一种心血管疾病个体化用药基因检测体系试剂盒及其应用
阅读：1031发布：2020-08-08
专利汇可以提供一种心血管疾病个体化用药基因检测体系试剂盒及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种心 血管 疾病 个体化用药基因检测体系 试剂 盒 及其应用，包括PCR反应体系、LDR的反应体系。本发明所述试剂盒采用多重PCR技术和多重LDR技术，两种技术相结合，基于杂交反应和连接反应，双重保证，检测过程中无需DNA纯化，减少了污染的可能性，结果更加准确。PCR-LDR检测的准确度可以与Sanger测序相媲美，但是前者多样性更高、成本更低。，下面是一种心血管疾病个体化用药基因检测体系试剂盒及其应用专利的具体信息内容。
1.一种心血管疾病个体化用药基因检测试剂盒，包括PCR反应体系和LDR的反应体系，其特征在于：针对心血管疾病药物代谢关联的16个基因的19个关联的SNP位点，所述PCR反应体系中包括19对引物；LDR的反应体系中包括19组探针，其中每组探针含3条LDR探针，其中一条是修饰探针，另外两条探针为SNP位点两等位基因特异性探针。
2.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于，所述修饰探针包括3部分：目标区域互补序列、长度差异的随机序列和连接了FAM荧光标记的通用序列。
3.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在在于，所述心血管疾病药物代谢关联的16个基因的19个关联的SNP位点具体为rs4149056，rs12248560，rs4986893，rs10306114，rs4343，rs5186，rs4244285，rs1057910，rs776746，rs2108622，rs429358，rs671，rs5918，rs7412，rs9923231，rs5065，rs1801253，rs1065852，和rs12041331。
4.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于，所述PCR反应体系中的引物序列如SEQ ID NO.1-38所示。
5.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于，所述LDR的反应体系中的特异性探针序列如SEQ ID NO.58-95所示。
6.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于，所述修饰探针序列如SEQ ID NO.39-57所示。
7.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于，所述PCR反应体系中还包括MgCl2,dNTP,引物mix和Taq酶；LDR的反应体系还包括：pH 8.5的Tris–HCl，MgCl2,KCl,DTT,NAD+,Taq DNA连接酶。
8.一种心血管疾病个体化用药基因检测试剂盒操作说明书，包括：
(1)待测样本中提取基因组DNA，作为模板加入PCR体系，进行多重PCR反应；
(2)将上述多重PCR反应的产物作为模板，加入LDR反应，进行多重LDR反应；
(3)从上述LDR反应产物进行毛细管电泳，根据电泳峰图展示的LDR产物片段大小，判断每个SNP位点等位基因类型；具体信息见下表：
一种心血管疾病个体化用药基因检测体系试剂盒及其应用
技术领域
背景技术
[0002] 心血管疾病严重危害全人类的健康，在众多致死因素中高居榜首。据调查，2016年，中国大约都有2.7亿人正遭受心血管疾病的病痛折磨，农村居民中心血管疾病致死率为309.33/10万人，在城市居民中致死率为265.11/10万人，总体平均致死率为43％以上。心血管疾病临床常用药物包括阿司匹林、氯吡格雷、华法林、硝酸甘油和他汀类。然而，同样的药物对不同的人具有非常明显的药效差异，这主要是由于遗传背景不同。COX-1、GPⅡb/Ⅲa、CYP2C19、CYP2C9、VKORC1、ALDH2等6个基因在药物新手、转运、代谢和无效成分排出等过程中起到重要的作用，而且在关键位置的单核苷酸多态性会导致这些基因丧失功能。
[0003] 华法林是临床应用最为广泛的抗血栓类药物，但它在某些人中会增加出血和血栓风险。VKORCl和CYP2C9是影响个体间华法林用药剂量差异的主要遗传因子。CYP2C9具有非常高的多态性，两个主要的变异为CYP2C9*2 and CYP2C9*3，这两种变异编码蛋白的酶活性分别比野生型CYP2C9*1低30％和80％。VKORC1也发现了多个SNP与个体间用药剂量差异有关，2个common位点为1173C>T and 3730G>A。1173CC类型的起效剂量(6.2mg/d)要远高于1173TT类型的起效剂量(4.8mg/d)。
