[0001] 本
发明涉及人
乳头瘤病毒(HPV)基因型的检测，特别是生殖器人乳头瘤病毒基因型的检测。
[0002] 人乳头瘤病毒及其意义
[0003] 据世界卫生组织(WHO)称，在女性中
宫颈癌是癌症死亡的第二大常见原因。全世界99％以上的
宫颈癌中都存在HPV感染。据估计，全世界每年有超过500,000名女性发展宫颈癌，超过273,000例是致命的。即使采用巴氏筛查方案，也有相当数量的女性每年死于宫颈癌。
[0004] HPV感染是全球最常见的性传播
疾病(STD)，高达60％的性活跃女性一生中会在生殖道内被HPV感染一次。不论HPV感染状况如何，不到1/10,000的女性会发展为浸润性宫颈癌。大部分HPV感染女性不发展细胞学异常或癌症的事实强调了在HPV感染女性中调节宫颈疾病至癌症的进展的因素的重要性。这些因素可能包括HPV基因型和分子变异、HPV病毒载量、HPV感染的持续存在、与其他STD媒介的共同感染、宿主的免疫状态及如吸烟等环境因素。
[0005] 乳头瘤病毒是感染
哺乳动物上皮细胞的小DNA病毒，其引起上皮增生性病变，其可以是良性的，例如
纤维化乳头瘤(疣)，或者可以是恶性的。所有乳头瘤病毒的相似之处在于，共享基因组大小、组织、开放阅读框和
蛋白质功能。许多但不是全部的基因组区域在各种乳头瘤病毒中是保守的。
[0006] 由于乳头瘤病毒的生命周期和宿主细胞的分化状态之间的密切关联，乳头瘤病毒的生命周期的细节尚未完全阐明。已知乳头瘤
病毒感染宿主上皮基底细胞，其中病毒基因组已经建立，并保持为与宿主细胞复制协同复制的低拷贝数附加体。当感染的细胞分
化成角质形成细胞时，病毒DNA扩增，晚期基因被诱导，然后进行乳头瘤病毒的营养复制。
[0007] 乳头瘤病毒感染各种各样的动物，包括人类。人乳头瘤病毒(HPV)(包括乳头瘤病毒科，α-、β-、γ-、δ-、多发性乳头瘤病毒和未分类乳头瘤病毒属)是性传播疾病的常见原因。几种类型的HPV已经通过DNA序列数据被鉴定出来，迄今为止已有96种HPV基因型被完全测序。HPV的基因分型是基于L1、E6和E7基因的DNA序列。与先前建立的菌株相比，序列中10％差异足以定义新型病毒。
[0008] 人乳头瘤病毒组的异质性大概描述于deVilliers，1989，J.Virology 63：4898-4903，将其通过引用并入本文。许多HPV类型的基因组已被测序和/或表征。
[0009] 根据可获得的分子、临床和流行病学数据，一部分HPV明确地是宫颈癌及其前体的病原体。在约90％的宫颈腺癌和鳞状细胞癌中检测到HPV。大部分HPV感染是自发清除的，但在来自宫颈
肿瘤的转移中发现HPV DNA持续感染。然而，已知的高
风险(或致癌性)HPV类型是宫颈癌的显著风险因素，并且其在其他癌症中的作用越来越被认可。几乎所有的宫颈癌(99％)都含有高风险型HPV的基因，最常见的类型是16、18、31和45。其他的高风险类型包括31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68和73。HPV31、33、35、51和52有时被认为是“中等风险”，因为它们在轻度或重度发育不良病变中比在癌中更常见。在高风险菌株中，HPV16和18与宫颈癌密切相关。在超过50％的鳞状细胞癌中发现了HPV16DNA，而在超过50％的腺癌中发现了HPV18DNA。然而，绝大部分肛
门与生殖器HPV具有致癌潜
力。
[0010] 迄今为止，与HPV感染相关的临床疾病以及HPV检测和分型方法的潜在应用领域包括尖锐湿疣、硬化性苔藓、鳞状细胞增生、外阴上皮内瘤变、鳞状细胞癌、宫颈上皮内瘤变、宫颈癌、子宫颈腺癌、肛门上皮内瘤变、阴茎上皮内瘤变、喉腺癌、复发性
呼吸道乳头瘤病和疣状表皮发育不良。最近的证据表明，HPV也可能在男性
前列腺癌的发展中发挥作用。
[0011] 在
发明人George Papanicolaou之后，使用称为
巴氏涂片(Pap smear)的巴氏
染色(Papanicolaou Stain)测试宫颈癌前体病变(上皮内病变)或细胞学异常。该技术涉及在
载玻片上涂
抹子宫颈刮取物，并用细胞核染料苏木精将获自肛门-生殖道的细胞染色。然而，巴氏涂片缺乏可重复性，并不足以预测即将发生的HPV诱导的瘤形成。已经显示25％的晚期原位癌患者在诊断前几年可能呈现正常巴氏涂片，或者在宫颈癌病例复查时最后的阴性细胞学检查均为阳性。一个越来越普遍的问题是在阴性巴氏涂片的3年内发生浸润性癌症。
[0012] 当前可接受的假阴性率(即根据病理学家专家小组观察组织活检而不是涂片样品确实具有异常的女性，但在常规涂片筛查过程中未诊断出此)是大约5％～10％，但最近的研究表明，实际假阴性率可能要高得多。此外，约7％～8％的病例中，巴氏涂片显示意义不明的非典型鳞状细胞(ASCUS)。在另外20％～30％的病例中，由于炎性细胞的存在，巴氏涂片可能不足以用于解释。在宫颈的情况下，扁平疣(通过
阴道镜检查
可视化)是疑似癌前病变。已经很好地描述了扁平疣到原位癌和宫颈癌的
组织病理学进程。
[0013] 上皮内病变是具有偶发性HPV感染的女性常见的早期事件，HPV-16或HPV-18感染与活检证实的CIN 2-3级之间的间隔似乎相对较短。然而研究证明，高风险型HPV感染通常是短暂的。HPV感染的持续大大增加了进展为高级上皮内病变和浸润性疾病的风险。
[0014] 该疾病的进展是可变的，并且其与HPV的丢失或持续相关。大量异常病变自发消退，其他不能进展，而少数进展迅速。
[0015] 由于高风险基因型在宫颈癌中的优先作用，并且由于其他病理状态的不同结果性和特征性类型模式，所以HPV的鉴定和分型非常重要。另外不同类型的高风险HPV对受影响的个体构成不同的风险。例如，HPV16和HPV18在高级宫颈异常和癌症中比其他HPV类型更一致地被鉴定。HPV16也在鳞状癌病例中更普遍，HPV18在腺癌病例中更为普遍。
[0016] HPV诊断
[0017] 自1980年以来，已经克隆了几种病毒基因组并在HPV诊断中用作类型特异性探针。滤膜杂交技术已经用于检测与用于常规细胞学的样品平行采集的宫颈刮取物中的HPV DNA。HPV DNA探针已经用于不同的基于杂交的测定，例如Southern和杂交Dot/Southern测定以检测来自临床的组织样品中的HPV DNA。另外，已经证明了纯化的活检DNA和保存组织试样中的原位杂交，即直接
