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微球形多孔可生物相容 支架及制造该支架的方法和装置

阅读：480发布：2022-08-04

专利汇可以提供微球形多孔可生物相容支架及制造该支架的方法和装置专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明提供了包含大孔和微孔的双孔聚合物微球。本发明还提供了制造这些微球的方法和装置。本发明进一步提供了使用双孔聚合物微球的方法。，下面是微球形多孔可生物相容支架及制造该支架的方法和装置专利的具体信息内容。

权利要求

1.制备双孔聚合物颗粒的方法，所述方法包括：
(a)提供包含基质聚合物、第一溶剂和第二溶剂的均质溶液；
(b)向所述溶液中加入大孔间隔子材料；
(c)将所述溶液的液滴注射进淬冷装置中；
(d)淬冷所述溶液的液滴，以将所述基质聚合物固化成具有大孔和微孔的颗粒；
(e)从所述淬冷装置提取基本为球形的颗粒，并任选地筛分所述颗粒；和
(f)任选地从所述颗粒中洗涤去所述大孔间隔子材料。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述颗粒是微球。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述颗粒是基本为球形的微球。
4.如权利要求1-3中任一项权利要求所述的方法，其中所述基质聚合物可溶于所述第一溶剂。
5.如权利要求1-4中任一项权利要求所述的方法，其中所述基质聚合物不可溶于所述第二溶剂。
6.如权利要求1-5中任一项权利要求所述的方法，其中所述第二溶剂可与所述第一溶剂混溶。
7.如权利要求1-6中任一项权利要求所述的方法，其中所述第一溶剂和所述第二溶剂是可混溶的，使得所述基质聚合物基本溶解在所述均质溶液中。
8.如权利要求1-7中任一项权利要求所述的方法，其中所述第一溶剂与所述第一溶剂和第二溶剂的总体积的体积比在约1％到约50％v/v之间、约1％到约40％v/v之间、约
2％到约30％v/v之间、约4％到约25％v/v之间、或约5％到约15％v/v之间。
9.如权利要求1-8中任一项权利要求所述的方法，其中所述溶液中的所述基质聚合物的浓度在约0.1％到约50％重量之间、约1％到约40％重量之间、约5％到约23％重量之间、或约10％到约20％重量之间。
10.如权利要求1-9中任一项权利要求所述的方法，其中所述大孔间隔子材料在所述第一溶剂和基质聚合物中是不可混溶的或仅轻微混溶的。
11.如权利要求1-10中任一项权利要求所述的方法，其中所述大孔间隔子材料在所述第二溶剂中是可混溶的。
12.如权利要求1-11中任一项权利要求所述的方法，其中所述大孔间隔子材料是氯化钠。
13.如权利要求1-12中任一项权利要求所述的方法，其中所述第二溶剂是水。
14.如权利要求1-9中任一项权利要求所述的方法，其中所述大孔间隔子材料在所述第一溶剂或第二溶剂中是不可混溶的。
15.如权利要求1-14中任一项权利要求所述的方法，其中所述大孔间隔子材料可溶于第三溶剂或在洗涤中使用的其他介质。
16.如权利要求1-15中任一项权利要求所述的方法，其中所述大孔间隔子材料是添加剂。
17.如权利要求16所述的方法，其中所述大孔间隔子材料是顺铂。
18.如权利要求15所述的方法，其中所述大孔间隔子材料是顺铂，且所述介质是基于氮的介质。
19.如权利要求1-18中任一项权利要求所述的方法，其中所述大孔间隔子材料是不可生物吸收的。
20.如权利要求19所述的方法，其中所述大孔间隔子材料栓塞管腔结构例如血管。
21.如权利要求1-18中任一项权利要求所述的方法，其中所述大孔间隔子材料是可生物吸收的。
22.如权利要求1-21中任一项权利要求所述的方法，其中所述大孔间隔子材料是无毒的和/或可生物相容的。
23.如权利要求1-21中任一项权利要求所述的方法，其中所述大孔间隔子材料选自碱金属和碱土金属卤化物、磷酸盐、硫酸盐；糖、糖的晶体；水溶性聚合物、微球、纳米颗粒、水溶性聚合物的微球；蛋白、白蛋白和氯化钠。
24.如权利要求1-23中任一项权利要求所述的方法，其中所述基质聚合物可溶于所述第一溶剂且可与所述第二溶剂混溶，且其中所述第一溶剂与所述第二溶剂的比例在允许所述基质聚合物溶解形成均质溶液的范围内。
25.如权利要求1-24中任一项权利要求所述的方法，其中所述第一溶剂是1，4-二噁烷。
26.如权利要求1-25中任一项权利要求所述的方法，其中所述第二溶剂是水。
27.如权利要求1-26中任一项权利要求所述的方法，其中所述淬冷的速度有效地在所述第一溶剂和第二溶剂的液液分层开始前导致所述第一溶剂结晶。
28.如权利要求1-27中任一项权利要求所述的方法，其中所述淬冷未在碟形模具中完成。
29.如权利要求1-28中任一项权利要求所述的方法，其中所述大孔的直径范围是约20到约500微米。
30.如权利要求1-29中任一项权利要求所述的方法，其中所述微孔的直径范围是约1到约70微米。
31.如权利要求1-30中任一项权利要求所述的方法，其中所述颗粒的直径范围是约50到约1100微米。
32.如权利要求1-31中任一项权利要求所述的方法，其中所述洗涤包含过滤、应用热、和升华中的一种或多种。
33.如权利要求1-32中任一项权利要求所述的方法，进一步包括提供添加剂。
34.如权利要求33所述的方法，其中在所述淬冷之前向所述溶液提供所述添加剂。
35.如权利要求33或34所述的方法，其中在所述淬冷之后向所述溶液提供所述添加剂。
36.如权利要求33-35中任一项权利要求所述的方法，其中在所述淬冷期间向所述溶液提供所述添加剂。
37.如权利要求33-36中任一项权利要求所述的方法，其中在所述注射之前向所述溶液提供所述添加剂。
38.如权利要求33-37中任一项权利要求所述的方法，其中在所述注射之后向所述溶液提供所述添加剂。
39.如权利要求33-38中任一项权利要求所述的方法，其中在所述注射期间向所述溶液提供所述添加剂。
40.如权利要求33-39中任一项权利要求所述的方法，其中在所述洗涤之前向所述溶液提供所述添加剂。
41.如权利要求33-40中任一项权利要求所述的方法，其中在所述洗涤之后向所述溶液提供所述添加剂。
42.如权利要求33-41中任一项权利要求所述的方法，其中在所述洗涤期间向所述溶液提供所述添加剂。
43.如权利要求33-42中任一项权利要求所述的方法，其中所述添加剂共价连接在聚合物上。
44.如权利要求43所述的方法，其中所述添加剂共价连接在所述聚合物的一个或多个悬垂的游离羧酸基团上。
45.如权利要求33-44中任一项权利要求所述的方法，其中将所述添加剂结合入所述颗粒中或包涂在所述颗粒上。
46.如权利要求33-45中任一项权利要求所述的方法，其中所述添加剂附着在所述颗粒的表面上。
47.如权利要求46所述的方法，其中所述添加剂通过与所述基质聚合物交联、离子键合、酸碱反应、受体位点吸引、或重力，附着在所述微球的表面上。
48.如权利要求1-47中任一项权利要求所述的方法，其中(a)-(f)中的一项或多项在低于42℃的温度下进行。
49.如权利要求48所述的方法，其中(a)-(f)各项在低于42℃的温度下进行。
50.如权利要求1-49中任一项权利要求所述的方法，其中所述基质聚合物包含可生物相容的聚合物或单体，或由其组成。
51.如权利要求1-50中任一项权利要求所述的方法，其中所述基质聚合物包含可生物吸收的和/或可生物降解的聚合物或单体，或由其组成。
52.如权利要求1-51中任一项权利要求所述的方法，其中所述基质聚合物包含以下物质或由以下物质组成：聚羟基-链烷酸酯(PHA)、聚(羟基丁酸酯)(PHB)、聚(羟基丁酸酯-共-羟基戊酸酯)(PVBV)、α-羟基羧酸及其共聚物、聚(乳)酸(PLA)、聚(乙交酯)(PGA)；聚己内酯(PCL)；聚酯酰胺；脂肪族共聚酯；芳香族共聚酯；多糖、淀粉、木质纤维素材料、果胶、壳聚糖、几丁质、胶、蜡；蛋白、脂质、酪蛋白、乳清、胶原、明胶、纤维蛋白、葡糖胺聚糖(GAGS)；玉米蛋白、大豆蛋白、谷蛋白、聚氧乙烯/聚对苯二甲酸乙二酯或其共聚物；带有羟基末端的柔性链的乳酸和/或乙醇酸共聚物、聚(亚炕基二醇)、羟基末端的聚氧乙烯、聚氧丙烯、聚(氧乙烯-共-氧丙烯)、聚四氢呋喃链、聚(氧乙烯乙二醇)、聚(氧丙烯)-聚(氧乙烯)-乙二醇嵌段共聚物、聚(氧丁烯)乙二醇、聚己内酯、聚羟基丁酸酯、聚酯/聚碳酸酯/聚酸酐和聚(原酸酯)的共聚物；基于双酚-A的聚磷酸酯、聚(双酚-A苯基磷酸酯)、聚(双酚-A乙基磷酸酯)、聚(双酚-A乙基膦酸酯)、聚(双酚-A苯基膦酸酯)、聚[双(2-乙氧基)对苯二甲酸氢膦酸酯]、基于双酚-A的聚(磷酸酯)的共聚物、源自酪氨酸的双酚单体、聚亚胺碳酸酯、聚碳酸酯、聚丙烯酸酯、聚氨酯聚醚、去氨基酪氨酰-酪氨酸(DT)酯、去氨基酪氨酰酪氨酸乙酯(DTE)、去氨基酪氨酰酪氨酸丁酯(DTB)、去氨基酪氨酰酪氨酸己酯(DTH)、去氨基酪氨酰酪氨酸辛酯(DTO)、聚碳酸酯、聚亚胺碳酸酯、聚芳酯、聚氨酯、聚(环氧烷烃醚)、由α-和β-羟基酸和酪氨酸衍生物制备得到的二羟基单体聚合成的聚(环氧烷烃)嵌段共聚物、聚碳酸酯和聚芳酯与聚(环氧烷烃)的嵌段共聚物、聚碳酸酯、聚亚胺碳酸酯、聚芳酯、聚(环氧烷烃)嵌段共聚物、聚碳酸酯与聚(环氧烷烃)的嵌段共聚物、聚芳酯与聚(环氧烷烃)的嵌段共聚物、α-羟基羧酸、聚(己内酯)、聚(羟基丁酸酯)、聚酸酐、聚(原酸酯)、聚酯基于双酚-A的聚(磷酸酯)、聚碳酸酯、聚芳酯、聚碳酸酯和聚(环氧烷烃)的共聚物、聚丙烯酸酯和聚(环氧烷烃)的共聚物、α-羟基羧酸、聚(己内酯)、聚(羟基丁酸酯)、聚酸酐、聚(原酸酯)、聚酯基于双酚-A的聚(磷酸酯)、或其组合。
53.如权利要求1-51中任一项权利要求所述的方法，其中所述基质聚合物包含下式化合物或由其组成：
其中R1是-CH＝CH-或(-CH2-)n，其中n是零或从1到8的整数；且R2选自包含最多
18个碳原子的直链和带支链的烷基和烷基芳基基团。
54.如权利要求2-53中任一项权利要求所述的方法，进一步包括将颗粒灭菌。
55.包含基质聚合物的双孔颗粒，其中所述颗粒包含直径范围在约20到约500微米的大孔和直径范围在约1到约70微米的微孔，且其中所述微球的直径范围是约50到约1100微米。
56.如权利要求55所述的颗粒，其中所述颗粒是微球。
57.如权利要求56所述的颗粒，其中所述微球是基本为球形的微球。
58.如权利要求55-57中任一项权利要求所述的颗粒，其中所述颗粒进一步包含添加剂。
59.如权利要求58所述的颗粒，其中所述添加剂共价连接在所述聚合物上。
60.如权利要求59所述的颗粒，其中所述添加剂共价连接在所述聚合物的一个或多个悬垂的游离羧酸基团上。
61.如权利要求58-60中任一项权利要求所述的颗粒，其中将所述添加剂结合入所述颗粒中或包涂在所述颗粒上。
62.如权利要求58-61中任一项权利要求所述的颗粒，其中所述添加剂附着在所述颗粒的表面上。
63.如权利要求62所述的颗粒，其中所述添加剂通过与所述基质聚合物交联、离子键合、酸碱反应、受体位点吸引、或重力，附着在所述颗粒的表面上。
64.如权利要求55-63中任一项权利要求所述的颗粒，其中所述颗粒包含可生物相容的聚合物或单体，或由其组成。
65.如权利要求55-64中任一项权利要求所述的颗粒，其中所述聚合物或单体是可生物吸收的和/或可生物降解的聚合物或单体。
66.如权利要求55-65中任一项权利要求所述的颗粒，其中所述基质聚合物包含以下物质或由以下物质组成：聚羟基-链烷酸酯(PHA)、聚(羟基丁酸酯)(PHB)、聚(羟基丁酸酯-共-羟基戊酸酯)(PVBV)、α-羟基羧酸及其共聚物、聚(乳)酸(PLA)、聚(乙交酯)(PGA)；聚己内酯(PCL)；聚酯酰胺；脂肪族共聚酯；芳香族共聚酯；多糖、淀粉、木质纤维素材料、果胶、壳聚糖、几丁质、胶、蜡；蛋白、脂质、酪蛋白、乳清、胶原、明胶、纤维蛋白、葡糖胺聚糖(GAGS)；玉米蛋白、大豆蛋白、谷蛋白、聚氧乙烯/聚对苯二甲酸乙二酯或其共聚物；带有羟基末端的柔性链的乳酸和/或乙醇酸共聚物、聚(亚烷基二醇)、羟基末端的聚氧乙烯、聚氧丙烯、聚(氧乙烯-共-氧丙烯)、聚四氢呋喃链、聚(氧乙烯乙二醇)、聚(氧丙烯)-聚(氧乙烯)-乙二醇嵌段共聚物、聚(氧丁烯)乙二醇、聚己内酯、聚羟基丁酸酯、聚酯/聚碳酸酯/聚酸酐和聚(原酸酯)的共聚物；基于双酚-A的聚磷酸酯、聚(双酚-A苯基磷酸酯)、聚(双酚-A乙基磷酸酯)、聚(双酚-A乙基膦酸酯)、聚(双酚-A苯基膦酸酯)、聚[双(2-乙氧基)对苯二甲酸氢膦酸酯]、基于双酚-A的聚(磷酸酯)共聚物、源自酪氨酸的双酚单体、聚亚胺碳酸酯、聚碳酸酯、聚丙烯酸酯、聚氨酯聚醚、去氨基酪氨酰-酪氨酸(DT)酯、去氨基酪氨酰酪氨酸乙酯(DTE)、去氨基酪氨酰酪氨酸丁酯(DTB)、去氨基酪氨酰酪氨酸己酯(DTH)、去氨基酪氨酰酪氨酸辛酯(DTO)、聚碳酸酯、聚亚胺碳酸酯、聚芳酯、聚氨酯、聚(环氧烷烃醚)、由α-和β-羟基酸和酪氨酸衍生物制备得到的二羟基单体聚合成的聚(环氧烷烃)嵌段共聚物、聚碳酸酯和聚芳酯与聚(环氧烷烃)的嵌段共聚物、聚碳酸酯、聚亚胺碳酸酯、聚芳酯、聚(环氧烷烃)嵌段共聚物、聚碳酸酯与聚(环氧烷烃)的嵌段共聚物、聚芳酯与聚(环氧烷烃)的嵌段共聚物、α-羟基羧酸、聚(己内酯)、聚(羟基丁酸酯)、聚酸酐、聚(原酸酯)、聚酯基于双酚-A的聚(磷酸酯)、聚碳酸酯、聚芳酯、聚碳酸酯和聚(环氧烷烃)的共聚物、聚丙烯酸酯和聚(环氧烷烃)的共聚物、α-羟基羧酸、聚(己内酯)、聚(羟基丁酸酯)、聚酸酐、聚(原酸酯)、聚酯基于双酚-A的聚(磷酸酯)、或其组合。
67.如权利要求55-65中任一项权利要求所述的颗粒，其中所述基质聚合物包含下式化合物或由其组成：
其中R1是-CH＝CH-或(-CH2-)n，其中n是零或从1到8的整数；且R2选自包含最多
18个碳原子的直链和带支链的炕基和烷基芳基基团。
68.如权利要求55-67中任一项权利要求所述的颗粒，其中所述颗粒包含聚乙烯醇。
69.如权利要求68所述的颗粒，其中所述颗粒进一步包含丙烯酸、丙烯酰胺或丙烯酸酯聚合物或共聚物。
70.如权利要求55-67中任一项权利要求所述的颗粒，其中所述颗粒包含丙烯酸、丙烯酰胺或丙烯酸酯聚合物或共聚物。
71.如权利要求55-67中任一项权利要求所述的颗粒，其中所述颗粒包含三丙烯酰胺聚合物。
72.如权利要求55-67中任一项权利要求所述的颗粒，其中所述基质聚合物是
N-三-羟甲基甲基丙烯酰胺、二乙基氨基乙基丙烯酰胺、N，N-亚甲基双丙烯酰胺、或其组合。
73.如权利要求55-67中任一项权利要求所述的颗粒，其中所述颗粒包含丙烯酸钠和乙烯醇共聚物。
74.如权利要求1-73中任一项权利要求所述的颗粒，其中所述颗粒进一步包含细胞粘附促进剂。
75.如权利要求1-74中任一项权利要求所述的颗粒，其中所述颗粒包含明胶。
76.如权利要求1-75中任一项权利要求所述的颗粒，其中所述颗粒是交联的。
77.如权利要求1-75中任一项权利要求所述的颗粒，其中所述颗粒不是交联的。
78.如权利要求55-77中任一项权利要求所述的颗粒，其中所述颗粒是无菌的。
79.通过如权利要求1-55中任一项权利要求所述的方法制备的双孔颗粒。
80.如权利要求55-79中任一项权利要求所述的颗粒，其进一步包含细胞。
81.如权利要求80所述的颗粒，其中所述细胞是干细胞。
82.如权利要求81所述的颗粒，其中所述干细胞不是人胚胎干细胞。
83.可注射的组合物，其包含如权利要求55-82中任一项权利要求所述的颗粒和药学上可接受的载体。
84.在患者中完全或部分栓塞的方法，该方法包括对患者施用如权利要求55-82中任一项权利要求所述的颗粒。
85.治疗或控制癌或肿瘤的方法，该方法包括向患者的直接或间接地向癌或肿瘤供血的血管、静脉或动脉施用如权利要求55-82中任一项权利要求所述的颗粒。
86.如权利要求85所述的方法，其中所述颗粒提供或允许对癌或肿瘤的暂时或连续灌注。
87.向患者递送细胞的方法，该方法包括对患者施用如权利要求80-82中任一项权利要求所述的颗粒。
88.如权利要求87所述的方法，其中所述细胞被递送到患者的组织或器官，或者所述细胞与患者的组织或器官接触。
89.在患者的组织或器官中保留细胞的方法，该方法包括对患者施用如权利要求
80-82中任一项权利要求所述的颗粒，并将所述细胞与所述组织或器官接触。
90.在患者的组织或器官中植入细胞的方法，该方法包括对患者施用如权利要求
80-82中任一项权利要求所述的颗粒，并将所述细胞与所述组织或器官接触。
91.在患者中组织再生的方法，该方法包括对患者施用如权利要求80-82中任一项权利要求所述的颗粒。
92.如权利要求91所述的方法，其中所述细胞与被再生的组织接触。
93.如权利要求88-92中任一项权利要求所述的方法，其中所述组织是心脏组织、肺组织、神经组织、脑组织、肝脏组织、胰腺组织或子宫组织。
94.如权利要求88-92所述的方法，其中所述组织是血管、静脉或动脉。
95.如权利要求88-94中任一项权利要求所述的方法，其中所述组织是伤口或其他受损伤组织。
96.在患者中移植胰岛细胞的方法，该方法包括对患者施用如权利要求80所述的颗粒，其中所述细胞是胰岛细胞。
97.在患者中治疗或控制糖尿病的方法，该方法包括对患者施用如权利要求80所述的颗粒，其中所述细胞是胰岛细胞。
98.如权利要求96或97所述的方法，其中向所述患者的肝脏的门静脉施用所述颗粒。
99.如权利要求96-98中任一项权利要求所述的方法，其中所述胰岛细胞生成胰岛素。
100.如权利要求87-99中任一项权利要求所述的方法，其中所述颗粒提供或允许对所述细胞被递送区域的暂时或连续灌注。
101.在患者中动脉内近距离治疗的方法，该方法包括对患者施用如权利要求55-82中任一项权利要求所述的颗粒。
102.如权利要求101所述的方法，其中所述颗粒包含添加剂。
103.如权利要求102所述的方法，其中所述添加剂是放射性材料。
104.如权利要求100-103中任一项权利要求所述的方法，其中将所述颗粒施用至癌或肿瘤。
105.如权利要求104所述的方法，其中所述颗粒提供或允许对癌或肿瘤的暂时或连续灌注。
106.如权利要求104或105所述的方法，其中所述颗粒完全或部分地栓塞了患者的直接或间接地向癌或肿瘤供血的血管、静脉或动脉。
107.向患者递送添加剂的方法，该方法包括对患者施用如权利要求55-82中任一项权利要求所述的颗粒，其中所述颗粒包含所述添加剂。
108.如权利要求107所述的方法，其中所述添加剂是治疗剂或药物。
109.如权利要求107所述的方法，其中所述添加剂是示踪剂或显像剂。
110.如权利要求109所述的方法，其中所述示踪剂或显像剂是放射标记的抗体、FDG、碘造影剂、铁磁剂、SIPO、钆螯合物、镁、钡、放射性核苷酸、或其组合。
111.在患者中延长和/或控制添加剂的递送的方法，该方法包括对患者施用如权利要求55-82中任一项权利要求所述的颗粒，其中所述颗粒包含所述所述添加剂。
112.如权利要求111所述的方法，其中所述添加剂是治疗剂或药物。
113.如权利要求111所述的方法，其中所述治疗剂或药物是激素、生育控制剂、香料、润肤剂、防晒剂、抗炎剂、抗真菌剂、抗微生物剂、或其组合。
114.如权利要求111-113中任一项权利要求所述的方法，其中通过管腔内、间质、真皮下、经皮或皮下施用对患者施用所述颗粒。
115.从患者的血液中捕获、过滤或提取细胞的方法，该方法包括施用如权利要求
55-82中任一项权利要求所述的颗粒，其中所述颗粒允许通过所述颗粒的灌注，且其中所述颗粒从所述患者的血液中捕获、过滤或提取所述细胞。
116.制造双孔聚合物颗粒的装置，其包括：
(a)储存容器；
(b)淬冷塔；
(c)包含喷嘴的注射器，其中所述喷嘴具有的直径范围是约5到约1100微米；且其中所述容器与所述注射器连接；和
(d)一个或多个微筛。
117.如权利要求116所述的装置，其中所述注射器进一步包含筒腔和活塞。
118.如权利要求116或117所述的装置，其中所述储存容器进一步包含搅拌器或混合器。
119.如权利要求116-118中任一项权利要求所述的装置，其中所述储存容器包含第一溶剂、第二溶剂和基质聚合物。
120.如权利要求116-119中任一项权利要求所述的装置，其进一步包含与储存容器相连的导管。
121.如权利要求120所述的装置，其中所述导管包含大孔间隔子材料。