[0004] 氯吡格雷是一种抗血小板药物，用于急性冠脉综合征(ACS)和经皮冠状动脉支架植入术(IF)可降低这些患者心肌梗死(MI)和中风的风险。临床研究表明，有些病人是氯吡格雷弱代谢型，他们的CYP2C19途径没有酶活性去活化氯吡格雷，因此服用药物也没有效果。大约14％的中国人属于CYP2C19弱代谢型。CYP2C19*2、*3、*4、*5、*7、*8等6种变异类型均具有比野生型更低的酶活性。CYP2C19*17是唯一一种酶活性比野生型升高的变异类型。
[0005] 阿司匹林抵抗在心血管疾病患者中也是非常普遍，这种症状会提高ACS和血管缺血的风险。GPⅢa PLA2、PEAR1和PTGS1等3个及原因的变异与阿司匹林抵抗有关。硝酸甘油的代谢依赖于ALDH2(Aldehyde dehydrogenase II)，ALDH2基因编码蛋白将硝酸甘油代谢为NO。该基因编码区一个SNP(G1510A)显著降低酶活性，并且该等位基因的携带者主要分布于包括中国在内的东亚人群。这些携带者都不适合服用硝酸甘油治疗心绞痛。SLCO1B1基因的SNP位点rs4149056和APOE基因的2个SNP位点rs429358和rs7412影响他汀类药物代谢。
[0006] 随着临床用药越来越关注与个体间遗传差异，多样化的SNP检测技术应用于临床基因检测。DNA测序、TaqMan探针法和限制性酶切长度多态性(RFLP)是传统SNP分型的金标准。等位基因特异性PCR、分子信标和质谱法使得SNP分型接受度更高，更加流行。然而，这些方法灵敏度、特异性和多样性都存在差别，同时也有着各自方法的成本。TaqMan探针法和分子信标具有足够的特异性，但多样性不足。RFLP工艺复杂，成本低廉，可在常规实验室操作，但步骤繁琐，耗时。有些分型方法依赖于特殊的设备，比如质谱法依赖于引物颜色和质谱仪。质谱法具有足够的准确性和多样性，但是该方法依赖于额外的设备，并且成本比较高。
[0007] PCR-LDR(连接酶检测反应)是一种理想的SNP分型方法。基于连接酶的技术依赖于DNA连接酶对单核苷酸差异的区分能力。当DNA探针与PCR产物中的SNP位点互补时，探针可以特异性的结合。LDR反应可以基于探针的长度不同而达到多样性识别不同SNP位点的目的。荧光标记的产物可以非常方便的在DNA测序仪上分离和鉴别。PCR-LDR法特别适合于单管中检测十几个SNP位点的分型，可大幅度降低检测成本，因此该方法成为一种非常合适的心血管疾病临床基因检测的可选手段。
[0008] CN 104313159 A公开了一种高特异性14个位点多个耳聋易感基因的多重PCR-LDR检测试剂盒PCR扩增反应结束时没有消除Taq酶活性，体系中存在过量的Taq酶会对下游LDR反应产生干扰，影响LDR结果的稳定性和准确性。本专利申请公开的检测体系和试剂盒在多重PCR阶段，PCR程序中设置了Taq酶失活的反应程序，灭活的Taq酶不会干扰LDR反应的效率，从而提高了分型结果的可靠性。
发明内容
[0009] 本发明所要解决的技术问题是提供一种心血管疾病个体化用药基因检测体系试剂盒及其应用，克服现有心血管疾病基因检测试剂盒仅检测单个应用方向的缺陷，检测结果给医生和病人提供更加综合的可靠信息，从而更加合理制定用药方案，保障用药安全。本发明提供一种基于多重PCR和多重LDR技术的心血管疾病个体化用药基因检测试剂盒，可应用于临床检测心血管疾病患者常用药物代谢基因的关联SNP，为合理用药提供参考。
[0010] 本发明的一种心血管疾病个体化用药基因检测试剂盒，包括PCR反应体系、LDR的反应体系；
[0011] 针对心血管疾病药物代谢关联的16个基因的19个关联的SNP位点，所述PCR反应体系中包括19对引物；LDR的反应体系中包括19组探针，其中每组探针含3条LDR探针，一条是modify探针(也即修饰探针)，另外两条探针为SNP位点两等位基因特异性探针。
[0012] 所述PCR反应体系中的19对引物为特异性扩增目标位点侧翼序列的PCR寡基核苷酸引物；LDR的反应体系中的19组探针为：与等位基因特异性结合的LDR寡基核苷酸探针及带荧光的Modify探针。
[0013] 所述modify探针包括3部分：目标区域互补序列、长度差异的随机序列和连接了FAM荧光标记的通用序列。
[0014] 所述心血管疾病药物代谢关联的16个基因的19个关联的SNP位点具体为：rs4149056，rs12248560，rs4986893，rs10306114，rs4343，rs5186，rs4244285，rs1057910，rs776746，rs2108622，rs429358，rs671，rs5918，rs7412，rs9923231，rs5065，rs1801253，rs1065852，rs12041331。所述PCR反应体系中的引物序列如SEQ ID NO.1-38所示；
