson等人(1994)的Clustal W 程序。
在确定两个核苷酸序列是否落在这些百分比限度内时，本领域技 术人员将会意识到必须进行并列比较或者序列的多重比对。在这样的 比较或比对中，差异可在不相同的残基的定位中出现，这取决于用来 进行比对的算法。在本文本中，提及两个或更多个核苷酸序列之间的 “同一性百分比”应被视为指所述序列之间相同的残基的数目，如用 本领域技术人员已知的任何标准算法所测定的。例如，可以采用 BESTFIT程序或者其它合适的程序(Computer Genetics Group，Inc.， University Research Park，Madison，Wisconsin，United States of America)(Devereaux等人，Nucl.Acids Res.，12：387-395，1984) 来对核苷酸序列进行比对并计算它们的同一性。
高严紧度优选涉及在65℃和0.1×SSC(1×SSC＝0.15M NaCl， 0.015M柠檬酸钠，pH7.0)的条件下的杂交。
在一个实施方案中，本发明还基于用于扩增新世界灵长类免疫球 蛋白可变区基因的方法，例如使用对于重链和轻链可变区基因家族特 异的引物通过聚合酶链式反应(PCR)从提取自新世界灵长类淋巴细胞 的核酸中进行扩增。例如，关于重链和轻链可变结构域基因(分别为 VH和VL)的边界的信息可以用于设计PCR引物，所述引物从经克隆的 重链或轻链编码序列中扩增可变结构域，所述重链或轻链编码序列编 码已知与给定抗原相结合的抗体。然后，将扩增的可变区单独地或者 作为与另一本发明的人或灵长类恒定区多肽序列的融合物插入合适的 表达载体中，以产生本发明的结构域抗体构建体。合适的表达载体将 是本领域技术人员所熟知的。
VH、VL和恒定区结构域储库可以是天然存在的免疫球蛋白序列储 库或合成的储库。天然存在的储库是例如从表达免疫球蛋白的细胞制 备的储库，所述表达免疫球蛋白的细胞从一种或多种灵长类中收获。 此类储库可以是原初的()，即从新生的表达免疫球蛋白的细胞 制备，或者是重排的，即从例如成年灵长类B细胞制备。需要时，随 后对从天然储库或任何储库中鉴定的结合靶抗原的克隆实施诱变并进 一步进行筛选，以产生和选择具有改善的结合特征的变体。
单个免疫球蛋白可变结构域的合成储库是通过向经克隆的可变结 构域中人工引入多样性来制备的。
可以通过例如噬菌体展示，就所希望的结合特异性和功能行为来 筛选VH和VL结构域储库。用于构建噬菌体展示文库和λ噬菌体表达文 库的方法在本领域中是众所周知的。噬菌体展示技术已在本领域中进 行了广泛描述，以及用于产生和筛选这样的文库以及对它们的产物进 行亲和力成熟的方法和化合物的例子可以在例如下列文献中找到： Barbas等人，(1991)PNAS 88：7978-7982；Clarkson等人.(1991) Nature 352：624-628；Dower等人，PCT.91/17271，美国专利号 5,427,908，美国专利号5,580,717和EP 527,839；Fuchs等人，(1991) Bio/Technology 9：1370-1372；Garrad等人，(1991)Bio/Technology 9：1373-1377；Garrard等人，PCT WO 92/09690；Gram等人，(1992) PNAS 89：3576-3580；Griffiths等人，(1993)EMBO J 12：725-734； Griffiths等人，美国专利号5,885,793和EP 589,877；Hawkins等 人，(1992)J Mol Biol 226：889-896；Hay等人，(1992)Hum Autibod Hybridomas 3：81-85；Hoogenboom等人，(1991)Nuc Acid Res 19： 4133-4137；Huse等人，(1989)Science 246：1275-1281；Knappik 等人，(2000)J Mol Biol 296：57-86；Knappik等人，PCT WO 97/08320； Ladner等人，美国专利号5,223,409，5,403,484，5,571,698， 5,837,500和EP 436,597；McCafferty等人，(1990)Nature 348： 552-554；McCafferty等人，PCT.WO 92/01047，美国专利号 5,969,108和EP 589,877；Salfeld等人，PCT WO 97/29131，美国临 时申请号60/126,603；和Winter等人，PCT WO 92/20791和EP 368,684。
表达VH和VL结构域储库的重组文库可以在微生物例如酵母或细菌 的表面上进行表达(参见PCT公开WO 99/36569和98/49286)。
本发明的结构域抗体构建体可以通过重组方法来产生，包括从真 核表达系统中产生，所述真核表达系统包括例如酵母、高等植物、昆 虫和哺乳动物细胞，以及真菌表达系统和病毒编码的表达系统，如此 处所描述的或者本领域已知的。
本发明的结构域抗体构建体可以用S抗体编码核酸来制备，以便 提供转基因植物和培养的植物细胞(例如，但不限于，烟草和玉米)， 其在植物的某些部位中或者在由其培养出的细胞中产生这样的构建 体。作为非限制性的例子，表达重组蛋白质的转基因烟草叶已被成功 用于提供大量的重组蛋白质，例如，采用诱导型启动子(参见例如， Cramer等人，Curr.Top.Microbol.Immunol.240：95-1181999) 和其中所引用的参考文献。此外，转基因玉米也已经用于以商业生产 水平来表达哺乳动物蛋白质，其生物活性等价于在其他重组系统中生 产的或者从天然来源中纯化的蛋白质(参见例如，Hood等人，Adv.Exp. Med.Biol.464：127-147 1999和其中所引用的参考文献)。也已从 转基因植物种子(包括烟草种子和马铃薯块茎)中大量生产抗体，包 括抗体片段例如单链抗体(scFv′s)(参见例如，Conrad等人，Plant Mol.Biol.38：101-109， 1998和其中所引用的参考文献)。因此， 本发明的结构域抗体构建体也可以根据已知的方法用转基因植物来生 产(也参见例如，Fischer等人，Biotechnol.Appl.Biochem.30： 99-108 October，1999；Ma & Hein.，Trends Biotechnol.13：522-7 1995；Ma等人，Plant Physiol.109：341-61995；Whitelam等人， Biochem.Soc.Trans.22：940-944 1994；和其中所引用的参考文 献；以上每一篇参考文献在此通过提及而整体合并入本文)。
本发明的结构域抗体构建体包括天然纯化的产物、化学合成方法 的产物和通过重组技术从真核宿主(包括例如酵母、高等植物、昆虫 和哺乳动物细胞)中产生的产物。取决于在重组生产方法中所采用的 宿主，本发明的抗体构建体可以是糖基化的或者非糖基化的，其中优 选是糖基化的。这样的方法在许多标准的实验室手册中已有描述， Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版， Cold Spring Harbor，N.Y.1989，第17.37-17.42节；Ausubel等人， 编辑，Current Protocols in Molecular Biology 1987-1993，第10， 12，13，16，18和20章；Colligan等人，Current Protocols in Protein Science，John Wiley & Sons，NY，N.Y.1997-2001，Protein Science，第12-14章，所有文献在此通过提及而整体合并入本文。
在一种表达系统中，在核糖体上展示重组肽/蛋白质文库(例如参 见Roberts，RW和Szostak，J.W.1997.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.94： 12297-123202以及PCT公开号WO 98/31700)。因此，另一个例子涉 及DNA文库(例如，优选从经免疫的细胞制备的抗体或衍生物的DNA 文库，但不限于此)的产生和体外转录，翻译该文库，从而使得蛋白 质和“经免疫的”mRNA停留在核糖体上，亲和力选择(例如通过与RSP 结合)，mRNA分离，反向翻译和后续扩增(例如通过聚合酶链式反应 或相关技术)。必要时可以偶联另外的选择和扩增循环，以通过在这 种系统中引入体细胞突变或通过现有技术中已知的其他亲和力成熟方 法来进行亲和力成熟。
另一个例子考虑应用乳状液区室化技术(emulsion compartmentalisation technology)以产生本发明的结构域抗体。 在乳状液区室化中，将体外和光学分选方法与在乳状液的油滴内的水 相中翻译的蛋白质及其核苷酸编码序列的共区室化相组合(参见PCT 公开号WO 99/026711和WO00/40712)。
CDR序列可以得自几个来源，例如数据库，如国家生物技术信息 中心(National Centre for Biotechnology Information)蛋白质 和核苷酸数据库(www.ncbi.nlm.nih.gov)，The Kabat Database of Sequences of Proteins of Immunological Interest (www.kabatdatabase.com)，或IMGT数据库(www.imgt.cines.fr)。 备选地，可以从VH和VL结构域储库预测CDR区(参见例如Kabat EA 和Wu TT，Attempts to locate complementarity determining residues in the variable positions of light and heavy chains. Ann.NY Acad.Sci.190：382-393(1971))。CDR序列可以是基因组 DNA或cDNA。
存在许多方法可以把替代CDR嫁接到可变区序列中，并且这样的 方法对于本领域技术人员将会是熟悉的。本发明的优选方法涉及经由 引物指导的诱变来替换可变区(或dAb)中的CDR2。该方法由下述步 骤组成：使编码所需突变的合成寡核苷酸与靶区域退火，其中它充当 引物用于起始体外DNA合成；通过DNA聚合酶延伸寡核苷酸以产生携 带所需突变的双链DNA；和将该序列连接并克隆到合适的表达载体中。
在本发明的优选实施方案中，将新世界灵长类的CDR序列嫁接到 在人中具有低免疫原性的可变区序列中。
术语“低免疫原性”是指结构域抗体构建体或其抗原结合部分在 人中不产生这样的抗体应答，即所述抗体应答的量级足以减少以达到 治疗效果来说足够的时间连续施用所述结构域抗体构建体的功效。
优选地，其中嫁接入新世界灵长类CDR的可变区序列为图1中的 “dAb接纳体序列”(命名为化合物128)。该dAb接纳体序列由SEQ ID No：5所示的氨基酸序列组成：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIDSYLHWYQQKPGKAPKLLIYSASELQSG
VPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQVVWRPFTFGQGTKVEIKR
(SEQ ID No：5)。
该序列由SEQ ID No：6所示的核苷酸序列编码：
GAC ATC CAG ATG ACC CAG TCT CCA TCC TCT CTG TCT GCA TCT GTA GGA
GAC CGT GTC ACC ATC ACT TGC CGG GCA AGT CAG AGC ATT GAT AGT TAT
TTA CAT TGG TAC CAG CAG AAA CCA GGC AAA GCC CCT AAG CTC CTG ATC
TAT AGT GCA TCC GAG TTG CAA AGT GGG GTC CCA TCA CGT TTC AGT GGC
ACT GGA TCT GGG ACA GAT TTC ACT CTC ACC ATC AGC AGT CTG CAA CCT
GAA GAT TTT GCT ACG TAC TAC TGT CAA CAG GTT GTG TGG CGT CCT TTT
ACG TTC GGC CAA GGG ACC AAG GTG GAA ATC AAA CGG
(SEQ ID No：6)。
在本发明的一个优选实施方案中，将新世界灵长类狨CDR序列 YSASNLET(SEQ ID No：4)嫁接入该可变区dAb接纳体序列中，以便 替代该dAb接纳体序列的CDR2序列(YSASELQS；SEQ ID No：55)， 从而产生下面的dAb(命名为化合物145)：
化合物145
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIDSYLHWYQQKPGKAPKLLIYSASNLETG
VPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQVVWRPFTFGQGTKVEIKR
(SEQ ID No：7)。
因此，在一个优选的实施方案中，与人TNF-α结合的结构域抗体 构建体的dAb包含SEQ ID No：7所示的氨基酸序列。
结构域抗体构建体的可变区序列(dAb)可以进一步经历亲和力成 熟以便改善其抗原结合特征，这在本发明的范围之内。这可能需要对 结构域抗体构建体的CDR1、CDR3或构架区中的某些氨基酸残基进行修 饰。
例如，如“材料和方法”中所述的，对SEQ ID No：7进行亲和力 成熟，并就TNF-α结合进行测试。在进一步的优选实施方案中，与人 TNF-α结合的结构域抗体构建体的可变区(dAb)包含SEQ ID No：8 或SEQ ID No：9的氨基酸序列。这些被分别命名为化合物123和化合 物100，并且它们的序列如下所示：
化合物123
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQAIDSYLHWYQQKPGKAPKLLTYSASNLET
GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQVVWRPFTFGQGTKVEIKR
(SEQ ID No：8)
化合物100
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTTTCRASQSIDSYLHWYQQKPGKAPKLLTYSASNLETG
VPSRFSGSGSGTDFTLTISSLLPEDFATYYCQQVVWRPFTFGQGTKVEIKR
(SEQ ID No：9)。
在一个特别优选的实施方案中，与人TNF-α结合的结构域抗体构 建体的可变区(dAb)包含SEQ ID No：10的氨基酸序列。这被命名为 化合物196，并且序列提供在下面：
化合物196
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQAIDSYLHWYQQKPGKAPKLLIYSASNLET
GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLLPEDFATYYCQQVVWRPFTFGQGTKVEIKR
(SEQ ID No：10)。
本领域技术人员将会意识到，结构域抗体构建体的恒定区序列可 以来源于人或灵长类序列。灵长类序列可以是新世界灵长类或旧世界 灵长类序列。合适的旧世界灵长类包括黑猩猩，或其他类人猿例如大 猩猩或猩猩，它们由于其与人的紧密的系统发生接近性而与人恒定区 序列共享高度的同源性。优选地，所述恒定区来源于人抗体序列。这 样的序列的例子可以在下列中找到：国家生物技术信息中心蛋白质和 核苷酸数据库(www.ncbi.nlm.nih.gov)，The Kabat Database of Sequences of Proteins of Immunological Interest (www.kabatdatabase.com)，或IMGT数据库(www.imgt.cines.fr)。
在设计本发明的结构域抗体构建体中，本发明者截短了恒定(Fc) 区的CH1结构域。保留了最小数目的CH1结构域残基以便为铰链区附近 的结构域抗体构建体提供柔韧性。优选地，保留CH1结构域的至少20 个C-末端氨基酸残基，更优选地至少10个氨基酸，更加优选地至少5 个氨基酸，更为优选地单个氨基酸残基。
因此，在优选的实施方案中，结构域抗体构建体具有包含下列组 分的形式：dAb-C末端CH1结构域残基-铰链区-CH2结构域-CH3结 构域，如图2中所示意性地图解说明的。
在特别优选的实施方案中，结构域抗体构建体具有SEQ ID No：11 所示的氨基酸序列。这被命名为化合物170。
化合物170
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQAIDSYLHWYQQKPGKAPKLLIYSASNLET
GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLLPEDFATYYCQQVVWRPFTFGQGTKVEIKRVEPKS
SDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFN
WYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALP
APLEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNG
QPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQK
SLSLSPGK (SEQ ID No：11)。
天然存在的免疫球蛋白的铰链区包含半胱氨酸(C)侧链，其促进 重链CH1结构域和轻链恒定区结构域之间二硫键的形成。由于所述构 建体只包含单个可变结构域，从而留下一个潜在具有活性的未配对的 半胱氨酸残基，因此将该半胱氨酸残基用阻止二硫键形成的氨基酸残 基置换。具有未配对的半胱氨酸的可能后果可以包括由于构建体的聚 集和错误折叠所导致的降低的蛋白质表达。
应当理解，来源于任何抗体类别的任何铰链区序列可适合在本发 明中使用。不过，铰链区优选来自抗体亚类IgG1。优选地，所述铰链 区基于IgG1铰链区的天然存在的序列，并且包含序列 EPKSSDKTHTCPPCPA(SEQ ID No：12)。在此序列中，通常存在于位 置5处的Cys加下划线的Ser残基替代。
优选地，CH1结构域的C-末端氨基酸残基来源于IgG1。更优选地， CH1残基为缬氨酸(V)残基或保守氨基酸置换例如亮氨酸(L)或异亮 氨酸(I)。该残基紧邻铰链区并且有助于增加铰链区附近构建体的灵 柔韧性。
CH2和CH3结构域的序列优选来源于Swissprot数据库登录号 PO1857：
PELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHN
AKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKG
QPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPV
LDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
(SEQ ID No：63)。
所述结构域抗体构建体可以衍生化或与另一种功能分子连接。例 如，结构域抗体构建体可以通过化学偶联、基因融合、非共价结合或 其他方式与一种或多种其他分子实体进行功能上连接，所述其他分子 实体例如为另一种抗体、可检测的试剂、细胞毒剂、药物试剂和/或可 以介导所述抗体或抗体结合部分与另一种分子(例如链霉抗生物素蛋 白核心区或多组氨酸标签)结合的蛋白质或肽。