说明书全文

微球形多孔可生物相容 支架及制造该支架的方法和装置

[0001] 相关申请的相互参考

[0002] 本申请对2008年10月30日提交的美国临时序列号61/197,803主张权益，该临时申请通过参考完整并入本文。

技术领域

[0003] 本发明提供了包含大孔和微孔的双孔聚合物微球，以及制造此类微球的方法和装置。本发明进一步提供了使用双孔聚合物微球的方法。

背景技术

[0004] 合成的可生物相容的多孔支架，例如在美国专利号6,337,198(Levene等)中公开的那些，可被用作支撑细胞生长和组织再生的框架。Levene等公开了具有双孔分布的基于聚合物的支架的制造方法，其中较大的孔为约50到约500微米，而较小的孔小于20微米。Levene等的支架结构的缺点之一是其相对大的总尺寸。Levene等公开的支架是使用模具(或碟)制造的，该模具形成具有碟形状的连续聚合物超结构。Levene等描述了直径为8mm且厚度为2-3mm的碟。该尺寸的支架必须手术植入到靶向位点，而不适于通过导管、针头或管道进行注射，也不适于向体内更小的环境例如血管环境递送。

[0005] 本领域已知固体可生物相容的球(无孔)是充分阻断血液向靶向组织(例如癌组织)流动以对抗这些组织生长的一种手段。这些技术被称作栓塞或栓塞治疗——参见Liu等，JVIR 2005，16(7)：911-935和Chua等，Clinical Radiology2005，60(1)：116-122。这些固体球也可以递送放射以向靶向组织提供放射治疗——参见Salem等，JVIR 2006，17(8)：1251-1278。但是，可能并不希望在靶向区域中完全栓塞，因为需要血流来提供氧气。

[0006] 因此，对适于通过导管、针头或管道注射，适于向活生物内(体内)的微环境中递送并悬浮其中，且能够提供具有最小或最佳栓塞效应的持续血流的较小尺寸的多孔支架结构(例如微球)存在普遍需求。

[0007] 发明概述

[0008] 结合系统、工具和方法对以下实施方案及其各方面进行描述说明，所述系统、工具和方法是示例性和说明性的而不限制范围。在阅读说明书和研究附图后，相关领域的其它限制对本领域技术人员将是显而易见的。在各种实施方案中，上述问题中的一或多个已被减少或排除，而其他实施方案针对其他改善。

[0009] 一方面，本发明提供了制备双孔聚合物颗粒的方法，所述方法包括：(a)提供包含基质聚合物、第一溶剂和第二溶剂的均质溶液；(b)向该溶液中加入大孔间隔子材料；(c)将该溶液的液滴注射进淬冷装置中；(d)淬冷该溶液的液滴，以将该基质聚合物固化成具有大孔和微孔的颗粒；(e)从该淬冷装置提取基本为球形的颗粒，并任选地筛分该颗粒；和(f)任选地从该颗粒中洗出该大孔间隔子材料。在该方法的一些实施方案中，(a)-(f)中的一项或多项在温度低于42℃执行。在该方法的一个实施方案中，(a)-(f)各项在温度低于42℃执行。本发明还提供了通过这些方法制造的颗粒。在一些实施方案中，该颗粒是微球，例如基本球形的微球。在其它实施方案中，该颗粒进一步包含添加剂。

[0010] 第二方面，本发明提供了包含基质聚合物的双孔颗粒，其中该颗粒包含直径范围在约20到约500微米的大孔和直径范围在约1到约70微米的微孔，且其中该微球的直径范围为约50到约1100微米。在一些实施方案中，该颗粒是微球，例如基本球形的微球。在其它实施方案中，该颗粒进一步包含添加剂。在其它实施方案中，该颗粒进一步包含细胞。

[0011] 第三方面，本发明提供了在患者中完全或部分栓塞的方法，其包含对患者施用本发明提供的双孔颗粒。在一些实施方案中，该颗粒提供或允许了血管、静脉、动脉、组织或器官的暂时或连续灌注，例如与颗粒不存在时的灌注量相比约5％、约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、或约95％的灌注。

[0012] 第四方面，本发明提供了在患者中治疗或控制癌或肿瘤、或其症状的方法，其包含对患者的直接或间接向癌或肿瘤供血的血管、静脉或动脉施用本发明提供的双孔颗粒。在某些实施方案中，该颗粒提供或允许了癌或肿瘤的暂时或连续灌注。

[0013] 第五方面，本发明提供了向患者递送细胞的方法，其包含对患者施用本发明提供的双孔颗粒，其中该双孔颗粒包含细胞。在某些实施方案中，细胞被递送到患者的组织或器官，或者与患者的组织或器官接触。在某些实施方案中，该颗粒提供或允许了细胞被递送区域的暂时或连续灌注。

[0014] 第六方面，本发明提供了在患者的组织或器官中保留细胞的方法，其包含对患者施用本发明提供的双孔颗粒，其中该双孔颗粒包含细胞，以及让细胞与组织或器官接触。在某些实施方案中，该颗粒提供或允许了细胞被递送区域的暂时或连续灌注。

[0015] 第七方面，本发明提供了在患者的组织或器官中植入细胞的方法，其包含对患者施用本发明提供的双孔颗粒，其中该双孔颗粒包含细胞，以及让细胞与组织或器官接触。在某些实施方案中，该颗粒提供或允许了细胞被递送区域的暂时或连续灌注。

[0016] 第八方面，本发明提供了在患者中组织再生的方法，其包含对患者施用本发明提供的双孔颗粒，其中该双孔颗粒包含细胞，其中该细胞与要再生的组织接触。在某些实施方案中，该组织是心脏、肺、神经、脑、肝或胰腺组织。在其它实施方案中，该组织是血管、静脉或动脉。在一些实施方案中，该组织是伤口或其他损伤组织。在某些实施方案中，该颗粒提供或允许了细胞被递送区域的暂时或连续灌注。在某些实施方案中，该颗粒被施用至患者的心脏、肺、神经系统、脑、肺、肝或胰腺。

[0017] 第九方面，本发明提供了在患者中胰岛细胞移植的方法，其包含对患者施用本发明提供的双孔颗粒，其中该细胞是胰岛细胞。在某些实施方案中，该颗粒提供或允许了细胞被递送区域的暂时或连续灌注。

[0018] 第十方面，本发明提供了在患者中治疗或控制糖尿病或其症状的方法，其包含对患者施用本发明提供的双孔颗粒，其中该细胞是胰岛细胞。在一些实施方案中，该胰岛细胞生产胰岛素。在某些实施方案中，该颗粒被施用至患者的肝(例如肝的门静脉)。在某些实施方案中，该颗粒提供或允许了细胞被递送区域的暂时或连续灌注。

[0019] 第十一方面，本发明提供了在患者中动脉内近距离治疗的方法，对患者施用本发明提供的双孔颗粒。在一些实施方案中，该颗粒包含添加剂，例如放射性材料。在其它实施方案中，该颗粒是对癌或肿瘤施用的。在某些实施方案中，该颗粒提供或允许了癌或肿瘤的暂时或连续灌注。在一些实施方案中，该颗粒完全或部分地栓塞了患者的直接或间接向癌或肿瘤供血的血管、静脉或动脉。

[0020] 第十二方面，本发明提供了向患者递送添加剂的方法，其包含对患者施用本发明提供的双孔颗粒，其中该颗粒包含该添加剂。在一些实施方案中，该添加剂是治疗剂或药物。在其它实施方案中，该添加剂是示踪剂或显像剂。在其它实施方案中，该添加剂是诊断剂。

[0021] 第十三方面，本发明提供了在患者中延长和/或控制添加剂(例如治疗剂或药物)的递送的方法，其包含对患者施用本发明提供的双孔颗粒，其中该颗粒包含该添加剂。在某些实施方案中，该颗粒通过管腔内、间质、真皮下、经皮或皮下施用而被施用至患者。

[0022] 第十四方面，本发明提供了从患者的血液中捕获、过滤或提取细胞的方法，其包含对患者施用本发明提供的双孔颗粒，其中该颗粒允许经由该颗粒的灌注，而且其中该颗粒从该患者的血液或邻近组织中捕获、过滤、吸引、促进细胞迁移或提取细胞。

[0023] 第十五方面，本发明提供了制造双孔聚合物颗粒的装置，其包含：(a)储存容器；(b)淬冷塔；(c)包含喷嘴的注射器，其中该喷嘴的直径范围从约5到约1100微米；且其中该容器与该注射器连接；和(d)一个或多个微筛。在某些实施方案中，喷嘴可以被通过孔提供层流流动的其他手段代替，例如已建立的聚焦射流技术。在一个实施方案中，可以使用整合进平面微通道的流聚焦几何构型来代替喷嘴。在此类实施方案中，可以产生单分散的和多分散的液滴。参见Anna等，(2003)Appl.Phys.Lett.82，364。在某些实施方案中，注射器进一步包含筒腔和活塞。在其它实施方案中，储存容器进一步包含搅拌器或混合器。在一些实施方案中，储存容器包含本发明提供的第一溶剂、第二溶剂和基质聚合物。在其它实施方案中，装置进一步包含与储存容器相连接的导管，其中该导管任选地包含本发明提供的微孔间隔子材料。

[0024] 除了上述示范性的方面和实施方案之外，通过参考附图和通过研究以下详细说明，进一步的方面和实施方案将变得显而易见。

[0025] 术语

[0026] 除非另外定义，本文使用的所有技术和科学术语与本领域普通技术人员所通常理解的具有相同含义。所有专利、专利申请、公开的专利申请和其他公开物通过参考被完整并入本文。如果本文的术语具有多个定义，那么除非另外规定，以这一部分中的定义为准。

[0027] 术语“约”或“大约”指在给定值或给定范围的20％以内、10％以内、5％以内、或1％以内、或更少。

[0028] 术语“添加剂”指微球可以携带、包含、用其进行浸渍、被其包涂、或与其相连的物质、分子或材料(例如生物活性材料)。在一些实施方案中，可以在制造过程中向基质聚合物中加入添加剂。添加剂的非限制性例子包括治疗剂、细胞、细胞分化和信号材料、细胞粘附因子或促进剂(例如，选择素、胶原、明胶、葡糖胺聚糖、纤连蛋白、凝集素、聚阳离子、聚赖氨酸、壳聚糖等，或任何其他天然或合成的生物细胞粘附剂)、抗体、血液凝固或抗凝固剂、放射源和化疗材料。

[0029] 本文使用的“施用”指将存在于身体以外的物质(例如，本发明提供的颗粒或微球)注射或物理递送到患者中的行为，例如但不限于通过肺(例如吸入)、粘膜(例如鼻内)、真皮内、静脉内、动脉内、胆内、眼内、骨内、肌肉内递送和/或本发明描述的或本领域已知的任何其他物理递送方法。当治疗或控制疾病或其症状时，物质的施用通常发生在疾病或其症状发作后。当预防疾病或其症状时，物质的施用典型地发生在疾病或其症状发作前。在某些实施方案中，这样的施用使得递送的颗粒(例如，本发明提供的颗粒和/或添加剂)与靶向区域(例如组织或器官)的接触。

[0030] 术语“双孔分布”、“双孔径分布”和“双孔径”可互换使用，指在本发明提供的多孔聚合物支架或微球中存在的两种不同的孔径范围(例如大孔/微孔，或大孔/小孔)。例如，在一些实施方案中，双孔分布中的大孔尺寸可以大约是约20到约500微米，而微孔可以大约是约1到约70微米。在其它实施方案中，大孔的尺寸可以大约是约20到约200微米，而微孔可以大约是约1到约40微米。本文使用的术语“双孔微球”、“双孔聚合微球”或“双孔聚合物微球”指包含两种尺寸分布的孔的聚合微球。

[0031] 本文使用的术语“可生物吸收的”指材料降解、被身体体内代谢或被身体排除的能力。

[0032] 本文使用的术语“可生物降解的”指能够在一段时间内化学地、生理地、或通过其他生物手段被身体吸收的材料或物体(例如聚合物、微球)。

[0033] 本文使用的术语“可生物相容的”指材料或物体(例如聚合物或微球)被体内应用(例如，应用至细胞、组织或器官)而不引起显著免疫反应、炎症或其它不良反应(除非另有目的)的性质或能力。

[0034] 本文使用的“细胞粘附促进剂”指任何材料，因其在微球中存在或与微球结合，提高或增强了细胞对微球表面的粘着性。这些材料经常是蛋白，其通过蛋白和聚合物的共价键与微球表面结合。

[0035] 本文使用的术语“有效量”指治疗(例如本发明提供的微球或组合物)的量，其足以降低和/或改善给定疾病和/或其相关症状的严重程度和/或持续时间。在本发明提供的方法的某些实施方案中，有效量的颗粒被施用至患者。

[0036] 本文使用的术语“植入”指移植的细胞被宿主组织接受、在该环境中存活并坚持例如24小时或更长时间的过程。在某些实施方案中，被移植的干细胞进一步再生。

[0037] 本文在涉及施用其它治疗时使用的术语“联合”指使用超过一种治疗。术语“联合”的使用并不限制向个体施用治疗的顺序。第一治疗可以在施用第二治疗之前(例如1分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1星期、2星期、3星期、4星期、5星期、6星期、8星期或12星期)、同时、或之后(例如1分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1星期、2星期、3星期、4星期、5星期、6星期、8星期或12星期)向曾经患有给定疾病、已患有给定疾病、或对给定疾病易感的个体施用。任何额外的治疗可以与其它额外治疗以任何次序施用。在某些实施方案中，本发明提供的颗粒可以与一种或多种治疗(例如，当前被施用以预防、治疗、控制和/或改善指定疾病或与其相关的其他症状的非磁性标记细胞的治疗)联合施用。可以与本发明提供的颗粒联合施用的治疗的非限制性例子包括添加剂，例如镇痛剂、麻醉剂、抗生素、或免疫调节剂，或在美国药典和/或Physician’s Desk Reference中列举的任何其他药剂。

[0038] 本文使用的“可注射的”指能够经由注射器、导管、针头或其他在液体介质中注射或注入微球的手段被施用、递送或携带进身体。在某些实施方案中，本发明提供的颗粒是可注射的颗粒。

[0039] 本文使用的术语“控制”指个体通过治疗(例如本发明提供的微球)获得的有益效果，但其并不导致感染的治愈。在本发明提供的方法的某些实施方案中，向个体施用一种或多种治疗来“控制”给定疾病或与其相关的一种或多种症状从而防止该疾病的进展或恶化。

[0040] 本文使用的术语“微球”指被制造成各种尺寸的物体的聚合物或聚合物组合。本文使用的微球可以是任何形状，尽管它们通常是基本球形的形状。微球的这些结构一般可以是球形或椭球形，或被假想的球形或椭球形限定。微球可以通过本领域已知的任何方法灭菌，例如通过辐射，例如γ或β辐射。本文提供的微球可以包含本文描述和定义的其他材料。但是，将会认识到，术语“微球”是为了解释本发明提供的组合物和方法而使用的一种方便的描述，在某些实施方案中，本文描述的示例性微球在形状上并不必须被限制为精确球形(例如是颗粒)。

[0041] 本文使用的术语“药学上可接受的”指被联邦或州政府的管理机构批准，或者在美国药典、欧洲药典或其它公认药典中列出的供在动物中，更具体地在人中使用。

[0042] 术语“聚合物”指由分子单元的多次重复组成的分子。本文使用的聚合物可以是任何结构形式，例如线性的或带支链的(例如“多臂”或“星形”)。因此，术语“基质聚合物”指可以结合进组合物中的聚合物，该组合物包含例如聚合物和一种或多种添加剂。术语“共聚物”指由两种或多种单体或聚合体种类组合形成的聚合物。术语“嵌段共聚物”指由嵌段大分子组成的共聚物。在某些实施方案中，嵌段共聚物中的邻近嵌段，包含源自不同种类单体的单元、或源自相同种类单体但具有结构单元的不同组合或序列分布的单元。注意到本文使用的术语“聚合物”不应当被限制为严格化学意义上的聚合物，可以使用其它具有本文描述特征的合适材料。