[0015] 所述LDR的反应体系中的特异性探针序列如SEQ ID NO.58-95所示。
[0016] 所述修饰探针序列如SEQ ID NO.39-57所示。
[0017] 所述PCR反应体系中还包括Taq酶，UNG酶和dNTP，PCR缓冲液，引物；LDR的反应体系还包括：连接酶，UNG酶，dNTP，探针和缓冲溶液。
[0019] (1)待测样本中提取基因组DNA，作为模板加入PCR体系，进行多重PCR反应；其中所述PCR反应体系包括Taq酶，UNG酶和dNTP，PCR缓冲液，引物；
[0020] (2)将上述多重PCR反应的产物作为模板，加入LDR反应，进行多重LDR反应；其中所述LDR反应体系包括连接酶，UNG酶，dNTP，探针和缓冲溶液；
[0022]
[0023]
[0024] 本发明提供的心血管疾病个体化用药基因检测试剂盒，检测心血管疾病5类用途11种常用药物代谢相关16个基因的19个关联的SNP位点。
[0025] 本发明涉及的常用药物、药物代谢基因及SNP位点分别为：
[0026]
[0027]
[0028] 本发明提供的心血管疾病个体化用药基因检测试剂盒，16个基因的19个SNP位点，其对应的多重PCR引物序列SEQ ID NO.1-38如下：
[0029]
[0030]
[0031] 本发明提供的心血管疾病个体化用药基因检测试剂盒，16个基因19个SNP位点的LDR鉴别探针序列和通用探针序列(SEQ ID NO.39-95)，长度及产物长度如下：
[0032]
[0033]
[0034]
[0035] 所述PCR反应所需试剂MgCl2,dNTP,引物mix和Taq酶。
[0036] 所述LDR反应所需试剂，包括Tris–HCl(pH 8.5),MgCl2,KCl,DTT,NAD+,Taq DNA连接酶。
[0038] 根据本发明提供的实施方案，试剂盒用于判断基因检测结果的标准是以电泳结果的峰图为依据，判断样本的基因型，根据基因型类型，参照国家卫计委推出的《药物代谢酶和药物作用靶点基因检测技术指南(试行)》判断样本来源的患者所属对应药物的代谢型，医生根据《指南》对代谢型特征的描述和计算公式，判断用药的种类和剂量是否适合对应的患者，从而指导医生和病人选择更加合理的用药方案。
[0039] 有益效果
[0040] 本发明所述心血管疾病个体化用药基因检测试剂盒，目前针对临床心血管疾病个体化用药的方案主要是单类药物检测居多，而本发明涉及5类用途11种常见药物，覆盖范围更全面，同时心血管疾病患者往往是多种病症并发，所以采用本发明提供的试剂盒进行基因检测，可以更全面的指导个体化用药，提前规避可能存在的风险。
[0041] 本发明设计不同长度的探针区分同个SNP位点的不同等位基因以及不同的SNP位点。modify探针和鉴别探针中都包含了一段随机序列，这拓宽了探针检测的变化范围。仅1个探针连接了荧光标记，该探针可以整合所有的LDR产物，并且对每个SNP位点的鉴别探针进行标记。
[0042] 本发明所述试剂盒采用多重PCR技术和多重LDR技术，两种技术相结合，基于杂交反应和连接反应，双重保证，检测过程中无需DNA纯化，减少了污染的可能性，结果更加准确。PCR-LDR检测的准确度可以与Sanger测序相媲美，但是前者多样性更高、成本更低。
[0043] 因此，本发明提供的一种心血管疾病个体化用药基因检测试剂盒是一种高效的临床基因检测试剂盒，在选择药物进行治疗之前使用本发明进行基因检测，帮助医生和病人选择正确的药物进行治疗，避免错误用药，降低不良反应。附图说明
[0044] 图1为LDR产物ABI3730电泳效果图；
[0045] 图2为rs1057910,rs776746and rs4244285 8个样本Sanger法验证分型结果；
[0046] 图3为19个SNP237例样本中19个SNP等位基因分布。
具体实施方式
[0047] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
[0048] 实施例1
[0049] 样本采集与DNA抽提
[0050] 采集200μl心血管疾病患者血液，使用Axygen DNA抽提试剂盒进行基因组DNA提取，具体方法参照试剂盒说明书。DNA使用0.8％的琼脂糖凝胶电泳和OD260/280的值进行质控。
[0051] 多重PCR