结构域抗体构建体可以与之衍生的有用的可检测试剂包括荧光化 合物。示例性的荧光可检测试剂包括荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹 明、5-二甲基胺-1-萘磺酰氯、藻红蛋白等。结构域抗体构建体还可以 用可检测的酶进行衍生化，例如碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、葡萄 糖氧化酶等。当结构域抗体构建体用可检测的酶进行衍生化时，它通 过添加该酶用于产生可检测的反应产物的另外试剂来检测。结构域抗 体构建体还可以用生物素进行衍生化，并通过间接测量抗生物素蛋白 或链霉抗生物素蛋白结合进行检测。
可以将根据本发明的结构域抗体构建体与一种或多种分子连接， 所述分子能够在体内提供增加的半衰期和针对降解的抗性而无活性 (例如，结合亲和力)的损失。这些分子可以通过连接体而连接至结 构域抗体构建体，从而它们不干扰/在空间上阻碍抗原结合位点。这些 加合分子包括如美国专利申请20050271663所述的针对内源分子的 dAb。通常，此类加合分子是体内天然存在并且抵抗经由内源性机制的 降解或去除的多肽或多肽片段。增加半衰期的分子可以选自下列：
(a)来自细胞外基质的蛋白质，例如，胶原，层粘连蛋白，整联 蛋白和纤连蛋白；
(b)在血液中发现的蛋白质，例如纤维蛋白，α-2巨球蛋白， 血清白蛋白，纤维蛋白原A，纤维蛋白原B，血清淀粉样蛋白A，庚珠 蛋白(heptaglobin)，蛋白质，泛蛋白，子宫球蛋白(uteroglobulin)， β-2微球蛋白，纤溶酶原，溶菌酶，半胱氨酸蛋白酶抑制剂C，α-1- 抗胰蛋白酶和胰腺胰蛋白酶抑制剂；
(c)免疫血清蛋白，例如IgE，IgG，IgM；
(d)转运蛋白，例如视黄醇结合蛋白，α-1微球蛋白；
(e)防卫素，例如β-防卫素1，嗜中性粒细胞防卫素1、2和3；
(f)在血脑屏障处或在神经组织中发现的蛋白质，例如黑皮质素 受体、髓磷脂、抗坏血酸转运体；
(g)转铁蛋白受体特异性配体-神经药物试剂融合蛋白(参见 US5977307)；脑毛细管内皮细胞受体，转铁蛋白，转铁蛋白受体，胰 岛素，胰岛素样生长因子1(IGF1)受体，胰岛素样生长因子2(IGF 2)受体，胰岛素受体；
(h)定位于肾的蛋白质，例如多囊蛋白，IV型胶原，有机阴离 子运载体K1，Heymann′s抗原；
(i)定位于肝的蛋白质，例如乙醇脱氢酶，G250；
(j)凝血因子X；
(k)α-1抗胰蛋白酶；
(l)HNF 1α；
(m)定位于肺的蛋白质，例如分泌组分(结合IgA)；
(n)定位于心脏的蛋白质，例如HSP 27；
(o)定位于皮肤的蛋白质，例如角蛋白；
(p)骨特异性蛋白质，例如骨形态发生蛋白(BMPs)，例如BMP-2、 -4、-5、-6、-7(也称为成骨蛋白(OP-1))和-8(OP-2)；
(q)肿瘤特异性蛋白质，例如人滋养层抗原，赫赛汀(herceptin) 受体，雌激素受体，组织蛋白酶例如组织蛋白酶B(在肝和脾中发现)；
(r)疾病特异性蛋白质，例如仅在活化的T-细胞上表达的抗原： 包括LAG-3(淋巴细胞活化基因)；护骨蛋白配体(OPGL)，参见Kong YY等人，Nature(1999)402，304-309；OX40(TNF受体家族的成员， 在活化的T细胞上表达，以及为已知在产生人T细胞白血病病毒I型 (HTLV-I)的细胞中特异性地上调的唯一共刺激T细胞分子——参见 Pankow R等人，J.Immunol.(2000)Jul 1；165(1)：263-70)；金 属蛋白酶(与关节炎/癌症相关)，包括CG6512果蝇，人截瘫蛋白， 人FtsH，人AFG3L2，鼠类ftsH；血管生成生长因子，包括酸性成纤 维细胞生长因子(FGF-1)，碱性成纤维细胞生长因子(FGF-2)，血 管内皮生长因子/血管通透性因子(VEGF/VPF)，转化生长因子-α(TGF- α)，肿瘤坏死因子-α(TNF-α)，血管生成素，白介素-3(IL-3)， 白介素-8(IL-8)，血小板衍生内皮生长因子(PD-ECGF)，胎盘生长 因子(PlGF)，中期因子(midkine)血小板衍生生长因子-BB(PDGF)， CXXXC趋化分子(fractalkine)；
(s)应激蛋白质(热休克蛋白)；和
(t)参与Fc转运的蛋白质。
本发明还扩展至聚乙二醇化的结构域抗体构建体，其相对于非聚 乙二醇化的抗体多肽而言提供了增加的半衰期和针对降解的抗性而无 活性(例如，结合亲和力)的损失。
结构域抗体构建体可以使用本领域已知的方法与聚合物分子(优 选PEG)偶联，所述聚合物分子对于达到增加的半衰期和降解抗性性 质是有用的。可以在本发明中使用的聚合物部分可以是合成的或天然 存在的，并且包括但不限于，直链或支化的聚亚烷基、聚亚烯基或聚 氧化烯聚合物，或分支或未分支的多糖例如同或杂多糖。可以在本发 明中使用的合成聚合物的优选例子包括直链或支化的聚(乙二醇) (PEG)、聚(丙二醇)或聚(乙烯醇)，及其衍生物或取代的形式。用于 与结构域抗体构建体连接的特别优选的取代的聚合物包括取代的 PEG，包括甲氧基(聚乙二醇)。除PEG外可以使用的，或可以代替PEG 使用的天然存在的聚合物部分包括乳糖、直链淀粉、葡聚糖或糖原， 以及将由本领域技术人员认可的其衍生物。
在本发明中可用的聚合物(PEG)分子可以使用本领域众所周知的 方法与结构域抗体构建体连接。在PEG或其他聚合物部分与本发明的 结构域抗体构建体连接中的第一个步骤是用包含亲电子体的官能团替 换PEG聚合物的羟基末端基团。特别地，将PEG聚合物与结构域抗体 构建体单体或多聚体中存在的半胱氨酸或赖氨酸残基连接。所述半胱 氨酸和赖氨酸残基可以是天然存在的，或可以被改造到结构域抗体构 建体分子中。
可以通过多种方法来完成本发明的结构域抗体构建体的PEG化 (参见例如Kozlowski-A & Harris-JM(2001)Journal of Controlled Release 72：217)。PEG可以直接地或者通过间插性连接体与结构域 抗体构建体连接。用于将聚乙二醇连接至蛋白质的无连接体系统已在 下列文献中描述：Delgado等人(1992)，Crit.Rev.Thera.Drug Carrier Sys.9：249-304；Francis等人，(1998)，Intern.J.Hematol. 68：1-18；US 4,002,531；US 5,349,052；WO 95/06058；和WO 98/32466， 其中每一篇文献的公开内容通过提及而合并入本文。
一种将聚乙二醇直接连接至蛋白质的氨基酸残基而不使用间插性 连接体的系统采用了三氟乙磺酸化的(tresylated)MPEG，其是通过 用三氟乙磺酰氯(tresylchloride)修饰单甲氧基聚乙二醇(MPEG) 而产生的。在氨基酸残基与三氟乙磺酸化的MPEG反应后，将聚乙二醇 直接连接至胺基团上。因此，本发明包括通过将本发明的蛋白质与具 有2，2，2-三氯乙磺酰基的聚乙二醇分子进行反应而产生的蛋白质-聚 乙二醇缀合物。
还可以使用许多不同的间插性连接体来将聚乙二醇连接至蛋白 质。例如，US 5,612,460公开了用于将聚乙二醇连接至蛋白质的氨基 甲酸乙酯连接体。蛋白质-聚乙二醇缀合物(其中聚乙二醇通过连接体 连接至蛋白质)也可以通过将蛋白质与化合物进行反应来产生，所述 化合物例如为MPEG-琥珀酰亚胺基琥珀酸酯、用1，1’-碳酰二咪唑 (1，1’-carbonyldiimidazole)活化的MPEG、MPEG-2，4，5-三氯戊基 碳酸酯、MPEG-对硝基苯酚碳酸酯和各种MPEG-琥珀酸酯衍生物。许多 用于将聚乙二醇连接至蛋白质的其他聚乙二醇衍生物和反应化学在 WO98/32466中进行了描述，其全部公开内容通过提及而合并入本文。
在本发明的一个特别优选的实施方案中，结构域抗体构建体通过 赖氨酸残基直接偶联至聚乙二醇。在本发明的另一个优选实施方案中， 结构域抗体构建体通过半胱氨酸残基直接偶联至PEG。未配对的半胱 氨酸残基可以事先存在于序列中，也可以通过在例如结构域抗体构建 体的C-末端中掺入半胱氨酸残基而添加。备选地，PEG与结构域抗体 构建体的连接可以通过形成二硫键的半胱氨酸残基而得到促进，如在 US20060210526中所描述的。
聚合物分子的其他衍生形式包括例如这样的衍生物，其中存在另 外的部分或反应性基团以允许与本文所述的结构域抗体构建体的氨基 酸残基相互作用。此类衍生物包括N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活性酯， 琥珀酰亚胺基丙酸酯聚合物，和巯基-选择性反应试剂例如马来酰亚 胺，乙烯砜和硫醇。PEG聚合物可以是线性分子，或可以是分支的，其 中多个PEG部分存在于单个聚合物中。
反应性基团(例如，MAL、NHS、SPA、VS或巯基)可以直接与PEG 聚合物连接，或可以经由连接体分子与PEG连接。
在本发明中可用的聚合物的大小可以为500Da-60kDa，例如， 1000Da-60kDa，10kDa-60kDa，20kDa-60kDa，30kDa-60kDa， 40kDa-60kDa，以及高达50kDa-60kDa。在本发明中使用的聚合 物，特别是PEG，可以是直链聚合物或可以具有分支的构象。
在进一步的实施方案中，根据第一方面的结构域抗体构建体可以 是多聚化的，如例如异或同二聚体，异或同三聚体，异或同四聚体， 或更高次的异或同多聚体。多聚化可以增加抗原结合的强度，其中结 合的强度与多个结合位点的结合亲和力总和有关。
第五方面，本发明提供了药物组合物，其包含有效量的根据第一 方面的结构域抗体构建体，以及药学上可接受的载体或稀释剂。
“药学上可接受的载体”包括生理学相容的任何和所有溶剂、分 散介质、包衣剂、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。药 学上可接受的载体的例子包括水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、葡萄糖、 甘油、乙醇等中的一种或多种及其组合。在许多情况下，优选地将是 在组合物中包括等渗剂，例如糖，多元醇例如甘露醇、山梨糖醇，或 氯化钠。药学上可接受的物质例如少量的辅助物质例如湿润或乳化剂、 防腐剂或缓冲质。
所述组合物可以是各种形式，包括液体、半固体和固体剂型，例 如液体溶液(例如可吸入的、可注射的和可输注的溶液)，分散液或 悬浮液，片剂，丸剂，粉剂，脂质体或栓剂。优选地，所述组合物是 用于免疫接种的可注射溶液的形式。施用可以是静脉内、动脉内、皮 下、腹膜内或肌内。
通常，治疗组合物必须是无菌的并且在制造和储存条件下是稳定 的。组合物可以配制为溶液、微乳液、分散体、脂质体或其他适合于 高药物浓度的有序结构。溶液的适当的流动性可以通过例如使用包衣 剂如卵磷脂和/或表面活性剂来维持。无菌可注射溶液可以通过下列方 式来制备：在具有一种上面所列的成分或其组合的合适溶剂中以所需 的量掺入活性化合物(即结构域抗体构建体)，随后过滤灭菌。
所述组合物还可以配制成用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末。
在某些实施方案中，活性化合物可以用载体来制备，所述载体将 保护化合物不被快速释放，例如受控释放制剂，包括植入物，透皮贴 剂和微胶囊化的递送系统。可以使用相容的聚合物，例如乙烯乙酸乙 烯酯，聚酐，聚乙醇酸，胶原，聚原酸酯或聚乳酸。
所述组合物还可以配制用于口服施用。在这个实施方案中，结构 域抗体构建体可以封装在硬或软壳明胶胶囊中，压缩成片剂，或直接 掺入受试者的饮食内。
允许肺、直肠、透皮、鞘内、眼内施用的制剂将是本领域技术人 员熟知的。
还可以将补充的活性化合物掺入至所述组合物中。结构域抗体构 建体可以与一种或多种另外的治疗剂例如可溶性TNF-α受体或抑制 人TNF-α产生的化学试剂，或者结合其他靶标例如细胞因子或细胞表 面分子的抗体一起共配制和/或共施用。备选地，它可以与可溶性免疫 化学试剂例如蛋白A、C、G或L一起共施用。
有效量可以包括治疗有效量或预防有效量的本发明的结构域抗体 构建体。治疗有效量是指以必需的剂量和时间段，对于取得所希望的 治疗结果而言有效的量。预防有效量是指以必需的剂量和时间段，对 于取得所希望的预防结果而言有效的量。因为预防剂量在发病之前或 在疾病的早期阶段施用，所以预防有效量可以比治疗有效量小。
第六方面，本发明提供了根据本发明第一方面的结构域抗体构建 体在检测人TNF-α的诊断应用中的用途。
例如，根据本发明的抗人TNF-α结构域抗体构建体可以用于检测 例如生物样品如血清或血浆中的人TNF-α，其中使用常规的免疫测定 法，例如酶联免疫吸附测定法(ELISA)、放射免疫测定法(RIA)或 组织免疫组织化学。可以通过竞争免疫测定法在生物学流体中测定根 据本发明的抗人TNF-α结构域抗体构建体，其中使用用可检测物质标 记的重组人TNF-α标准和未标记的抗人TNF-α抗体。
根据本发明的抗人TNF-α结构域抗体构建体还可用于检测来自 除人类以外的其他物种例如非人灵长类(包括猕猴、黑猩猩、狨、恒 河猴)和其他物种例如狗、大鼠、小鼠、兔、猫、猪、牛的TNF-α。
根据本发明的抗人TNF-α结构域抗体构建体还可用于其中希望 抑制TNF-α活性的细胞培养应用。
第七方面，本发明提供了用于在人受试者中治疗特征在于人TNF- α活性的病症的方法，其包括给所述受试者施用根据本发明第二方面 的药物组合物。
特征在于人TNF-α活性的病症意欲包括这样的疾病和其他病症， 即其中在患有所述病症的受试者中TNF-α的存在已显示负责或被怀 疑负责所述病症的病理生理学，或者已显示是或被怀疑是促成所述病 症恶化的因素。优选地，特征在于人TNF-α活性的病症选自炎症，炎 性疾病，脓毒症，包括败血症性休克、内毒素性休克、革兰氏阴性脓 毒症和中毒性休克综合征；自身免疫性疾病，包括类风湿性关节炎、 幼年关节炎、类风湿性脊椎炎、强直性脊椎炎、舍格伦综合征、骨关 节炎和痛风性关节炎、过敏症、多发性硬化症、自身免疫性糖尿病、 自身免疫性葡萄膜炎、银屑病、类天疱疮以及肾病综合征；眼的炎性 病况，包括黄斑变性、葡萄膜炎、贝赫切特病；感染性疾病，包括由 于感染和感染后继发的恶病质所引起的发热和肌痛；移植物抗宿主病； 肿瘤生长或转移，恶性血液病(hematologic malignancies)；肺部 病症，包括哮喘、成人呼吸窘迫综合征、休克肺、慢性肺部炎性疾病、 肺结节病、肺纤维化和矽肺；炎症性肠病，包括克罗恩病和溃疡性结 肠炎；心脏病症，充血性心力衰竭；血管病症，包括韦格纳病(Wegener′s sease)、巨细胞动脉炎；炎症性骨病；中枢神经系统病症，例如阿 尔茨海默病；周围神经系统病症，例如坐骨神经痛；肝炎，凝血障碍， 烧伤，再灌注损伤，子宫内膜异位症，瘢痕瘤形成，和瘢痕组织形成。
在一个特别优选的实施方案中，所述特征在于人TNF-α活性的病 症是年龄相关性黄斑变性。TNF-α参与刺激VEGF产生和促进眼内的新 血管形成(Oh-H等人，1999 Inves tigative Ophthalmology & Visual Science 40：1891-98)，因此，TNF-α活性的抑制剂，例如此处所描 述的结构域抗体构建体，可用于治疗与血管生成相关的眼病症，包括 年龄相关性黄斑变性。
在本说明书自始至终，单词“包含”或者变化形式“包括”或“含 有”应当理解为暗示包括所述元素、整数或步骤，或者元素、整数或 步骤的组，但不排除任何其他元素、整数或步骤，或者元素、整数或 步骤的组。
本说明书中提及的所有出版物通过提及而合并入本文。本说明书 中包括的文件、行为、材料、装置、物品等的任何讨论仅用于提供本 发明的背景的目的。它不应被视为承认任何或所有这些内容构成现有 技术基础的一部分或者是在与本发明相关的领域中的公知常识，就好 像它在本申请的每项权利要求的优先权日前存在于澳大利亚或其他地 方。
为了能够更清楚地理解本发明的本质，现在将参考下述非限制性 实施例来描述其优选形式。
实施例1
材料和方法
新世界灵长类VL基因的分离
狨(毛狨属(Callithrix)，种未知)和枭猴(夜猴(Aotus trivirgatus))基因组DNA分别以目录编号85011419和90110510 获自欧洲细胞培养物保藏中心(ECACC)。狨DNA来源于细胞系B95-8， 而枭猴DNA来自细胞系OMK 637-69。
基于人Vκ前导序列和重组信号序列(RSS)的简并引物得自 Walter和Tomlinson，Antibody Engineering：A Practical Approach (1996)。用于扩增种系Vκ DNA的引物如下：
引物VK1BL
AATCKCAGGTKCCAGATG(SEQ ID No：13)
引物VK1BL35a
GTTYRGGTKKGTAACACT(SEQ ID No：14)
引物VK1BL35b
ATGMCTTGTWACACTGTG(SEQ ID No：15)。
采用引物对VK1BL x VK1BL35a或VK1BL x VK1BL35b，使用Taq 聚合酶来进行PCR(30个循环)。在经克隆的序列和所使用的2套引 物之间存在重叠。
将基因组PCR产物克隆入Invitrogen的TOPO TA克隆试剂盒(目 录号K4500-01)中，并用M13正向引物和pUC反向引物进行测序。从 正和反方向对序列进行确认。为了进一步确认关键序列没有发生PCR 错误，对于狨序列重复两次PCR和克隆过程。核苷酸(SEQ ID No：16 -26和SEQ ID No：38-43)和氨基酸(SEQ ID No：27-37和SEQ ID No：44-49)在图3中给出。狨序列1、2和3得到了确认。序列4、 5、6、7和8只在初始PCR中进行了查看。序列9、10和11只在重复 (即第二次)PCR和克隆中进行了查看。
合成寡核苷酸并克隆入接纳体序列中
四个CDR序列，即来自枭猴序列1(SEQ ID No：44)的YAATKLQS (SEQ ID No：1)、来自枭猴序列2(SEQ ID No：45)的YEASSLQS (SEQ ID No：2)、来自狨序列1(SEQ ID No：27)的YEASKLQS(SEQ ID No：3)和来自狨序列2(SEQ ID No：28)的YSASNLET(SEQ ID NO： 4)，选自图3中所示的氨基酸序列。发现枭猴序列5，YYASSLQS(SEQ ID No：56)，与秘鲁夜猴(Aotus nancymaae)(Ma’s夜猴)的cDNA 序列GI6176295相同，而所有其他序列是独特的。
在该表达载体(Domantis拥有专利权的载体)中的接纳体可变区 (抗-TNF的结构域抗体)序列依次用KpnI和SanDI进行消化(25μg)， KpnI和SanDI切除大部分的FR2以及CDR2，如限制性消化图谱(图4) 上所示的。然后，凝胶纯化该载体以除去被切除的野生型FR2和CDR2 序列。
通过下述方式来进行寡核苷酸的退火：将寡核苷酸对(500pmol， 基于在图3中所示的序列)在95℃下温育5分钟，接着在65℃下温育 5分钟，然后让其在热台(hot block)上慢慢达到室温。然后，在dNTP 存在下在Klenow反应中补满重叠部分。使用标准方法完成将合成的双 链DNA(来源于寡核苷酸退火和末端补齐)分子克隆入接纳体可变区 序列中。
亲和力成熟
通过构建14个分开的文库来对嫁接了狨CDR的dAb化合物145 (SEQ ID No：7)进行亲和力成熟，其中每一个文库在单个氨基酸残 基处具有SEQ ID No：7的序列多样化。所选的残基在下面用阴影显示。
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQ WYQQKPGKPKLLIYSASNLETG
VPSRFSGGSGTFTLTISSLPEDFATYYCQQPTFGQGTKVEIKR。
所述选择基于已知在成熟的人Ig储库中多样化的CDR1和CDR3 中的残基，以及被观察到在相关dAb中进行诱变后产生功能性蛋白质 的构架残基。对于每个所选的残基，以NKK简并性设计互补的正向和 反向PCR引物对，并且进行两个初始PCR反应，其中每个PCR反应采 用单诱变引物和侧翼引物。在进行清理之后，将两个PCR产物退火， 随后使用单独的侧翼引物进行扩增(通过PCR的重叠延伸来进行剪接； Lowman H.L.& Clackson T.(编辑)，Phage Display：A practical approach，Oxford University Press，Oxford，UK)。使用固相TNF 通过ELISA对克隆进行初次筛选，并对阳性克隆进行测序。从最好的 克隆中纯化出dAb蛋白质，并就在受体结合测定法和L929细胞毒性测 定法中的效力进行评价。发现化合物100(SEQ ID No：9)和123(SEQ ID No：8)具有相对于亲本dAb即化合物145(SEQ ID No：7)而言 改善的TNF中和作用。
