健康状态的测定法
阅读：684发布：2020-06-20
专利汇可以提供健康状态的测定法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及用检测病毒的存在与检测指示 健康状态 的基因组靶标或标记的存在的组合来检测确定受试者健康状态的测定法。，下面是健康状态的测定法专利的具体信息内容。
1.确定受试者健康状态的测定法，包括：
用能修饰核酸中未甲基化的胞嘧啶的试剂处理受试者样品，其中 样品中病毒核酸和基因组核酸经处理形成衍生病毒核酸和衍生基因组核 酸；
测定所述处理样品中衍生病毒核酸的存在；以及
确定所述处理样品中所述衍生基因组核酸中基因组靶标的状态， 其中一个或多个所述衍生病毒核酸的存在和所述基因组靶标的状态可指 示健康状态。
2.根据权利要求1所述的测定法，还包括：
在所述测定和确定步骤之前，扩增至少部分所述衍生病毒核酸和部分衍 生基因组核酸。
3.确定受试者健康状态的测定法，包括：
用修饰未甲基化胞嘧啶的试剂处理含有病毒核酸和基因组核酸的受试 者样品，以形成具有胞嘧啶数减少但具有与对应的未处理病毒核酸和未处理 基因组核酸的碱基总数基本上相同的衍生病毒核酸和衍生基因组核酸；
获得病毒特异性核酸分子；
获得具有基因组靶标的核酸分子；
测试病毒特异性核酸分子的存在；以及
确定经处理和扩增的样品中基因组靶标的状态，其中检测到一个或 多个病毒特异性核酸分子和靶标的状态指示了受试者的健康状态。
4.根据权利要求3所述的测定法，其中通过扩增衍生病毒核酸和衍生 基因组核酸获得所述病毒特异性核酸分子和具有基因组靶标的核酸分子。
5.确定受试者健康状态的测定法，包括：
用修饰未甲基化胞嘧啶的试剂处理受试者样品以形成衍生核酸；
提供能够允许将期望的病毒核酸分子扩增为所述衍生核酸的引物；
提供能够允许将靶基因组核酸分子扩增为所述衍生核酸的引物；
对所述衍生核酸进行扩增反应；以及
测定扩增的期望病毒核酸和扩增的靶基因组核酸的存在，其中一个 或多个扩增产物的存在或不存在指示受试者的健康状态。
6.根据权利要求5所述的测定法，包括：
测定含有所述期望的病毒特异性核酸分子的扩增核酸产物的存在，其中 检测到所述期望的病毒特异性核酸分子指示样品中存在该病毒。
7.根据权利要求5或6所述的测定法，包括：
测定含有所述靶核酸分子的扩增核酸产物的存在，其中检测到所述靶核 酸分子指示样品中基因组或基因的状态。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的测定法，其中所述试剂将未甲 基化的胞嘧啶修饰成尿嘧啶。
9.根据权利要求8所述的测定法，其中所述试剂选自亚硫酸氢盐、醋 酸盐或柠檬酸盐。
10.根据权利要求9所述的测定法，其中所述试剂是亚硫酸氢钠。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的测定法，其中所述靶基因组 核酸对一个基因或多个基因或调控区例如启动子或增强子、或基因组的任何 编码或非编码、或静止或可动的区域是特异性的。
12.根据权利要求11所述的测定法，其中所述靶标具有甲基化特征。
13.根据权利要求12所述的测定法，其中所述甲基化特征是基因组核 酸的甲基化区域或未甲基化区域。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的测定法，其中所述病毒与疾 病状态例如癌症有关。
15.根据权利要求14所述的测定法，其中所述病毒选自如下组成的 组：人乳头瘤病毒、肝炎病毒、人类免疫缺陷病毒(HIV-1和HIV-2)、人 疱疹病毒(HHV)、逆转录病毒、多瘤病毒以及腺病毒。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的测定法，其中所述基因组 靶标与疾病状态例如癌症有关。
17.根据权利要求16所述的测定法，其中所述基因组靶标选自下列 区域组成的组：CD14、ENDRB、HIC、RARB1、PGR、SFRS8、TMSB10、 ABCG2、MFNG、LAMR1、RAGE、ABL1、CRBP、GPR37、HRK、RARA、 SYK、ECE1、MME、TEM、NF2、XIAPHSX11、RARRES1、FLI1、HTLF、 LDHB、RB1、TGD、CDK4、MMP14、RAB32、BARD1、NF1、LIM2、 MMP2、DAB2、BMP6、CDKN1C、DAB21P、LMNB1、MMP28、HAI2、 SOCS1、HIC2、MSH6、RIN2、HMGA1、JUN、S100P*、SRF、VDR、 DKK3、KRAS2、PLAU、TNFRSF10B、CDH1、MAC30、DDB2、PAX6、 AXL、EIF4A2、SLIT2、RECK、TERC、GATA5以及STAT1。
18.确定受试者健康状态的测定法，包括：
用亚硫酸氢盐试剂在使病毒核酸和基因组核酸中未甲基化的胞嘧啶转 化成尿嘧啶的条件下处理受试者样品，形成所述衍生病毒核酸和衍生基因组 核酸；
为样品提供能够结合到所述衍生病毒核酸区域的引物，所述引物能 够允许扩增所述衍生病毒核酸中期望的病毒特异性核酸分子；
为样品提供能够结合到所述衍生基因组核酸区域的引物，所述引物 能够允许扩增所述衍生基因组核酸中期望的靶基因组特异性核酸分子；
对所述处理样品进行扩增反应；以及
测定扩增的病毒核酸产物和扩增的基因组核酸靶标的存在，其中检 测到产物和靶标中的一个或两者指示了受试者的健康状态。
19.根据权利要求18所述的测定法，还包括：
测试存在病毒的样品以确定样品中病毒的型、亚型、变体或基因型。
20.根据权利要求18或19所述的测定法，其中所述扩增通过聚合酶链 式反应(PCR)或等温扩增来进行。
21.筛选受试者潜在的宫颈癌的测定法，包括：
用亚硫酸氢盐试剂在使人乳头瘤病毒(HPV)和基因组核酸中未甲基化的 胞嘧啶转化成尿嘧啶的条件下处理受试者样品，以形成衍生HPV核酸和衍 生基因组核酸；
提供能够结合到衍生HPV核酸区域的引物，所述引物能够允许扩增 所述衍生HPV核酸中期望的HPV特异性核酸分子；
提供能够结合到衍生基因组核酸区域的引物，所述引物能够允许扩 增所述衍生基因组核酸中期望的基因组特异性核酸分子；
对所述衍生HPV核酸和衍生基因组核酸进行扩增反应；以及
测定扩增的HPV核酸产物和扩增的基因组核酸产物的存在，其中检 测到该产物中的一种或两者指示受试者发展为宫颈癌的状态。
22.根据权利要求21所述的测定法，还包括：
测定存在HPV的样品，以确定样品中HPV的型、亚型、变体或基因型。
23.根据权利要求22所述的测定法，其中所述样品选自如下组成的 组：拭样、活组织切片、涂片、巴氏涂片、表面刮片、压舌板取样和液体样 品，以及来自各种贮存介质，例如冷冻材料、石蜡块、载玻片、法医标本系 统和档案材料的样品。
技术领域
本发明通常涉及检测样品中病毒存在的以及检测基因组标记，作为用于 确定受试者健康状况的一种测定法。本发明适合作为具有预后意义的风险评 估测试。
背景技术
目前多种方法可以用于检测特异核酸分子。这些方法通常都依赖于靶核 酸和核酸探针之间的序列依赖性杂交，其中核酸探针的长度范围可以是从短 寡核苷酸(20个碱基或更短)至许多千碱基(kb)的序列。
从总的核酸序列中扩增特异序列，最广泛采用的方法是聚合酶链式反应 (PCR)(Dieffenbach，C and Dveksler，G.eds.PCR Primer：A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Press，Plainview NY)。在该扩增方法中，在互补DNA链 上且在待扩增区域的任一端处的长度通常为20-30个核苷酸的寡核苷酸，用 于在变性的单链DNA上引导DNA合成。变性、引物杂交以及使用热稳定的 DNA聚合酶的DNA链合成的连续循环使引物之间的序列呈指数扩增。通过 首先复制，可扩增RNA序列，该首先复制使用反转录酶产生互补DNA(cDNA) 拷贝。扩增的DNA片段可通过多种手段进行检测，包括凝胶电泳、与标记 的探针杂交，采用允许后续鉴定(例如通过酶联反应)的标记引物，以及采用 一旦与靶标DNA杂交即产生信号的荧光标记引物(例如Beacon和TaqMan 体系)。
同PCR一样，多种用于检测和扩增特异的核苷酸序列的其它技术已得以 发展。一个实例就是连接酶链式反应(Barany，F.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88，189-193，1991)。
另一个实例是1992年首次描述并命名为链置换扩增(Strand Displacement Amplification，SDA)的等温扩增(Walker GT，Little MC，Nadeau JG and Shank D.Isothermal in vitro amplification of DNA by a restriction enzyme/DNA polymerase system.PNAS 89：392-396(1992))。从那时起，已经描 述了大量其它等温扩增技术，包括转录介导的扩增(Transcription Mediated Amplification，TMA)和基于核酸序列的扩增(Nucleic Acid Sequence Based Amplification，NASBA)，其利用RNA聚合酶来复制RNA序列而不是相应的 基因组DNA。(Guatelli JC，Whitfield KM，Kwoh DY，Barringer KJ，Richmann DD and Gingeras TR.Isothermal，in vitro amplification of nucleic acids by a multienzyme reaction modeled after retroviral replication.PNAS 87：1874-1878 (1990)：Kievits T，van Gemen B，van Strijp D，Schukkink R，Dircks M， Adriaanse H，Malek L，Sooknanan R，Lens P.NASBA isothermal enzymatic in vitro nucleic acid amplification optimized for the diagnosis of HIV-1 infection.J Virol Methods.1991 Dec；35(3)：273-86)
其它基于DNA的等温技术包括：滚环扩增(Rolling Circle Amplification，RCA)，其中DNA聚合酶延伸针对环状模板的引物(Fire A and Xu SQ.Rolling replication of short circles.PNAS 92：4641-4645 (1995)；利用环状探针检测靶标的分支扩增(Ramification，Amplificaiton， RAM)(Zhang W，Cohenford M，Lentrichia B，Isenberg HD，Simson E，Li H， Yi J，Zhang DY.Detection of Chlamydia trachomatis by isothermal ramification amplification method：a feasibility study.J Clin Microbiol. 2002Jan；40(1)：128-32.)；以及最近的解旋酶依赖的等温DNA扩增 (Helicase-Dependent isothermal DNA amplification，HDA)，其利用解旋酶 代替加热来使DNA链解开(Vincent M，Xu Y，Kong H.Helicase-dependent isothermal DNA amplification.EMBO Rep.2004Aug；5(8)：795-800.)。
最近，已经描述了DNA的等温扩增法(Walker GT，Little MC，Nadeau JG and Shank D.Isothermal in vitro amplification of DNA by a restriction enzyme/DNA polymerase system.PNAS 89：392-396(1992))。传统的扩增 技术依赖于在扩增反应每一个循环中的靶标分子变性和退火的连续循 环。DNA的热处理导致DNA分子一定程度的剪切，因此当DNA有限， 例如从来自发育中的胚泡的少量细胞中分离DNA时，或者特别是在DNA 已经是片段的形式如在组织切片、石蜡块和古代DNA样品中的的情况 下，这种加热-冷却循环可能进一步破坏DNA并导致扩增信号的丢失。 等温法不依赖于模板DNA的连续变性来产生单链分子作为进一步扩增 的模板，而是通过特异的限制性内切酶在恒温下酶切DNA分子，或者通 过利用解旋酶解开DNA双链体。
术语称为链置换扩增的技术依赖于某些限制性内切酶切割半修饰 DNA的未修饰链的能力以及缺少5’-3’核酸外切酶的DNA聚合酶延伸和 置换下游链的能力。然后通过偶联有义和反义反应而实现指数扩增，其 中来自有义反应的链置换充当反义反应的模板(Walker GT，Little MC， Nadeau JG and Shank D.Isothermal in vitro amplification of DNA by a restriction enzyme/DNA polymerase system.PNAS 89：392-396(1992)。此 类技术已经成功地用于以下扩增：结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)(Walker GT，Little MC，Nadeau JG and Shank D.Isothermal in vitro amplification of DNA by a restriction enzyme/DNA polymerase system. PNAS 89：392-396(1992))；HIV-1、丙型肝炎和HPV-16(Nuovo G.J.， 2000)，以及沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)(Spears PA，Linn P， Woodard DL and Walker GT.Simultaneous Strand Displacement Amplification and Fluorescence Polarization Detection of Chlamydia trachomatis.Anal.Biochem.247：130-137(1997))。
至今，SDA的应用依赖于修饰的磷硫酰核苷酸，用以产生半磷硫酰DNA 双链体，其在修饰的链上对酶切具有抗性，导致酶切代替消化作用来推动置 换反应。然而，最近已经设计改造了多种“切口酶”，这些酶不以传统的方 式切割DNA，而是在其中一条DNA链上形成一个切口。“切口酶”包括 N.Alw1(Xu Y，Lunnen KD and Kong H.Engineering a nicking endonuclease N.Alw1 by domain swapping.PNAS 98：12990-12995(2001)、N.BstNB1 (Morgan RD，Calvet C，Demeter M，Agra R，Kong H.Characterization of the specific DNA nicking activity of restriction endonuclease N.BstNBI.Biol Chem. 2000Nov；381(11)：1123-5.)以及Mly1(Besnier CE，Kong H.Converting MlyI endonuclease into a nicking enzyme by changing its oligomerization state. EMBO Rep.2001Sep；2(9)：782-6.Epub 2001 Aug 23)。因此，这些酶的应用将 简化SDA步骤。
另外，SDA技术已经通过热稳定的限制性内切酶(Ava1)和热稳定的 外切聚合酶(Bst聚合酶)的组合使用而得到改善。已表明这种组合可以将 反应的扩增效率从108倍扩增提高到1010倍扩增，因此应用该技术来扩 增独特的单拷贝分子是可能的。利用热稳定聚合酶/酶组合得到的总扩增 因子为109的数量级(Milla M.A.，Spears P.A.，Pearson R.E.and Walker G. T.Use of the Restriction Enzyme Ava1 and Exo-Bst Polymerase in Strand Displacement Amplification Biotechniques 199724：392-396)。
目前，所有的等温DNA扩增技术都要求起始的双链模板DNA分子 在扩增开始之前变性。另外，每次引发只启动一次扩增。
对于直接检测，靶标核酸最通常是根据大小通过凝胶电泳进行分离， 并在与靶序列互补的探针杂交(DNA印迹和RNA印迹)前，转移至固相支 持体上。该探针可以是天然核酸或类似物，例如肽核酸(Peptide nucleic acid，PNA)或锁核酸(locked nucleic acid，LNA)或嵌入核酸(intercalating nucleic acid，INA)。该探针可直接标记(例如，用32P)，或者可以采用间接 检测方法，间接方法通常依赖将“标签”例如生物素或者地高辛结合至 该探针中，然后通过例如酶联底物转化或者化学发光的方法来检测该探 针。
另一种广泛应用的直接检测核酸的方法是“夹心”杂交(Sandiwich hybridisation)。在该方法中，将捕获探针偶联到固相载体上，并且溶液中 的靶标核酸与结合的探针进行杂交，将未结合的靶核酸洗去，并利用与 靶标序列杂交的第二探针来检测结合的核酸。检测可以利用上述列出的 直接或者间接的方法。这些方法的实例包括“分支DNA”信号检测系统， 其是利用夹心杂交原理的实例(1991，Urdea，M.S.，et al.，Nucleic Acids Symp.Ser.24，197-200)。利用核酸杂交直接检测核酸序列的迅速发展的领 域是DNA微阵列(2002，Nature Genetics，32，[Supplement]；2004，Cope， L.M.，et al.，Bioinformatics，20，323-331；2004，Kendall，S.L.，et al.，Trends in Microbiology，12，537-544)。在该过程方法中，将单核酸物种类别 (species)以网格模式固定于固相载体支持体上，或者在固相支持体载体上 光刻地合成，其中单核酸类别范围可以从短寡核苷酸(在Affymetrix system体系中通常为25-mers)至较长的寡核苷酸(在Applied Biosystems and Agilent platforms平台中通常为60-mers)至更长的序列例如cDNA克 隆。将加标签的或标记的核酸群(nucleic acid population)与该阵列进行杂 交，并将阵列中每个点的杂交水平加以定量。尽管也可以采用其它检测 系统，例如化学发光，但最常见的是将放射性标记的或者荧光标记的核 酸(例如cRNAs或者cDNAs)用于杂交。
最近，人们对采用分子学方法诊断感染性疾病很感兴趣，因为这些 新兴的方法提供灵敏而特异的病原微生物检测。在此背景下，本发明涉 及人乳头瘤病毒(HPV)，其DNA基因组以群体水平存在，作为具有单个 HPV类型的可变基因库(pool)，该HPV类型在群体水平水平以及在它们 的基因组大小上不同。各种分子实验的局限性限制了利用分子实验对各 种临床样品中不同HPV型的检测和精确鉴别。此外，大量“基因型”、 “变体”、“亚型”和“型”存在于定义HPV的伞状分组(umbrella grouping) 中。例如，目前存在超过100种公认的HPV类型，其中一些与人类疾病 密切相关。所谓的高度和中度风险型与发展成癌症有关，经由最精确的 可用的分子方法对其进行检测是临床急需优先考虑的事情。
主要问题是单独HPV的检测未必是发展成癌症的优良指标。尽管宫 颈上皮内瘤(Cervical Intraepithelial Neoplasia，CIN)能够发展为浸润型，但 是许多病变退化或者持续，而没有发展成癌。两年内70％的妇女将清除 HPV感染(1998，Journal of Pediatrics，132，277-284；Moscicki，A.B.，et al.)。然而，CIN的发现及其发展非常易变，以致还没有得以治疗，其可 恢复常态或导致完全型癌(full blown carcinoma)。约三分之一至一半的 CINI和CINII病例自发恢复(1990，Australian and New Zealand Journal of Obstetrics and Gynaecology，30，1-23.，Channen，W et al.)，从CINI发展到 CINII需要10年左右时间，但是一些女性可能会是20年或者更长时间 (2000，Cancer Research，60，6027-6032.，Ylitalo，E et al.)。
细胞、组织或器官的病毒感染可能会改变这些实体的基因组甲基化 标记，如在Epstein-Barr病毒的情况下，并且其与胃癌相关(2002，American J.Pathology，160，787-794，Kang，G.H.，et al)。因为甲基化或去甲基化是在 许多细胞分裂(cell divisions)中获得的稳定的变化，在某些情况下，如生 物体世代通常稳定的甲基化谱(methylome)的改变可能是癌前或癌状态的 先兆。
在单个验定中，实现识别所有不同HPV类型的可靠稳定的基于DNA 的检测系统是具有挑战性的，不仅是因为不同HPV基因组型之间存在交 叉杂交问题，而且构成HPV型的准确分类依赖于具有显著的生物信息学 局限性的基因组序列的相似性。因此，当将新的HPV型定义为与以前的 HPV型小于90％的序列相似性时，更精细的分类学细分(subdivision)成 为更有待解决的问题。因此，当DNA序列同源性相对于以前的亚型在 90-98％范围内时，被定义为新的HPV“亚型”。当序列同源性为以前的 变体的98-100％之间时，被定义为新的“变体”(1993，Van Rast，M.A.，et al.，Papillomavirus Rep，4，61-65；1998，Southern，S.A.and Herrington，C.S. Sex.Transm.Inf.74，101-109)。上述范围可以进一步扩大到基于比较单个 分离病毒颗粒的单基因组来测量突变。这种情况下，“基因型”可以是 任何完全测序的HPV基因组，其与任何其它完全测序的HPV基因组最 少有一个碱基的差别，其包括在确定位点的单个碱基可以G、A、T或C 四种状态中的一种而存在的所有情况，以及通过缺失、添加、扩增或转 座到另一位点来改变既定位点的碱基的情况。
由于上述原因，相对于HPV16基因组，进行了本专利说明书申请中 所用的生物信息学的比较(利用HPV16基因组1至7904位作为标准比较 物，并利用先前技术BLAST法(1996，Morgenstern，B.，et al.，Proc.Natl. Acad.Sci.USA.93，12098-12103)。在本文中用作参考目的的标准HPV “型”是乳头瘤病毒科的HPV16，其是7904个碱基对的乳头瘤病毒 (National Center for Biotechnology Information，NCBI locus NC_001526； version NC_001526.1；GI：9627100；references，Medline，91162763 and 85246220；PubMed 1848319 and 2990099)。
疾病风险评估中现有的HPV检测系统所面临的困难主要有三方面， 第一是技术系统本身的局限性。第二是对患病细胞群的病理学解释的局 限性。第三是在评估不同人类群体疾病进程的临床水平上的局限性，该 群体在遗传背景和起作用的辅助因素上倾向于有差别。
某些HPV型与宫颈癌有关，而且导致阴道癌、外阴癌、阴茎癌和肛 门癌更不明确的部分。环状组织为宫颈变性带，其是对HPV致癌力具高 度易感性的区域，通常利用肉眼或显微镜可见的标准通，经由组织学、 细胞学和分子生物学方法，对其从完整的细胞常态到侵袭性癌的状态进 行评估。如果有助于确定细胞群从正常到异常组织所经过的分子轨道，那 么对病毒诱导的异常在病毒水平以及以及有障碍的人类细胞水平上进行 早期检测将有巨大的临床意义。然而，尽管巴氏涂片已经使用了半个世 纪，异常宫颈的细胞学诊断和常态之间的固相早期风险评估目前仍然有 问题。主要问题是围绕定义”初期癌’例如不同等级的宫颈上皮内瘤(CIN1， CIN2和CIN3)的难易理解的标准以及因此涉及治疗方案的临床决策的难 易理解的标准。许多临床医生认为初期癌的定义是伪精确方式，其是为 了避免使用CIN2、CIN3和原位癌。显微镜诊断甚至是CIN2的临床意义 上都存在很大的异质性(2003，Schiffman，M.，J.Nat.Cancer Instit.Monog. 31，14-19)。某些CIN2病变显微镜观察具有不良表象，但是能够被免疫 系统克服并消失，而其它病变可能会发展成浸润性癌。因此，许多人认 为CIN2是可疑诊断的缓冲区，尽管该区域的边界条件仍然有争议。一些 临床医生认为将CIN2和CIN3组合不可行，而其它临床医生会治疗CIN2 或者更坏状况的所有病变。最后，有文献表明有三分之一至三分之二被 确定为CIN3的妇女会发展成浸润性癌，但是其甚至以不可预知而且依赖 时间的方式发生(2003，Schiffman，M.，J.Nat.Cancer.Instit.Monog.31， 14-19；1978，Kinlen，L.J.，et al.，Lancet 2，463-465；1956，Peterson，O.Am. J.Obstet.Gynec.72，1063-1071)。
医生今天仍然面临的重要问题是难于定义低度的细胞学异常情况， 例如无明确意义的非典型鳞状细胞(ASCUS)或鳞状上皮内病变(SILs)。” “实上，ASCUS不是适当的诊断，而是很少得到了解的变化的‘废纸篓’ 范畴，其具有不被了解的变化”(1996，Lorincz，A.T.，1996，J.Obstet. Gyncol.Res.22，629-636)。因为来自口服避孕药的使用，抽烟和HPV以 外的病原体例如沙眼衣原体和II型单纯疱疹病毒、抗氧化剂营养素以及 宫颈炎的辅助因素效应，癌前期病变的整个范围很难去解释，所有上述 这些都声称能调节从重度鳞状上皮细胞内病变(HSILs)发展到宫颈癌的风 险(2003，Castellsague，X.J.Nat.Cancer Inst.Monog.31，20-28)。因为最初 发现将凹细胞非典型性和CIN1归入轻度鳞状上皮细胞内病变(LSILs)较 新的范畴中是没有益处的，因此引入Bethesda分类系统及其2001年修订 版几乎没有减少临床医生中的上述混淆。引入Bethesda系统的结果是许 多临床医生对凹细胞非典型性没有进行阴道镜检查，“但是认为对CIN1 患者非得做这项检查”，(1995，Hatch，K.D.，，Am.J.Obstet.Gyn.172， 1150-1157)。显然，尽管阴道镜检查技术需要多年练习，但主观的细胞学 标准仍然会导致不一致性和非再现性(1994，Sherman，M.E.，Am.J.Clin. Pathology，102，182-187；1988，Giles，J.A.，Br.Med.J.，296，1099-1102)。
连续诊断的障碍是模糊诊断例如“典型”能占某些背景中诊断的20 ％或更多(1993，Schiffman，M.Contemporary OB/GYN，27-40)。一种专门 设计用于评价病理学家对“非典型”涂片的独立诊断一致水平的实验说 明了这种情况。实验发现五位病理学家对同样的一组样品的准确一致仅 在29％的病例中发生(1994，Sherman，M.E.，et al.，Am.J.Clin.Pathology， 102，182-187)。最终结果是宫颈细胞学继续保持高假阴性率(称为低灵敏 度)和高假阳性率(称为低特异性)。不同病理学家的细胞学解释产生达到 20％左右的假阴性率以及达到15％的假阳性率(1993，Koss，L.G.，Cancer， 71，1406-1412)。假阳性结果导致不必要的阴道镜检查、活组织检查和治 疗，所有这些都会增加医疗费负担。假阴性结果导致潜在的医疗事故法 律诉讼及相关费用。利用HPV检验对宫颈异常情况进行早期分子诊断向 这种领域提供比细胞学诊断更少的主观实验。
生物体不健康的基因组指标与许多水平的基因组甲基化状态的变化 密切相关。食品添加物对甲基化和代谢健康具有非故意的并且有害的结 果(Waterland，R.A.，2003，Molecular and Cellular Biology，23，5293-5300)， 并且，某些基因组启动子区的异常甲基化，例如reelin基因座的异常甲 基化与各种精神状况例如精神分裂症有关(2002，Chen，Y.，et al.，Nucleic Acids Research，30，2930-2939；Miklos，G.L.G.，and Maleszka，R.，2004， Nature Biotechnology，22，615-621)。甲基化研究的单个最大领域是在癌症 研究中，其中详细记录了基因组区域的超甲基化和低甲基化(French，S.W.， et al.，2002，Clinical Immunology，103，217-230；Frigola，J.，et al.，2005， Human Molecular Genetics，14，319-326；Belinsky S.A.，et al.，Nature Reviews Cancer，4，1-11)。其中一些研究其目的是揭示用于指示癌症的预 后生物标记(Baker，M.，2005，Nature Biotechnology，23，297-304)，但是生 物标记领域尽是不一致的结果。另外，这些基因组研究与对来自微生物 和病毒感染的细胞和组织干扰的其它来源罕有关联。另外，癌基因组通 常包含大量的基因组变动，例如染色体非整倍性、节段非整倍性、缺失、 扩增、倒位、易位和多点突变(Duesberg，P.，2004，Cell Cycle，3，823-828； Miklos，G.L.G.，2005，Nature Biotechnology，23，535-537)，并且在甲基化 变化的情况下，仍然没有深入探讨这些基因组变动对早期检测的重要性 (Vogelstein，B.，et al.，2004，Nature Medicine，10，789-799；Lucito，R.，et al.， 2003，Genome Research，13，2291-2305)。
鉴于以上所列的所有问题和不足，对于DNA方法的临床效果尤其是 在瘤前病变的筛查中仍然存在争议。细胞异常的灵敏早期分子预后指标 可能非常有价值的。本发明人已经研发了用于检测病毒和基因组靶标的 新的方法、试剂盒以及整合的生物信息学平台，用于确定个体的健康状 态。
从总的核酸序列中扩增特异序列，最广泛采用的方法是聚合酶链式反应 (PCR)(Dieffenbach，C and Dveksler，G.eds.PCR Primer：A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Press，Plainview NY)。在该扩增方法中，在互补DNA链 上且在待扩增区域的任一端处的长度通常为20-30个核苷酸的寡核苷酸，用 于在变性的单链DNA上引导DNA合成。变性、引物杂交以及使用热稳定的 DNA聚合酶的DNA链合成的连续循环使引物之间的序列呈指数扩增。通过 首先复制，可扩增RNA序列，该首先复制使用反转录酶产生互补DNA(cDNA) 拷贝。扩增的DNA片段可通过多种手段进行检测，包括凝胶电泳、与标记 的探针杂交，采用允许后续鉴定(例如通过酶联反应)的标记引物，以及采用 一旦与靶标DNA杂交即产生信号的荧光标记引物(例如Beacon和TaqMan 体系)。
同PCR一样，多种用于检测和扩增特异的核苷酸序列的其它技术已得以 发展。一个实例就是连接酶链式反应(Barany，F.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88，189-193，1991)。
另一个实例是1992年首次描述并命名为链置换扩增(Strand Displacement Amplification，SDA)的等温扩增(Walker GT，Little MC，Nadeau JG and Shank D.Isothermal in vitro amplification of DNA by a restriction enzyme/DNA polymerase system.PNAS 89：392-396(1992))。从那时起，已经描 述了大量其它等温扩增技术，包括转录介导的扩增(Transcription Mediated Amplification，TMA)和基于核酸序列的扩增(Nucleic Acid Sequence Based Amplification，NASBA)，其利用RNA聚合酶来复制RNA序列而不是相应的 基因组DNA。(Guatelli JC，Whitfield KM，Kwoh DY，Barringer KJ，Richmann DD and Gingeras TR.Isothermal，in vitro amplification of nucleic acids by a multienzyme reaction modeled after retroviral replication.PNAS 87：1874-1878 (1990)：Kievits T，van Gemen B，van Strijp D，Schukkink R，Dircks M， Adriaanse H，Malek L，Sooknanan R，Lens P.NASBA isothermal enzymatic in vitro nucleic acid amplification optimized for the diagnosis of HIV-1 infection.J Virol Methods.1991 Dec；35(3)：273-86)