[0043] 本文使用的术语“预防”指给定疾病的完全或部分抑制；在个体中给定疾病或其相关症状的疾病进展的发展或发作的完全或部分抑制；给定疾病或其相关症状的进展的完全或部分抑制。

[0044] 本文使用的术语“再生”在涉及组织或器官再生时指新组织的生长和/或发育过程。在某些实施方案中，组织再生包含细胞增殖的活化和/或增强。在其它实施方案中，组织再生包含细胞迁移的活化和/或增强。

[0045] 本文使用的术语“保留”指移植的细胞被宿主组织或器官保留的过程，例如，被接受、并在该环境中存活和持续例如数分钟到数小时的时间。在某些实施方案中，被移植的细胞进一步复制。

[0046] 术语“干细胞”指具有自我更新和生成分化的后代的能力的细胞。在某些实施方案中，干细胞是间充质干细胞。

[0047] 本文使用的术语“个体”和“患者”可互换使用。本文使用的个体是哺乳动物，例如非灵长目动物(例如，母牛、猪、马、猫、狗、大鼠、兔子等)或灵长目动物(例如猴和人)，包括施用本发明提供的颗粒。在一些实施方案中，患者需要治疗或控制疾病或其症状。在具体的实施方案中，个体是人。

[0048] 本文使用的术语“基本为球形”或“总体上为球形”指接近完美的球的形状，完美的球被定义为具有最小外表面积的体积。具体地，本发明使用的“基本为球形”指当观察颗粒的任何横截面时，平均较大直径和平均较小直径之间的差距小于20％。在一些实施方案中，在高达1000倍的放大下，本发明提供的微球表面看上去是光滑的。

[0049] 本文使用的术语“治疗剂”或“治疗药物”可互换使用，其指任何治疗活性物质，其被递送到生命体的身体管道中以产生所需的通常是有益的效果。

[0050] 本文使用的术语“治疗”指可被用于控制、治疗和/或改善给定疾病或其相关症状的任何方案、方法和/或药剂。在某些实施方案中，术语“治疗”指生物治疗、支持治疗、和/或本领域技术人员(例如医务人员)已知的可用于给定疾病或其相关症状的控制或治疗的其他治疗。

[0051] “组织构建”、“组织生成”、“组织工程”和“组织修复”在涉及本发明提供的组合物和方法时可互换使用，指与组织的愈合、生长、再生长、或状况变化相关的过程或事件。涵盖的组织包括但不限于肌肉组织、结缔组织、脂肪、和神经组织。适合本发明提供的治疗和控制方法的组织缺陷包括但不限于在患者的心脏、冠状血管、血管、脊髓、骨、软骨、腱、韧带、乳腺、肝、胆囊、胆管、胰腺、肠组织、泌尿系统、皮肤、疝、和牙齿组织中的缺陷。

[0052] 本文使用的术语“治疗”指疾病或其症状的进展、严重程度和/或持续时间的下降或改善。

[0053] 附图简要说明

[0054] 以附图部分的参照图说明示例性的实施方案。本文公开的实施方案和图应被认为是说明性的而非限制性的。

[0055] 图1A-1B描绘了根据本文提供的特定实施方案的示例性可生物相容的多孔微球(微球20)。图1A是可生物相容的多孔微球20的横截面视图。图1B描绘了微球20的横截面的一部分的放大视图，显示了其双孔分布。

[0056] 图2显示了根据本文提供的特定实施方案用于制造可生物相容的多孔微球(例如微球20)的装置(装置50)。

[0057] 图3是流程图，说明了根据本文提供的特定实施方案制造可生物相容的多孔微球(例如微球20)的示例性方法(方法200)的步骤。

[0058] 详细说明

[0059] 在以下说明中，提供了具体细节从而为本领域技术人员提供更彻底的理解。但是，熟知的元素可以不被显示或详细描述，以避免不必要地模糊本公开内容。因此，说明和附图应被视为说明性的而非限制性的方式。

[0060] A.双孔微球

[0061] 本发明提供了具有广泛医学应用的可变尺寸的可生物相容的双孔支架结构(例如颗粒，如微球)。在某些实施方案中，使用液体材料的表面张力制造支架结构以提供总体上球形或椭球体的形状，或者被假想的球形或椭球形限定，该支架结构在本文中被称作微球。

[0062] 在一些实施方案中，微球的直径范围是约50到约1100微米。在其它实施方案中，微球的直径小于约500微米。在另一些其它实施方案中，微球的直径小于约300微米。这些直径允许微球经由导管、针头、管道等通过各种途径包括血管、胆管内、经食道、皮下、真皮下、粘膜下、经支气管、或间质，在体内递送至靶向组织。在一些实施方案中，双孔分布中的大孔的尺寸可以大约是约20到约500微米，而微孔可以大约是约1到约70微米。在其它实施方案中，大孔的尺寸可以大约是约20到约200微米，而微孔可以大约是约1到约40微米。在某些实施方案中，双孔聚合物微球进一步包含添加剂。

[0063] 在一个实施方案中，本发明提供了双孔聚合物微球，其包含的大孔直径范围是约20到约500微米或约20到约200微米；且微孔直径范围是约1到约70微米或约1到约40微米。在某些实施方案中，微球的直径范围是约50到约1100微米、约50到约500微米、或约50到约300微米。

[0064] 图1A描绘了根据本文提供的特定实施方案的示例性的可生物相容的多孔微球20通过其中心的横截面视图。图1B描绘了微球20的横截面的一部分的放大视图，显示了其双孔分布。

[0065] 微球20包含可生物相容的基质聚合物或单体22(在本描述中被称作基质聚合物22)。在特定实施方案中，基质聚合物22也可以是可生物吸收的和/或可生物降解的。合适的基质聚合物22的例子在本文别处描述。

[0066] 虽然本发明提供的双孔微球(微球20)可以被构建成具有任何所需尺寸，在某些实施方案中，微球尺寸范围是直径约50到约1100微米，从而有助于微球20基于导管通过各种途径包括血管(动脉、静脉、门静脉)、胆管内(例如胆道)、经食道、皮下、真皮下、粘膜下、经支气管、或间质递送向靶向组织层的递送。其他可能的递送机制包括通过针头或管道注射，和直接放置在靶向组织中、靶向组织上或靶向组织附近。递送微球的其他非限制性例子在本文别处提供。

[0067] 本文提供的微球可以在其中散布各种尺寸和形状的孔。在图1A和1B的示例中，微球(20)具有双孔分布，其包括相对大的孔(大孔)(24)和相对小的孔(微孔)(26)。在具体实施方案中，微孔的直径范围为约1到约70微米，而大孔的直径范围为约20到约500微米。这样的双孔分布，与均一孔分布相比，易于增加微球的总体孔隙度和表面积，降低微球的质量密度，并增加微球中孔之间相互连接的数目。双孔分布可以允许体内穿过微球和微球周围的血流动力学改善，降低微球引起的血流阻力、湍流和压差，并因此降低灌注梯度和血凝块的形成可能性(血栓形成)。类似的流动动力学改善可以在血液以外的液体中产生。双态分布也可以提供了隔离细胞的位点，能够在较大的孔中实现粘附、固定或分化，同时保持经由大孔或微孔而通过微球的灌注。

[0068] 大孔和微孔在尺寸上的差异允许了各类的生物活性材料(例如不同尺寸的细胞)在靶向组织的递送、捕获或保留。双孔分布增加的表面积和互连性，也可以促进细胞生长、组织再生、血管形成、和更高浓度的生物活性材料向靶向组织的递送。大孔可以为功能组织在微球支架内的形成提供足够开放的空间，而微孔可以在大孔之间形成通道，以增加或优化细胞与细胞的接触或交流、营养物和氧气向细胞的扩散、渗透和表面模式以引导细胞。大孔也可以充当血液或其他液体可以通过其间流动的通道，且有可能分化成永久管道(例如人造血管、胆管或静脉)。在特定微球中的双孔分布的孔隙度可以被设计以使得微球的比重与其靶向的流体悬浮液或靶向的组织的比重近乎匹配(或具有一定的关系(例如更重或更轻))。

[0069] 在一个实施方案中，颗粒进一步包含细胞粘附促进剂。在另一实施方案中，颗粒包含明胶。在一些实施方案中，颗粒是交联的。在其它实施方案中，颗粒不是交联的。在某些实施方案中，颗粒是无菌的。

[0070] 本发明提供的微球可以包含除颗粒之外的其他材料。在一些实施方案中，本发明提供的微球的大孔和微孔可以包含(例如，携带、包含、用其进行浸渍、被其包涂、或与其相连)的各种生物活性材料或本发明提供的其他添加剂，例如但不限于治疗剂、细胞、细胞分化和信号材料、细胞粘附因子(例如选择素)、抗体、血液凝固或抗凝固剂、和化疗材料。添加剂的其他非限制性实施例在本文别处提供。这些携带材料的微球允许了所选定的治疗向特定靶向组织的递送和延长接触。大孔和微孔的尺寸可以依照本发明提供的实施方案而变化，以允许携带不同尺寸的添加剂。

[0071] B.制造双孔微球的装置和方法

[0072] 本发明也提供了制造本发明提供的可生物相容的多孔颗粒(例如微球)的示例性装置和方法。

[0073] 关于制造包含具有大孔和微孔的双孔分布的基质聚合物的支架的基础化学部分在美国专利号6,337,198(Levene等)中描述，其通过参考被完整并入本文。在某些实施方案中，该过程包含制备均质溶液，该溶液包含溶解在第一溶剂(基质聚合物在其中是可溶的)中的基质聚合物和基质聚合物在其中不可溶的第二溶剂，但第二溶剂可与第一溶剂混溶。依照Levene等，由此制备的均质溶液在模具中的具有合适尺寸的固体大孔间隔子颗粒上铸型。依照Levene等，大孔间隔子颗粒在第一溶剂中是不可溶的，但可以是可溶于水的。得到的混合物通过低温淬冷发生相分离，导致第一溶剂的结晶，同时让聚合物溶液的液液分层最小化。然后进行过滤工艺来去除大孔间隔子。在某些实施方案中，微孔可以通过第一溶剂(即基质聚合物在其中可溶的溶剂)在相分离时结晶而在材料中形成，而大孔通过将溶解大孔间隔子的物质滤除而形成。在一些实施方案中，第二溶剂可以用来执行过滤过程。

[0074] 图2说明了依照本发明提供的具体实施方案可用来制造微球20的装置(50)。图3说明了使用装置50制造微球20的方法的具体实施方案的方框图。

[0075] 仅作为说明，方法200从方框202开始，其包括通过将基质聚合物22与第一溶剂(基质聚合物在其中是可溶的)和第二溶剂(基质聚合物在其中是不溶的，但第二溶剂与第一溶剂可混溶)混合，制备均质溶液54。在某些实施方案中，第一和第二溶剂是可混溶的，且可以形成基质聚合物在其中可溶的混合物。不受限于任何理论，溶剂和工艺条件的选择对在液液分层前发生溶剂结晶是关键性的。可以对溶液54中第一和第二溶剂的量的比率进行选择，以允许基质聚合物基本完全溶解并允许溶液54为基本均质的。在某些实施方案中，第一溶剂与溶剂总体积的体积比，在约1％到约50％v/v、约1％到约40％v/v、约2％到约30％v/v、或约4％到约25％v/v之间。在具体实施方案中，第一溶剂与溶剂总体积的体积比是约5％到约15％v/v。

[0076] 溶剂混合物中的聚合物浓度在约0.1％到约50％(重量)之间、约1％到约40％(重量)之间、或约5％到约23％(重量)。在具体实施方案中，溶剂混合物中的聚合物浓度在约10％到约20％(重量)之间。基质聚合物、第一和第二溶剂、以及大孔间隔子材料(68)可以选自各种合适的材料。

[0077] 在示例装置50中，在储存容器52中提供溶液54。容器52可以包含搅拌器、混合器等(未显示)，以确保基质聚合物22在溶液54中基本完全溶解。在一些实施方案中，当大孔间隔子颗粒68在第二溶剂中可溶时，大孔间隔子颗粒68可以在容器52中与溶剂溶液54混合。在其它实施方案中，大孔间隔子颗粒68可以如下所述通过导管66单独添加。在示例装置50中，容器52通过导管58与注射器60流体连通，该导管58可包含阀门56和/或62。在其它实施方案中，可使用其他合适的装置来向注射器60提供溶液54。在示例实施方案中，注射器60包含筒腔61(溶液54被提供到其中)和提供压力的活塞64。在某些实施方案中，可通过任何合适的手段驱动活塞64，以减少筒腔61的容积并由此对其中包含的液体施加压力，由此液体向出口管道70和喷嘴72移动。

[0078] 仅作为说明，方法200随后进行到方框204，其包含通过导管66向注射器60添加大孔间隔子颗粒68。在某些实施方案中，大孔间隔子68可以由小量的第一或第二溶剂中的一种携带，从而有助于间隔子68向溶液54的添加。例如，大孔间隔子68可以与第一溶剂混合，以让其更容易地注射进溶液54。在示例实施方案中，大孔间隔子68在出口导管70中添加到溶液54中(即尽可能近地靠近喷嘴72)，而且尽可能地离溶液54通过喷嘴72注射进塔80越短暂越好。不受限于任何理论，向喷嘴72添加大孔间隔子68的这种相近易于使得大孔间隔子68和溶液54之间的分离最小化。在一些实施方案中，大孔间隔子68以这样的方式添加使得其在出口导管70中在溶液54内变得适度均匀分散。在其它实施方案中，可以使用其他合适的机制来向溶液54添加大孔间隔子68。这些其他合适的机制可包含在注射器60中或在其他位置(例如，在容器52中)向溶液54添加大孔间隔子68。在一些实施方案中，装置50可以包含用于控制注射的大孔间隔子颗粒68的尺寸的机制或装置，例如通过在导管66等中使用合适的筛等。

[0079] 仅作为说明，方法200然后进行到方框206，其包含将溶液54和大孔间隔子68的混合物由注射器60注射到淬冷塔80中，该注射方式在塔80中产生溶液54和大孔间隔子68的混合物的液滴84A、84B(统称为液滴84)。在示例装置中，液滴84形成并使用喷嘴72从注射器60注射到淬冷塔80中。在某些实施方案中，液滴84形成并使用装置从注射器60注射到淬冷塔80中，该装置产生固定速率和孔径的向部分90中的层流或非层流扩散。喷嘴72可以包含一个或多个可变尺寸的孔74，孔74可改变以控制液滴84的尺寸。在一些实施方案中，由喷嘴72产生的液滴84的尺寸大约是直径约5到约1100微米。合适的喷嘴或类似装置是本领域技术人员已知的。在其它实施方案中，可以使用其他位于注射器60和淬冷塔80之间的合适配置的雾化装置来产生液滴84。在某些实施方案中，液滴84通过喷嘴
72注射进入塔80的注射速率可以通过调节喷嘴72和/或调节施加在活塞64上的压力来控制。在一些实施方案中，应当如本文所述控制液滴84注射进塔80的注射速率以有助于液滴84的淬冷。

[0080] 仅作为说明，方法200随后进行到方框208，其包括在液滴84进入塔80后尽可能快地冷冻(即淬冷)液滴84。在某些实施方案中，淬冷塔80可包含或具备用于控制或调节其中的温度和压力的装置(未明确显示)。这些压力和温度调控装置是本领域熟知的，且可包括任何合适的设备。在某些实施方案中，如以下详细解释的，调节淬冷塔80内的温度和压力从而在液滴84进入塔80后尽可能快地引起液滴84的淬冷。

[0081] 在某些实施方案中，淬冷塔80能够支持合适的压力和温度，以在溶液54中发生任何显著的液体分离(例如，第一和第二溶剂的液液分层)前，通过溶剂从液体到固体的相变而诱导基质聚合物22的快速聚合。在一些实施方案中，可向塔80中填充合适的非反应性介质82，以引起快速的温度下降。例如，塔80的介质82可以包含液氮或其他合适的冷却剂。在一些实施方案中，塔80的介质82可以包含第二溶剂或由其组成。在某些实施方案中，微滴84的淬冷引发了第一溶剂的结晶并导致基质聚合物22从溶液中固化出来(聚合)。在一些实施方案中，基质聚合物22在大孔间隔子微粒68周围固化，在固化的基质聚合物22内形成对应于大孔24的印痕。

[0082] 在某些实施方案中，从液体到固体的相变也导致微球20内微孔26的网络的形成。不希望受限于任何特定的理论，相信在塔80中的淬冷引起第一溶剂在溶液中的结晶，这随后在生成的微球20中引发基质聚合物22的聚合和微孔26的形成。不受限于任何理论，相信第二溶剂(其与基质聚合物22不混溶但可与第一溶剂混溶)充当启动第一溶剂结晶的成核剂。

[0083] 因为溶液54中液体的表面张力，在某些实施方案中，液滴84(其最初悬浮在塔80的介质82中)总体上为球形(遭受变形力，例如重力、可通过注射器60施加的力等)。总体上为球形的液滴84导致了当液滴84在塔80中淬冷时，得到的固化的基质聚合物22保持了总体上为球形的形状，这(如下面进一步解释的)提供了总体上为微球形状的结构85A、85B(共称为微球85)。另外，相对小尺寸的液滴84提供了大的表面积/体积比，这与涉及在碟形模具中淬冷的现有技术工艺相比，改善了淬冷速率。虽然不希望受限于任何理论，但淬冷速度越快，冷却期间的液液分离就越小。液液分层可以显著减少微孔26的形成，并因此影响双孔分布。

[0084] 在示例性装置50中，塔80是垂直定位的，尽管在其它实施方案中塔80可以以其他方向定位。液滴84和/或微球85的质量密度可以大于或小于它们悬浮于其中的介质82的质量密度。在示例性的实施方案中，比介质82密度低的液滴84A和/或微球85A将易于沿方向86A上升。相反，比介质82密度更大的液滴84B和/或微球85B将易于沿方向86B下沉。

[0085] 仅作为说明，方法200随后进行到方框210，其涉及从塔80提取微球85。在示例性的实施方案中，使用微筛94A、94B(总称为微筛94)进行方框210的提取。更具体地，可以从塔80经由出口通道88A、88B(总称为出口通道88)中的一条或两条提取微球85，所述出口通道88A、88B分别包含微筛94A、94B。一个或多个适当配置的泵90A、90B(总称为泵90)可以用来沿环路循环携带微球85的介质82，该环路从塔80通过输出通道88，通过微筛
94，并通过返回通道106回到塔80中。部分92A是狭窄的管道，例如管道或其他有弹性的物质，其将允许液流的连续回路以促进微球向筛中的移动。在某些实施方案中，部分92A是与部分90A连接的管道，部分90A将是例如滚轮泵、热泵或促进液体通过回路流动的其他机制。在示例性实施方案中，上部输出通道88A连接在塔80顶部或其附近，以提取在介质82内上升的微球85A，而下部输出通道88B连接在塔80底部或其附近，以提取在介质82内下沉的微球85B。

