一次性芯片型流动室与利用其的细胞分选仪
阅读：1025发布：2020-10-11
专利汇可以提供一次性芯片型流动室与利用其的细胞分选仪专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 实现无残留、无交叉污染的细胞分选仪、能够检测侧方散射光的流式细胞仪、准确检测细胞 密度 、不需要 荧光 校正的多重 染色 分析。本发明提供一种微粒分离装置，其具有：流动室，在平板 基板 内形成流道；光照射装置， 对流 经流道的样品液中的微粒照射光；检测装置，检测在照射光时由微粒产生的散射光或荧光，基于它们的 信号 强度对微粒进行识别，检测目标微粒；定压 泵 以及与定压泵连接的电磁 阀 ，所述定压泵对在流动室的流道中流动的样品液中的微粒施加压 力 脉冲；以及，控制装置，基于来自检测装置的信号，控制 电磁阀 的动作。，下面是一次性芯片型流动室与利用其的细胞分选仪专利的具体信息内容。
1.一种流动室装置，在平板基板内形成流道，用于在流道内流动样品液的状态下，分离包含在样品溶液中的粒子，其特征在于，
所述流动室的结构如下：在透明基板中形成有流道，在所述流道的上游侧与下游侧的基板上部分别形成有与所述流道进行流体连接(fluidly connected)的贮液室；
所述流动室具有形成于所述透明基板上的所述样品液的导入用流道和设置在其两侧的一对鞘液导入用流道、合流流道以及一对分支流道；
所述合流流道，是所述样品液的导入用流道与设置在其两侧的所述一对鞘液导入用流道合流而成，所述鞘液夹着所述样品液，在其两侧流动；
所述一对分支流道，其对置地连接于所述合流流道的侧面；
所述一对分支流道具有能够与外部泵进行气密连接的端口，
具有与所述导入用流道连接的样品液贮液室、与所述鞘液导入用流道连接的鞘液贮液室、与所述分支流道连接的分选贮液室、以及回收样品液贮液室。
2.根据权利要求1所述的流动室装置，其特征在于，在合流流道两侧的基板端具有斜面结构，用于反射侧方散射光。
3.一种液体中微粒的检测装置，其特征在于，其具有：
流动室，在平板基板内形成流道；
照射光源，其在流动室中将样品液中的微粒与鞘液一起在所述流道中流动的状态下，对样品液中的微粒照射光；
检测装置，检测在照射所述光时由所述微粒产生的散射光或荧光，基于它们的信号强度对所述微粒进行识别，检测目标微粒；以及，
控制、分析部，控制所述各部，基于来自所述检测装置的信息，分析所述微粒，流道连接于样品液贮液室的下侧，探测在所述样品液完全流完的时刻所产生的气泡，利用散射光信号和荧光信号，将与细胞不同的气泡分布作为所述样品液检测的终点，由此对包含在全部所述样品液中的粒子数的总量进行定量。
一次性芯片型流动室与利用其的细胞分选仪
[0001] 本申请是申请日为2011年01月11日，申请号为201180006138.7，发明名称为一次性芯片型流动室与利用其的细胞分选仪的分案申请。要求日本在先申请JP2010-007295的优先权，优先权日为2010年1月15日。
技术领域
[0002] 本发明涉及一种流式细胞仪等具有生物粒子分析功能的装置或细胞分选仪等具有流动室分离功能的装置，用该装置实现新功能的测定方法，以及一次性流动室芯片。
背景技术
[0003] 流式细胞仪通常被广泛用于鉴别各种类型的细胞及生物学粒子。现有的流式细胞仪通常采用石英制成，具有光学上透明的流动室，所述流动室形成有流道，以使能够形成通过其并应被一个一个地识别的细胞流。该流道中流动的细胞流利用同心包围该细胞流的鞘液，从而集中于流道的中央部流动。该流道的中央部被激光束照射，细胞通过该照射区域时，产生依赖于细胞大小、形状、折射率的光散射。该激光的波长通过与荧光色素种类的配合来决定，以用来用荧光检测由荧光色素进行特异性染色的细胞。像这样，通过对每个细胞，除散射光之外，还利用多个光检测器按照不同波长检测荧光，从而能够以多个角度分析细胞。上述流式细胞仪的技术记载于专利文献1中。并且，关于平板状的流动室记载于特开平第2003-302330(专利文献10)及美国专利第7105355号(专利文献11)中。利用一次性芯片的流式细胞仪记载于专利第4358888号(专利文献14)中。