其它基于DNA的等温技术包括：滚环扩增(Rolling Circle Amplification，RCA)，其中DNA聚合酶延伸针对环状模板的引物(Fire A and Xu SQ.Rolling replication of short circles.PNAS 92：4641-4645 (1995)；利用环状探针检测靶标的分支扩增(Ramification，Amplificaiton， RAM)(Zhang W，Cohenford M，Lentrichia B，Isenberg HD，Simson E，Li H， Yi J，Zhang DY.Detection of Chlamydia trachomatis by isothermal ramification amplification method：a feasibility study.J Clin Microbiol. 2002Jan；40(1)：128-32.)；以及最近的解旋酶依赖的等温DNA扩增 (Helicase-Dependent isothermal DNA amplification，HDA)，其利用解旋酶 代替加热来使DNA链解开(Vincent M，Xu Y，Kong H.Helicase-dependent isothermal DNA amplification.EMBO Rep.2004Aug；5(8)：795-800.)。
最近，已经描述了DNA的等温扩增法(Walker GT，Little MC，Nadeau JG and Shank D.Isothermal in vitro amplification of DNA by a restriction enzyme/DNA polymerase system.PNAS 89：392-396(1992))。传统的扩增 技术依赖于在扩增反应每一个循环中的靶标分子变性和退火的连续循 环。DNA的热处理导致DNA分子一定程度的剪切，因此当DNA有限， 例如从来自发育中的胚泡的少量细胞中分离DNA时，或者特别是在DNA 已经是片段的形式如在组织切片、石蜡块和古代DNA样品中的的情况 下，这种加热-冷却循环可能进一步破坏DNA并导致扩增信号的丢失。 等温法不依赖于模板DNA的连续变性来产生单链分子作为进一步扩增 的模板，而是通过特异的限制性内切酶在恒温下酶切DNA分子，或者通 过利用解旋酶解开DNA双链体。
术语称为链置换扩增的技术依赖于某些限制性内切酶切割半修饰 DNA的未修饰链的能力以及缺少5’-3’核酸外切酶的DNA聚合酶延伸和 置换下游链的能力。然后通过偶联有义和反义反应而实现指数扩增，其 中来自有义反应的链置换充当反义反应的模板(Walker GT，Little MC， Nadeau JG and Shank D.Isothermal in vitro amplification of DNA by a restriction enzyme/DNA polymerase system.PNAS 89：392-396(1992)。此 类技术已经成功地用于以下扩增：结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)(Walker GT，Little MC，Nadeau JG and Shank D.Isothermal in vitro amplification of DNA by a restriction enzyme/DNA polymerase system. PNAS 89：392-396(1992))；HIV-1、丙型肝炎和HPV-16(Nuovo G.J.， 2000)，以及沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)(Spears PA，Linn P， Woodard DL and Walker GT.Simultaneous Strand Displacement Amplification and Fluorescence Polarization Detection of Chlamydia trachomatis.Anal.Biochem.247：130-137(1997))。
至今，SDA的应用依赖于修饰的磷硫酰核苷酸，用以产生半磷硫酰DNA 双链体，其在修饰的链上对酶切具有抗性，导致酶切代替消化作用来推动置 换反应。然而，最近已经设计改造了多种“切口酶”，这些酶不以传统的方 式切割DNA，而是在其中一条DNA链上形成一个切口。“切口酶”包括 N.Alw1(Xu Y，Lunnen KD and Kong H.Engineering a nicking endonuclease N.Alw1 by domain swapping.PNAS 98：12990-12995(2001)、N.BstNB1 (Morgan RD，Calvet C，Demeter M，Agra R，Kong H.Characterization of the specific DNA nicking activity of restriction endonuclease N.BstNBI.Biol Chem. 2000Nov；381(11)：1123-5.)以及Mly1(Besnier CE，Kong H.Converting MlyI endonuclease into a nicking enzyme by changing its oligomerization state. EMBO Rep.2001Sep；2(9)：782-6.Epub 2001 Aug 23)。因此，这些酶的应用将 简化SDA步骤。
另外，SDA技术已经通过热稳定的限制性内切酶(Ava1)和热稳定的 外切聚合酶(Bst聚合酶)的组合使用而得到改善。已表明这种组合可以将 反应的扩增效率从108倍扩增提高到1010倍扩增，因此应用该技术来扩 增独特的单拷贝分子是可能的。利用热稳定聚合酶/酶组合得到的总扩增 因子为109的数量级(Milla M.A.，Spears P.A.，Pearson R.E.and Walker G. T.Use of the Restriction Enzyme Ava1 and Exo-Bst Polymerase in Strand Displacement Amplification Biotechniques 199724：392-396)。
目前，所有的等温DNA扩增技术都要求起始的双链模板DNA分子 在扩增开始之前变性。另外，每次引发只启动一次扩增。
对于直接检测，靶标核酸最通常是根据大小通过凝胶电泳进行分离， 并在与靶序列互补的探针杂交(DNA印迹和RNA印迹)前，转移至固相支 持体上。该探针可以是天然核酸或类似物，例如肽核酸(Peptide nucleic acid，PNA)或锁核酸(locked nucleic acid，LNA)或嵌入核酸(intercalating nucleic acid，INA)。该探针可直接标记(例如，用32P)，或者可以采用间接 检测方法，间接方法通常依赖将“标签”例如生物素或者地高辛结合至 该探针中，然后通过例如酶联底物转化或者化学发光的方法来检测该探 针。
另一种广泛应用的直接检测核酸的方法是“夹心”杂交(Sandiwich hybridisation)。在该方法中，将捕获探针偶联到固相载体上，并且溶液中 的靶标核酸与结合的探针进行杂交，将未结合的靶核酸洗去，并利用与 靶标序列杂交的第二探针来检测结合的核酸。检测可以利用上述列出的 直接或者间接的方法。这些方法的实例包括“分支DNA”信号检测系统， 其是利用夹心杂交原理的实例(1991，Urdea，M.S.，et al.，Nucleic Acids Symp.Ser.24，197-200)。利用核酸杂交直接检测核酸序列的迅速发展的领 域是DNA微阵列(2002，Nature Genetics，32，[Supplement]；2004，Cope， L.M.，et al.，Bioinformatics，20，323-331；2004，Kendall，S.L.，et al.，Trends in Microbiology，12，537-544)。在该过程方法中，将单核酸物种类别 (species)以网格模式固定于固相载体支持体上，或者在固相支持体载体上 光刻地合成，其中单核酸类别范围可以从短寡核苷酸(在Affymetrix system体系中通常为25-mers)至较长的寡核苷酸(在Applied Biosystems and Agilent platforms平台中通常为60-mers)至更长的序列例如cDNA克 隆。将加标签的或标记的核酸群(nucleic acid population)与该阵列进行杂 交，并将阵列中每个点的杂交水平加以定量。尽管也可以采用其它检测 系统，例如化学发光，但最常见的是将放射性标记的或者荧光标记的核 酸(例如cRNAs或者cDNAs)用于杂交。
最近，人们对采用分子学方法诊断感染性疾病很感兴趣，因为这些 新兴的方法提供灵敏而特异的病原微生物检测。在此背景下，本发明涉 及人乳头瘤病毒(HPV)，其DNA基因组以群体水平存在，作为具有单个 HPV类型的可变基因库(pool)，该HPV类型在群体水平水平以及在它们 的基因组大小上不同。各种分子实验的局限性限制了利用分子实验对各 种临床样品中不同HPV型的检测和精确鉴别。此外，大量“基因型”、 “变体”、“亚型”和“型”存在于定义HPV的伞状分组(umbrella grouping) 中。例如，目前存在超过100种公认的HPV类型，其中一些与人类疾病 密切相关。所谓的高度和中度风险型与发展成癌症有关，经由最精确的 可用的分子方法对其进行检测是临床急需优先考虑的事情。
主要问题是单独HPV的检测未必是发展成癌症的优良指标。尽管宫 颈上皮内瘤(Cervical Intraepithelial Neoplasia，CIN)能够发展为浸润型，但 是许多病变退化或者持续，而没有发展成癌。两年内70％的妇女将清除 HPV感染(1998，Journal of Pediatrics，132，277-284；Moscicki，A.B.，et al.)。然而，CIN的发现及其发展非常易变，以致还没有得以治疗，其可 恢复常态或导致完全型癌(full blown carcinoma)。约三分之一至一半的 CINI和CINII病例自发恢复(1990，Australian and New Zealand Journal of Obstetrics and Gynaecology，30，1-23.，Channen，W et al.)，从CINI发展到 CINII需要10年左右时间，但是一些女性可能会是20年或者更长时间 (2000，Cancer Research，60，6027-6032.，Ylitalo，E et al.)。
细胞、组织或器官的病毒感染可能会改变这些实体的基因组甲基化 标记，如在Epstein-Barr病毒的情况下，并且其与胃癌相关(2002，American J.Pathology，160，787-794，Kang，G.H.，et al)。因为甲基化或去甲基化是在 许多细胞分裂(cell divisions)中获得的稳定的变化，在某些情况下，如生 物体世代通常稳定的甲基化谱(methylome)的改变可能是癌前或癌状态的 先兆。
在单个验定中，实现识别所有不同HPV类型的可靠稳定的基于DNA 的检测系统是具有挑战性的，不仅是因为不同HPV基因组型之间存在交 叉杂交问题，而且构成HPV型的准确分类依赖于具有显著的生物信息学 局限性的基因组序列的相似性。因此，当将新的HPV型定义为与以前的 HPV型小于90％的序列相似性时，更精细的分类学细分(subdivision)成 为更有待解决的问题。因此，当DNA序列同源性相对于以前的亚型在 90-98％范围内时，被定义为新的HPV“亚型”。当序列同源性为以前的 变体的98-100％之间时，被定义为新的“变体”(1993，Van Rast，M.A.，et al.，Papillomavirus Rep，4，61-65；1998，Southern，S.A.and Herrington，C.S. Sex.Transm.Inf.74，101-109)。上述范围可以进一步扩大到基于比较单个 分离病毒颗粒的单基因组来测量突变。这种情况下，“基因型”可以是 任何完全测序的HPV基因组，其与任何其它完全测序的HPV基因组最 少有一个碱基的差别，其包括在确定位点的单个碱基可以G、A、T或C 四种状态中的一种而存在的所有情况，以及通过缺失、添加、扩增或转 座到另一位点来改变既定位点的碱基的情况。
由于上述原因，相对于HPV16基因组，进行了本专利说明书申请中 所用的生物信息学的比较(利用HPV16基因组1至7904位作为标准比较 物，并利用先前技术BLAST法(1996，Morgenstern，B.，et al.，Proc.Natl. Acad.Sci.USA.93，12098-12103)。在本文中用作参考目的的标准HPV “型”是乳头瘤病毒科的HPV16，其是7904个碱基对的乳头瘤病毒 (National Center for Biotechnology Information，NCBI locus NC_001526； version NC_001526.1；GI：9627100；references，Medline，91162763 and 85246220；PubMed 1848319 and 2990099)。
疾病风险评估中现有的HPV检测系统所面临的困难主要有三方面， 第一是技术系统本身的局限性。第二是对患病细胞群的病理学解释的局 限性。第三是在评估不同人类群体疾病进程的临床水平上的局限性，该 群体在遗传背景和起作用的辅助因素上倾向于有差别。
某些HPV型与宫颈癌有关，而且导致阴道癌、外阴癌、阴茎癌和肛 门癌更不明确的部分。环状组织为宫颈变性带，其是对HPV致癌力具高 度易感性的区域，通常利用肉眼或显微镜可见的标准通，经由组织学、 细胞学和分子生物学方法，对其从完整的细胞常态到侵袭性癌的状态进 行评估。如果有助于确定细胞群从正常到异常组织所经过的分子轨道，那 么对病毒诱导的异常在病毒水平以及以及有障碍的人类细胞水平上进行 早期检测将有巨大的临床意义。然而，尽管巴氏涂片已经使用了半个世 纪，异常宫颈的细胞学诊断和常态之间的固相早期风险评估目前仍然有 问题。主要问题是围绕定义”初期癌’例如不同等级的宫颈上皮内瘤(CIN1， CIN2和CIN3)的难易理解的标准以及因此涉及治疗方案的临床决策的难 易理解的标准。许多临床医生认为初期癌的定义是伪精确方式，其是为 了避免使用CIN2、CIN3和原位癌。显微镜诊断甚至是CIN2的临床意义 上都存在很大的异质性(2003，Schiffman，M.，J.Nat.Cancer Instit.Monog. 31，14-19)。某些CIN2病变显微镜观察具有不良表象，但是能够被免疫 系统克服并消失，而其它病变可能会发展成浸润性癌。因此，许多人认 为CIN2是可疑诊断的缓冲区，尽管该区域的边界条件仍然有争议。一些 临床医生认为将CIN2和CIN3组合不可行，而其它临床医生会治疗CIN2 或者更坏状况的所有病变。最后，有文献表明有三分之一至三分之二被 确定为CIN3的妇女会发展成浸润性癌，但是其甚至以不可预知而且依赖 时间的方式发生(2003，Schiffman，M.，J.Nat.Cancer.Instit.Monog.31， 14-19；1978，Kinlen，L.J.，et al.，Lancet 2，463-465；1956，Peterson，O.Am. J.Obstet.Gynec.72，1063-1071)。
医生今天仍然面临的重要问题是难于定义低度的细胞学异常情况， 例如无明确意义的非典型鳞状细胞(ASCUS)或鳞状上皮内病变(SILs)。” “实上，ASCUS不是适当的诊断，而是很少得到了解的变化的‘废纸篓’ 范畴，其具有不被了解的变化”(1996，Lorincz，A.T.，1996，J.Obstet. Gyncol.Res.22，629-636)。因为来自口服避孕药的使用，抽烟和HPV以 外的病原体例如沙眼衣原体和II型单纯疱疹病毒、抗氧化剂营养素以及 宫颈炎的辅助因素效应，癌前期病变的整个范围很难去解释，所有上述 这些都声称能调节从重度鳞状上皮细胞内病变(HSILs)发展到宫颈癌的风 险(2003，Castellsague，X.J.Nat.Cancer Inst.Monog.31，20-28)。因为最初 发现将凹细胞非典型性和CIN1归入轻度鳞状上皮细胞内病变(LSILs)较 新的范畴中是没有益处的，因此引入Bethesda分类系统及其2001年修订 版几乎没有减少临床医生中的上述混淆。引入Bethesda系统的结果是许 多临床医生对凹细胞非典型性没有进行阴道镜检查，“但是认为对CIN1 患者非得做这项检查”，(1995，Hatch，K.D.，，Am.J.Obstet.Gyn.172， 1150-1157)。显然，尽管阴道镜检查技术需要多年练习，但主观的细胞学 标准仍然会导致不一致性和非再现性(1994，Sherman，M.E.，Am.J.Clin. Pathology，102，182-187；1988，Giles，J.A.，Br.Med.J.，296，1099-1102)。
连续诊断的障碍是模糊诊断例如“典型”能占某些背景中诊断的20 ％或更多(1993，Schiffman，M.Contemporary OB/GYN，27-40)。一种专门 设计用于评价病理学家对“非典型”涂片的独立诊断一致水平的实验说 明了这种情况。实验发现五位病理学家对同样的一组样品的准确一致仅 在29％的病例中发生(1994，Sherman，M.E.，et al.，Am.J.Clin.Pathology， 102，182-187)。最终结果是宫颈细胞学继续保持高假阴性率(称为低灵敏 度)和高假阳性率(称为低特异性)。不同病理学家的细胞学解释产生达到 20％左右的假阴性率以及达到15％的假阳性率(1993，Koss，L.G.，Cancer， 71，1406-1412)。假阳性结果导致不必要的阴道镜检查、活组织检查和治 疗，所有这些都会增加医疗费负担。假阴性结果导致潜在的医疗事故法 律诉讼及相关费用。利用HPV检验对宫颈异常情况进行早期分子诊断向 这种领域提供比细胞学诊断更少的主观实验。
生物体不健康的基因组指标与许多水平的基因组甲基化状态的变化 密切相关。食品添加物对甲基化和代谢健康具有非故意的并且有害的结 果(Waterland，R.A.，2003，Molecular and Cellular Biology，23，5293-5300)， 并且，某些基因组启动子区的异常甲基化，例如reelin基因座的异常甲 基化与各种精神状况例如精神分裂症有关(2002，Chen，Y.，et al.，Nucleic Acids Research，30，2930-2939；Miklos，G.L.G.，and Maleszka，R.，2004， Nature Biotechnology，22，615-621)。甲基化研究的单个最大领域是在癌症 研究中，其中详细记录了基因组区域的超甲基化和低甲基化(French，S.W.， et al.，2002，Clinical Immunology，103，217-230；Frigola，J.，et al.，2005， Human Molecular Genetics，14，319-326；Belinsky S.A.，et al.，Nature Reviews Cancer，4，1-11)。其中一些研究其目的是揭示用于指示癌症的预 后生物标记(Baker，M.，2005，Nature Biotechnology，23，297-304)，但是生 物标记领域尽是不一致的结果。另外，这些基因组研究与对来自微生物 和病毒感染的细胞和组织干扰的其它来源罕有关联。另外，癌基因组通 常包含大量的基因组变动，例如染色体非整倍性、节段非整倍性、缺失、 扩增、倒位、易位和多点突变(Duesberg，P.，2004，Cell Cycle，3，823-828； Miklos，G.L.G.，2005，Nature Biotechnology，23，535-537)，并且在甲基化 变化的情况下，仍然没有深入探讨这些基因组变动对早期检测的重要性 (Vogelstein，B.，et al.，2004，Nature Medicine，10，789-799；Lucito，R.，et al.， 2003，Genome Research，13，2291-2305)。
鉴于以上所列的所有问题和不足，对于DNA方法的临床效果尤其是 在瘤前病变的筛查中仍然存在争议。细胞异常的灵敏早期分子预后指标 可能非常有价值的。本发明人已经研发了用于检测病毒和基因组靶标的 新的方法、试剂盒以及整合的生物信息学平台，用于确定个体的健康状 态。
发明内容
总的来说，本发明涉及一种用于确定受试者健康状态的测定法，其将病 毒存在的检测和指示健康状态的基因组靶标或标记的存在、缺失或者状态的 检测组合使用。如果需要，可对相同的测试、容器或者反应中的仅仅一个样 品实施本发明。
第一方面，本发明提供了用于确定受试者健康状态的测定法，包括：
(a)用能修饰核酸中未甲基化的胞嘧啶的试剂来处理受试者样品，其中 处理样品中的病毒核酸和基因组核酸经以形成衍生病毒核酸和衍生基因组 核酸；
(b)测定处理样品中衍生病毒核酸的存在；以及
(c)确定处理样品中衍生基因组核酸的基因组标记的状态，其中一个或 多个衍生病毒核酸的存在和基因组标记的状态指示健康状况。
在优选的形式中，所述测定法还包括：
在分析和确定步骤之前，扩增至少部分衍生病毒核酸和衍生基因组核 酸。
第二方面，本发明提供了用于确定受试者健康状态的测定法，其包括：
(a)用修饰未甲基化的胞嘧啶的试剂来处理含有病毒核酸和基因组核酸 的受试者样品，以形成具有胞嘧啶数减少但实质上具有与对应的未处理病毒 核酸和未处理基因组核酸的碱基总数相同的衍生病毒核酸和衍生基因组核 酸；
(b)获得病毒特异性核酸分子；
(c)获得具有基因组靶标的核酸分子；
(d)测试病毒特异性核酸分子的存在；以及
(e)确定处理和扩增样品中基因组靶标的状态，其中一个或多个病毒特 异性核酸分子的检测和靶标的状态指示受试者的健康状况。
优选地，通过扩增衍生病毒核酸和衍生基因组核酸，获得病毒特异性核 酸分子和具有基因组靶标的核酸分子。
第三方面，本发明提供了用于确定受试者健康状态的测定法，其包括：
(a)用修饰未甲基化的胞嘧啶的试剂来处理受试者样品，以形成衍生核 酸；
(b)提供能够允许将期望病毒核酸扩增为衍生核酸的引物；
(c)提供能够允许将靶基因组核酸分子扩增为衍生核酸的引物；
(d)对衍生核酸实施扩增反应；以及
(e)测定扩增的期望病毒核酸和扩增的靶基因组核酸的存在，其中一个 或多个扩增产物的存在或者不存在指示受试者的健康状态。
在优选的形式中，步骤(e)包括测定含有期望的病毒特异性核酸分子的扩 增核酸产物的存在，其中期望的病毒特异性核酸分子的检测指示样品中存在 该病毒。
在另一个优选的形式中，步骤(e)还包括测定含有靶标核酸分子的扩 增核酸产物的存在，其中靶标核酸分子的检测指示样品中基因组或者基 因的状态。
第四方面，本发明提供了一种用于确定受试者健康状态的测定法， 其包括：
(a)用亚硫酸氢盐试剂在使病毒和基因组核酸中未甲基化的胞嘧啶 转化为尿嘧啶的条件下处理受试者样品，以形成衍生病毒核酸和衍生基 因组核酸；
(b)为样品提供能结合到衍生病毒核酸区域的引物，该引物能够允许衍 生病毒核酸中期望的病毒特异性核酸分子的扩增；
(c)为样品提供能结合到衍生基因组核酸区域的引物；该引物能够允许 衍生基因组核酸中期望的靶标基因组特异性核酸分子的扩增；
(d)对处理样品的进行扩增反应；以及
(e)测定扩增的病毒核酸产物和扩增的基因组核酸靶标的存在，其中该 产物和靶标中一个或全部的检测指示受试者的健康状况。
在优选的形式中，该测定法还包括：
(f)测试存在病毒的样品，以确定样品中病毒的型、亚型、变体或者基 因型。
扩增可通过任何适合的方式进行，例如PCR或者等温扩增。
如果病毒含有DNA基因组，用试剂处理可以产生衍生核酸。然而，如 果病毒含有RNA基因组，基因组可经逆转录酶法转化为DNA。转化可在用 试剂处理之前或之后进行。优选地，采用病毒特异性引物以确保没有任何其 它RNA转化为cDNA。
受试者可以是任何具有显著频率的基因组甲基化的高等生命形式。通 常，本发明适于动物或人类以及病毒感染的植物种。优选地，动物是农场的 或家养的哺乳动物，但它们可以是健康状态需要监测的野生群体。人类可以 是健康个体或患者。
期望的病毒核酸分子可以是对病毒家族本身或低等分类范畴例如病 毒的属或种、型或亚型、或者变异体或基因型具有特异性的，不论其是 否是指示疾病。
某些基因组区的甲基化通常使相关基因的表达“关闭”。然而，在 某些情况下，某些基因可能具有相关的甲基化区域，但是基因表达仍然 “打开(on)”。因此，在优选的形式中，甲基化或非甲基化可以作为预后 指标，而不是基因本身的表达。阻断特异性核酸区域的扩增以确定或靶 向期望的甲基化状态也是可能的。
靶标基因组核酸可以是对一个基因或多个基因或调控区例如启动子或 增强子或者是基因组的任何编码或非编码区、或者静止或可动区具特异性 的。优选地，靶标具有用于诊断或预后目的的甲基化特征，其包括可动的或 者曾经是可动的元件，例如由重复DNA序列LINE家族举例说明的那些元件 (长散置元；也称作长散在核元件，人类基因组中广泛的逆转录转座子家族； 1996，Smit，A.F.A.，Current Opinion in Genetics and Development，6，743-748； 2003，Han，J.S.，et al.，Nature，429，268-274；2004，Brouha，B.，et al.，Proc.Natl. Acad.Sci.USA.100，5280-5285)以及SINE家族(短散置元件，也称作短散在 核元件；Batzer，M.A.，et al.)，它们共同组成了几乎人类基因组的一半。更优选 地，靶基因组核酸是基因组核酸的甲基化或未甲基化区域的指标。
优选地，可以利用对病毒特定型或病毒型的特定族具特异性的引物重复 进行测定，其中扩增产物的存在是病毒特定型或病毒型的特定族的指标。
通常，扩增后，每个衍生核酸形成了与相应的未处理的核酸相比胞嘧啶 总数减少的简化核酸分子，其中简化的核酸分子优选地包括对该病毒或靶标 具特异性的核酸序列。
对于不含有甲基化的胞嘧啶的双链DNA，上述处理步骤产生两个衍生 核酸，每个均包含碱基腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶。这两个衍生核 酸是由双链DNA的两个单链产生的。这两个衍生核酸不含有胞嘧啶，但仍 然含有与原始的未处理DNA分子相同的碱基总数和序列长度。重要的是， 这两个衍生物彼此不是互补的，并且形成一个上游链和一个下游链。一个或 多个链可以作为扩增的靶标来产生简化的核酸分子。
通常，在未处理病毒基因组中不天然存在病毒特异性的简化核酸序列。
病毒株或型能够赋予特定人或动物种族谱系中特定组织以高、中或低水 平致癌状态或其它疾病状态。实例包括高风险HPV型16、18、45和56；中 风险HPV型30、31、33、35、39、51、52、58、59和68；以及低风险HPV 型6、11、42、43、44、53、54和55。
上述病毒可以来自任何已描述的人类病毒家族(参见； http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ICTVdb/Ictv/ICD-10.htm)，例如来自：
痘病毒科(Poxviridae)，其包括牛痘病毒(Cowpox virus)、猴痘病毒 (Monkeypox virus)、痘苗病毒(Vaccinia virus)和类天花病毒(Vnariola virus)。依赖于上述病毒，它们能引起皮肤和粘膜损伤、湿疹(eczema)以 及传染性脓疱性皮炎(congagious pulstular dermatitis)。2003年 International Statistical Classification of Diseases and Related Health Problems(ICD)第十版(http://www3.who.int/icd/vol1htm2003/navi.htm)概 述了各种人类疾病。
副粘病毒科(Paramyxoviridae)，其包括尼帕病毒(Nipah virus)、副流 感病毒(parainfluenza)和腮腺炎病毒(Mumps)，其与各种呼吸器官疾病 (respiratory illness)、腮腺炎(mumps)、脑膜炎(meningitis)、胰腺炎 (pancreatitis)、脑炎(encephalitis)和麻疹(measles)有关。尼帕病毒于1999 年被首次识别，其致使70％的感染患者患致命的脑炎，并且具有非常广 泛的宿主范围包括人类、犬(dogs)、猫(cats)、猪(pigs)、马(horses)、仓鼠 (hamsters)、蝙蝠(bats)和豚鼠(guinea pigs)。它是全球健康和经济的严重 威胁(2005，Nature，436，401-405；Negrete，O.A.，et al，)；
黄病毒科(Flaviviridae)，其包括登革病毒(Dengue)、黄热病病毒 (Yellow Fever)、丙型肝炎病毒和庚型肝炎病毒(hepatitis C and G)，其与 脑炎(encephalitis)、肝炎和休克综合征(shock syndrome)有关。例如，丙型 肝炎病毒是具有六个主要基因型的RNA病毒，它是全世界超过一亿七千 万人感染慢性肝病的主要原因，而且无有效的疫苗(2005，Science，309， 623-626；Lindenbach，B.D.，et al，)；
疱疹病毒科(Herpesviridae)，其包括人疱疹病毒(herpesvirus)1至8。 这些病毒可以引起口腔感染、角膜溃疡(ulceration of the cornea)、生殖道 感染(genital tract infections)、脑膜炎(meningitis)、水痘(chickenpox)、肺 炎(pneumonia)、带状疱疹(shingles)、巨细胞病毒性单核细胞增多症 (cytomegaloviral mononucleosis)和脑炎。人巨细胞病毒可以在免疫障碍的 个体包括器官移植的个体中产生严重的致命疾病。另外，HHV8被认为 是AIDS相关病症Kaposi肉瘤(Kaposi sarcoma)的致病因素(2003，Nature， 424，456-461；Wang，X.，et al，)；
腺病毒科(Adenoviridae)，其包括人类腺病毒(adenoviruses)A至F。 这些病毒可以引起呼吸器官疾病、肾感染、结膜炎(conjunctivitis)和腹泻 (diarrhoea)；
乳头瘤病毒科(Papillomaviridae)，其包括以上介绍的人乳头瘤病毒 类型。这些病毒引起病毒性疣(viral warts)和宫颈(cervis)、喉(larynx)及膀 胱(bladder)的肿瘤(neoplasm)。
细小病毒科(Parvoviridae)，其包括B19病毒，产生风疹(Rubella)症 状但没有并发症。
肝DNA病毒科(Hepadnaviridae)，其包括乙型肝炎病毒(Hepatitis B)， 与肝硬化(cirrhosis of the liver)和原发性肝细胞癌(primary hepatocellular carcinoma)有关；
逆转录病毒科(Retroviridae)，其包括1和2型HTLV以及1和2型 HIV，与急性感染和各种恶性肿瘤例如人T细胞白血病有关；
呼肠孤病毒科(Reoviridae)，其包括轮状病毒(rotavirus)，与腹泻、胃 肠炎(gastroenteritis)和上呼吸道疾病(upper respiratory tract illness)有关；
纤丝病毒科(Filoviridae)，其包括马堡型和埃博拉型病毒((Marburg and Ebola type viruses)，与出血热(hemorrhagic fever)有关；
弹状病毒科(Rhabdoviridae)，其包括水疱性口炎病毒(vesicular stomatitis)和狂犬病毒(Rabies)，与发热和狂犬病(Rabies)有关；
正粘病毒科(Orthomyxoviridae)，其包括A、B和C型流感病毒 (influenza)，与普通感冒和肺炎(pheumonia)有关；
本扬病毒科(Bunyaviridae)，其包括克里米亚-刚果出血热病毒 (Crimean-congo hemorrhagic fever virus)、New York病毒(New York virus) 和汉坦病毒(Hantavirus)，与急性发热和肺综合症(pulmonary syndromes) 有关；