[0052] 心血管疾病治疗药物代谢通路相关的19个SNP位点多重PCR引物序列使用本发明公布的引物序列。19对引物划分为2个组分别进行多重PCR扩增。组1包括10个SNP位点：rs4149056，rs12248560，rs4986893，rs10306114，rs4343，rs5186，rs4244285，rs1057910，rs776746，rs2108622；组2包括9个SNP位点：rs429358，rs671，rs5918，rs7412，rs9923231，rs5065，rs1801253，rs1065852，rs12041331。PCR体系使用15μl体系：1.5mM MgCl2,0.2mM dNTP,2μl引物mix,2μl DNA模板,1U Takara热启动Taq酶(Takara Co.LTD)。PCR反应条件设置为：95℃预变性10分钟；95℃变性30秒、56℃退火90秒、74℃延伸1分钟，重复40个循环；72℃延伸10分钟；98℃10分钟使Taq酶变性。
[0053] 多重LDR
[0054] LDR探针序列信息请见对应发明内容(具体见SEQ ID NO.39-95)。
[0055] 本发明设计了3条LDR探针，一条是modify探针(修饰探针)，另外两条探针为SNP位点两等位基因特异性探针。通用探针包括3部分：目标区域互补序列、长度差异的随机序列和连接了FAM荧光标记的通用序列。等位基因特异性探针具有不同的长度，且最后一个碱基分别与SNP两等位基因互补。每个SNP位点的探针依据上一步多重PCR的分组方案进行分组。LDR反应的寡核苷酸等位基因1、等位基因2、modify探针(互补序列和随机序列)、连接了FAM荧光标记的通用序列和模板按照1：1：2：n：n的比例混合在一个反应体系里(n指的是一次反应中SNP的数目，如组1，n＝10)。
[0056] LDR反应采用5μl体系，包括20mM Tris–HCl(pH 8.5),5mM MgCl2,100mM KCl,10mM DTT,1mM NAD+,1U Taq DNA连接酶(New England Biolabs,USA)，2μl探针混合和2μl PCR产物。PCR程序设定为：预变性94℃2分钟，变性94℃15秒、退火50℃25秒，设置变性和退火30次循环。LDR产物在ABI3730XL测序仪上进行毛细管电泳检测，电泳条件设为3KV 30分钟。下机数据使用GeneMapper 3.3软件进行分析。
[0057] 实施例2
[0058] 临床基因检测应用
[0059] 样本采集与DNA抽提
[0060] 237例血液样本来自于上海市松江区中心医院心血管疾病患者，包括高血压、冠心病、慢性心力衰竭、高脂血症或心肌梗塞等。病人的信息请见附表1。取200μl血液，使用Axygen DNA抽提试剂盒进行基因组DNA提取，具体方法参照试剂盒说明书。DNA使用0.8％的琼脂糖凝胶电泳和OD260/280的值进行质控。
[0061] 表1为血样来源病人年龄和性别分布
[0062] 信息 男/女 年龄上限 年龄下限 50～59(y) 60～69(y) 70～79(y) 80～89(y) 90～100(y)数目 106/131 98 53 10 105 71 48 3
[0063] 方法评估
[0064] 为同时对19个SNP进行分型，将LDR检测时的探针设计成具有长度差异的探针。同一个位点的探针长度差异为2个核苷酸，而不同位点的探针长度在3个核苷酸以上。结果表明，19个SNP位点在一条泳道中可以清晰地区分开(如图1所示)。19个SNP中，16个符合哈温平衡，3个不符合哈温平衡。为进一步验证方法的可靠性，采用Sanger法抽样检测了3个SNP位点(rs1057910,rs776746和rs4244285)的8个样本，结果表明两种方法的分型结果一致(如图2所示)。
[0065] 临床样本19个SNP位点PCR-LDR基因分型
[0066] 本研究使用的237例血液样本来自于上海市松江中心医院治疗的病人，年龄在53岁-98岁之间。所有的病人都接受抗血栓治疗。
[0068] 表2为237例病人19个SNP位点基因型频率统计：
[0069]
[0070]
[0071] *:Ensemble waston
[0072] **:CASAgilent
[0073] 结果表明，病例中基因型分布于大队列中的分布非常相似。然而，只有22％的人没有药物代谢通路的变异，78％的人携带了至少1个变异，99个人(42％)仅携带一个变异，25％携带了2个变异，3个病人携带了4个变异(图3)。
[0074] 本发明提供的试剂盒检测了237例心血管疾病患者的心血管疾病治疗药物代谢通路的19个SNP位点。78％的人携带了至少1个变异，这预示着大部分患者是迫切需要此类基因检测的结果，以指导他们选择正确的药物和剂量进行治疗。在选择药物进行治疗之前，做个性化用药安全基因检测辅助选择药物、降低不良药物反应，避免错误用药，这对心血管疾病患者和医生来说都是非常有帮助的。
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