[0086] 将会意识到，装置50可以包含任何合适的用于通过微筛94循环介质82的机制，且装置50的实施方案不限于图3中显示的特定循环途径和泵排列。在某些实施方案中，使用一对输出通道88不是必须的。在一些实施方案中，可以通过适当配置的泵迫使微球85通过单个输出通道和相应的微筛。在一些实施方案中，上部输出通道88A或下部输出通道88B中的一条可以运作，而通道88中的另一条可以被关闭(例如，通过适当配置的阀)。选择通道88中的哪一条可以运作，可以取决于微球85的预期质量密度。在另一些其它的实施方案中，装置50可以包含不同数量的输出通道88。泵90可以包含任何合适类型的泵，例如滚轮泵，且可以以任何合适的泵排列使用。取决于对于被制造的微球85的密度而言最适合的循环途径，可以使用一个或多个泵90。

[0087] 可以设计微筛94以捕获微球85而允许基础介质82从其中穿过。随后可提取在微筛94中捕获的微球85(例如，人工或通过任何其他合适的手段)供洗涤和进一步加工。

[0088] 仅作为说明，方法200随后进行到方框212，其涉及从微球85中洗涤掉任何残留的大孔间隔子68和溶剂，产生干净的微球20，其仅包含具有双孔分布的基质聚合物22。如果微球85在其在塔80中于介质82中循环时是足够干净的，则方框212洗涤过程不是必须的(取决于介质82的选择)。用于除去大孔间隔子68的方框212的洗涤工艺可以涉及过滤(即在合适的液体或气体溶剂中溶解大孔间隔子68)，使用热和/或升华、或其他用于除去残留的大孔间隔子68和溶剂的合适技术。例如，如果大孔间隔子68是盐晶体或其他水溶性材料，洗涤过程可以涉及在水中过滤微球85。作为另一实施例，微球85可以放置在与真空泵连接的容器中经历溶剂完全升华所需的时间。在一些实施方案中，方框212的洗涤过程不需要除去大孔间隔子68。例如，大孔间隔子68可以包含生物活性物质，所述生物活性物质可最初保留在微球20的大孔中而不被冼除，且随后其可以被其中放置微球20的生物所摄取。在方框212结束时，已准备好微球20以供如下所述的进一步加工和/或应用。

[0089] 在一些实施方案中，方法200可以包含灭菌微球20的额外步骤(未明确显示)。作为非限制性实施例，这样的灭菌可以涉及使用合适的外部辐射或基于气体的灭菌工艺。在一些实施方案中，方法200也可以涉及按尺寸分类微球20(未明确显示)，以使得特定尺寸范围内的微球20可被选择供特定应用。例如，可以使用不同精细度的微筛排列来完成这样的分类。

[0090] 1.基质聚合物

[0091] 在某些实施方案中，基质聚合物22包含可生物相容的聚合物或单体，其也可以是可生物吸收的和/或可生物降解的。在一些实施方案中，基质聚合物在室温和体温下是充分机械刚性的，由此微球在制造过程的洗涤过程中和随后的加工和体内应用期间保持其形状和孔结构。

[0092] 适合用作基质聚合物(或至少基质聚合物的一部分)的可生物吸收的聚合物的非限制性实施例包括以下一种或多种：

[0093] (i)基于微生物的聚合物：

[0094] (a)聚羟基-链烷酸酯(PHA)——例如聚(羟基丁酸酯)(PHB)、聚(羟基丁酸酯-共-羟基戊酸酯)(PVBV)；

[0095] (ii)源自生物技术的单体：

[0096] (a)α-羟基羧酸及其共聚物——例如聚(乳)酸(PLA)、聚(乙交酯)(PGA)；

[0097] (iii)基于石油化工的聚合物：

[0098] (a)聚己内酯(PCL)；

[0099] (b)聚酯酰胺；

[0100] (c)脂肪族共聚酯；

[0101] (d)芳香族共聚酯。

[0102] 可用来提供基质聚合物(或至少基质聚合物的一部分)的可生物吸收的材料的其他非限制性实施例包括可吸收的可生物相容的生物量产品，例如以下一种或多种：

[0103] (i)多糖：

[0104] (a)淀粉——例如，小麦、玉米和/或土豆；

[0105] (b)木质纤维素材料——例如，木头、稻草；

[0106] (c)其他多糖材料——例如，果胶、壳聚糖/几丁质、胶、蜡；

[0107] (ii)蛋白和脂质：

[0108] (a)基于动物的蛋白和脂质——例如酪蛋白、乳清蛋白、胶原/明胶、纤维蛋白、葡糖胺聚糖(GAGS)；

[0109] (b)基于植物的蛋白和脂质——例如玉米蛋白、大豆蛋白、谷蛋白。

[0110] 适合用作本发明的基质聚合物的额外非限制性实施例包括以下一种或多种：聚氧乙烯/聚对苯二甲酸乙二酯及其共聚物；乳酸或乙醇酸或带有羟基末端柔性链的两种酸的组合的共聚物，例如各种分子量和形式的可商业购买的聚(亚烷基二醇)。聚(亚烷基二醇)的例子包括但不限于具有羟基末端的聚氧乙烯、聚氧丙烯、聚(氧乙烯共聚氧丙烯)和聚四氢呋喃链、聚(氧乙烯乙二醇)、聚(氧丙烯)-聚(氧乙烯)-乙二醇嵌段共聚物、和聚(氧丁烯)乙二醇。

[0111] 适合本发明使用的基质聚合物的进一步非限制性例子包括以下一种或多种：可生物降解且可生物相容的聚己内酯，聚羟基丁酸酯，聚酯、聚碳酸酯、聚酸酐和聚(原酸酯)的共聚物；基于双酚-A的聚磷酸酯例如聚(双酚-A苯基磷酸酯)、聚(双酚-A乙基磷酸酯)、聚(双酚-A乙基膦酸酯)、聚(双酚-A苯基膦酸酯)、聚[双(2-乙氧基)对苯二甲酸氢膦酸酯]、和基于双酚-A的聚(磷酸酯)的共聚物；源自具有如下示范结构的酪氨酸源双酚单体的聚合物：

[0112]

[0113] 其中R1是-CH＝CH-或(-CH2-)n，其中n是零或从1到8的整数；而且R2选自包含最多18个碳原子的直链和带支链的烷基和烷基芳基的基团。双酚化合物可以被聚合以形成例如聚亚胺碳酸酯、聚碳酸酯、聚丙烯酸酯、聚氨酯或聚醚。关于制备聚亚胺碳酸酯和聚碳酸酯的方法参见例如美国专利号5,099,060和5,198,507。作为示例，在本发明提供的方法中使用的合适的双酚单体包括去氨基酪氨酰-酪氨酸(DT)酯，例如去氨基酪氨酰酪氨酸乙酯(DTE)、去氨基酪氨酰酪氨酸丁酯(DTB)、去氨基酪氨酰酪氨酸己酯(DTH)、去氨基酪氨酰酪氨酸辛酯(DTO)、或其组合。

[0114] 适合基质聚合物的更进一步的非限制性例子包括以下一种或多种：聚碳酸酯、聚亚胺碳酸酯、聚芳酯、聚氨酯、严格交替的聚(环氧烷烃醚)、由α-和β-羟基酸和酪氨酸衍生物制备得到的二羟基单体聚合成的聚(环氧烷烃)嵌段共聚物、聚碳酸酯和聚芳酯与聚(环氧烷烃)的嵌段共聚物、聚碳酸酯、聚亚胺碳酸酯、聚芳酯、聚(环氧烷烃)嵌段共聚物、聚碳酸酯与聚(环氧烷烃)的嵌段共聚物、聚芳酯与聚(环氧烷烃)的嵌段共聚物、α-羟基羧酸、聚(己内酯)、聚(羟基丁酸酯)、聚酸酐、聚(原酸酯)和聚酯基于双酚-A的聚(磷酸酯)、或其组合。关于制备聚芳酯的方法参见例如美国专利号5,216,115，其作为参考被完整并入本文。

[0115] 在一个实施方案中，颗粒(或微球)包含聚乙烯醇。在另一个实施方案中，颗粒包含丙烯酸、丙烯酰胺或丙烯酸酯聚合物或共聚物。在一些实施方案中，颗粒包含聚乙烯醇和丙烯酸、丙烯酰胺或丙烯酸酯聚合物或共聚物。在一个实施方案中，颗粒包含三丙烯酰胺聚合物。在另一个实施方案中，颗粒的基质聚合物是N-三-羟甲基甲基丙烯酰胺、二乙基氨基乙基丙烯酰胺、N，N-亚甲基双丙烯酰胺、或其组合。在一个实施方案中，颗粒包含丙烯酸钠和乙烯醇共聚物。在某些实施方案中，颗粒进一步包含细胞粘附促进剂，例如明胶。在一些实施方案中，颗粒是交联的。在其它实施方案中，颗粒不是交联的。

[0116] 上述材料是可能用作基质聚合物(或其一部分)的材料的非限制性例子。此类材料的其他非限制性例子，包括碘浸透的聚合物、或包含游离羧酸悬垂链的聚合物。也可能将磷灰石衍生物例如羟磷灰石和氟磷灰石用作基质聚合物。任何上述材料或本发明别处提供的材料可单独或以任何组合用作例如单体、聚合物或其共聚物。

[0117] 2.溶剂

[0118] 在某些实施方案中，第一溶剂的特征在于基质聚合物22在该溶剂中可以以不同浓度溶解。在一些实施方案中，第一溶剂也可与第二溶剂混溶以形成连续相介质。在具体实施方案中，第一溶剂具有的熔点可以在约-20℃到约+20℃之间，由此，在高速率冷却时，结晶是偏好的相分离机制(尽管第一溶剂不限于这一温度范围)，且在其他具体实施方案中，溶剂具有的熔点可以在约-40℃到约+40℃之间。对于聚乳酸(PLA)源基质聚合物而言可相容的第一溶剂的例子是1，4-二噁烷，其具有12℃的熔点和低结晶能量。其他溶剂可被用于其他基质聚合物材料。

[0119] 在某些实施方案中，第二溶剂的特征在于基质聚合物在该溶剂中是不可混溶的或仅以非常低的浓度混溶。但是，第二溶剂可与第一溶剂完全混溶。可与PLA基质聚合物和1，4-二噁烷第一溶剂相容的第二溶剂的具体例子是水。适合用作第二溶剂的溶剂的其它非限制性例子包括醇，例如但不限于甲醇、乙醇、异丙醇、叔丁醇和1，3-丙二醇。或者，第二溶剂也可以在由第一溶剂、大孔间隔子和任选的添加剂组成的乳液中充当连续相。

[0120] 3.大孔间隔子材料

[0121] 在一些实施方案中，大孔间隔子材料68的特征在于其在第一溶剂和基质聚合物22中不可混溶或仅略微混溶。在一些实施方案中，大孔间隔子材料可与第二溶剂混溶。在一实施方案中，大孔间隔子材料可在第二溶剂中大量混溶。例如，在第二溶剂是水的情况下，氯化钠(食盐)成为合适的大孔间隔子材料。如果在洗涤(方框212)后以任何残留量存留在微球20中，盐还具有可生物相容的额外益处。在一些实施方案中，大孔间隔子材料
68可以不与第一或第二溶剂混溶。在某些实施方案中，大孔间隔子材料68可溶于上述洗涤过程212中使用的第三溶剂中。在一些实施方案中，大孔间隔子材料68可以与塔80的介质82混溶，由此在通过塔80的循环期间被洗涤出来。在一些实施方案中，可能不希望大孔间隔子材料68被洗涤出来，使得其留作(至少在初始阶段)微球20中的添加剂供以后使用(例如，当介质82是基于氮的介质时，顺铂可以用作大孔间隔子材料68)。大孔间隔子
68也可以是不可吸收的，其由于生物侵蚀而从微球20中脱落，并导致较小管腔结构(例如血管)的栓塞。

[0122] 将会理解，对大孔24的尺寸控制可以取决于用来提供大孔间隔子68的晶体或颗粒的总体尺寸以及大孔间隔子68进入溶液54的时机。除了盐以外或作为盐的替代物，满足上述任何溶解度标准的其他无毒的可生物相容的结晶物质也适合作为大孔间隔子材料68。作为非限制性例子，合适的大孔间隔子材料68可以包括：可生物接受的碱金属和碱土金属卤化物、磷酸盐、硫酸盐等；糖的晶体；水溶性聚合物的微球；和蛋白例如白蛋白。在具体实施方案中，本发明使用的大孔间隔子材料68是氯化钠。大孔间隔子材料68也可以包含较小的微球20或纳米颗粒(其可以是或可以不是可生物吸收的)。经选择的这些材料的颗粒应当具有大孔24所需的直径。

[0123] 在某些实施方案中，大孔间隔子材料是添加剂。在一些实施方案中，大孔间隔子材料是顺铂。在一个实施方案中，大孔间隔子材料是顺铂且介质是氮基介质。在某些实施方案中，大孔间隔子材料是可生物吸收的。在其它实施方案中，大孔间隔子材料不是可生物吸收的。在某些实施方案中，大孔间隔子材料栓塞了管腔结构例如血管。在某些实施方案中，大孔间隔子材料是无毒的和/或可生物相容的。在一些实施方案中，大孔间隔子材料选自碱金属和碱土金属卤化物、磷酸盐、硫酸盐；糖、糖的晶体；水溶性聚合物、微球、纳米颗粒、水溶性聚合物的微球；蛋白、白蛋白和氯化钠。

[0124] 4.添加剂

[0125] 在一些实施方案中，制造微球20的方法不包括在微球20中含有一种或多种添加剂(例如生物活性材料)。在其它实施方案中，制造微球20的方法可以进一步包括在微球20中结合入一种或多种添加剂(例如生物活性材料)。该步骤可在制造过程的各个阶段进行。作为非限制性例子，添加剂可以在聚合物溶液54注射进塔80前被引入该溶液，在洗涤(方框212)后添加到微球20的孔中，和/或结合进且最初留存在微球20中的大孔间隔子
68中，或者添加剂可以充当聚合过程的引发剂。

[0126] 在某些实施方案中，能够承受制造过程中的温度波动的添加剂在注射进塔80前结合入聚合物溶液54中。在此类实施方案中，可以在注射前约1、5、10、15、20、30、45分钟或约1、2、4、6小时内向溶液中提供添加剂。在一些实施方案中，可以在将添加剂溶解在其中之前将基质聚合物22以及第一和第二溶剂预混合，或者可将添加剂溶解在其具有最佳可溶性的溶剂中，然后将第一和第二溶剂以及基质聚合物22混合。当液滴84在塔80中淬冷时，这些添加剂材料可被嵌埋在基质聚合物22中。在微球20形成的随后阶段中(例如，在液滴84淬冷形成微球85后)，这些添加剂可以通过各种方式粘附在微球20的表面上，例如通过与基质聚合物22交联、离子键合、酸碱反应、受体位点吸引、或重力。在某些实施方案中，在注射后向溶液中提供添加剂。在此类实施方案中，在注射后约1、5、10、15、20、30、45分钟或约1、2、4、6小时内向溶液中提供添加剂。在一些实施方案中，在注射期间向溶液中提供添加剂。

[0127] 在某些实施方案中，在淬冷前向溶液中提供添加剂。在这些实施方案中，可以在淬冷前约1、5、10、15、20、30、45分钟或约1、2、4、6小时内向溶液中提供添加剂。在其它实施方案中，在淬冷后向溶液中提供添加剂。在这些实施方案中，在淬冷后约1、5、10、15、20、30、45分钟或约1、2、4、6小时内向溶液中提供添加剂。在一些实施方案中，在淬冷期间向溶液中提供添加剂。

[0128] 在某些实施方案中，在洗涤前向溶液中提供添加剂。在这些实施方案中，可以在洗涤前约1、5、10、15、20、30、45分钟或约1、2、4、6小时内向溶液中提供添加剂。在其它实施方案中，在洗涤后向溶液中提供添加剂。在这些实施方案中，在洗涤后约1、5、10、15、20、30、45分钟或约1、2、4、6小时内向溶液中提供添加剂。在一些实施方案中，在洗涤期间向溶液中提供添加剂。

[0129] 除了在其制造期间将添加剂引入微球20外，或者作为其替代方法，可以在方法200结束后将添加剂结合入微球20中或包涂在微球20上。在某些实施方案中，添加剂可以共价连接在聚合物上。在一实施方案中，可以使用本领域已知的方法将添加剂共价连接在具有悬垂的游离羧酸基团的聚合物上。参见例如美国专利号5,219,564和5,660,822；
Nathan等，Bio.Congo Chem.，4，54-62(1992)和Nathan，Macromolecules，25，4476(1992)，其作为参考被完整并入本文。在某些实施方案中，当偶联形式的添加剂具有活性时，使用对水解具有稳定性的偶联物。当偶联形式的添加剂无活性时，使用可水解的偶联物。

[0130] 在某些实施方案中，可将添加剂结合入颗粒中或包涂在其上。在一实施方案中，通过本领域已知的工艺，微球20可以用抗凝血剂(例如肝素)包涂，使得抗凝血剂与微球20表面共价连接。这些不形成血栓的涂层可能有益于某些应用，例如组织工程或者干细胞移植或收获。在一些实施方案中，微球20可以生物活性物质包涂，所述生物活性物质是所需的细胞群落的受体或化学趋化剂。可以通过吸附或化学键合来施用这些涂层。在某些实施方案中，添加剂粘附在颗粒表面上。在一实施方案中，添加剂通过与基质聚合物交联、离子键合、酸碱反应、受体位点吸引或重力粘附在微球表面上。

[0131] 在某些实施方案中，添加剂可以随后以受控方式在活个体的选定靶向区域从微球20中释放，或者可以不从微球20中释放而通过与周围液体和组织接触被活化。可以通过微球20的生物侵蚀(如果基质聚合物22是可生物降解的)、从微球20扩散、或向微球20的聚合物表面迁移来释放添加剂。添加剂可以在生理学上或药学上可接受的载体、赋形剂、稳定剂等中提供，且可以在持续释放或定时释放制剂中提供。添加剂也可以包含试剂以促进其递送，所述试剂例如抗体、抗体片段、生长因子、激素、或其他靶定向部分，添加剂与所述试剂相连接。

[0132] 适合与微球20一起使用的添加剂包括生物学或药学活性化合物。生物学活性化合物的例子包括但不限于细胞附着中介物，例如包含已知影响细胞附着的“RGD”整联蛋白结合序列变体的肽、生物活性配体、和增强或排除细胞或组织向内生长的各种情形的物质。这些物质包括例如骨诱导物质，例如骨形态发生蛋白(BMP)、表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、血小板源生长因子(PDGF)、胰岛素样生长因子(IGF-I和II)、TGF-β、血管内皮生长因子(VEGF)、肿瘤坏死因子(TNF)、肿瘤诱导因子(TIF)等。

[0133] 药学活性化合物的例子包括但不限于阿昔洛韦、头孢拉定、malfalen、普鲁卡因、麻黄碱、阿霉素、道诺霉素、白花丹素、阿托品、quanine、地高辛、奎尼丁、生物活性肽、二氢卟吩e6、头孢菌素、脯氨酸和脯氨酸类似物(例如顺式-羟基-L-脯氨酸)、青霉素V、阿司匹林、布洛芬、类固醇、烟酸、化学去氧胆酸、苯丁酸氮芥等。可以用作添加剂的生物活性物质的其他非限制性例子包括血管扩张剂例如硝酸盐(硝酸甘油，基于一氧化二氮的材料)、钙通道阻滞剂(商业名维拉帕米)、溶栓剂(例如组织纤溶酶原因子(TPA)、链激酶、尿激酶)、抗血小板聚集/粘附因子(例如IIa-IIIb抑制剂，商业名reopro)。

[0134] 其它潜在添加剂包括传统化疗剂或生物化疗剂。传统化疗剂的非限制性例子包括铂类化疗剂、拓扑异构体、拓扑抑制剂和逆转录酶化疗剂。生物化疗剂的非限制性例子包括贝伐单抗、西妥昔单抗、3-溴丙酮酸酯、小分子生物制品例如索拉非尼和多重激酶抑制剂。其它示例性添加剂是本文别处提供的治疗剂和药物。