[0004] 下面对细胞分选方法的公知实例进行叙述。美国专利第3710933号(专利文献1)及美国专利第3826364号(专利文献2)中记载的 方法为现有一般产品中所用的分离方法，从用于形成液滴的喷嘴中将样品液作为液滴向空气中吐出，通过电场，将包含分离对象细胞的液滴以液滴单位进行分离的方法。特开昭第64-3541(专利文献3)公开了如下方法：使鞘流在流动室中流动的样品液的周围流动，通过对样品液施加电场，从而使带电的粒子从样品流向鞘流的方向移动，并分离检测。特开平1-170853号(专利文献4)中记载了如下方法：对在流动室中流动的粒子施加压力脉冲，将粒子分离到流动室内非平稳流动的流道中。国际公开号为WO98/10267号(专利文献5)中公开了如下技术：对在流动室中周围被鞘流挤压流动的微粒施加场，使微粒流发生偏移并进行分离。国际公开号为WO2004/101731号(专利文献6)中公开了如下方法：利用设置于流动室中流道两侧的凝胶电极，将液体中带电的细胞用电场进行分离。美国专利第6808075号(专利文献7)中公开了如下方式：通过垂直形成弯液面的气泡阀来对粒子流施加压力脉冲，使流发生偏移并分离。WO2006/076195号(专利文献8)公开了一种以水滴单位射出并回收到容器中的方法，所述水滴单位含有以同专利文献5一样施加物理冲击脉冲为目的的粒子。美国专利第4756427号(专利文献9)中记载了如下方法：测定被鞘流挤压的样品液流中的粒子，在判断为目标微粒的情况下，利用压电原件，通过脉冲流将其导入到其它流道，进行分离。
[0005] 专利文献12中记载的细胞分离方法，其是通过在油内形成含有细胞的液滴并使其流动，从而通过静电场，使力作用于含有目标细胞的液滴的方法。专利文献13中采取了以下方法：在流动室中的流道上形成细胞分选用的支流道，利用压电原件产生脉冲流，将所需的细胞引入到分选流道中。
[0006] 现有技术文献
[0007] 专利文献
[0008] 专利文献1：美国专利第3710933号
[0009] 专利文献2：美国专利第3826364号
[0010] 专利文献3：特开昭64-3541号公报
[0011] 专利文献4：特开平1-170853号公报
[0012] 专利文献5：国际公开号WO98/10267
[0013] 专利文献6：国际公开号WO2004/101731
[0014] 专利文献7：美国专利第6808075号
[0015] 专利文献8：国际公开号WO2006/076195
[0016] 专利文献9：美国专利第4756427号
[0017] 专利文献10：特开2003-302330号公报
[0018] 专利文献11：美国专利第7105355号
[0019] 专利文献12：WO2009/021215
[0020] 专利文献13：特开昭61-137062号公报
[0021] 专利文献14：专利4358888
发明内容
[0022] 本发明要解决的技术问题
[0023] (1.送液系统的问题)
[0024] 现有的细胞分选仪，其送液系统存在生物危害方面的问题。即，这是因为其为以下结构，发生外部异物向测量样品内的混入及测量样品向外部扩散。即，不能简单地更换试样液的贮液室、送液泵及具有流动室的送液系统，现有的流式细胞仪，为了降低残留，在每次测量不同的样品时必须进行洗净。将粒子分离功能附加到流式细胞仪上，这种细胞分选仪也同样存在这一问题。作为解决该问题的方法之一，是使流动室能够一次性使用。为了能够做成一次性的，流动室适合使用如载玻片那样的平板状结构。即，因为该结构能够通过射出成型等容易地形成流道样式，且能够廉价批量生产。在使用平板状流动室的情况下，适合使用将照射激光从表面垂直入射的方法。但是，在检测向平板面内侧方向的散射光即侧方散射光方面存在问题。检测侧方散 射光的意义在于获得细胞内部结构的信息，对于通常的流式细胞仪来说是必须具备的功能。通常的流式细胞仪的流动室，其流动室的横截面一般为正方形，对检测与激光照射方向垂直的方向的散射光没有问题，且可与前方散射光同时检测。但是，使用平板型流动室的情况下，由于侧方散射光的方向上存在流动室基板，因此流动室的平板结构本身成为测量的障碍。作为解决这一问题的方法，专利文献11记载有以下方法。在流动室的流道侧面设置光纤，将流道内发出的光导出至光检测器。但是，这种情况下，由于光纤连接到流动室，因此不适合每次检测都更换流动室，因此不能适用于一次性用途的流动室。作为本发明人之前的发明，专利文献14的利用一次性芯片型流动室的流式细胞仪中，不包括检测侧方散射光的功能。