定位于与核酸探针互补的那些序列的完整细胞内。
[0018] 已经开发了多种方法来使用类型特异性反应检测人乳头瘤病毒类型，其一次检测一种HPV类型。已经使用聚合酶链式反应(PCR)来扩增和检测HPV16和HPV18DNA的存在，特别是在
口腔和宫颈活检中检测HPV16。已经描述了通过PCR对1a、5、6a、8、11、16、18和33型中的HPV序列进行特异性扩增的引物混合物。美国
专利号4,683,195和4,683,202公开了PCR和使用PCR以在样品中检测是否存在核酸序列。
[0019] 美国专利号5,447,839公开了用于HPV检测和分型的方法，将其通过引用并入本文。在该方法中，使用扩增致癌性和非致癌性HPV类型的共有引物通过PCR扩增样品中的HPV DNA序列。因此，通过扩增产物的形成来指示样品中HPV的存在。然后使用与DNA的扩增区域杂交的类型特异性DNA探针对HPV进行分型。在该专利中公开的类型特异性杂交探针能够
鉴别和区分5种已知致癌类型的HPV，即HPV-6、HPV-11、HPV-16、HPV-18和HPV-33。
[0020] 已经设计了多种检测高风险型HPV的方法。其中许多依赖于HPV基因组中的独特序列的检测。例如，本领域已经报道了与特定高风险HPV株的基因的一部分互补的DNA或RNA探针，其可用于筛选患者样品中特定高风险HPV株的存在(美国专利号4,849,332，将其通过引用并入本文)。美国专利号5,705,627报道了使用PCR以利用简并或混合共有引物扩增和检测HPV DNA，然后使用基因型特异性DNA探针的混合物进行分型，将其通过引用并入本文。使用共有引物的其他实例可以在美国专利号5,364,758和Kleter，B等，Am.J.of Pathology，153卷，第6期，1731-39(1998)找到。这些参考文献也通过引用并入本文。
[0021] 有一种基于杂交和
信号放大的可利用商业方法。(Hybrid Capture II，Digene Corp.)然而，由于HPV基因组的某些部分的高度序列同源性，据报道该方法具有特异性问题。
[0022] 基于扩增的方法由负责灵敏度(扩增)的部分组成，其与负责特异性的那些部分(通过杂交检测)分开。这些技术在扩增的基因组部分、引物数量和检测技术上不同。最常用的扩增方法是GP5+-GP6+(通用引物-GP)、MY9-MY11、PGMY、SPF、L1C和类型特异性PCR反应。最常用的检测技术是序列特异性杂交、限制性
片段长度多态性(RFLP)和线性探针测定(LiPA)。有时，但很少，应用测序或其他方法。扩增的分析特性在很大范围内变化，其特征在于可扩增的基因型数目，基因型扩增/检测的分析灵敏度、特异性以及在于基因型之间的灵敏度差异。
[0023] HPV实时PCR
[0024] 人乳头瘤病毒-16(HPV-16)病毒载量可以是预测高级宫颈病变存在的
生物标志物。已经开发了几种实时PCR测定法来精确测量HPV-16病毒载量(HPV-16L1、HPV-16E6和HPV-16E6PG)。该方法实时进行HPV检测，但一次只检测一种基因型。
[0025] 使用 实时PCR在幼年型发作复发性呼吸道乳头瘤病患者中进行HPV DNA的鉴定。该方法用于在实时PCR反应中检测多种人乳头瘤病毒基因型。然而，该扩增方法不同于本发明所描述的方法。产生的
扩增子比本领域中基于探针的实时扩增方法所接受的长度更长(大约450bp)。优选的长度是150bp以下。该检测方法是非特异性的，并且不能可靠地区分基因型，其需要随后的使用具有6、11、16、18、31和33型HPV的类型特异性引物的实时PCR进行的病毒分型。这再次检测到分离株中人乳头瘤病毒的类型，但是一次只能检测一种基因型。
[0026] 共有引物设计方法
[0027] 用于仅检测一种人乳头瘤病毒核酸分子(例如编码L1的一部分的核酸分子)的引物和探针可以例如使用如OLIGO(Molecular Biology Insights Inc.，Cascade，Colo.)或Primer 3等
计算机程序设计。这些寡核苷酸的适当特征对于本领域技术人员来说是众所周知的。
[0028] 关于PCR引物设计的一般原理有大量的文献，其导向大量的
软件应用，最著名的是Primer 3和各种扩展。也已经开发了用于测试成对匹配的引物的快速动态规划公式。多重PCR的应用在过去十年中稳步增加，因此需要更复杂的引物选择方案。不同的
算法可能有利于特定的目标，或可能为特定的技术平台而设计。一般而言，鉴定引物对以最大化单个测定的多重
水平的问题已显示是NP完全的。已经提出在解决产品尺寸限制时消除3'
碱基互补性的近似算法。
[0029] 需要廉价、快速、稳健、高通量的用于HPV检测的实时PCR方法，其足够特异性以识别各个HPV类型，同时也是高度灵敏的。
[0030] 这些目标是矛盾的目标，因为诸如Taqman系统等实时PCR方法需要通常不允许调整不同类型HPV的灵敏度的共有引物。因此必须设计类似共有引物作用的HPV类型特异性引物，即
覆盖(理想或理论HPV基因组的)非常相同的区域。如果引物被随机放置或相邻放置，诸如Taqman等实时PCR方法将不起作用。
[0031] 这不是一个简单的设计情况。需要大量的优化，以确保类型特异性引物尽可能覆盖彼此。这是使用便捷的设计软件无法实现的。
[0032] 除考虑引物和探针序列外，还必须考虑诸如Taqman反应等高性能、稳健的实时PCR方法的所有常规设计要求。这包括确保扩增子长度小于150bp，引物的解链
温度为60℃左右，探针的解链温度为68℃左右。
[0033] 另外，检测需要高度灵敏而不会失去分析特异性。
[0034] 之前HPV检测要求尽可能特异，以使他们不发现太多不需要
治疗的HPV阳性女性(通常感染与需要治疗的病变的比例为10比1)。
[0035] 然而，通过使用特定的生物标志物，现在可以使用分类测试，其在许多HPV阳性女性中可以发现少数癌前病变。HPV现在被认为是风险因素。因此，现在需要高度灵敏的HPV测试并且更加有用，因为了解哪些患者处于风险中是非常重要的。一旦患者被确定为患有HPV，可以对其进行监测或送去进一步筛选以在早期阶段鉴定病变的发展。