沙粒病毒科(Arenaviridae)，其包括拉沙病毒(Lassa virus)、淋巴细胞 性脉络丛脑膜炎病毒(lymphocytic choriomeningitis virus)，与脑炎、脑膜 炎和出血热(hemorrhagic fever)有关；
冠状病毒科(Coronaviridae)，其包括人类冠状病毒(human coronavirus)，与普通感冒症状和胃肠道症状(gastrointestinal symptoms)有 关；
小核糖核酸病毒科(Picornaviridae)，其包括人类肠道病毒(human enteroviruses)A至D和脊髓灰质炎病毒(polio virus)，与支气管炎 (bronchitis)、脑膜炎和瘫痪(paralysis)有关；
杯状病毒科(Caliciviridae)，其包括诺瓦克样病毒和扎幌样病毒 (Norwalk-like and Sapporo-like viruses)，与急性胃肠炎(acute gastroenteritis)有关；
未分类的“戊型肝炎样病毒”(Hepatitis E-like viruses，HEV)与急性 肝炎有关；
星状病毒科(Astroviridae)，其包括人星状病毒(human astrovirus)， 与肠炎(enteritis)和胃肠炎(gastroenteritis)有关；以及
披膜病毒科(Togaviridae)，其包括罗斯河病毒(Ross River)和风疹病 毒(Rubella)，与脑炎、白细胞减少症(leucopenia)和疹(rash)有关。利用本 发明，临床分类为低风险的病毒在特定基因型或种族谱系的个人或动物 上实际上可能是高风险的。
核酸分子可以利用任何适宜的检测方法进行检测。实例包括，但不 限于：
提供能结合于核酸分子区域的检测配体，并有足够的时间使该检测 配体结合于该区域；以及
测定该检测配体与核酸分子的结合，以检测该核酸分子的存在情况。 应了解可以利用本领域中已知的任何适宜的方式来检测核酸分子。
当任何特定病毒的病毒特异的核酸分子已经获得或得以鉴定，可以 设计探针或引物以确保在扩增反应中扩增目的区域。重要的是要注意可 以分析所处理的基因组的两条链以及由此转化的基因组(下文称为“衍生 物”)的两条链两者以用于引物设计，因为处理或转化导致序列的不对称 性(参见下文)，因此为了检测同一基因座的上游链和下游链(也称为 “Watson”和“Crick”链)需要不同的引物序列。因此，存在两个分子群， 即如在转化后立即存在的转化基因组，以及在衍生物通过常规酶学方法 (PCR)或通过例如等温扩增的方法复制后得到的分子群。为了方便，通常 针对转化的上游链设计引物，但是引物也生针对下游链被而产生。因此， 对样品实施临床或科学测定以检测生物体基因组中特定类型的病毒和靶 标是可能的。
本发明可以使用指示代表性病毒类型的探针或引物，其可以用于确 定特定样品中是否存在任何病毒。此外，病毒型特异性探针可以用来实 际检测或鉴定病毒的特定型、亚型、变体和基因型实例。
本发明可以使用指示靶标例如甲基化的探针或引物，其可以用于确 定特定样品中是否存在靶标。此外，靶标特异性探针可以用来实际检测 或鉴定基因组中的靶标。
本发明真实且意想不到的优势是，其可以在一个反应管或容器中实 施。不仅可以分析病毒而且能够鉴定基因组靶标或靶标。在一个分析中 两种试验参数的组合允许确定受试者的健康状态。健康状态可以是疾病 例如癌症、癌前状态、高风险疾病状态等等。本发明可以作为疾病状态 或潜在疾病状态的早期指示，其将允许早期医学或兽医学或园艺学的干 预以防止进一步发展或治愈该疾病。
本发明尤其适合检测涉及疾病状态例如癌症的病毒。实例包括，但 不限于人类乳头瘤病毒、肝炎病毒、人免疫缺陷病毒(HIV)以及上述各种 病毒家族的成员。
本发明尤其适合检测涉及疾病状态例如癌症的细胞中的基因组靶 标。依赖于疾病或健康状态，基因组中潜在的任何基因、调控区或非编 码区、或者其核外或胞外组分是本发明所使用的潜在标记。
本发明人已经获得资料，其证明某些基因组区域的甲基化状态指示 癌进展，而且其进展在病毒存在情况下更加可靠。
利用临床样品和细胞系，本发明人观察对了在几乎400个人类基因 附近的调控区的甲基化模式进行了观察，并且，当处于癌状态并且HPV 存在时，发现约发现了超过60个具有甲基化改变的基因组标记，当处于 癌状态并且HPV存在时其具有甲基化改变。实例包括，但不限于一个或 多个下列基因组区域：CD14、ENDRB、HIC、RARB1、PGR、SFRS8、 TMSB10、ABCG2、MFNG、LAMR1、RAGE、ABL1、CRBP、GPR37、 HRK、RARA、SYK、ECE1、MME、TEM、NF2、XIAP、RARRES1、 FLI1、HTLF、LDHB、RB1、TGD、CDK4、MMP14、RAB32、BARD1、 NF1、LIM2、MMP2、DAB2、BMP6、CDKN1C、DAB2IP、LMNB1、 MMP28、HAI2、SOCS1、HIC2、MSH6、RIN2、HMGA1、JUN、S100P*、 SRF、VDR、DKK3、KRAS2、PLAU、TNFRSF10B、CDH1、MAC30、 DDB2、PAX6、AXL、EIF4A2、SLIT2、RECK、TERC、GATA5、STAT1。 其它区域包括列于下文表8中的区域。
根据本发明人获得的HPV资料，应了解每个和每种疾病或健康状态 可具有特定的基因组区域，其可在本发明中用作标记。当样品是HPV阳 性并且来自癌或癌前状态时，约15％经检验的基因组标记是阳性的(甲基 化)，该事实表明存在大量任何特定疾病或健康状态可能的靶标。既然人 类基因组中存在约25000个编码蛋白的基因座，那么15％的比例将预计 约有4000个利用基因调控区的可能的靶标。由于在特定疾病或健康状态 中特异的CpG区可以被甲基化，因而可能存在许多更加潜在的靶标。本 发明因此包括所有此类可能的标记。应了解本领域的技术人员能够使用 本教导来确定对于任何疾病或健康状态的任何有用的基因组标记。
第五方面，本发明提供了筛选受试者中潜在宫颈癌的测定法，包括：
(a)用亚硫酸氢盐试剂在使人乳头瘤病毒(HPV)和基因组核酸中未甲 基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶的条件下来处理受试者样品，以形成衍生 HPV核酸和衍生基因组核酸；
(b)提供能结合至衍生HPV核酸区域的引物，该引物能够允许扩增衍生 HPV核酸中期望的HPV特异性的核酸分子；
(c)提供能结合至衍生基因组核酸区域的引物，该引物能够允许扩增衍 生基因组核酸中期望的基因组特异性的核酸分子；
(d)对衍生HPV核酸和衍生基因组核酸进行扩增反应；以及
(e)测定扩增的HPV核酸产物和扩增的基因组核酸产物的存在，其中一 种产物一个或两种产物的检测指示受试者发展为宫颈癌状态。
在一个优选的形式中，该测定法还包括：
(f)测定存在HPV的样品，以确定样品中HPV的型、亚型、变异体或 者基因型。
例如对于HPV16的检测，可以制备能结合至衍生HPV16病毒核酸的引 物。应了解如HPV16所进行的，可以通过将各自的基因组序列中所有胞嘧 啶改变成尿嘧啶来确定所有其它HPV型的衍生HPV核酸。上述转化描述了 根据本发明测定法的步骤a中所进行的处理样品中病毒核酸的结果。
应了解可以设计其它适当的引物或探针，其能结合到其它HPV型来源 的衍生HPV病毒核酸。
第六方面，本发明提供了确定受试者健康状态的测定法中所使用的试剂 盒，其包括病毒特异性核酸分子的探针或引物、基因组特异性的核酸分子的 探针或引物，以及用于扩增反应例如PCR的一种或多种试剂或组分。
样品包括，但不限于拭样(swab)、活组织切片(biopsy)、涂片(smear)、巴 氏涂片(Pap smear)、表面刮片(surface scrape)、压舌板取样(spatula)和液体样 品(fluid sample)，以及来自不同存储介质的样品，例如冷冻材料(frozen material)、石蜡块(paraffin blocks)、载玻片(galss slides)、法医标本系统(forensic collection systems)和档案材料(archival material)。
任何生物种群，包括动物和人类、以及植物都存在对长期病毒效应 有抵抗作用的个体。因此，病毒存在和基因组标记例如基因组甲基化的 组合应该可以辨别生物体是否有或可能有疾病状态。本发明适合人类应 用以及兽医和其它基于生物体的应用。例如，本发明可以用于所有畜禽， 其有充分迹象表明发生了基因组甲基化，并且本发明甚至可以作为监测 野生种群的管理工具。
本质上，本发明涉及在两种水平上进行测定：一个用于病毒的存在， 另一个是用于从特定扩增产物或没有扩增来推断的基因组或核酸靶标的 存在、缺失或状态。靶标可以是甲基化状态、核酸序列、或缺少核酸序 列、或是改变的核酸序列。在某些晚期癌症中，基因组靶标可以完全缺 失，因此其存在的缺乏可以用于诊断。其本身可以是优秀的诊断工具而 且涵盖于本发明中。另外，许多癌症具有称作双微体(double-minutes)的 染色体外扩增子(amplicons)，因此严格来讲它们不是基因组，由于其不 存在于46条染色体中的一条。相似地，任何线粒体DNA、或细胞质或 细胞核细胞器所含的DNA涵盖于本发明中。
本发明人研发了一种组合技术，例如当在单个试管中使用时，该组 合技术比其它任何单独用于评估细胞群向癌性轨道发展的风险的技术更 加有效。通常，一个或少数基因组靶标的基因组甲基化可以在一个管中 进行。当同时包含病毒基因组和宿主基因组DNA(或RNA)的患者样品通 过使用亚硫酸氢钠转化成能够同时用于检测病毒存在和宿主甲基化模式 改变的简化形式时，该测定法是有效的。
修饰核酸可以将未甲基化的胞嘧啶转化为另一种核苷酸。优选地，该 试剂将未甲基化的胞嘧啶修饰为尿嘧啶，其随后在衍生核酸的扩增过程 中被替代为胸腺嘧啶。优选地，用于修饰未甲基化的胞嘧啶的试剂是亚 硫酸氢钠。类似地修饰未甲基化的胞嘧啶而不是甲基化的胞嘧啶的其它 试剂也可用于本发明的测定法中。实例包括，但不限于亚硫酸氢盐、醋 酸盐或柠檬酸盐。优选地，所述试剂是亚硫酸氢钠，一种在酸性水溶液 存在条件下将胞嘧啶修饰为尿嘧啶的试剂。
亚硫酸氢钠(NaHSO3)易与胞嘧啶的5，6-双键反应，形成磺酸化的胞 嘧啶反应中间体，该中间体易于脱氨，并在水存在下生成尿嘧啶亚硫酸 盐。如有必要，可在适度碱性条件下去除亚硫酸盐基团，形成尿嘧啶。 因此，潜在地所有胞嘧啶均可被转化为尿嘧啶。然而由于甲基化保护，任 何甲基化的胞嘧啶均不能由所述修饰试剂转化。
整个说明书中，除非上下文另有要求，词语“包括(comprise)”或其 变形如“包含(comprises)”或“包含(comprising)”应理解为表示包括所 述元件、整体或步骤、或元件、整体或步骤的组合，但不排除任何其它 元件、整体或步骤或元件、整体或步骤的组合。
对已包含于本说明书中的文献、法令(acts)、材料、装置、文章等的 任何讨论仅用于为本发明提供背景。尽管其在本说明书中各项权利要求 的优选权日期之前在澳大利亚已经存在，但并不认为是对任何或全部这 些内容构成现有技术基础的一部分的承认，或者成为本发明相关领域中 的公知常识。
为了更清楚地理解本发明，优选的实施例将参照以下附图和实例加 以阐述。
第一方面，本发明提供了用于确定受试者健康状态的测定法，包括：
(a)用能修饰核酸中未甲基化的胞嘧啶的试剂来处理受试者样品，其中 处理样品中的病毒核酸和基因组核酸经以形成衍生病毒核酸和衍生基因组 核酸；
(b)测定处理样品中衍生病毒核酸的存在；以及
(c)确定处理样品中衍生基因组核酸的基因组标记的状态，其中一个或 多个衍生病毒核酸的存在和基因组标记的状态指示健康状况。
在优选的形式中，所述测定法还包括：
在分析和确定步骤之前，扩增至少部分衍生病毒核酸和衍生基因组核 酸。
第二方面，本发明提供了用于确定受试者健康状态的测定法，其包括：
(a)用修饰未甲基化的胞嘧啶的试剂来处理含有病毒核酸和基因组核酸 的受试者样品，以形成具有胞嘧啶数减少但实质上具有与对应的未处理病毒 核酸和未处理基因组核酸的碱基总数相同的衍生病毒核酸和衍生基因组核 酸；
(b)获得病毒特异性核酸分子；
(c)获得具有基因组靶标的核酸分子；
(d)测试病毒特异性核酸分子的存在；以及
(e)确定处理和扩增样品中基因组靶标的状态，其中一个或多个病毒特 异性核酸分子的检测和靶标的状态指示受试者的健康状况。
优选地，通过扩增衍生病毒核酸和衍生基因组核酸，获得病毒特异性核 酸分子和具有基因组靶标的核酸分子。
第三方面，本发明提供了用于确定受试者健康状态的测定法，其包括：
(a)用修饰未甲基化的胞嘧啶的试剂来处理受试者样品，以形成衍生核 酸；
(b)提供能够允许将期望病毒核酸扩增为衍生核酸的引物；
(c)提供能够允许将靶基因组核酸分子扩增为衍生核酸的引物；
(d)对衍生核酸实施扩增反应；以及
(e)测定扩增的期望病毒核酸和扩增的靶基因组核酸的存在，其中一个 或多个扩增产物的存在或者不存在指示受试者的健康状态。
在优选的形式中，步骤(e)包括测定含有期望的病毒特异性核酸分子的扩 增核酸产物的存在，其中期望的病毒特异性核酸分子的检测指示样品中存在 该病毒。
在另一个优选的形式中，步骤(e)还包括测定含有靶标核酸分子的扩 增核酸产物的存在，其中靶标核酸分子的检测指示样品中基因组或者基 因的状态。
第四方面，本发明提供了一种用于确定受试者健康状态的测定法， 其包括：
(a)用亚硫酸氢盐试剂在使病毒和基因组核酸中未甲基化的胞嘧啶 转化为尿嘧啶的条件下处理受试者样品，以形成衍生病毒核酸和衍生基 因组核酸；
(b)为样品提供能结合到衍生病毒核酸区域的引物，该引物能够允许衍 生病毒核酸中期望的病毒特异性核酸分子的扩增；
(c)为样品提供能结合到衍生基因组核酸区域的引物；该引物能够允许 衍生基因组核酸中期望的靶标基因组特异性核酸分子的扩增；
(d)对处理样品的进行扩增反应；以及
(e)测定扩增的病毒核酸产物和扩增的基因组核酸靶标的存在，其中该 产物和靶标中一个或全部的检测指示受试者的健康状况。
在优选的形式中，该测定法还包括：
(f)测试存在病毒的样品，以确定样品中病毒的型、亚型、变体或者基 因型。
扩增可通过任何适合的方式进行，例如PCR或者等温扩增。
如果病毒含有DNA基因组，用试剂处理可以产生衍生核酸。然而，如 果病毒含有RNA基因组，基因组可经逆转录酶法转化为DNA。转化可在用 试剂处理之前或之后进行。优选地，采用病毒特异性引物以确保没有任何其 它RNA转化为cDNA。
受试者可以是任何具有显著频率的基因组甲基化的高等生命形式。通 常，本发明适于动物或人类以及病毒感染的植物种。优选地，动物是农场的 或家养的哺乳动物，但它们可以是健康状态需要监测的野生群体。人类可以 是健康个体或患者。
期望的病毒核酸分子可以是对病毒家族本身或低等分类范畴例如病 毒的属或种、型或亚型、或者变异体或基因型具有特异性的，不论其是 否是指示疾病。
某些基因组区的甲基化通常使相关基因的表达“关闭”。然而，在 某些情况下，某些基因可能具有相关的甲基化区域，但是基因表达仍然 “打开(on)”。因此，在优选的形式中，甲基化或非甲基化可以作为预后 指标，而不是基因本身的表达。阻断特异性核酸区域的扩增以确定或靶 向期望的甲基化状态也是可能的。
靶标基因组核酸可以是对一个基因或多个基因或调控区例如启动子或 增强子或者是基因组的任何编码或非编码区、或者静止或可动区具特异性 的。优选地，靶标具有用于诊断或预后目的的甲基化特征，其包括可动的或 者曾经是可动的元件，例如由重复DNA序列LINE家族举例说明的那些元件 (长散置元；也称作长散在核元件，人类基因组中广泛的逆转录转座子家族； 1996，Smit，A.F.A.，Current Opinion in Genetics and Development，6，743-748； 2003，Han，J.S.，et al.，Nature，429，268-274；2004，Brouha，B.，et al.，Proc.Natl. Acad.Sci.USA.100，5280-5285)以及SINE家族(短散置元件，也称作短散在 核元件；Batzer，M.A.，et al.)，它们共同组成了几乎人类基因组的一半。更优选 地，靶基因组核酸是基因组核酸的甲基化或未甲基化区域的指标。
优选地，可以利用对病毒特定型或病毒型的特定族具特异性的引物重复 进行测定，其中扩增产物的存在是病毒特定型或病毒型的特定族的指标。
通常，扩增后，每个衍生核酸形成了与相应的未处理的核酸相比胞嘧啶 总数减少的简化核酸分子，其中简化的核酸分子优选地包括对该病毒或靶标 具特异性的核酸序列。
对于不含有甲基化的胞嘧啶的双链DNA，上述处理步骤产生两个衍生 核酸，每个均包含碱基腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶。这两个衍生核 酸是由双链DNA的两个单链产生的。这两个衍生核酸不含有胞嘧啶，但仍 然含有与原始的未处理DNA分子相同的碱基总数和序列长度。重要的是， 这两个衍生物彼此不是互补的，并且形成一个上游链和一个下游链。一个或 多个链可以作为扩增的靶标来产生简化的核酸分子。
通常，在未处理病毒基因组中不天然存在病毒特异性的简化核酸序列。
病毒株或型能够赋予特定人或动物种族谱系中特定组织以高、中或低水 平致癌状态或其它疾病状态。实例包括高风险HPV型16、18、45和56；中 风险HPV型30、31、33、35、39、51、52、58、59和68；以及低风险HPV 型6、11、42、43、44、53、54和55。
上述病毒可以来自任何已描述的人类病毒家族(参见； http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ICTVdb/Ictv/ICD-10.htm)，例如来自：
痘病毒科(Poxviridae)，其包括牛痘病毒(Cowpox virus)、猴痘病毒 (Monkeypox virus)、痘苗病毒(Vaccinia virus)和类天花病毒(Vnariola virus)。依赖于上述病毒，它们能引起皮肤和粘膜损伤、湿疹(eczema)以 及传染性脓疱性皮炎(congagious pulstular dermatitis)。2003年 International Statistical Classification of Diseases and Related Health Problems(ICD)第十版(http://www3.who.int/icd/vol1htm2003/navi.htm)概 述了各种人类疾病。
副粘病毒科(Paramyxoviridae)，其包括尼帕病毒(Nipah virus)、副流 感病毒(parainfluenza)和腮腺炎病毒(Mumps)，其与各种呼吸器官疾病 (respiratory illness)、腮腺炎(mumps)、脑膜炎(meningitis)、胰腺炎 (pancreatitis)、脑炎(encephalitis)和麻疹(measles)有关。尼帕病毒于1999 年被首次识别，其致使70％的感染患者患致命的脑炎，并且具有非常广 泛的宿主范围包括人类、犬(dogs)、猫(cats)、猪(pigs)、马(horses)、仓鼠 (hamsters)、蝙蝠(bats)和豚鼠(guinea pigs)。它是全球健康和经济的严重 威胁(2005，Nature，436，401-405；Negrete，O.A.，et al，)；
黄病毒科(Flaviviridae)，其包括登革病毒(Dengue)、黄热病病毒 (Yellow Fever)、丙型肝炎病毒和庚型肝炎病毒(hepatitis C and G)，其与 脑炎(encephalitis)、肝炎和休克综合征(shock syndrome)有关。例如，丙型 肝炎病毒是具有六个主要基因型的RNA病毒，它是全世界超过一亿七千 万人感染慢性肝病的主要原因，而且无有效的疫苗(2005，Science，309， 623-626；Lindenbach，B.D.，et al，)；
疱疹病毒科(Herpesviridae)，其包括人疱疹病毒(herpesvirus)1至8。 这些病毒可以引起口腔感染、角膜溃疡(ulceration of the cornea)、生殖道 感染(genital tract infections)、脑膜炎(meningitis)、水痘(chickenpox)、肺 炎(pneumonia)、带状疱疹(shingles)、巨细胞病毒性单核细胞增多症 (cytomegaloviral mononucleosis)和脑炎。人巨细胞病毒可以在免疫障碍的 个体包括器官移植的个体中产生严重的致命疾病。另外，HHV8被认为 是AIDS相关病症Kaposi肉瘤(Kaposi sarcoma)的致病因素(2003，Nature， 424，456-461；Wang，X.，et al，)；
腺病毒科(Adenoviridae)，其包括人类腺病毒(adenoviruses)A至F。 这些病毒可以引起呼吸器官疾病、肾感染、结膜炎(conjunctivitis)和腹泻 (diarrhoea)；
乳头瘤病毒科(Papillomaviridae)，其包括以上介绍的人乳头瘤病毒 类型。这些病毒引起病毒性疣(viral warts)和宫颈(cervis)、喉(larynx)及膀 胱(bladder)的肿瘤(neoplasm)。
细小病毒科(Parvoviridae)，其包括B19病毒，产生风疹(Rubella)症 状但没有并发症。
肝DNA病毒科(Hepadnaviridae)，其包括乙型肝炎病毒(Hepatitis B)， 与肝硬化(cirrhosis of the liver)和原发性肝细胞癌(primary hepatocellular carcinoma)有关；
逆转录病毒科(Retroviridae)，其包括1和2型HTLV以及1和2型 HIV，与急性感染和各种恶性肿瘤例如人T细胞白血病有关；
呼肠孤病毒科(Reoviridae)，其包括轮状病毒(rotavirus)，与腹泻、胃 肠炎(gastroenteritis)和上呼吸道疾病(upper respiratory tract illness)有关；
纤丝病毒科(Filoviridae)，其包括马堡型和埃博拉型病毒((Marburg and Ebola type viruses)，与出血热(hemorrhagic fever)有关；
弹状病毒科(Rhabdoviridae)，其包括水疱性口炎病毒(vesicular stomatitis)和狂犬病毒(Rabies)，与发热和狂犬病(Rabies)有关；
正粘病毒科(Orthomyxoviridae)，其包括A、B和C型流感病毒 (influenza)，与普通感冒和肺炎(pheumonia)有关；
本扬病毒科(Bunyaviridae)，其包括克里米亚-刚果出血热病毒 (Crimean-congo hemorrhagic fever virus)、New York病毒(New York virus) 和汉坦病毒(Hantavirus)，与急性发热和肺综合症(pulmonary syndromes) 有关；
沙粒病毒科(Arenaviridae)，其包括拉沙病毒(Lassa virus)、淋巴细胞 性脉络丛脑膜炎病毒(lymphocytic choriomeningitis virus)，与脑炎、脑膜 炎和出血热(hemorrhagic fever)有关；
冠状病毒科(Coronaviridae)，其包括人类冠状病毒(human coronavirus)，与普通感冒症状和胃肠道症状(gastrointestinal symptoms)有 关；
小核糖核酸病毒科(Picornaviridae)，其包括人类肠道病毒(human enteroviruses)A至D和脊髓灰质炎病毒(polio virus)，与支气管炎 (bronchitis)、脑膜炎和瘫痪(paralysis)有关；
杯状病毒科(Caliciviridae)，其包括诺瓦克样病毒和扎幌样病毒 (Norwalk-like and Sapporo-like viruses)，与急性胃肠炎(acute gastroenteritis)有关；
未分类的“戊型肝炎样病毒”(Hepatitis E-like viruses，HEV)与急性 肝炎有关；
星状病毒科(Astroviridae)，其包括人星状病毒(human astrovirus)， 与肠炎(enteritis)和胃肠炎(gastroenteritis)有关；以及
披膜病毒科(Togaviridae)，其包括罗斯河病毒(Ross River)和风疹病 毒(Rubella)，与脑炎、白细胞减少症(leucopenia)和疹(rash)有关。利用本 发明，临床分类为低风险的病毒在特定基因型或种族谱系的个人或动物 上实际上可能是高风险的。
核酸分子可以利用任何适宜的检测方法进行检测。实例包括，但不 限于：
提供能结合于核酸分子区域的检测配体，并有足够的时间使该检测 配体结合于该区域；以及
测定该检测配体与核酸分子的结合，以检测该核酸分子的存在情况。 应了解可以利用本领域中已知的任何适宜的方式来检测核酸分子。
当任何特定病毒的病毒特异的核酸分子已经获得或得以鉴定，可以 设计探针或引物以确保在扩增反应中扩增目的区域。重要的是要注意可 以分析所处理的基因组的两条链以及由此转化的基因组(下文称为“衍生 物”)的两条链两者以用于引物设计，因为处理或转化导致序列的不对称 性(参见下文)，因此为了检测同一基因座的上游链和下游链(也称为 “Watson”和“Crick”链)需要不同的引物序列。因此，存在两个分子群， 即如在转化后立即存在的转化基因组，以及在衍生物通过常规酶学方法 (PCR)或通过例如等温扩增的方法复制后得到的分子群。为了方便，通常 针对转化的上游链设计引物，但是引物也生针对下游链被而产生。因此， 对样品实施临床或科学测定以检测生物体基因组中特定类型的病毒和靶 标是可能的。
本发明可以使用指示代表性病毒类型的探针或引物，其可以用于确 定特定样品中是否存在任何病毒。此外，病毒型特异性探针可以用来实 际检测或鉴定病毒的特定型、亚型、变体和基因型实例。
本发明可以使用指示靶标例如甲基化的探针或引物，其可以用于确 定特定样品中是否存在靶标。此外，靶标特异性探针可以用来实际检测 或鉴定基因组中的靶标。
本发明真实且意想不到的优势是，其可以在一个反应管或容器中实 施。不仅可以分析病毒而且能够鉴定基因组靶标或靶标。在一个分析中 两种试验参数的组合允许确定受试者的健康状态。健康状态可以是疾病 例如癌症、癌前状态、高风险疾病状态等等。本发明可以作为疾病状态 或潜在疾病状态的早期指示，其将允许早期医学或兽医学或园艺学的干 预以防止进一步发展或治愈该疾病。
本发明尤其适合检测涉及疾病状态例如癌症的病毒。实例包括，但 不限于人类乳头瘤病毒、肝炎病毒、人免疫缺陷病毒(HIV)以及上述各种 病毒家族的成员。
本发明尤其适合检测涉及疾病状态例如癌症的细胞中的基因组靶 标。依赖于疾病或健康状态，基因组中潜在的任何基因、调控区或非编 码区、或者其核外或胞外组分是本发明所使用的潜在标记。
本发明人已经获得资料，其证明某些基因组区域的甲基化状态指示 癌进展，而且其进展在病毒存在情况下更加可靠。
利用临床样品和细胞系，本发明人观察对了在几乎400个人类基因 附近的调控区的甲基化模式进行了观察，并且，当处于癌状态并且HPV 存在时，发现约发现了超过60个具有甲基化改变的基因组标记，当处于 癌状态并且HPV存在时其具有甲基化改变。实例包括，但不限于一个或 多个下列基因组区域：CD14、ENDRB、HIC、RARB1、PGR、SFRS8、 TMSB10、ABCG2、MFNG、LAMR1、RAGE、ABL1、CRBP、GPR37、 HRK、RARA、SYK、ECE1、MME、TEM、NF2、XIAP、RARRES1、 FLI1、HTLF、LDHB、RB1、TGD、CDK4、MMP14、RAB32、BARD1、 NF1、LIM2、MMP2、DAB2、BMP6、CDKN1C、DAB2IP、LMNB1、 MMP28、HAI2、SOCS1、HIC2、MSH6、RIN2、HMGA1、JUN、S100P*、 SRF、VDR、DKK3、KRAS2、PLAU、TNFRSF10B、CDH1、MAC30、 DDB2、PAX6、AXL、EIF4A2、SLIT2、RECK、TERC、GATA5、STAT1。 其它区域包括列于下文表8中的区域。
根据本发明人获得的HPV资料，应了解每个和每种疾病或健康状态 可具有特定的基因组区域，其可在本发明中用作标记。当样品是HPV阳 性并且来自癌或癌前状态时，约15％经检验的基因组标记是阳性的(甲基 化)，该事实表明存在大量任何特定疾病或健康状态可能的靶标。既然人 类基因组中存在约25000个编码蛋白的基因座，那么15％的比例将预计 约有4000个利用基因调控区的可能的靶标。由于在特定疾病或健康状态 中特异的CpG区可以被甲基化，因而可能存在许多更加潜在的靶标。本 发明因此包括所有此类可能的标记。应了解本领域的技术人员能够使用 本教导来确定对于任何疾病或健康状态的任何有用的基因组标记。
第五方面，本发明提供了筛选受试者中潜在宫颈癌的测定法，包括：
(a)用亚硫酸氢盐试剂在使人乳头瘤病毒(HPV)和基因组核酸中未甲 基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶的条件下来处理受试者样品，以形成衍生 HPV核酸和衍生基因组核酸；
(b)提供能结合至衍生HPV核酸区域的引物，该引物能够允许扩增衍生 HPV核酸中期望的HPV特异性的核酸分子；
(c)提供能结合至衍生基因组核酸区域的引物，该引物能够允许扩增衍 生基因组核酸中期望的基因组特异性的核酸分子；
(d)对衍生HPV核酸和衍生基因组核酸进行扩增反应；以及
(e)测定扩增的HPV核酸产物和扩增的基因组核酸产物的存在，其中一 种产物一个或两种产物的检测指示受试者发展为宫颈癌状态。
在一个优选的形式中，该测定法还包括：
(f)测定存在HPV的样品，以确定样品中HPV的型、亚型、变异体或 者基因型。
例如对于HPV16的检测，可以制备能结合至衍生HPV16病毒核酸的引 物。应了解如HPV16所进行的，可以通过将各自的基因组序列中所有胞嘧 啶改变成尿嘧啶来确定所有其它HPV型的衍生HPV核酸。上述转化描述了 根据本发明测定法的步骤a中所进行的处理样品中病毒核酸的结果。
应了解可以设计其它适当的引物或探针，其能结合到其它HPV型来源 的衍生HPV病毒核酸。
第六方面，本发明提供了确定受试者健康状态的测定法中所使用的试剂 盒，其包括病毒特异性核酸分子的探针或引物、基因组特异性的核酸分子的 探针或引物，以及用于扩增反应例如PCR的一种或多种试剂或组分。
样品包括，但不限于拭样(swab)、活组织切片(biopsy)、涂片(smear)、巴 氏涂片(Pap smear)、表面刮片(surface scrape)、压舌板取样(spatula)和液体样 品(fluid sample)，以及来自不同存储介质的样品，例如冷冻材料(frozen material)、石蜡块(paraffin blocks)、载玻片(galss slides)、法医标本系统(forensic collection systems)和档案材料(archival material)。
任何生物种群，包括动物和人类、以及植物都存在对长期病毒效应 有抵抗作用的个体。因此，病毒存在和基因组标记例如基因组甲基化的 组合应该可以辨别生物体是否有或可能有疾病状态。本发明适合人类应 用以及兽医和其它基于生物体的应用。例如，本发明可以用于所有畜禽， 其有充分迹象表明发生了基因组甲基化，并且本发明甚至可以作为监测 野生种群的管理工具。
本质上，本发明涉及在两种水平上进行测定：一个用于病毒的存在， 另一个是用于从特定扩增产物或没有扩增来推断的基因组或核酸靶标的 存在、缺失或状态。靶标可以是甲基化状态、核酸序列、或缺少核酸序 列、或是改变的核酸序列。在某些晚期癌症中，基因组靶标可以完全缺 失，因此其存在的缺乏可以用于诊断。其本身可以是优秀的诊断工具而 且涵盖于本发明中。另外，许多癌症具有称作双微体(double-minutes)的 染色体外扩增子(amplicons)，因此严格来讲它们不是基因组，由于其不 存在于46条染色体中的一条。相似地，任何线粒体DNA、或细胞质或 细胞核细胞器所含的DNA涵盖于本发明中。
本发明人研发了一种组合技术，例如当在单个试管中使用时，该组 合技术比其它任何单独用于评估细胞群向癌性轨道发展的风险的技术更 加有效。通常，一个或少数基因组靶标的基因组甲基化可以在一个管中 进行。当同时包含病毒基因组和宿主基因组DNA(或RNA)的患者样品通 过使用亚硫酸氢钠转化成能够同时用于检测病毒存在和宿主甲基化模式 改变的简化形式时，该测定法是有效的。
修饰核酸可以将未甲基化的胞嘧啶转化为另一种核苷酸。优选地，该 试剂将未甲基化的胞嘧啶修饰为尿嘧啶，其随后在衍生核酸的扩增过程 中被替代为胸腺嘧啶。优选地，用于修饰未甲基化的胞嘧啶的试剂是亚 硫酸氢钠。类似地修饰未甲基化的胞嘧啶而不是甲基化的胞嘧啶的其它 试剂也可用于本发明的测定法中。实例包括，但不限于亚硫酸氢盐、醋 酸盐或柠檬酸盐。优选地，所述试剂是亚硫酸氢钠，一种在酸性水溶液 存在条件下将胞嘧啶修饰为尿嘧啶的试剂。
亚硫酸氢钠(NaHSO3)易与胞嘧啶的5，6-双键反应，形成磺酸化的胞 嘧啶反应中间体，该中间体易于脱氨，并在水存在下生成尿嘧啶亚硫酸 盐。如有必要，可在适度碱性条件下去除亚硫酸盐基团，形成尿嘧啶。 因此，潜在地所有胞嘧啶均可被转化为尿嘧啶。然而由于甲基化保护，任 何甲基化的胞嘧啶均不能由所述修饰试剂转化。