[0135] 在某些实施方案中，与本文提供的双孔颗粒或微球、组合物和方法联合使用的添加剂是一种或多种治疗剂。可以在本文提供的组合物、方法或试剂盒中与微球联合使用的治疗剂包括(例如，一种、两种、三种、四种或更多种)试剂，例如药物。这些治疗剂可以是抗肿瘤药物、抗血管生成药物、抗真菌药物、抗病毒药物、抗炎症药物、抗细菌药物、细胞毒性药物、化疗或疼痛缓解药物和/或抗组胺药物中的任意一种或多种。治疗剂也可以是例如激素、类固醇、维生素、细胞因子、趋化因子、生长因子、白细胞介素、酶、抗过敏剂、循环药物、抗结核剂、抗心绞痛剂、抗原生动物剂、抗风湿剂、麻醉剂、强心苷剂、镇静剂、局部麻醉剂、全身麻醉剂、及其组合中的任意一种或多种。这些治疗剂也可以包括例如抗肿瘤剂、血管生成因子、免疫抑制剂、或抗增殖剂(抗再狭窄剂)。治疗剂的其它非限制性例子包括胚胎因子、成纤维细胞生长因子、转录因子、激酶抑制剂、或腺苷。在某些实施方案中，治疗剂是抗肿瘤药、化疗药或疼痛缓解药物。

[0136] 抗血管生成药或抗肿瘤药的例子包括但不限于AGM-1470(TNP-470)、抑制血管生成的类固醇、血管生成抑制因子、抗avβ3抗体、抗bFGF抗体、抗IL-1抗体、抗TNF-α抗体、抗VEGF抗体、金诺芬、硫唑嘌呤、BB-94和BB-2516、碱性FGF-可溶受体、羧基胺基-三唑(CAI)、软骨源抑制剂(CDI)、几丁质、氯喹、CM 101、可的松/肝素、可的松/透明质酸、脱氧可的松/肝素、CT-2584、环磷酰胺、环孢菌素A、地塞米松、双氯芬酸/透明质酸、嗜酸性细胞主要碱性蛋白、纤连蛋白肽、神经胶质瘤源血管生成抑制因子(GD-AIF)、GM 1474、氯化金、硫代苹果酸金、肝素酶、透明质酸(高和低分子量类型)、氢化可的松β-环葡聚糖、布洛芬、吲哚美辛、干扰素-α、干扰素γ-诱导蛋白10、干扰素-γ、IL-1、IL-2、IL-4、IL-12、层粘蛋白、左旋咪唑、利诺胺、LM609、马立马司他(BB-2516)、甲羟孕酮、甲氨蝶呤、二甲胺四环素、一氧化氮、奥曲肽(生长激素抑制素类似物)、D-青霉胺、戊聚糖多硫酸酯、胎盘增殖蛋白相关蛋白、胎盘核糖核酸酶抑制剂、纤溶酶原活化剂抑制剂(PAI)、血小板因子-4(PF4)、泼尼松龙、催乳激素(16-kDa片段)、增殖蛋白相关蛋白、前列腺素合酶抑制剂、鱼精蛋白、类维生素A、生长激素抑制素、物质P、苏拉明、SU101、替可加兰钠(05-4152)、四氢可的索-血小板反应蛋白(TSP)、金属蛋白酶的组织抑制剂(TIMP 1、2、3)、沙利度胺、3-氨基沙利度胺、3-羟基沙利度胺、沙利度胺/3-氨基沙利度胺/3-羟基沙利度胺的代谢物或水解产物、维生素A和玻璃体液。在另一实施方案中，抗血管生成剂选自沙利度胺、3-氨基沙利度胺、3-羟基沙利度胺以及沙利度胺/3-氨基沙利度胺/3-羟基沙利度胺的代谢物或水解产物。在一个实施方案中，抗血管生成剂是沙利度胺。

[0137] 其他抗血管生成或抗肿瘤药物包括且不限于烷化剂、氮芥、抗代谢物、促性腺激素释放激素拮抗剂、雄激素、抗雄激素、抗雌激素、雌激素、及其组合。具体例子包括但不限于放线菌素D、阿地白介素、阿仑单抗、阿利维A酸、别嘌呤醇、六甲蜜胺、氨磷汀、氨鲁米特、两性霉素B、安吖啶、阿那曲唑、安丝菌素、阿拉伯糖基腺嘌呤、三氧化二砷、天冬酰胺酶、欧文氏菌属天冬酰胺酶、BCG活菌、苯甲酰胺、贝伐单抗、贝沙罗汀、博来霉素、3-溴丙酮酸酯、白消安、卡鲁睾酮、卡培他滨、卡铂、卡折来新、卡氮芥、塞来昔布、苯丁酸氮芥、顺铂、克拉屈滨、环磷酰胺、阿糖胞苷、阿拉伯糖苷胞嘧啶、达卡巴嗪、放线菌素D、达贝泊汀α、柔红霉素、道诺霉素、地尼白介素、右丙亚胺、地塞米松、多西紫杉醇、阿霉素、屈他雄酮、表柔比星、依伯汀α、雌莫司汀、依托泊苷、VP-16、依西美坦、非格司亭、氟尿苷、氟达拉滨、氟尿嘧啶(5-FU)、氟他胺、氟维司群、demcitabine、吉西他滨、吉妥单抗、醋酸戈舍瑞林、羟基脲、替伊莫单抗、伊达比星、异环磷酰胺、伊马替尼、干扰素(例如，干扰素α-2a、干扰素α-2b)、伊立替康、来曲唑、甲酰四氢叶酸、亮丙瑞林、环己亚硝脲、meciorthamine、甲地孕酮、关法仑(例如PAM、L-PAM或苯丙氨酸氮芥)、巯基嘌呤、巯基聚赖氨酸、美司钠、甲磺酸、甲氨蝶呤、甲氧沙林、光神霉素、丝裂霉素、米托坦、米托蒽醌、苯丙酸诺龙、三苯氧胺、奥普瑞白介素、奥沙利铂、紫杉醇、帕米膦酸钠、培加酶、培门冬酶、聚乙二醇非格司亭、喷司他丁、哌泊溴烷、普卡霉素、卟吩姆钠、甲基苄肼、奎纳克林、雷替曲塞、拉布立酶、核苷、利妥昔单抗、沙格司亭、螺铂、链佐星、他莫昔芬、喃氟啶-尿嘧啶、替莫唑胺、替尼泊苷、睾内酯、硫鸟嘌呤、噻替派、组织纤溶酶原活化剂、托泊替康、托瑞米芬、托西莫单抗、曲妥珠单抗、曲奥舒凡、维甲酸、曲洛司坦戊柔比星、长春碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨、唑来膦酸，其盐或其混合物。在一些实施方案中，铂化合物是螺铂、顺铂、或卡铂。在具体实施方案中，药物是顺铂、丝裂霉素、紫杉醇、他莫昔芬、阿霉素、他莫昔芬、或其混合物。

[0138] 疼痛缓解药物的例子是且不限于镇痛剂或抗炎剂，例如非甾族抗炎症药物(NSAID)、布洛芬、酮洛芬、右酮洛芬、苯托沙敏、扑尔敏、氟比洛芬、万络、西乐葆、bexxstar、萘丁关酮、阿司匹林、可待因、磷酸可待因、对乙酰氨基酚、扑热息痛、利多卡因、和萘普生。在一些实施方案中，疼痛缓解药物是阿片类物质。阿片类物质因为其有效的镇痛或疼痛缓解性质而常被开成处方。属于这一类的化合物中包括麻醉剂，例如吗啡、可待因、和相关药物。阿片类物质的其它例子包括羟考酮、丙氧芬、氢可酮、氢吗啡酮和哌替啶。麻醉剂包括例如且不限于止痛剂和鸦片制剂，例如可待因、海洛因、美沙酮、吗啡和鸦片。

[0139] 激素和类固醇包括例如且不限于生长激素、黑素细胞刺激激素、促肾上腺皮质激素、地塞米松、醋酸地塞米松、地塞米松磷酸钠、可的松、醋酸可的松、氢化可的松、醋酸氢化可的松、环戊丙酸氢化可的松、氢化可的松磷酸钠、氢化可的松琥珀酸钠、泼尼松、泼尼松龙、醋酸泼尼松龙、泼尼松龙磷酸钠、泼尼松龙醋酸特丁酯、特戊酸泼尼松龙、曲安西龙、曲安奈德、己曲安缩松、醋酸曲安西龙、甲基泼尼松龙、醋酸甲基泼尼松龙、甲基泼尼松龙琥珀酸钠、氟尼缩松、二丙酸倍氯米松、倍他米松磷酸钠、倍他米松、vetamethasone磷酸二钠、vetamethasone磷酸钠、醋酸倍他米松、倍他米松磷酸二钠、醋酸氯泼尼松、皮质酮、去氧皮质酮、醋酸去氧皮质酮、特戊酸去氧皮质酮、去氧米松、雌二醇、氟氢可的松、醋酸氟氢可的松、醋酸双氯松、氟氢可的松、氟米龙、氟泼尼龙、帕拉米松、醋酸帕拉米松、雄甾酮、氟甲睾酮、醛甾酮、羟甲雄二烯酮、甲基雄烯二醇、甲基睾酮、诺乙雄龙、睾酮、庚酸睾酮、丙酸睾酮、马萘雌酮、马烯雌酮、雌二醇苯甲酸酯、雌二醇二丙酸酯、雌三醇、雌激素酮、雌激素酮苯甲酸酯、乙酸基孕烯醇酮、醋酸阿那孕酮、醋酸氯地孕酮、醋酸氟孕酮、羟甲基孕酮、醋酸羟甲基孕酮、羟基孕酮、醋酸羟基孕酮、己酸羟基孕酮、醋酸美仑孕酮、甲基诺龙、孕烯醇酮、孕酮、乙炔基雌二醇、炔雌醇甲醚、二甲炔酮、脱水羟基孕酮、炔诺醇二醋酸酯、炔诺酮、醋酸炔诺酮、炔诺酮、氟轻松、氟氢缩松、氟尼缩松、氢化可的松琥珀酸钠、甲基泼尼松龙琥珀酸钠、泼尼松龙磷酸钠、曲安奈德、羟二酮钠螺内酯、氧雄龙、羟甲烯龙、屈他雄酮、环戊丙酸睾酮、睾酮乙酸苯酯、雌二醇环戊丙酸酯和异炔诺酮。

[0140] 肽和肽类似物包括例如且不限于锰超氧化物歧化酶、组织纤溶酶原活化剂(t-PA)、谷胱甘肽、胰岛素、多巴胺、肽配体(包括RGD、AGD、RGE、KGD、KGE或KQAGDV(对GPEXma受体具有亲合力的肽))、鸦片肽、脑啡肽、内啡肽及其类似物、人绒毛膜促性腺激素(HCG)、促肾上腺皮质激素释放因子(CRF)、缩胆囊肽及其类似物、缓激肽及其类似物以及促进剂和抑制剂、弹性蛋白、加压素、胃蛋白酶、胰高血糖素、物质P、整联蛋白、卡托普利、依那普利、赖诺普利和其他ACE抑制剂、促肾上腺皮质激素(ACTH)、催产素、降钙素、IgG或其片段、IgA或其片段、IgM或其片段、效应细胞蛋白酶受体的配体(所有亚型)、凝血酶、链激酶、尿激酶、t-PA及所有活性片段或类似物、蛋白激酶C及其结合配体、干扰素(α-IFN、β-IFN、γ-IFN)、集落刺激因子(CSF)、粒细胞集落刺激因子(GCSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、肿瘤坏死因子(TNF)、神经生长因子(NGF)、血小板源生长因子、淋巴毒素、表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、血管内皮细胞生长因子、促红细胞生成素、转化生长因子、制瘤素M、白细胞介素(IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20等)、金属蛋白激酶配体、胶原酶以及激动剂和拮抗剂。

[0141] 抗体包括例如但不限于基本纯化的抗体或其片段，包括非人类抗体或其片段。在各种实施方案中，基本纯化的抗体或其片段可以是人类的、非人类的、嵌合的和/或人源化抗体。这些非人类抗体可以是山羊、小鼠、绵羊、马、鸡、兔或大鼠抗体。抗体可以是单克隆或多克隆抗体。

[0142] 抗有丝分裂因子包括且不限于雌莫司汀及其磷酸化衍生物、磷酸雌莫司汀、阿霉素、amphethinile、考布他汀A4、和秋水仙碱。

[0143] 抗凝结剂包括例如且不限于苯丙香豆醇和肝素。

[0144] 抗病毒剂包括例如且不限于阿昔洛韦、金刚烷胺叠氮胸苷(AZT或齐多呋定)、三氮唑核苷、和阿糖腺苷一水合物(腺嘌呤阿拉伯糖苷，ara-A)。

[0145] 抗心绞痛剂包括例如且不限于地尔硫卓、硝苯地平、维拉帕米、赤藓糖醇四硝酸酯、异山梨醇二硝酸酯、硝酸甘油(三硝酸甘油酯)、和季戊四醇四硝酸酯。

[0146] 抗生素包括例如氨苯砜、氯霉素、新霉素、头孢克洛、头孢羟氨苄、头孢氨苄、头孢拉定红霉素、克林霉素、林可霉素、阿莫西林、氨苄西林、巴氨西林、羧苄青霉素、双氯西林、环青霉素、picloxacillin、海他西林、甲氧西林、萘夫西林、苯唑西林、青霉素G、青霉素V、替卡西林、利福平和四环素。

[0147] 抗炎剂和镇痛剂包括例如二氟尼柳、布洛芬、吲哚美辛、甲氯灭酸、甲灭酸、萘普生、羟布宗、保泰松、吡罗昔康、舒林酸、托美汀、阿司匹林和水杨酸盐。

[0148] 循环药物包括例如且不限于普萘洛尔。

[0149] 强心苷剂包括例如且不限于去乙酰毛花甙丙、洋地黄毒甙、地高辛、洋地黄苷和洋地黄。

[0150] 神经肌肉阻滞剂包括例如且不限于甲磺酸阿曲库铵、戈拉碘铵、己芴溴铵、碘甲筒箭毒、泮库溴铵、琥珀酰氯化胆碱(氯琥珀胆碱)、氯化筒箭毒碱、和维库溴铵。

[0151] 镇静剂包括例如且不限于异戊巴比妥、异戊巴比妥钠、阿普比妥、仲丁巴比妥钠、水合氯醛、乙氯维诺、炔己蚁胺、盐酸氟西泮、苯乙哌啶酮、盐酸左关丙嗪、甲乙哌酮、咪达唑仑盐酸副醛、戊巴比妥、戊巴比妥钠、苯巴比妥钠、司可巴比妥钠、他布酮、羟基安定、和三唑仑。

[0152] 局部麻醉剂包括例如且不限于盐酸丁哌卡因、盐酸氯普鲁卡因、盐酸依替卡因、盐酸利多卡因、盐酸甲哌卡因、盐酸普鲁卡因、和盐酸丁卡因。

[0153] 全身麻醉剂包括例如且不限于氟哌利多、依托咪酯、含氟哌利多的柠檬酸芬太尼、盐酸氯胺酮、烯丙炔巴比妥钠、和硫喷妥钠。

[0154] 放射性颗粒或离子包括例如且不限于锶、铼、钇、锝和钴。

[0155] 在其他应用中，微球20可以为各种治疗或其它添加剂提供到达身体中向局部靶向区域的递送运载体，实现了治疗或其它添加剂与靶向区域的延长的、受控的接触。微球20可以掺杂、混合、包涂、或浸透所需的治疗剂或其他添加剂，并通过任何合适的手段注射到靶向区域中。例如，微球20可以潜在地递送任何以下添加剂：化疗剂、免疫调节剂、病毒载体、化学趋化剂、多肽、神经递质、生物制品(例如贝伐单抗)、抗体受体位点、抗体、抗生素和组织分化信号材料。或者，可以在微球结构上连接分子天线以为抗体结合、酸碱反应、离子结合、额外交联、以及亲水/疏水受体位点提供位点。添加剂的其它非限制性例子在本文别处提供。

[0156] 结合入多孔微球20的添加剂的量将对个体(典型地为哺乳动物)产生最佳功效。在某些实施方案中，该个体需要所述添加剂的治疗。施用的剂量和方法将因个体而不同，且取决于各种因素，例如被治疗的哺乳动物的类型、其性别、重量、饮食、同时使用的药物、总体临床状况、使用的特定化合物、这些化合物的具体用途、和本领域技术人员将认识到的其他因素。在某些实施方案中，添加剂剂量范围从约0.001mg/kg到约1000mg/kg，例如从约0.01mg/kg到约100mg/kg或从约0.10mg/kg到约20mg/kg。添加剂可以单独使用，或与其它治疗剂或诊断剂联合使用。一般地，治疗或控制从小剂量开始，然后剂量可以逐步小幅增加，直到在这种情况下达到所需效果。另外，本领域技术人员可以依靠参考材料，例如Medical Economics Company，Montvale，N.J.出版的Physician’s Desk Reference，来确定特定药物/药剂的适当数量，由此，可以使用本发明提供的方法对患者施用这样的剂量或更低或更高的剂量。依照本发明提供的方法，在某些实施方案中，为了例如在患者中治疗或控制状况(即疾病状态、疾病、病症等)，向患者(例如患者的某区域)递送药物，目的是。
药物可以如上使用，或可以结合入其它实施方案例如乳液中。

[0157] C.药物组合物

[0158] 本发明提供了药物组合物，其包含任何上述微球和药学上可接受的液体或其它可生物相容的载体。组合物可以是悬浮液、水凝胶或乳液的形式。组合物也可以是所述微球在所述液体中的悬浮液。在一些实施方案中，组合物是无菌的。

[0159] 药学上可接受的液体可以是且不限于盐水、缓冲溶液、水、等张溶液、生物体液或其混合物。液体也可以是盐溶液，且在某些实施方案中，由选自钠、钾、钙、镁、铁、锌和铵的阳离子组成，例如，量为约0.01M到约5M。

[0160] 组合物可以包含约10％到约90％重量的微球和约10％到约90％重量的液体(或其它可生物相容的载体)。组合物也可以包含约10％到约50％重量的微球和约50％到约90％重量的液体(或其它可生物相容的载体)。

[0161] 供治疗用途的可接受的药物载体包括稀释剂，增溶剂，润滑剂，悬浮剂，封装材料，溶剂，增稠剂，分散剂，缓冲液例如磷酸盐、柠檬酸盐、醋酸盐和其它有机酸盐，抗氧化剂例如抗坏血酸，防腐剂，低分子量(少于约10个残基)肽例如聚精氨酸，蛋白例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白，亲水聚合物例如聚(乙烯吡咯烷酮)，氨基酸例如甘氨酸、谷氨酸、天冬氨酸或精氨酸，单糖，二糖，以及其他碳水化合物包括纤维素或其衍生物、葡萄糖、甘露糖或糊精，螯合剂例如EDTA，糖醇例如甘露醇或山梨糖醇，抗衡离子例如钠和/或非离子表面活性剂例如tween、普朗尼克或PEG。

[0162] 在一些实施方案中，可生物相容的载体是水基溶液、水-有机溶液、有机溶液、非水性溶液、或其混合物。在某些实施方案中，可生物相容的载体包含由阳离子例如钠、钾、钙、镁、铁、锌、铵、及其混合物组成的盐，例如，量从约0.01M到约5M。

[0163] 装载在微球内或微球上的添加剂(例如治疗剂)可以由于生理过程而在体内释放。装载在微球上的药物的释放可以被pH和盐浓度影响。例如，通过在微球周围的环境中建立pH变化或离子强度变化，可以加速药物释放。本领域技术人员可以容易地确定这样的最佳药物释放条件。