[0036] 本
申请提供了廉价、快速、稳健、高通量的方法，其能够检测和鉴定所有HPV，同时保持高度的灵敏度。本发明的方法可以用作高风险HPV感染的筛选测试。基因型特异性引物和探针的使用为筛选和基因分型提供了均一的系统。先前已知的方法不能同时筛选和基因分型。
[0037] 本发明提供了检测HPV存在的方法，该方法包括使用一种或多种扩增混合物扩增获自样品的核酸，其中，所述扩增混合物选自：
[0038] (a)扩增混合物1，其包含：
[0039] 5'-TCATGCAGGAACATCCAGACT-3'(SEQ.ID NO:1)
[0040] 5'-CCAAACTTATTGGGGTCAGG-3'(SEQ.ID NO:2)
[0041] 5'-TTGCAGTTGGACATCCCTATTTTCC-3'(SEQ.ID NO:3)
[0042] (b)扩增混合物2，其包含：
[0043] 5'-TCATGCTGGCAGCTCTAGATT-3'(SEQ.ID NO:4)
[0044] 5'-GGTCAGGTAACTGCACCCTAAA-3'(SEQ.ID NO:5)
[0045] 5'-AGGGTTCCTGCAGGTGGTGGC-3'(SEQ.ID NO:6)
[0046] (c)扩增混合物3，其包含：
[0047] 5'-CACGCAGGCAGTGCTAGG-3'(SEQ.ID NO:10)
[0048] 5'-TCCAAATTTGTTTGGATCTGG-3'(SEQ.ID NO:11)
[0049] 5'-CAGTAGGCCATCCATATTATTCCATACC-3'(SEQ.ID NO:12)
[0050] (d)扩增混合物4，其包含：
[0051] 5'-GCTGGTAGTTCCAGACTTCTTGC-3'(SEQ.ID NO:13)
[0052] 5'-CCAAATTTATTAGGATCTGGTAAACG-3'(SEQ.ID NO:14)
[0053] 5'-TGGTACCCAAAGTATCAGGCTTGCA-3'(SEQ.ID NO:15)
[0054] (e)扩增混合物5，其包含：
[0055] 5'-TTATGCAGGCAGTTCTCGATT-3'(SEQ.ID NO:16)
[0056] 5'-GGGTCCGGCAATTTAATTCT-3'(SEQ.ID NO:17)
[0057] 5'-AGGACATCCCTATTTTTCTATTAAAAACACCAGT-3'(SEQ.ID NO:18)
[0058] (f)扩增混合物6，其包含：
[0059] 5'-TATCATGCAGGCAGTTCACG-3'(SEQ.ID NO:19)
[0060] 5'-AAACTTATTAGGGTCGGGCAAC-3'(SEQ.ID NO:20)
[0061] 5'-GGACAATACCAAAACAAACATTCCCA-3'(SEQ.ID NO:21)
[0062] (g)扩增混合物7，其包含：
[0063] 5'-TGCTGGCAGTTCCAGACTTT-3'(SEQ.ID NO:22)
[0064] 5'-AAACCAAATTTATTGGGATCAGG-3'(SEQ.ID NO:23)
[0065] 5'-TCCCAAGGTATCAGGCTTACAGTATAGGG-3'(SEQ.ID NO:24)
[0066] (h)扩增混合物8，其包含：
[0067] 5'-ACGCAGGCAGTTCCAGACT-3'(SEQ.ID NO:25)
[0068] 5'-GGCCAAATTTATTGGGATCA-3'(SEQ.ID NO:26)
[0069] 5'-TGGTAGACAGGATGTTCCTAAGGTGTC-3'(SEQ.ID NO:27)；或
[0070] (i)扩增混合物9，其包含：
[0071] 5'-TCATGCAGGCAGTTCTAGGC-3'(SEQ.ID NO:31)
[0072] 5'-GAAATCCAAACTTATTAGGATCTGGT-3'(SEQ.ID NO:32)
[0073] 5'-AGCAGTACCCAAGGTATCTGGTTTGCA-3'(SEQ.ID NO:33)
[0074] (j)扩增混合物10，其包含：
[0075] 5'-ATGCTGGCAGCTCTAGATTATT-3'(SEQ.ID NO:34)
[0076] 5'-TTAGGATCGGGCAATGTCAC-3'(SEQ.ID NO:35)
[0077] 5'-TGAATGGTGGTCGCAAGCAGG-3'(SEQ.ID NO:36)
[0078] (k)扩增混合物11，其包含：
[0079] 5'-GCAGGCAGTTCCCGATTATT-3'(SEQ.ID NO:37)
[0080] 5'-TCCAAATTTATTAGGATCGGGTAAA-3'(SEQ.ID NO:38)
[0081] 5'-CAG GCT GTT CCT AAG GTA TCC GCA-3'(SEQ.ID NO:39)
[0082] (l)扩增混合物12，其包含：
[0083] 5'-TGCAGGCAGTTCCAGACTAA-3'(SEQ.ID NO:40)
[0084] 5'-GAGTCCAAACTTGTTAGGATCTGGT-3'(SEQ.ID NO:41)
[0085] 5'-CCTCAACGCGTGCTGCTATTCC-3'(SEQ.ID NO:42)
[0086] (m)扩增混合物13，其包含：
[0087] 5'-TGCAGGTAGCTCTAGGTTGCT-3'(SEQ.ID NO:43)
[0088] 5'-TAGGATCAGGCAACCGTACC-3'(SEQ.ID NO:44)
[0089] CAAATCTGGTACCAAAACAAACATCCC-3'(SEQ.ID NO:45)
[0090] (n)扩增混合物14，其包含：
[0091] TGCTGGTACATCTAGGTTATTAACTG-3'(SEQ.ID NO:46)
[0092] 5'-CAGGAACACTAAATTTATTAGGATCAGG-3'(SEQ.ID NO:47)
[0093] 5'-CTATGTCTGGGGGCCGCAAG.-3'(SEQ.ID NO:48)；