整个说明书中，除非上下文另有要求，词语“包括(comprise)”或其 变形如“包含(comprises)”或“包含(comprising)”应理解为表示包括所 述元件、整体或步骤、或元件、整体或步骤的组合，但不排除任何其它 元件、整体或步骤或元件、整体或步骤的组合。
对已包含于本说明书中的文献、法令(acts)、材料、装置、文章等的 任何讨论仅用于为本发明提供背景。尽管其在本说明书中各项权利要求 的优选权日期之前在澳大利亚已经存在，但并不认为是对任何或全部这 些内容构成现有技术基础的一部分的承认，或者成为本发明相关领域中 的公知常识。
为了更清楚地理解本发明，优选的实施例将参照以下附图和实例加 以阐述。
附图说明
图1表示各种人样品的高风险HPV实验和HPV分型，其中样品包 括Hela细胞系、来自两个被认为具有高度鳞状上皮内病变的个体(1和2) 的样品(被称为HSIL-1和HSIL-2)、具有正常细胞学的两个个体(被称为 Normal-1和Normal-2)以及没有癌症状态的细胞学指示，但如病理学家所 确定的，根据细胞表型推断为HPV感染的一个个体(被称为HPV+Nor)。 A.利用高-中度风险HPV型的通用引物来确定六份不同样品的高风险 HPV型；B.使用对HPV型具特异性的复杂性降低的引物组16、18、31、 33、35、39、45、51、52、56、58和59以及正常组织样品中的引物组 42、43、44、53、54、55、66、68、73、82、83和84来用于HPV实 验。
图2表示相同LBC样品中人类基因组DNA和HPV DNA的同时检测。
图3表示正常宫颈样品的代表性凝胶，该宫颈样品在16个不同基因 座进行了扩增，然后经限制性内切酶BstU1和TaqαI组合消化，并通过 琼脂糖凝胶进行了电泳。从液基细胞学样品(在此编号为28和29)中提取 DNA，用亚硫酸氢钠进行修饰，然后用巢式引物(nested primers)扩增所鉴 定的基因用于进一步分析。这些基因从左到右分别是1)TEM 2)MME 3) ECE14)SYK 5)RARA 6)HRK 7)GPR378)CRBP 9)ABL110)RAGE 11) LAMR112)MFNG 13)ABCG214)TMSBIO 15)SFRS8和16)PGR。
图4表示肿瘤样品的代表性凝胶，该肿瘤样品在16个不同的基因座 上进行了扩增、经限制性内切酶BstU1和TaqαI组合消化并在琼脂糖凝 胶上进行了电泳。从液基细胞学样品(在此编号为82、83、84、94、95 和96)中提取DNA，用亚硫酸氢钠进行修饰，然后用巢式引物扩增所鉴 定的基因用于进一步分析。这些基因从左到右分别是1)PGR 2)SFRS83) TMSBIO 4)ABCG25)MFNG 6)LAMR17)RAGE 8)ABL19)CRBP 10) GPR3711)HRK 12)RARA 13)SYK 14)ECE115)MME and 16)TEM。
图2表示相同LBC样品中人类基因组DNA和HPV DNA的同时检测。
图3表示正常宫颈样品的代表性凝胶，该宫颈样品在16个不同基因 座进行了扩增，然后经限制性内切酶BstU1和TaqαI组合消化，并通过 琼脂糖凝胶进行了电泳。从液基细胞学样品(在此编号为28和29)中提取 DNA，用亚硫酸氢钠进行修饰，然后用巢式引物(nested primers)扩增所鉴 定的基因用于进一步分析。这些基因从左到右分别是1)TEM 2)MME 3) ECE14)SYK 5)RARA 6)HRK 7)GPR378)CRBP 9)ABL110)RAGE 11) LAMR112)MFNG 13)ABCG214)TMSBIO 15)SFRS8和16)PGR。
图4表示肿瘤样品的代表性凝胶，该肿瘤样品在16个不同的基因座 上进行了扩增、经限制性内切酶BstU1和TaqαI组合消化并在琼脂糖凝 胶上进行了电泳。从液基细胞学样品(在此编号为82、83、84、94、95 和96)中提取DNA，用亚硫酸氢钠进行修饰，然后用巢式引物扩增所鉴 定的基因用于进一步分析。这些基因从左到右分别是1)PGR 2)SFRS83) TMSBIO 4)ABCG25)MFNG 6)LAMR17)RAGE 8)ABL19)CRBP 10) GPR3711)HRK 12)RARA 13)SYK 14)ECE115)MME and 16)TEM。
具体实施方式
定义
如在本文中所用的术语“受试者”意思是指在胞嘧啶上具有基因组甲基 化的生物体。其通常包括哺乳动物例如动物和人类以及许多植物物种。
如在本文中所使用的术语“健康状态”意思为根据易定义的疾病或痛苦， 个体不同于整个群的程度。对于人类，其被世界卫生组织(World Heath Organization)采用国际疾病分类(International Classification of Diseases)来定 义，其是所有一般流行病学和健康管理目的的标准诊断分类。在临床术语中， 可以采用《哈里森内科学》Braunwald，E et al.，eds，McGraw Hill，Medical Publishing Division，第15版和以后的版本中所列标准对健康状态进行测定。
如在本文中所使用的术语“基因组靶标状态”可包括靶标核酸(染色 体或染色体外的)存在与否、基因组靶标的甲基化或未甲基化，靶标可以 是生物群内特定细胞类型的正常或多态性存在的核酸，或是通过感染性 微生物或病毒引入的靶标，或者是通过扩增、修饰、倒位或易位来对外 部干扰作出反应的靶标。
如在本文中所使用的术语“修饰”意思为将未甲基化的胞嘧啶转化为 另一种核苷酸。优选地，所述试剂将未甲基化的胞嘧啶修饰为尿嘧啶，其 随后在修饰的核酸扩增过程中被替换为胸腺嘧啶。
如在本文中所使用的术语“复杂性降低”在广义上意思为DNA基因 组，无论其天然存在于真核、原核或病毒/类病毒生命形式中，还是人工 合成的(或者如果作为RNA病毒/类病毒基因组而天然存在，随后，复制 为cDNA的形式)，其含有四种共同的碱基：G、A、T和C，经过亚硫酸 氢盐的修饰，其经历了Ts频率的增加和Cs频率的减少。上述转化把曾 经是正常的基因组变成术语称为“衍生物”的聚合物序列，其没有功能 的生物学意义，而且由“假基因组(genomic ghosts)”组成。
如在本文中所使用的术语“复杂性降低”不是指碱基在衍生物群中 存在的顺序，例如序列ATATATATATATAT(SEQ ID NO：76)与相同长度 的序列之一AAAAAAATTTTTTT(SEQ ID NO：77)之间的任何数学上的 复杂性差异。如在本文中所使用的术语“复杂性降低”是指两个实体(一 个是原始基因组，另一个是衍生物)中的碱基的未变位置，该位置是通过 分子探针或引物对不变位置1至n处都具有目标碱基的原始基因组及其 衍生物而测得的。在某个特定女性的30亿个碱基对的单倍体人类基因组 中，上游链上所述不变位置定义为从1至n，其中n是位置3,000,000,000。 如果在序列1至n中，在原始基因组上游链中第i个碱基是C，则在转化 的人衍生物中第i个碱基是U。在7904个碱基对的HPV16病毒基因组中， 所述不变的位置定义为从1至7904，其中n是7904。如果在序列1至n 中，在原始基因组上游链中第i个碱基是C，则在转化的HPV衍生物中 第i个碱基是U。应了解当不同类型的HPV衍生物或型用于比对并且这 些病毒衍生物长度不同时，则确定正确的第i个碱基需要仔细的生物信息 学多重比对，如同Morgenstern，B.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.93， 12098-12103对标准多重基因组比对进行说明的一样。
实例阐明了上述转化过程当应用于个体病毒基因组或应用于存在于 含有人类细胞和病毒基因组或其部分的临床样品中的病毒基因组混合物 时的结果。
一个正常10个碱基的基因组序列(“上游”链)，其序列为5’ GGGGAAATTC 3’(SEQ ID NO：78)，具有互补的“下游”链，其序列为 5’GAATTTCCCC 3’(SEQ ID NO：79)。变性和亚硫酸氢盐处理之后，上 述“上游”链变为5’GGGGAAATTU 3’(SEQ ID NO：80)，并且上述“下 游”链变为5’GAATTTUUUU 3’(SEQ ID NO：81)。由于胞嘧啶已经转化 为尿嘧啶，而尿嘧啶在DNA聚合酶体外转体内机制的识别方面与胸腺嘧啶 相当，所以该上游链衍生物基本上是5’GGGGAAATTT 5’GGGGAAATTT 3’(SEQ ID NO：82)，下游链衍生物是5’5’GAATTTTTTT 3’(SEQ ID NO：83)。因此起始正常的基因组从其上下游链之间具有5个Cs 和5个Ts转化为现在上下游链之间没有Cs而具有10个Ts的衍生聚合物群。 正常基因组已从四碱基的基因组降低为三碱基衍生物，复杂性得以降低。此 外，衍生物群中的‘基因座’只是指该衍生物中的位置坐标。例如，亚硫酸 氢盐转化后，基因座失去了其在任何网络水平所具有的所有功能生物学特 征。如果该基因组以前是编码、调控或是具有结构的，那么现在其两条链都 是生物学失语(biological gibberish)。因此衍生物群是没有功能的化学聚合物 的集合，其现在代表基因组以前的互补链的两个非互补链 (non-complementary ghost)，该基因组现在是不含有信息的。此外，该衍 生物是唯一的，而且不代表在任何细胞的(或病毒或类病毒)生命形式中通过 正常进化过程产生的序列，除非是统计的意外。
探针和复杂性降低
对于分子探针的正常意义，本发明人在本文中根据在两个相同大小的实 体中在特定的分子条件下实现探针对特异基因座的相同特异性和杂交水平 所需的探针长度的增加(IPL)来定义‘复杂性降低’，所述的实体其中第一个 是正常基因组，第二个是‘转化的’基因组(衍生物)。出于分子用途的目的， IPL是等于或大于1的整数。每个基因座在正常基因组以及转化的衍生物中 保持相同的位置。
实际上，“复杂性降低”可以通过探针长度来测定。例如，平均来 说，11-mer的寡核苷酸探针将具有一个独特的位置，其将与由四种碱基 G、A、T和C组成的4、194、304个碱基(411等于4,194,304)的正常基 因组完美杂交。然而，一旦这种4、194、304个碱基的正常基因组已经 由HGS亚硫酸氢盐法进行了转化，那么现在该转化的衍生物富含T而且 复杂性较低。然而，复杂性降低的结果就是之前独特的11-mer探针不再 具有可在复杂性降低的衍生物中可与之杂交的独特位置，其它新产生的 11碱基序列的位置，其作为亚硫酸氢盐转化的结果而重新出现。这些新 产生的序列在本文中称为“诱饵基因座”。因此现在需要约14-mer探针 来找到并与该原始基因座杂交。在该实例中，探针长度的增加约是从0 至3个碱基。
尽管其看来可能与直觉相反，但需要长度增加的寡核苷酸探针来检 测富含T的衍生物中的原始基因座。因此衍生物复杂性的降低意思是可 能需要设计基因座的上游和下游链的更长的探针来寻找衍生物中原始的 独特位置。然而，如下文所述的，嵌入性核酸(Interca1ating Nucleic Acid， INA)探针的使用允许比传统寡核苷酸探针更短的探针，因此克服了增加 长度的需要。
如在本文中所使用的术语“复杂性降低”也可以应用于探针序列的 不同结构，该探针序列可以用于确定样品中HPV的存在。此外，这些探 针可以含有非常规主链，例如PNA主链或对一个主链的修饰性插入，如 在INA中所描述的那样。因此衍生物被认为具有降低的复杂性，与探针 是否含有额外的组分例如嵌入性假核苷酸(如在INA中)无关。实例包括， 但不限于DNA、RNA、锁核酸(LNA)、肽核酸(PNA)、MNA、阿卓糖醇 核酸(ANA)、己糖醇核酸(HNA)、嵌入性核酸(INA)、肌醇核酸(CNA)及其 混合物和杂交体，以及其磷原子修饰物，例如但不限于磷硫酰、磷酸甲 脂、亚磷酰胺、二硫代磷酸酯、膦酸硒、磷酸三酯以及磷酸硼。非天然 存在的核苷酸包括，但不限于以下核苷酸，包括：DNA、RNA、PNA、 INA、HNA、MNA、ANA、LNA、CAN、CeNA、TNA、(2’-NH)-TNA、 (3’-NH)-TNA、α-L-核糖-LNA(α-L-Ribo-LNA)、α-L-木糖-LNA (α-L-Xylo-LNA)、β-D-木糖-LNA(β-D-Xylo-LNA)、α-D-核糖-LNA (α-D-Ribo-LNA)、[3.2.1]-LNA、双环-DNA、6-氨基-双环-DNA、5-表-双 环-DNA、α-双环-DNA、三环-DNA、双环[4.3.0]-DNA，双环[3.2.1]-DNA， 双环[4.3.0]酰胺-DNA、β-D-吡喃核糖基-NA、α-L-吡喃来苏糖基-NA、 2’-R-RNA、α-L-RNA或α-D-RNA、β-D-RNA。另外，非含磷化合物可 以用于连接于核苷酸，例如但不限于甲基亚氨基甲基、甲酰乙酸乙酯、 硫代甲酰乙酸乙酯以及含有酰胺的连接基团。特别地，核酸和核酸类似 物可以一种或者多种嵌入性假核苷酸(IPN)。IPN的存在不是核酸分子复 杂性描述的一部分，其主链也不是该复杂性的一部分，例如在PNA中。
“INA”表示依照WO 03/051901、WO 03/052132、WO 03/052133 和WO 03/052134(Human Genetic Signatures Pty Ltd)中的教导的嵌入性 核酸，其均以引用的方式并入本文中。INA是含有一个或者多个嵌入性假核 苷酸(IPN)分子的寡核苷酸或者寡核苷酸类似物。
“HNA”表示核酸例如由Van Aetschot et al.，1995所描述的。
“MNA”表示核酸例如由Hossain et al，1998所描述的。
“ANA”指由Allert et al，1999所描述的核酸。
“LNA”可以为任何LNA分子，如在WO 99/14226(Exiqon)中所描述的。 优选地，LNA选自WO 99/14226的摘要中所描述的分子。更优选地，LNA 是如Singh et al，1998、Koshkin et al，1998或Obika et al.，1997中所描述的核 酸。
“PNA”指的是肽核酸，例如由Nielsen et al，1991所描述的。
复杂性降低是根据探针长度和基因座上下游链的不同探针序列来定 义的，其原则是适用于不同结构或不同分子环境中修饰的探针和引物的 一个相对术语。INAs的实例阐明了这种相对性。INAs相对于标准寡核苷 酸探针的显著优点是INAs可以比常规寡核苷酸更短，其仍然可以实现相 同的杂交结果(INA长度＜寡核苷酸长度)。这是由于INA对互补DNA 具有高亲和力，其高亲和力是由于作为INAs的结构组分的嵌入性假核苷 酸(Intercalating Pseudo Nucleotides，IPN)。因此如果需要具有特定数量 IPNs的长度为X个核苷酸的INA来实现与未转化的基因组的成功且特异 性的杂交，那么在相同的分子条件下仍然需要长度大于X的INA与亚硫 酸氢盐转化的基因组中的相同基因座杂交。
也需要特别重要指明的是对于宿主与病原体的相互作用(在相同临 床样品中病毒和宿主基因组共存，但是具有显著不同的浓度)中，“复杂 性降低”和INAs的使用将新的有利条件引入到杂交方案中，尤其是由于 INAs优先杂交于富含AT的核酸序列。例如，在未转化HPV DNA的纯 溶液中，找到并与7904个碱基的HPV16基因组的独特基因座杂交所需 要的病毒探针或引物的大概长度大约是6-mer探针/引物(46等于4096个 碱基)。亚硫酸氢盐处理产生富含T的HPV衍生物之后，现在需要约8-mer 探针或引物以在相同分子条件下找到该独特位置(38等于6561个碱基)。
然而，当样品中最初存在两个大小显著不等的基因组时，例如7904 个碱基对的HPV基因组和约3,000,000,000个碱基对的人类基因组，并且 这两个基因组都‘复杂性降低’到它们各自的衍生物时，独特病毒序列 的探针或引物现在与溶液中它们的衍生物靶标相杂交，其中溶液中富含T 的人类衍生物占压倒性的多数。例如，如果样品中每个人类衍生物都存 在一个HPV衍生物，那么病毒探针或引物将与3,000,007,904个碱基对的 衍生物杂交。因此现在对于独特病毒序列的分析需要约14-mer探针或引 物以避免在人类序列中新产生的病毒诱饵基因座发出杂交信号。
除了包含探针和引物长度的“复杂性降低”的内容以外，当PCR反 应中所使用的简并引物数量适中时，杂交动力学的变化和检测PCR产物 的能力也是重要的。由于HPV型间存在广泛的基因组变异，所以先前扩 增技术需要使用大量的简并引物来产生相应扩增的核酸产物或来自多重 PCR反应的扩增子。然而，探针/引物库的简并性越大，溶液中任何个体 有关的探针或引物的浓度就越低。上述情况与对复杂真核基因组所实施 的驱动-示踪物反应(driver-tracer reactions)中杂交的动力学和保真性相 似，其于1966年被首次引入到科学文献中，见Waring，M.&Britten R.J. Science，154，791-794；and in 1968 by Britten，R.J and Kohne D E.，Science， 161，529-540，(本文中的早期参考来自the Carnegie Institution of Washington Yearbook reports)。
另外，当HPV PCR引物相对于人类衍生物为高浓度时，杂交反应中 的优势力量是HPV引物。例如，如果样品中病毒负荷高(数量级是100,000 个HPV基因组至单个人类基因组)，如果每个人类衍生物仅有一个HPV 衍生物，那么病毒引物的杂交动力学将比其快100,000倍。在前种情况中， 溶液中病毒组分的行为就如同该组分是基因组中高度重复的组分。然而， 为了利用单一PCR反应检测临床样品中不同风险的不同HPV类型，通 常需要每种HPV类型的不同引物，所述每种HPV类型必需使用简并引 物。最终结果是引物群在混合的正常基因组的常规多重PCR反应中可能 会组合性交叉。可能确实存在数千个不同的引物来竞争杂交位点，其最 终结果是PCR扩增的失败，或扩增的核酸产物的分布严重偏向存在于样 品中的特定的HPV类型。其对于从存在常规的未转化的基因组的临床样 品中产生数据提出了一个主要问题。
本发明的“复杂性降低”，其与INA探针和引物的选择使用相组合， 其克服了许多这些现有技术问题的困难。
引物和复杂性降低
应注意的是复杂性降低依赖于已转化的分子群(衍生物)是否保持转 化状态或是否经受了进一步扩展而有所不同。在上文所讨论的实例中， 衍生物群如同其存在于临床样品中一样保持未扩增。回想到上游链(5’ GGGGAAATTC 3’)(SEQ ID NO：78)和下游链(5’GAATTTCCCC 3’) (SEQ ID NO：79)分别转化成5’GGGGAAATTU 3’(SEQ ID NO：80)和5’ GAATTTUUUU 3’(SEQ ID NO：81)。由于胞嘧啶转化为尿嘧啶，而尿嘧 啶在DNA聚合酶体外转体内的机制识别方面与胸腺嘧啶相当，所以其上 游链衍生物基本上是5’GGGGAAATTT 3’(SEQ ID NO：82)，其下游链衍 生物是5’GAATTTTTTT 3’(SEQ ID NO：83)。然而，如果现在将衍生物 群通过酶学方法体外转体内进行复制，那么将随之产生四种不同的衍生 物群，它们是[5’GGGGAAATTT 3’(SEQ ID NO：82)]、[5’AAATTTCCCC 3’(SEQ ID NO：84)]、[5’AAAAAAATTC 3’(SEQ ID NO：85)]和[5′ GAATTTTTTT 3’(SEQ ID NO：86)]。这些衍生物确实都是复杂性降低的， 但未与转化后立即存在的原始的未复制的衍生物降低至相同的程度。因 此当PCR引物是针对原始的未复制的衍生物的链时，由于针对上游或下 游链的引物的选择将会影响该结果，因此有必要明确地决定哪个是人们 希望观察到的扩增核酸产物。处理构成转化基因组的产物的两个非互补 的衍生物群与处理复制后存在的四个衍生物群的差别直觉上是不清楚 的，但是可能对引物的设计具有重要意义。
最后，较长探针或引物的问题，其早期被引入是为了将“复杂性降 低”形式化和定量化，只是假定当寻找分子衍生物群中独特序列时的相 关性。然而本发明的重要基础可能是病毒型间具有最大相似性的衍生物 基因座的选择，必要时其允许在一个初次检查中测定所有病毒型。依赖 于是否选择上游或下游链衍生物，这些所选的基因座可能有所不同，并 且与下游链相比，这些基因座将会在上游链的不同区域。
由于通过利用本发明中HGS亚硫酸氢盐处理的转化而产生具有更高 序列相似性的基因座，在衍生物群中需要较长探针和引物的实际重要性 为病毒检测所获得的实际优势所掩盖，其也被比常规寡核苷酸需要更短 的探针和引物分子的INAs的选择使用所掩盖。另外，将巢式PCR法应 用于衍生物群需要两条引物在相同的邻近位置结合以产生扩增的核酸产 物。如果其中一条PCR引物与靶标邻近位置以外的诱饵基因座具有序列 相似性，那么该引物对的其它成员在相同的非靶标区域附近也具有诱饵 基因座是不可能的。该巢式PCR法的内引物在与第一轮引物相同的非靶 标区域再次具有诱饵基因座，是更不可能的。假扩增的可能性是非常不 可能的。
如在本文中所使用的术语“病毒特异性的核酸分子”意思是已经确定或 获得的分子，其具有一个或多个对病毒或病毒型具特异性的序列。
如在本文中所使用的术语“病毒的分类水平”包括型、亚型、变异体和 基因型。识别病毒基因组的流动性。不同的病毒群可能对单个核苷酸的 改变是多态性的，或是如果它们存在于正常DNA修复过程不再起作用的 某些癌细胞中，则可能是高或低可突变性。
如在本文中所使用的术语“病毒特异性的核酸分子”意思是存在于处理 或转化的病毒DNA中特异性的核酸分子，其是该病毒或病毒型的指示。
如在本文中所使用的术语“病毒型”是指任何现有的或新的病毒群， 其与以前分离且表征的病毒型的序列相似性小于90％。
如在本文中所使用的术语“病毒亚型”是指任何现有的或新的病毒 群，相对于以前的病毒亚型其序列相似性范围在90-98％之间。
如在本文中所使用的术语“病毒变异体”是指任何存在的或新的病 毒群，其中序列相似性是以前变体的98-100％之间。
如在本文中所使用的术语“HPV基因型”如下。基因型是任何完全 测序的HPV基因组，其与任何其它完全测序的HPV基因组有最少为一 个碱基的差别，其包括单个碱基是否以G、A、T或C中任一个存在，或 者在标准参照(即HPV16从位置1至位置7904)中特定位置的碱基是否通 过缺失、添加、扩增或转座到其它位置而发生改变。本发明人采用现有 技术BLAST法对所有其它HPV基因型与标准HPV16进行了比较。
如在本文中所使用的术语“HPV特异的核酸分子”意思是存在于处 理或转化的病毒DNA中的特异性的核酸分子，其可能是该病毒或病毒型 的指示。
如在本文中所使用的术语“HPV型”是指任何存在的或新的HPV群， 其与以前分离且表征的HPV型的序列相似性小于90％(1993，Van Rast，M. A.，et al.，Papillomavirus Rep，4，61-65；1998，Southern，S.A.and Herrington，C.S.，Sex.Transm.Inf.74，101-109)。
如在本文中所使用的术语“HPV亚型”是指任何现有的或新的HPV 群，其中相对于以前的亚型其序列相似性在90-98％范围内(1993，Van Rast，M.A.，et al.，Papillomavirus Rep，4，61-65；1998，Southern，S.A.and Herrington，C.S.，Sex.Transm.Inf.74，101-109)。
如在本文中所使用的术语“HPV变体”是指任何现有的或新的HPV 群，其中序列相似性为以前的变异体的98-100％之间(1993，Van Rast，M. A.，et al.，Papillomavirus Rep，4，61-65；1998，Southern，A.and Herrington， C.S.Sex.Transm.Inf.74，101-109)。
如在本文中所使用的术语“HPV基因型”如下。基因型是任何完全 测序的HPV基因组，其与任何其它完全测序的HPV基因组有最少为一 个碱基的差别，其包括单个碱基是否以G、A、T或C中任一个存在，或 者在标准参照中(即HPV16从位置1至位置7904)特定位置的碱基是否通 过缺失、添加、扩增或转座到其它位置而发生改变。本发明人采用现有 技术BLAST法对所有其它HPV基因型与标准HPV16进行了比较。
表1提供了从患者液基细胞学样品中产生HPV特异性产物的寡核苷 酸引物的列表。所有引物均针对不同HPV型的上游链衍生物。这些引物 的名称如下：
HPV型特异衍生物的区域引物编号如下列的每个设计。
例如首行说明了在E7衍生物区域中HPV16的引物#1。名称HPV-Uni 和HPV-HM代表简并寡核苷酸引物。非标准名称参见以前的定义。
表1
名称 序列 SEQ ID NO：
HPV16-E7-1 TATGTATGGAGATATATTTATATTGT 1
HPV16-E7-2 GTTATGAGTAATTAAATGATAGTTT 2
HPV16-E7-3 TAAAACACACAATTCCTAATATAC 3
HPV16-E7-4 CCCATTAATACCTACAAAATCAAC 4
HPV16-E6-1 GAAAGTTATTATAGTTATGTATAGAGT 5
HPV16-E6-2 ATTAGAATGTGTGTATTGTAAGTAAT 6
HPV16-E6-3 ACTACAATATAAATATATCTCCATAC 7
HPV16-E6-4 AAACTATCATTTAATTACTCATAAC 8
HPV16-E4-1 GAATATATTTTGTGTAGTTTAAAGATGATGT 9
HPV16-E4-2 GTTTTATATTTGTGTTTAGTAGT 10
HPV16-E4-3 CCTTTTAAATATACTATAAATATAATATTAC 11
HPV16-E4-4 CACACAATATACAATATACAATAC 12
HPV18-E7-1 GTATGGATTTAAGGTAATATTGTAAGAT 13
HPV18-E7-2 GTATTTAGAGTTTTAAAATGAAATTT 14
HPV18-E7-3 AACACACAAAAAACAAAATATTC 15
HPV18-E7-4 ACCATTATTACTTACTACTAAAATAC 16
HPV18-E6-1 GATAGTATATAGTATGTTGTATGTT 17
HPV18-E6-2 ATTTAGATTTTGTGTATGGAGATAT 18
HPV18-E6-3 ATCTTACAATATTACCTTAAATCCATAC 19
HPV18-E6-4 AAATTTCATTTTAAAACTCTAAATAC 20
HPV18-E4-1 GGGAATATAGGTAAGTGGGAAGTAT 21
HPV18-E4-2 GATTGTAATGATTTTATGTGTAGTATT 22
HPV18-E4-3 AAATAATATATCTCTATAATAATC 23
HPV18-E4-4 TTCATTACCTACACCTATCCAATACC 24
HPV56-E7-1 GATTTATAGTGTAATGAGTAATTGGATAGT 25
HPV56-E7-2 GGTTATAGTAAGTTAGATAAGT 26
HPV56-E7-3 TCCCCATCTATACCTTCAAATAAC 27
HPV56-E7-4 CCTATTTTTTTTTCTACAATTAC 28
HPV31-E7-1 GTAATTGATTTTTATTGTTATGAGT 29
HPV31-E7-2 GTTATAGATAGTTTAGTTGGATAAGT 30
HPV31-E7-3 CTAAATCAACCATTATAATTACAATC 31
HPV31-E7-4 CCTATCTATCTATCAATTACTAC 32
名称 序列 SEQ ID NO：
HPV33-E7-1 TTTTGTATATGGAAATATATTAGAAT 33
HPV33-E7-2 TAGGTGTATTATATGTTAAAGATT 34
HPV33-E7-3 CCTCATCTAAACTATCACTTAATTAC 35
HPV33-E7-4 TAACTAATTATACTTATCCATCTAAC 36
HPV35-E7-1 AAATAATGTAATAAATAGTTATGTT 37
HPV35-E7-2 GTTGTGTTTAGTTGAAAAGTAAAGAT 38
HPV35-E7-3 CCATATATATACTCTATACACACAAAC 39
HPV35-E7-4 AAACACACTATTCCAAATATAC 40
HPV39-E7-1 TTAAAGTTTATTTTGTAGGAAATTG 41
HPV39-E7-2 GATTTATGTTTTTATAATGAAATATAGT 42
HPV39-E7-3 CTAATAAATCCATAAACAACTAC 43
HPV39-E7-4 CATAACAAATTACTAATTTACATTTAC 44
HPV58-E7-1 TATTTTGAATTAATTGATTTATTTTGT 45
HPV58-E7-2 ATGAGTAATTATGTGATAGTTT 46
HPV58-E7-3 ATACATATACCCATAAACAACTAC 47
HPV58-E7-4 TTATTACTATACACAACTAAAAC 48
HPV6-E7-1 GATATTTTGATTATGTTGGATATGT 49
HPV6-E7-2 GTTGAAGAAGAAATTAAATAAGAT 50
HPV6-E7-3 TACTATCACATCCACAACAACAAATC 51
HPV6-E7-4 CTCTAATATCTATTTCTATACACTAC 52
HPV11-E7-1 GTTATGAGTAATTAGAAGATAGT 53
HPV11-E7-2 ATTATTAAATATTGATTTGTTGT 54
HPV11-E7-3 ATACCTATAATATACTCTACTATAAC 55
HPV11-E7-4 CAAAATTTTATATAATATACCTATC 56
HPV42-E7-1 GTATATAGTGGAGAAAGAAATTGGAT 57
HPV42-E7-2 GAATAATAAATTAGATGTGTTTTGTGTT 58
HPV42-E7-3 CCAATTATTCATAACAATACAAATC 59
HPV42-E7-4 ACTTAATCATCTTCATCTAAAC 60
HPV53-E7-1 TAGTGTAYGGGGTTAGTTTGGAAGT 61
HPV53-E7-2 ATTTGATTTATTAATAAGGTGT 62
HPV53-E7-3 CTATAATATATTATAAAAATATTAATAC 63
HPV53-E7-4 CAATTACTCATAACATTACAAATC 64
名称 序列 SEQ ID NO：
HPV-Uni-1 GATGGKGATATGRTDSATRTWGGDTWTGG 65
HPV-Uni-2 TAARTATTTWGATTATWTDDRAATG 66
HPV-Uni-3 TATTWTAWCCYTAHRCHYWHTAHAACCA 67
AMAAAHAMHTAATTHYHMMAACAWAYAC 68
HPV-Uni-4 C
HPV-HM-1 GATTTDKWDTGTWATGAGTAATT 69
HPV-HML-1 GRKTTDKWDTGTWRKGARTAATT 70
HPV-HM-2 RRYRRKTTAGABGADGA 71
HPV-HML-2 RRHRRKTTWGANKWDGA 72
HPV-HM-3 YDATACCTWCWMAWWHVDCCAT 73
HPV-HML-3 YDATACCTWHWHHDWHNDCCAT 74
HPV-HML-4 ACHHHAAACCAHCCHHWACAHCC 75
病毒测定
本发明的测定法第一部分中所采用的病毒检测也可以与其它类型非常 不同的测定法相组合，它们分别是用于评价细胞群内已发生变化的细胞状态 的测定法，用于通过感染细胞内紊乱的代谢组学、蛋白质组学、代谢物或代 谢组学网络所支撑的风险评估的测定法，和用于监测感染进程和评价治疗方 案例如抗病毒疗法的测定法。
例如，测量病毒特异性核酸分子的分子测定法可以与下列测定法相组 合：
-利用模式识别和高通量自动成像技术例如用于组织切片中荧光信号 自动定量的多表位配体制图系统(Multi-Epitope-Ligand-Kartographie，MELK) 的测定法，
-利用光学显微镜、共焦显微镜或透射电镜分析的测定法，用于荧 光原位杂交(FISH)、检测细胞内染色体紊乱例如非整倍性或异常细胞器 (数目、类型或形态外观等方面)的总体水平的细胞学或组织学测定法。
-利用核酸或多肽适体(aptamers)的测定法；Spiegelmers(镜像高亲和 力寡核苷酸配体)测定法；多色纳米晶体(量子点生物结合物)测定法，用 于细胞表面或内部组分的分子或生物标记的超敏感非同位素检测；包含 通过指数级富集(Exponential Enrichment)的配体系统进化技术(Systematic Evolution of Ligands，SELEX)以及针对不同细胞组分的高亲和力适配子 配体的组合化学方法。
-利用细胞的激光捕获或免疫磁性富集技术或者与流式细胞仪配套 使用的基于微球的技术或者包含不同核酸或肽/蛋白质的胶体悬浮系统的 光学条形码的测定法。
-利用用于检测总体基因组不平衡性例如复制、缺失、转座、重排 的单细胞比较基因组杂交及其相关的原位技术的测定法。