化合物100和123的增强亲和力的置换的组合产生了这样的抗 -TNF dAb(化合物196；SEQ ID No：10)，其在L929细胞毒性测定 法中具有进一步改善的效力。
细胞培养
将CHOK1SV细胞(Lonza Biologics，UK)，即CHOK1的悬浮变 种，在补充有6mM L-谷氨酰胺(Invitrogen目录号10743-029和 25030-081)的CD CHO培养基中维持在对数生长期。培养物在36.5℃、 10％ CO2和于140rpm摇动下温育。在转染前24小时，在血细胞计数 器上通过台盼蓝排除法(Sigma目录号T8154)来估定数目和生存力。 通过于200×g下5分钟来使8×106个活细胞形成粒状沉淀，并重悬 浮于8ml CM25培养基(Lonza Biologics，UK)中，所述培养基中补 充有10％热灭活的经透析的胎牛血清(Invitrogen目录号26400-044) 和6mM L-谷氨酰胺。将细胞以每孔500μl铺于24孔板中，并于36.5 ℃、10％ CO2下温育。
在转染前3小时，给培养基增添500μl CM25培养基的新鲜的等 分试样，所述CM25培养基补充有10％热灭活的经透析的胎牛血清和6 mM L-谷氨酰胺。
表达载体
就用于哺乳动物细胞表达对化合物112(SEQ ID No：50)和化合 物170(SEQ ID No：51)的基因序列进行优化，并且进行合成。
化合物112
GACATCCAGATGACCCAGAGCCCCAGCAGCCTGAGCGCCTCTGTGGGCGATAGAGTGACC
ATCACCTGCAGAGCCAGCCAGGCCATCGACAGCTACCTGCACTGGTATCAGCAGAAGCCT
GGCAAGGCCCCTAAGCTGCTGATCTACAGCGCCAGCAATCTGGAGACCGGCGTGCCTAGC
AGATTCAGCGGCAGCGGCTCCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCAGCCTGCTGCCT
GAGGATTTCGCCACCTACTACTGCCAGCAGGTGGTGTGGAGACCTTTCACCTTCGGCCAG
GGCACCAAGGTGGAGATCAAGCGGGTGGAGCCCAAGAGCTGCGATAAGACCCACACCTGC
CCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGCGGACCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAG
CCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGATGTG
AGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAAT
GCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTG
ACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAG
GCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCC
CAGCTGTACACCCTGCCCCCTAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACC
TGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAG
CCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTG
TACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCAGC
GTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGC
AAG(SEQ ID No：50)
化合物170
GACATCCAGATGACCCAGAGCCCCAGCAGCCTGAGCGCCTCTGTGGGCGATAGAGTGACC
ATCACCTGCAGAGCCAGCCAGGCCATCGACAGCTACCTGCACTGGTATCAGCAGAAGCCT
GGCAAGGCCCCTAAGCTGCTGATCTACAGCGCCAGCAATCTGGAGACCGGCGTGCCTAGC
AGATTCAGCGGCAGCGGCTCCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCAGCCTGCTGCCT
GAGGATTTCGCCACCTACTACTGCCAGCAGGTGGTGTGGAGACCTTTCACCTTCGGCCAG
GGCACCAAGGTGGAGATCAAGCGGGTGGAGCCCAAGAGCAGCGATAAGACCCACACCTGC
CCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGCGGACCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAG
CCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGATGTG
AGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAAT
GCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTG
ACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAG
GCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCC
CAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACC
TGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAG
CCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTG
TACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCAGC
GTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGC
AAG(SEQ ID No：51)
每个序列在5’末端侧翼具有一个Hind III位点、Kozak序列 (GCCACC；SEQ ID No：57)和人IgGκ前导序列(氨基酸序列 MSVPTQVLGLLLLWLTDARC；SEQ ID NO：58)。在3’末端，给每个序列 添加两个终止密码子和一个EcoRI位点。在合成之后，将基因以克隆 入pCRScript载体(Stratagene)中的方式提供，并在合适的限制酶 缓冲液(分别为Roche Diagnostics目录号10656313001、10703737001 和11417967001)中通过HindIII/EcoRI消化而释放。类似地，对GS 表达载体pEE12.4(Lonza Biologics，UK)进行消化，并用牛小肠碱 性磷酸酶(Roche Diagnostics目录号10713023001)进行去磷酸化。 使用Promega的LigaFast Rapid DNA连接系统(目录号M8221)将 每个基因连接入制备好的pEE12.4骨架中。然后，将连接产物转化入 One Shot Top 10经化学方法获得的感受态细胞(Invitrogen目录号 C4040-03)中，并通过标准技术来鉴定阳性克隆。使用QIAfilter中 量制备柱(QIAgen目录号12243)，通过过夜培养物的中量制备来制 备大量的所得载体(pEE12.4-PNO621和pEE12.4-PNO521-S114C)。 通过在含1/10体积的3M乙酸钠(pH5.2)的100％乙醇(Sigma目录号 分别为S2889和E7023)中沉淀20μg来制备载体以用于转染。在用 70％乙醇洗涤之后，将载体以0.5μg/μl的工作浓度重悬浮于40μl T.E.pH8.0(Sigma目录号T9285)中。
转染
对于每次转染，将2μl Lipofectamine 2000加入至96孔平板的 一个孔中的50μl Optimem I培养基(Invitrogen目录号11668-027 和31985-062)中。在第2个孔中，将1.6μl表达载体(0.8μg)加 入至50μl Optimem I培养基中。在5分钟室温温育后，将所述2个 孔的内容物混合在一起并进一步进行20分钟温育。这该第二次温育 后，将全部转染混合物加入至包含CHOK1SV细胞的24孔平板的孔中。 将细胞温育至少72小时并收获上清液。使上清液在4,000xg下离心 5分钟以使细胞碎片形成粒状沉淀，并贮存于-20℃直至通过TNF ELISA 来测定化合物112(SEQ ID No：59)和化合物170(SEQ ID No：11) 的表达。
化合物112
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQAIDSYLHWYQQKPGKAPKLLIYSASNLET
GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLLPEDFATYYCQQVVWRPFTFGQGTKVEIKRVEPKS
CDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKPN
WYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALP
APIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNG
QPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQK
SLSLSPGK(SEQ ID No：59)
TNF ELISA
将微量滴定板(例如Sarstedt 82.9923-148)用1μl/mL人重组 TNF-α(Peprotech Cat# 300-01A)在碳酸盐/碳酸氢盐包被缓冲液 (pH9.6)中的溶液进行包被，100μl/孔。在4℃过夜温育之后，用 含0.05％Tween-20的PBS(0.01M，pH7.2)洗涤平板三次，和用PBS 洗涤三次。每个孔中加入200μl封闭缓冲液(含1％BSA[牛血清白蛋 白，Sigma Cat# A-9647]的PBS)，并在25℃下温育1小时。如上所述 洗涤平板，并向每个孔中加入100μl体积的稀释于抗体稀释剂(含 1％BSA和0.05％Tween 20的PBS)中的样品或化合物170标准。在 25℃下温育1小时之后，如上所述洗涤平板，并向每个孔中加入100 μl体积的以1：1000稀释于抗体稀释剂中的二抗(缀合有过氧化物酶 的山羊抗人免疫球蛋白，Zymed，Cat# 81-7120)。洗涤平板，并向每 个孔中加入100μl体积的ABTS底物(2，2’-连氮基-双(3-乙基苯并噻 唑啉-6-磺酸)二铵盐，Sigma Cat# A-1888，0.5mg/mL于含0.03％ H2O2 的柠檬酸盐缓冲液(pH4.4)中)。底物在室温下显色30分钟，并于 405nm(参考620nm)处读取吸光度。相对于标准曲线来确定样品浓 度，并表示为相对于表达的化合物112的平均浓度。
结果
包含截短的CH1
在结构域抗体构建体中包含截短的CH1导致这样的在可变结构域 和铰链之间的连接，即相比于缺少截短的CH1的连接(83.3％；以1的 缺口开放罚分，使用在Vector NTI(Invitrogen)上的Align X计算 出的)，所述在可变结构域和铰链之间的连接具有更高的与常规IgG1 CH1-铰链连接的同源性(91.7％)。增高的同源性可能转变为增加的对 于常规免疫球蛋白肽序列(对于其，人类患者应当是免疫耐受的)的 相像性，从而降低了免疫原性潜力。
序列：
化合物170可变区-截短的CH1-铰链连接：
TKVEIKREPKS
IgG1 CH1-铰链连接(NCBI登录号AAG00909)：
EPKS
化合物170可变区-铰链连接(没有截短的CH1)：
TKVEIKREPKS
CH1序列以双下划线标示。
获自NCBI蛋白质数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)的CH1 结构域(SEQ ID No：60)AAG00909：
1 STKGPSVFPL APSSKSTSGG TAALGCLVKD YFPEFVTVSW NSGALTSGVH TFPAVLQSSG
6.1 LYSLSSVVTV PSSSLGTQTY ICNVNHKPSN TKVDKRVEPK SCDKTHTCPP CPAPELLGGP
121 SVFLFPPKPK DTLMISRTPE VTCVVVDVSH EDPEVKFNWY VDGVEVHNAK TKPKEEQYNS
181 TYRVVSVLTV LHQDWLNGKE YKCKVSNKAL PAPIEKTISK AKGQPREPQV YTLPPSREEM
241 TKNQVSLTCL VKGFYPSDIA VEWESNGQPE NNYKTTPPVL DSDGSFFLYS KLTVDKSRWQ
301 QCNVFSCSVM HEALHNHYTQ KSLSLSPGK
CH1-铰链连接以下划线标示。
中和TNF-α诱导的细胞毒性
使用鼠类L929细胞生存力测定法，对结构域抗体构建体化合物 170(SEQ ID No：11)中和TNF-α介导的细胞毒性的能力进行了评估。 在平底96孔板中，以50μL体积，制备了化合物170在含10％胎牛血 清的RPMI培养基(RPMI-FBS)中的系列稀释物。向这些孔的每一个中 以360pg/mL的浓度加入50μl的重组人TNF-α(Strathmann Biotec， Hamburg，Germany)，随后加入在50μL中的2.5×104个L929细胞 和25μL 40μg/mL放线菌素D，均在RPMI-FBS中制备。对照包括没 有TNF(用于确定100％生存力)的孔、无细胞(0％生存力)的孔和范 围为2pg/mL至4200pg/mL的TNF-α标准曲线的孔。培养板在5％ CO2 气氛中于37℃温育20小时，然后在加入25μl的3-(4，5-二甲基噻唑 -2-基)-5-(3-羧基甲氧基苯基)-2-(4-磺基苯基)-2H-四唑鎓(MTS)/ 吩嗪乙基硫酸盐(phenazine ethosulfate，PES)(Promega，CellTiter 96 AQueousOne，Madison USA)后再温育3小时。针对630nm的参考 波长在492nm处测定吸光度，和使用从三次重复的测试孔计算出的平 均值来绘制生存力曲线。通过随着化合物170浓度增加而细胞生存力 增加(图6)，表明了化合物170中和TNF-α的能力。
中和TNF-α与人p55和p75 TNF受体的结合
结构域抗体构建体化合物170(SEQ ID No：11)抑制TNF-α与人 p55和p75 TNF受体结合的能力通过受体结合测定法来进行评价。以 在碳酸盐包被缓冲液(pH9.2)中的0.1μg/mL，通过于4℃温育过夜， 将人p55(RnD systems，目录号372-RI)或p75(RnD systems，目 录号762-R2)包被到Maxisorb板(Nunc)上。在抗体稀释剂(PBS pH7.2， 0.05％ Tween-20，1％BSA)中制备范围从100μg/mL降至3.15ng/mL 的化合物170的系列半对数(half-log)稀释物(和无化合物170的 “空白”对照)，并与等体积的在抗体稀释剂中的60ng/mL人TNF- α相混合。还制备了不含PN0621和不含TNF-α的空白以测量背景结 合。让所有混合物在温和搅动下于室温温育正好1小时。在该温育过 程中，经包被的平板用PBS，0.05％ Tween-20洗涤3次，然后用PBS 洗三次。然后，于室温用200μl/孔的PBS，1％BSA封闭平板45分钟。 在洗涤平板后，对于每个浓度的受试化合物170向三次重复的孔中加 入100μl的化合物170/TNF-α混合物，以及加入所有对照。然后， 将平板于室温下温育1小时。在洗涤平板后，以在抗体稀释剂中的0.6 μg/mL，向每个孔中加入生物素化的抗人TNF-α抗体(RnD Systems， 目录号BAF210)，并于室温温育1小时。在洗涤后，以在抗体稀释剂 中的1:2000，加入链霉抗生物素蛋白-HRP缀合物(Zymed，目录号 43-4323)，并于室温下温育45分钟。使用TMB底物(Invitrogen， 目 录号00-2023)进行显色，在4分钟后，用1M HCl终止反应。然后， 使用620nm的参照，在450nm处测量吸光度读数。通过计算三次重 复的平均吸光度来进行分析。从每个吸光度值中减去非特异性结合(无 TNF-α)的平均值。
结果如图7中所示，并且显示，化合物170阻止TNF-α与人p55 或p75 TNF受体的相互作用。
细胞结合型TNF-α的结合
使用NS0细胞系27D4对与细胞结合型(跨膜)TNF-α的结合进行 分析，所述细胞系是用编码缺乏TACE切割位点的人TNF-α蛋白的基 因稳定转染的，从而TNF-α保持为细胞膜结合的，因为其不能被切割。 基于另一种鼠类骨髓瘤(SP2/0)的相似细胞系也已得到描述(Scallon 等人，(1995)Cytokine 7 251-259)。
在每个样品5×105个活27D4细胞上进行流式细胞术分析，其中 所有步骤于4℃或在冰上进行。以100μg/mL，将细胞粒状沉淀与受试 样品(化合物170；SEQ ID No：11)或不相关特异性同种型-匹配的 对照(Sigma，目录号：15154)一起重悬浮于含2％FBS的PBS中， 并在冰上温育1小时。进行两次细胞洗涤循环，每次包括以1000×g 离心10分钟和将细胞粒状沉淀重悬浮于PBS/2％ FBS中。在又一次的 离心步骤后，将细胞粒状沉淀重悬浮于100μl的二抗缀合物(抗人 Fc FITC缀合物，Sigma，目录号F9512)中，并温育30分钟。然后， 如上所述将样品洗两次，并将细胞粒状沉淀重悬浮于500μl含5 μg/mL碘化丙锭(Sigma，目录号P4864)的PBS/2％ FBS中。在Beckman Coulter Cell Lab Quanta流式细胞仪上对细胞的荧光染色进行分析， 和使用WinMDI来处理数据。
结果显现在图8中，并且显示，表达跨膜TNF-α的NSO 27D4细 胞(黑色实线)的化合物170染色显现出比不相关特异性同种型-匹配 的对照(灰色填充)更高的荧光强度。
高表达化合物170的细胞系的建立
使用在“材料和方法”部分中所描述的表达载体来建立表达化合 物170(SEQ ID No：11)的稳定的CHOK1SV细胞系。简而言之，在40 μg的线性化的质粒DNA存在下，在没有谷氨酰胺的CDCHO无蛋白质 培养基中对1×107个处于对数生长期的细胞进行电穿孔。转染后24 小时，施加50μM甲硫氨酸砜亚胺(methionine sulphoximine) (Sigma)的选择压力，并让抗性细胞在96孔板中形成集落。当接近 汇合时，将单个菌落转移至24孔板、T25瓶和随后T75瓶。在T75瓶 中一旦汇合，就将细胞系进展至在E125锥形瓶中的培养，并且经历6 次传代培养而适应于悬浮生长。一旦适应于悬浮生长，就将细胞系在 92.5％ CDCHO培养基：7.5％ DMSO的冷冻混合物中冷藏。