[0025] (2.流动室的问题)
[0026] 此外，如果不能以廉价制备流动室，则难以成为一次性产品。为了以廉价制备，用透明树脂制备为宜。但是，树脂在波长小于500nm的短波长区域，存在很小的光吸收带并发出荧光，因此成为检测的背景噪声。即，适合一次性的由透明树脂制备的流动室的情况下，本身的荧光成为检测的障碍。
[0027] (3.细胞分离方法的问题)
[0028] 对细胞分选的问题进行叙述。作为第一问题，存在生物危害对策方面的问题。
[0029] 专利文献1或专利文献2中所述的利用喷嘴来吐出液滴，通过电场，将包含分离对象细胞的液滴以液滴单位进行分离的方法(喷气方式)，在生物危害对策方面存在问题。即，样品为被病原性病毒或细菌污染的细胞的情况下，具有将非常危险的物质作为气溶胶扩散到大气中的风险。作为解决第一问题的方法，考虑了将气溶胶密闭在流动室内，而不使其扩散到大气中，在此状态下进行分离的方法。作为这种方法，公开有以下几种技术。专利文献3公开了一种鞘流在流动池 中流动的样品液的周围流动，通过对样品液施加电场，利用电场使带电粒子从样品流向鞘流方向移动来进行分离检测的方法。专利文献4公开了一种对在流动室中流动的粒子，施加由压电原件产生的压力脉冲，将粒子分离到流动室中的非平稳流动的流道的方法，但是，在该方法中，为了避免分离的粒子返回原流道，需要形成空气稳流等，存在控制复杂的问题。专利文献5中公开了一种使鞘流在流动室内流动的样品液的周围流动，挤压样品液流，对样品液中的微粒施加电场或磁场等场，从而使微粒流发生偏移来进行分离的技术。在该方法中，使用电场作为场的情况下，相当于上述专利文献3中的内容。这种利用电场的方法，与专利文献6中的方法相同，即使采用一些方法来防止因电分解产生气泡，细胞所具有的电荷也会被周围电解质中所含的离子屏蔽，降低作用于粒子的力，因此对于电解质中的分离并不实用。专利文献7中公开了一种在芯片内的细胞分离技术。其是通过从侧面的压力使一个微粒流偏移，并在下游进行分离的方法。但是，为了施加压力，需要弯液面的往返运动，由于在来回往返中会产生逆方向流，因此，需要在等到粒子足够远后将弯液面位置回复到原位置。专利文献8公开了如下方法，其同专利文献4一样，通过施加物理冲击脉冲，将包含目标细胞的区域以水滴单位射出，并回收到容器中。上述内容在一次性流动室芯片内不能实现，存在与其它样品间的污染。专利文献9的方法不适用于一次性芯片。
专利文献12的方法，其是通过在油内形成包含细胞的液滴并流动，对包含目标细胞的带电液滴作用静电力，从而进行分离的方法。这种情况下，具有以下优点，在油内不存在屏蔽静电力的离子，但是在高粘性的油中，在分选比细胞大的液滴时，具有速度慢的缺点。如专利文献13记载的那样，利用压电原件产生脉冲流使细胞分离到支流道中的方法，该方法的流动室与压电的连接也没有以一次性作为前提。如果将压电原件组装到流动室的情况下，流动室的价格会变得昂贵，因此不适用于一次性芯片。
专利文献12的方法，其是通过在油内形成包含细胞的液滴并流动，对包含目标细胞的带电液滴作用静电力，从而进行分离的方法。这种情况下，具有以下优点，在油内不存在屏蔽静电力的离子，但是在高粘性的油中，在分选比细胞大的液滴时，具有速度慢的缺点。如专利文献13记载的那样，利用压电原件产生脉冲流使细胞分离到支流道中的方法，该方法的流动室与压电的连接也没有以一次性作为前提。如果将压电原件组装到流动室的情况下，流动室的价格会变得昂贵，因此不适用于一次性芯片。