-报告转录组调节的测定法，例如robogenomic微阵列技术 (robogenomic microarray technologies)，包括基因表达系列分析(Serial Analysis of Gene Expression，SAGE)、全数基因表达分析(Total Gene Expression Analyses，TOGA)、随机顺序可寻址的高密度光纤传感器阵列、 在微球上应用的大规模平行测序(Massively Parallel Signature Sequencing， MPSS)。
-报告蛋白质组调节的测定法，其采用各种技术，包括通过蛋白芯 片细胞分析、基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱法(matrix Assisted Laser Desorption lonization-Time of Flight，MALDI-TOF)、傅里叶变换离 子回旋共振质谱法(Fourier Transformed lon Cyclotron Resonance Mass Spectrometry，FTICR)、液质联用质谱(LC MS-MS)和快速蒸发冷却质谱 (Rapid Evaaporative cooling Mass Spectrometry，RapEvap MS)，
-利用检测水平达到zeptomole(10-21)敏感性的多光子检测技术 (Multi Photon Dection，MPD)的测定法，
-利用访问临床样品来源的细胞的甲基化谱的甲基化谱技术来确定 沿着从常态到宫颈癌的特定轨道的细胞群的位置的测定法；优选地来确 定病毒感染细胞或招募到感染或炎症位置的免疫细胞中基因组座改变的 甲基化特征。
以前曾评价过上述一些技术(2001，Miklos and Maleszka，Proteomics， 1，30-41)。
数据收集、整合和管理系统
与本发明有关的公开材料的数据收集和处理系统可以与临床患者数 据相组合，并采用专业化的算法进行分析。自动平台管理和数据收集可 以自动化存储，而且所收集的数据可以与信息基础和软件工具相组合， 其与基因本体论(gene ontologies，GO)配合使用，正如国家图书馆医学主 题词表(National Library of Medicines’s Medical Subject Headings，MeSH)、 孟德尔人类遗传学数据库(Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM)或 例如人类基因突变数据库(Human Genome Mutation Database，HGMD)或 PubMed等知识数据库举例说明的与疾病本体论配合使用一样。软件管线 与最新的人类基因组集合相配合，并且提供从例如基因库(Genbank)和 RefSeq等资源来源的信息的访问和下载，其可以与报告HPV感染细胞的 基因组状态或由于体内其它部位存在的HPV而被细胞所影响的基因组状 态的测定法组合使用。
例如，整合了HPV数据与临床和相关的生物信息学数据的数据库基 础可以利用松散耦合的模块架构，其可以促进更好的软件工程和数据库 管理。关系型数据库管理系统(relational database management system， RDBMS)(例如Postgresql 7.3版)是开放源和鲁棒(robust)，而且作为部分 整合系统的一个范例来评价和更好地预测HPV领域的临床结果。包括基 于网络的图形用户界面(Graphical User Interfaces，GUI)的附加特征可以 将整合的细胞学和组织学分析与分子HPV数据库连同通过不同形式获得 的治疗和药用数据相组合。用于图像分析的增强的数字技术、病理学家 的远程图像共享和自动可视化系统的整合被看作自动分子试剂盒平台的 整合部分。
细胞取样
病毒检测方案可以用于在机体任何部分来源的样品上进行，包括前 胚泡期、胚胎组织、围产期材料、尸体或法医来源的样品。优选地，样 品来自宫颈阴道部例如宫颈和阴道，但是也可以可能来自表皮。优选地， 样品来自宫颈变性转化带(cervinal transformation zone)。上述样品可以使 用宫颈刷(CervexBrush)(Therapak Corp，Irwindale，CA，USA)、Digene宫 颈采样器宫颈刷(Digene Cervical sampler cervical brush)(Digene Corp. Gaitherburg，MD，USA)、塑料刮铲/刷组合(Cooper Instruments，Hollywood， FL，USA)来收集上述样品；或者使用涤纶拭子(Dacron swabs)或从男性和 女性患者肛门生殖器区域获得样品的任何适当的材料，或者通过任何标 准活组织检查方法例如针吸活组织检查(needle biopsy)检测。上述样品可 以置于各种培养基中，例如PreserveCyte，(Cytyc Corp.MA，USA)或来自 TriPath Imaging Burlington，NC，USA的AutoCyte PREP。优选地，采用 液基细胞学进行初次测试，但是平面平台例如石蜡切片和载玻片也是适 合的。
试剂盒
本发明可以以多种试剂盒或试剂盒组合的形式实施，并根据手动、 半自动或自动平台加以例示。在优选的形式中，MethyEasyTM或High Throught MethylEasyTM试剂盒(Human Genetic Signatures Pty Ltd， Australia)可以利用自动化平台例如EpMotion在96或384孔板中进行核 酸的转化。
人乳头瘤病毒(HPV)
成熟的人乳头瘤病毒DNA包裹在由两种病毒编码蛋白组成的二十 面体衣壳膜内。对于HPV16，其双链环状DNA基因组长度为7904个碱 基对，但是在普通的中度风险类型中其长度变化从HPV51的7808个碱 基对到HPV52的7924个碱基对。病毒基因组的这些区域以在环状分子 中存在的顺序列示于下文。该病毒有一个称为URR的非编码区，随后是 称为E6、E7、E1、E2、E4、E、L2和L1的许多编码区。某些病毒型 可能缺失功能性的E5区。E4区产生多种蛋白产物，这些蛋白产物可以 引起细胞质角蛋白网络紊乱而导致称为凹空细胞病(koilocytosis)的细胞 质“晕轮效应(halo effect)”。不同HPV型都是嗜上皮细胞的，其感染后 可以导致凹空细胞病、角化不良症(dyskeratosis)、多核化(multinucleation) 以及异常例如核增大和低度鳞状上皮内病变(low grade squamous intraepithelial Iesions，SILs)，所有上述变化只产生在宫颈。在宫颈癌中病 毒感染和染色体异常是相关的，但是在肿瘤中可以观察到多参数的改变， 其与病毒感染、病毒基因表达、病毒整合、细胞分化和基因组异常的关 系还了解甚少(1998，Southern，S.A.et al.，Sex Transm Inf.，74，101-109)。由于上述原 因，对不同病毒型及其在不同遗传背景中的不同效应进行检测是非常重 要的。
另外，尽管现有技术中承认HPV型指定为表皮和粘膜以及高-、中- 和低度风险范畴，但是这些范畴甚至在HPV的表皮和粘膜子范畴之间表 现出一些冲突和重叠。例如，HPV7与皮肤疣以及口腔病损有关。在泛发 性疣病和肛门生殖器损伤中已分离了HPV26。而且，尽管将HPV6和 HPV11分类为低风险型，但已从Buschke-Lowenstein瘤以及喉癌和外阴 癌(vulval carcinomas)和尖锐湿疣(condylomata acuminata)中分离到它们 (1986，Boshart，M.et al.，J.Virology，58，963-966；1992，Rubben，A.，et al.， J Gen Virol.，73，3147-3153)。
病毒整合到宿主基因组上导致E1和L1区之间的线性化，而保留 URR、E6和E7区，但是基因区例如E1、L1和L2缺失并且E2失活或 者缺失。在宫颈癌中通常保留E6和E7区，而E2蛋白没有表达。E2的 损伤与预后不良和存活率缩短有关。
患者样品
家庭医生利用Cytyc Corporation USA提供的宫颈取样装置从宫颈癌 表面收集细胞样品。患者同意收集的样品作为常规癌筛选计划的一部分 或作为以前宫颈疾病的监测实验。医生将上述细胞从收集装置转移到用 于保存细胞的甲醇/水溶液中，并运送到实验室用于检验。利用常规形态 学制剂来评价细胞样品由于癌前病变或病毒感染而引起的变化。单独的 等份细胞样品用于本说明书中所概述的DNA实验。
DNA提取
病毒DNA可以从任何适当的来源获得。实例包括，但不限于细胞培 养物、肉汤培养物、环境样品、临床样品、体液、液态样品、固态样品 例如组织。样品来源的病毒DNA可以通过标准方法获得。一个适当的石 蜡固定物质的提取实例如下：将目的样品置于400μl的7M盐酸胍、5mM EDTA、100mM Tris/HCI pH6.4、1％Triton-X-100、50mM蛋白酶 K(Sigma)、100μg/ml酵母tRNA中。用一次性1.5ml研棒彻底均质化样 品，并在60℃放置48小时。温育后，使样品经过5个干冰5分钟/95℃ 的冻/融循环5分钟。然后漩涡样品并在微型离心机离心2分钟使细胞碎 片沉淀。将上清移入干净管中并稀释以降低盐浓度，然后用苯酚-氯仿抽 提，乙醇沉淀并重悬浮于50μl10mM Tris/0.1mM EDTA中。
令人吃惊的是，本发明人发现没有必要将病毒DNA与其它来源的核 酸进行分离。上述处理步骤可以用于大量不同DNA类型的混合物，然而 病毒特异核酸仍然可以通过本发明进行鉴定。据估计，复杂DNA混合物 中的检测界限为标准PCR检测的界限，其可以低至靶病毒核酸分子的单 拷贝。
高通量HPV测定
本发明可以利用96孔板以高通量方式分步使用，96孔板中许多样品 可以同时进行HPV的测试。下列潜在的商品化试剂盒的说明书对其进行 了说明：
HPV高通量DNA亚硫酸氢盐处理试剂盒的目录
组分名称 含量 裂解缓冲液 1×1023ml 蛋白酶K 2×1×2ml 结合缓冲液 1×35ml 试剂1 1×20.8ml 试剂2 1×8g 洗脱缓冲液试剂3 1×725ml 试剂4 1×7ml 对照样品1 1×40μl 对照样品2 1×1620μl 对照引物3A和3B 2×40μl 纯化平板平板1： 孵育平板 1×96孔 洗涤平板2：转化平板 1×96孔 洗脱平板3：纯化平板 1×96孔 底部盖膜平板4：洗涤平板 1×盖膜(mat)96孔 密封膜平板5：洗脱平板 41×膜(film)96孔 密封帽 36×8帽材(cap strips) 平板6：高风险HPV引物平板 2×220μl 96孔
组分名称 含量 载体DNA平板7：HPV分型平板 18×100μl 96孔 HPV分型平板8：对照平板 82×96孔
注意.个体高风险分型引物组可从人类遗传标记控股有限公司 (Human Genetic Signatures)(咨询)获得。
注意：对照样品/引物1、2、3A和3B收到后应保持在-20℃。
所需的材料和设备(未提供)
■采用下列多头抽真空装置或者离心机：
96孔板多头抽真空装置，其带有在至少-10英寸汞柱(in Hg，4.9psi)的压 力下使用的泵。(利用Biorad Aurum多歧管进行室内测试，但是其它多歧 管可以改造使用。)
或者
离心机，其带有与高架式96孔板配套的转子。(利用Eppendorf5810进 行室内测试)。
■与96孔0.2ml低式平板配套使用的热盖PCR扩增仪
■与384孔板配套使用的热盖PCR扩增仪(用于HPV分型)
■80％异丙醇(分子生物学级)
■水(分子生物学级)
■氢氧化钠颗粒(分析级)
■2xPCR master-mix(Promega Cat#M75051000rxn)
■E-Gel System Mother E-BaseTM device(Invitrogen EB-M03)
■E-gels 96高通量2％琼脂糖(Invitrogen Cat#G7008-02)
■E-gel低分子量标准(Invitrogen Cat#12373031)
■试剂容器x5
标准实验室设备(未提供)
■1ml体积的多道移液器(200μl-1000μl)
■200μl体积的多道移液器(20μl-200μl)
■10μl体积的多道移液器(1μl-10μl)
■无尘纸巾
■计时器
■带滤芯吸头(10μl-1000μl)
■透射仪
■凝胶成像系统
■Glison P1000
■Glison P200
■Glison P20
方法
如果首次使用HPV高通量DNA亚硫酸氢盐处理试剂盒，强烈推荐 在进行亚硫酸氢盐转化法之前阅读用户指南中的详细方法。
使用HPV高通量DNA亚硫酸氢盐处理试剂盒在转化之前不需要预 先消化基因组DNA。
上述试剂盒优化了起始DNA的浓度从1ng到4μg的基因组DNA。
样品制备
■将总体积的试剂1与试剂2瓶组合，并且轻柔颠倒混匀。将组合试剂 置于72℃10分钟或直到完全溶解。
注意：试剂1和试剂2一经混合便可在4℃暗处稳定保存1个月。从 生产之日起，所有试剂在室温下可稳定保存1年。
■实验开始前，将结合缓冲液在72℃烘箱或培养箱中放置1小时。
■每次新鲜配置0.3M NaOH溶液(例如0.6克NaOH/50.0ml水)
■将纯化平板置于洗涤平板顶部
■将5μL对照样品1加入495μL水(分子生物级)中，并且平行处理实验 样品。对照样品1含有未转化HPV模板，其作为过程对照(process control)和敏感性对照。其应该置于孔H10内。
■总是进行“无DNA对照”，其中用其余实验样品处理500μL水，其 应当置于孔H11。
■用手剧烈振荡液基样品(PreservCyt)以使任何沉淀细胞重悬并保证样 品充分混匀。
■将300μL重悬细胞转移至纯化平板/洗涤平板套装的适当的孔中(不使 用孔H10、H11或H12)。详细记录样品放置于哪一个孔。
实验方案
●将纯化平板/洗涤平板套装以2000xrcf离心1min，丢掉流动 的液体部分。注意不要丢掉洗涤平板。
●用底部盖膜密封纯化平板出口，确保所有出口完全密封。确保 盖膜的切角与纯化平板切角始终成直线。
●将2ml蛋白酶K加入裂解缓冲液并且颠倒混匀。
●纯化平板每孔加入100μL裂解缓冲液(使用12道移液器)。
●取10.5ml结合缓冲液放到新管中并且加入100μL载体DNA。 颠倒混匀并且向纯化平板的每孔中加入100μL结合缓冲液(使用12 道移液器)，然后用提供的平板封口膜密封纯化平板顶部。
●55℃孵育60分钟。
●小心地去掉纯化平板上的底部盖膜，并且将纯化平板迅速放置 在洗涤平板的上面。去掉纯化平板的封口膜，然后以2000xrcf离 心1分钟，丢掉流动的液体部分。注意不要丢掉洗涤平板。
●更换纯化平板的底部盖膜。
●向转化平板的每孔中加入50μL新鲜配置的0.3M NaOH溶液， 用新鲜的封口膜(提供的)密封纯化平板上部。
●55℃温育15分钟。
●去掉封口膜并且使用多道移液器向转化平板的每孔中加入 220μL经组合的试剂1和试剂2，用新鲜的封口膜(提供的)密封纯化 平板的顶部。
●转化平板在55℃温育3小时。
●温育后，去掉封口膜并向转化平板的每孔中加入240μL结合缓 冲液(参考重要实验方法制备)，用移液器混合，并用新鲜的封口膜 (提供的)密封纯化平板顶部。
●小心地从纯化平板去掉底部盖膜，并且将纯化平板迅速置于洗 涤平板上面。
●去掉封口膜，2000xrcf离心1分钟，丢掉流动的液体部分。
●向每孔加入200μL 80％异丙醇，室温2000xrcf离心1分钟。
●去掉洗涤平板，丢掉流动的液体部分，然后室温2000xrcf离 心1分钟。
●丢掉洗涤平板，将纯化平板置于洗脱平板的上面以确保纯化平 板的顶与洗脱平板正确对齐。平板在室温下放置5分钟。
●采用多道移液器向纯化平板的每个样品孔中加入30μL洗脱缓 冲液，移液器吸头靠近膜表面但不要接触。
●室温温育1分钟。
●重复上述步骤一次，总洗脱体积达到60μL。
●室温1000xrcf将纯化平板/洗脱平板组合体离心1分钟。
●去掉洗脱平板并用提供的密封帽密封。
●将平板置于热盖热循环仪的热盖PCR仪，95℃温育30分钟。
去掉密封帽前进行短暂离心。
■用手剧烈振荡液基样品(PreservCyt(R))以使任何沉淀细胞重悬并且保 证溶液均质。
■将4ml重悬的细胞转移到15ml Costar离心管。如果培养基小于4ml， 则将全部材料转移到15ml Costar离心管并且补充无菌蒸馏水使体积 达到4ml。精确测试需要至少1ml体积的样品。
■将上述离心管在吊桶式转头中3000xg离心15分钟。
■小心地倾倒上清，不要使沉淀细胞悬起。
■用200μL裂解缓冲液将沉淀的细胞重悬，充分混合直到溶液均质。
■向温育平板的每孔中加入20μL蛋白酶K并进行温育。
■将80μL样品转移到密封帽覆盖的孵育平板(平板1)并且在55℃温育1 小时。
实验方案准备
■将总体积的试剂1与试剂2瓶组合，并且轻柔颠倒混匀。注意：试剂 1和试剂2一经混合便可在4℃暗处稳定保存1个月。从生产之日起， 试剂1、2、3和4在室温下可稳定保存1年。
■每次新鲜配置NaOH溶液(例如1克NaOH/8.3ml水)，而且向转化平 板(平板2)的每孔中加入5μL。
■将5μL对照样品1加入15μL水(分子生物级)中，平行处理测试样品。
■将20μL细胞裂解物转移到转化平板(平板2)并且轻柔混匀。
■用提供的封口膜将转化平板(平板2)密封，并且在37℃烘箱中温育15 分钟。温育后，在去掉封口膜之前将平板短暂离心以在膜上沉淀任何 凝结(condensation)。
■用提供的密封帽将孵育平板(平板1)密封，-20℃保存。
■确保试剂3没有形成固体沉淀。如果有沉淀，则将该溶液加热(不超过 80℃)并且混匀。
离心方案
■用多道移液器向转化平板(平板2)的每孔中加入220μL组合的试剂1 和试剂2，然后用移液器轻柔混匀，并用提供的8条密封帽密封该平 板。
■将转化平板(平板2)在55℃烘箱中温育3小时。
亚硫酸氢盐处理可能进行至少1小时，然而，减少孵育时间可能会导致 扩增子中局部的非转化(non-conversion)。因此不推荐小于3小时的温育 时间。
■温育后，向转化平板(平板2)的每孔中加入240μL试剂3(参考重要方 案制备)。
■将纯化平板(平板3)置于洗涤平板(平板4)的上面。
■将样品从转化平板(平板2)转移到纯化平板(平板3)对应的孔，并且用 提供的封口膜密封。
■将纯化平板(平板3)/洗涤平板(平板4)组合体放入离心机，以1,000rcf 室温离心4-5分钟。
■从洗涤平板(平板4)上丢掉流动的液体部分，然后再将其置于纯化平板 (平板3)的下面。向纯化平板(平板3)的每孔中加入0.8ml 80％异丙醇 (分子生物学级)。
■1,000rcf室温离心1分钟。
■去掉洗涤平板(平板4)，丢掉流动的液体部分，然后再以1,000rcf室温 离心2分钟。
■将纯化平板(平板3)置于洗脱平板(平板5)的上面以确保纯化平板(平板 3)的顶位于洗脱平板(平板5)适当的孔中。
■用多道移液器向纯化平板(平板3)的每个样品孔中加入50μL试剂4， 移液器吸头靠近膜表面但不要与之接触。
■室温温育1-2分钟。
■将纯化平板(平板3)/洗脱平板(平板5)组合体以1,000rcf室温离心1分 钟。
■去掉洗脱平板(平板5)，并用提供的密封帽密封。
■将平板置于热盖PCR仪中95℃温育30分钟。
现在已将DNA样品经转化并且准备进行PCR扩增。温育后，将平板短 暂离心以去掉密封帽上的任何凝结。
内部对照PCR反应
提供有基因组DNA和对照PCR引物用于简单故障的排除。提供有 对照样品1(紫色)和2(绿色)用于过程控制。对照样品1是提供的足够用 于8个转化反应的未处理的DNA。对照样品2是提供的足够用于20个 PCR扩增的亚硫酸氢盐处理的DNA。对照引物3A(黄色)和3B(红色)是 PCR引物，其可以用于检查回收的DNA的完整性(提供的足够用于20个 PCR扩增)。
巢式PCR引物可以用来进一步提高检测的敏感性，其用HPV高通量 DNA亚硫酸氢盐修饰试剂盒来实现。对照引物是常规亚硫酸氢盐PCR引 物而且已进行了优化供用于两轮的PCR扩增。由于在大多数情况下琼脂 糖凝胶电泳以后没有可见的扩增子条带，因此不推荐将这些PCR引物用 于单轮PCR。
注意：上述方案是基于热盖热循环仪的使用。如果没有热盖热循环 仪，外罩会与矿物油反应。
对照反应
■对照样品1(紫色)含有未处理的HPV基因组DNA(50ng/μl)
■对照样品2(绿色)含有亚硫酸氢盐处理的HPV人DNA(20ng/μl)
■对照引物3A(黄色)含有第一轮PCR引物
■对照引物3B(红色)含有第二轮PCR引物
对照PCR
对照引物3A(第一轮PCR引物)和对照引物3B(第二轮PCR引物)是 有效的巢式引物，其提供有足够用于最多20个对照PCR反应的量。必 要时可提供这些引物样品用于加快故障检查过程，而且其也可以用于估 计你的修饰的DNA的量。
注意：第二轮PCR反应可以与第一轮PCR反应同时准备并且冷冻直到需 要时。
高风险PCR扩增
第一轮扩增
■对于每个反应，向提供的高风险PCR平板上加入12.5μl PCR Master Mix(例如Promega Master Mix)和9.5μl水(分子生物学级)。如果你将准 备96个样品，那么在适当的管中将1.25ml Master mix和850μl水以及 200μl引物混合物组合并且充分混合。然后用多道移液器向提供的高 风险HPV平板(平板6)的每孔中加入23μl反应混合物。
■向适当的孔对照孔H10和H11中加入2μl对照引物3A。
■将2μl所需的修饰DNA从洗脱平板(平板5)加到提供的高风险HPV平 板(平板6)，并且将2μl对照样品2加入孔H11，然后将其余的保存于 -20℃用于随后的HPV分型(参见下文的高风险平板设计)。
■运行下列PCR程序。
95℃/3min 1个循环 95℃/1min 42℃/2min 60℃/2min 30个循环
65℃/10min 1个循环
第二轮扩增
■将2μl第一轮扩增的DNA加入到第二轮混合物中，与第一轮扩增所准 备的完全相同。
■运行下列PCR程序
95℃/3min 1个循环 95℃/1min 42℃/2min 60℃/2min 30个循环 60℃/10min 1个循环
电泳
■从铝箔包装中取出96孔2％E-凝胶并且去掉红色的96孔梳子。
■用多道移液器将10μl无菌水加入凝胶的每个孔中。
■将10μl DNA标记加入标记孔中。
■用多道移液器将10μl扩增产物转移到E-凝胶的每孔中。
■设定E-base 5-7分钟，并且按pwr/prg。
■利用紫外透射仪和凝胶成像软件记录结果。
HPY分型
第一轮扩增
高风险分型平板(平板8)含有针对下列高风险HPV型的菌株特异引 性物：16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59和68。洗脱 平板(平板5)上保留足够量的DNA用于每个样品的所有高风险菌株的分 型。
■从-20℃冰箱取出洗脱平板(平板5)。
■高风险通用扩增为阳性的任何样品现在可利用菌株特异性引物进行分 型(参见下文分型平板设置)。
■对于每个反应，向提供的PCR平板每孔中加入12.5μl PCR Master Mix(例如Promega Master Mix)和8.5μl水。如果你有6个样品需要分 型，那么向适当的管中加入1187.5μl Master mix和807.5μl水并且充 分混合。然后如下文所说明的，向HPV分型平板(平板7)的每孔中加 入21μl混合物。
■如下文所说明的，向每孔中加入2μl适当的引物。
■如果在384孔板中进行分型并且有24个样品需要分型，则向适当的管 中加入4.5ml Master mix和3.42ml水，充分混合，然后如下文所说明 的，向384孔板每孔中加入21μl混合物。然后如下文所说明的，将 2μl适合的引物加入每孔中。
■向分型平板适当的孔中加入2μl高风险阳性样品(来自洗脱平板，平板 5)。
■准备足够的管用于你的每个样品以及“无模板”(阴性)对照。
■运行下列PCR程序。
95℃/3min 1个循环 95℃/1min 45℃/2min 65℃/2min 30个循环 65℃/10min 1个循环
第二轮扩增
■将2μl第一轮扩增的DNA加入到第二轮混合物中，与第一轮扩增所准 备的完全相同。
■运行下列PCR程序
95℃/3min 1个循环 95℃/1min 45℃/2min 30个循环
65℃/2min 65℃/10min 1个循环
电泳
■从铝箔包装中取出96孔2％E-凝胶并且去掉红色的96孔梳子。
■用多道移液器将10μl无菌水加入到凝胶的每个孔中。
■将10μl DNA标记加到标记孔中。
■用多道移液器将10μl扩增产物转移到E-凝胶的每孔中。
■设定E-base 5-7分钟，并且按run。
■利用紫外透射仪和凝胶成像软件记录结果。
■现在样品进行了分型。
故障排除
亚硫酸氢盐处理的样品来源的HPV DNA，当采用基因组简化引物进 行扩增时，引物不论是寡核苷酸还是修饰的核酸例如INAs，其都为发现 样品中任何型的HPV提供了非常卓越的检测系统，其可以是人临床资料 来源的样品或是另一极端的环境来源。由于临床相关病毒(HPV)被认为是 人类癌症的原因，本发明因而得到发展。
依据本发明的检测测定法的实际意义是可变的。虽然利用PCR扩增 已证明上文所详细描述的原则，但是可以利用本领域已知的任何方法进 行资料解析。当前人们以微阵列检测系统为重点利用基因组简化引物能 够实现多种HPV的检测，由于亚硫酸氢盐处理降低了基因组的复杂性， 因此可以在有更少数量检测器的微阵列上实现更多型HPV的检测(特 点)。
总之，HGS基因组简化引物法产生了与许多患者的临床表型相关的 一致性的数据。
亚硫酸氢盐处理
以下列出了一个有效的亚硫酸氢盐处理核酸的示例性方案。该方案 可以保留基本上全部处理的DNA。本文中该方法也被称为人类遗传印记 (Human Genetic Signatures，HGS))法。应了解样品或试剂的体积或量可以 变化。
优选的亚硫酸氢盐处理方法可以在人类遗传标记控股有限公司 (Human Gnetic Sgnatures Pty Ltd)为申请人的US 10/428310或 WO 2004/096825(PCT/AU2004/000549)中查到，二者以引用的方式并入 本文中。
对于2μg DNA，如果需要可以用适当的限制性酶进行预消化，以20μl 的终体积加入2μl(1/10体积)的3M NaOH(6g/50ml水，新鲜制备)。该 步骤将双链DNA分子变性为单链形式，因为亚硫酸氢盐试剂优选与单链 分子反应。将该混合物在37℃温育15分钟。可用高于室温的温育温度 来提高变性效率。
温育后，依次加入208μl 2M焦亚硫酸钠(7.6g/20ml水，与416ml 的10N NaOH；BDH AnalaR#10356.4D；新鲜制备)以及12μl的10mM 对苯二酚(0.055g/50ml水，BDH AnalR#103122E；新鲜制备)。对苯二 酚是还原剂，并有助于降低试剂的氧化作用。还可以使用其它的还原剂， 例如二硫苏糖醇(DTT)、巯基乙醇、醌(对苯二酚)或其它合适的还原剂。 样品用200μl矿物油覆盖。矿物油覆盖可以防止试剂的蒸发和氧化，但 并非必需。随后将样品在55℃温育过夜。可选择地，该样品可以在热循 环仪中进行如下循环：如下温育约4小时或整夜：第一步，在PCR仪中 循环55℃/2小时；第二步，95℃/2分钟。第一步可以在约37℃至约 90℃之间的任何温度进行，时间长度可以从5分钟至8小时之间变化。 第二步可以在约70℃至约99℃之间的任何温度进行，时间长度可以从 1秒钟至60分钟或者更长之间变化。
用焦亚硫酸钠处理后，将油去除，如果DNA浓度低则加入1μl tRNA(20mg/ml)或2μl糖原。这些添加剂是可选的，并且可以用来通过与 靶标DNA共沉淀而提高所获得的DNA产量，尤其是DNA以低浓度存 在时。当核酸量＜0.5μg时，则通常需要使用添加剂作为载体以更加有效 的沉淀核酸。
异丙醇提纯处理如下进行：将800μl水加入样品中，混匀，然后加入 1ml异丙醇。水或缓冲液将反应管中的亚硫酸氢盐浓度降低到该盐不随目 的靶标核酸一起沉淀的水平。稀释度通常为约1/4至1/1000，只要将盐 浓度稀释至低于如本文所公开的预期范围即可。
将样品重新混匀，并置于4℃至少5分钟。将样品在微型离心机中 离心10-15分钟，并将沉淀用70％ETOH洗涤2次，每次均涡旋。该洗 涤处理除去任何与核酸一起沉淀的残余盐。
将沉淀干燥，然后重悬于适当体积例如50μl的T/E(10mM Tris/0.1 mM EDTA)pH 7.0-12.5中。已经发现pH 10.5的缓冲液特别有效。如悬浮 核酸所需要的一样，将样品在37℃至95℃孵育1分钟至96小时。
扩增
PCR扩增利用Promega PCR master mix，在25μl包括2μl亚硫酸氢盐 处理的基因组DNA以及6ng/μl的每种引物的反应混合物中进行。将链 特异性巢式引物用于扩增。用PCR引物1和4进行第一轮PCR扩增(见 下文)。第一轮扩增后，将1μl扩增的材料转移至含有PCR引物2和3的 第二轮PCR预先混合液中，并如前所述进行扩增。PCR产物的样品在 ThermoHybaid PX2热循环仪中进行扩增，条件如下：95℃/4分钟的1个 循环；随后是95℃/1分钟、50℃/2分钟以及72℃/2分钟，共30个循环； 72℃/10分钟的1个循环。
完全巢式PCR法的示意图如下所示：
多重扩增
将1μl亚硫酸氢盐处理的DNA加入到在25μl 20反应体积中的下列 组分中：x1 Qiagen多重标准混合物(master mix)、5-100ng每种第一轮INA 或寡核苷酸引物、1.5-4.2nM MgSO4、400μM每种dNTP以及0.5-2单位 的聚合酶混合物。所述组分随后在热盖热循环仪中进行如下循环。通常， 在每个扩增反应中可以存在多达200个单独的引物序列：
第一步：94℃15min 1个循环
第二步：94℃1min
50℃3min 35个循环
68℃3min
第三步：68℃10min 1个循环
随后对第一轮扩增的等份试样进行第二轮扩增，将第一轮扩增转移 到含有酶反应混合物和适当的第二轮引物的第二轮反应管中。然后进行 如上循环。
HGS“复杂性降低”引物和探针
任何合适的PCR引物或探针，以及特别设计用于非PCR扩增包括等 温扩增法的引物和探针均可用于本发明。引物或探针通常具有与待扩增 的序列互补序列。引物或探针通常是寡核苷酸，但可以是核苷酸类似物， 例如INAs。针对上游链和下游链的引物的序列是不同的。
探针和引物
探针或引物可以是任何合适的核酸分子或核酸类似物。实例包括， 但不限于DNA、RNA、锁核酸(LNA)、肽核酸(PNA)、MNA、阿卓糖醇 核酸(altritol nucleic acid，ANA)、己糖醇核酸(hexitol nucleic acid，HNA)、 嵌入性核酸(intercalating nucleic acid，INA)、肌醇核酸(cyclohexanyl nucleic acid，CNA)及其混合物和杂交体，以及其磷原子修饰物，例如但 不限于硫代磷酸酯(phosphorothiates)、磷酸甲酯(methyl phospholates)、亚 磷酰胺(phosphoramidites)、二硫代磷酸酯(phosphorodithiates)、硒代磷酸 酯(phosphoroselenoates)、磷酸三酯(phosphotriesters)以及硼代磷酸酯 (phosphoboranoates)。非天然存在的核苷酸包括，但不限于以下核苷酸， 包括：DNA、RNA、PNA、INA、HNA、MNA、ANA、LNA、CAN、CeNA、 TNA、(2’-NH)-TNA、(3’-NH)-TNA、α-L-Ribo-LNA、α-L-Xylo-LNA、 β-D-Xylo-LNA、α-D-Ribo-LNA、[3.2.1]-LNA、双环-DNA、6-氨基-双环 -DNA、5-epi-双环-DNA、α-双环-DNA、三环-DNA、双环[4.3.0]-DNA，双 环[3.2.1]-DNA，双环[4.3.0]酰胺-DNA、β-D-吡喃核糖基-NA、α-L-吡喃 来苏糖基-NA、2’-R-RNA、α-L-RNA或α-D-RNA、β-D-RNA。另外，非 含磷化合物可以用于连接到核苷酸，例如但不限于甲基亚氨基甲基 (methyliminomethyl)、甲酰乙酸乙酯(formacetate)、硫代甲酰乙酸乙酯 (thioformacetate)以及含有酰胺的连接基团。特别地，核酸和核酸类似物 可能包含一种或者多种嵌入性假核苷酸。
探针或引物可以是含有一种或多种形成INA的内部IPNs的DNA或 DNA寡核苷酸。
检测方法
存在有多种可能的检测系统可以用来确定期望样品的状态。检测系 统包括，但不限于：
I.适当标记的DNA杂交于微阵列型装置，其可选择 10-＞200,000的单个组分。该阵列可以由位于任何合 适的固体表面例如玻璃(glass)、塑料(plastic)、云母 (mica)、尼龙(nylon)、珠子(bead)、磁珠(magnetic bead)、荧光珠(fluorescent bead)或膜(membrane)上的 INAs、PNAs或核苷酸或者修饰的核苷酸阵列构成；
II.DNA印迹型检测系统；
III.标准PCR检测系统，例如琼脂糖凝胶、荧光读出器 (readouts)例如Genescan分析、夹心杂交测定 (Sandwich hybridization assays)、DNA染色剂例如溴 化乙锭、Sybr绿、抗体检测、ELISA平板读数器型 装置、荧光计装置；
IV.特异性或多种基因组扩增片段的实时PCR定量或对 其的任何变更；
V.在WO 2004/065625中列出的任何检测系统，例如荧 光珠、酶交联物、放射性珠等；
VI.利用扩增步骤的其它任何检测系统，例如连接酶链 反应或等温DNA扩增技术例如链置换扩增(SDA).