[0094] 其中，SEQ ID No:3、6、12、15、18、21、24、27、33、36、39、42、45和48标记有猝灭剂和染料，一个在5'末端，一个在3'末端。优选SEQ ID No:3、6、12、15、18、21、24、27、33、36、39、42、45和48在5'末端标记有染料，在3'末端标记有猝灭剂。
[0095] 该方法可以进一步包括测量由染料产生的信号。信号的存在表明存在被测试的HPV基因型。如果没有检测到信号，那么所测试的HPV基因型不存在，并且样品来自未被所检测的HPV基因型感染的受试者。可以通过将样品暴露于适当
波长的光下以诱导来自染料的
荧光发射来检测信号。
[0096] 本发明还提供了检测HPV存在的方法，该方法包括使用一种或多种扩增混合物扩增来自样品的核酸，其中，所述扩增混合物选自：
[0097] (a)扩增混合物15，其包含：
[0098] 5'-TCATGCAGGAACATCCAGACT-3'(SEQ.ID NO:1)
[0099] 5'-CCAAACTTATTGGGGTCAGG-3'(SEQ.ID NO:2)
[0100] 5'-TTGCAGTTGGACATCCCTATTTTCC-3'(SEQ.ID NO:3)
[0101] 5'-TCATGCTGGCAGCTCTAGATT-3'(SEQ.ID NO:4)
[0102] 5'-GGTCAGGTAACTGCACCCTAAA-3'(SEQ.ID NO:5)
[0103] 5'-AGGGTTCCTGCAGGTGGTGGC-3'(SEQ.ID NO:6)
[0104] (b)扩增混合物16，其包含：
[0105] 5'-CACGCAGGCAGTGCTAGG-3'(SEQ.ID NO:10)
[0106] 5'-TCCAAATTTGTTTGGATCTGG-3'(SEQ.ID NO:11)
[0107] 5'-CAGTAGGCCATCCATATTATTCCATACC-3'(SEQ.ID NO:12)
[0108] 5'-GCTGGTAGTTCCAGACTTCTTGC-3'(SEQ.ID NO:13)
[0109] 5'-CCAAATTTATTAGGATCTGGTAAACG-3'(SEQ.ID NO:14)
[0110] 5'-TGGTACCCAAAGTATCAGGCTTGCA-3'(SEQ.ID NO:15)
[0111] 5'-TTATGCAGGCAGTTCTCGATT-3'(SEQ.ID NO:16)
[0112] 5'-GGGTCCGGCAATTTAATTCT-3'(SEQ.ID NO:17)
[0113] 5'-AGGACATCCCTATTTTTCTATTAAAAACACCAGT-3'(SEQ.ID NO:18)
[0114] 5'-TATCATGCAGGCAGTTCACG-3'(SEQ.ID NO:19)
[0115] 5'-AAACTTATTAGGGTCGGGCAAC-3'(SEQ.ID NO:20)
[0116] 5'-GGACAATACCAAAACAAACATTCCCA-3'(SEQ.ID NO:21)
[0117] 5'-TGCTGGCAGTTCCAGACTTT-3'(SEQ.ID NO:22)
[0118] 5'-AAACCAAATTTATTGGGATCAGG-3'(SEQ.ID NO:23)
[0119] 5'-TCCCAAGGTATCAGGCTTACAGTATAGGG-3'(SEQ.ID NO:24)
[0120] 5'-ACGCAGGCAGTTCCAGACT-3'(SEQ.ID NO:25)
[0121] 5'-GGCCAAATTTATTGGGATCA-3'(SEQ.ID NO:26)
[0122] 5'-TGGTAGACAGGATGTTCCTAAGGTGTC-3'(SEQ.ID NO:27)；或
[0123] (c)扩增混合物17，其包含：
[0124] 5'-TCATGCAGGCAGTTCTAGGC-3'(SEQ.ID NO:31)
[0125] 5'-GAAATCCAAACTTATTAGGATCTGGT-3'(SEQ.ID NO:32)
[0126] 5'-AGCAGTACCCAAGGTATCTGGTTTGCA-3'(SEQ.ID NO:33)
[0127] 5'-ATGCTGGCAGCTCTAGATTATT-3'(SEQ.ID NO:34)
[0128] 5'-TTAGGATCGGGCAATGTCAC-3'(SEQ.ID NO:35)
[0129] 5'-TGAATGGTGGTCGCAAGCAGG-3'(SEQ.ID NO:36)
[0130] 5'-GCAGGCAGTTCCCGATTATT-3'(SEQ.ID NO:37)
[0131] 5'-TCCAAATTTATTAGGATCGGGTAAA-3'(SEQ.ID NO:38)
[0132] 5'-CAG GCT GTT CCT AAG GTA TCC GCA-3'(SEQ.ID NO:39)
[0133] 5'-TGCAGGCAGTTCCAGACTAA-3'(SEQ.ID NO:40)
[0134] 5'-GAGTCCAAACTTGTTAGGATCTGGT-3'(SEQ.ID NO:41)
[0135] 5'-CCTCAACGCGTGCTGCTATTCC-3'(SEQ.ID NO:42)
[0136] 5'-TGCAGGTAGCTCTAGGTTGCT-3'(SEQ.ID NO:43)
[0137] 5'-TAGGATCAGGCAACCGTACC-3'(SEQ.ID NO:44)
[0138] CAAATCTGGTACCAAAACAAACATCCC-3'(SEQ.ID NO:45)
[0139] TGCTGGTACATCTAGGTTATTAACTG-3'(SEQ.ID NO:46)
[0140] 5'-CAGGAACACTAAATTTATTAGGATCAGG-3'(SEQ.ID NO:47)
[0141] 5'-CTATGTCTGGGGGCCGCAAG.-3'(SEQ.ID NO:48)；
[0142] 其中，SEQ ID No:3、6、12、15、18、21、24、27、33、36、39、42、45和48标记有猝灭剂和染料，一个在5'末端，一个在3'末端。优选SEQ ID No:3、6、12、15、18、21、24、27、33、36、39、42、45和48在5'末端标记有染料，在3'末端标记有猝灭剂。
