一种鳞状上皮细胞内癌SCC-TCT联合检测方法
专利汇可以提供一种鳞状上皮细胞内癌SCC-TCT联合检测方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开一种鳞状上皮细胞内癌SCC-TCT联合检测方法。该方法是将 宫颈 部位的脱落细胞取样，预处理后得到样品溶液；将皂素和样品溶液，离心后取沉淀，加入 磷酸 盐 缓冲液混匀后，进行细胞数总数的计数；将计数后的细胞悬液离心后加入磷酸盐缓冲液进行至少一次冻融，得到SCC 抗原 游离、释放后的样品溶液；然后对其进行细胞内SCC抗原酶标检验分析；根据测定结果判断筛选，将高于临界值的标本筛选出来，该标本相对应的样品溶液在液基细胞仪上制成均匀涂片后固定，巴氏 染色 法染色， 显微镜 细胞形态学分析，判断 肿瘤 细胞的形态。本发明采用SCC-TCT联合检测技术，把80～90﹪正常标本筛选出来，可提高病理医生的工作效率。，下面是一种鳞状上皮细胞内癌SCC-TCT联合检测方法专利的具体信息内容。
1. 一种鳞状上皮细胞内癌SCC-TCT联合检测方法，其特征在于该方法包括以下步骤：
步骤(1).脱落细胞预处理：
将宫颈部位的脱落细胞取样，放入保存液中固定脱落细胞，得到预处理后的样品溶液，于0℃～8℃下保存；
步骤(2).离心聚集脱落细胞：
在试管中首先加入20～50µl 1wt﹪皂素，然后加入5～10ml步骤（1）得到的样品溶液，2000～3000转/分钟下离心5～10分钟后，弃去上清液；
步骤(3).脱落细胞数总数计数：
步骤(2)离心后的脱落细胞沉淀聚集于试管中，加入pH值为7.4的磷酸盐缓冲液2ml再次充分混匀后，得到细胞悬液；对该试管内细胞悬液进行细胞数总数的计数；
步骤(4).细胞内的SCC抗原游离、释放：
将步骤(3)细胞数总数计数后的细胞悬液于2000～3000转/分钟下离心5～10分钟，弃去上清液后再次加入100µl pH值为7.4的磷酸盐缓冲液并混匀，得到混合液；然后将混合液进行至少一次冻融，此时细胞由于冻融的作用使细胞膜破裂，得到SCC抗原游离、释放后的样品溶液；
所述的冻融过程为将混合液置于液氮箱内，于-190℃下迅速超低温冷冻2～3分钟后，取出置于50℃下溶解；
步骤(5).细胞内SCC抗原酶标检验分析：
5.1取步骤(4)SCC抗原游离、释放后的样品溶液20～50µl，加入到已被SCC抗体包被的酶标板小孔内，抗原抗体反应30～60min后，洗涤；
5.2然后在步骤5.1酶标板小孔内再加入50µl SCC酶标抗体，反应15min后形成抗原-抗体-酶标抗原复合物,洗涤；
5.3步骤5.2抗原-抗体-酶标抗原复合物经过彻底洗涤后，加入50µl底物TMB进行显色；TMB在50µl HRP酶的催化下转化成蓝色，并在50µlpH值为5.0的磷酸-柠檬酸缓冲液的作用下转化成最终的黄色；颜色的深浅和待检液中的鳞状细胞癌抗体呈正相关；
5.4将步骤5.3显色后的待检液放入酶标仪内，分析鳞状细胞癌抗体的浓度，单位为ng；并将步骤（3）计数得到的细胞数总数输入到酶标仪内，结合鳞状细胞癌抗体的浓度转换成细胞数总数内的实际测得的SCC-Ab浓度，单位为_ng/_万细胞；
步骤(6).筛选结果：
根据步骤5.4测定的结果进行判断筛选，若高于临界值的标本筛选出来，然后进行步骤(7)；