VII.生物传感器技术适用于本发明，例如以The Texas A&M University System为申请人的US 6426231和 US 6916665以及以University of Massachusetts为申 请人的US 6824659，其以引用的方式并入本文中。
嵌入性核酸
嵌入性核酸(INA)是非天然存在的多核苷酸，其可与具序列特异性的 核酸(DNA和RNA)杂交。在基于探针或引物的杂交测定中，INA是作为 核酸探针和引物的替换物/替代物的候选者，因为它们表现出多种合乎需 要的特性。INA是多聚物，其与杂交核酸而形成比相应天然存在的核酸/ 核酸复合物热力学更加稳定的杂交体，它们不是已知降解肽或核酸的酶 的底物。因此，相比天然存在的核酸片段，INA在生物样品中应该更稳 定，而且比天然存在的核酸片段具有更长的贮存期。与非常依赖于离子 强度的核酸杂交不同，INA与核酸的杂交完全独立于离子强度而且在低 离子强度及非常不利于天然存在的核酸与核酸杂交的条件下，仍然有利 地进行。INA的结合强度依赖于分子中设计的嵌入基团的数量以及来自 双链结构中以特异性方式聚集的碱基之间的氢键的常规相互作用。INA 识别DNA较之DNA识别DNA，对序列区分的效率更高。
优选地，INA是(S)-1-O-(4，4′-二甲氧三苯基甲基)-3-O-(1-异戊二烯 基甲基)-丙三醇的亚磷酰胺。
INA以商业上可行的形式通过对标准寡核苷酸合成步骤的改造而合 成。INA的完整定义及其合成可以在WO 03/051901、WO 03/052132、 WO 03/052133和WO 03/052134(Human Genetic Signatures Pty Ltd)中 查到，其均以引用的方式并入本文中。
INA探针和引物与标准核酸探针和引物之间的确存在许多差异。这 些差异可以很方便地分为生物、结构及其理化差异。如上文以及下文所 讨论的，当在通常已采用了核酸的应用中尝试利用INA探针和引物时， 这些生物、结构以及理化差异可能导致不可预测的结果。在化学技术领 域中，常常观察到不同组合物的这种不等价性。
关于生物差异，核酸是在活物种的生命中作为遗传传递和表达的因 子而发挥重要作用的生物物质，已经相当充分的理解了其在体内的性质。 然而INA是最近开发的完全人工的分子，由化学家想象而且利用合成有 机化学制备，其不具备已知的生物学功能。
结构上，INA也与核酸显著不同。尽管两者均可利用常规核苷酸碱 基(A、C、G、T和U)，这些分子的组成在结构上是不同的。RNA、DNA 和INA的主链由重复的核糖磷酸二酯以及2-脱氧核糖单元构成。INA与 DNA或RNA的区别在于具有一个或多个大的扁平分子，其借助连接分 子连接于多聚体。双链结构中，该扁平分子嵌入到双链结构中与INA相 对的互补DNA链中的碱基之间。
INA与DNA或RNA之间的物理/化学差异也很大。INA结合于互 补DNA比核酸探针或引物结合于相同靶序列更加迅速。与DNA或RNA 片段不同，INA与RNA结合很弱，除非嵌入基团位于末端位置。由于嵌 入基团与互补DNA链上的碱基之间的强烈相互作用，INA/DNA复合物 的稳定性高于类似的DNA/DNA或RNA/DNA复合物的稳定性。
与其它核酸例如DNA或RNA片段或者PNA不同，INA没有表现 出自我聚集或结合的性质。
总之，由于INA与具序列特异性的核酸杂交，所有INA是开发基 于探针或引物的测定的有用候选物，尤其适合于试剂盒以及筛选测定。 然而，INA探针和引物不等于核酸探针和引物。因此，任何可提高基于 探针或引物的测定法的特异性、敏感性以及可靠性的方法、试剂盒或组 合物，在含有DNA样品的检测、分析和定量中均有用。INA具有用于本 发明目的的必要特性。
HPV和癌基因组标记
利用临床样品和细胞系，本发明人对几乎400种人类基因的调控区 的甲基化模式进行了观察，并发现超过60种当处于癌状态并且HPV存 在时具有甲基化的改变的基因组标记。实例包括，但不限于一种或多种 下列基因组区域内、或附近、转录单位(基因)，称为：CD14、ENDRB、 HIC、RARB1、PGR、SFRS8、TMSB10、ABCG2、MFNG、LAMR1、 RAGE、ABL1、CRBP、GPR37、HRK、RARA、SYK、ECE1、MME、 TEM、NF2、XIAPHSX11、RARRES1、FLI1、HTLF、LDHB、RB1、 TGD、CDK4、MMP14、RAB32、BARD1、NF1、LIM2、MMP2、DAB2、 BMP6、CDKN1C、DAB2IP、LMNB1、MMP28、HAI2、SOCS1、HIC2、 MSH6、RIN2、HMGA1、JUN、S100P*、SRF、VDR、DKK3、KRAS2、 PLAU、TNFRSF10B、CDH1、MAC30、DDB2、PAX6、AXL、EIF4A2、 SLIT2、RECK、TERC、GATA5、STAT1。
疾病状态
本发明人采用HPV和宫颈癌中所选的人类基因组区的甲基化作为证 明本发明的实例。应了解其它状态例如各种形式的痴呆(阿尔茨海默病) 可以有传染性的组分，例如单纯疱疹病毒类型1(2004，Neurobiology of Aging，25，619-627；Itzhaki，R.F.，et al.)；与冠状病毒相关SARS肺炎有关 的临床进展和病毒负荷(2003，The Lancet，361，1767-1772，Peiris，J.S.M.m et al.，)；人免疫缺陷病毒HIV以及免疫系统障碍和几种基于病毒的出血 热(2004，Nature Medicine，10，570-576，Weiss，R.A.，et al.，)；包括尼帕病毒 (Nipah virus)、副流感病毒(parainfluenza)和腮腺炎病毒(Mumps)的副粘病 毒科病毒，其与各种呼吸系统疾病、腮腺炎、脑膜炎、胰腺炎、脑炎和 麻疹有关。1999年被首次识别尼帕病毒，其在70％的感染患者中引起患 致命的脑炎，并且具有非常广泛的宿主范围包括人类、犬、猫、猪、马、 仓鼠、蝙蝠和豚鼠。它是全球健康和经济的重要威胁(2005，Nature，436， 401-405；Negrete，O.A.，et al，)；黄病毒科病毒，其包括登革病毒、黄热病 病毒、丙型肝炎病毒和庚型肝炎病毒，其与脑炎、肝炎和休克综合征有 关。例如，丙型肝炎病毒是全世界超过一亿七千万人感染的慢性肝病的 主要原因，而且没有有效的疫苗(2005，Science，309，623-626；Lindenbach， B.D.，et al，)，最后是疱疹病毒科病毒，其包括人疱疹病毒1至8。这些病 毒可以引起口腔感染、角膜溃疡、生殖道感染、脑膜炎、水痘、肺炎、 带状疱疹、巨细胞病毒性单核细胞增多症和脑炎。人巨细胞病毒在免疫 障碍个体包括器官移植个体中引起严重的致命疾病(2003，Nature，424， 456-461；Wang，X.，et al，)，其也是在人类以及各种动物中作为健康状态的 进展的本发明的候选者，其可以通过病毒存在和宿主DNA甲基化状态的 组合来进行监测。相似的实例来自植物病毒和类病毒。
实施例
HPV
HPV和宫颈癌将用于下列实例来证明本发明。应了解如上文所列的 其它病毒和疾病状态也可以通过本发明进行测定。
为了重申本发明人计算机模拟的(in silico)生物信息学分析所基于的 基础，在本文中用作参考目的的标准HPV型是乳多空病毒科 (Papovaviridae)乳头瘤病毒属(Papillomavirus)的HPV16，其最初是由国际 病毒分类委员会(ICTV)所如此命名的(1993，Van Rast，M.A.，et al.， Papillomavirus Rep，4，61-65；see also，1998 Southern，S.A.and Herrington， C.S.Sex.Transm.Inf.74，101-109)。尽管分类学升级到乳头瘤病毒科，但 是在现有技术中常常互换使用。为了避免含糊不清，本发明人用已完全 测序的HPV16 7904个碱基对的基因组作为标准比较(National Center for Biotechnology Information，NCBI locus NC_001526；版本NC_001526.1； GI：9627100；references，Medline，91162763和85246220；PubMed 1848319和2990099)。
另外，本发明人使用所谓的高风险HPV型16、18、45和56的已完 全测序的基因组，其NCBI登录号分别是NC-001526、NC-001357、 NC-001590和NC-001594。
本发明人使用所谓的中度风险HPV型30、31、33、35、39、51、52、 58和66的已完全测序的基因组，其NCBI登录号分别是NC-001585， NC-001527，NC-001528，NC-001529，NC-001535，NC-001533，NC-001592， NC-001443and NC-001695。
本发明人使用所谓的低度风险HPV型6、11、42、43、44、53、54 和55的已完全测序的基因组，其NCBI登录号分别是NC-000904、 NC-001525、NC-001534、NC-005349、NC-001689、NC-001593、NC-001676 和NC-001692。
如本发明人所证实的，许多技术、方法和临床的问题阻碍了通过常 规DNA实验对各种临床样品中的人乳头瘤病毒DNA的检测。本发明为 现有技术中所面临的许多困难提出了解决方案。因为HPV DNA的亚硫 酸氢盐转化降低了HPV衍生物序列库(derivative sequence pool)的复杂 性，复杂性降低使样品中不同HPV型的初期筛选更加有效，因此可以更 加适当和准确的与临床资料相结合。
利用申请人所开发的方法对样品中HPV进行检测的实例可以在人类 遗传标记控股有限公司为申请人的WO 2006/066353 (PCT/AU2005/001963)中查到，其以引用的方式并入本文中。
图1表示对各种正常个体以及高度鳞状上皮内病变的个体和存在 HPV的细胞系进行测试结果。提供的该数据补充了图1中来自对患者的 数据，该患者已测试了HPV以及400个人类基因组区域的甲基化状态。
表2在从三种主要风险类型的不同HPV衍生物中产生的扩增的核酸 产物碱基对中预期片段大小。
HPV和各种人类基因组区域的甲基化状态同时存在
设计实验以证实HPV的存在连同特定基因组区域的甲基化状态一起 与任一单独特征比较是更加有效的健康状态的预后指标。以此方式，对 样品的大量基因组区域的甲基化状态进行测定，所述样品来自宫颈细胞 学正常的个体，来自宫颈细胞学具有高度鳞状上皮内病变特征的个体， 以及来自根据细胞形态学癌指标其宫颈细胞学是正常的但基于细胞学特 征推断是HPV阳性的个体。
图1A表示HeLa细胞系、如病理学家所确定的表现出HSIL的两个 患者(称为HSIL-1和HSIL-2)、具有正常宫颈形态但是根据病理表型推断 存在HPV的一个患者(称为HPV+Nor)，它们都是如利用适当的PCR扩 增技术所确定的HPV存在阳性。具有正常宫颈形态的两个患者(称为 Normal-1和Normal-2)是高等风险HPV型存在阴性的。
图1B表示HeLa细胞系中存在条带(扩增子)(泳道1)，其含有HPV18 型DNA序列。两个HSIL样品(泳道2和#)含有如分子测定的HPV16。 发现病理学家确定为形态正常但其中一些细胞具有作为HPV感染指标的 特征性胞质特点的宫颈组织为HPV型82(泳道4)阳性的。
然后在每个基因座测试这些临床样品的甲基化存在(称为pos)或非甲 基化(称为neg)。例如，关键的预后指标是病理正常的患者具有非甲基化 基因座，而高度鳞状上皮内病变的患者在相同区域具有甲基化；简言之， 在发展到癌状态的过程中相关基因区域已沉默。(反之同样适用。正常细 胞学个体在特定细胞型中有基因座被甲基化，而在癌状态中该基因座变 为未甲基化的)。
因为特定基因组区域的甲基化随细胞型而变化，所以一些基因组区 域对于特定细胞型中癌状态的发展必然是不具有任何信息的。这些区域 在所有样品中或者完全未甲基化，或在所有临床样品中完全甲基化。
表3A和3B表示许多临床样品和HeLa细胞系的HPV状态，以及53 个个体的人类基因组区域的甲基化状态。
如从表3A和3B所看到的，HeLa宫颈癌细胞系和高度鳞状上皮内病 变(HSIL)两者都是根据分子确定的HPV DNA存在阳性。一个非癌但病理 学推断为HPV感染的宫颈组织样品(称为HPV+Nor)也被发现是HPV存 在阳性。发现两个来自不同个体的正常宫颈组织样品为如分子所确定的 HPV DNA序列存在阴性。
上述每个区域都经PCR扩增，产生的扩增子用适当的限制性酶消化 (和/或测序)以确定特定基因组区域的甲基化状态(表3A和3B)。
首先，存在对于预后指标没有任何信息的基因组区域。在所有样品 (13个基因组区域ABCG2至VHL)中这些区域未甲基化，或者是在所有 样品(4个基因组区域，CD34、MAGEA2、MAGEA3和MINT31)中已甲 基化。对表3A和3B的结果中称为CD14、ENDRB、HIC和RARB的基 因组区域特别有趣。所有上述这些区域在HeLa宫颈癌细胞学和两个HSIL 样品中都是甲基化的。有趣的是，在经测试的正常宫颈组织或感染HPV 的非癌宫颈组织样品中，这些区域都不是甲基化的。
最后，32个基因组区域ANAX7至TNFRS10B在正常个体和具有 HSIL的个体之间表现出可变的甲基化模式。该变化极有可能反映患者个 体的遗传背景与在人类基因组的个体基因座中甲基化状态的不同稳定性 的混合。
该结果表明尽管在几乎所有HSIL和宫颈癌中已经检测到HPV存在， 但是仅HPV存在不是宫颈高度异常情况的可靠指标。然而，将HPV存 在与宫颈DNA样品的甲基化特征谱(methylation profile)中的变化联系起 来时，其给出了更好的疾病状态的预后指标。
表3A
HeLa HSIL-1 HSIL-2 Norm-1 Norm-2 HPV +Nor HPV状态 Pos Pos Pos Neg Neg Pos
表3B
ND＝未确定
除了基因组区域CD14、ENDRB、HIC和RARB甲基化以外，本发 明人还鉴定了其他62个DNA基因组区域，其表现出与HSIL样品中 CD14、ENDRB、HIC和RARB相似的甲基化特征谱，但是与来自384 个候补基因的正常宫颈组织或感染HPV的正常宫颈组织中的不同。这些 标记物列于表4中。
图2表示利用HGS HR-HPV DNA纯化和检测试剂盒对36个LBC样 品的人类基因组DNA和HPV DNA进行PCR扩增的结果。从结果中可以 看出，采用该方法可以同时测定存在人类基因组改变以及病毒存在与否。
图3表示正常宫颈样品在16个不同基因座进行扩增，然后经限制性 核酸内切酶BstU1和TaqαI组合消化，进行琼脂糖凝胶电泳的代表性凝 胶。从液基细胞学样品(在此编号为28和29)中提取DNA，经亚硫酸氢钠 修饰，然后用所鉴定基因的巢式引物进行扩增用于进一步分析。这些基 因从左到右分别是1)TEM 2)MME 3)ECE14)SYK 5)RARA 6)HRK 7) GPR378)CRBP 9)ABL110)RAGE 11)LAMR1 12)MFNG 13)ABCG2 14)TMSBIO 15)SFRS8和16)PGR。
病理学家对样品的病理学和HPV感染谱(infection profile)进行了评 价。当扩增子中CpG二核苷酸未甲基化时，亚硫酸氢盐修饰将未甲基化 的胞嘧啶转化为尿嘧啶碱基，扩增后转化成胸腺嘧啶碱基。因未保留未 甲基化的CpG二核苷酸和限制性位点，因此不会被核酸内切酶BstU1(识 别CGCG，如果样品未甲基化，其在扩增后将转化成TGTG，但是如果 样品中含有甲基化的序列，其将会保持CGCG)或TaqαI(识别TCGA，如 果样品未甲基化，其在扩增后将转化成TTGA，但是如果样品中含有甲 基化的序列，其将保持TCGA)识别。单一条带表示未消化的PCR产物， 因此检测到单一条带则意味着扩增子中CpG二核苷酸是未甲基化的。甲 基化的CpG二核苷酸对亚硫酸氢盐修饰具抗性，因此保留了限制性核酸 内切酶识别的限制性位点。因此，根据扩增子中可用的CpG位点的数量， 将PCR产物消化成多个片段(如星号所示的)。检测到空泳道表明PCR反 应不成功。
在这些16个基因座中几乎没有检测到多条带。该分析的代表性结果 列于表5。
许多代表性的病理学正常的宫颈样品(NORM)的甲基化特征谱，其中 有一些可能是HPV感染(NORM HPV)。从液基细胞学样品中提取DNA， 经亚硫酸氢钠修饰，然后对384个不同的基因进行扩增。用限制性酶消 化扩增子并进行琼脂糖凝胶电泳。检测到单产物(未消化的产物)表示所询 问基因的启动子区为未甲基化(U)。检测到多条带(消化产物)意味着所询 问基因的启动子区为甲基化(M)。在特异性基因组中(称为“F”)没有条带 则推断PCR反应不成功。
还列出了高度和中度风险乳头瘤病毒DNA的存在(+)或不存在(-)。 包括了扩增人GST-P1基因和鼠GST-P1基因两者(HmGST)的引物，作为 PCR反应的对照。检测到条带则推断DNA已转化并可用于扩增。
图4表示肿瘤样品在16个不同基因座进行扩增，然后经限制性核酸 内切酶BstU1和TaqαI组合消化，进行琼脂糖凝胶电泳的代表性凝胶。 从液基细胞学样品(在此编号为82、83、84、94、95和96)中提取DNA， 经亚硫酸氢钠修饰，然后用所鉴定基因的巢式引物进行扩增用于进一步 分析。这些基因从左到右分别是1)PGR 2)SFRS83)TMSBIO 4)ABCG25) MFNG 6)LAMR17)RAGE 8)ABL1 9)CRBP 10)GPR37 11)HRK 12) RARA 13)SYK 14)ECE1 15)MME and 16)TEM。
病理学家对样品的病理学和HPV感染谱进行了评价。当扩增子中 CpG二核苷酸未甲基化时，亚硫酸氢盐修饰将未甲基化的胞嘧啶转化为 尿嘧啶碱基。未甲基化的CpG二核苷酸和限制位点没有保留，因此不会 被核酸内切酶BstU1或TaqαI识别。检测到单一条带表示未消化的PCR 产物，因此意味着扩增子中CpG二核苷酸是未甲基化的。甲基化的CpG 二核苷酸对被亚硫酸氢盐修饰具有抗性，因此保留了限制性核酸内切酶 识别的限制性位点。因此，根据扩增子中可用的CpG位点的数量，将PCR 产物消化成多个片段(如星号所示的)。检测到空泳道表明PCR反应不成 功。
与正常样品(见图4)相比较，肿瘤样品中更多比例的基因都是甲基化 的。该分析的代表性结果列于表6中。
在表6中，许多代表性的病理学异常的宫颈样品(如病理学家所评价 的)的甲基化特征谱。基于人乳头瘤病毒(HPV)的存在和病变类型(低度 LG，低度LG乳头瘤病毒LG HPV，以前的高度Pr HG，高度HG，高度 原位癌3组分和原位癌3病变CIN3)对样品进行了分类。
从液基细胞学样品中提取DNA，经亚硫酸氢钠修饰，然后对384个 不同的基因进行扩增。用限制性酶消化扩增子并进行琼脂糖凝胶电泳。 检测到单个产物(未消化的产物)则表示所询问基因的启动子区为未甲基 化(U)。检测到多条带(消化产物)则代表所询问基因的启动子区为甲基化 (M)。在特异基因组(称为“F”)没有条带则推断PCR反应不成功。
表7患者病理学列表
表7表示对64个不同基因座的DNA甲基化特征谱进行调查的样品 的病理学。
从预先确定病理学的96位患者的液基细胞学样品中提取DNA。病 理学家所评价的样品的相应病理学与病理学类型、发病程度以及人乳头 瘤病毒感染的存在与否有关。
将样品标记为细胞学正常(NORM)、可能有HPV感染(HPV)、细胞学 正常可能伴有HPV感染(HPV NORM)、低度病变而且伴有HPV感染(LG HPV)、高度病变(LG)、增强的高度病变(INC HG)、以前的高度病变(Pr HG)、原位癌1病变可能伴有HPV感染、高度原位癌3病变(HG CIN3)、 高度癌(HG Cx)、鳞状上皮细胞癌(SCC)、鳞状上皮细胞癌 (carcinoma/cancer)(SCC Cx)、腺癌(AC Cx)、子宫内膜癌(Ca Endomet)、 腺癌/原位腺癌(AC/AIS)。
表8示出了本发明人发现的基因或基因组区域，其是用于本发明的 疾病状态的适当的指标。应了解本领域的技术人员能够设计适当的引物 或探针来检测上述基因或基因组区域中一个或多个改变，并且与检测病 毒核酸的存在相结合。
表8适合本发明的疾病基因或基因组区域
本领域的技术人员应了解，在不背离广泛描述的本发明的精神或范 围的情况下，可以对如在具体实施方案中所示的本发明进行多种变化和/ 或更改，因此，应认为本实施方案在所有方面是说明性的而非限制性的。
序列表
<110>人类遗传标记控股有限公司(Human genetic Signatures Pty Ltd)
<120>健康状态的测定法(Assay for a health staate)
<130>205737340
<160>86
<170>PatentIn version 3.1
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如在本文中所用的术语“受试者”意思是指在胞嘧啶上具有基因组甲基 化的生物体。其通常包括哺乳动物例如动物和人类以及许多植物物种。
如在本文中所使用的术语“健康状态”意思为根据易定义的疾病或痛苦， 个体不同于整个群的程度。对于人类，其被世界卫生组织(World Heath Organization)采用国际疾病分类(International Classification of Diseases)来定 义，其是所有一般流行病学和健康管理目的的标准诊断分类。在临床术语中， 可以采用《哈里森内科学》Braunwald，E et al.，eds，McGraw Hill，Medical Publishing Division，第15版和以后的版本中所列标准对健康状态进行测定。
如在本文中所使用的术语“基因组靶标状态”可包括靶标核酸(染色 体或染色体外的)存在与否、基因组靶标的甲基化或未甲基化，靶标可以 是生物群内特定细胞类型的正常或多态性存在的核酸，或是通过感染性 微生物或病毒引入的靶标，或者是通过扩增、修饰、倒位或易位来对外 部干扰作出反应的靶标。
如在本文中所使用的术语“修饰”意思为将未甲基化的胞嘧啶转化为 另一种核苷酸。优选地，所述试剂将未甲基化的胞嘧啶修饰为尿嘧啶，其 随后在修饰的核酸扩增过程中被替换为胸腺嘧啶。
如在本文中所使用的术语“复杂性降低”在广义上意思为DNA基因 组，无论其天然存在于真核、原核或病毒/类病毒生命形式中，还是人工 合成的(或者如果作为RNA病毒/类病毒基因组而天然存在，随后，复制 为cDNA的形式)，其含有四种共同的碱基：G、A、T和C，经过亚硫酸 氢盐的修饰，其经历了Ts频率的增加和Cs频率的减少。上述转化把曾 经是正常的基因组变成术语称为“衍生物”的聚合物序列，其没有功能 的生物学意义，而且由“假基因组(genomic ghosts)”组成。
如在本文中所使用的术语“复杂性降低”不是指碱基在衍生物群中 存在的顺序，例如序列ATATATATATATAT(SEQ ID NO：76)与相同长度 的序列之一AAAAAAATTTTTTT(SEQ ID NO：77)之间的任何数学上的 复杂性差异。如在本文中所使用的术语“复杂性降低”是指两个实体(一 个是原始基因组，另一个是衍生物)中的碱基的未变位置，该位置是通过 分子探针或引物对不变位置1至n处都具有目标碱基的原始基因组及其 衍生物而测得的。在某个特定女性的30亿个碱基对的单倍体人类基因组 中，上游链上所述不变位置定义为从1至n，其中n是位置3,000,000,000。 如果在序列1至n中，在原始基因组上游链中第i个碱基是C，则在转化 的人衍生物中第i个碱基是U。在7904个碱基对的HPV16病毒基因组中， 所述不变的位置定义为从1至7904，其中n是7904。如果在序列1至n 中，在原始基因组上游链中第i个碱基是C，则在转化的HPV衍生物中 第i个碱基是U。应了解当不同类型的HPV衍生物或型用于比对并且这 些病毒衍生物长度不同时，则确定正确的第i个碱基需要仔细的生物信息 学多重比对，如同Morgenstern，B.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.93， 12098-12103对标准多重基因组比对进行说明的一样。
实例阐明了上述转化过程当应用于个体病毒基因组或应用于存在于 含有人类细胞和病毒基因组或其部分的临床样品中的病毒基因组混合物 时的结果。
一个正常10个碱基的基因组序列(“上游”链)，其序列为5’ GGGGAAATTC 3’(SEQ ID NO：78)，具有互补的“下游”链，其序列为 5’GAATTTCCCC 3’(SEQ ID NO：79)。变性和亚硫酸氢盐处理之后，上 述“上游”链变为5’GGGGAAATTU 3’(SEQ ID NO：80)，并且上述“下 游”链变为5’GAATTTUUUU 3’(SEQ ID NO：81)。由于胞嘧啶已经转化 为尿嘧啶，而尿嘧啶在DNA聚合酶体外转体内机制的识别方面与胸腺嘧啶 相当，所以该上游链衍生物基本上是5’GGGGAAATTT 5’GGGGAAATTT 3’(SEQ ID NO：82)，下游链衍生物是5’5’GAATTTTTTT 3’(SEQ ID NO：83)。因此起始正常的基因组从其上下游链之间具有5个Cs 和5个Ts转化为现在上下游链之间没有Cs而具有10个Ts的衍生聚合物群。 正常基因组已从四碱基的基因组降低为三碱基衍生物，复杂性得以降低。此 外，衍生物群中的‘基因座’只是指该衍生物中的位置坐标。例如，亚硫酸 氢盐转化后，基因座失去了其在任何网络水平所具有的所有功能生物学特 征。如果该基因组以前是编码、调控或是具有结构的，那么现在其两条链都 是生物学失语(biological gibberish)。因此衍生物群是没有功能的化学聚合物 的集合，其现在代表基因组以前的互补链的两个非互补链 (non-complementary ghost)，该基因组现在是不含有信息的。此外，该衍 生物是唯一的，而且不代表在任何细胞的(或病毒或类病毒)生命形式中通过 正常进化过程产生的序列，除非是统计的意外。
探针和复杂性降低
对于分子探针的正常意义，本发明人在本文中根据在两个相同大小的实 体中在特定的分子条件下实现探针对特异基因座的相同特异性和杂交水平 所需的探针长度的增加(IPL)来定义‘复杂性降低’，所述的实体其中第一个 是正常基因组，第二个是‘转化的’基因组(衍生物)。出于分子用途的目的， IPL是等于或大于1的整数。每个基因座在正常基因组以及转化的衍生物中 保持相同的位置。
实际上，“复杂性降低”可以通过探针长度来测定。例如，平均来 说，11-mer的寡核苷酸探针将具有一个独特的位置，其将与由四种碱基 G、A、T和C组成的4、194、304个碱基(411等于4,194,304)的正常基 因组完美杂交。然而，一旦这种4、194、304个碱基的正常基因组已经 由HGS亚硫酸氢盐法进行了转化，那么现在该转化的衍生物富含T而且 复杂性较低。然而，复杂性降低的结果就是之前独特的11-mer探针不再 具有可在复杂性降低的衍生物中可与之杂交的独特位置，其它新产生的 11碱基序列的位置，其作为亚硫酸氢盐转化的结果而重新出现。这些新 产生的序列在本文中称为“诱饵基因座”。因此现在需要约14-mer探针 来找到并与该原始基因座杂交。在该实例中，探针长度的增加约是从0 至3个碱基。
尽管其看来可能与直觉相反，但需要长度增加的寡核苷酸探针来检 测富含T的衍生物中的原始基因座。因此衍生物复杂性的降低意思是可 能需要设计基因座的上游和下游链的更长的探针来寻找衍生物中原始的 独特位置。然而，如下文所述的，嵌入性核酸(Interca1ating Nucleic Acid， INA)探针的使用允许比传统寡核苷酸探针更短的探针，因此克服了增加 长度的需要。
如在本文中所使用的术语“复杂性降低”也可以应用于探针序列的 不同结构，该探针序列可以用于确定样品中HPV的存在。此外，这些探 针可以含有非常规主链，例如PNA主链或对一个主链的修饰性插入，如 在INA中所描述的那样。因此衍生物被认为具有降低的复杂性，与探针 是否含有额外的组分例如嵌入性假核苷酸(如在INA中)无关。实例包括， 但不限于DNA、RNA、锁核酸(LNA)、肽核酸(PNA)、MNA、阿卓糖醇 核酸(ANA)、己糖醇核酸(HNA)、嵌入性核酸(INA)、肌醇核酸(CNA)及其 混合物和杂交体，以及其磷原子修饰物，例如但不限于磷硫酰、磷酸甲 脂、亚磷酰胺、二硫代磷酸酯、膦酸硒、磷酸三酯以及磷酸硼。非天然 存在的核苷酸包括，但不限于以下核苷酸，包括：DNA、RNA、PNA、 INA、HNA、MNA、ANA、LNA、CAN、CeNA、TNA、(2’-NH)-TNA、 (3’-NH)-TNA、α-L-核糖-LNA(α-L-Ribo-LNA)、α-L-木糖-LNA (α-L-Xylo-LNA)、β-D-木糖-LNA(β-D-Xylo-LNA)、α-D-核糖-LNA (α-D-Ribo-LNA)、[3.2.1]-LNA、双环-DNA、6-氨基-双环-DNA、5-表-双 环-DNA、α-双环-DNA、三环-DNA、双环[4.3.0]-DNA，双环[3.2.1]-DNA， 双环[4.3.0]酰胺-DNA、β-D-吡喃核糖基-NA、α-L-吡喃来苏糖基-NA、 2’-R-RNA、α-L-RNA或α-D-RNA、β-D-RNA。另外，非含磷化合物可 以用于连接于核苷酸，例如但不限于甲基亚氨基甲基、甲酰乙酸乙酯、 硫代甲酰乙酸乙酯以及含有酰胺的连接基团。特别地，核酸和核酸类似 物可以一种或者多种嵌入性假核苷酸(IPN)。IPN的存在不是核酸分子复 杂性描述的一部分，其主链也不是该复杂性的一部分，例如在PNA中。
“INA”表示依照WO 03/051901、WO 03/052132、WO 03/052133 和WO 03/052134(Human Genetic Signatures Pty Ltd)中的教导的嵌入性 核酸，其均以引用的方式并入本文中。INA是含有一个或者多个嵌入性假核 苷酸(IPN)分子的寡核苷酸或者寡核苷酸类似物。
“HNA”表示核酸例如由Van Aetschot et al.，1995所描述的。
“MNA”表示核酸例如由Hossain et al，1998所描述的。
“ANA”指由Allert et al，1999所描述的核酸。
“LNA”可以为任何LNA分子，如在WO 99/14226(Exiqon)中所描述的。 优选地，LNA选自WO 99/14226的摘要中所描述的分子。更优选地，LNA 是如Singh et al，1998、Koshkin et al，1998或Obika et al.，1997中所描述的核 酸。
“PNA”指的是肽核酸，例如由Nielsen et al，1991所描述的。
复杂性降低是根据探针长度和基因座上下游链的不同探针序列来定 义的，其原则是适用于不同结构或不同分子环境中修饰的探针和引物的 一个相对术语。INAs的实例阐明了这种相对性。INAs相对于标准寡核苷 酸探针的显著优点是INAs可以比常规寡核苷酸更短，其仍然可以实现相 同的杂交结果(INA长度＜寡核苷酸长度)。这是由于INA对互补DNA 具有高亲和力，其高亲和力是由于作为INAs的结构组分的嵌入性假核苷 酸(Intercalating Pseudo Nucleotides，IPN)。因此如果需要具有特定数量 IPNs的长度为X个核苷酸的INA来实现与未转化的基因组的成功且特异 性的杂交，那么在相同的分子条件下仍然需要长度大于X的INA与亚硫 酸氢盐转化的基因组中的相同基因座杂交。
也需要特别重要指明的是对于宿主与病原体的相互作用(在相同临 床样品中病毒和宿主基因组共存，但是具有显著不同的浓度)中，“复杂 性降低”和INAs的使用将新的有利条件引入到杂交方案中，尤其是由于 INAs优先杂交于富含AT的核酸序列。例如，在未转化HPV DNA的纯 溶液中，找到并与7904个碱基的HPV16基因组的独特基因座杂交所需 要的病毒探针或引物的大概长度大约是6-mer探针/引物(46等于4096个 碱基)。亚硫酸氢盐处理产生富含T的HPV衍生物之后，现在需要约8-mer 探针或引物以在相同分子条件下找到该独特位置(38等于6561个碱基)。
然而，当样品中最初存在两个大小显著不等的基因组时，例如7904 个碱基对的HPV基因组和约3,000,000,000个碱基对的人类基因组，并且 这两个基因组都‘复杂性降低’到它们各自的衍生物时，独特病毒序列 的探针或引物现在与溶液中它们的衍生物靶标相杂交，其中溶液中富含T 的人类衍生物占压倒性的多数。例如，如果样品中每个人类衍生物都存 在一个HPV衍生物，那么病毒探针或引物将与3,000,007,904个碱基对的 衍生物杂交。因此现在对于独特病毒序列的分析需要约14-mer探针或引 物以避免在人类序列中新产生的病毒诱饵基因座发出杂交信号。
除了包含探针和引物长度的“复杂性降低”的内容以外，当PCR反 应中所使用的简并引物数量适中时，杂交动力学的变化和检测PCR产物 的能力也是重要的。由于HPV型间存在广泛的基因组变异，所以先前扩 增技术需要使用大量的简并引物来产生相应扩增的核酸产物或来自多重 PCR反应的扩增子。然而，探针/引物库的简并性越大，溶液中任何个体 有关的探针或引物的浓度就越低。上述情况与对复杂真核基因组所实施 的驱动-示踪物反应(driver-tracer reactions)中杂交的动力学和保真性相 似，其于1966年被首次引入到科学文献中，见Waring，M.&Britten R.J. Science，154，791-794；and in 1968 by Britten，R.J and Kohne D E.，Science， 161，529-540，(本文中的早期参考来自the Carnegie Institution of Washington Yearbook reports)。
另外，当HPV PCR引物相对于人类衍生物为高浓度时，杂交反应中 的优势力量是HPV引物。例如，如果样品中病毒负荷高(数量级是100,000 个HPV基因组至单个人类基因组)，如果每个人类衍生物仅有一个HPV 衍生物，那么病毒引物的杂交动力学将比其快100,000倍。在前种情况中， 溶液中病毒组分的行为就如同该组分是基因组中高度重复的组分。然而， 为了利用单一PCR反应检测临床样品中不同风险的不同HPV类型，通 常需要每种HPV类型的不同引物，所述每种HPV类型必需使用简并引 物。最终结果是引物群在混合的正常基因组的常规多重PCR反应中可能 会组合性交叉。可能确实存在数千个不同的引物来竞争杂交位点，其最 终结果是PCR扩增的失败，或扩增的核酸产物的分布严重偏向存在于样 品中的特定的HPV类型。其对于从存在常规的未转化的基因组的临床样 品中产生数据提出了一个主要问题。
本发明的“复杂性降低”，其与INA探针和引物的选择使用相组合， 其克服了许多这些现有技术问题的困难。
引物和复杂性降低