[0143] 优选的是，该方法进一步包括用能够扩增人类对照基因(优选因子V leiden基因)的扩增混合物扩增获自样品的核酸。
[0144] 更优选的是，能够扩增人类对照基因的扩增混合物包含：
[0145] 扩增混合物18，其包含：
[0146] 5'-TCTGAAAGGTTACTTCAAGGACAA-3'(SEQ.ID NO:52)
[0147] 5'-CATCGCCTCTGGGCTAATAG-3'(SEQ.ID NO:53)
[0148] 5'-CTGTAAGAGCAGATCCCTGGACAGGC-3'(SEQ.ID NO:54)
[0149] 其中，SEQ ID NO:54标记有猝灭剂和染料，一个在5'末端，一个在3'末端。优选SEQ ID NO:54在5'末端标记有染料，在3'末端标记有猝灭剂。
[0150] 该方法包括一个或多个反应。该方法可以包括使用扩增混合物1至18的任何组合的1、2、3、4或更多个反应。该方法优选可以包括使用扩增混合物15至18的1、2、3或4个反应。优选使用扩增混合物分别进行每个反应，即每种扩增混合物与核酸样品反应。优选两种以上扩增混合物在一个反应中不混合在一起，并且每种扩增混合物的反应在单独的容器中进行。作为另一种选择，选自扩增混合物1至17，例如至多3种扩增混合物的数种扩增混合物，可选地，与诸如扩增混合物18等能够扩增人类对照基因的扩增混合物，和/或内部对照基因扩增混合物一起，可以在一个反应中使用。可以将一种、两种、三种或更多种的混合物，可选地，与人类对照基因混合物和/或内部对照基因混合物置于一个容器中。在一个反应中优选使用至多3种选自扩增混合物1至17的扩增混合物。如本文所述的“容器”是指反应室。其可以是多孔板内的一个孔，或是诸如eppendorf管等单独的容器。
[0151] 每种扩增混合物包含用于扩增和鉴定存在的任何HPV核酸序列的引物和探针。扩增混合物15号靶向HPV 16和18，扩增混合物16号靶向HPV31、33、52、56、58、59；扩增混合物17号靶向HPV35、39、45、51、66、68；扩增混合物反应18号靶向人类对照基因，例如因子V leiden基因。每个反应也优选具有内部对照。
[0152] 优选的是，所述扩增混合物进一步包含一种或多种内部对照引物。例如扩增混合物1至18可以进一步包含Seq.ID No:7、8和9，其中SEQ ID NO:9标记有猝灭剂和染料，一个在5'末端，一个在3'末端。优选SEQ ID NO:9在5'末端标记有染料，在3'末端标记有猝灭剂。例如，扩增混合物15优选进一步包含：
[0153] 5'-GTGGGGACGCCATCTATTC-3'(SEQ.ID NO:7)
[0154] 5'-TATGCGCGAGGCATATTCTA-3'(SEQ.ID NO:8)
[0155] 5'-CAGATACCGGTGCGCTGCGT-3'；(SEQ.ID NO:9)；和/或
[0156] 扩增混合物16进一步包含：
[0157] 5'-GTGGGGACGCCATCTATTC-3(SEQ.ID NO:28)
[0158] 5'-TATGCGCGAGGCATATTCTA-3(SEQ.ID NO:29)
[0159] 5'-CAGATACCGGTGCGCTGCGT-3'；(SEQ.ID NO:30)；和/或
[0160] 扩增混合物17进一步包含：
[0161] 5'-GTGGGGACGCCATCTATTC-3'(SEQ.ID NO:49)
[0162] 5'-TATGCGCGAGGCATATTCTA-3'(SEQ.ID NO:50)
[0163] 5'-CAGATACCGGTGCGCTGCGT-3'(SEQ.ID NO:51)；和/或
[0164] 扩增混合物18进一步包含：
[0165] 5'-GTGGGGACGCCATCTATTC-3'(SEQ.ID NO:55)
[0166] 5'-TATGCGCGAGGCATATTCTA-3'(SEQ.ID NO:56)
[0167] 5'-CAGATACCGGTGCGCTGCGT-3'(SEQ.ID NO:57)
[0168] 其中，SEQ ID NO:9、30、51和57标记有猝灭剂和染料，一个在5'末端，一个在3'末端。优选SEQ ID NO:9、30、51和57在5'末端标记有染料，在3'末端标记有猝灭剂。
[0169] 扩增混合物15优选由SEQ.ID NO:1-6组成；和/或
[0170] 扩增混合物16由SEQ.ID NO:10-27组成；和/或
[0171] 扩增混合物17由SEQ.ID NO:31-48组成；和/或
[0172] 扩增混合物18由SEQ.ID NO:52-54组成。
[0173] 更优选的是，扩增混合物15由SEQ.ID NO:1-9组成；和/或
[0174] 扩增混合物16由SEQ.ID NO:10-30组成；和/或
[0175] 扩增混合物17由SEQ.ID NO:31-51组成；和/或
[0176] 扩增混合物18由SEQ.ID NO:52-57组成。
[0177] 寡核苷酸引物和探针可以通过多种方法来合成，例如，Ozaki等，Nuc.Acids Res.20：5205-5214(1992)；Agrawal等，Nuc.Acids Res.18：5419-5423(1990)等。方便的是，寡核苷酸引物和探针在例如392或394型号DNA/RNA合成仪(AppliedBiosystems，Inc.，Foster City，California)等自动DNA合成仪上利用标准化学方法合成，例如，亚磷酰胺化学方法(Beaucage和Iyer，Tetrahedron 48：2223-2311(1992)，美国专利号4980460、4725677、4415732、4458066和4973679)。
[0178] SEQ.ID NO:3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33、36、39、42、45、48、51、54和57是探针。扩增混合物中使用的探针标记有猝灭剂和染料，一个在5'末端，一个在3'末端。因此，所述探针可以在5'末端标记有染料并在3'末端标记有猝灭剂或者所述探针可以在5'末端标记有猝灭剂并在3'末端标记有染料。优选扩增混合物中使用的探针在5'末端标记有染料，在3'末端标记有猝灭剂。所述染料优选是