步骤(7).液基细胞TCT检查：
将步骤（6）筛选出来的标本相对应的样品溶液在液基细胞仪上制成均匀涂片并立即用
95wt﹪酒精固定，然后用巴氏染色法将制片染色，显微镜细胞形态学分析，判断肿瘤细胞的形态，得出SCC-TCT的检验结果。
2.如权利要求1所述的一种鳞状上皮细胞内癌SCC-TCT联合检测方法，其特征在于步骤（3）处理后的沉淀在进行步骤（4）前，可对其进行抗原修复，具体操作是在沉淀中加入
0.05wt﹪～0.1 wt﹪胰蛋白酶修复液100µl混匀，37℃下反应30～60min。
3.如权利要求1所述的一种鳞状上皮细胞内癌SCC-TCT联合检测方法，其特征在于步骤(1)所述的保存液为质量分数为10～50﹪的甲醇溶液、质量分数为10～50﹪的乙醇溶液或质量分数为10﹪的甲醛溶液。
一种鳞状上皮细胞内癌SCC-TCT联合检测方法
技术领域
背景技术
发明内容
将宫颈部位的脱落细胞取样，放入保存液中固定脱落细胞，得到预处理后的样品溶液，于0℃～8℃下保存；
所述的保存液为质量分数为10～50﹪的甲醇溶液、质量分数为10～50﹪的乙醇溶液或质量分数为10﹪的甲醛溶液；
步骤(2).离心聚集脱落细胞：
在试管中首先加入20～50µl 1wt﹪皂素，然后加入5～10ml步骤（1）得到的样品溶液，2000～3000转/分钟下离心5～10分钟后，弃去上清液；
所述的皂素用于破除样品溶液中的红细胞；
步骤(3).脱落细胞数总数计数：
步骤(2)离心后的脱落细胞沉淀聚集于试管中，加入pH值为7.4的磷酸盐缓冲液2ml再次充分混匀后，得到细胞悬液；对该试管内细胞悬液进行细胞数总数的计数；
所述的细胞数总数的计数方法可以采用人工细胞计数法计数或者细胞计数仪计数；
1.人工细胞计数法是在2ml细胞悬液内取50µl滴入细胞计数板的细胞
池内，在显微镜下人工计数四个大方格内的细胞数。细胞池内大方格的面积是
1mm×1mm=1mm²,四个大方格的面积是4mm²,细胞池的高度是1mm,4个大方格的体积是
4mm³=0.004ml,2ml/0.04ml=500。若人工计数得四大方格内的细胞数为20个，那么该管的细胞数总量为20×500=10000个细胞。
所述的冻融过程为将混合液置于液氮箱内，于-190℃下迅速超低温冷冻2～3分钟后，取出置于50℃下溶解；
步骤(5).细胞内SCC抗原酶标检验分析：
5.1取步骤(4)SCC抗原游离、释放后的样品溶液20～50µl，加入到已被SCC抗体包被的酶标板小孔内，抗原抗体反应30～60min后，洗涤；
5.2然后在步骤5.1酶标板小孔内再加入50µl SCC酶标抗体，反应15min后形成抗原-抗体-酶标抗原复合物,洗涤；
5.3步骤5.2抗原-抗体-酶标抗原复合物经过彻底洗涤后，加入50µl底物TMB（3＇，
3＇，5＇，5＇-四甲基联苯胺）进行显色。TMB在50µlHRP酶（辣根过氧化物酶）的催化下转化成蓝色，并在50µlpH值为5.0的磷酸-柠檬酸缓冲液的作用下转化成最终的黄色；颜色的深浅和待检液中的鳞状细胞癌抗体(SCC-Ab) 呈正相关。
根据步骤5.4测定的结果进行判断筛选，若高于临界值的标本筛选出来，然后进行步骤(7)；
所述的临界值可根据临床试验得出的结果，通过人为设定。
95wt﹪酒精固定，然后用巴氏染色法将制片染色，显微镜细胞形态学分析，判断肿瘤细胞的形态，得出SCC-TCT的检验结果。