应注意的是复杂性降低依赖于已转化的分子群(衍生物)是否保持转 化状态或是否经受了进一步扩展而有所不同。在上文所讨论的实例中， 衍生物群如同其存在于临床样品中一样保持未扩增。回想到上游链(5’ GGGGAAATTC 3’)(SEQ ID NO：78)和下游链(5’GAATTTCCCC 3’) (SEQ ID NO：79)分别转化成5’GGGGAAATTU 3’(SEQ ID NO：80)和5’ GAATTTUUUU 3’(SEQ ID NO：81)。由于胞嘧啶转化为尿嘧啶，而尿嘧 啶在DNA聚合酶体外转体内的机制识别方面与胸腺嘧啶相当，所以其上 游链衍生物基本上是5’GGGGAAATTT 3’(SEQ ID NO：82)，其下游链衍 生物是5’GAATTTTTTT 3’(SEQ ID NO：83)。然而，如果现在将衍生物 群通过酶学方法体外转体内进行复制，那么将随之产生四种不同的衍生 物群，它们是[5’GGGGAAATTT 3’(SEQ ID NO：82)]、[5’AAATTTCCCC 3’(SEQ ID NO：84)]、[5’AAAAAAATTC 3’(SEQ ID NO：85)]和[5′ GAATTTTTTT 3’(SEQ ID NO：86)]。这些衍生物确实都是复杂性降低的， 但未与转化后立即存在的原始的未复制的衍生物降低至相同的程度。因 此当PCR引物是针对原始的未复制的衍生物的链时，由于针对上游或下 游链的引物的选择将会影响该结果，因此有必要明确地决定哪个是人们 希望观察到的扩增核酸产物。处理构成转化基因组的产物的两个非互补 的衍生物群与处理复制后存在的四个衍生物群的差别直觉上是不清楚 的，但是可能对引物的设计具有重要意义。
最后，较长探针或引物的问题，其早期被引入是为了将“复杂性降 低”形式化和定量化，只是假定当寻找分子衍生物群中独特序列时的相 关性。然而本发明的重要基础可能是病毒型间具有最大相似性的衍生物 基因座的选择，必要时其允许在一个初次检查中测定所有病毒型。依赖 于是否选择上游或下游链衍生物，这些所选的基因座可能有所不同，并 且与下游链相比，这些基因座将会在上游链的不同区域。
由于通过利用本发明中HGS亚硫酸氢盐处理的转化而产生具有更高 序列相似性的基因座，在衍生物群中需要较长探针和引物的实际重要性 为病毒检测所获得的实际优势所掩盖，其也被比常规寡核苷酸需要更短 的探针和引物分子的INAs的选择使用所掩盖。另外，将巢式PCR法应 用于衍生物群需要两条引物在相同的邻近位置结合以产生扩增的核酸产 物。如果其中一条PCR引物与靶标邻近位置以外的诱饵基因座具有序列 相似性，那么该引物对的其它成员在相同的非靶标区域附近也具有诱饵 基因座是不可能的。该巢式PCR法的内引物在与第一轮引物相同的非靶 标区域再次具有诱饵基因座，是更不可能的。假扩增的可能性是非常不 可能的。
如在本文中所使用的术语“病毒特异性的核酸分子”意思是已经确定或 获得的分子，其具有一个或多个对病毒或病毒型具特异性的序列。
如在本文中所使用的术语“病毒的分类水平”包括型、亚型、变异体和 基因型。识别病毒基因组的流动性。不同的病毒群可能对单个核苷酸的 改变是多态性的，或是如果它们存在于正常DNA修复过程不再起作用的 某些癌细胞中，则可能是高或低可突变性。
如在本文中所使用的术语“病毒特异性的核酸分子”意思是存在于处理 或转化的病毒DNA中特异性的核酸分子，其是该病毒或病毒型的指示。
如在本文中所使用的术语“病毒型”是指任何现有的或新的病毒群， 其与以前分离且表征的病毒型的序列相似性小于90％。
如在本文中所使用的术语“病毒亚型”是指任何现有的或新的病毒 群，相对于以前的病毒亚型其序列相似性范围在90-98％之间。
如在本文中所使用的术语“病毒变异体”是指任何存在的或新的病 毒群，其中序列相似性是以前变体的98-100％之间。
如在本文中所使用的术语“HPV基因型”如下。基因型是任何完全 测序的HPV基因组，其与任何其它完全测序的HPV基因组有最少为一 个碱基的差别，其包括单个碱基是否以G、A、T或C中任一个存在，或 者在标准参照(即HPV16从位置1至位置7904)中特定位置的碱基是否通 过缺失、添加、扩增或转座到其它位置而发生改变。本发明人采用现有 技术BLAST法对所有其它HPV基因型与标准HPV16进行了比较。
如在本文中所使用的术语“HPV特异的核酸分子”意思是存在于处 理或转化的病毒DNA中的特异性的核酸分子，其可能是该病毒或病毒型 的指示。
如在本文中所使用的术语“HPV型”是指任何存在的或新的HPV群， 其与以前分离且表征的HPV型的序列相似性小于90％(1993，Van Rast，M. A.，et al.，Papillomavirus Rep，4，61-65；1998，Southern，S.A.and Herrington，C.S.，Sex.Transm.Inf.74，101-109)。
如在本文中所使用的术语“HPV亚型”是指任何现有的或新的HPV 群，其中相对于以前的亚型其序列相似性在90-98％范围内(1993，Van Rast，M.A.，et al.，Papillomavirus Rep，4，61-65；1998，Southern，S.A.and Herrington，C.S.，Sex.Transm.Inf.74，101-109)。
如在本文中所使用的术语“HPV变体”是指任何现有的或新的HPV 群，其中序列相似性为以前的变异体的98-100％之间(1993，Van Rast，M. A.，et al.，Papillomavirus Rep，4，61-65；1998，Southern，A.and Herrington， C.S.Sex.Transm.Inf.74，101-109)。
如在本文中所使用的术语“HPV基因型”如下。基因型是任何完全 测序的HPV基因组，其与任何其它完全测序的HPV基因组有最少为一 个碱基的差别，其包括单个碱基是否以G、A、T或C中任一个存在，或 者在标准参照中(即HPV16从位置1至位置7904)特定位置的碱基是否通 过缺失、添加、扩增或转座到其它位置而发生改变。本发明人采用现有 技术BLAST法对所有其它HPV基因型与标准HPV16进行了比较。
表1提供了从患者液基细胞学样品中产生HPV特异性产物的寡核苷 酸引物的列表。所有引物均针对不同HPV型的上游链衍生物。这些引物 的名称如下：
HPV型特异衍生物的区域引物编号如下列的每个设计。
例如首行说明了在E7衍生物区域中HPV16的引物#1。名称HPV-Uni 和HPV-HM代表简并寡核苷酸引物。非标准名称参见以前的定义。
表1
名称 序列 SEQ ID NO：
HPV16-E7-1 TATGTATGGAGATATATTTATATTGT 1
HPV16-E7-2 GTTATGAGTAATTAAATGATAGTTT 2
HPV16-E7-3 TAAAACACACAATTCCTAATATAC 3
HPV16-E7-4 CCCATTAATACCTACAAAATCAAC 4
HPV16-E6-1 GAAAGTTATTATAGTTATGTATAGAGT 5
HPV16-E6-2 ATTAGAATGTGTGTATTGTAAGTAAT 6
HPV16-E6-3 ACTACAATATAAATATATCTCCATAC 7
HPV16-E6-4 AAACTATCATTTAATTACTCATAAC 8
HPV16-E4-1 GAATATATTTTGTGTAGTTTAAAGATGATGT 9
HPV16-E4-2 GTTTTATATTTGTGTTTAGTAGT 10
HPV16-E4-3 CCTTTTAAATATACTATAAATATAATATTAC 11
HPV16-E4-4 CACACAATATACAATATACAATAC 12
HPV18-E7-1 GTATGGATTTAAGGTAATATTGTAAGAT 13
HPV18-E7-2 GTATTTAGAGTTTTAAAATGAAATTT 14
HPV18-E7-3 AACACACAAAAAACAAAATATTC 15
HPV18-E7-4 ACCATTATTACTTACTACTAAAATAC 16
HPV18-E6-1 GATAGTATATAGTATGTTGTATGTT 17
HPV18-E6-2 ATTTAGATTTTGTGTATGGAGATAT 18
HPV18-E6-3 ATCTTACAATATTACCTTAAATCCATAC 19
HPV18-E6-4 AAATTTCATTTTAAAACTCTAAATAC 20
HPV18-E4-1 GGGAATATAGGTAAGTGGGAAGTAT 21
HPV18-E4-2 GATTGTAATGATTTTATGTGTAGTATT 22
HPV18-E4-3 AAATAATATATCTCTATAATAATC 23
HPV18-E4-4 TTCATTACCTACACCTATCCAATACC 24
HPV56-E7-1 GATTTATAGTGTAATGAGTAATTGGATAGT 25
HPV56-E7-2 GGTTATAGTAAGTTAGATAAGT 26
HPV56-E7-3 TCCCCATCTATACCTTCAAATAAC 27
HPV56-E7-4 CCTATTTTTTTTTCTACAATTAC 28
HPV31-E7-1 GTAATTGATTTTTATTGTTATGAGT 29
HPV31-E7-2 GTTATAGATAGTTTAGTTGGATAAGT 30
HPV31-E7-3 CTAAATCAACCATTATAATTACAATC 31
HPV31-E7-4 CCTATCTATCTATCAATTACTAC 32
名称 序列 SEQ ID NO：
HPV33-E7-1 TTTTGTATATGGAAATATATTAGAAT 33
HPV33-E7-2 TAGGTGTATTATATGTTAAAGATT 34
HPV33-E7-3 CCTCATCTAAACTATCACTTAATTAC 35
HPV33-E7-4 TAACTAATTATACTTATCCATCTAAC 36
HPV35-E7-1 AAATAATGTAATAAATAGTTATGTT 37
HPV35-E7-2 GTTGTGTTTAGTTGAAAAGTAAAGAT 38
HPV35-E7-3 CCATATATATACTCTATACACACAAAC 39
HPV35-E7-4 AAACACACTATTCCAAATATAC 40
HPV39-E7-1 TTAAAGTTTATTTTGTAGGAAATTG 41
HPV39-E7-2 GATTTATGTTTTTATAATGAAATATAGT 42
HPV39-E7-3 CTAATAAATCCATAAACAACTAC 43
HPV39-E7-4 CATAACAAATTACTAATTTACATTTAC 44
HPV58-E7-1 TATTTTGAATTAATTGATTTATTTTGT 45
HPV58-E7-2 ATGAGTAATTATGTGATAGTTT 46
HPV58-E7-3 ATACATATACCCATAAACAACTAC 47
HPV58-E7-4 TTATTACTATACACAACTAAAAC 48
HPV6-E7-1 GATATTTTGATTATGTTGGATATGT 49
HPV6-E7-2 GTTGAAGAAGAAATTAAATAAGAT 50
HPV6-E7-3 TACTATCACATCCACAACAACAAATC 51
HPV6-E7-4 CTCTAATATCTATTTCTATACACTAC 52
HPV11-E7-1 GTTATGAGTAATTAGAAGATAGT 53
HPV11-E7-2 ATTATTAAATATTGATTTGTTGT 54
HPV11-E7-3 ATACCTATAATATACTCTACTATAAC 55
HPV11-E7-4 CAAAATTTTATATAATATACCTATC 56
HPV42-E7-1 GTATATAGTGGAGAAAGAAATTGGAT 57
HPV42-E7-2 GAATAATAAATTAGATGTGTTTTGTGTT 58
HPV42-E7-3 CCAATTATTCATAACAATACAAATC 59
HPV42-E7-4 ACTTAATCATCTTCATCTAAAC 60
HPV53-E7-1 TAGTGTAYGGGGTTAGTTTGGAAGT 61
HPV53-E7-2 ATTTGATTTATTAATAAGGTGT 62
HPV53-E7-3 CTATAATATATTATAAAAATATTAATAC 63
HPV53-E7-4 CAATTACTCATAACATTACAAATC 64
名称 序列 SEQ ID NO：
HPV-Uni-1 GATGGKGATATGRTDSATRTWGGDTWTGG 65
HPV-Uni-2 TAARTATTTWGATTATWTDDRAATG 66
HPV-Uni-3 TATTWTAWCCYTAHRCHYWHTAHAACCA 67
AMAAAHAMHTAATTHYHMMAACAWAYAC 68
HPV-Uni-4 C
HPV-HM-1 GATTTDKWDTGTWATGAGTAATT 69
HPV-HML-1 GRKTTDKWDTGTWRKGARTAATT 70
HPV-HM-2 RRYRRKTTAGABGADGA 71
HPV-HML-2 RRHRRKTTWGANKWDGA 72
HPV-HM-3 YDATACCTWCWMAWWHVDCCAT 73
HPV-HML-3 YDATACCTWHWHHDWHNDCCAT 74
HPV-HML-4 ACHHHAAACCAHCCHHWACAHCC 75
病毒测定
本发明的测定法第一部分中所采用的病毒检测也可以与其它类型非常 不同的测定法相组合，它们分别是用于评价细胞群内已发生变化的细胞状态 的测定法，用于通过感染细胞内紊乱的代谢组学、蛋白质组学、代谢物或代 谢组学网络所支撑的风险评估的测定法，和用于监测感染进程和评价治疗方 案例如抗病毒疗法的测定法。
例如，测量病毒特异性核酸分子的分子测定法可以与下列测定法相组 合：
-利用模式识别和高通量自动成像技术例如用于组织切片中荧光信号 自动定量的多表位配体制图系统(Multi-Epitope-Ligand-Kartographie，MELK) 的测定法，
-利用光学显微镜、共焦显微镜或透射电镜分析的测定法，用于荧 光原位杂交(FISH)、检测细胞内染色体紊乱例如非整倍性或异常细胞器 (数目、类型或形态外观等方面)的总体水平的细胞学或组织学测定法。
-利用核酸或多肽适体(aptamers)的测定法；Spiegelmers(镜像高亲和 力寡核苷酸配体)测定法；多色纳米晶体(量子点生物结合物)测定法，用 于细胞表面或内部组分的分子或生物标记的超敏感非同位素检测；包含 通过指数级富集(Exponential Enrichment)的配体系统进化技术(Systematic Evolution of Ligands，SELEX)以及针对不同细胞组分的高亲和力适配子 配体的组合化学方法。
-利用细胞的激光捕获或免疫磁性富集技术或者与流式细胞仪配套 使用的基于微球的技术或者包含不同核酸或肽/蛋白质的胶体悬浮系统的 光学条形码的测定法。
-利用用于检测总体基因组不平衡性例如复制、缺失、转座、重排 的单细胞比较基因组杂交及其相关的原位技术的测定法。
-报告转录组调节的测定法，例如robogenomic微阵列技术 (robogenomic microarray technologies)，包括基因表达系列分析(Serial Analysis of Gene Expression，SAGE)、全数基因表达分析(Total Gene Expression Analyses，TOGA)、随机顺序可寻址的高密度光纤传感器阵列、 在微球上应用的大规模平行测序(Massively Parallel Signature Sequencing， MPSS)。
-报告蛋白质组调节的测定法，其采用各种技术，包括通过蛋白芯 片细胞分析、基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱法(matrix Assisted Laser Desorption lonization-Time of Flight，MALDI-TOF)、傅里叶变换离 子回旋共振质谱法(Fourier Transformed lon Cyclotron Resonance Mass Spectrometry，FTICR)、液质联用质谱(LC MS-MS)和快速蒸发冷却质谱 (Rapid Evaaporative cooling Mass Spectrometry，RapEvap MS)，
-利用检测水平达到zeptomole(10-21)敏感性的多光子检测技术 (Multi Photon Dection，MPD)的测定法，
-利用访问临床样品来源的细胞的甲基化谱的甲基化谱技术来确定 沿着从常态到宫颈癌的特定轨道的细胞群的位置的测定法；优选地来确 定病毒感染细胞或招募到感染或炎症位置的免疫细胞中基因组座改变的 甲基化特征。
以前曾评价过上述一些技术(2001，Miklos and Maleszka，Proteomics， 1，30-41)。
数据收集、整合和管理系统
与本发明有关的公开材料的数据收集和处理系统可以与临床患者数 据相组合，并采用专业化的算法进行分析。自动平台管理和数据收集可 以自动化存储，而且所收集的数据可以与信息基础和软件工具相组合， 其与基因本体论(gene ontologies，GO)配合使用，正如国家图书馆医学主 题词表(National Library of Medicines’s Medical Subject Headings，MeSH)、 孟德尔人类遗传学数据库(Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM)或 例如人类基因突变数据库(Human Genome Mutation Database，HGMD)或 PubMed等知识数据库举例说明的与疾病本体论配合使用一样。软件管线 与最新的人类基因组集合相配合，并且提供从例如基因库(Genbank)和 RefSeq等资源来源的信息的访问和下载，其可以与报告HPV感染细胞的 基因组状态或由于体内其它部位存在的HPV而被细胞所影响的基因组状 态的测定法组合使用。
例如，整合了HPV数据与临床和相关的生物信息学数据的数据库基 础可以利用松散耦合的模块架构，其可以促进更好的软件工程和数据库 管理。关系型数据库管理系统(relational database management system， RDBMS)(例如Postgresql 7.3版)是开放源和鲁棒(robust)，而且作为部分 整合系统的一个范例来评价和更好地预测HPV领域的临床结果。包括基 于网络的图形用户界面(Graphical User Interfaces，GUI)的附加特征可以 将整合的细胞学和组织学分析与分子HPV数据库连同通过不同形式获得 的治疗和药用数据相组合。用于图像分析的增强的数字技术、病理学家 的远程图像共享和自动可视化系统的整合被看作自动分子试剂盒平台的 整合部分。
细胞取样
病毒检测方案可以用于在机体任何部分来源的样品上进行，包括前 胚泡期、胚胎组织、围产期材料、尸体或法医来源的样品。优选地，样 品来自宫颈阴道部例如宫颈和阴道，但是也可以可能来自表皮。优选地， 样品来自宫颈变性转化带(cervinal transformation zone)。上述样品可以使 用宫颈刷(CervexBrush)(Therapak Corp，Irwindale，CA，USA)、Digene宫 颈采样器宫颈刷(Digene Cervical sampler cervical brush)(Digene Corp. Gaitherburg，MD，USA)、塑料刮铲/刷组合(Cooper Instruments，Hollywood， FL，USA)来收集上述样品；或者使用涤纶拭子(Dacron swabs)或从男性和 女性患者肛门生殖器区域获得样品的任何适当的材料，或者通过任何标 准活组织检查方法例如针吸活组织检查(needle biopsy)检测。上述样品可 以置于各种培养基中，例如PreserveCyte，(Cytyc Corp.MA，USA)或来自 TriPath Imaging Burlington，NC，USA的AutoCyte PREP。优选地，采用 液基细胞学进行初次测试，但是平面平台例如石蜡切片和载玻片也是适 合的。
试剂盒
本发明可以以多种试剂盒或试剂盒组合的形式实施，并根据手动、 半自动或自动平台加以例示。在优选的形式中，MethyEasyTM或High Throught MethylEasyTM试剂盒(Human Genetic Signatures Pty Ltd， Australia)可以利用自动化平台例如EpMotion在96或384孔板中进行核 酸的转化。
人乳头瘤病毒(HPV)
成熟的人乳头瘤病毒DNA包裹在由两种病毒编码蛋白组成的二十 面体衣壳膜内。对于HPV16，其双链环状DNA基因组长度为7904个碱 基对，但是在普通的中度风险类型中其长度变化从HPV51的7808个碱 基对到HPV52的7924个碱基对。病毒基因组的这些区域以在环状分子 中存在的顺序列示于下文。该病毒有一个称为URR的非编码区，随后是 称为E6、E7、E1、E2、E4、E、L2和L1的许多编码区。某些病毒型 可能缺失功能性的E5区。E4区产生多种蛋白产物，这些蛋白产物可以 引起细胞质角蛋白网络紊乱而导致称为凹空细胞病(koilocytosis)的细胞 质“晕轮效应(halo effect)”。不同HPV型都是嗜上皮细胞的，其感染后 可以导致凹空细胞病、角化不良症(dyskeratosis)、多核化(multinucleation) 以及异常例如核增大和低度鳞状上皮内病变(low grade squamous intraepithelial Iesions，SILs)，所有上述变化只产生在宫颈。在宫颈癌中病 毒感染和染色体异常是相关的，但是在肿瘤中可以观察到多参数的改变， 其与病毒感染、病毒基因表达、病毒整合、细胞分化和基因组异常的关 系还了解甚少(1998，Southern，S.A.et al.，Sex Transm Inf.，74，101-109)。由于上述原 因，对不同病毒型及其在不同遗传背景中的不同效应进行检测是非常重 要的。
另外，尽管现有技术中承认HPV型指定为表皮和粘膜以及高-、中- 和低度风险范畴，但是这些范畴甚至在HPV的表皮和粘膜子范畴之间表 现出一些冲突和重叠。例如，HPV7与皮肤疣以及口腔病损有关。在泛发 性疣病和肛门生殖器损伤中已分离了HPV26。而且，尽管将HPV6和 HPV11分类为低风险型，但已从Buschke-Lowenstein瘤以及喉癌和外阴 癌(vulval carcinomas)和尖锐湿疣(condylomata acuminata)中分离到它们 (1986，Boshart，M.et al.，J.Virology，58，963-966；1992，Rubben，A.，et al.， J Gen Virol.，73，3147-3153)。
病毒整合到宿主基因组上导致E1和L1区之间的线性化，而保留 URR、E6和E7区，但是基因区例如E1、L1和L2缺失并且E2失活或 者缺失。在宫颈癌中通常保留E6和E7区，而E2蛋白没有表达。E2的 损伤与预后不良和存活率缩短有关。
患者样品
家庭医生利用Cytyc Corporation USA提供的宫颈取样装置从宫颈癌 表面收集细胞样品。患者同意收集的样品作为常规癌筛选计划的一部分 或作为以前宫颈疾病的监测实验。医生将上述细胞从收集装置转移到用 于保存细胞的甲醇/水溶液中，并运送到实验室用于检验。利用常规形态 学制剂来评价细胞样品由于癌前病变或病毒感染而引起的变化。单独的 等份细胞样品用于本说明书中所概述的DNA实验。
DNA提取
病毒DNA可以从任何适当的来源获得。实例包括，但不限于细胞培 养物、肉汤培养物、环境样品、临床样品、体液、液态样品、固态样品 例如组织。样品来源的病毒DNA可以通过标准方法获得。一个适当的石 蜡固定物质的提取实例如下：将目的样品置于400μl的7M盐酸胍、5mM EDTA、100mM Tris/HCI pH6.4、1％Triton-X-100、50mM蛋白酶 K(Sigma)、100μg/ml酵母tRNA中。用一次性1.5ml研棒彻底均质化样 品，并在60℃放置48小时。温育后，使样品经过5个干冰5分钟/95℃ 的冻/融循环5分钟。然后漩涡样品并在微型离心机离心2分钟使细胞碎 片沉淀。将上清移入干净管中并稀释以降低盐浓度，然后用苯酚-氯仿抽 提，乙醇沉淀并重悬浮于50μl10mM Tris/0.1mM EDTA中。
令人吃惊的是，本发明人发现没有必要将病毒DNA与其它来源的核 酸进行分离。上述处理步骤可以用于大量不同DNA类型的混合物，然而 病毒特异核酸仍然可以通过本发明进行鉴定。据估计，复杂DNA混合物 中的检测界限为标准PCR检测的界限，其可以低至靶病毒核酸分子的单 拷贝。
高通量HPV测定
本发明可以利用96孔板以高通量方式分步使用，96孔板中许多样品 可以同时进行HPV的测试。下列潜在的商品化试剂盒的说明书对其进行 了说明：
HPV高通量DNA亚硫酸氢盐处理试剂盒的目录
组分名称 含量 裂解缓冲液 1×1023ml 蛋白酶K 2×1×2ml 结合缓冲液 1×35ml 试剂1 1×20.8ml 试剂2 1×8g 洗脱缓冲液试剂3 1×725ml 试剂4 1×7ml 对照样品1 1×40μl 对照样品2 1×1620μl 对照引物3A和3B 2×40μl 纯化平板平板1： 孵育平板 1×96孔 洗涤平板2：转化平板 1×96孔 洗脱平板3：纯化平板 1×96孔 底部盖膜平板4：洗涤平板 1×盖膜(mat)96孔 密封膜平板5：洗脱平板 41×膜(film)96孔 密封帽 36×8帽材(cap strips) 平板6：高风险HPV引物平板 2×220μl 96孔
组分名称 含量 载体DNA平板7：HPV分型平板 18×100μl 96孔 HPV分型平板8：对照平板 82×96孔
注意.个体高风险分型引物组可从人类遗传标记控股有限公司 (Human Genetic Signatures)(咨询
注意：对照样品/引物1、2、3A和3B收到后应保持在-20℃。
所需的材料和设备(未提供)
■采用下列多头抽真空装置或者离心机：
96孔板多头抽真空装置，其带有在至少-10英寸汞柱(in Hg，4.9psi)的压 力下使用的泵。(利用Biorad Aurum多歧管进行室内测试，但是其它多歧 管可以改造使用。)
或者
离心机，其带有与高架式96孔板配套的转子。(利用Eppendorf5810进 行室内测试)。
■与96孔0.2ml低式平板配套使用的热盖PCR扩增仪
■与384孔板配套使用的热盖PCR扩增仪(用于HPV分型)
■80％异丙醇(分子生物学级)
■水(分子生物学级)
■氢氧化钠颗粒(分析级)
■2xPCR master-mix(Promega Cat#M75051000rxn)
■E-Gel System Mother E-BaseTM device(Invitrogen EB-M03)
■E-gels 96高通量2％琼脂糖(Invitrogen Cat#G7008-02)
■E-gel低分子量标准(Invitrogen Cat#12373031)
■试剂容器x5
标准实验室设备(未提供)
■1ml体积的多道移液器(200μl-1000μl)
■200μl体积的多道移液器(20μl-200μl)
■10μl体积的多道移液器(1μl-10μl)
■无尘纸巾
■计时器
■带滤芯吸头(10μl-1000μl)
■透射仪
■凝胶成像系统
■Glison P1000
■Glison P200
■Glison P20
方法
如果首次使用HPV高通量DNA亚硫酸氢盐处理试剂盒，强烈推荐 在进行亚硫酸氢盐转化法之前阅读用户指南中的详细方法。
使用HPV高通量DNA亚硫酸氢盐处理试剂盒在转化之前不需要预 先消化基因组DNA。
上述试剂盒优化了起始DNA的浓度从1ng到4μg的基因组DNA。
样品制备
■将总体积的试剂1与试剂2瓶组合，并且轻柔颠倒混匀。将组合试剂 置于72℃10分钟或直到完全溶解。
注意：试剂1和试剂2一经混合便可在4℃暗处稳定保存1个月。从 生产之日起，所有试剂在室温下可稳定保存1年。
■实验开始前，将结合缓冲液在72℃烘箱或培养箱中放置1小时。
■每次新鲜配置0.3M NaOH溶液(例如0.6克NaOH/50.0ml水)
■将纯化平板置于洗涤平板顶部
■将5μL对照样品1加入495μL水(分子生物级)中，并且平行处理实验 样品。对照样品1含有未转化HPV模板，其作为过程对照(process control)和敏感性对照。其应该置于孔H10内。
■总是进行“无DNA对照”，其中用其余实验样品处理500μL水，其 应当置于孔H11。
■用手剧烈振荡液基样品(PreservCyt)以使任何沉淀细胞重悬并保证样 品充分混匀。
■将300μL重悬细胞转移至纯化平板/洗涤平板套装的适当的孔中(不使 用孔H10、H11或H12)。详细记录样品放置于哪一个孔。
实验方案
●将纯化平板/洗涤平板套装以2000xrcf离心1min，丢掉流动 的液体部分。注意不要丢掉洗涤平板。
●用底部盖膜密封纯化平板出口，确保所有出口完全密封。确保 盖膜的切角与纯化平板切角始终成直线。
●将2ml蛋白酶K加入裂解缓冲液并且颠倒混匀。
●纯化平板每孔加入100μL裂解缓冲液(使用12道移液器)。
●取10.5ml结合缓冲液放到新管中并且加入100μL载体DNA。 颠倒混匀并且向纯化平板的每孔中加入100μL结合缓冲液(使用12 道移液器)，然后用提供的平板封口膜密封纯化平板顶部。
●55℃孵育60分钟。
●小心地去掉纯化平板上的底部盖膜，并且将纯化平板迅速放置 在洗涤平板的上面。去掉纯化平板的封口膜，然后以2000xrcf离 心1分钟，丢掉流动的液体部分。注意不要丢掉洗涤平板。
●更换纯化平板的底部盖膜。
●向转化平板的每孔中加入50μL新鲜配置的0.3M NaOH溶液， 用新鲜的封口膜(提供的)密封纯化平板上部。
●55℃温育15分钟。
●去掉封口膜并且使用多道移液器向转化平板的每孔中加入 220μL经组合的试剂1和试剂2，用新鲜的封口膜(提供的)密封纯化 平板的顶部。
●转化平板在55℃温育3小时。
●温育后，去掉封口膜并向转化平板的每孔中加入240μL结合缓 冲液(参考重要实验方法制备)，用移液器混合，并用新鲜的封口膜 (提供的)密封纯化平板顶部。
●小心地从纯化平板去掉底部盖膜，并且将纯化平板迅速置于洗 涤平板上面。
●去掉封口膜，2000xrcf离心1分钟，丢掉流动的液体部分。
●向每孔加入200μL 80％异丙醇，室温2000xrcf离心1分钟。
●去掉洗涤平板，丢掉流动的液体部分，然后室温2000xrcf离 心1分钟。
●丢掉洗涤平板，将纯化平板置于洗脱平板的上面以确保纯化平 板的顶与洗脱平板正确对齐。平板在室温下放置5分钟。
●采用多道移液器向纯化平板的每个样品孔中加入30μL洗脱缓 冲液，移液器吸头靠近膜表面但不要接触。
●室温温育1分钟。
●重复上述步骤一次，总洗脱体积达到60μL。
●室温1000xrcf将纯化平板/洗脱平板组合体离心1分钟。
●去掉洗脱平板并用提供的密封帽密封。
●将平板置于热盖热循环仪的热盖PCR仪，95℃温育30分钟。
去掉密封帽前进行短暂离心。
■用手剧烈振荡液基样品(PreservCyt(R))以使任何沉淀细胞重悬并且保 证溶液均质。
■将4ml重悬的细胞转移到15ml Costar离心管。如果培养基小于4ml， 则将全部材料转移到15ml Costar离心管并且补充无菌蒸馏水使体积 达到4ml。精确测试需要至少1ml体积的样品。
■将上述离心管在吊桶式转头中3000xg离心15分钟。
■小心地倾倒上清，不要使沉淀细胞悬起。
■用200μL裂解缓冲液将沉淀的细胞重悬，充分混合直到溶液均质。
■向温育平板的每孔中加入20μL蛋白酶K并进行温育。
■将80μL样品转移到密封帽覆盖的孵育平板(平板1)并且在55℃温育1 小时。
实验方案准备
■将总体积的试剂1与试剂2瓶组合，并且轻柔颠倒混匀。注意：试剂 1和试剂2一经混合便可在4℃暗处稳定保存1个月。从生产之日起， 试剂1、2、3和4在室温下可稳定保存1年。
■每次新鲜配置NaOH溶液(例如1克NaOH/8.3ml水)，而且向转化平 板(平板2)的每孔中加入5μL。
■将5μL对照样品1加入15μL水(分子生物级)中，平行处理测试样品。
■将20μL细胞裂解物转移到转化平板(平板2)并且轻柔混匀。
■用提供的封口膜将转化平板(平板2)密封，并且在37℃烘箱中温育15 分钟。温育后，在去掉封口膜之前将平板短暂离心以在膜上沉淀任何 凝结(condensation)。
■用提供的密封帽将孵育平板(平板1)密封，-20℃保存。
■确保试剂3没有形成固体沉淀。如果有沉淀，则将该溶液加热(不超过 80℃)并且混匀。
离心方案
■用多道移液器向转化平板(平板2)的每孔中加入220μL组合的试剂1 和试剂2，然后用移液器轻柔混匀，并用提供的8条密封帽密封该平 板。
■将转化平板(平板2)在55℃烘箱中温育3小时。
亚硫酸氢盐处理可能进行至少1小时，然而，减少孵育时间可能会导致 扩增子中局部的非转化(non-conversion)。因此不推荐小于3小时的温育 时间。
■温育后，向转化平板(平板2)的每孔中加入240μL试剂3(参考重要方 案制备)。
■将纯化平板(平板3)置于洗涤平板(平板4)的上面。
■将样品从转化平板(平板2)转移到纯化平板(平板3)对应的孔，并且用 提供的封口膜密封。
■将纯化平板(平板3)/洗涤平板(平板4)组合体放入离心机，以1,000rcf 室温离心4-5分钟。
■从洗涤平板(平板4)上丢掉流动的液体部分，然后再将其置于纯化平板 (平板3)的下面。向纯化平板(平板3)的每孔中加入0.8ml 80％异丙醇 (分子生物学级)。
■1,000rcf室温离心1分钟。
■去掉洗涤平板(平板4)，丢掉流动的液体部分，然后再以1,000rcf室温 离心2分钟。
■将纯化平板(平板3)置于洗脱平板(平板5)的上面以确保纯化平板(平板 3)的顶位于洗脱平板(平板5)适当的孔中。
■用多道移液器向纯化平板(平板3)的每个样品孔中加入50μL试剂4， 移液器吸头靠近膜表面但不要与之接触。
■室温温育1-2分钟。
■将纯化平板(平板3)/洗脱平板(平板5)组合体以1,000rcf室温离心1分 钟。
■去掉洗脱平板(平板5)，并用提供的密封帽密封。
■将平板置于热盖PCR仪中95℃温育30分钟。
现在已将DNA样品经转化并且准备进行PCR扩增。温育后，将平板短 暂离心以去掉密封帽上的任何凝结。
内部对照PCR反应
提供有基因组DNA和对照PCR引物用于简单故障的排除。提供有 对照样品1(紫色)和2(绿色)用于过程控制。对照样品1是提供的足够用 于8个转化反应的未处理的DNA。对照样品2是提供的足够用于20个 PCR扩增的亚硫酸氢盐处理的DNA。对照引物3A(黄色)和3B(红色)是 PCR引物，其可以用于检查回收的DNA的完整性(提供的足够用于20个 PCR扩增)。