在细胞系通过不同的孔和瓶大小进行扩展的同时，与细胞系进入 下一阶段的过程相平行地进行许多生产率(productivity)评估。因 此，在24孔板和E125锥形瓶阶段进行了生产率评估。在每一情况下， 让细胞生长14天，并且就化合物170的水平通过实施例1中所描述的 TNF ELISA方法对上清液进行评价。将细胞系按生产率进行排序，并 选择最高的10个，以用于在Lonza Biologics的拥有专利权的补料- 分批生产率评估中进行评价。所获得的生产率在700mg/L和3371mg/L 之间。选择了生产率为2724mg/L的先导细胞系，以用于在10L实验 室规模的发酵罐中进行评价。
运行四个分开的10L实验室规模的发酵罐15天，其中基于无蛋白 质的CDCHO培养基，采用先导细胞系和拥有专利权的通用补料分批工 艺。4个发酵的所得的平均生产率是4851mg/L，其中最高生产率为 4925mg/L(在15天的发酵中，对于非克隆细胞系，由Lonza Biologics 先前报道的最高生产率水平为3560mg/L)。设计了所使用的10L实 验室规模的发酵罐以模拟在高达2000L的更大规模的发酵罐中所见的 发酵条件，因此预期该先导细胞系适合于商业规模的生产。确实，在 200L发酵罐中观察到了相似的表达水平。
通过蛋白A亲和层析对从表达化合物170(SEQ ID No：70)的先 导细胞系的4×10L发酵中收获的产物进行纯化，并且通过在还原和非 还原条件下的SDS PAGE进行分析。如图11中所示的，化合物170表 达为约90kDa的单体。该单体由两个约40kDa的亚基组成，它们在 图12中当在还原条件下运行SDS PAGE时可见。由于SDS PAGE不适合 准确测定蛋白质的大小，因而对化合物170单体作了进一步的分析。 ESI-MS(电喷雾电离质谱法)将化合物170单体的大小测定为78.739 kDa。这与2个亚基的预测的分子量(2 x 38.058＝76.116kDa)是 一致的，其中每个亚基还携带二天线型(biantennary)核心岩藻糖基 化的聚糖糖结构。
在非人灵长类中的长血清半衰期
以0.5、5和50mg/kg的剂量，给猕猴皮下施用化合物170(SEQ ID No：11)，并在0.5、1、2、6和24小时，随后在1、2、4、7、 10和14天抽取血液样品。使用实施例1中所描述的抗-TNF ELISA方 法，就化合物170水平的定量对这些样品进行分析。通过分析这些样 品中化合物170的水平来确定消除半衰期。于0.5mg/kg，计算出110.5 ±13.9小时的消除半衰期。于5mg/kg和50mg/kg，计算出110.9± 10.4和103.5±11.5小时的消除半衰期。
当以50mg/kg通过静脉内途径施用化合物170时，于10、30和 60分钟，4和24小时，2、4、7、10和14天抽取血液样品。使用实 施例1中所描述的抗-TNF ELISA方法，就化合物170水平的定量对这 些样品进行分析。通过分析这些样品中化合物170的水平来确定消除 半衰期。在50mg/kg静脉内施用后，计算出109.6±10.7小时的消除 半衰期。
有利的安全性特性
在动物安全性和毒性研究中对按照GMP标准生产的化合物170 (SEQ ID No：11)进行评价。
单剂量的安全性
通过皮下或静脉内施用途径，以0.5、5和50mg/kg给不同的猴 施用单剂量的化合物170，它们未显示与用化合物170进行的其治疗 有关的影响。在这些研究中，对一系列器官作了显微镜检查，未观察 到任何影响。
逐步升高的剂量和重复剂量的安全性
从0.5mg/kg的剂量(皮下或静脉内施用)开始，每7天给猕猴 施用逐步升高的剂量直至50mg/kg。就各种生理学和行为参数对动物 进行评估，包括血液学、临床化学、体重和器官重以及尸体剖检后的 器官肉眼检查。在这些研究自始至终，对于使用化合物170进行的治 疗未报告有不良反应。在研究的剂量逐步升高阶段之后，在进一步的 4周时间内，对那些经皮下接受逐步升高的剂量的动物进一步施用4 个50mg/kg的剂量。在各种参数方面，仍未观察到与使用化合物170 进行的治疗有关的影响。
心血管的安全性
在安装有无线电遥测监测器的猕猴中，评价50mg/kg的化合物 170的心血管安全性。这些监测器能直接从有意识的猴身上报告一系 列呼吸和心血管参数。在给予化合物170后，未报道不良的与治疗有 关的临床观察结果。
细菌表达
在哺乳动物表达系统中产生在前述实施例中的化合物170(SEQ ID No：11)。还用细菌表达系统来产生功能性化合物170。
对减去信号序列的化合物170的氨基酸序列进行回译和用 GeneOptimizerTM进行优化以用于大肠杆菌(E.coli)表达，并且在 GeneArt GmbH从头合成。将合成的基因通过NcoI和HindIII限制性 位点(Roche)亚克隆入pBAD gIII/His-标记的表达载体(Invitrogen) 中，从而产生准备用于细菌表达的载体。通过热休克法用所述载体转 化TOP10细胞(Invitrogen)，并产生单个菌落的甘油原种。诱导条 件是0.002％的阿拉伯糖(Sigma；终浓度)和4小时的诱导期。化合 物170蛋白质样品使用在pBAD细菌表达系统手册(Invitrogen)中详 述的渗透压休克法来产生。使用BCA测定法(Pierce)来测定样品的 总蛋白质浓度。在如实施例1中所述的ELISA中，就其与TNF-α的结 合来检测由细菌表达的化合物170。
图9显示了在细菌系统中产生的化合物170在ELISA测定法中保 持与TNF-α的结合。
用于化合物170的细菌表达的DNA序列如下：
ATGGCGAGCACCGATATTCAGATGACCCAGAGCCCGAGCAGCCTGAGCGCGAGCGTGGGT
GATCGTGTGACCATTACCTGCCGTGCGAGCCAGGCGATTGATAGCTATCTGCATTGGTAT
CAGCAGAAACCGGGCAAAGCGCCGAAACTGCTGATTTATAGCGCGAGCAACCTGGAAACC
GGCGTGCCGAGCCGTTTTAGCGGCAGCGGTAGCGGCACCGATTTTACCCTGACCATTAGC
AGCCTGCTGCCGGAAGATTTTGCGACCTATTATTGCCAGCAGGTGGTGTGGCGTCCGTTT
ACCTTTGGCCAGGGCACCAAAGTGGAAATTAAACGCGTGGAACCGAAAAGCAGCGATAAA
ACCCACACGTGCCCGCCGTGTCCGGCGCCGGAACTGCTGGGTGGCCCGAGCGTGTTTCTG
TTTCCGCCGAAACCGAAAGATACCCTGATGATTAGCCGTACCCCGGAAGTGACCTCCCTC
GTGGTGGATGTGAGCCATGAAGATCCGGAAGTGAAATTCAACTGGTATGTGGATGGCGTG
GAAGTGCATAACGCGAAAACCAAACCGCGTGAAGAACAGTATAACAGCACCTATCGTGTG
GTGAGCGTGCTGACCGTGCTGCATCAGGATTGGCTGAACGGCAAAGAATACAAATGCAAA
GTGTCTAACAAAGCGCTGCCGGCGCCGATTGAAAAAACCATCAGCAAAGCGAAAGGCCAG
CCGCGTGAACCGCAGGTGTATACCCTGCCGCCGAGCCGTGATGAACTGACCAAAAACCAG
GTGAGCCTGACCTGCCTGGTGAAAGGCTTTTATCCGAGCGATATTGCGGTGGAATGGGAA
AGCAACGGCCAGCCGGAAAACAACTATAAAACCACCCCGCCGGTGCTGGATAGCGATGGC
AGCTTTTTCCTGTATAGCAAACTGACCGTGGATAAAAGCCGTTGGCAGCAGGGCAACGTG
TTTAGCTGCAGCGTGATGCATGAAGCGCTGCATAACCATTATACCCAGAAAAGCCTGAGC
CTGAGCCCGGGTAAAGCGGCGGCG
(SEQ ID No：61)。
由SEQ ID No：61编码的氨基酸序列如下：
MASTDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQAIDSYLHWYQQKPGKAPKLLIYSASNLET
GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLLPEDFATYYCQQVVWRPFTFGQGTKVEIKRVEPKSSDK
THTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGV
EVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQ
PREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDG
SFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKAAAVDHHHHHH
(SEQ ID NO：62)。
化合物170在人TNF介导的鼠类关节炎模型中的体内效用
人TNF转基因小鼠系Tg197表现出失调的TNF表达，并发展出慢 性炎性多关节炎(Keffer，J.等人， (1991)， Transgenic mice expressing human tumor necrosis factor：a predictive genetic model of arthritis.EMBO Journal 10：4025-31)。在这些小鼠中 化合物170(SEQ ID No：11)的施用防止了关节炎的形成以及相关的 体重减轻(图10A和B)。8只杂合的Tg197的组(每组包含4只雄性 和4只雌性)通过每周两次腹膜内注射化合物170和不相关特异性对 照人IgG1(帕利珠单抗[]，MedImmune/Abbott)(在PBS中) 进行治疗，均以10mg/kg。治疗在小鼠3周龄时开始。按一周的间隔， 对小鼠进行称重并基于目测踝关节形态学(肿胀、变形和活动程度) 进行评分(关节炎得分)。
在化合物112中位置114处的Cys的置换导致增加的蛋白质表达
化合物112(SEQ ID No：59)是化合物170(SEQ ID No：11) 的修饰产物，其在位置114处包含半胱氨酸残基而不是丝氨酸残基， 后者存在于化合物170的这个位置上。通过与化合物170进行比较评 价了半胱氨酸114置换为丝氨酸对于蛋白质表达的影响。通过如“材 料和方法”部分所述的使用固相TNF的ELISA，就蛋白质表达来对用 化合物112和170的基因构建体转染的宿主细胞的多个培养物进行检 测。结果显示在图11中。
本领域技术人员将会意识到，可以对如具体实施方案中所示的本 发明进行众多改变和/或修饰，而不背离如广泛描述的本发明的精神或 范围。因此，这些实施方案在所有方面被视为举例说明性的而非限制 性的。
序列表
<110>Peptech Limited
<120>结构域抗体构建体
<130>WJP GHE 03 1411 5717
<160>64
<170>PatentIn version 3.3
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<211>216
<212>PRT
<213>来自Swissprot数据库登录号P01857的CH2/CH3结构域序列
<400>63
<210>64
<211>17
<212>PRT
<213>合成的
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(1)
<223>X为缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(6)..(6)
<223>X不存在或为除半胱氨酸以外的其他氨基酸
<400>64
由于其在炎症中的作用，在减轻炎性病症的症状的努力中，TNF- α已作为重要的用于抑制的靶标而显露出来。已追求了多种为了疾病 的临床治疗而抑制TNF-α的方法，特别是包括可溶性TNF-α受体和特 异于TNF-α的抗体的用途。
结构域抗体
结构域抗体(dAb)是抗体的最小功能性结合单元，并且相应于抗 体的重链可变区(VH)或轻链可变区(VL)。结构域抗体具有约13kDa 的分子量，或小于完整抗体大小的十分之一。
与常规抗体不同，结构域抗体在细菌、酵母和哺乳动物系统中良 好表达。它们的小尺寸允许更高的摩尔量/克产物，从而提供了效力/ 毫克剂量的显著增加。此外，dAb可以用作构建部件，以制备治疗产 物例如多重靶向性的包含dAb的分子，其中两个或更多个dAb结合至 两个或更多个不同的分子靶，或者可以将dAb合并入为肺或口服施用 而设计的结构中。
本发明者现在已设计出一种新的包含免疫球蛋白可变结构域的结 构域抗体构建体，所述可变结构域连接至包括有截短的CH1结构域的 恒定区。推测包含恒定区有助于延长通常具有短的持续时间的dAb的 体内半衰期。
新世界灵长类免疫球蛋白
进化上遥远的灵长类，例如新世界灵长类，足够类似于人以具有 类似于人抗体的抗体，从而使得当衍生自此类灵长类的抗体被引入人 中时，宿主不产生抗抗体免疫应答。新世界灵长类(广鼻猴下目 (Platyrrhini))包含至少53个种，其通常分成2个科：狨科 (Callithricidae)和悬猴科(Cebidae)。狨科由狨和组成。悬 猴科包括松鼠猴、青猴、蜘蛛猴、绒毛猴、悬猴、夜或枭猴和吼猴。
先前的研究已表征了表达的普通狨(Callithrix jacchus)的免 疫球蛋白重链储库(von Budingen H-C等人，Characterization of the expressed immunoglobulin IGHV repertoire in the New World marmoset Callithrix jacchus.Immunogenetics；53：557-563 (2001))。鉴定了6个IGHV亚群，其显示了与它们的人IGHV对应物 的高度序列相似性。当与互补决定区(CDR)相比较时，构架区是更保 守的，其中最高程度的可变性位于CDR3中。普通狨与人IGHV序列之 间的相似性程度小于旧世界灵长类与人之间的相似性程度。
发明概述
第一方面，本发明提供了与人TNF-α结合的结构域抗体构建体， 所述构建体包含：
(a)与人TNF-α结合的结构域抗体(dAb)；
(b)经修饰的铰链区序列；
(c)人或灵长类重链恒定区序列，其具有不多于20个残基，更优 选地不多于10个残基，更加优选地不多于5个残基和更为优选地单个 残基的截短的CH1结构域，
其中所述经修饰的铰链区序列包含缺失或者半胱氨酸残基的单氨 基酸置换，所述半胱氨酸残基通常促进重和轻抗体链间二硫键的形成。
第二方面，本发明提供了编码本发明第一方面的结构域抗体构建 体的核酸序列。
第三方面，本发明提供了分离的核酸分子，其包含编码与人TNF- α结合的结构域抗体构建体的序列，其中所述核酸分子包含与SEQ ID No：50或SEQ ID No：51所示的序列至少60％同一的，优选地至少80％ 同一的，更优选地至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一的核酸序 列，和最优选地包含SEQ ID No：50或SEQ ID No：51所示的序列。
第四方面，本发明提供了分离的核酸分子，其包含编码与人TNF- α结合的结构域抗体构建体的序列，其中所述核酸分子包含与SEQ ID No：50或SEQ ID No：51所示核苷酸序列在高严紧度条件下杂交的核 酸序列。
第五方面，本发明提供了药物组合物，其包含有效量的根据第一 方面的结构域抗体构建体，以及药学上可接受的载体或稀释剂。
第六方面，本发明提供了根据本发明第一方面的结构域抗体构建 体在检测人TNF-α的诊断应用中的用途。
第七方面，本发明提供了用于在人受试者中治疗特征在于人TNF- α活性的病症的方法，其包括给所述受试者施用根据本发明第二方面 的药物组合物。
附图简述
图1显示了接纳体(acceptor)dAb的氨基酸序列(SEQ ID No：5) 和核苷酸序列(SEQ ID No：6)。
图2显示了本发明的结构域抗体构建体的优选实施方案的结构， 作为(A)单体和(B)二聚体。
图3显示了十一个(11)狨和六个(6)枭猴Vκ基因区段的核苷 酸和氨基酸序列。
图4显示了接纳体dAb的氨基酸序列和核苷酸序列(两条链)。 图中标示了KpnI和SanDI的限制性消化位点，其切出包含CDR2的区 域。被除去的CDR2残基以下划线标示。
图5显示了化合物170(SEQ ID No：11)在鼠类L929细胞生存 力测定法中中和TNF-α介导的细胞毒性的能力。
图6显示了，化合物170(SEQ ID No：11)阻止TNF-α与人p55 或p75 TNF受体的相互作用。
图7显示了，表达跨膜TNF-α的NSO 27D4细胞(黑色实线)的 化合物170(SEQ ID No：11)染色显现出比不相关特异性同种型-匹 配的对照(irrelevant specificity isotype-matched control)(灰 色填充)更高的荧光强度。
图8显示了在细菌表达系统中产生的化合物170(SEQ ID No：11) 在ELISA中保持与TNF-α的结合。
图9显示了相对于特异性对照人IgG1而言，化合物170(SEQ ID No：11)在TNF介导的鼠关节炎模型中的功效。以每周一次的间隔对 小鼠进行评分(关节炎得分)(A)，和称重(B)。
图10显示了对化合物112(SEQ ID No：59)和化合物170(SEQ ID No：11)的蛋白质表达的影响。
图11显示了化合物170(SEQ ID No：11)的非还原性SDS PAGE 分析，所述化合物170来自4×10L先导细胞系(lead cell line) 发酵并经蛋白A纯化。泳道1＝测定法间对照；泳道2＝分子量标 准参照物；泳道3＝空白；泳道4＝经蛋白A纯化的在10L发酵ID (运行1)中的化合物170(SEQ ID No：11)；泳道5＝经蛋白A纯 化的在10L发酵ID(运行2)中的化合物170；泳道6＝经蛋白A 纯化的在10L发酵ID(运行3)中的化合物170；泳道7＝经蛋白A 纯化的在10L发酵ID(运行4)中的化合物170。
图12显示了化合物170(SEQ ID No：11)的还原性SDS PAGE分 析，所述化合物170来自4×10L先导细胞系(lead cell line)发 酵并经蛋白A纯化。泳道1＝测定法间对照；泳道2＝分子量标准 参照物；泳道3＝空白；泳道4＝经蛋白A纯化的在10L发酵ID (运行1)中的化合物170(SEQ ID No：11)；泳道5＝经蛋白A纯 化的在10L发酵ID(运行2)中的化合物170；泳道6＝经蛋白A 纯化的在10L发酵ID(运行3)中的化合物170；泳道7＝经蛋白A 纯化的在10L发酵ID(运行4)中的化合物170。
发明详述
本发明者已产生了结构域抗体构建体，其与人TNF-α结合并且被 推测当给人施用时展现出低免疫原性。该结构域抗体构建体包含相应 于免疫球蛋白重链或轻链可变结构域(即结构域抗体(dAb))的部分、 铰链区和相应于抗体重链恒定区的部分，但其中所述恒定区具有截短 的CH1结构域。
推测包含恒定区部分能增加dAb的体内半衰期，以及提供效应子 功能，所述效应子功能被认为是抗TNF抗体的抗炎机制的组成部分。
第一方面，本发明提供了与人TNF-α结合的结构域抗体构建体， 所述构建体包含：
(a)与人TNF-α结合的结构域抗体(dAb)；
(b)经修饰的铰链区序列；
(c)人或灵长类重链恒定区序列，其具有不多于20个残基，更优 选地不多于10个残基，更加优选地不多于5个残基和更为优选地单个 残基的截短的CH1结构域，
其中所述经修饰的铰链区序列包含缺失或者半胱氨酸残基的单氨 基酸置换，所述半胱氨酸残基通常促进重和轻抗体链间二硫键的形成。
在一个优选的实施方案中，CH1结构域和铰链区为 XEPKSZDKTHTCPPCPA，其中X为缬氨酸、亮氨酸或异亮苷酸，和Z不存 在或为除半胱氨酸以外的其他氨基酸。优选地，X为缬氨酸，和Z为 丝氨酸。
在本发明的一个优选实施方案中，所述dAb包含免疫球蛋白重链 或轻链可变结构域，其中所述可变结构域包含至少一个具有来源于新 世界灵长类的序列的互补决定区(CDR)，其中所述CDR选自YAATKLQS (SEQ ID No：1)、YEASSLQS(SEQ ID No：2)、YEASKLQS(SEQ ID No：3)和YSASNLET(SEQ ID No：4)。