具体实施方式
步骤(2).离心聚集脱落细胞：
在试管中首先加入20µl 1wt﹪皂素，然后加入5ml步骤（1）得到的样品溶液，2000转/分钟下离心10分钟后，弃去上清液；
所述的皂素用于破除样品溶液中的红细胞；
步骤(3).脱落细胞数总量计数：
步骤(2)离心后的脱落细胞沉淀聚集于试管中，加入pH值为7.4的磷酸盐缓冲液2ml再次充分混匀后，得到细胞悬液；对细胞悬液采用人工计数法计数进行细胞数总数计数；
人工细胞计数法是在2ml细胞悬液内取50µl滴入细胞计数板的细胞池内，在显微镜下人工计数四个大方格内的细胞数。细胞池内大方格的面积是1mm×1mm=1mm²,四个大方格的面积是4mm²,细胞池的高度是1mm,4个大方格的体积是4mm³=0.004ml,2ml/0.04ml=500。
如人工计数得四大方格内的细胞数为20个那么该管的细胞数总量为20×500=10000个细胞。
所述的冻融过程为将混合液置于液氮箱内，于-190℃下迅速超低温冷冻3分钟后，取出置于50℃下溶解；
步骤(5).细胞内SCC抗原酶标检验分析：
5.1取步骤(4)SCC抗原游离、释放后的样品溶液20µl，加入到已被SCC抗体包被的酶标板小孔内，抗原抗体反应30min后，洗涤；
5.2然后在步骤5.1酶标板小孔内再加入50µl SCC酶标抗体，反应15min形成抗原-抗体-酶标抗原复合物,洗涤；
5.3步骤5.2抗原-抗体-酶标抗原复合物经过彻底洗涤后，加入50µl底物TMB（3＇，
3＇，5＇，5＇-四甲基联苯胺）进行显色。TMB在50µlHRP酶（辣根过氧化物酶）的催化下转化成蓝色，并在50µlpH5.0的磷酸-柠檬酸缓冲液的作用下转化成最终的黄色；显色结果是450nm吸光度的黄色。
根据步骤5.4测定的结果进行判断筛选，该病人标本实际测得的SCC浓度以大大高于临界值，将该病人标本筛选出来然后进行步骤(7)；
步骤(7).液基细胞TCT检查：
将步骤（6）将筛选出来的该标本在液基细胞仪上制成均匀涂片并立即用95wt﹪酒精固定，然后用巴氏染色法将制片染色，制片后提供病理医生显微镜细胞形态学分析，最后供病理医生判断该标本的脱落细胞的细胞核内染色体有CINⅢ 结果，得出报告：SCC 50ng/1万细胞、TCT的检验结果为脱落细胞CINⅢ。
步骤(2).离心聚集脱落细胞：
在试管中首先加入50µl 1wt﹪皂素，然后加入 10ml步骤（1）得到的样品溶液，3000转/分钟下离心5分钟后，弃去上清液；
所述的皂素用于破除样品溶液中的红细胞；
步骤(3).脱落细胞数总量计数：
步骤(4)离心后的脱落细胞沉淀聚集于试管中，加入pH值为7.4的磷酸盐缓冲液2ml再次充分混匀后，得到细胞悬液；对细胞悬液采用人工计数法计数进行细胞数总数计数；
用细胞计数仪计数如： SCC-100细胞计数仪是一种集成了激光诱导荧光检测的电子显微镜，以碘化丙锭（propidium iodide）作为染料标记DNA，进行检测出细胞悬液中的细胞总数为25000。
所述的冻融过程为将混合液置于液氮箱内，于-190℃下迅速超低温冷冻2分钟后，取出置于50℃下溶解；
步骤(5).细胞内SCC抗原酶标检验分析：
5.1取步骤(4)SCC抗原游离、释放后的样品溶液50µl，加入到已被SCC抗体包被的酶标板小孔内，抗原抗体反应60min后，洗涤；