[0164] 在一些实施方案中，添加剂(例如治疗剂)通过延长和/或持续释放来释放。在某些实施方案中，添加剂经过数小时、数天或数星期释放。在一个实施方案中，在一段时间后，例如，约3小时、约6小时、约12小时、约18小时后，或约1天、约2天、约3天、约4天、约5天、约6天后，或约1星期、约2星期、约3星期、约4星期、约5星期、约6星期、约7星期、约8星期、约9星期、或约10星期或更久之后，约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、或约100％的药物从微球中释放。药物释放性质将部分取决于使用的具体药物的性质，但可被本领域技术人员方便地确定。

[0165] 在一些实施方案中，添加剂(例如治疗剂)经过数天或数星期从微球中释放。在一个实施方案中，超过约1％但少于约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约50％、约75％或约90％的药物在约72小时内、约96小时内、一星期内、两星期内、或四星期内释放。

[0166] D.使用双孔微球的方法

[0167] 根据本发明提供的具体实施方案，可生物相容的双孔微球20可具有各种广泛的医学应用。例如，本发明提供的微球可以用作组织工程，组织引导再生，体内干细胞收获、培养或分化，治疗材料在靶向的人或动物组织中的递送和悬浮，和/或其他应用。不受限于任何理论，微球20的尺寸允许其相对容易地被递送至活个体的几乎任何靶向区域(例如通过非手术手段，例如通过导管、针头、导管等)，且微球20的多孔结构使得其在这些靶向区域内具有各种应用，例如递送延长的局部治疗，或者促进细胞生长和移植。

[0168] 可以通过本领域已知的方法将本发明提供的组合物和方法中的微球施用(或者与其接触)至组织或器官(例如，心脏、肾、脊髓、子宫、肝或胰腺)。在某些实施方案中，将微球施用至具有超过一条血液供应的组织或器官例如肝、肺、脊柱、脊髓、子宫或胰腺(例如通过注射)。在某些实施方案中，将颗粒施用至患者的心脏、肺、神经系统、脑、肺、肝、子宫或胰腺。在一些实施方案中，将颗粒施用至组织或器官内包含的一条或多条血管、静脉或动脉。在某些实施方案中，本发明提供的双孔微球被用于对抗靶向区域(例如施用或注射区域，例如在组织或器官内或其附近)中的缺血。在本发明提供的方法的一些实施方案中，通过管腔内施用或注射向患者施用微球。在本发明提供的方法的其它实施方案中，通过血管内施用或注射向患者施用微球。

[0169] 微球可以被全身递送或局部递送至希望的组织或器官。在一些实施方案中，微球可以在手术之前、期间或之后向组织或器官施用。在其它实施方案中，使用非手术方法向组织或器官递送微球，例如，局部地通过直接注射进选定组织而递送至远端位点并让其被动循环到靶向位点，或通过注射到远端位点并用磁铁来积极引导其至靶向位点。这些非手术递送方法包括例如输注或血管内(例如静脉内或动脉内)、肌肉内、腹膜内、鞘内、真皮内或皮下施用。

[0170] 可以通过对患者施用治疗有效量的本发明提供的微球或药物组合物来治疗或控制以上疾病或病症。

[0171] 通常通过注射来进行施用。在某些实施方案中，通过导管施用微球。在其它实施方案中，使用连接在注射器上的针头注射微球。在一些实施方案中，施用是向血管内进行的。在其它实施方案中，施用直接到达作用位点，例如进入肿瘤块中，或进入需要此类治疗或控制的细胞、器官或组织中。本发明提供的微球可以在施用时已装载药物。在其它实施方案中，可将微球与药物溶液联合施用，其中药物溶液在微球施用之前、同时或之后施用。

[0172] 施用时，微球或药物组合物是适合注射的。在具体实施方案中，微球或包含微球的组合物是无菌的。微球可以通过任何本领域已知的方法灭菌，例如通过辐射，例如γ或β辐射。在某些实施方案中，使用无菌技术来无菌制备微球。在一些实施方案中，无菌制备的微球包含添加剂，例如治疗剂或药物。

[0173] 在某些实施方案中，本发明提供了适于治疗或控制肿瘤或其他癌症、非致瘤性血管生成依赖性疾病、或疼痛(例如与肿瘤或其它癌症相关的疼痛)、或其症状的组合物和方法。这些癌症包括且不限于(解剖学上的和原发肿瘤位点)肝、卵巢、乳腺、肾、肺、胰腺、甲状腺、前列腺、子宫、皮肤癌、头颈部肿瘤、乳腺肿瘤、脑、骨、软组织(例如肉瘤、脂肪瘤、恶性纤维组织细胞瘤)、血液(例如淋巴瘤)、Kaposi’s肉瘤、和膀胱癌的浅表型。在某些实施方案中，治疗或控制方法可以是药物自装载药物的微球中的局部(或全身)释放单独产生或与微球的栓塞效应联合产生的结果。在某些实施方案中，本发明提供的装载药物的微球被施用至除血管以外的位点特异性位置(例如，直接施用至肿瘤块)，且没有发生血管栓塞。

[0174] 但是，除了癌症之外，许多以血管异常生长为特征的其他非致瘤性血管生成依赖性疾病也可以用本发明提供的微球或药物组合物治疗(通过下调或上调)或控制。这些非致瘤性血管生成依赖性疾病的代表性例子包括且不限于肥厚性疤痕和瘢痕瘤、增殖性糖尿病性视网膜病变、类风湿性关节炎、动静脉畸形、淋巴管畸形、静脉畸形、粥样硬化斑块、延误的伤口愈合、血友病性关节、骨不连骨折Klippel Trenaunay综合症、Parkes Weber综合症、Osier-Weber-Rendu综合症、蓝色橡皮疱疹综合症、皮肤和皮下痣、血管瘤、平滑肌瘤、腺瘤、错构瘤、牛皮癣、化脓性肉芽肿、硬皮病、沙眼、月经过多和血管粘附。

[0175] 类似地，本发明提供的微球和组合物可以用来向各种需要其的细胞、组织或器官递送药物。例如，微球和组合物可以用来治疗或控制肿瘤或癌症、炎性疾病或与炎症相关的其它疾病、或其症状。在其它实施方案中，本发明提供的微球和组合物可以用来治疗或控制子宫纤维瘤。

[0176] 在一些实施方案中，可以在施用微球前对组织、器官或细胞施用药物或治疗剂。在某些实施方案中，在施用微球前约1分钟到约60分钟之间施用药物或治疗剂。在一些实施方案中，在施用微球前1、5、10、15、20、30、45分钟或约1、2、4、6、10、12、18、20或24小时内对组织、器官或细胞施用药物或治疗剂。在另一些其他的实施方案中，药物或治疗剂与微球同时施用。在某些实施方案中，在施用药物或治疗剂前对组织、器官或细胞施用微球。在某些实施方案中，在施用药物或治疗剂前约1分钟到约60分钟之间施用微球。在一些实施方案中，在施用药物或治疗剂前1、5、10、15、20、30、45分钟或约1、2、4、6、10、12、18、20或24小时内对组织、器官或细胞施用微球。

[0177] 另外，微球(具有或不具有生物活性添加剂)可以与细胞递送同时施用，细胞递送可以包括且不限于对糖尿病的胰岛细胞移植、为心肌合成或保存而进行的干细胞施用、骨结构内的骨促进或合成、以及对肝或肺的基于导管的干细胞施用。

[0178] 在一些实施方案中，可以在施用微球前对组织、器官施用细胞(例如干细胞)。在某些实施方案中，在施用微球前约1分钟到约60分钟之间施用细胞(例如干细胞)。在一些实施方案中，在施用微球前1、5、10、15、20、30、45分钟或约1、2、4、6、10、12、18、20或24小时内对组织或器官施用细胞(例如干细胞)。在另一些其他的实施方案中，细胞(例如干细胞)与微球同时施用。在某些实施方案中，在施用细胞(例如干细胞)前对组织或器官施用微球。在某些实施方案中，在施用细胞前约1分钟到约60分钟之间施用微球。在一些实施方案中，在施用细胞(例如干细胞)前1、5、10、15、20、30、45分钟或约1、2、4、6、10、12、18、20或24小时内对组织或器官施用微球。在这些各种实施方案中，细胞和/或微球可以任选地与药物或治疗剂一起向组织或器官施用。

[0179] 在本发明提供的方法中使用的细胞的有效剂量将取决于使用的细胞类型和/或递送位点而变化，且这些剂量可以由医生方便地确定。在某些实施方案中，细胞数量范围是5 9 6 8 7 7
1x10 到1x10。例如，细胞可以以约1x10 到1x10 之间的剂量施用，例如1x10 到5x10之间的剂量。取决于例如将被递送的器官或组织的尺寸，或损伤区域的尺寸，可以使用更多或更少的细胞。例如，较大区域的损伤可能需要较大剂量的细胞，而小区域的损伤可能需要
5 9
较小剂量的细胞。根据接收者的体重，有效剂量可以在1x10 到1x10/kg体重之间，例如
5 6 7 8 9 6 6
1x10、1x10、1x10、1x10、或1x10(或其任何范围)/kg体重，例如在1x10 到5x10 个细胞/kg体重之间。患者年龄、总体情况、和免疫状况可被用作确定施用剂量的因素，且将由医生方便地确定。

[0180] 本发明提供的组合物和方法的进一步非限制性示范性应用领域是动脉内近距离治疗、胰岛细胞移植和下述其他领域，其说明了微球20的潜在功能。

[0181] 1.动脉内近距离治疗

[0182] 动脉内近距离治疗是一种放射治疗形式，其包括基于导管通过动脉向体内的靶向区域进行放射性材料输注，通常用于治疗或控制癌组织或其症状。递送的放射性材料可以具有栓塞效应(阻滞对靶向区域的血液供应)，这对于维持靶向区域中的治疗可能是有益的。但是，这些局部放射治疗通常取决于自由基特别是氧自由基的生成。可以通过在靶向区域周围提供氧环境来促进氧自由基的生成。因此，可能不希望靶向区域内的完全栓塞，因为需要血流来提供氧气。事实上，充分含氧的环境可以导致自由基生成增加，转化成相应增强的放射治疗效果。考虑到这些要求，依照本发明提供的实施方案的多孔微球20可以为动脉内近距离治疗提供相当合适的材料，因为它们能够产生局部区域的放射源(留在靶向区域中)，同时允许向靶向区域的连续血液流入(灌注)和最小或最佳的栓塞效应。此外，额外的治疗剂可以结合进微球结构以实现对靶向区域的延长递送。微球20可以通过各种手段变得具有放射性，例如通过用树脂包涂微球和/或随后通过放射轰击微球20。也可以制造微球20，通过与任何用来形成微球20的材料共价键合(如在美国专利申请10/762507中描述的)或通过在美国专利5011677中描述的技术来结合入放射性药物。

[0183] 2.胰岛细胞移植

[0184] 微球20的另一种示范性应用是在胰岛细胞移植领域中。胰岛细胞移植通常为不能生成胰岛素的糖尿病个体提供来自供体胰腺的生成胰岛素的胰岛细胞。通常，一定量的胰岛细胞通过基于导管的输注被植入到接收者的肝的门静脉中。目前该技术的缺陷是将移植的细胞作为悬浮液注射，这可能导致细胞间的接触、增加的细胞挤压、增加的灌注压、和局部炎症性反应；所有这些因素都可能导致凋亡和移植排斥。如果细胞被充分间隔开以避免或减少细胞间接触、保持充分的血液流动、且生物活性物质以局部水平施用，那么移植细胞的存活可能性可以增加。在移植时共施用的依照本发明提供的实施方案的多孔微球20(具有或不具有生物活性物质，以及具有或不具有可被完全生物吸收的能力)可导致细胞密度下降，且可允许连续灌注，并因此增加了移植存活的可能性。具体地，可以设计微球内的大孔结构以提供适合以合适的间隔距离容纳胰岛细胞的支架，而双孔结构将允许细胞内和细胞周围合适的血液流动动力学。

[0185] 3.其他细胞递送和组织再生

[0186] 使微球20适合胰岛细胞移植的性质(例如，细胞分离和连续灌注)也使微球20潜在地适合许多其他类型的细胞生长、细胞移植和组织再生应用。例如，根据本文提供的实施方案的微球20可被用在干细胞治疗中，作为支持干细胞分化和组织发生的可注射支架。微球20(具有生物活性剂，例如选择蛋白、激素、细胞受体、病毒、以及可以与球表面或基质掺杂、结合或混合的药物)的注射可导致干细胞或靶向的细胞迁移(用于收获、加工、或分化成最终的细胞系)，或者在具体实施方案中，导致功能细胞群或器官的体外生成(器官发生)。特定的非限制性干细胞治疗应用包括将微球20和干细胞注射进具有独特解剖学特征的肝或肺中——即肝具有通过动脉供应和门静脉流入的血管流入，而肺具有通过肺动脉和支气管动脉的双重流入血液供应——从而集中、收获或分化。此外，这些微球20可用各种启动子、化学趋化剂或细胞增强剂包涂或掺杂，其可以促进细胞迁移和/或分化，且可以在靶向区域中促进局部组织再生的建立。

[0187] 包含可生物吸收的(或者可生物侵蚀的或可生物降解的)基质聚合物的微球20可具有更多的优点。在细胞移植或组织生成时，这些微球20可以随时间分解，仅留下生成的或移植的细胞结构。可分解的微球20也可允许对递送的治疗的血液流动增加和治疗向靶向组织中的渗透增加。微球20的逐渐分解也可允许局部治疗(例如药物治疗或放射治疗)向靶向区域的逐渐递送。

[0188] 在某些实施方案中，本发明提供了组织构建和生成的方法。在一些实施方案中，该方法包括向患者例如哺乳动物施用双孔微球的组合物，其任选地在可生物相容的载体中。

[0189] 本发明提供的组织构建和生成方法提供的益处不限于在任何特定的器官或身体部分中修复任何特定类型的组织或组织缺陷。该方法适合在身体的任何类型的任何部分构建和生成缺陷组织，包括但不限于心脏、冠状血管、血管、脊髓、骨、软骨、腱、韧带、乳腺、肝、胆囊、胆管、胰腺、肠组织、泌尿系统、皮肤、疝、和牙齿组织。进一步地，在某些实施方案中，使用包含双孔微球和细胞例如干细胞(例如多能间充质干细胞)的组合物可以改善组织接受度和治疗的有效性。本发明提供的方法还可以增加结缔组织应答。

[0190] 本发明提供了在患者中组织(或器官)构建或再生的方法，包括对患者施用细胞例如干细胞。在一些实施方案中，细胞与该组织或器官接触。在某些实施方案中，对患者施用可注射的组合物。可以通过常规注射器和9到26号针头进行注射。也可以通过各种技术协助注射，例如内窥镜递送或腹腔镜技术。此外，当与可注射组合物的各种有益实施方案组合时(例如自体细胞和治疗剂)，本发明提供的方法可以提供额外的和更有益的治疗效果以进一步改善组织构建和生成。

[0191] 使用本发明提供的方法的注射频率和注射量基于被治疗的组织或器官缺陷的特定情况的性质和位置而决定。在某些实施方案中，多重注射是不必要的。但是，在其它实施方案中，为达到最佳效果，重复注射可能是必须的。熟练的从业者可以为每种特定情况确定注射的频率和量。

[0192] 在某些实施方案中，在施用后，微球被固定在注射位置，且没有被淋巴系统消化或排除，和/或微球没有从注射位置移走。在其它实施方案中，微球是可生物吸收的或可生物降解的。

[0193] 本发明提供的某些双孔微球的性质使得微球能够为有效的组织构建、组织生成和组织工程提供支架。在注射位点形成支架的能力使得本发明提供的微球在提供组织修复中特别有效。支架的尺寸可以根据注射的量和频率决定，这进一步地由所进行的组织构建和生成的性质和位置决定。熟练的从业者将能够为每种特定情况确定注射的精确量和频率。

[0194] 本发明提供的微球可包含细胞例如干细胞(例如，间充质干细胞)可以在注射位点促进新细胞生长的事实与支架效应的组合使得本发明提供的方法在提供组织构建和生成机制中特别有效。由于在某些实施方案中本发明提供的微球是可生物吸收的和/或可生物降解的，它们可以在充当组织生成的支架后被结合入修复的组织。

[0195] 在本发明提供的方法的某些实施方案中，组织构建和生成通过向器官、器官组件或组织中体外施用包含细胞的微球，随后将其加入身体、器官或器官组件来完成。

[0196] 本发明提供的方法可以通过任何类型例如9到26号的无菌针头、以及相应的注射器或其他注射手段例如三向注射器来进行。针头、注射器和其他注射手段可从供应商例如VWR Scientific Products(West Chester，Pa.)、BecktonDickinson、Kendal和Baxter Healthcare商业购买。使用的注射器尺寸和针头长度将取决于特定的注射，基于各种因素例如被治疗的具体疾病或病症、注射的位置和深度、以及使用的可注射悬浮液的体积和具体组成。熟练的从业者基于经验和本发明提供的教导将能够做出注射器和针头的选择。

[0197] 在一个实施方案中，用于制备在本发明提供的组合物和方法中使用的可注射悬浮液的方法如下。将双孔微球洗涤、灭菌、然后与包含细胞例如干细胞(例如间充质干细胞)的细胞培养物混合。然后细胞从其原始培养表面分离，例如通过胰蛋白酶消化。让微球、细胞培养基和分离的细胞的混合物在无菌的且适合干细胞培养的培养过程中持续不少于12小时的时间。悬浮液随后可供注射。

[0198] 4.基因治疗

[0199] 在本发明提供的组合物和方法的一些实施方案中，双孔微球包含细胞例如干细胞。在某些实施方案中，该细胞不是人胚胎干细胞。在一些实施方案中，使用本领域已知的技术对细胞进行遗传工程改造以表达一种或多种多肽，例如治疗剂。在一些实施方案中，细胞在例如载体中包含表达多肽的核苷酸序列。在某些实施方案中，细胞连续表达多肽。在其它实施方案中，细胞瞬时表达多肽。在另一些其它实施方案中，细胞可被调控以表达多肽，例如，通过在包含编码多肽的核酸序列的载体中使用诱导启动子或其他调控元件。在其它实施方案中，双孔微球包含遗传材料。

[0200] 遗传材料可以通过常规转化或转染技术引入真核细胞，所述遗传材料包含天然或合成源的核酸、聚核苷酸、RNA和DNA，包括重组的RNA和DNA以及反义RNA和DNA；锤头状RNA、核酶、抗原核酸、单链和双链RNA和DNA及其类似物，所述遗传材料可与或不与其他元件组合，例如，例如且不限于组织特异性增强子和核定位信号。本发明使用的术语“转化”和“转染”指各种领域公知的将外源核酸引入宿主细胞的技术，包括例如且不限于磷酸钙或氯化钙共沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转染、脂质体转染或电穿孔。转化或转染宿主细胞的合适方法可以在Sambrook等(2001)Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY和其他实验室手册中找到。

[0201] 对于哺乳动物细胞的稳定转染，已知基于使用的表达载体和转染技术，仅有一小部分细胞可以将外源DNA整合到它们的基因组中。为了识别和筛选这些整合体，编码选择标记(例如对抗生素的抗性)的基因通常与感兴趣的基因一起被引入宿主细胞。选择标记可以包括赋予对药物例如G418、潮霉素和甲氨蝶呤的抗性的那些标记。通过药物筛选可以识别被引入的核酸稳定转染的细胞(例如，已经结合入选择标记基因的细胞将存活，而其他细胞死去)。