在另一优选的实施方案中，所述CDR为CDR2。
在一个优选的实施方案中，dAb具有选自下列的序列：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIDSYLHWYQQKPGKAPKLLIYSASNLETG
VPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQVVWRPFTFGQGTKVEIKR
(化合物145；SEQ ID No：7)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQAIDSYLHWYQQKPGKAPKLLIYSASNLET
GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQVVWRPFTFGQGTKVEIKR
(化合物123；SEQ ID No：8)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIDSYLHWYQQKPGKAPKLLIYSASNLETG
VPSRFSGSGSGTDFTLTISSLLPHDFATYYCQQVVWRPFTFGQGTKVEIKR
(化合物100；SEQ ID No：9)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQAIDSYLHWYQQKPGKAPKLLIYSASNLET
GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLLPEDFATYYCQQVVWRPFTFGQGTKVEIKR
(化合物196；SEQ ID No：10)
DIQMTQSPSSLSASVGDRYTITCRASQSIDSYLHWYQQKPGKPPKLLIYSASNLETG
VPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQVVWRPFTFGQGTKVEIKR
(化合物134；SEQ ID No：52)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIDSYLHWYQQKPGKAPKLLIYSASNLETG
VPSRFSGRGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQVVWRPFTFGQGTKVEIKR
(化合物137；SEQ ID No：53)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIDSYLHWYQQKPGKAPKLLIYSASNLETG
VPSRFSGSGSGTDFTLTISSLVPEDFATYYCQQVVWRPFTFGQGTKVEIKR
(化合物121；SEQ ID No：54)；和
与这些序列之一至少95％，更优选地至少96％、97％、98％或99％同一的 序列。
在进一步的优选实施方案中，所述恒定区包含CH2和CH3结构域， 其一起具有下列序列：
PELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHN
AKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKG
QPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPV
LDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK；
(SEQ ID NO：63)
或者与其至少60％同一的，优选地至少80％同一的，更优选地至少90％、 95％、96％、97％、98％或99％同一的氨基酸序列。
在另一个优选的实施方案中，所述结构域抗体构建体包含与SEQ ID No：11所示的序列至少60％同一的，优选地至少80％同一的，更优 选地至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一的氨基酸序列，和最优 选地包含SEQ ID No：11所示的序列。
此处所用的术语“与......结合”意指抗原被免疫球蛋白可变区 以1μM或更低的解离常数(Kd)进行结合，如使用例如BIAcoreTM表 面等离子体共振系统和BIAcoreTM动力学评估软件(例如，2.1版)通 过表面等离子体共振分析所测量的。特异性结合相互作用的亲和力或 解离常数(Kd)优选地为约500nM或更低，更优选地约300nM或更 低，以及优选地至少300nM至50pM，200nM至50pM，和更优选地 至少100nM至50pM，75nM至50pM，10nM至50pM。此处所用的 术语“dAb”指与抗原特异性地结合的抗体单可变结构域(VH或VL)多 肽。
在本发明的一个进一步的优选实施方案中，结构域抗体构建体与 另一个根据本发明的结构域抗体构建体形成同或异二聚体。二聚化能 够增加抗原结合的强度，其中所述结合的强度与多个结合位点的结合 亲和力总和有关。为了促进二聚体的形成，结构域抗体构建体的铰链 区包含至少一个，和优选地两个半胱氨酸残基。
在本发明的一个特别优选的实施方案中，结构域抗体构建体和一 个相同的结构域抗体构建体形成同二聚体。
因此，在另一个方面中，本发明提供了与人TNF-α结合的二聚结 构域抗体构建体，其中所述二聚体由两个根据本发明的结构域抗体构 建体组成。
优选的是，二聚结构域抗体构建体为同二聚体，并且特别优选的 是，组成同二聚体的所述结构域抗体构建体包含与SEQ ID No：11所 示的序列至少60％同一的，优选地至少80％同一的，更优选地至少90％、 95％、96％、97％、98％或99％同一的氨基酸序列，和最优选地包含SEQ ID No：11所示的序列。
第二方面，本发明提供了编码本发明第一方面的结构域抗体构建 体的核酸序列。
第三方面，本发明提供了分离的核酸分子，其包含编码与人TNF- α结合的结构域抗体构建体的序列，其中所述核酸分子包含与SEQ ID No：50或SEQ ID No：51所示的序列至少60％同一的，优选地至少80％ 同一的，更优选地至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一的核酸序 列，和最优选地包含SEQ ID No：50或SEQ ID No：51所示的序列。
第四方面，本发明提供了分离的核酸分子，其包含编码与人TNF- α结合的结构域抗体构建体的序列，其中所述核酸分子包含与SEQ ID No：50或SEQ ID No：51所示核苷酸序列在高严紧度条件下杂交的核 酸序列。
在确定两个多肽序列是否落在同一性百分比限度内时，本领域技 术人员将会意识到必须进行并列比较或者序列的多重比对。在这样的 比较或比对中，差异将在不相同的残基的定位中出现，这取决于用来 进行比对的算法。在本文本中，提及两个或更多个氨基酸序列之间的 “同一性百分比”或者“相似性”应被视为分别指所述序列之间相同 的或相似的残基的数目，如用本领域技术人员已知的任何标准算法所 测定的。例如，氨基酸序列同一性或相似性可以用GAP程序进行计算 和/或用PILEUP程序(Computer Genetics Group，Inc.，University Research Park，Madison，Wisconsin，United States of America) (Devereaux等人，1984)进行比对。GAP程序使用了Needleman和 Wunsch(1970)的算法来使相同的/相似的残基的数目最大化并使在比 对中序列缺口的数目和长度最小化。备选地或者另外地，当比较多于 两个的氨基酸序列时，可以使用Thompson等人(1994)的Clustal W 程序。
在确定两个核苷酸序列是否落在这些百分比限度内时，本领域技 术人员将会意识到必须进行并列比较或者序列的多重比对。在这样的 比较或比对中，差异可在不相同的残基的定位中出现，这取决于用来 进行比对的算法。在本文本中，提及两个或更多个核苷酸序列之间的 “同一性百分比”应被视为指所述序列之间相同的残基的数目，如用 本领域技术人员已知的任何标准算法所测定的。例如，可以采用 BESTFIT程序或者其它合适的程序(Computer Genetics Group，Inc.， University Research Park，Madison，Wisconsin，United States of America)(Devereaux等人，Nucl.Acids Res.，12：387-395，1984) 来对核苷酸序列进行比对并计算它们的同一性。
高严紧度优选涉及在65℃和0.1×SSC(1×SSC＝0.15M NaCl， 0.015M柠檬酸钠，pH7.0)的条件下的杂交。
在一个实施方案中，本发明还基于用于扩增新世界灵长类免疫球 蛋白可变区基因的方法，例如使用对于重链和轻链可变区基因家族特 异的引物通过聚合酶链式反应(PCR)从提取自新世界灵长类淋巴细胞 的核酸中进行扩增。例如，关于重链和轻链可变结构域基因(分别为 VH和VL)的边界的信息可以用于设计PCR引物，所述引物从经克隆的 重链或轻链编码序列中扩增可变结构域，所述重链或轻链编码序列编 码已知与给定抗原相结合的抗体。然后，将扩增的可变区单独地或者 作为与另一本发明的人或灵长类恒定区多肽序列的融合物插入合适的 表达载体中，以产生本发明的结构域抗体构建体。合适的表达载体将 是本领域技术人员所熟知的。
VH、VL和恒定区结构域储库可以是天然存在的免疫球蛋白序列储 库或合成的储库。天然存在的储库是例如从表达免疫球蛋白的细胞制 备的储库，所述表达免疫球蛋白的细胞从一种或多种灵长类中收获。 此类储库可以是原初的()，即从新生的表达免疫球蛋白的细胞 制备，或者是重排的，即从例如成年灵长类B细胞制备。需要时，随 后对从天然储库或任何储库中鉴定的结合靶抗原的克隆实施诱变并进 一步进行筛选，以产生和选择具有改善的结合特征的变体。
单个免疫球蛋白可变结构域的合成储库是通过向经克隆的可变结 构域中人工引入多样性来制备的。
可以通过例如噬菌体展示，就所希望的结合特异性和功能行为来 筛选VH和VL结构域储库。用于构建噬菌体展示文库和λ噬菌体表达文 库的方法在本领域中是众所周知的。噬菌体展示技术已在本领域中进 行了广泛描述，以及用于产生和筛选这样的文库以及对它们的产物进 行亲和力成熟的方法和化合物的例子可以在例如下列文献中找到： Barbas等人，(1991)PNAS 88：7978-7982；Clarkson等人.(1991) Nature 352：624-628；Dower等人，PCT.91/17271，美国专利号 5,427,908，美国专利号5,580,717和EP 527,839；Fuchs等人，(1991) Bio/Technology 9：1370-1372；Garrad等人，(1991)Bio/Technology 9：1373-1377；Garrard等人，PCT WO 92/09690；Gram等人，(1992) PNAS 89：3576-3580；Griffiths等人，(1993)EMBO J 12：725-734； Griffiths等人，美国专利号5,885,793和EP 589,877；Hawkins等 人，(1992)J Mol Biol 226：889-896；Hay等人，(1992)Hum Autibod Hybridomas 3：81-85；Hoogenboom等人，(1991)Nuc Acid Res 19： 4133-4137；Huse等人，(1989)Science 246：1275-1281；Knappik 等人，(2000)J Mol Biol 296：57-86；Knappik等人，PCT WO 97/08320； Ladner等人，美国专利号5,223,409，5,403,484，5,571,698， 5,837,500和EP 436,597；McCafferty等人，(1990)Nature 348： 552-554；McCafferty等人，PCT.WO 92/01047，美国专利号 5,969,108和EP 589,877；Salfeld等人，PCT WO 97/29131，美国临 时申请号60/126,603；和Winter等人，PCT WO 92/20791和EP 368,684。
表达VH和VL结构域储库的重组文库可以在微生物例如酵母或细菌 的表面上进行表达(参见PCT公开WO 99/36569和98/49286)。
本发明的结构域抗体构建体可以通过重组方法来产生，包括从真 核表达系统中产生，所述真核表达系统包括例如酵母、高等植物、昆 虫和哺乳动物细胞，以及真菌表达系统和病毒编码的表达系统，如此 处所描述的或者本领域已知的。
本发明的结构域抗体构建体可以用S抗体编码核酸来制备，以便 提供转基因植物和培养的植物细胞(例如，但不限于，烟草和玉米)， 其在植物的某些部位中或者在由其培养出的细胞中产生这样的构建 体。作为非限制性的例子，表达重组蛋白质的转基因烟草叶已被成功 用于提供大量的重组蛋白质，例如，采用诱导型启动子(参见例如， Cramer等人，Curr.Top.Microbol.Immunol.240：95-1181999) 和其中所引用的参考文献。此外，转基因玉米也已经用于以商业生产 水平来表达哺乳动物蛋白质，其生物活性等价于在其他重组系统中生 产的或者从天然来源中纯化的蛋白质(参见例如，Hood等人，Adv.Exp. Med.Biol.464：127-147 1999和其中所引用的参考文献)。也已从 转基因植物种子(包括烟草种子和马铃薯块茎)中大量生产抗体，包 括抗体片段例如单链抗体(scFv′s)(参见例如，Conrad等人，Plant Mol.Biol.38：101-109， 1998和其中所引用的参考文献)。因此， 本发明的结构域抗体构建体也可以根据已知的方法用转基因植物来生 产(也参见例如，Fischer等人，Biotechnol.Appl.Biochem.30： 99-108 October，1999；Ma & Hein.，Trends Biotechnol.13：522-7 1995；Ma等人，Plant Physiol.109：341-61995；Whitelam等人， Biochem.Soc.Trans.22：940-944 1994；和其中所引用的参考文 献；以上每一篇参考文献在此通过提及而整体合并入本文)。
本发明的结构域抗体构建体包括天然纯化的产物、化学合成方法 的产物和通过重组技术从真核宿主(包括例如酵母、高等植物、昆虫 和哺乳动物细胞)中产生的产物。取决于在重组生产方法中所采用的 宿主，本发明的抗体构建体可以是糖基化的或者非糖基化的，其中优 选是糖基化的。这样的方法在许多标准的实验室手册中已有描述， Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版， Cold Spring Harbor，N.Y.1989，第17.37-17.42节；Ausubel等人， 编辑，Current Protocols in Molecular Biology 1987-1993，第10， 12，13，16，18和20章；Colligan等人，Current Protocols in Protein Science，John Wiley & Sons，NY，N.Y.1997-2001，Protein Science，第12-14章，所有文献在此通过提及而整体合并入本文。
在一种表达系统中，在核糖体上展示重组肽/蛋白质文库(例如参 见Roberts，RW和Szostak，J.W.1997.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.94： 12297-123202以及PCT公开号WO 98/31700)。因此，另一个例子涉 及DNA文库(例如，优选从经免疫的细胞制备的抗体或衍生物的DNA 文库，但不限于此)的产生和体外转录，翻译该文库，从而使得蛋白 质和“经免疫的”mRNA停留在核糖体上，亲和力选择(例如通过与RSP 结合)，mRNA分离，反向翻译和后续扩增(例如通过聚合酶链式反应 或相关技术)。必要时可以偶联另外的选择和扩增循环，以通过在这 种系统中引入体细胞突变或通过现有技术中已知的其他亲和力成熟方 法来进行亲和力成熟。
另一个例子考虑应用乳状液区室化技术(emulsion compartmentalisation technology)以产生本发明的结构域抗体。 在乳状液区室化中，将体外和光学分选方法与在乳状液的油滴内的水 相中翻译的蛋白质及其核苷酸编码序列的共区室化相组合(参见PCT 公开号WO 99/026711和WO00/40712)。
CDR序列可以得自几个来源，例如数据库，如国家生物技术信息 中心(National Centre for Biotechnology Information)蛋白质 和核苷酸数据库(www.ncbi.nlm.nih.gov)，The Kabat Database of Sequences of Proteins of Immunological Interest (www.kabatdatabase.com)，或IMGT数据库(www.imgt.cines.fr)。 备选地，可以从VH和VL结构域储库预测CDR区(参见例如Kabat EA 和Wu TT，Attempts to locate complementarity determining residues in the variable positions of light and heavy chains. Ann.NY Acad.Sci.190：382-393(1971))。CDR序列可以是基因组 DNA或cDNA。
存在许多方法可以把替代CDR嫁接到可变区序列中，并且这样的 方法对于本领域技术人员将会是熟悉的。本发明的优选方法涉及经由 引物指导的诱变来替换可变区(或dAb)中的CDR2。该方法由下述步 骤组成：使编码所需突变的合成寡核苷酸与靶区域退火，其中它充当 引物用于起始体外DNA合成；通过DNA聚合酶延伸寡核苷酸以产生携 带所需突变的双链DNA；和将该序列连接并克隆到合适的表达载体中。
在本发明的优选实施方案中，将新世界灵长类的CDR序列嫁接到 在人中具有低免疫原性的可变区序列中。
术语“低免疫原性”是指结构域抗体构建体或其抗原结合部分在 人中不产生这样的抗体应答，即所述抗体应答的量级足以减少以达到 治疗效果来说足够的时间连续施用所述结构域抗体构建体的功效。
优选地，其中嫁接入新世界灵长类CDR的可变区序列为图1中的 “dAb接纳体序列”(命名为化合物128)。该dAb接纳体序列由SEQ ID No：5所示的氨基酸序列组成：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIDSYLHWYQQKPGKAPKLLIYSASELQSG
VPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQVVWRPFTFGQGTKVEIKR
(SEQ ID No：5)。
该序列由SEQ ID No：6所示的核苷酸序列编码：
GAC ATC CAG ATG ACC CAG TCT CCA TCC TCT CTG TCT GCA TCT GTA GGA
GAC CGT GTC ACC ATC ACT TGC CGG GCA AGT CAG AGC ATT GAT AGT TAT
TTA CAT TGG TAC CAG CAG AAA CCA GGC AAA GCC CCT AAG CTC CTG ATC
TAT AGT GCA TCC GAG TTG CAA AGT GGG GTC CCA TCA CGT TTC AGT GGC
ACT GGA TCT GGG ACA GAT TTC ACT CTC ACC ATC AGC AGT CTG CAA CCT
GAA GAT TTT GCT ACG TAC TAC TGT CAA CAG GTT GTG TGG CGT CCT TTT