[0030] (4.应对多个待测样品的流式细胞仪的问题)
[0031] 下面，对应对多个待测样品的流式细胞仪的问题进行叙述。通常的流式细胞仪采用以下方法作为应对多个待测样品的方法：将96孔板自动放置在XYZ载置台上，并依次进行检测。这种方法，由于轮流使用送液系统，因此会产生残留及待测样品间的交叉污染。因此想到了在形成多个流道的芯片中，以低廉的运营成本，在短时间内检测多个待测样品的方法。这种情况下，如上所述的那样，侧方散射光的检测成为难点。在形成多个流道的情况下，如专利文献11中所记载的方法那样，想到了将光纤插入流道的侧面，通过光纤将信号光导入检测器中，检测侧方散射的方法，但是包含光纤的一次性芯片并不实用。
[0032] (5.利用一次性芯片检测准确浓度的问题)
[0033] 下面，在利用一次性芯片的检测中，对测量样品的准确浓度进行检测的情况下的问题进行叙述。由于细胞因重力而沉降，样品液的细胞浓度，有底面附近的密度随时间增大的现象。尽管存在这种现象但为了检测准确浓度，需要检测全部的样品液。这种情况下存在以下问题：例如，作为已知例的专利文献14中所记载的芯片，当放入样品液进行检测时，在样品液刚消失时，会产生气泡，在细胞的检测数据中会混入气泡数据。这种气泡的产生，成为检测细胞的准确个数的障碍。
[0034] (6.数据分析的问题)
[0035] 下面，对流式细胞仪的数据分析方面的问题进行叙述。流式细胞仪的多色分析一般进行荧光校正。但是，在该荧光校正中，从分布于检测波长不同的多个检测器间的多个信号强度中，每个荧光标签校正一个信号强度，因此在测量前需要使用测定用样品进行装置调节。因此，测定用样品为了获得测常数据和调节装置，需要仅荧光色的数量并单独进行染色的样品。并且，荧光检测器至少需要三个以上，即， 具有三种以上颜色。在这种状况下，可以用二维图表显示二维数据，但在现有的流式细胞仪中存在三维数据的分析和显示方面的问题。即，用多个二维显示或可旋转显示的三维显示来进行，不能实现可立即理解的显示。
[0036] 解决技术问题的技术手段
[0037] 本发明鉴于上述情况，提供一种使用以下一次性芯片型的流动室来分析识别生物粒子并进行分离的装置，以及一次性流动室。
[0038] [1]一种粒子分离装置，其具有：
[0039] 流动室，在平板基板内形成流道；
[0040] 光照射装置，对流经上述流道的样品液中的微粒照射光；
[0041] 检测装置，检测在照射上述光时由上述微粒产生的散射光或荧光，基于它们的信号强度对上述微粒进行识别，检测目标微粒；
[0042] 定压泵以及与定压泵连接的电磁阀，上述定压泵对在上述流动室的上述流道中流动的上述样品液中的上述微粒施加压力脉冲；以及，
[0043] 控制部，基于来自上述检测装置的信号，控制上述电磁阀的动作，其特征在于，[0044] 上述流动室具有上述样品液的导入用流道以及设置在其两侧的一对鞘液导入用流道、合流流道、光照射区域以及一对对置的分支流道；
[0045] 上述合流流道，是上述一对鞘液导入用流道合流到所述样品液的导入用流道而成，在该合流流道内，鞘液夹着上述样品液，在其两侧流动；
[0046] 上述光照射区域位于上述合流流道上；
[0047] 上述一对对置的分支流道，在与上述光照射区域相比的下游处连接到上述合流流道上；
[0048] 在上述一对对置的分支流道中的一个流道上连接通常为关闭状态的第一电磁阀和负压的定压泵；
[0050] 上述检测装置对上述微粒通过上述光照射区域时所产生的光信号进行检测；
[0051] 上述控制部基于来自上述检测装置的上述光信号，判断上述微粒是否为应分离的目标微粒，在判断为是应分离的目标微粒的情况下，在该微粒通过与上述一对对置的分支流道连接的上述合流流道区域中，对上述第一及第二电磁阀提供只是短时间作为开启状态的信号，对从上述对置的一对分支流道通过上述区域中的上述目标微粒施加推(PUSH)及拉(PULL)的压力，由此改变上述目标微粒流，从而分离上述目标微粒。
[0052] [2]如上述[1]中记载的微粒分离装置，其特征在于，