荧光染料。在扩增过程中，通过诸如Taq聚合酶等聚合酶从探针中除去淬灭剂和/或染料，因此可以检测来自染料的信号。“在5'末端”和“3'末端”是指染料或猝灭剂分别与探针的5'末端或3'末端的核苷酸连接。
[0179] 如本文使用的，“猝灭剂”是减少由荧
光标记物发射的荧光的部分。这包括荧光发射的完全和部分抑制。抑制的程度不重要，只要一旦猝灭剂被除去就可以检测到荧光的变化即可。
[0180] 猝灭部分优选选自由以下组成的组：四甲基罗丹明(TAMRA)，可选地经取代苯类(phenyls)、
萘类(naphthyls)、蒽类(anthracenyls)、苯并噻唑类、苯并噁唑类或苯并咪唑类、芘类、蒽类、萘类、吖啶类、芪类、吲哚类、苯并吲哚类、噁唑类、苯并噁唑类、噻唑类、苯并噻唑类、4-
氨基-7-硝基苯并-2-
氧杂-1,3-二唑类、花青类、羰花青类、喹诺
酮类(carbostyryls)、卟啉类、水杨酸盐类、邻氨基苯
甲酸盐类、甘菊蓝类(azulene)、二萘嵌苯类、吡啶类、喹啉类、香豆素类、多氮杂茚烯类(polyazaindacenes)、呫吨类、噁嗪类、苯并噁嗪类、卡巴嗪类、次联苯甲酮类(phenalenones)、苯次联苯甲酮类(benzphenalenones)、卡巴嗪类、噁嗪类、4-
硼杂-3a,4a-二氮杂-茚烯类(4-bora-3a,4a-diaza-s-indacenes)、氟荧光素类、罗丹明类、甲氨基酚类(rhodols)、5-羧基氟荧光素类、5-(2'-氨乙基)氨基萘-1-磺酸类(EDANS)、邻氨基苯甲酰胺类、铽
螯合物、活性红4、4-(4'-二甲基氨基苯偶氮基)
苯甲酸(dabcyls)、硝基酪氨酸类、孔雀石绿类、德克萨斯红类、二硝基苯类、ATTO染料、EVO染料、DYO染料、Alexa染料和BODIPY染料。猝灭剂优选选自来自Life technologies的
[0181] 所述染料优选是荧光染料。代表性的供体荧光染料包括6-羧基荧光素(FAM)、四氯荧光素(TET)、荧光素、萤光黄、B-藻红蛋白、9-吖啶异硫氰酸酯、萤光黄VS、4-乙酰胺基-4'-异硫氰酸芪-2,2'-二磺酸、7-二乙氨基-3-(4'-异硫氰酰苯基)-4-甲基香豆素、琥珀酰亚胺1-丁酸芘、4-乙酰胺基-4'-异硫氰酸芪-2,2'-二磺酸衍生物，可选地，经取代的芘类、蒽类、萘类、吖啶类、芪类、吲哚类、苯并吲哚类、噁唑类、苯并噁唑类、噻唑类、苯并噻唑类、4-氨基-7-硝基苯并-2-氧杂-1、3-二唑、花青、羰花青、喹诺酮类、卟啉类、水杨酸盐类、
邻氨基苯甲酸盐类、甘菊蓝类、二萘嵌苯类、吡啶类、喹啉类、香豆素类、多氮杂茚烯类、呫吨类、噁嗪类、苯并噁嗪类、卡巴嗪类、次联苯甲酮类、苯次联苯甲酮类、卡巴嗪类、噁嗪类、4-硼杂-3a,
4a-二氮杂-茚烯类、氟荧光素类、罗丹明类、甲氨基酚类、5-羧基荧光素(FAM)、5-(2'-氨乙基)氨基萘-1-磺酸类(EDANS)、邻氨基苯甲酰胺类、铽螯合物、活性红4、德克萨斯红类、ATTO染料、EVO染料、DYO染料、Alexa染料和BODIPY染料。所述染料优选选自从Lifetechnologies获得的 和 四甲基罗丹明(TAMRA)可以作为染料以及猝灭剂，这
取决于染料/猝灭剂的组合。适合的染料/猝灭剂组合是技术人员已知的。
[0182] 一种扩增混合物中的不同探针可以用相同或不同的染料标记。如果混合物中的不同探针使用不同
颜色的染料，则可以检测到不同HPV基因型的存在。例如，如果扩增混合物15中的探针用不同颜色的染料标记，则可以鉴定样品中是否存在HPV16、HPV18或两种基因型。
[0183] 该方法可以使用两种以上扩增混合物进行。优选对每种扩增混合物进行单独的反应。例如在该方法使用两种扩增混合物的情况下，进行两个反应，每个反应在单独的室中进行。作为另一种选择，选自混合物1至17的至多3种混合物，可选地，与内部对照扩增混合物(例如SEQ.ID NO:7、8和9)和/或能够扩增人类对照基因的混合物(例如扩增混合物18)可以在单个反应室中在一个反应中混合在一起。扩增反应可以并发地进行，即同时进行，或者依次进行，即一个接一个地进行。
[0184] 优选核酸使用PCR进行扩增；更优选实时PCR。
[0185] 优选使用聚合酶链式反应(PCR)进行扩增。扩增反应可以是PCR(例如参见美国专利号4,683,195和4,683,202，及Innis等编，PCR Protocols，(Academic Press，New York，1989；Sambrook等，Molecular Cloning，第二版，(Cold Spring Harbour Laboratory，New York 1989))。当RNA被分离并优选通过逆转录转化成cDNA时，也可以使用PCR。优选使用Taq DNA聚合酶进行PCR，例如AmplitaqTM(Perkin-Elmer，Norwalk，Conn.)。Taq聚合酶也可以获自MBI Fermentas、Perkin Elmer、Boehringer Mannheim和Beckman Instruments。在本发明的方法中也可以使用等同的，优选热稳定的DNA聚合酶，如Tfl(Thermus flavus)聚合酶(Gut等，Virol.Methods 77(1)：37-46(1999))。
[0186] 作为另一种选择，扩增反应可以是RT-PCR(Yajima等，Clin.Chem，44(12)：2441-2445(1998)；Martell等，J.Clin.Microbiol.，37(2)：327-332(1999)；Gut等，Virol.Methods 77(1)：37-46(1999)；Predhomme等，Leukemia，13(6)：957-964(1999))，其中RNA被逆转录成cDNA，然后cDNA进行PCR扩增。