ACG TTC GGC CAA GGG ACC AAG GTG GAA ATC AAA CGG
(SEQ ID No：6)。
在本发明的一个优选实施方案中，将新世界灵长类狨CDR序列 YSASNLET(SEQ ID No：4)嫁接入该可变区dAb接纳体序列中，以便 替代该dAb接纳体序列的CDR2序列(YSASELQS；SEQ ID No：55)， 从而产生下面的dAb(命名为化合物145)：
化合物145
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIDSYLHWYQQKPGKAPKLLIYSASNLETG
VPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQVVWRPFTFGQGTKVEIKR
(SEQ ID No：7)。
因此，在一个优选的实施方案中，与人TNF-α结合的结构域抗体 构建体的dAb包含SEQ ID No：7所示的氨基酸序列。
结构域抗体构建体的可变区序列(dAb)可以进一步经历亲和力成 熟以便改善其抗原结合特征，这在本发明的范围之内。这可能需要对 结构域抗体构建体的CDR1、CDR3或构架区中的某些氨基酸残基进行修 饰。
例如，如“材料和方法”中所述的，对SEQ ID No：7进行亲和力 成熟，并就TNF-α结合进行测试。在进一步的优选实施方案中，与人 TNF-α结合的结构域抗体构建体的可变区(dAb)包含SEQ ID No：8 或SEQ ID No：9的氨基酸序列。这些被分别命名为化合物123和化合 物100，并且它们的序列如下所示：
化合物123
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQAIDSYLHWYQQKPGKAPKLLTYSASNLET
GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQVVWRPFTFGQGTKVEIKR
(SEQ ID No：8)
化合物100
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTTTCRASQSIDSYLHWYQQKPGKAPKLLTYSASNLETG
VPSRFSGSGSGTDFTLTISSLLPEDFATYYCQQVVWRPFTFGQGTKVEIKR
(SEQ ID No：9)。
在一个特别优选的实施方案中，与人TNF-α结合的结构域抗体构 建体的可变区(dAb)包含SEQ ID No：10的氨基酸序列。这被命名为 化合物196，并且序列提供在下面：
化合物196
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQAIDSYLHWYQQKPGKAPKLLIYSASNLET
GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLLPEDFATYYCQQVVWRPFTFGQGTKVEIKR
(SEQ ID No：10)。
本领域技术人员将会意识到，结构域抗体构建体的恒定区序列可 以来源于人或灵长类序列。灵长类序列可以是新世界灵长类或旧世界 灵长类序列。合适的旧世界灵长类包括黑猩猩，或其他类人猿例如大 猩猩或猩猩，它们由于其与人的紧密的系统发生接近性而与人恒定区 序列共享高度的同源性。优选地，所述恒定区来源于人抗体序列。这 样的序列的例子可以在下列中找到：国家生物技术信息中心蛋白质和 核苷酸数据库(www.ncbi.nlm.nih.gov)，The Kabat Database of Sequences of Proteins of Immunological Interest (www.kabatdatabase.com)，或IMGT数据库(www.imgt.cines.fr)。
在设计本发明的结构域抗体构建体中，本发明者截短了恒定(Fc) 区的CH1结构域。保留了最小数目的CH1结构域残基以便为铰链区附近 的结构域抗体构建体提供柔韧性。优选地，保留CH1结构域的至少20 个C-末端氨基酸残基，更优选地至少10个氨基酸，更加优选地至少5 个氨基酸，更为优选地单个氨基酸残基。
因此，在优选的实施方案中，结构域抗体构建体具有包含下列组 分的形式：dAb-C末端CH1结构域残基-铰链区-CH2结构域-CH3结 构域，如图2中所示意性地图解说明的。
在特别优选的实施方案中，结构域抗体构建体具有SEQ ID No：11 所示的氨基酸序列。这被命名为化合物170。
化合物170
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQAIDSYLHWYQQKPGKAPKLLIYSASNLET
GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLLPEDFATYYCQQVVWRPFTFGQGTKVEIKRVEPKS
SDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFN
WYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALP
APLEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNG
QPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQK
SLSLSPGK (SEQ ID No：11)。
天然存在的免疫球蛋白的铰链区包含半胱氨酸(C)侧链，其促进 重链CH1结构域和轻链恒定区结构域之间二硫键的形成。由于所述构 建体只包含单个可变结构域，从而留下一个潜在具有活性的未配对的 半胱氨酸残基，因此将该半胱氨酸残基用阻止二硫键形成的氨基酸残 基置换。具有未配对的半胱氨酸的可能后果可以包括由于构建体的聚 集和错误折叠所导致的降低的蛋白质表达。
应当理解，来源于任何抗体类别的任何铰链区序列可适合在本发 明中使用。不过，铰链区优选来自抗体亚类IgG1。优选地，所述铰链 区基于IgG1铰链区的天然存在的序列，并且包含序列 EPKSSDKTHTCPPCPA(SEQ ID No：12)。在此序列中，通常存在于位 置5处的Cys加下划线的Ser残基替代。
优选地，CH1结构域的C-末端氨基酸残基来源于IgG1。更优选地， CH1残基为缬氨酸(V)残基或保守氨基酸置换例如亮氨酸(L)或异亮 氨酸(I)。该残基紧邻铰链区并且有助于增加铰链区附近构建体的灵 柔韧性。
CH2和CH3结构域的序列优选来源于Swissprot数据库登录号 PO1857：
PELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHN
AKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKG
QPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPV
LDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
(SEQ ID No：63)。
所述结构域抗体构建体可以衍生化或与另一种功能分子连接。例 如，结构域抗体构建体可以通过化学偶联、基因融合、非共价结合或 其他方式与一种或多种其他分子实体进行功能上连接，所述其他分子 实体例如为另一种抗体、可检测的试剂、细胞毒剂、药物试剂和/或可 以介导所述抗体或抗体结合部分与另一种分子(例如链霉抗生物素蛋 白核心区或多组氨酸标签)结合的蛋白质或肽。
结构域抗体构建体可以与之衍生的有用的可检测试剂包括荧光化 合物。示例性的荧光可检测试剂包括荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹 明、5-二甲基胺-1-萘磺酰氯、藻红蛋白等。结构域抗体构建体还可以 用可检测的酶进行衍生化，例如碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、葡萄 糖氧化酶等。当结构域抗体构建体用可检测的酶进行衍生化时，它通 过添加该酶用于产生可检测的反应产物的另外试剂来检测。结构域抗 体构建体还可以用生物素进行衍生化，并通过间接测量抗生物素蛋白 或链霉抗生物素蛋白结合进行检测。
可以将根据本发明的结构域抗体构建体与一种或多种分子连接， 所述分子能够在体内提供增加的半衰期和针对降解的抗性而无活性 (例如，结合亲和力)的损失。这些分子可以通过连接体而连接至结 构域抗体构建体，从而它们不干扰/在空间上阻碍抗原结合位点。这些 加合分子包括如美国专利申请20050271663所述的针对内源分子的 dAb。通常，此类加合分子是体内天然存在并且抵抗经由内源性机制的 降解或去除的多肽或多肽片段。增加半衰期的分子可以选自下列：
(a)来自细胞外基质的蛋白质，例如，胶原，层粘连蛋白，整联 蛋白和纤连蛋白；
(b)在血液中发现的蛋白质，例如纤维蛋白，α-2巨球蛋白， 血清白蛋白，纤维蛋白原A，纤维蛋白原B，血清淀粉样蛋白A，庚珠 蛋白(heptaglobin)，蛋白质，泛蛋白，子宫球蛋白(uteroglobulin)， β-2微球蛋白，纤溶酶原，溶菌酶，半胱氨酸蛋白酶抑制剂C，α-1- 抗胰蛋白酶和胰腺胰蛋白酶抑制剂；
(c)免疫血清蛋白，例如IgE，IgG，IgM；
(d)转运蛋白，例如视黄醇结合蛋白，α-1微球蛋白；
(e)防卫素，例如β-防卫素1，嗜中性粒细胞防卫素1、2和3；
(f)在血脑屏障处或在神经组织中发现的蛋白质，例如黑皮质素 受体、髓磷脂、抗坏血酸转运体；
(g)转铁蛋白受体特异性配体-神经药物试剂融合蛋白(参见 US5977307)；脑毛细管内皮细胞受体，转铁蛋白，转铁蛋白受体，胰 岛素，胰岛素样生长因子1(IGF1)受体，胰岛素样生长因子2(IGF 2)受体，胰岛素受体；
(h)定位于肾的蛋白质，例如多囊蛋白，IV型胶原，有机阴离 子运载体K1，Heymann′s抗原；
(i)定位于肝的蛋白质，例如乙醇脱氢酶，G250；
(j)凝血因子X；
(k)α-1抗胰蛋白酶；
(l)HNF 1α；
(m)定位于肺的蛋白质，例如分泌组分(结合IgA)；
(n)定位于心脏的蛋白质，例如HSP 27；
(o)定位于皮肤的蛋白质，例如角蛋白；
(p)骨特异性蛋白质，例如骨形态发生蛋白(BMPs)，例如BMP-2、 -4、-5、-6、-7(也称为成骨蛋白(OP-1))和-8(OP-2)；
(q)肿瘤特异性蛋白质，例如人滋养层抗原，赫赛汀(herceptin) 受体，雌激素受体，组织蛋白酶例如组织蛋白酶B(在肝和脾中发现)；
(r)疾病特异性蛋白质，例如仅在活化的T-细胞上表达的抗原： 包括LAG-3(淋巴细胞活化基因)；护骨蛋白配体(OPGL)，参见Kong YY等人，Nature(1999)402，304-309；OX40(TNF受体家族的成员， 在活化的T细胞上表达，以及为已知在产生人T细胞白血病病毒I型 (HTLV-I)的细胞中特异性地上调的唯一共刺激T细胞分子——参见 Pankow R等人，J.Immunol.(2000)Jul 1；165(1)：263-70)；金 属蛋白酶(与关节炎/癌症相关)，包括CG6512果蝇，人截瘫蛋白， 人FtsH，人AFG3L2，鼠类ftsH；血管生成生长因子，包括酸性成纤 维细胞生长因子(FGF-1)，碱性成纤维细胞生长因子(FGF-2)，血 管内皮生长因子/血管通透性因子(VEGF/VPF)，转化生长因子-α(TGF- α)，肿瘤坏死因子-α(TNF-α)，血管生成素，白介素-3(IL-3)， 白介素-8(IL-8)，血小板衍生内皮生长因子(PD-ECGF)，胎盘生长 因子(PlGF)，中期因子(midkine)血小板衍生生长因子-BB(PDGF)， CXXXC趋化分子(fractalkine)；
(s)应激蛋白质(热休克蛋白)；和
(t)参与Fc转运的蛋白质。
本发明还扩展至聚乙二醇化的结构域抗体构建体，其相对于非聚 乙二醇化的抗体多肽而言提供了增加的半衰期和针对降解的抗性而无 活性(例如，结合亲和力)的损失。
结构域抗体构建体可以使用本领域已知的方法与聚合物分子(优 选PEG)偶联，所述聚合物分子对于达到增加的半衰期和降解抗性性 质是有用的。可以在本发明中使用的聚合物部分可以是合成的或天然 存在的，并且包括但不限于，直链或支化的聚亚烷基、聚亚烯基或聚 氧化烯聚合物，或分支或未分支的多糖例如同或杂多糖。可以在本发 明中使用的合成聚合物的优选例子包括直链或支化的聚(乙二醇) (PEG)、聚(丙二醇)或聚(乙烯醇)，及其衍生物或取代的形式。用于 与结构域抗体构建体连接的特别优选的取代的聚合物包括取代的 PEG，包括甲氧基(聚乙二醇)。除PEG外可以使用的，或可以代替PEG 使用的天然存在的聚合物部分包括乳糖、直链淀粉、葡聚糖或糖原， 以及将由本领域技术人员认可的其衍生物。
在本发明中可用的聚合物(PEG)分子可以使用本领域众所周知的 方法与结构域抗体构建体连接。在PEG或其他聚合物部分与本发明的 结构域抗体构建体连接中的第一个步骤是用包含亲电子体的官能团替 换PEG聚合物的羟基末端基团。特别地，将PEG聚合物与结构域抗体 构建体单体或多聚体中存在的半胱氨酸或赖氨酸残基连接。所述半胱 氨酸和赖氨酸残基可以是天然存在的，或可以被改造到结构域抗体构 建体分子中。
可以通过多种方法来完成本发明的结构域抗体构建体的PEG化 (参见例如Kozlowski-A & Harris-JM(2001)Journal of Controlled Release 72：217)。PEG可以直接地或者通过间插性连接体与结构域 抗体构建体连接。用于将聚乙二醇连接至蛋白质的无连接体系统已在 下列文献中描述：Delgado等人(1992)，Crit.Rev.Thera.Drug Carrier Sys.9：249-304；Francis等人，(1998)，Intern.J.Hematol. 68：1-18；US 4,002,531；US 5,349,052；WO 95/06058；和WO 98/32466， 其中每一篇文献的公开内容通过提及而合并入本文。
一种将聚乙二醇直接连接至蛋白质的氨基酸残基而不使用间插性 连接体的系统采用了三氟乙磺酸化的(tresylated)MPEG，其是通过 用三氟乙磺酰氯(tresylchloride)修饰单甲氧基聚乙二醇(MPEG) 而产生的。在氨基酸残基与三氟乙磺酸化的MPEG反应后，将聚乙二醇 直接连接至胺基团上。因此，本发明包括通过将本发明的蛋白质与具 有2，2，2-三氯乙磺酰基的聚乙二醇分子进行反应而产生的蛋白质-聚 乙二醇缀合物。
还可以使用许多不同的间插性连接体来将聚乙二醇连接至蛋白 质。例如，US 5,612,460公开了用于将聚乙二醇连接至蛋白质的氨基 甲酸乙酯连接体。蛋白质-聚乙二醇缀合物(其中聚乙二醇通过连接体 连接至蛋白质)也可以通过将蛋白质与化合物进行反应来产生，所述 化合物例如为MPEG-琥珀酰亚胺基琥珀酸酯、用1，1’-碳酰二咪唑 (1，1’-carbonyldiimidazole)活化的MPEG、MPEG-2，4，5-三氯戊基 碳酸酯、MPEG-对硝基苯酚碳酸酯和各种MPEG-琥珀酸酯衍生物。许多 用于将聚乙二醇连接至蛋白质的其他聚乙二醇衍生物和反应化学在 WO98/32466中进行了描述，其全部公开内容通过提及而合并入本文。
在本发明的一个特别优选的实施方案中，结构域抗体构建体通过 赖氨酸残基直接偶联至聚乙二醇。在本发明的另一个优选实施方案中， 结构域抗体构建体通过半胱氨酸残基直接偶联至PEG。未配对的半胱 氨酸残基可以事先存在于序列中，也可以通过在例如结构域抗体构建 体的C-末端中掺入半胱氨酸残基而添加。备选地，PEG与结构域抗体 构建体的连接可以通过形成二硫键的半胱氨酸残基而得到促进，如在 US20060210526中所描述的。
聚合物分子的其他衍生形式包括例如这样的衍生物，其中存在另 外的部分或反应性基团以允许与本文所述的结构域抗体构建体的氨基 酸残基相互作用。此类衍生物包括N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活性酯， 琥珀酰亚胺基丙酸酯聚合物，和巯基-选择性反应试剂例如马来酰亚 胺，乙烯砜和硫醇。PEG聚合物可以是线性分子，或可以是分支的，其 中多个PEG部分存在于单个聚合物中。
反应性基团(例如，MAL、NHS、SPA、VS或巯基)可以直接与PEG 聚合物连接，或可以经由连接体分子与PEG连接。
在本发明中可用的聚合物的大小可以为500Da-60kDa，例如， 1000Da-60kDa，10kDa-60kDa，20kDa-60kDa，30kDa-60kDa， 40kDa-60kDa，以及高达50kDa-60kDa。在本发明中使用的聚合 物，特别是PEG，可以是直链聚合物或可以具有分支的构象。
在进一步的实施方案中，根据第一方面的结构域抗体构建体可以 是多聚化的，如例如异或同二聚体，异或同三聚体，异或同四聚体， 或更高次的异或同多聚体。多聚化可以增加抗原结合的强度，其中结 合的强度与多个结合位点的结合亲和力总和有关。
第五方面，本发明提供了药物组合物，其包含有效量的根据第一 方面的结构域抗体构建体，以及药学上可接受的载体或稀释剂。
“药学上可接受的载体”包括生理学相容的任何和所有溶剂、分 散介质、包衣剂、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。药 学上可接受的载体的例子包括水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、葡萄糖、 甘油、乙醇等中的一种或多种及其组合。在许多情况下，优选地将是 在组合物中包括等渗剂，例如糖，多元醇例如甘露醇、山梨糖醇，或 氯化钠。药学上可接受的物质例如少量的辅助物质例如湿润或乳化剂、 防腐剂或缓冲质。
所述组合物可以是各种形式，包括液体、半固体和固体剂型，例 如液体溶液(例如可吸入的、可注射的和可输注的溶液)，分散液或 悬浮液，片剂，丸剂，粉剂，脂质体或栓剂。优选地，所述组合物是 用于免疫接种的可注射溶液的形式。施用可以是静脉内、动脉内、皮 下、腹膜内或肌内。
通常，治疗组合物必须是无菌的并且在制造和储存条件下是稳定 的。组合物可以配制为溶液、微乳液、分散体、脂质体或其他适合于 高药物浓度的有序结构。溶液的适当的流动性可以通过例如使用包衣 剂如卵磷脂和/或表面活性剂来维持。无菌可注射溶液可以通过下列方 式来制备：在具有一种上面所列的成分或其组合的合适溶剂中以所需 的量掺入活性化合物(即结构域抗体构建体)，随后过滤灭菌。
所述组合物还可以配制成用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末。
在某些实施方案中，活性化合物可以用载体来制备，所述载体将 保护化合物不被快速释放，例如受控释放制剂，包括植入物，透皮贴 剂和微胶囊化的递送系统。可以使用相容的聚合物，例如乙烯乙酸乙 烯酯，聚酐，聚乙醇酸，胶原，聚原酸酯或聚乳酸。
所述组合物还可以配制用于口服施用。在这个实施方案中，结构 域抗体构建体可以封装在硬或软壳明胶胶囊中，压缩成片剂，或直接 掺入受试者的饮食内。
允许肺、直肠、透皮、鞘内、眼内施用的制剂将是本领域技术人 员熟知的。
还可以将补充的活性化合物掺入至所述组合物中。结构域抗体构 建体可以与一种或多种另外的治疗剂例如可溶性TNF-α受体或抑制 人TNF-α产生的化学试剂，或者结合其他靶标例如细胞因子或细胞表 面分子的抗体一起共配制和/或共施用。备选地，它可以与可溶性免疫 化学试剂例如蛋白A、C、G或L一起共施用。
有效量可以包括治疗有效量或预防有效量的本发明的结构域抗体 构建体。治疗有效量是指以必需的剂量和时间段，对于取得所希望的 治疗结果而言有效的量。预防有效量是指以必需的剂量和时间段，对 于取得所希望的预防结果而言有效的量。因为预防剂量在发病之前或 在疾病的早期阶段施用，所以预防有效量可以比治疗有效量小。
第六方面，本发明提供了根据本发明第一方面的结构域抗体构建 体在检测人TNF-α的诊断应用中的用途。