巢式PCR引物可以用来进一步提高检测的敏感性，其用HPV高通量 DNA亚硫酸氢盐修饰试剂盒来实现。对照引物是常规亚硫酸氢盐PCR引 物而且已进行了优化供用于两轮的PCR扩增。由于在大多数情况下琼脂 糖凝胶电泳以后没有可见的扩增子条带，因此不推荐将这些PCR引物用 于单轮PCR。
注意：上述方案是基于热盖热循环仪的使用。如果没有热盖热循环 仪，外罩会与矿物油反应。
对照反应
■对照样品1(紫色)含有未处理的HPV基因组DNA(50ng/μl)
■对照样品2(绿色)含有亚硫酸氢盐处理的HPV人DNA(20ng/μl)
■对照引物3A(黄色)含有第一轮PCR引物
■对照引物3B(红色)含有第二轮PCR引物
对照PCR
对照引物3A(第一轮PCR引物)和对照引物3B(第二轮PCR引物)是 有效的巢式引物，其提供有足够用于最多20个对照PCR反应的量。必 要时可提供这些引物样品用于加快故障检查过程，而且其也可以用于估 计你的修饰的DNA的量。
注意：第二轮PCR反应可以与第一轮PCR反应同时准备并且冷冻直到需 要时。
高风险PCR扩增
第一轮扩增
■对于每个反应，向提供的高风险PCR平板上加入12.5μl PCR Master Mix(例如Promega Master Mix)和9.5μl水(分子生物学级)。如果你将准 备96个样品，那么在适当的管中将1.25ml Master mix和850μl水以及 200μl引物混合物组合并且充分混合。然后用多道移液器向提供的高 风险HPV平板(平板6)的每孔中加入23μl反应混合物。
■向适当的孔对照孔H10和H11中加入2μl对照引物3A。
■将2μl所需的修饰DNA从洗脱平板(平板5)加到提供的高风险HPV平 板(平板6)，并且将2μl对照样品2加入孔H11，然后将其余的保存于 -20℃用于随后的HPV分型(参见下文的高风险平板设计)。
■运行下列PCR程序。
95℃/3min 1个循环 95℃/1min 42℃/2min 60℃/2min 30个循环
65℃/10min 1个循环
第二轮扩增
■将2μl第一轮扩增的DNA加入到第二轮混合物中，与第一轮扩增所准 备的完全相同。
■运行下列PCR程序
95℃/3min 1个循环 95℃/1min 42℃/2min 60℃/2min 30个循环 60℃/10min 1个循环
电泳
■从铝箔包装中取出96孔2％E-凝胶并且去掉红色的96孔梳子。
■用多道移液器将10μl无菌水加入凝胶的每个孔中。
■将10μl DNA标记加入标记孔中。
■用多道移液器将10μl扩增产物转移到E-凝胶的每孔中。
■设定E-base 5-7分钟，并且按pwr/prg。
■利用紫外透射仪和凝胶成像软件记录结果。
HPY分型
第一轮扩增
高风险分型平板(平板8)含有针对下列高风险HPV型的菌株特异引 性物：16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59和68。洗脱 平板(平板5)上保留足够量的DNA用于每个样品的所有高风险菌株的分 型。
■从-20℃冰箱取出洗脱平板(平板5)。
■高风险通用扩增为阳性的任何样品现在可利用菌株特异性引物进行分 型(参见下文分型平板设置)。
■对于每个反应，向提供的PCR平板每孔中加入12.5μl PCR Master Mix(例如Promega Master Mix)和8.5μl水。如果你有6个样品需要分 型，那么向适当的管中加入1187.5μl Master mix和807.5μl水并且充 分混合。然后如下文所说明的，向HPV分型平板(平板7)的每孔中加 入21μl混合物。
■如下文所说明的，向每孔中加入2μl适当的引物。
■如果在384孔板中进行分型并且有24个样品需要分型，则向适当的管 中加入4.5ml Master mix和3.42ml水，充分混合，然后如下文所说明 的，向384孔板每孔中加入21μl混合物。然后如下文所说明的，将 2μl适合的引物加入每孔中。
■向分型平板适当的孔中加入2μl高风险阳性样品(来自洗脱平板，平板 5)。
■准备足够的管用于你的每个样品以及“无模板”(阴性)对照。
■运行下列PCR程序。
95℃/3min 1个循环 95℃/1min 45℃/2min 65℃/2min 30个循环 65℃/10min 1个循环
第二轮扩增
■将2μl第一轮扩增的DNA加入到第二轮混合物中，与第一轮扩增所准 备的完全相同。
■运行下列PCR程序
95℃/3min 1个循环 95℃/1min 45℃/2min 30个循环
65℃/2min 65℃/10min 1个循环
电泳
■从铝箔包装中取出96孔2％E-凝胶并且去掉红色的96孔梳子。
■用多道移液器将10μl无菌水加入到凝胶的每个孔中。
■将10μl DNA标记加到标记孔中。
■用多道移液器将10μl扩增产物转移到E-凝胶的每孔中。
■设定E-base 5-7分钟，并且按run。
■利用紫外透射仪和凝胶成像软件记录结果。
■现在样品进行了分型。
故障排除
亚硫酸氢盐处理的样品来源的HPV DNA，当采用基因组简化引物进 行扩增时，引物不论是寡核苷酸还是修饰的核酸例如INAs，其都为发现 样品中任何型的HPV提供了非常卓越的检测系统，其可以是人临床资料 来源的样品或是另一极端的环境来源。由于临床相关病毒(HPV)被认为是 人类癌症的原因，本发明因而得到发展。
依据本发明的检测测定法的实际意义是可变的。虽然利用PCR扩增 已证明上文所详细描述的原则，但是可以利用本领域已知的任何方法进 行资料解析。当前人们以微阵列检测系统为重点利用基因组简化引物能 够实现多种HPV的检测，由于亚硫酸氢盐处理降低了基因组的复杂性， 因此可以在有更少数量检测器的微阵列上实现更多型HPV的检测(特 点)。
总之，HGS基因组简化引物法产生了与许多患者的临床表型相关的 一致性的数据。
亚硫酸氢盐处理
以下列出了一个有效的亚硫酸氢盐处理核酸的示例性方案。该方案 可以保留基本上全部处理的DNA。本文中该方法也被称为人类遗传印记 (Human Genetic Signatures，HGS))法。应了解样品或试剂的体积或量可以 变化。
优选的亚硫酸氢盐处理方法可以在人类遗传标记控股有限公司 (Human Gnetic Sgnatures Pty Ltd)为申请人的US 10/428310或 WO 2004/096825(PCT/AU2004/000549)中查到，二者以引用的方式并入 本文中。
对于2μg DNA，如果需要可以用适当的限制性酶进行预消化，以20μl 的终体积加入2μl(1/10体积)的3M NaOH(6g/50ml水，新鲜制备)。该 步骤将双链DNA分子变性为单链形式，因为亚硫酸氢盐试剂优选与单链 分子反应。将该混合物在37℃温育15分钟。可用高于室温的温育温度 来提高变性效率。
温育后，依次加入208μl 2M焦亚硫酸钠(7.6g/20ml水，与416ml 的10N NaOH；BDH AnalaR#10356.4D；新鲜制备)以及12μl的10mM 对苯二酚(0.055g/50ml水，BDH AnalR#103122E；新鲜制备)。对苯二 酚是还原剂，并有助于降低试剂的氧化作用。还可以使用其它的还原剂， 例如二硫苏糖醇(DTT)、巯基乙醇、醌(对苯二酚)或其它合适的还原剂。 样品用200μl矿物油覆盖。矿物油覆盖可以防止试剂的蒸发和氧化，但 并非必需。随后将样品在55℃温育过夜。可选择地，该样品可以在热循 环仪中进行如下循环：如下温育约4小时或整夜：第一步，在PCR仪中 循环55℃/2小时；第二步，95℃/2分钟。第一步可以在约37℃至约 90℃之间的任何温度进行，时间长度可以从5分钟至8小时之间变化。 第二步可以在约70℃至约99℃之间的任何温度进行，时间长度可以从 1秒钟至60分钟或者更长之间变化。
用焦亚硫酸钠处理后，将油去除，如果DNA浓度低则加入1μl tRNA(20mg/ml)或2μl糖原。这些添加剂是可选的，并且可以用来通过与 靶标DNA共沉淀而提高所获得的DNA产量，尤其是DNA以低浓度存 在时。当核酸量＜0.5μg时，则通常需要使用添加剂作为载体以更加有效 的沉淀核酸。
异丙醇提纯处理如下进行：将800μl水加入样品中，混匀，然后加入 1ml异丙醇。水或缓冲液将反应管中的亚硫酸氢盐浓度降低到该盐不随目 的靶标核酸一起沉淀的水平。稀释度通常为约1/4至1/1000，只要将盐 浓度稀释至低于如本文所公开的预期范围即可。
将样品重新混匀，并置于4℃至少5分钟。将样品在微型离心机中 离心10-15分钟，并将沉淀用70％ETOH洗涤2次，每次均涡旋。该洗 涤处理除去任何与核酸一起沉淀的残余盐。
将沉淀干燥，然后重悬于适当体积例如50μl的T/E(10mM Tris/0.1 mM EDTA)pH 7.0-12.5中。已经发现pH 10.5的缓冲液特别有效。如悬浮 核酸所需要的一样，将样品在37℃至95℃孵育1分钟至96小时。
扩增
PCR扩增利用Promega PCR master mix，在25μl包括2μl亚硫酸氢盐 处理的基因组DNA以及6ng/μl的每种引物的反应混合物中进行。将链 特异性巢式引物用于扩增。用PCR引物1和4进行第一轮PCR扩增(见 下文)。第一轮扩增后，将1μl扩增的材料转移至含有PCR引物2和3的 第二轮PCR预先混合液中，并如前所述进行扩增。PCR产物的样品在 ThermoHybaid PX2热循环仪中进行扩增，条件如下：95℃/4分钟的1个 循环；随后是95℃/1分钟、50℃/2分钟以及72℃/2分钟，共30个循环； 72℃/10分钟的1个循环。
完全巢式PCR法的示意图如下所示：
多重扩增
将1μl亚硫酸氢盐处理的DNA加入到在25μl 20反应体积中的下列 组分中：x1 Qiagen多重标准混合物(master mix)、5-100ng每种第一轮INA 或寡核苷酸引物、1.5-4.2nM MgSO4、400μM每种dNTP以及0.5-2单位 的聚合酶混合物。所述组分随后在热盖热循环仪中进行如下循环。通常， 在每个扩增反应中可以存在多达200个单独的引物序列：
第一步：94℃15min 1个循环
第二步：94℃1min
50℃3min 35个循环
68℃3min
第三步：68℃10min 1个循环
随后对第一轮扩增的等份试样进行第二轮扩增，将第一轮扩增转移 到含有酶反应混合物和适当的第二轮引物的第二轮反应管中。然后进行 如上循环。
HGS“复杂性降低”引物和探针
任何合适的PCR引物或探针，以及特别设计用于非PCR扩增包括等 温扩增法的引物和探针均可用于本发明。引物或探针通常具有与待扩增 的序列互补序列。引物或探针通常是寡核苷酸，但可以是核苷酸类似物， 例如INAs。针对上游链和下游链的引物的序列是不同的。
探针和引物
探针或引物可以是任何合适的核酸分子或核酸类似物。实例包括， 但不限于DNA、RNA、锁核酸(LNA)、肽核酸(PNA)、MNA、阿卓糖醇 核酸(altritol nucleic acid，ANA)、己糖醇核酸(hexitol nucleic acid，HNA)、 嵌入性核酸(intercalating nucleic acid，INA)、肌醇核酸(cyclohexanyl nucleic acid，CNA)及其混合物和杂交体，以及其磷原子修饰物，例如但 不限于硫代磷酸酯(phosphorothiates)、磷酸甲酯(methyl phospholates)、亚 磷酰胺(phosphoramidites)、二硫代磷酸酯(phosphorodithiates)、硒代磷酸 酯(phosphoroselenoates)、磷酸三酯(phosphotriesters)以及硼代磷酸酯 (phosphoboranoates)。非天然存在的核苷酸包括，但不限于以下核苷酸， 包括：DNA、RNA、PNA、INA、HNA、MNA、ANA、LNA、CAN、CeNA、 TNA、(2’-NH)-TNA、(3’-NH)-TNA、α-L-Ribo-LNA、α-L-Xylo-LNA、 β-D-Xylo-LNA、α-D-Ribo-LNA、[3.2.1]-LNA、双环-DNA、6-氨基-双环 -DNA、5-epi-双环-DNA、α-双环-DNA、三环-DNA、双环[4.3.0]-DNA，双 环[3.2.1]-DNA，双环[4.3.0]酰胺-DNA、β-D-吡喃核糖基-NA、α-L-吡喃 来苏糖基-NA、2’-R-RNA、α-L-RNA或α-D-RNA、β-D-RNA。另外，非 含磷化合物可以用于连接到核苷酸，例如但不限于甲基亚氨基甲基 (methyliminomethyl)、甲酰乙酸乙酯(formacetate)、硫代甲酰乙酸乙酯 (thioformacetate)以及含有酰胺的连接基团。特别地，核酸和核酸类似物 可能包含一种或者多种嵌入性假核苷酸。
探针或引物可以是含有一种或多种形成INA的内部IPNs的DNA或 DNA寡核苷酸。
检测方法
存在有多种可能的检测系统可以用来确定期望样品的状态。检测系 统包括，但不限于：
I.适当标记的DNA杂交于微阵列型装置，其可选择 10-＞200,000的单个组分。该阵列可以由位于任何合 适的固体表面例如玻璃(glass)、塑料(plastic)、云母 (mica)、尼龙(nylon)、珠子(bead)、磁珠(magnetic bead)、荧光珠(fluorescent bead)或膜(membrane)上的 INAs、PNAs或核苷酸或者修饰的核苷酸阵列构成；
II.DNA印迹型检测系统；
III.标准PCR检测系统，例如琼脂糖凝胶、荧光读出器 (readouts)例如Genescan分析、夹心杂交测定 (Sandwich hybridization assays)、DNA染色剂例如溴 化乙锭、Sybr绿、抗体检测、ELISA平板读数器型 装置、荧光计装置；
IV.特异性或多种基因组扩增片段的实时PCR定量或对 其的任何变更；
V.在WO 2004/065625中列出的任何检测系统，例如荧 光珠、酶交联物、放射性珠等；
VI.利用扩增步骤的其它任何检测系统，例如连接酶链 反应或等温DNA扩增技术例如链置换扩增(SDA).
VII.生物传感器技术适用于本发明，例如以The Texas A&M University System为申请人的US 6426231和 US 6916665以及以University of Massachusetts为申 请人的US 6824659，其以引用的方式并入本文中。
嵌入性核酸
嵌入性核酸(INA)是非天然存在的多核苷酸，其可与具序列特异性的 核酸(DNA和RNA)杂交。在基于探针或引物的杂交测定中，INA是作为 核酸探针和引物的替换物/替代物的候选者，因为它们表现出多种合乎需 要的特性。INA是多聚物，其与杂交核酸而形成比相应天然存在的核酸/ 核酸复合物热力学更加稳定的杂交体，它们不是已知降解肽或核酸的酶 的底物。因此，相比天然存在的核酸片段，INA在生物样品中应该更稳 定，而且比天然存在的核酸片段具有更长的贮存期。与非常依赖于离子 强度的核酸杂交不同，INA与核酸的杂交完全独立于离子强度而且在低 离子强度及非常不利于天然存在的核酸与核酸杂交的条件下，仍然有利 地进行。INA的结合强度依赖于分子中设计的嵌入基团的数量以及来自 双链结构中以特异性方式聚集的碱基之间的氢键的常规相互作用。INA 识别DNA较之DNA识别DNA，对序列区分的效率更高。
优选地，INA是(S)-1-O-(4，4′-二甲氧三苯基甲基)-3-O-(1-异戊二烯 基甲基)-丙三醇的亚磷酰胺。
INA以商业上可行的形式通过对标准寡核苷酸合成步骤的改造而合 成。INA的完整定义及其合成可以在WO 03/051901、WO 03/052132、 WO 03/052133和WO 03/052134(Human Genetic Signatures Pty Ltd)中 查到，其均以引用的方式并入本文中。
INA探针和引物与标准核酸探针和引物之间的确存在许多差异。这 些差异可以很方便地分为生物、结构及其理化差异。如上文以及下文所 讨论的，当在通常已采用了核酸的应用中尝试利用INA探针和引物时， 这些生物、结构以及理化差异可能导致不可预测的结果。在化学技术领 域中，常常观察到不同组合物的这种不等价性。
关于生物差异，核酸是在活物种的生命中作为遗传传递和表达的因 子而发挥重要作用的生物物质，已经相当充分的理解了其在体内的性质。 然而INA是最近开发的完全人工的分子，由化学家想象而且利用合成有 机化学制备，其不具备已知的生物学功能。
结构上，INA也与核酸显著不同。尽管两者均可利用常规核苷酸碱 基(A、C、G、T和U)，这些分子的组成在结构上是不同的。RNA、DNA 和INA的主链由重复的核糖磷酸二酯以及2-脱氧核糖单元构成。INA与 DNA或RNA的区别在于具有一个或多个大的扁平分子，其借助连接分 子连接于多聚体。双链结构中，该扁平分子嵌入到双链结构中与INA相 对的互补DNA链中的碱基之间。
INA与DNA或RNA之间的物理/化学差异也很大。INA结合于互 补DNA比核酸探针或引物结合于相同靶序列更加迅速。与DNA或RNA 片段不同，INA与RNA结合很弱，除非嵌入基团位于末端位置。由于嵌 入基团与互补DNA链上的碱基之间的强烈相互作用，INA/DNA复合物 的稳定性高于类似的DNA/DNA或RNA/DNA复合物的稳定性。
与其它核酸例如DNA或RNA片段或者PNA不同，INA没有表现 出自我聚集或结合的性质。
总之，由于INA与具序列特异性的核酸杂交，所有INA是开发基 于探针或引物的测定的有用候选物，尤其适合于试剂盒以及筛选测定。 然而，INA探针和引物不等于核酸探针和引物。因此，任何可提高基于 探针或引物的测定法的特异性、敏感性以及可靠性的方法、试剂盒或组 合物，在含有DNA样品的检测、分析和定量中均有用。INA具有用于本 发明目的的必要特性。
HPV和癌基因组标记
利用临床样品和细胞系，本发明人对几乎400种人类基因的调控区 的甲基化模式进行了观察，并发现超过60种当处于癌状态并且HPV存 在时具有甲基化的改变的基因组标记。实例包括，但不限于一种或多种 下列基因组区域内、或附近、转录单位(基因)，称为：CD14、ENDRB、 HIC、RARB1、PGR、SFRS8、TMSB10、ABCG2、MFNG、LAMR1、 RAGE、ABL1、CRBP、GPR37、HRK、RARA、SYK、ECE1、MME、 TEM、NF2、XIAPHSX11、RARRES1、FLI1、HTLF、LDHB、RB1、 TGD、CDK4、MMP14、RAB32、BARD1、NF1、LIM2、MMP2、DAB2、 BMP6、CDKN1C、DAB2IP、LMNB1、MMP28、HAI2、SOCS1、HIC2、 MSH6、RIN2、HMGA1、JUN、S100P*、SRF、VDR、DKK3、KRAS2、 PLAU、TNFRSF10B、CDH1、MAC30、DDB2、PAX6、AXL、EIF4A2、 SLIT2、RECK、TERC、GATA5、STAT1。
疾病状态
本发明人采用HPV和宫颈癌中所选的人类基因组区的甲基化作为证 明本发明的实例。应了解其它状态例如各种形式的痴呆(阿尔茨海默病) 可以有传染性的组分，例如单纯疱疹病毒类型1(2004，Neurobiology of Aging，25，619-627；Itzhaki，R.F.，et al.)；与冠状病毒相关SARS肺炎有关 的临床进展和病毒负荷(2003，The Lancet，361，1767-1772，Peiris，J.S.M.m et al.，)；人免疫缺陷病毒HIV以及免疫系统障碍和几种基于病毒的出血 热(2004，Nature Medicine，10，570-576，Weiss，R.A.，et al.，)；包括尼帕病毒 (Nipah virus)、副流感病毒(parainfluenza)和腮腺炎病毒(Mumps)的副粘病 毒科病毒，其与各种呼吸系统疾病、腮腺炎、脑膜炎、胰腺炎、脑炎和 麻疹有关。1999年被首次识别尼帕病毒，其在70％的感染患者中引起患 致命的脑炎，并且具有非常广泛的宿主范围包括人类、犬、猫、猪、马、 仓鼠、蝙蝠和豚鼠。它是全球健康和经济的重要威胁(2005，Nature，436， 401-405；Negrete，O.A.，et al，)；黄病毒科病毒，其包括登革病毒、黄热病 病毒、丙型肝炎病毒和庚型肝炎病毒，其与脑炎、肝炎和休克综合征有 关。例如，丙型肝炎病毒是全世界超过一亿七千万人感染的慢性肝病的 主要原因，而且没有有效的疫苗(2005，Science，309，623-626；Lindenbach， B.D.，et al，)，最后是疱疹病毒科病毒，其包括人疱疹病毒1至8。这些病 毒可以引起口腔感染、角膜溃疡、生殖道感染、脑膜炎、水痘、肺炎、 带状疱疹、巨细胞病毒性单核细胞增多症和脑炎。人巨细胞病毒在免疫 障碍个体包括器官移植个体中引起严重的致命疾病(2003，Nature，424， 456-461；Wang，X.，et al，)，其也是在人类以及各种动物中作为健康状态的 进展的本发明的候选者，其可以通过病毒存在和宿主DNA甲基化状态的 组合来进行监测。相似的实例来自植物病毒和类病毒。
实施例
HPV
HPV和宫颈癌将用于下列实例来证明本发明。应了解如上文所列的 其它病毒和疾病状态也可以通过本发明进行测定。
为了重申本发明人计算机模拟的(in silico)生物信息学分析所基于的 基础，在本文中用作参考目的的标准HPV型是乳多空病毒科 (Papovaviridae)乳头瘤病毒属(Papillomavirus)的HPV16，其最初是由国际 病毒分类委员会(ICTV)所如此命名的(1993，Van Rast，M.A.，et al.， Papillomavirus Rep，4，61-65；see also，1998 Southern，S.A.and Herrington， C.S.Sex.Transm.Inf.74，101-109)。尽管分类学升级到乳头瘤病毒科，但 是在现有技术中常常互换使用。为了避免含糊不清，本发明人用已完全 测序的HPV16 7904个碱基对的基因组作为标准比较(National Center for Biotechnology Information，NCBI locus NC_001526；版本NC_001526.1； GI：9627100；references，Medline，91162763和85246220；PubMed 1848319和2990099)。
另外，本发明人使用所谓的高风险HPV型16、18、45和56的已完 全测序的基因组，其NCBI登录号分别是NC-001526、NC-001357、 NC-001590和NC-001594。
本发明人使用所谓的中度风险HPV型30、31、33、35、39、51、52、 58和66的已完全测序的基因组，其NCBI登录号分别是NC-001585， NC-001527，NC-001528，NC-001529，NC-001535，NC-001533，NC-001592， NC-001443and NC-001695。
本发明人使用所谓的低度风险HPV型6、11、42、43、44、53、54 和55的已完全测序的基因组，其NCBI登录号分别是NC-000904、 NC-001525、NC-001534、NC-005349、NC-001689、NC-001593、NC-001676 和NC-001692。
如本发明人所证实的，许多技术、方法和临床的问题阻碍了通过常 规DNA实验对各种临床样品中的人乳头瘤病毒DNA的检测。本发明为 现有技术中所面临的许多困难提出了解决方案。因为HPV DNA的亚硫 酸氢盐转化降低了HPV衍生物序列库(derivative sequence pool)的复杂 性，复杂性降低使样品中不同HPV型的初期筛选更加有效，因此可以更 加适当和准确的与临床资料相结合。
利用申请人所开发的方法对样品中HPV进行检测的实例可以在人类 遗传标记控股有限公司为申请人的WO 2006/066353 (PCT/AU2005/001963)中查到，其以引用的方式并入本文中。
图1表示对各种正常个体以及高度鳞状上皮内病变的个体和存在 HPV的细胞系进行测试结果。提供的该数据补充了图1中来自对患者的 数据，该患者已测试了HPV以及400个人类基因组区域的甲基化状态。
表2在从三种主要风险类型的不同HPV衍生物中产生的扩增的核酸 产物碱基对中预期片段大小。
HPV和各种人类基因组区域的甲基化状态同时存在
设计实验以证实HPV的存在连同特定基因组区域的甲基化状态一起 与任一单独特征比较是更加有效的健康状态的预后指标。以此方式，对 样品的大量基因组区域的甲基化状态进行测定，所述样品来自宫颈细胞 学正常的个体，来自宫颈细胞学具有高度鳞状上皮内病变特征的个体， 以及来自根据细胞形态学癌指标其宫颈细胞学是正常的但基于细胞学特 征推断是HPV阳性的个体。
图1A表示HeLa细胞系、如病理学家所确定的表现出HSIL的两个 患者(称为HSIL-1和HSIL-2)、具有正常宫颈形态但是根据病理表型推断 存在HPV的一个患者(称为HPV+Nor)，它们都是如利用适当的PCR扩 增技术所确定的HPV存在阳性。具有正常宫颈形态的两个患者(称为 Normal-1和Normal-2)是高等风险HPV型存在阴性的。
图1B表示HeLa细胞系中存在条带(扩增子)(泳道1)，其含有HPV18 型DNA序列。两个HSIL样品(泳道2和#)含有如分子测定的HPV16。 发现病理学家确定为形态正常但其中一些细胞具有作为HPV感染指标的 特征性胞质特点的宫颈组织为HPV型82(泳道4)阳性的。
然后在每个基因座测试这些临床样品的甲基化存在(称为pos)或非甲 基化(称为neg)。例如，关键的预后指标是病理正常的患者具有非甲基化 基因座，而高度鳞状上皮内病变的患者在相同区域具有甲基化；简言之， 在发展到癌状态的过程中相关基因区域已沉默。(反之同样适用。正常细 胞学个体在特定细胞型中有基因座被甲基化，而在癌状态中该基因座变 为未甲基化的)。
因为特定基因组区域的甲基化随细胞型而变化，所以一些基因组区 域对于特定细胞型中癌状态的发展必然是不具有任何信息的。这些区域 在所有样品中或者完全未甲基化，或在所有临床样品中完全甲基化。
表3A和3B表示许多临床样品和HeLa细胞系的HPV状态，以及53 个个体的人类基因组区域的甲基化状态。
如从表3A和3B所看到的，HeLa宫颈癌细胞系和高度鳞状上皮内病 变(HSIL)两者都是根据分子确定的HPV DNA存在阳性。一个非癌但病理 学推断为HPV感染的宫颈组织样品(称为HPV+Nor)也被发现是HPV存 在阳性。发现两个来自不同个体的正常宫颈组织样品为如分子所确定的 HPV DNA序列存在阴性。
上述每个区域都经PCR扩增，产生的扩增子用适当的限制性酶消化 (和/或测序)以确定特定基因组区域的甲基化状态(表3A和3B)。
首先，存在对于预后指标没有任何信息的基因组区域。在所有样品 (13个基因组区域ABCG2至VHL)中这些区域未甲基化，或者是在所有 样品(4个基因组区域，CD34、MAGEA2、MAGEA3和MINT31)中已甲 基化。对表3A和3B的结果中称为CD14、ENDRB、HIC和RARB的基 因组区域特别有趣。所有上述这些区域在HeLa宫颈癌细胞学和两个HSIL 样品中都是甲基化的。有趣的是，在经测试的正常宫颈组织或感染HPV 的非癌宫颈组织样品中，这些区域都不是甲基化的。
最后，32个基因组区域ANAX7至TNFRS10B在正常个体和具有 HSIL的个体之间表现出可变的甲基化模式。该变化极有可能反映患者个 体的遗传背景与在人类基因组的个体基因座中甲基化状态的不同稳定性 的混合。
该结果表明尽管在几乎所有HSIL和宫颈癌中已经检测到HPV存在， 但是仅HPV存在不是宫颈高度异常情况的可靠指标。然而，将HPV存 在与宫颈DNA样品的甲基化特征谱(methylation profile)中的变化联系起 来时，其给出了更好的疾病状态的预后指标。
表3A
HeLa HSIL-1 HSIL-2 Norm-1 Norm-2 HPV +Nor HPV状态 Pos Pos Pos Neg Neg Pos
表3B
ND＝未确定
除了基因组区域CD14、ENDRB、HIC和RARB甲基化以外，本发 明人还鉴定了其他62个DNA基因组区域，其表现出与HSIL样品中 CD14、ENDRB、HIC和RARB相似的甲基化特征谱，但是与来自384 个候补基因的正常宫颈组织或感染HPV的正常宫颈组织中的不同。这些 标记物列于表4中。
图2表示利用HGS HR-HPV DNA纯化和检测试剂盒对36个LBC样 品的人类基因组DNA和HPV DNA进行PCR扩增的结果。从结果中可以 看出，采用该方法可以同时测定存在人类基因组改变以及病毒存在与否。
图3表示正常宫颈样品在16个不同基因座进行扩增，然后经限制性 核酸内切酶BstU1和TaqαI组合消化，进行琼脂糖凝胶电泳的代表性凝 胶。从液基细胞学样品(在此编号为28和29)中提取DNA，经亚硫酸氢钠 修饰，然后用所鉴定基因的巢式引物进行扩增用于进一步分析。这些基 因从左到右分别是1)TEM 2)MME 3)ECE14)SYK 5)RARA 6)HRK 7) GPR378)CRBP 9)ABL110)RAGE 11)LAMR1 12)MFNG 13)ABCG2 14)TMSBIO 15)SFRS8和16)PGR。
病理学家对样品的病理学和HPV感染谱(infection profile)进行了评 价。当扩增子中CpG二核苷酸未甲基化时，亚硫酸氢盐修饰将未甲基化 的胞嘧啶转化为尿嘧啶碱基，扩增后转化成胸腺嘧啶碱基。因未保留未 甲基化的CpG二核苷酸和限制性位点，因此不会被核酸内切酶BstU1(识 别CGCG，如果样品未甲基化，其在扩增后将转化成TGTG，但是如果 样品中含有甲基化的序列，其将会保持CGCG)或TaqαI(识别TCGA，如 果样品未甲基化，其在扩增后将转化成TTGA，但是如果样品中含有甲 基化的序列，其将保持TCGA)识别。单一条带表示未消化的PCR产物， 因此检测到单一条带则意味着扩增子中CpG二核苷酸是未甲基化的。甲 基化的CpG二核苷酸对亚硫酸氢盐修饰具抗性，因此保留了限制性核酸 内切酶识别的限制性位点。因此，根据扩增子中可用的CpG位点的数量， 将PCR产物消化成多个片段(如星号所示的)。检测到空泳道表明PCR反 应不成功。
在这些16个基因座中几乎没有检测到多条带。该分析的代表性结果 列于表5。
许多代表性的病理学正常的宫颈样品(NORM)的甲基化特征谱，其中 有一些可能是HPV感染(NORM HPV)。从液基细胞学样品中提取DNA， 经亚硫酸氢钠修饰，然后对384个不同的基因进行扩增。用限制性酶消 化扩增子并进行琼脂糖凝胶电泳。检测到单产物(未消化的产物)表示所询 问基因的启动子区为未甲基化(U)。检测到多条带(消化产物)意味着所询 问基因的启动子区为甲基化(M)。在特异性基因组中(称为“F”)没有条带 则推断PCR反应不成功。
还列出了高度和中度风险乳头瘤病毒DNA的存在(+)或不存在(-)。 包括了扩增人GST-P1基因和鼠GST-P1基因两者(HmGST)的引物，作为 PCR反应的对照。检测到条带则推断DNA已转化并可用于扩增。
图4表示肿瘤样品在16个不同基因座进行扩增，然后经限制性核酸 内切酶BstU1和TaqαI组合消化，进行琼脂糖凝胶电泳的代表性凝胶。 从液基细胞学样品(在此编号为82、83、84、94、95和96)中提取DNA， 经亚硫酸氢钠修饰，然后用所鉴定基因的巢式引物进行扩增用于进一步 分析。这些基因从左到右分别是1)PGR 2)SFRS83)TMSBIO 4)ABCG25) MFNG 6)LAMR17)RAGE 8)ABL1 9)CRBP 10)GPR37 11)HRK 12) RARA 13)SYK 14)ECE1 15)MME and 16)TEM。
病理学家对样品的病理学和HPV感染谱进行了评价。当扩增子中 CpG二核苷酸未甲基化时，亚硫酸氢盐修饰将未甲基化的胞嘧啶转化为 尿嘧啶碱基。未甲基化的CpG二核苷酸和限制位点没有保留，因此不会 被核酸内切酶BstU1或TaqαI识别。检测到单一条带表示未消化的PCR 产物，因此意味着扩增子中CpG二核苷酸是未甲基化的。甲基化的CpG 二核苷酸对被亚硫酸氢盐修饰具有抗性，因此保留了限制性核酸内切酶 识别的限制性位点。因此，根据扩增子中可用的CpG位点的数量，将PCR 产物消化成多个片段(如星号所示的)。检测到空泳道表明PCR反应不成 功。
与正常样品(见图4)相比较，肿瘤样品中更多比例的基因都是甲基化 的。该分析的代表性结果列于表6中。
在表6中，许多代表性的病理学异常的宫颈样品(如病理学家所评价 的)的甲基化特征谱。基于人乳头瘤病毒(HPV)的存在和病变类型(低度 LG，低度LG乳头瘤病毒LG HPV，以前的高度Pr HG，高度HG，高度 原位癌3组分和原位癌3病变CIN3)对样品进行了分类。
从液基细胞学样品中提取DNA，经亚硫酸氢钠修饰，然后对384个 不同的基因进行扩增。用限制性酶消化扩增子并进行琼脂糖凝胶电泳。 检测到单个产物(未消化的产物)则表示所询问基因的启动子区为未甲基 化(U)。检测到多条带(消化产物)则代表所询问基因的启动子区为甲基化 (M)。在特异基因组(称为“F”)没有条带则推断PCR反应不成功。
表7患者病理学列表
表7表示对64个不同基因座的DNA甲基化特征谱进行调查的样品 的病理学。
从预先确定病理学的96位患者的液基细胞学样品中提取DNA。病 理学家所评价的样品的相应病理学与病理学类型、发病程度以及人乳头 瘤病毒感染的存在与否有关。
将样品标记为细胞学正常(NORM)、可能有HPV感染(HPV)、细胞学 正常可能伴有HPV感染(HPV NORM)、低度病变而且伴有HPV感染(LG HPV)、高度病变(LG)、增强的高度病变(INC HG)、以前的高度病变(Pr HG)、原位癌1病变可能伴有HPV感染、高度原位癌3病变(HG CIN3)、 高度癌(HG Cx)、鳞状上皮细胞癌(SCC)、鳞状上皮细胞癌 (carcinoma/cancer)(SCC Cx)、腺癌(AC Cx)、子宫内膜癌(Ca Endomet)、 腺癌/原位腺癌(AC/AIS)。
表8示出了本发明人发现的基因或基因组区域，其是用于本发明的 疾病状态的适当的指标。应了解本领域的技术人员能够设计适当的引物 或探针来检测上述基因或基因组区域中一个或多个改变，并且与检测病 毒核酸的存在相结合。
表8适合本发明的疾病基因或基因组区域
本领域的技术人员应了解，在不背离广泛描述的本发明的精神或范 围的情况下，可以对如在具体实施方案中所示的本发明进行多种变化和/ 或更改，因此，应认为本实施方案在所有方面是说明性的而非限制性的。
序列表
<110>人类遗传标记控股有限公司(Human genetic Signatures Pty Ltd)
<120>健康状态的测定法(Assay for a health staate)
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<170>PatentIn version 3.1
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