[0187] 众所周知，PCR涉及DNA(或RNA)样品的提取和变性(优选通过加热)。加入摩尔过量的寡核苷酸引物及聚合酶(其可以是热稳定的)和dNTP以形成扩增的序列。设计寡核苷酸引物以与扩增所需序列的相反末端杂交。在第一轮扩增中，聚合酶复制DNA以产生两个“长产物”，其以相应的引物开始。然后将包含两个长产物和两条原始链的总DNA变性，并进行第二轮聚合(例如通过降低温度)。第二轮的结果是两条原始链、来自第一轮的两个长产物、两个新的长产物(由原始链产生)和两个由长产物产生的“短产物”。这些短产物具有在每个末端具有引物的靶序列的序列(正义或反义)。对于每一轮额外的扩增，短产物的数量呈指数增长，每一轮产生两个额外的长产物，并且短产物的数量等于在前一轮结束时剩余的长产物和短产物的总和。
[0188] 优选使用Taqman系统扩增核酸。TAQMANTM技术检测是否存在扩增产物，从而检测是TM否存在人乳头瘤病毒。TAQMAN 技术使用一个标记有两个荧光部分的单链杂交探针。当用合适波长的
光激发第一荧光部分时，根据FRET原理，吸收的
能量传递到第二荧光部分。第二荧光部分通常是猝灭剂分子。在PCR反应的
退火步骤期间，标记的杂交探针与靶DNA结合，并在随后的延伸阶段期间被Taq聚合酶的5'至3'外切核酸酶活性降解。作为结果，激发的荧光部分和第二荧光部分在空间上相互分离。因此，在不存在第二荧光的情况下激发第一荧光部分时，来自第一荧光部分的荧光发射被可检测地改变。例如，如果第二荧光部分是猝灭剂，则来自第一荧光部分的荧光发射增加，从而可被检测到。举例而言，ABI PRISMTM 7700序列检测系统(AppliedBiosystems，Foster City，Calif.)使用TAQMANTM技术，并且适用于执行检测人乳头瘤病毒的方法。有关使用ABI PRISMTM 7700系统进行PCR扩增和检测的信息可在Applied Biosystems
网站找到。
[0189] 本发明的方法在获自生物样品的核酸上进行。代表性的生物样品包括宫颈刮取物、活检、涂片或
石蜡组织切片、发生人乳头瘤病毒感染的解剖部位的其他刮取物和尿液。所述样品优选选自支气管抽吸物、尿液、前列腺按摩液(massate)、精液(ejaculatum)、血液和宫颈、外阴、肛门、生殖器、
皮肤或喉细胞学样品、刮取物或活检样品。样品优选为宫颈刮取物，如巴氏涂片测试期间获得的宫颈刮取物。可以使用常规方法从样品中分离核酸。
[0190] 如本文使用的，“核酸”是指以其各种形式的DNA和RNA，例如mRNA和hnRNA。核酸可以是单链或双链的。
[0191] 优选的扩增混合物包含以下扩增混合物或由以下扩增混合物组成：
[0192] 扩增混合物A
[0193]HPV16/tqm4/F：TCATGCAGGAACATCCAGACT
HPV16/tqm4/R：CCAAACTTATTGGGGTCAGG
HPV16Tqm/T1/VIC/Q：5'-VIC-TTGCAGTTGGACATCCCTATTTTCC-QSY-3'
HPV18/tqm4/F：TCATGCTGGCAGCTCTAGATT
HPV18/tqm4/R：GGTCAGGTAACTGCACCCTAAA
HPV18Tqm/T2/FAM/Q：5'-FAM-AGGGTTCCTGCAGGTGGTGGC-QSY-3
TQMIC/hdv/F1：5-gtggggacgccatctattc-3
TQMIC/hdv/R1：5-tatgcgcgaggcatattcta-3
TQMIC/T1/JUN/Q：5-CY5-CAGATACCGGTGCGCTGCGT-QSY-3
[0194] 扩增混合物B
[0195]
[0196]
[0197]
[0198] 本发明还提供了用于检测HPV的扩增混合物，所述扩增混合物包含：
[0199] (a)SEQ.ID NO:1-3；及可选地，SEQ.ID NO:7-9
[0200] (b)SEQ.ID NO:3-6；及可选地，SEQ.ID NO:7-9
[0201] (c)SEQ.ID NO:10-12；及可选地，SEQ.ID NO:28-30
[0202] (d)SEQ.ID NO:13-15；及可选地，SEQ.ID NO:28-30
[0203] (e)SEQ.ID NO:16-18；及可选地，SEQ.ID NO:28-30
[0204] (f)SEQ.ID NO:19-21；及可选地，SEQ.ID NO:28-30
[0205] (g)SEQ.ID NO:22-24；及可选地，SEQ.ID NO:28-30
[0206] (h)SEQ.ID NO:25-27；及可选地，SEQ.ID NO:28-30
[0207] (i)SEQ.ID NO:31-33；及可选地，SEQ.ID NO:49-51
[0208] (j)SEQ.ID NO:34-36；及可选地，SEQ.ID NO:49-51
[0209] (k)SEQ.ID NO:37-39；及可选地，SEQ.ID NO:49-51
[0210] (l)SEQ.ID NO:40-42；及可选地，SEQ.ID NO:49-51
[0211] (m)SEQ.ID NO:43-45；及可选地，SEQ.ID NO:49-51
[0212] (n)SEQ.ID NO:46-48；及可选地，SEQ.ID NO:49-51
[0213] 其中，SEQ ID No:3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33、36、39、42、45、48和51标记有猝灭剂和染料，一个在5'末端，一个在3'末端。优选SEQ ID NO:3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33、36、39、42、45、48和51在5'末端标记有染料，在3'末端标记有猝灭剂。
[0214] 本发明还提供了用于检测HPV的扩增混合物，所述扩增混合物包含：
[0215] (a)SEQ.ID NO:1-6；及可选地，SEQ.ID NO:7-9或
[0216] (b)SEQ.ID NO:10-27；及可选地，SEQ.ID NO:28-30或
[0217] (c)SEQ.ID NO:31-48；及可选地，SEQ.ID NO:49-51