例如，根据本发明的抗人TNF-α结构域抗体构建体可以用于检测 例如生物样品如血清或血浆中的人TNF-α，其中使用常规的免疫测定 法，例如酶联免疫吸附测定法(ELISA)、放射免疫测定法(RIA)或 组织免疫组织化学。可以通过竞争免疫测定法在生物学流体中测定根 据本发明的抗人TNF-α结构域抗体构建体，其中使用用可检测物质标 记的重组人TNF-α标准和未标记的抗人TNF-α抗体。
根据本发明的抗人TNF-α结构域抗体构建体还可用于检测来自 除人类以外的其他物种例如非人灵长类(包括猕猴、黑猩猩、狨、恒 河猴)和其他物种例如狗、大鼠、小鼠、兔、猫、猪、牛的TNF-α。
根据本发明的抗人TNF-α结构域抗体构建体还可用于其中希望 抑制TNF-α活性的细胞培养应用。
第七方面，本发明提供了用于在人受试者中治疗特征在于人TNF- α活性的病症的方法，其包括给所述受试者施用根据本发明第二方面 的药物组合物。
特征在于人TNF-α活性的病症意欲包括这样的疾病和其他病症， 即其中在患有所述病症的受试者中TNF-α的存在已显示负责或被怀 疑负责所述病症的病理生理学，或者已显示是或被怀疑是促成所述病 症恶化的因素。优选地，特征在于人TNF-α活性的病症选自炎症，炎 性疾病，脓毒症，包括败血症性休克、内毒素性休克、革兰氏阴性脓 毒症和中毒性休克综合征；自身免疫性疾病，包括类风湿性关节炎、 幼年关节炎、类风湿性脊椎炎、强直性脊椎炎、舍格伦综合征、骨关 节炎和痛风性关节炎、过敏症、多发性硬化症、自身免疫性糖尿病、 自身免疫性葡萄膜炎、银屑病、类天疱疮以及肾病综合征；眼的炎性 病况，包括黄斑变性、葡萄膜炎、贝赫切特病；感染性疾病，包括由 于感染和感染后继发的恶病质所引起的发热和肌痛；移植物抗宿主病； 肿瘤生长或转移，恶性血液病(hematologic malignancies)；肺部 病症，包括哮喘、成人呼吸窘迫综合征、休克肺、慢性肺部炎性疾病、 肺结节病、肺纤维化和矽肺；炎症性肠病，包括克罗恩病和溃疡性结 肠炎；心脏病症，充血性心力衰竭；血管病症，包括韦格纳病(Wegener′s sease)、巨细胞动脉炎；炎症性骨病；中枢神经系统病症，例如阿 尔茨海默病；周围神经系统病症，例如坐骨神经痛；肝炎，凝血障碍， 烧伤，再灌注损伤，子宫内膜异位症，瘢痕瘤形成，和瘢痕组织形成。
在一个特别优选的实施方案中，所述特征在于人TNF-α活性的病 症是年龄相关性黄斑变性。TNF-α参与刺激VEGF产生和促进眼内的新 血管形成(Oh-H等人，1999 Inves tigative Ophthalmology & Visual Science 40：1891-98)，因此，TNF-α活性的抑制剂，例如此处所描 述的结构域抗体构建体，可用于治疗与血管生成相关的眼病症，包括 年龄相关性黄斑变性。
在本说明书自始至终，单词“包含”或者变化形式“包括”或“含 有”应当理解为暗示包括所述元素、整数或步骤，或者元素、整数或 步骤的组，但不排除任何其他元素、整数或步骤，或者元素、整数或 步骤的组。
本说明书中提及的所有出版物通过提及而合并入本文。本说明书 中包括的文件、行为、材料、装置、物品等的任何讨论仅用于提供本 发明的背景的目的。它不应被视为承认任何或所有这些内容构成现有 技术基础的一部分或者是在与本发明相关的领域中的公知常识，就好 像它在本申请的每项权利要求的优先权日前存在于澳大利亚或其他地 方。
为了能够更清楚地理解本发明的本质，现在将参考下述非限制性 实施例来描述其优选形式。
实施例1
材料和方法
新世界灵长类VL基因的分离
狨(毛狨属(Callithrix)，种未知)和枭猴(夜猴(Aotus trivirgatus))基因组DNA分别以目录编号85011419和90110510 获自欧洲细胞培养物保藏中心(ECACC)。狨DNA来源于细胞系B95-8， 而枭猴DNA来自细胞系OMK 637-69。
基于人Vκ前导序列和重组信号序列(RSS)的简并引物得自 Walter和Tomlinson，Antibody Engineering：A Practical Approach (1996)。用于扩增种系Vκ DNA的引物如下：
引物VK1BL
AATCKCAGGTKCCAGATG(SEQ ID No：13)
引物VK1BL35a
GTTYRGGTKKGTAACACT(SEQ ID No：14)
引物VK1BL35b
ATGMCTTGTWACACTGTG(SEQ ID No：15)。
采用引物对VK1BL x VK1BL35a或VK1BL x VK1BL35b，使用Taq 聚合酶来进行PCR(30个循环)。在经克隆的序列和所使用的2套引 物之间存在重叠。
将基因组PCR产物克隆入Invitrogen的TOPO TA克隆试剂盒(目 录号K4500-01)中，并用M13正向引物和pUC反向引物进行测序。从 正和反方向对序列进行确认。为了进一步确认关键序列没有发生PCR 错误，对于狨序列重复两次PCR和克隆过程。核苷酸(SEQ ID No：16 -26和SEQ ID No：38-43)和氨基酸(SEQ ID No：27-37和SEQ ID No：44-49)在图3中给出。狨序列1、2和3得到了确认。序列4、 5、6、7和8只在初始PCR中进行了查看。序列9、10和11只在重复 (即第二次)PCR和克隆中进行了查看。
合成寡核苷酸并克隆入接纳体序列中
四个CDR序列，即来自枭猴序列1(SEQ ID No：44)的YAATKLQS (SEQ ID No：1)、来自枭猴序列2(SEQ ID No：45)的YEASSLQS (SEQ ID No：2)、来自狨序列1(SEQ ID No：27)的YEASKLQS(SEQ ID No：3)和来自狨序列2(SEQ ID No：28)的YSASNLET(SEQ ID NO： 4)，选自图3中所示的氨基酸序列。发现枭猴序列5，YYASSLQS(SEQ ID No：56)，与秘鲁夜猴(Aotus nancymaae)(Ma’s夜猴)的cDNA 序列GI6176295相同，而所有其他序列是独特的。
在该表达载体(Domantis拥有专利权的载体)中的接纳体可变区 (抗-TNF的结构域抗体)序列依次用KpnI和SanDI进行消化(25μg)， KpnI和SanDI切除大部分的FR2以及CDR2，如限制性消化图谱(图4) 上所示的。然后，凝胶纯化该载体以除去被切除的野生型FR2和CDR2 序列。
通过下述方式来进行寡核苷酸的退火：将寡核苷酸对(500pmol， 基于在图3中所示的序列)在95℃下温育5分钟，接着在65℃下温育 5分钟，然后让其在热台(hot block)上慢慢达到室温。然后，在dNTP 存在下在Klenow反应中补满重叠部分。使用标准方法完成将合成的双 链DNA(来源于寡核苷酸退火和末端补齐)分子克隆入接纳体可变区 序列中。
亲和力成熟
通过构建14个分开的文库来对嫁接了狨CDR的dAb化合物145 (SEQ ID No：7)进行亲和力成熟，其中每一个文库在单个氨基酸残 基处具有SEQ ID No：7的序列多样化。所选的残基在下面用阴影显示。
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQ WYQQKPGKPKLLIYSASNLETG
VPSRFSGGSGTFTLTISSLPEDFATYYCQQPTFGQGTKVEIKR。
所述选择基于已知在成熟的人Ig储库中多样化的CDR1和CDR3 中的残基，以及被观察到在相关dAb中进行诱变后产生功能性蛋白质 的构架残基。对于每个所选的残基，以NKK简并性设计互补的正向和 反向PCR引物对，并且进行两个初始PCR反应，其中每个PCR反应采 用单诱变引物和侧翼引物。在进行清理之后，将两个PCR产物退火， 随后使用单独的侧翼引物进行扩增(通过PCR的重叠延伸来进行剪接； Lowman H.L.& Clackson T.(编辑)，Phage Display：A practical approach，Oxford University Press，Oxford，UK)。使用固相TNF 通过ELISA对克隆进行初次筛选，并对阳性克隆进行测序。从最好的 克隆中纯化出dAb蛋白质，并就在受体结合测定法和L929细胞毒性测 定法中的效力进行评价。发现化合物100(SEQ ID No：9)和123(SEQ ID No：8)具有相对于亲本dAb即化合物145(SEQ ID No：7)而言 改善的TNF中和作用。
化合物100和123的增强亲和力的置换的组合产生了这样的抗 -TNF dAb(化合物196；SEQ ID No：10)，其在L929细胞毒性测定 法中具有进一步改善的效力。
细胞培养
将CHOK1SV细胞(Lonza Biologics，UK)，即CHOK1的悬浮变 种，在补充有6mM L-谷氨酰胺(Invitrogen目录号10743-029和 25030-081)的CD CHO培养基中维持在对数生长期。培养物在36.5℃、 10％ CO2和于140rpm摇动下温育。在转染前24小时，在血细胞计数 器上通过台盼蓝排除法(Sigma目录号T8154)来估定数目和生存力。 通过于200×g下5分钟来使8×106个活细胞形成粒状沉淀，并重悬 浮于8ml CM25培养基(Lonza Biologics，UK)中，所述培养基中补 充有10％热灭活的经透析的胎牛血清(Invitrogen目录号26400-044) 和6mM L-谷氨酰胺。将细胞以每孔500μl铺于24孔板中，并于36.5 ℃、10％ CO2下温育。
在转染前3小时，给培养基增添500μl CM25培养基的新鲜的等 分试样，所述CM25培养基补充有10％热灭活的经透析的胎牛血清和6 mM L-谷氨酰胺。
表达载体
就用于哺乳动物细胞表达对化合物112(SEQ ID No：50)和化合 物170(SEQ ID No：51)的基因序列进行优化，并且进行合成。
化合物112
GACATCCAGATGACCCAGAGCCCCAGCAGCCTGAGCGCCTCTGTGGGCGATAGAGTGACC
ATCACCTGCAGAGCCAGCCAGGCCATCGACAGCTACCTGCACTGGTATCAGCAGAAGCCT
GGCAAGGCCCCTAAGCTGCTGATCTACAGCGCCAGCAATCTGGAGACCGGCGTGCCTAGC
AGATTCAGCGGCAGCGGCTCCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCAGCCTGCTGCCT
GAGGATTTCGCCACCTACTACTGCCAGCAGGTGGTGTGGAGACCTTTCACCTTCGGCCAG
GGCACCAAGGTGGAGATCAAGCGGGTGGAGCCCAAGAGCTGCGATAAGACCCACACCTGC
CCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGCGGACCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAG
CCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGATGTG
AGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAAT
GCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTG
ACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAG
GCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCC
CAGCTGTACACCCTGCCCCCTAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACC
TGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAG
CCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTG
TACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCAGC
GTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGC
AAG(SEQ ID No：50)
化合物170
GACATCCAGATGACCCAGAGCCCCAGCAGCCTGAGCGCCTCTGTGGGCGATAGAGTGACC
ATCACCTGCAGAGCCAGCCAGGCCATCGACAGCTACCTGCACTGGTATCAGCAGAAGCCT
GGCAAGGCCCCTAAGCTGCTGATCTACAGCGCCAGCAATCTGGAGACCGGCGTGCCTAGC
AGATTCAGCGGCAGCGGCTCCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCAGCCTGCTGCCT
GAGGATTTCGCCACCTACTACTGCCAGCAGGTGGTGTGGAGACCTTTCACCTTCGGCCAG
GGCACCAAGGTGGAGATCAAGCGGGTGGAGCCCAAGAGCAGCGATAAGACCCACACCTGC
CCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGCGGACCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAG
CCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGATGTG
AGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAAT
GCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTG
ACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAG
GCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCC
CAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACC
TGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAG
CCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTG
TACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCAGC
GTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGC
AAG(SEQ ID No：51)
每个序列在5’末端侧翼具有一个Hind III位点、Kozak序列 (GCCACC；SEQ ID No：57)和人IgGκ前导序列(氨基酸序列 MSVPTQVLGLLLLWLTDARC；SEQ ID NO：58)。在3’末端，给每个序列 添加两个终止密码子和一个EcoRI位点。在合成之后，将基因以克隆 入pCRScript载体(Stratagene)中的方式提供，并在合适的限制酶 缓冲液(分别为Roche Diagnostics目录号10656313001、10703737001 和11417967001)中通过HindIII/EcoRI消化而释放。类似地，对GS 表达载体pEE12.4(Lonza Biologics，UK)进行消化，并用牛小肠碱 性磷酸酶(Roche Diagnostics目录号10713023001)进行去磷酸化。 使用Promega的LigaFast Rapid DNA连接系统(目录号M8221)将 每个基因连接入制备好的pEE12.4骨架中。然后，将连接产物转化入 One Shot Top 10经化学方法获得的感受态细胞(Invitrogen目录号 C4040-03)中，并通过标准技术来鉴定阳性克隆。使用QIAfilter中 量制备柱(QIAgen目录号12243)，通过过夜培养物的中量制备来制 备大量的所得载体(pEE12.4-PNO621和pEE12.4-PNO521-S114C)。 通过在含1/10体积的3M乙酸钠(pH5.2)的100％乙醇(Sigma目录号 分别为S2889和E7023)中沉淀20μg来制备载体以用于转染。在用 70％乙醇洗涤之后，将载体以0.5μg/μl的工作浓度重悬浮于40μl T.E.pH8.0(Sigma目录号T9285)中。
转染
对于每次转染，将2μl Lipofectamine 2000加入至96孔平板的 一个孔中的50μl Optimem I培养基(Invitrogen目录号11668-027 和31985-062)中。在第2个孔中，将1.6μl表达载体(0.8μg)加 入至50μl Optimem I培养基中。在5分钟室温温育后，将所述2个 孔的内容物混合在一起并进一步进行20分钟温育。这该第二次温育 后，将全部转染混合物加入至包含CHOK1SV细胞的24孔平板的孔中。 将细胞温育至少72小时并收获上清液。使上清液在4,000xg下离心 5分钟以使细胞碎片形成粒状沉淀，并贮存于-20℃直至通过TNF ELISA 来测定化合物112(SEQ ID No：59)和化合物170(SEQ ID No：11) 的表达。
化合物112
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQAIDSYLHWYQQKPGKAPKLLIYSASNLET
GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLLPEDFATYYCQQVVWRPFTFGQGTKVEIKRVEPKS
CDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKPN
WYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALP
APIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNG
QPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQK
SLSLSPGK(SEQ ID No：59)
TNF ELISA
将微量滴定板(例如Sarstedt 82.9923-148)用1μl/mL人重组 TNF-α(Peprotech Cat# 300-01A)在碳酸盐/碳酸氢盐包被缓冲液 (pH9.6)中的溶液进行包被，100μl/孔。在4℃过夜温育之后，用 含0.05％Tween-20的PBS(0.01M，pH7.2)洗涤平板三次，和用PBS 洗涤三次。每个孔中加入200μl封闭缓冲液(含1％BSA[牛血清白蛋 白，Sigma Cat# A-9647]的PBS)，并在25℃下温育1小时。如上所述 洗涤平板，并向每个孔中加入100μl体积的稀释于抗体稀释剂(含 1％BSA和0.05％Tween 20的PBS)中的样品或化合物170标准。在 25℃下温育1小时之后，如上所述洗涤平板，并向每个孔中加入100 μl体积的以1：1000稀释于抗体稀释剂中的二抗(缀合有过氧化物酶 的山羊抗人免疫球蛋白，Zymed，Cat# 81-7120)。洗涤平板，并向每 个孔中加入100μl体积的ABTS底物(2，2’-连氮基-双(3-乙基苯并噻 唑啉-6-磺酸)二铵盐，Sigma Cat# A-1888，0.5mg/mL于含0.03％ H2O2 的柠檬酸盐缓冲液(pH4.4)中)。底物在室温下显色30分钟，并于 405nm(参考620nm)处读取吸光度。相对于标准曲线来确定样品浓 度，并表示为相对于表达的化合物112的平均浓度。
结果
包含截短的CH1
在结构域抗体构建体中包含截短的CH1导致这样的在可变结构域 和铰链之间的连接，即相比于缺少截短的CH1的连接(83.3％；以1的 缺口开放罚分，使用在Vector NTI(Invitrogen)上的Align X计算 出的)，所述在可变结构域和铰链之间的连接具有更高的与常规IgG1 CH1-铰链连接的同源性(91.7％)。增高的同源性可能转变为增加的对 于常规免疫球蛋白肽序列(对于其，人类患者应当是免疫耐受的)的 相像性，从而降低了免疫原性潜力。