5.2然后在步骤5.1酶标板小孔内再加入50µl SCC酶标抗体，反应15min后形成抗原-抗体-酶标抗原复合物,洗涤；
5.3步骤5.2抗原-抗体-酶标抗原复合物经过彻底洗涤后，加入50µl底物TMB（3＇，
3＇，5＇，5＇-四甲基联苯胺）进行显色。TMB在50µlHRP酶（辣根过氧化物酶）的催化下转化成蓝色，并在50µlpH5.0的磷酸-柠檬酸缓冲液的作用下转化成最终的黄色；显色结果是450nm吸光度的黄色。
根据步骤5.4测定的结果进行判断筛选，该病人标本实际测得的SCC浓度低于临界值，该病人标本不需要进行液基细胞TCT检查。得出报告：SCC 1.2ng/1万细胞。
步骤(2).离心聚集脱落细胞：
在试管中首先加入30µl 1wt﹪皂素，然后加入6ml步骤（1）得到的样品溶液，2500转/分钟下离心7分钟后，弃去上清液；
所述的皂素用于破除样品溶液中的红细胞；
步骤(3).脱落细胞数总量计数：
步骤(2)离心后的脱落细胞沉淀聚集于试管中，加入pH值为7.4的磷酸盐缓冲液2ml再次充分混匀后，得到细胞悬液；对细胞悬液采用人工计数法计数进行细胞数总数计数；
人工细胞计数法是在2ml细胞悬液内取50µl滴入细胞计数板的细胞池内，在显微镜下人工计数四个大方格内的细胞数。细胞池内大方格的面积是1mm×1mm=1mm²,四个大方格的面积是4mm²,细胞池的高度是1mm,4个大方格的体积是4mm³=0.004ml,2ml/0.04ml=500。
如人工计数得四大方格内的细胞数为40个那么该管的细胞数总量为40×500=20000个细胞。
0.05wt﹪胰蛋白酶修复液100µl混匀，37℃下反应30min；然后于2500转/分钟下离心7分钟后，弃去上清液后再次加入100µlpH7.4磷酸盐缓冲液并混匀，得到混合液；然后将混合液进行4次冻融，此时细胞由于冻融的作用使细胞膜破裂，得到SCC抗原游离、释放后的样品溶液；
所述的冻融过程为将混合液置于液氮箱内，于-190℃下迅速超低温冷冻3分钟后，取出置于50℃下溶解；
步骤(5).细胞内SCC抗原酶标检验分析：
5.1取步骤(4)SCC抗原游离、释放后的样品溶液30µl，加入到已被SCC抗体包被的酶标板小孔内，抗原抗体反应50min后，洗涤；
5.2然后在步骤5.1酶标板小孔内再加入50µl SCC酶标抗体，反应15min形成抗原-抗体-酶标抗原复合物,洗涤；
5.3步骤5.2抗原-抗体-酶标抗原复合物经过彻底洗涤后，加入50µl底物TMB（3＇，
3＇，5＇，5＇-四甲基联苯胺）进行显色。TMB在50µlHRP酶（辣根过氧化物酶）的催化下转化成蓝色，并在50µlpH5.0的磷酸-柠檬酸缓冲液的作用下转化成最终的黄色；显色结果是450nm吸光度的黄色。
步骤(6).筛选结果：
根据步骤5.4测定的结果进行判断筛选，该病人标本实际测得的SCC浓度低于临界值，该病人标本不需要进行液基细胞TCT检查。得出报告：SCC 1.5ng/1万细胞。
步骤(2).离心聚集脱落细胞：
在试管中首先加入40µl 1wt﹪皂素，然后加入 9ml步骤（1）得到的样品溶液，2800转/分钟下离心6分钟后，弃去上清液；
所述的皂素用于破除样品溶液中的红细胞；
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