[0053] 上述控制部，在判断上述微粒为应分离的目标微粒的情况下，在该微粒通过上述一对对置的分支流道所连接的所述合流流道区域中，对上述第电磁阀提供只是短时间作为开启状态的信号；
[0054] 据此，对存在于上述对置的分支流道间的上述合流流道的上述区域中的上述目标微粒，施加推及拉的压力，由此改变上述目标微粒流，将上述目标微粒收入“拉”侧的上述分支流道，从而分离上述目标微粒。
[0055] [3]如上述[1]中记载的微粒分离装置，其特征在于，
[0056] 上述流动室还具有一对追加的分支流道，其在比与上述一对对置的分支流道连接的上述合流流道区域更下游处，从上述合流流道上分支；
[0057] 上述控制部，在判断上述微粒为应分离的目标微粒的情况下，在该微粒通过最初的上述一对分支流道相对且与上述最初的分支流道连接的上述合流流道的上述区域中，对上述电磁阀提供只是短时间作为开启状态的信号，
[0058] 据此，对存在于上述对置的上述最初的分支流道间的上述合流流道的上述区域中的上述目标微粒施加推及拉的压力，改变上述目标微粒流，将上述目标微粒分离到下游的上述追加分支流路中。
[0059] [4]一种平板状的流动室装置，其用于在流道内流动样品液的状态下，分离包含在样品液中的微粒，
[0060] 上述流动室的结构如下：在透明基板中形成有流道，在上述流道的上游侧与下游侧的基板上部分别形成有与上述流道进行流体连接(fluidly connected)的贮液室，其特征在于，
[0061] 上述流动室具有形成于透明基板上的上述样品液的导入用流道和设置在其两侧的一对鞘液导入用流道、合流流道以及对置的一对分支流道；
[0062] 上述合流流道，是上述样品液的导入用流道与设置在其两侧的上述一对鞘液导入用流道合流而成的，上述鞘液夹着上述样品液，在其两侧流动；
[0063] 上述一对对置的分支流道，其连接在上述合流流道的侧面；
[0064] 上述一对对置的分支流道具有能够与外部泵气密连接的端口。
[0065] [5]一种应对多个待测样品的流式细胞仪，其用于将包含生物粒子的样品液在流动室中的流道内流动的状态下，对样品液照射光，检测由包含在样品液中的样品粒子所产生的光，其特征在于，其具有：
[0066] 载置台，载置流动室；
[0067] 光照射装置；
[0068] 检测装置，检测上述生物粒子；以及，
[0069] 控制部，控制上述各部的动作，
[0070] 上述流动室为平板状，在透明的平板基板上形成有多个样品液贮液室及多个鞘液贮液室、多个废液贮液室及多个回收样品液贮液室，以及与这些贮液室分别流体连接的多个流道；
[0071] 各上述样品液贮液室在各上述鞘液贮液室内隔开形成，以避免各 自液体相混合；
[0072] 各上述样品液贮液室上连接有各样品液用流道；
[0073] 各上述鞘液贮液室上连接有一对鞘液用流道；
[0074] 各上述样品液流道的侧面上连接有上述一对鞘液用流道；
[0075] 通过在各上述样品液流道上连接上述一对鞘液用流道，从而形成从上述样品液流的左右合流鞘流的流道，合流后的流道以平行的等间距形成，最下游连接到形成于流动室上的上述废液贮液室及上述回收样品贮液室上；
[0076] 在多个上述流道的每一个上，利用使只能照射一个流道大小的光束依次以步进重复(step and repeat)方式照射光或流动室移动，来检测多个样品。
[0077] [6]如[5]中记载的应对多个待测样品的流式细胞仪，其特征在于，[0078] 通过使上述流动室的上述透明平板基板的上述流道侧面方向的两端倾斜，从而使从各上述流道内产生的侧方散射光在两端全反射，并进行检测。
[0080] 在分析包含多个荧光分子的细胞时，具有将由光照射产生的波长不同的两种荧光强度的比，对每个细胞导出分布并进行显示的功能；
[0081] 还具有根据其值来评价包含在细胞中的多个荧光分子的丰度的功能。
[0082] [8]一种检测液体中微粒的装置，其特征在于，其具有：
[0083] 流动室，在平板基板内形成流道；
[0084] 照射光源，其在流动室中将样品液中的微粒与鞘液一起在上述流道中流动的状态下，对样品液中的微粒照射光；