序列：
化合物170可变区-截短的CH1-铰链连接：
TKVEIKREPKS
IgG1 CH1-铰链连接(NCBI登录号AAG00909)：
EPKS
化合物170可变区-铰链连接(没有截短的CH1)：
TKVEIKREPKS
CH1序列以双下划线标示。
获自NCBI蛋白质数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)的CH1 结构域(SEQ ID No：60)AAG00909：
1 STKGPSVFPL APSSKSTSGG TAALGCLVKD YFPEFVTVSW NSGALTSGVH TFPAVLQSSG
6.1 LYSLSSVVTV PSSSLGTQTY ICNVNHKPSN TKVDKRVEPK SCDKTHTCPP CPAPELLGGP
121 SVFLFPPKPK DTLMISRTPE VTCVVVDVSH EDPEVKFNWY VDGVEVHNAK TKPKEEQYNS
181 TYRVVSVLTV LHQDWLNGKE YKCKVSNKAL PAPIEKTISK AKGQPREPQV YTLPPSREEM
241 TKNQVSLTCL VKGFYPSDIA VEWESNGQPE NNYKTTPPVL DSDGSFFLYS KLTVDKSRWQ
301 QCNVFSCSVM HEALHNHYTQ KSLSLSPGK
CH1-铰链连接以下划线标示。
中和TNF-α诱导的细胞毒性
使用鼠类L929细胞生存力测定法，对结构域抗体构建体化合物 170(SEQ ID No：11)中和TNF-α介导的细胞毒性的能力进行了评估。 在平底96孔板中，以50μL体积，制备了化合物170在含10％胎牛血 清的RPMI培养基(RPMI-FBS)中的系列稀释物。向这些孔的每一个中 以360pg/mL的浓度加入50μl的重组人TNF-α(Strathmann Biotec， Hamburg，Germany)，随后加入在50μL中的2.5×104个L929细胞 和25μL 40μg/mL放线菌素D，均在RPMI-FBS中制备。对照包括没 有TNF(用于确定100％生存力)的孔、无细胞(0％生存力)的孔和范 围为2pg/mL至4200pg/mL的TNF-α标准曲线的孔。培养板在5％ CO2 气氛中于37℃温育20小时，然后在加入25μl的3-(4，5-二甲基噻唑 -2-基)-5-(3-羧基甲氧基苯基)-2-(4-磺基苯基)-2H-四唑鎓(MTS)/ 吩嗪乙基硫酸盐(phenazine ethosulfate，PES)(Promega，CellTiter 96 AQueousOne，Madison USA)后再温育3小时。针对630nm的参考 波长在492nm处测定吸光度，和使用从三次重复的测试孔计算出的平 均值来绘制生存力曲线。通过随着化合物170浓度增加而细胞生存力 增加(图6)，表明了化合物170中和TNF-α的能力。
中和TNF-α与人p55和p75 TNF受体的结合
结构域抗体构建体化合物170(SEQ ID No：11)抑制TNF-α与人 p55和p75 TNF受体结合的能力通过受体结合测定法来进行评价。以 在碳酸盐包被缓冲液(pH9.2)中的0.1μg/mL，通过于4℃温育过夜， 将人p55(RnD systems，目录号372-RI)或p75(RnD systems，目 录号762-R2)包被到Maxisorb板(Nunc)上。在抗体稀释剂(PBS pH7.2， 0.05％ Tween-20，1％BSA)中制备范围从100μg/mL降至3.15ng/mL 的化合物170的系列半对数(half-log)稀释物(和无化合物170的 “空白”对照)，并与等体积的在抗体稀释剂中的60ng/mL人TNF- α相混合。还制备了不含PN0621和不含TNF-α的空白以测量背景结 合。让所有混合物在温和搅动下于室温温育正好1小时。在该温育过 程中，经包被的平板用PBS，0.05％ Tween-20洗涤3次，然后用PBS 洗三次。然后，于室温用200μl/孔的PBS，1％BSA封闭平板45分钟。 在洗涤平板后，对于每个浓度的受试化合物170向三次重复的孔中加 入100μl的化合物170/TNF-α混合物，以及加入所有对照。然后， 将平板于室温下温育1小时。在洗涤平板后，以在抗体稀释剂中的0.6 μg/mL，向每个孔中加入生物素化的抗人TNF-α抗体(RnD Systems， 目录号BAF210)，并于室温温育1小时。在洗涤后，以在抗体稀释剂 中的1:2000，加入链霉抗生物素蛋白-HRP缀合物(Zymed，目录号 43-4323)，并于室温下温育45分钟。使用TMB底物(Invitrogen， 目 录号00-2023)进行显色，在4分钟后，用1M HCl终止反应。然后， 使用620nm的参照，在450nm处测量吸光度读数。通过计算三次重 复的平均吸光度来进行分析。从每个吸光度值中减去非特异性结合(无 TNF-α)的平均值。
结果如图7中所示，并且显示，化合物170阻止TNF-α与人p55 或p75 TNF受体的相互作用。
细胞结合型TNF-α的结合
使用NS0细胞系27D4对与细胞结合型(跨膜)TNF-α的结合进行 分析，所述细胞系是用编码缺乏TACE切割位点的人TNF-α蛋白的基 因稳定转染的，从而TNF-α保持为细胞膜结合的，因为其不能被切割。 基于另一种鼠类骨髓瘤(SP2/0)的相似细胞系也已得到描述(Scallon 等人，(1995)Cytokine 7 251-259)。
在每个样品5×105个活27D4细胞上进行流式细胞术分析，其中 所有步骤于4℃或在冰上进行。以100μg/mL，将细胞粒状沉淀与受试 样品(化合物170；SEQ ID No：11)或不相关特异性同种型-匹配的 对照(Sigma，目录号：15154)一起重悬浮于含2％FBS的PBS中， 并在冰上温育1小时。进行两次细胞洗涤循环，每次包括以1000×g 离心10分钟和将细胞粒状沉淀重悬浮于PBS/2％ FBS中。在又一次的 离心步骤后，将细胞粒状沉淀重悬浮于100μl的二抗缀合物(抗人 Fc FITC缀合物，Sigma，目录号F9512)中，并温育30分钟。然后， 如上所述将样品洗两次，并将细胞粒状沉淀重悬浮于500μl含5 μg/mL碘化丙锭(Sigma，目录号P4864)的PBS/2％ FBS中。在Beckman Coulter Cell Lab Quanta流式细胞仪上对细胞的荧光染色进行分析， 和使用WinMDI来处理数据。
结果显现在图8中，并且显示，表达跨膜TNF-α的NSO 27D4细 胞(黑色实线)的化合物170染色显现出比不相关特异性同种型-匹配 的对照(灰色填充)更高的荧光强度。
高表达化合物170的细胞系的建立
使用在“材料和方法”部分中所描述的表达载体来建立表达化合 物170(SEQ ID No：11)的稳定的CHOK1SV细胞系。简而言之，在40 μg的线性化的质粒DNA存在下，在没有谷氨酰胺的CDCHO无蛋白质 培养基中对1×107个处于对数生长期的细胞进行电穿孔。转染后24 小时，施加50μM甲硫氨酸砜亚胺(methionine sulphoximine) (Sigma)的选择压力，并让抗性细胞在96孔板中形成集落。当接近 汇合时，将单个菌落转移至24孔板、T25瓶和随后T75瓶。在T75瓶 中一旦汇合，就将细胞系进展至在E125锥形瓶中的培养，并且经历6 次传代培养而适应于悬浮生长。一旦适应于悬浮生长，就将细胞系在 92.5％ CDCHO培养基：7.5％ DMSO的冷冻混合物中冷藏。
在细胞系通过不同的孔和瓶大小进行扩展的同时，与细胞系进入 下一阶段的过程相平行地进行许多生产率(productivity)评估。因 此，在24孔板和E125锥形瓶阶段进行了生产率评估。在每一情况下， 让细胞生长14天，并且就化合物170的水平通过实施例1中所描述的 TNF ELISA方法对上清液进行评价。将细胞系按生产率进行排序，并 选择最高的10个，以用于在Lonza Biologics的拥有专利权的补料- 分批生产率评估中进行评价。所获得的生产率在700mg/L和3371mg/L 之间。选择了生产率为2724mg/L的先导细胞系，以用于在10L实验 室规模的发酵罐中进行评价。
运行四个分开的10L实验室规模的发酵罐15天，其中基于无蛋白 质的CDCHO培养基，采用先导细胞系和拥有专利权的通用补料分批工 艺。4个发酵的所得的平均生产率是4851mg/L，其中最高生产率为 4925mg/L(在15天的发酵中，对于非克隆细胞系，由Lonza Biologics 先前报道的最高生产率水平为3560mg/L)。设计了所使用的10L实 验室规模的发酵罐以模拟在高达2000L的更大规模的发酵罐中所见的 发酵条件，因此预期该先导细胞系适合于商业规模的生产。确实，在 200L发酵罐中观察到了相似的表达水平。
通过蛋白A亲和层析对从表达化合物170(SEQ ID No：70)的先 导细胞系的4×10L发酵中收获的产物进行纯化，并且通过在还原和非 还原条件下的SDS PAGE进行分析。如图11中所示的，化合物170表 达为约90kDa的单体。该单体由两个约40kDa的亚基组成，它们在 图12中当在还原条件下运行SDS PAGE时可见。由于SDS PAGE不适合 准确测定蛋白质的大小，因而对化合物170单体作了进一步的分析。 ESI-MS(电喷雾电离质谱法)将化合物170单体的大小测定为78.739 kDa。这与2个亚基的预测的分子量(2 x 38.058＝76.116kDa)是 一致的，其中每个亚基还携带二天线型(biantennary)核心岩藻糖基 化的聚糖糖结构。
在非人灵长类中的长血清半衰期
以0.5、5和50mg/kg的剂量，给猕猴皮下施用化合物170(SEQ ID No：11)，并在0.5、1、2、6和24小时，随后在1、2、4、7、 10和14天抽取血液样品。使用实施例1中所描述的抗-TNF ELISA方 法，就化合物170水平的定量对这些样品进行分析。通过分析这些样 品中化合物170的水平来确定消除半衰期。于0.5mg/kg，计算出110.5 ±13.9小时的消除半衰期。于5mg/kg和50mg/kg，计算出110.9± 10.4和103.5±11.5小时的消除半衰期。
当以50mg/kg通过静脉内途径施用化合物170时，于10、30和 60分钟，4和24小时，2、4、7、10和14天抽取血液样品。使用实 施例1中所描述的抗-TNF ELISA方法，就化合物170水平的定量对这 些样品进行分析。通过分析这些样品中化合物170的水平来确定消除 半衰期。在50mg/kg静脉内施用后，计算出109.6±10.7小时的消除 半衰期。
有利的安全性特性
在动物安全性和毒性研究中对按照GMP标准生产的化合物170 (SEQ ID No：11)进行评价。
单剂量的安全性
通过皮下或静脉内施用途径，以0.5、5和50mg/kg给不同的猴 施用单剂量的化合物170，它们未显示与用化合物170进行的其治疗 有关的影响。在这些研究中，对一系列器官作了显微镜检查，未观察 到任何影响。
逐步升高的剂量和重复剂量的安全性
从0.5mg/kg的剂量(皮下或静脉内施用)开始，每7天给猕猴 施用逐步升高的剂量直至50mg/kg。就各种生理学和行为参数对动物 进行评估，包括血液学、临床化学、体重和器官重以及尸体剖检后的 器官肉眼检查。在这些研究自始至终，对于使用化合物170进行的治 疗未报告有不良反应。在研究的剂量逐步升高阶段之后，在进一步的 4周时间内，对那些经皮下接受逐步升高的剂量的动物进一步施用4 个50mg/kg的剂量。在各种参数方面，仍未观察到与使用化合物170 进行的治疗有关的影响。
心血管的安全性
在安装有无线电遥测监测器的猕猴中，评价50mg/kg的化合物 170的心血管安全性。这些监测器能直接从有意识的猴身上报告一系 列呼吸和心血管参数。在给予化合物170后，未报道不良的与治疗有 关的临床观察结果。
细菌表达
在哺乳动物表达系统中产生在前述实施例中的化合物170(SEQ ID No：11)。还用细菌表达系统来产生功能性化合物170。
对减去信号序列的化合物170的氨基酸序列进行回译和用 GeneOptimizerTM进行优化以用于大肠杆菌(E.coli)表达，并且在 GeneArt GmbH从头合成。将合成的基因通过NcoI和HindIII限制性 位点(Roche)亚克隆入pBAD gIII/His-标记的表达载体(Invitrogen) 中，从而产生准备用于细菌表达的载体。通过热休克法用所述载体转 化TOP10细胞(Invitrogen)，并产生单个菌落的甘油原种。诱导条 件是0.002％的阿拉伯糖(Sigma；终浓度)和4小时的诱导期。化合 物170蛋白质样品使用在pBAD细菌表达系统手册(Invitrogen)中详 述的渗透压休克法来产生。使用BCA测定法(Pierce)来测定样品的 总蛋白质浓度。在如实施例1中所述的ELISA中，就其与TNF-α的结 合来检测由细菌表达的化合物170。
图9显示了在细菌系统中产生的化合物170在ELISA测定法中保 持与TNF-α的结合。
用于化合物170的细菌表达的DNA序列如下：
ATGGCGAGCACCGATATTCAGATGACCCAGAGCCCGAGCAGCCTGAGCGCGAGCGTGGGT
GATCGTGTGACCATTACCTGCCGTGCGAGCCAGGCGATTGATAGCTATCTGCATTGGTAT
CAGCAGAAACCGGGCAAAGCGCCGAAACTGCTGATTTATAGCGCGAGCAACCTGGAAACC
GGCGTGCCGAGCCGTTTTAGCGGCAGCGGTAGCGGCACCGATTTTACCCTGACCATTAGC
AGCCTGCTGCCGGAAGATTTTGCGACCTATTATTGCCAGCAGGTGGTGTGGCGTCCGTTT
ACCTTTGGCCAGGGCACCAAAGTGGAAATTAAACGCGTGGAACCGAAAAGCAGCGATAAA
ACCCACACGTGCCCGCCGTGTCCGGCGCCGGAACTGCTGGGTGGCCCGAGCGTGTTTCTG
TTTCCGCCGAAACCGAAAGATACCCTGATGATTAGCCGTACCCCGGAAGTGACCTCCCTC
GTGGTGGATGTGAGCCATGAAGATCCGGAAGTGAAATTCAACTGGTATGTGGATGGCGTG
GAAGTGCATAACGCGAAAACCAAACCGCGTGAAGAACAGTATAACAGCACCTATCGTGTG
GTGAGCGTGCTGACCGTGCTGCATCAGGATTGGCTGAACGGCAAAGAATACAAATGCAAA
GTGTCTAACAAAGCGCTGCCGGCGCCGATTGAAAAAACCATCAGCAAAGCGAAAGGCCAG
CCGCGTGAACCGCAGGTGTATACCCTGCCGCCGAGCCGTGATGAACTGACCAAAAACCAG
GTGAGCCTGACCTGCCTGGTGAAAGGCTTTTATCCGAGCGATATTGCGGTGGAATGGGAA
AGCAACGGCCAGCCGGAAAACAACTATAAAACCACCCCGCCGGTGCTGGATAGCGATGGC
AGCTTTTTCCTGTATAGCAAACTGACCGTGGATAAAAGCCGTTGGCAGCAGGGCAACGTG
TTTAGCTGCAGCGTGATGCATGAAGCGCTGCATAACCATTATACCCAGAAAAGCCTGAGC
CTGAGCCCGGGTAAAGCGGCGGCG
(SEQ ID No：61)。
由SEQ ID No：61编码的氨基酸序列如下：
MASTDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQAIDSYLHWYQQKPGKAPKLLIYSASNLET
GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLLPEDFATYYCQQVVWRPFTFGQGTKVEIKRVEPKSSDK
THTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGV
EVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQ
PREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDG
SFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKAAAVDHHHHHH
(SEQ ID NO：62)。
化合物170在人TNF介导的鼠类关节炎模型中的体内效用
人TNF转基因小鼠系Tg197表现出失调的TNF表达，并发展出慢 性炎性多关节炎(Keffer，J.等人， (1991)， Transgenic mice expressing human tumor necrosis factor：a predictive genetic model of arthritis.EMBO Journal 10：4025-31)。在这些小鼠中 化合物170(SEQ ID No：11)的施用防止了关节炎的形成以及相关的 体重减轻(图10A和B)。8只杂合的Tg197的组(每组包含4只雄性 和4只雌性)通过每周两次腹膜内注射化合物170和不相关特异性对 照人IgG1(帕利珠单抗[]，MedImmune/Abbott)(在PBS中) 进行治疗，均以10mg/kg。治疗在小鼠3周龄时开始。按一周的间隔， 对小鼠进行称重并基于目测踝关节形态学(肿胀、变形和活动程度) 进行评分(关节炎得分)。
在化合物112中位置114处的Cys的置换导致增加的蛋白质表达
化合物112(SEQ ID No：59)是化合物170(SEQ ID No：11) 的修饰产物，其在位置114处包含半胱氨酸残基而不是丝氨酸残基， 后者存在于化合物170的这个位置上。通过与化合物170进行比较评 价了半胱氨酸114置换为丝氨酸对于蛋白质表达的影响。通过如“材 料和方法”部分所述的使用固相TNF的ELISA，就蛋白质表达来对用 化合物112和170的基因构建体转染的宿主细胞的多个培养物进行检 测。结果显示在图11中。
本领域技术人员将会意识到，可以对如具体实施方案中所示的本 发明进行众多改变和/或修饰，而不背离如广泛描述的本发明的精神或 范围。因此，这些实施方案在所有方面被视为举例说明性的而非限制 性的。
序列表
<110>Peptech Limited
<120>结构域抗体构建体
<130>WJP GHE 03 1411 5717
<160>64
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>8
<212>PRT
<213>夜猴
<400>1
<210>2
<211>8
<212>PRT
<213>夜猴
<400>2
<210>3
<211>6
<212>PRT
<213>毛狨属，种未知
<400>3
<210>4
<211>8
<212>PRT
<213>毛狨属，种未知
<400>4
<210>5
<211>108
<212>PRT
<213>合成的
<400>5
<210>6
<211>324
<212>DNA
<213>合成的
<400>6
<210>7
<211>108
<212>PRT
<213>合成的
<400>7
<210>8
<211>108
<212>PRT
<213>合成的
<400>8
<210>9
<211>108
<212>PRT
<213>合成的
<400>9
<210>10
<211>108
<212>PRT
<213>合成的
<400>10
<210>11
<211>341
<212>PRT
<213>合成的
<400>11
<210>12
<211>16
<212>PRT
<213>合成的
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