[0202] 为了实现治疗剂的有效率的体内转移，使用了各种转染剂。适合与本发明提供的方法一起使用的转染剂的代表性例子包括且不限于磷酸钙或氯化钙共沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转染、季铵两亲分子DOTMA((双氧油酰基丙基)三甲基溴化铵，被GEBCO-BRL商业化为Lipofectin))(Felgner等，(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84，7413-7417；Malone等(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA86 6077-6081)；具有悬垂的三甲基铵头部的亲脂性谷氨酸二酯(Ito等(1990)Biochem.Biophys.Acta 1023，124-132)；可代谢的原代脂质例如阳离子脂质双十八烷基胺基甘氨酰精胺(DOGS，Transfectam，Promega)和双棕榈酰磷脂酰乙醇戊基精胺(DPPES)(J.P.Behr(1986)Tetrahedron Lett.27，5861-5864；J.P.Behr等(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86，6982-6986)；可代谢的季铵盐(DOTB，N-(1-[2，3-双氧油酰基]丙基)-N，N，N-三甲基甲基硫酸铵(DOTAP)(BoehringerMannheim)、聚乙烯亚胺(PEI)、双油酰基酯、ChoTB、ChoSC、DOSC)(Leventis等(1990)Biochim.Inter.22，
235-241)；3β[N-(N′，N′-二甲基氨基乙炕)-氨基甲酰基]胆固醇(DC-Chol)，双油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)/3β[N-(N′，N′-二甲基氨基乙烷)-氨基甲酰基]胆固醇DC-Chol的一比一混合物(Gao等，(1991)Biochim.Biophys.Acta 1065，8-14)，精胺，亚精胺，脂多胺(Behr等，Bioconjugate Chem，1994，5：382-389)，亲脂性聚赖氨酸(LPLL)(Zhou等，(1991)Biochim.Biophys.Acta 939，8-18)，含过量磷脂酰胆碱/胆固醇的[[(1，1，3，3-四甲基丁基)甲苯氧基]乙氧基]乙基]二甲基苯甲基氢氧化铵(DEBDA氢氧化物)(Ballas等，(1988)Biochim.Biophys.Acta 939，8-18)，十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)/DOPE混合物(Pinnaduwage等，(1989)Biochim.Biophys.Acta 985，33-37)，谷氨酸(TMAG)与DOPE、CTAB、DEBDA、双十二炕基溴化铵(DDAB)、与硬脂酰胺的亲脂性二酯和磷脂酰乙醇胺的混合(Rose等，(1991)Biotechnique 10，520-525)，DDAB/DOPE(TransfectACE，GIBCO BRL)、和具有寡聚半乳糖的脂质(Remy等，待公开)。

[0203] 各种转染增强剂也可以增加生物活性治疗因子转移入细胞的效率。合适的转染增强剂包括例如且不限于DEAE-葡聚糖、聚凝胺、溶酶体破裂肽(Ohmori NI等，Biochem Biophys Res Commun Jun.27，1997；235(3)：726-9)、基于软骨素的蛋白聚糖、硫酸蛋白聚糖、聚乙烯亚胺、聚赖氨酸(Pollard H等J Biol Chem，1998 273(13)：7507-11)、整联蛋白结合肽CYGGRGDTP、线性葡聚糖非糖类、甘油、连接在寡核苷酸的3-末端核苷间键上的胆甾醇基(Letsinger，R.L.1989 Proc Natl Acad Sci USA 86：(17)：6553-6)、溶血磷脂、溶血磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰乙醇胺、和1-油酰基溶血磷脂酰胆碱。在某些实施方案中，合适的转染剂包括且不限于脂多胺，如在Behr等于1992年12月15日获得授权的美国专利号5,171,678、Behr等于1995年12月19日获得授权的美国专利号5,476,962，和Behr等于
1997年4月1日获得授权的美国专利号5,616,745中所公开的，所述专利的全部内容通过参考被并入本文。

[0204] 在其它实施方案中，本发明提供的微球包含表达载体。在其它实施方案中，微球包含含有表达载体的细胞。该表达载体可以包含编码治疗剂或多肽(或其一部分)的核酸。本文使用的术语“载体”指能够运输与其连接的另一种核酸的核酸分子。一类载体是“质粒”，其指在其中可以连接额外的DNA片段的环形双链DNA环。另一类载体是病毒载体，其中额外的DNA片段可以连接到病毒基因组中。病毒载体的具体例子包括且不限于可用于使用本发明提供的微球和转染剂的基因治疗的腺病毒和逆转录病毒载体。还预期了包含生物活性治疗因子的病毒样微粒的使用，其中病毒样微粒与转染剂物理连接，转染剂还与微粒相连接。可以通过使用与整联蛋白结合肽CYGGRGDTP偶联的聚乙烯亚胺(PEI)通过形成硫桥来设计这些病毒样微粒。这些PEI/包含RGD的肽/复合物与腺病毒分享组成性性质，例如尺寸和中央受保护的核心，以及早期特性，例如整联蛋白介导的细胞进入和酸引发的内体逃逸(Erbacher等，待公开)。

[0205] 某些载体能够在其被引入的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制原点的细菌载体和游离型哺乳动物载体)。其他载体(例如，非游离型哺乳动物载体)在引入宿主细胞后整合进宿主细胞的基因组中，并因此与宿主基因组一起复制。此外，某些载体，表达载体，能够引导与其可操作连接的基因的表达。一般而言，在重组DNA技术中有用的表达载体通常为质粒(载体)形式。但是，也预期其他形式的表达载体，例如提供同等功能的病毒载体(例如复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。

[0206] 本发明使用的重组表达载体可以以适合在宿主细胞中表达核酸的形式包含核酸。这意味着重组的表达载体包括一个或多个调控序列，其根据用于表达的宿主细胞来选择，其可操作地连接到待表达的核酸序列上。在重组表达载体内，“可操作地连接”指感兴趣的核苷酸序列以允许该核苷酸序列表达(例如，在体外转录/翻译系统中或当载体引入到宿主细胞中时在宿主细胞中)的方式与调控序列连接。术语“调控序列”包括启动子、增强子和其他表达控制元件(例如聚腺苷酸化信号)。这些调控序列在例如Goeddel，Gene ExpressionTechnology：Methods in Enzymology 185，Academic Press，San Diego，Calif.(1990)中描述。调控序列包括在许多类型宿主细胞中引导核苷酸序列的组成性表达的序列和仅在某些宿主细胞中引导核苷酸序列表达的序列(例如，组织特异性调控序列)。本领域技术人员将会意识到，表达载体的设计可以取决于若干因素例如待转化的宿主细胞的选择，希望的蛋白表达水平等。表达载体可以被引入宿主细胞中，由此产生如本发明所述的由核酸编码的蛋白或肽，包括融合蛋白或肽。

[0207] 重组表达载体可以被设计供在原核(例如大肠杆菌E.coli)或真核细胞(例如，昆虫细胞(使用杆状病毒表达载体)、酵母细胞、或哺乳动物细胞)中表达多肽。合适的宿主细胞在Goeddel，Gene Expression Technology：Methods inEnzymology 185，Academic Press，San Diego，Calif.(1990)中进一步讨论。或者，重组表达载体可以在体外转录和翻译，例如使用T7启动子调控序列和T7聚合酶。

[0208] 在另一个实施方案中，使用哺乳动物表达载体在哺乳动物细胞中表达核酸。哺乳动物表达载体的例子包括pCDM8(Seed(1987)Nature 329：840)和pMT2PC(Kaufman等(1987)EMBO J.6：187-195)。当在哺乳动物细胞中使用时，表达载体的控制功能常常由病毒调控元件提供。例如，常用的启动子源自多瘤病毒、腺病毒2、巨细胞病毒和猴病毒40。原核和真核细胞的其他合适的表达系统，参见Sambrook等(2001)Molecular Cloning：A LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY。

[0209] 在另一实施方案中，重组的哺乳动物表达载体能够在特定细胞类型中优先引导核酸的表达(例如，使用组织特异性调控元件来表达核酸)。组织特异性调控元件是本领域已知的。合适的组织特异性启动子的非限制性实施例包括白蛋白启动子(肝脏特异性；Pinkert等(1987)Genes Dev.1：268-277)、淋巴特异性启动子(Calame和Eaton(1988)Adv.Immunol.43 235-275)特别是T细胞受体的启动子(Winoto和Baltimore(1989).EMBO J.8：729-733)和免疫球蛋白的启动子(Banerji等(1983)Cell 33：729-740；Queen和Baltimore(1983)Cell33：741-748)、神经元特异性启动子(例如神经丝启动子；Byrne和Ruddle(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：5473-5477)、胰腺特异性启动子(Edlund等(1985)Science 230：912-916)、前列腺特异性启动子和/或增强子(美国专利号
5830,686，和5,871,726，其通过参考被完整地并入本文)、和乳腺特异性启动子(例如乳清启动子，美国专利号4,873,316和欧洲申请公开号264,166)。也包括发育调控启动子，例如鼠hox启动子(Kessel和Gruss(1990)Science 249：374-379)和α-胎蛋白启动子(Campes和Tilghman(1989)Genes Dev.3：537-546)。

[0210] 在某些实施方案中，重组表达载体包含以反义方向克隆到表达载体中的DNA分子。即，DNA分子以一种方式可操作地连接到调控序列上，该方式允许与编码给定多肽的mRNA反义的RNA分子的表达(通过DNA分子的转录)。

[0211] 可操作地连接到以反义方向克隆的核酸上的调控序列可以被选择为引导反义RNA分子在各种细胞类型中连续表达的序列，例如病毒启动子和/或增强子；或者可以选择调控序列，其引导反义RNA的组成性、组织特异性或细胞类型特异性表达。反义表达载体可以是重组质粒、噬菌粒或减毒病毒形式，其中反义核酸在高效率调控区域的控制下生成，高效率调控区域的活性可以由引入载体的细胞类型决定。关于使用反义基因的基因表达的调控的讨论，参见Weintraub等(Reviews-Trends in Genetics，Vol.1(1)1986)。

[0212] 在一个实施方案中，可以通过为DNA模板上的毒素基因提供组织特异性增强子和/或启动子以在癌细胞中集中该基因的表达来治疗癌症。例如，毒素基因包括且不限于白喉毒素基因。已知白喉毒素的细胞内表达能杀死细胞。某些启动子的使用可以是组织特异性的，例如对胰腺癌使用胰腺特异性启动子。因此，向胰腺细胞递送的功能性白喉毒素基因理论上可以根治整个胰腺。这一策略可以用作对胰腺癌的治疗。组织特异性增强子会确保白喉毒素的表达将仅发生在胰腺细胞中。包含受到组织特异性增强子的控制的白喉毒素基因的DNA/脂多胺/微球复合物将被直接引入到供养胰腺的插管动脉中。输注将按一定的给药计划进行，输注持续根治胰腺组织所必需的时间长度。可以使用具有类似效果的除白喉毒素以外的其他致死基因，例如蓖麻毒蛋白或眼镜蛇毒因子或肠毒素的基因。

[0213] 另一具体例子是使用前列腺特异性抗原启动子/增强子以将添加剂例如治疗剂引至需要治疗前列腺癌的患者的前列腺。也可以通过基因转移来治疗特定癌症，例如且不限于p53基因、成视网膜细胞瘤基因(和该基因家族的其他成员)，其抑制某些癌症的癌症性质。

[0214] 在本发明提供的组合物和方法的某些实施方案中涉及胰岛细胞移植；胰岛细胞通过基因治疗修饰。例如，已经描述了通过基因治疗法修饰胰岛细胞的方法以保护细胞免于凋亡(参见例如，Tellez等(2005)Gene Ther.12：120-128；Giannoukakis等(1999)Diabetes 48：1730-1736)、诱导胰岛细胞增殖、或直接增强被移植组织的功能从而用更少的供体细胞来促进疾病治疗(参见例如，Rao等(2004)Expert Opin.Biol.Ther.4：507-5518；Lopez-Talavera等(2004)Endocrinol.145：467-474)。

[0215] 以下进一步描述了多孔微球20的潜在应用的各种非限制性实施例。

[0216] 5.细胞隔离

[0217] 微球20可以与活细胞系一起体内施用，或者，由于血液流经(灌注)微球20的自然过滤，微球20可以作为筛从血流提取细胞以隔离或分化。通过微球20的这种灌注可以减少血液凝块的形成。启动子、化学趋化剂或细胞增强剂的掺杂、包涂或同时施用可以促进细胞迁移和/或分化，这可以在固体器官、骨和软骨、粘膜、内皮、神经、内分泌、或造血组织/细胞系中为局部组织再生建立基础，其目的是为了组织再生、分化，或在特定解剖学或组织学环境内改变细胞成分。

[0218] 6.化学栓塞/放射栓塞

[0219] 化学栓塞是化疗与栓塞或栓塞治疗(如上所述)的组合，通常用来治疗癌症。类似地，放射栓塞是放射治疗和栓塞或栓塞治疗的组合。微球20可以作为独立治疗向靶向区域注射，或者为了散布在末端治疗性栓塞之间以允许栓塞向肿瘤血液供应中的逐渐迁移，同时提供进入靶向肿瘤的连续灌注/血液流动。化疗剂向微球基质的添加可以通过改善对伴有栓塞材料的末端栓塞效应的治疗的暴露时间来增加治疗功效。

[0220] 7.生物生成器培养基

[0221] 生物生成器是用来在体外(活体以外)生长细胞的装置。不受限于任何理论，通过使用可生物相容的(可生物吸收的或永久的)微球20从而能够在生物生成器内提供的增加的空间可以增加搅拌的表面积、作为细胞向内生长的结合位点和隐窝，而且还降低细胞间接触，这些都是生物生成器培养基中希望拥有的条件。

[0222] 8.显像剂/定位剂的递送

[0223] 包含或含有碘浸透的聚合物的微球20，例如在PCT申请PCT/US98/23777中描述的那些，可作为Tc-99MAA的替代物(由于其在肝定向治疗中的乳化性质，其已被证明未达最佳标准)用于测定肿瘤或器官灌注的真实的血管分布率。可以添加到微球20的示踪剂或显像剂的其他非限制性例子包括放射标记的抗体、FDG、碘造影剂、铁磁剂(例如小微粒氧化铁(SPIO))、钆螯合物、镁、钡、或各种诊断性和/或治疗性的放射性核苷酸。

[0224] 9.美容治疗/局部和经皮药物递送

[0225] 在某些实施方案中，多孔微球20可以为多种局部和经皮美容物质的延长和受控递送提供运载体，例如香料、润肤剂、防晒剂、以及抗炎症剂、抗真菌剂、和抗微生物剂，如Smith等在“The characteristics and utility ofsolid phaseporous microspheres：a review”，Journal of Drugs in Dermatology，11-12，2006中所描述的。将这样的添加剂结合进微球20可以减少美容添加剂与周围组织的直接接触，并因此延长了添加剂的代谢半衰期。微球20的局部管腔内(血管和非血管)、间质、真皮下、经皮、或皮下注射和固定可以为粘性材料的施用形成支架，以提高局部生物利用度并延长接触。孔间距离可以影响再吸收和局部炎性反应的程度。与透明质酸酶等同时注射可以降低再吸收率，并因此延长治疗的功效。

[0226] 10.细胞生存力和储存

[0227] 不受限于任何理论，将细胞与惰性可生物相容的多孔微球20混合可以比目前使用的单玻片法为离体细胞系实现更有效率的储存和保持。微球20可以提供合适的支架或基质，被储存的细胞可以被有效率且安全地包装在其中。

[0228] 11.组织收获/组织扩张/器官和组织工程

[0229] 在某些实施方案中，除了启动子以外，微球20和干细胞或未分化的器官细胞系的混合物可以被塑造或形成可以作为器官和组织工程的基础功能单元的形状。

[0230] 虽然已在上面讨论了许多示范性方面和实施方案，本领域技术人员将认识到它们的某些改变、置换、添加和亚组合。作为非限制性实施例，微球20的实施方案也可以应用于：

[0231] ·改善骨的干细胞摄取进入心脏组织；

[0232] ·基于介导的持续激素反应，制备控制生育的药丸；

[0233] ·通过经皮注射，治疗甲状腺功能减退或其症状；

[0234] ·在功能受损的患者中再生肺脏组织(包括形成新的有功能的肺组织、血管，或改善氧气交换的手段)；

[0235] ·为神经学疾病或创伤(例如老年痴呆症、帕金森症、脑损伤、脊髓损伤)再生神经组织和脑组织；

[0236] ·激活局部血管生成以加速伤口愈合(即在损伤区域中生长血管)；

[0237] ·制备将在创伤情况中使用的粉末以提供持续的抗生素和紧急血栓形成(即形成血凝块来防止过度出血)。

[0238] E.试剂金

[0239] 本发明还提供了药物包装和试剂盒，其包含一个或多个填充了一种或多种前述微球的成分和本发明提供的组合物的容器。试剂盒可以包含一种或多种微球、造影剂、和含一种或多种药物的溶液，其中一种、两种、三种或多种成分可以置于一个、两个、三个或多个小瓶中。这些容器可以带有使用说明书和/或声明，其形式应按照管理药物或生物制品的制造、使用或销售的政府机构的规定，表明被该机构批准制造、使用或销售该产品以供患者(例如人或其他哺乳动物)施用。本文描述的任何测试或方法的试剂也可作为试剂盒的组分被包含。

[0240] 在一种试剂盒形式中，本发明提供的微球存在于一个小瓶中的液态生理学可相容的溶液中。在另一试剂盒形式中，本发明提供的微球可以在一个小瓶中以干燥形式提供，而药物溶液和造影剂可以在第二个和/或任选地第三个小瓶中提供。在某些实施方案中，包含造影剂的微球存在于一个小瓶中，而药物存在于另一个小瓶中的溶液中。在这种形式中，两个小瓶的内容物可以在施用前或在施用时混合在一起。在其它实施方案中，包含造影剂的微球和药物在一个小瓶中以干燥形式提供。然后可在施用前将粉末悬浮在合适的液体中，或者提供第二个小瓶，其包含可注射的溶液，且将两个小瓶的内容物在施用前或在施用时组合。

[0241] 最后，在另一种试剂盒形式中，本发明提供的微球存在于一个小瓶中，而第二个小瓶包含含有造影剂的药学上可接受的溶液。第一个小瓶中的微球可以预装载了药物，或者药物溶液可以任选地存在于第三个小瓶中。随后可以将微球与药物溶液和/或造影剂混合在一起，例如，在施用前或在施用时。

[0242] 提供以下实施例作为示例而非作为限制。实施例

[0243] 除非另外指明，本发明的操作使用了分子生物学、微生物学、遗传分析、重组DNA、有机化学、生物化学、PCR、寡核苷酸合成和修饰、核酸杂交、和本领域技术的相关领域中的常规技术。这些技术在本文引用的参考文献中描述且在文献中充分解释。参见例如Maniatis 等 (1982)Molecular Cloning：ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press；Sambrook等(1989)，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor LaboratoryPress；Sambrook等(2001)Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY；Ausubel等，Current Protocolsin Molecular Biology，John Wiley & Sons(1987以及每年的更新)；CurrentProtocols in Immunology，John Wiley & Sons(1987以及每年的更新)；Gait(编辑)(1984)Oligonucleotide Synthesis：A Practical Approach，IRL Press；Eckstein( 编辑 )(1991)Oligonucleotides and Analogues：A Practical Approach，IRL Press；Birren等(编辑)(1999)Genome Analysis：A Laboratory Manual，Cold SpringHarbor Laboratory Press。