[0085] 检测装置，检测在照射上述光时由上述微粒产生的散射光或荧光，基于它们的信号强度对上述微粒进行识别，检测目标微粒；以及，
[0086] 控制、分析部，控制上述各部，基于来自上述检测装置的信息，分析上述微粒；
[0087] 利用表示在上述样品液完全流完的时刻所产生的气泡的信号，通过探测上述样品液检测的终点，对包含在全部上述样品液中的粒子数进行定量。
[0088] [9]一种生物粒子分析装置，其特征在于，其具有照射光源和光测定装置，上述光测定装置的结构为在多个波长区域中检测通过光照射而由每个粒子产生的光；
[0089] 上述生物粒子分析装置具有以下功能，对每个粒子，利用与粒子的测定项目相对应的多个信号强度间的运算来求出指数，基于该指数的值来分析粒子特性。
[0090] [10]如上述[9]中记载的生物粒子分析装置，其特征在于，
[0091] 其具有运算装置，上述运算装置在对同时使用透过细胞膜的染色剂与不透过细胞膜的染色剂染色的细胞或细菌进行存活判断的测定分析的情况下，将由光照射产生的波长不同的两种荧光信号强度的比作为指数，基于该指数的值，判定是死细胞还是活细胞。
[0092] [11]一种生物粒子分析装置，其特征在于，其具有照射光源和光测定装置，上述光测定装置的结构为在多个波长区域检测通过光照射而由每个微粒产生的光，[0093] 对每个粒子，导出用多个信号强度间的运算式定义的指数，能够选择该指数作为数据显示图表的轴。
[0094] 发明效果
[0096] 图1A)为表示在流道内通过脉冲流进行细胞分选的情况下的问 题的附图。B)为表示根据本发明解决上述问题的原理的附图。
[0097] 图2a)为表示本发明的细胞分选仪的一个例子的附图，表示电磁阀关闭(OFF)的状态。b)为表示本发明的细胞分选仪的一个例子的附图，表示电磁阀开启(ON)的状态。
[0098] 图3a)为表示本发明的细胞分选仪的第二实施方式的附图，表示电磁阀关闭的状态。b)为表示本发明的细胞分选仪的第二实施方式的附图，表示电磁阀开启的状态。
[0099] 图4为表示使用本发明的一次性芯片型流动室且用于进行细胞分离的流动室结构、电磁阀及定压泵的附图。
[0100] 图5为表示使用本发明的一次性芯片型流动室且用于进行细胞分离的流动室、光学系统及控制系统的附图。
[0101] 图6为表示本发明的一次性芯片型的应对多个待测样品的流动室的结构的示意图。
[0102] 图7为表示使用本发明的一次性芯片型的应对多个待测样品的流动室的侧方散射检测光学系统的附图。
[0103] 图8为表示使用本发明的一次性芯片型的应对多个待测样品的流动室的侧方散射检测光学系统与芯片移动之间的关系的附图。
[0104] 图9为表示在使用本发明的一次性芯片型流动室的流式细胞仪中，能够去除在检测全部样品液时产生的气泡所带来的影响的附图。
[0106] 图11为表示根据本发明的二重染色细胞的分析方法的附图。以纵轴为FL1/FL2的对数比来表示(A)图表中的数据时，成为(B)图表。
[0107] 图12为对现有细胞的存活判定分析方法进行说明的附图。
[0108] 图13为表示将本发明的多重染色分析方法应用于细胞的存活判 定分析中的例子的结果示意图。
[0109] 图14为基于本发明的根据指数来判定存活的多维信息显示例。
[0110] 图15为基于本发明的根据指数的其它多维信息显示例。
具体实施方式
[0111] 1.粒子分离装置
[0112] 本发明的一个实施方式提供一种微粒分离装置。该粒子分离装置典型地具有：
[0113] i)流动室，在平板基板内形成流道；
[0114] ii)光照射装置，对在上述流道中流动的样品液中的微粒照射光；
[0115] iii)检测装置，检测在照射光时由粒子产生的散射光或荧光，基于它们的信号强度对上述微粒进行识别，检测目标微粒；
[0116] iv)定压泵以及与其连接的电磁阀，上述定压泵用于对在上述流动室的流道中流动的样品液中的微粒施加压力脉冲；
[0117] v)控制部，基于来自检测装置的信号，控制电磁阀的动作；