[0218] 其中，SEQ ID No:3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33、36、39、42、45、48和51标记有猝灭剂和染料，一个在5'末端，一个在3'末端。优选SEQ ID NO:3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33、36、39、42、45、48和51在5'末端标记有染料，在3'末端标记有猝灭剂。
[0219] 本申请还提供了用于检测HPV的
试剂盒，其包含一种或多种选自以下的扩增混合物：
[0220] (a)SEQ.ID NO:1-3；及可选地，SEQ.ID NO:7-9
[0221] (b)SEQ.ID NO:3-6；及可选地，SEQ.ID NO:7-9
[0222] (c)SEQ.ID NO:10-12；及可选地，SEQ.ID NO:28-30
[0223] (d)SEQ.ID NO:13-15；及可选地，SEQ.ID NO:28-30
[0224] (e)SEQ.ID NO:16-18；及可选地，SEQ.ID NO:28-30
[0225] (f)SEQ.ID NO:19-21；及可选地，SEQ.ID NO:28-30
[0226] (g)SEQ.ID NO:22-24；及可选地，SEQ.ID NO:28-30
[0227] (h)SEQ.ID NO:25-27；及可选地，SEQ.ID NO:28-30
[0228] (i)SEQ.ID NO:31-33；及可选地，SEQ.ID NO:49-51
[0229] (j)SEQ.ID NO:34-36；及可选地，SEQ.ID NO:49-51
[0230] (k)SEQ.ID NO:37-39；及可选地，SEQ.ID NO:49-51
[0231] (l)SEQ.ID NO:40-42；及可选地，SEQ.ID NO:49-51
[0232] (m)SEQ.ID NO:43-45；及可选地，SEQ.ID NO:49-51
[0233] (n)SEQ.ID NO:46-48；及可选地，SEQ.ID NO:49-51
[0234] 其中，SEQ ID No:3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33、36、39、42、45、48和51标记有猝灭剂和染料，一个在5'末端，一个在3'末端。优选SEQ ID NO:3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33、36、39、42、45、48和51在5'末端标记有染料，在3'末端标记有猝灭剂。
[0235] 本申请还提供了用于检测HPV的试剂盒，其包含选自以下的一种或多种扩增混合物：
[0236] (a)SEQ.ID NO:1-6；及可选地，SEQ.ID NO:7-9或
[0237] (b)SEQ.ID NO:10-27；及可选地，SEQ.ID NO:28-30或
[0238] (c)SEQ.ID NO:31-48；及可选地，SEQ.ID NO:49-51
[0239] 其中，SEQ ID No:3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33、36、39、42、45、48和51标记有猝灭剂和染料，一个在5'末端，一个在3'末端。优选SEQ ID NO:3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33、36、39、42、45、48和51在5'末端标记有染料，在3'末端标记有猝灭剂。
[0240] 优选地，所述试剂盒进一步包含扩增混合物，所述扩增混合物包含：
[0241] (d)SEQ.ID NO:52-54及可选地，SEQ.ID No:55-57，
[0242] 其中，SEQ ID NO:54和57标记有猝灭剂和染料，一个在5'末端，一个在3'末端。优选SEQ ID NO:54和57在5'末端标记有染料，在3'末端标记有猝灭剂。
[0243] 试剂盒还可以包括
包装标签或包装插页，其上具有用于使用引物混合物和探针对来检测生物样品中是否存在人乳头瘤病毒的说明。
[0244] 试剂盒可以进一步包含其他组分，例如PCR所需的试剂。这样的试剂包括缓冲液、适合的DNA聚合酶和dNTP(如dATP，dCTP，dGTP和dTTP)。试剂盒组分可以存在于许多小瓶或其他容器中。可以将试剂冻干，用于在使用之前进行稍后重构。作为另一种选择，组分可以以适合的缓冲溶液提供，以备使用。这样的溶液可以含有适合的
防腐剂。
[0245] 现在将参照下面的非限制性
实施例来描述本发明：实施例
[0246] 2,522名18岁至65岁的低风险女性(低风险意味着没有已知的HPV感染或入选前24个月细胞学阳性)进行了测试。
[0247] 通过使用基于96孔
二氧化硅结合板的离心的标准方法进行DNA提取。这是一种低成本和高通量的方法。
[0248] 使用液体处理
机器人以384孔格式进行PCR设置。
[0249] 对于每个反应，将如下表所详述的6μl扩增混合物加入到10μl洗脱的DNA中，进入每个反应
[0250] 扩增混合物A
[0251]
[0252]
[0253] 扩增混合物B
[0254]
[0255] 扩增混合物C
[0256]
[0257]
[0258] 扩增混合物D
[0259]引物/探针名称 量/反应 起始浓度 最终浓度
FV F1 0.0625 100μM 0.5μM
FV R1 0.0625 100μM 0.5μM
FV PN4/FAM 0.0125 100μM 0.1μM
IC2hdv/F 0.0625 100μM 0.5μM
IC2hdv/R 0.0625 100μM 0.5μM
IC T1Cy5 0.0125 100μM 0.1μM
D.V. 2.175 - -
[0260] TAQmanPCR使用所示的标准Taqman热曲线进行
[0261]
[0262] 将所得结果与使用Roche COBAS方法获得的结果进行比较。
[0263] Roche COBAS HPV发现20.22％的样品为阳性(95％置信区间：18.67％至21.84％)[0264] 本发明的方法将24.23％的样品鉴定为阳性(95％置信区间：22.57％至25.95％)[0265] 本发明的方法发现显著更多的阳性样品，从而鉴定了更多处于发展病变和癌性状况的风险中的女性。