[0244] 实施例1：双孔微球的制备

[0245] 使用双孔微球制造装置通过以下方法制备微球。简单地说，将0.2g聚(DTE碳酸酯)在3mL 1，4-二噁烷和0.3mL水的混合物中搅拌并溶解以在储存容器中形成均质溶液。随后将溶液倒入注射器的筒腔中。通过与注射器连接的导管，向溶液中添加7克氯化钠。然后对注射器筒腔施加压力从而让溶液液滴注射进淬冷塔中。液滴一进入塔就被快速冷冻和固化，形成双孔结构。接着，从微球中洗去残留的盐和溶剂。重复洗涤过程数次，直到硝酸银测试显示没有额外的氯离子释放到水中。从水中移出得到的微球，并干燥至恒重。

[0246] 实施例2：通过SEM扫描电子显微术评价微球形态学

[0247] 进行SEM扫描电子显微术来评价微球的形态学。简要地，通过微球在液氮中的低温破裂制备样本。对微球进行一系列的增压-减压，以确保孔中装满水。接着，样本在真空中干燥，使用粘着标签安装到金属底座上。使用溅射涂布机将它们包涂上银。使用Hitachi S450SEM在15kV检验。

[0248] 用NIH Image 1.6 软件分析由SEM获得的数字图像的孔尺寸。评估的图像参数包括孔面积、周长、椭圆的长轴和短轴。在评价孔之前对数字图像作调整。将编号的孔与实际的数字图像比较以确认孔的位置。不能恰当表示的某些孔数目在统计学数据分析中被排除。对每个微球，至少分析在2个不同的放大倍数(低放大倍数(比例尺200μm)和高放大倍数(比例尺10μm))下的3个不同的数字图像。

[0249] 实施例3：孔体积和尺寸分布的评价

[0250] 当大孔间隔子材料仍然存在于聚合物基质内时分析微球。通过用水银孔隙度仪记录不同压力下水银进入微球的体积，测定孔体积和孔尺寸分布。填充压力被记录到高达3,000psia。这一压力对应于水银进入0.06μm或更大的孔所需要的能量。孔直径和孔隙度值指直径小于310μm的等同圆柱形孔。

[0251] 这些值由Washburn方程确定：

[0252] D＝-(1/P)4γcos f

[0253] 其中D是孔直径，单位是微米；P是施加的压力(psia)；γ是水银和支架表面之间的表面张力(dynes/cm)；而且Φ是接触角。

[0254] 表面张力和接触角的推荐值是：

[0255] g＝485dynes/cm

[0256] Φ＝130°

[0257] 实施例4：双孔三丙烯醛基微球的示范制备

[0258] 在包含100ml去除了矿物质的水的烧杯中，溶解58g氯化钠和27g乙酸钠。加入400ml甘油，然后调节pH值到5.9和6.1之间。然后加入90g N-三-羟基-甲基甲基丙烯酰胺、35mg二乙基氨基乙基丙烯酰胺、10g N，N-亚甲基双丙烯酰胺、以及1-50g不溶的颗粒(或其它合适的大孔间隔子材料)，该颗粒具有的直径在20到500μm之间且分子量为
50-70g/mol。在60-70℃加热并加入100mo热的300mg/ml明胶溶液。通过加入热水，将混合物的总体积调节到980ml，然后加入20ml的70mg/ml过硫酸铵溶液和4ml N，N，N’，N’-四甲基乙二胺。

[0259] 将该溶液在50-70℃倒入石蜡油中。搅拌。数分钟后，通过温度的提高，证明丙烯酸单体的聚合反应。然后使用本发明提供的方法洗涤掉或从微球中除去大孔间隔子材料。然后通过倾析回收微球，仔细洗涤，筛选，并在高压灭菌器中在缓冲基质中灭菌。

[0260] 在筛选校准后，这些微球具有对栓塞有用的特征，其包括被标记的阳离子电荷和有效的粘附剂(明胶或变性的胶原)。

[0261] 实施例5：包含5-20％聚乙烯醇的双孔微球的示范性制备

[0262] 将5到20克聚乙烯醇在搅拌下在75ml的0.5M H2SO4-0.1M NaCl溶液中溶解。搅拌悬浮液直到形成澄清溶液，然后向溶液中加入1-50g不溶的微粒和25ml甲醛，该微粒的直径在20到500μm之间且分子量为50-70g/mol(或其它合适的大孔间隔子材料)。将得到的混合物快速倒入500ml搅拌中的包含2％去水山梨糖醇倍半油酸酯的石蜡油中。在这些条件下，聚乙烯醇液滴在悬浮油中形成乳液。乳液在约80℃加热至少6小时以实现甲醛在聚乙烯醇链上的缩合，并因此形成交联的聚乙烯醇的球形颗粒。

[0263] 通过乳液的搅拌速度来控制颗粒的尺寸。例如，为了获得直径300μm左右(平均尺寸)的微球，搅拌速度保持在约250rpm。

[0264] 然后通过过滤收集聚乙烯醇的水凝胶微球。或者，可以通过离心或简单倾析收集聚乙烯醇的水凝胶微球。然后使用本发明提供的方法洗涤掉或从微球中除去大孔间隔子材料。通过非极性溶剂或氯化溶剂例如二氯甲烷萃取残留的油。然后在室温下用0.5M Tris-HCl缓冲液(pH 9)过夜处理所得到的不含油的微球以中和过量的醛。

[0265] 最后，用生理水性缓冲液洗涤聚乙烯醇微球，筛分至希望的直径，灭菌，并作为液体悬浮液储存。该材料可用于栓塞步骤。

[0266] 实施例6：包含丙烯酸钠和乙烯醇共聚物的双孔微球的示范性制备

[0267] 向60g醋酸乙烯酯和40g丙烯酸甲酯中添加0.5g作为聚合引发剂的过氧化苯甲酰和1-50g NaCl(或1-50g不溶的微粒，其直径在20到500μm之间且分子量为50-70g/mol；或其他合适的大孔间隔材料)。其分散在包含3g作为分散稳定剂的部分皂化的聚乙烯醇和10g NaCl的300ml水中。悬浮聚合在65℃进行6小时。在除去溶剂后，聚合物在冷冻干燥器中干燥24小时。20克干燥粉末在包含200g甲醇和10g水的皂化液中悬浮。然后将反应维持在10℃，滴加40ml 10N NaOH溶液，然后反应在30℃进行24小时。在完成皂化反应后，用甲醇洗涤反应产物，此后，在干燥后获得15.8g球形的干燥皂化产物，颗粒直径为约50μm到约240μm。大孔间隔子材料也被洗涤掉或从微球中除去。然后将产物筛分并校准成例如约50μm增量，以得到数个尺寸范围，例如，约50μm-100μm、约100μm-150μm、约150μm-210μm。随后可以冻干筛分的产物。

[0268] 实施例7：为人类个体中的胰岛细胞移植施用双孔微球

[0269] 胰岛细胞移植过程描述如下。基于其较差的血糖控制，患有C-肽-阴性1型糖尿病超过5年的患者被包括在本研究中，尽管依从最佳的医学治疗，血糖控制由于反复的低血糖或代谢不稳定性而变得复杂。患者接受不含类固醇的免疫抑制治疗，其在胰岛细胞移植前即刻开始，在每次移植后经过8星期静脉施用5次剂量的达利珠单抗，剂量为mg/kg。移植后的三个月中，每日施用一次西罗莫司以达到12到15ng/ml的目标治疗范围，之后目标谷范围降低到7至12ng/ml。每日两次施用他克莫司，并调节达到3到6ng/ml的目标谷水平。另外，在过程开始前，给予患者标准的预防性抗生素。

[0270] 所有患者通过静脉内施用咪达唑仑和芬太尼被镇静。通过鼻套管以6L/min施用氧气。使用右侧经皮途径，患者仰卧。使用透视、超声波或二者的组合确定肝穿刺位点(腋前线或腋中线)。为每个过程记录总透视时间。用局部麻醉渗透皮下组织和肝囊。22号Chiba针头在透视或US引导下进入右门静脉的分支。在绝大多数情况下，选择二级或三级分支。18号导丝随后进入门静脉主干。

[0271] 胰岛细胞基本如Owen等(2003)Radiol.229：165-170中描述般制备。简要地，在从亲属处收到知情同意后，从脑死亡供体获得胰腺器官。使用酶溶解结合机械溶解，分离胰岛细胞，并在不含xenoprotein的培养基中制备。如果超过约4000个纯化的胰岛细胞等价物以低于10ml的细胞体积制备和包装，如果ABO血型兼容匹配，而且如果葛兰氏染色是阴性而且内毒素含量低于5个内毒素单位/kg，那么进行胰岛细胞移植。用胰岛细胞等价物表示的胰岛细胞的量考虑胰岛细胞体积的变化，标准的胰岛细胞测量为150μm。

[0272] 按照以下治疗方案之一对患者施用胰岛细胞：

[0273] 组I-胰岛细胞和双孔微球

[0274] 组II-仅胰岛细胞

[0275] 组III-仅微球

[0276] 将胰岛细胞制剂悬浮在包含肝素、20％人白蛋白和微球(组I中)的120mL补充培养基(M199；Mediatech，Herndon，Va)中。当包装的胰岛细胞体积低于5mL时，加入肝素(35U/kg)，且如果包装的细胞体积超过5mL，肝素的量增加到70U/kg。胰岛细胞通过这一鞘或通过放置在门静脉中的5-F Kumpe导管施用。或者，可以使用特别设计的加强的显微穿刺装置，其带有设计为接受0.038英寸导丝的4-F鞘。通道用明胶海绵颗粒栓塞。一旦可以得到加强的显微穿刺试剂盒，不再常规进行通道栓塞。

[0277] 首先使用60mL注射器经历大约10分钟施用带有微球的胰岛细胞(组I)或不带有微球的胰岛细胞(组II)、或仅施用微球(组III)。在第一个50mL等分试样后和在随后的50mL等分试样后，纪录门静脉压。或者，可以使用基于重力的封闭的输注袋系统来最小化对胰岛细胞的剪切力，以提供连续门静脉压监测的替代的间接方法，并减少在胰岛细胞递送期间制剂污染的风险。如果开始时门静脉压高于20mm Hg，或如果在过程期间其增加到基线值的两倍或高于22mm Hg，则终止该过程。取决于各个个体的需求，患者可以经历数次输注。

[0278] 输注过程后，任选地，去除导管，并使用明胶海绵纱布栓塞通道。由在过程时、在临床跟踪、和在放射学图和影像的确认审阅时记录的数据，记录并发症。将评估个体对胰岛素需求的下降、空腹葡萄糖和糖化的血红蛋白水平、基底C-肽分泌、和血糖漂移随时间的平均振幅。

[0279] 实施例8：双孔微球在心脏损伤的大鼠模型中的施用

[0280] BMC的制备：通过肌内施用盐酸氯胺酮(22mg/kg)，接着腹腔内注射戊巴比妥钠(30mg/kg)，麻醉成体Sprague-Dawley大鼠。在全身麻醉下，用包含1ml肝素的带18G针头的注射器从胫骨吸出骨髓。将骨髓细胞转移到无菌管中，与10ml培养基(含10％FBS、100U/ml penG的IMDM)和100μg/ml 链霉素混合。管在2000rpm离心5min，用5ml培养基重悬细胞团。为了分离骨髓细胞(BMC)和血红细胞(RBC)，使用Yablonka-Reuveni和Nameroff描述的梯度离心方法((1987)Histochem.87：27-38)。将细胞悬浮液装载到20％至60％的Percoll梯度中，细胞在14,000rpm离心10min。将总体积的上部三分之二(包含绝大部分BMC)转移到管中。细胞在2,000rpm离心10min。然后用PBS洗涤以除去Percoll。
重复这一过程，在培养基中重悬细胞团，供体内研究使用。

[0281] 心肌疤痕生成：在全身麻醉下，大鼠被插管，使用呼吸机，用补充了氧气(2L/min)的室内空气，保持正压通气(180mL/min)。通过2cm的左侧胸廓切开，暴露大鼠心脏。用金属探针(直径8x10mm)，通过浸入液氮中冷却到-190℃并应用于左心室游离壁15秒，制造低温损伤。这一过程重复5次，然后应用总共10次，每次持续1min。用丝线缝合肌肉层和皮肤切口。术后监控大鼠4小时，并通过肌内施用给予青霉素。

[0282] 移植：心肌损伤后三星期，将大鼠随机分成三组：

[0283] 组I-BMC+双孔微球

[0284] 组II-仅BMC

[0285] 组III-仅微球

[0286] 在全身麻醉下，通过正中切开胸骨，暴露大鼠心脏。使用结核菌素注射器或其他合6 6
适的导管将包含不同浓度的BMC(例如10)细胞的微球(组I)、50微升包含10 个细胞的BMC悬浮液(组II)或单独的微球(组III)注射进各个移植组中每只动物左心室游离壁疤痕组织的中心。用丝线缝合胸腔，并给予抗生素和镇痛剂。

[0287] 心脏功能测量：移植后五星期，用氯胺酮和戊巴比妥麻醉大鼠。执行胸骨的正中切开，去除心脏，动物通过放血安乐死。使用Langendorff装置和过滤的Krebs-Henseleit缓冲液(单位mmol/L：NaCl，118；KCl，4.7；KH2PO4，1.2；CaCl2，2.5；MgSO41.2；NaHCO3，25；和葡萄糖，11；pH 7.4)在压力100mm Hg用5％CO2和95％O2平衡，测量这三组的心脏功能。乳胶球囊通过二尖瓣传递到左心室中，并连接到压力传感器、传感放大器和微分放大器上。稳定10min后，在无起搏的空搏状态下通过定时采集，测量心脏的冠状动脉流量，重复三次。通过从40μl开始以20μl增量加入水来增加球囊大小，直到左心室舒张末压达到30mm Hg。在每个球囊体积记录收缩和舒张压，并计算充盈压。心脏称重，并通过水置换来测量其大小。

[0288] 测面积法：通过Pfeffer等(1991)Am.J.Physiol.260：H1406-H1414以及Jugdutt和Khan.(1994)Circulation 89：2297-2307的技术来测量左心室游离壁的疤痕尺寸。简要地，心脏在舒张(30mm Hg)时用10％中和的福尔马林固定，然后切成3mm厚的切片。对每片切片，透明追踪左心室的外部和内部线路，并使用计算测面积法(Jandal Scientific Sigma-Scan)量化。

[0289] 组织学研究：移植后5星期，在移植位点收集组织样本(0.5cm3)，并在中和的10％甲醛中固定，供组织学研究。包埋样本并切成10μm厚的切片，如生产商说明书(Sigma Chemical Co)中所述，用苏木紫和曙红对切片染色。

[0290] 识别疤痕中的移植BMC：在全身麻醉下，给4只大鼠留下疤痕，2星期后吸出骨髓。培养BMC并如上所述用5-aza诱导。为了识别疤痕组织中的移植细胞，细胞用溴脱氧尿苷(BrdU，Sigma)标记。简要地，在培养第六天向每个培养皿中加入10μL BrdU溶液(BrdU，
50mg；二甲基亚砜，0.8mL；水，1.2mL)，与细胞一起培养24小时。已标记的细胞+/-微球在心肌损伤后3星期移植到疤痕中，在移植后5星期如前所述收集样本。使用抗BrdU单克隆抗体来定位移植的骨髓细胞。简要地，在用甲苯脱蜡后，用100％、95％和70％乙醇梯度再水合样本。使用3％过氧化氢在室温下封闭样本中的内源性过氧化物酶10分钟。样本在42℃用胃蛋白酶处理5分钟，并在室温用2N HCl处理30分钟。在用PBS冲洗3次后，样本在室温在潮湿的箱室中与抗BrdU抗体一起培养16小时。阴性对照样本在相同条件下在PBS(不含第一抗体)中培养。测试和对照样本用PBS冲洗3次(每次15分钟)，然后在
37℃用与过氧化物酶共轭的山羊抗兔免疫球蛋白G孵育45分钟。样本用PBS洗涤3次(每次15分钟)，然后浸入二氨基联苯胺H202(含2mg/mL二氨基联苯胺、0.03％H2O2的0.02mL/L磷酸盐缓冲液)溶液中15分钟。用PBS洗涤后，样本盖上盖玻片并拍照。

[0291] 测量疤痕中的毛细血管密度：使用光学显微镜在x400放大倍数下对所有组的疤痕组织中的毛细血管计数。在每个疤痕中随机选择五个高倍区域，对每个区的毛细血管数2
目取平均值，表示为毛细血管数目/高倍区(0.2mm)。

[0292] 实施例9：在兔肝硬化模型中在肝移植期间双孔微球的施用

[0293] 雄性新西兰白兔被随机分成以下组。

[0294] 组I(对照)：每星期两次皮下注射橄榄油，前2星期剂量为0.3ml/kg体重，之后为0.2ml/kg直到12星期结束。从第13星期起每星期两次用生理盐水灌注门静脉，再持续12星期。

[0295] 组II：每星期两次皮下注射橄榄油，前2星期剂量为0.3ml/kg体重，之后为0.2ml/kg直到12星期结束。从第13星期起每星期两次仅用骨髓细胞灌注门静脉，再持续
12星期。

[0296] 组III：每星期两次皮下注射橄榄油，前2星期剂量为0.3ml/kg体重，之后为0.2ml/kg直到12星期结束。从第13星期起每星期两次用骨髓细胞+双孔微球灌注门静脉，再持续12星期。

[0297] 组IV：每星期两次皮下注射含50％CCl4的橄榄油，前2星期剂量为0.3ml/kg体重，另外12星期为0.2ml/kg体重。从第13星期起每星期两次用生理盐水灌注门静脉，再持续12星期。

[0298] 组V：和组IV一样施用50％CCl4。从第13星期起每星期两次仅用骨髓细胞灌注门静脉，再持续12星期。

[0299] 组VI：和组IV一样施用50％CCl4。从第13星期起每星期两次用骨髓细胞+双孔微球灌注门静脉，再持续12星期。

[0300] 门静脉灌注前2-9天，对所有兔子进行永久门静脉插管手术。在麻醉下，用剃刀刮去兔子毛层并消毒。手术通过5cm长的上腹部正中切口进行。取肝样本作病理学检查和羟脯氨酸测试。随后，将空肠肠系膜静脉去覆盖，并在分离静脉的终末支后作切口。结扎静脉远端，用包含肝素的生理盐水填充具有密封尖端和三个远侧孔的一次性无菌硬膜外麻醉导管。导管通过血管切口穿入朝向肝的近侧静脉，且当足够长的导管进入静脉时，通过结扎将其固定于血管。取下注射器，在确保导管处在正确位置后将导管切成合适的长度。在切断后立即将导管的开口端附到带注射盖的连接器上。用缝线缝合腹腔，而且皮下嵌入装满了肝素盐水的带注射盖的导管开口端。

[0301] 通过穿破注射盖，大约1-5x107个细胞的供体小鼠骨髓细胞(具有或不具有微球)或盐水通过门静脉灌注施用至兔子。灌注速度被设置为约2-5ml/min。在细胞施用24h后杀死兔子。在灌注前和灌注后从耳缘静脉取血样，供血常规、肝功能和肾功能测试。杀死后对肝、心肌、肾、肺和脑取样，并用甲醛固定供组织学检查。

[0302] 上述本发明的实施方案仅是示范性的，且本领域技术人员使用不超出常规的实验，将认识到或能够确定本文描述的具体过程的许多等同物。所有这些等同物被认为在本发明的范围内并被所附的权利要求覆盖。此外，除非该内容被另外明确说明，在本说明书和权利要求中使用的单数形式“一个”和“该”包括复数形式。因此，例如，提到“一种添加剂”时包括两种或多种此类添加剂的混合物。另外，普通技术人员将认识到，为了解释和主张权利的目的，操作顺序必须以一些特定的顺序陈述，但本发明预期在这些特定顺序基础上的各种改变。

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