[0118] 典型地，上述流动室具有：
[0119] a)样品液导入用流道和设置在其两侧的一对鞘液导入用流道；
[0120] b)合流流道，使上述一对鞘液导入用流道合流到样品液导入用流道而成(在合流流道内，鞘液夹着上述样品液，在其两侧流动)；
[0121] c)光照射区域，位于上述合流流道上；
[0122] d)一对对置的分支流道，在与光照射区域相比的下游处，(几乎成直角地)连接于上述合流流道上。
[0123] 典型地，在上述一对对置的分支流道的一个流道上连接通常为关闭状态的第一电磁阀和负压的定压泵；在上述一对对置的分支流道的另一个流道上连接通常为关闭状态的第二电磁阀和正压的定压泵。
[0124] 典型地，上述检测装置对上述粒子通过光照射区域时所产生的光信号进行检测。
[0125] 典型地，上述控制部基于来自上述检测装置的上述光信号，判断上述微粒是否为应分离的目标微粒，如果判断为是应分离的目标微粒的情况下，在该微粒通过与上述一对对置的分支流道连接的上述合流流道的区域中，对上述第一及第二电磁阀提供仅短时间呈开启状态的信号，对从上述对置的一对分支流道通过上述区域的上述目标微粒施加推(PUSH)及拉(PULL)的压力。这样一来，通过改变上述目标微粒流，从而能够将目标微粒从其它微粒中分离出来。
[0126] 或者也可以是，在本发明的微粒分离装置中，上述控制部，在判断上述微粒为应分离的目标微粒的情况下，在该微粒通过与上述一对对置的分支流道连接的合流流道区域中，对上述电磁阀提供只是短时间作为开启状态的信号；据此，对存在于上述对置的分支流道间的合流流道区域中的目标微粒施加推及拉的压力，改变上述目标微粒流，将目标微粒收入“拉”侧的分支流道。
[0127] 本发明的微粒分离装置，其流动室还可以具有一对追加的分支流道，所述一对追加的分支流道是在与一对对置的分支流道连接的合流流道区域相比更下游处，从合流流道分支出的。并且，利用上述控制部判断微粒为应分离的目标微粒的情况下，在该微粒通过最初一对分支流道相对且最初的分支流道连接的合流流道的上述区域中，对上述电磁阀提供只是短时间作为开启状态的信号，据此，对存在于对置的最初的分支流道间的合流流道区域中的目标微粒施加推及拉的压力，改变目标微粒流，将目标微粒分离到下游的追加的分支流路中，从而能够分离微粒。
[0128] 2.平板状流动室装置
[0129] 在本发明的其它实施方式中，提供一种平板状的流动室装置，其用于在将样品液在流道内流动的状态，分离包含在样品液中的微粒。该流动室装置，典型地具有如下结构：在透明基板中形成有流道，在该流道的上游侧与下游侧的基板上分别形成与上述流道进行流体连 接(fluidly connected)的贮液室。
[0130] 更具体地，该流动室装置，其具有形成于透明基板上的：
[0131] i)样品液导入用流道和设置在其两侧的一对鞘液导入用流道；
[0132] ii)合流流道，是上述样品液的导入用流道与设置在其两侧的上述一对鞘液导入用流道合流而成，鞘液夹着上述样品液，在其两侧流动；
[0133] iii)对置的一对分支流道，(几乎成直角地)连接于上述合流流道的侧面。
[0134] iv)上述一对分支流道具有能够与外部泵进行气密连接的端口。
[0135] 流动室结构还可以是具有一对追加的分支流道，所述一对追加的分支流道是在与上述分支流道连接的上述合流流道区域相比更下游处，从上述合流流道分支出的。
[0136] 3.应对多个待测样品的流式细胞仪。
[0137] 在本发明的再一个实施方式中，提供一种应对多个待测样品的流式细胞仪，其用于将包含生物粒子的样品液在流动室的流道内流动的状态下，对样品液照射光，检测由包含在样品液中的样品粒子所产生的光。该流式细胞仪典型地具有：
[0138] i)载置台，载置流动室；
[0139] ii)光照射装置；
[0140] iii)检测装置，检测生物粒子；
[0141] iv)控制部，控制上述各部的动作。
[0142] 上述流动室也可以是平板状。进一步地，上述流动室也可以在透明的平板基板上形成有多个样品液贮液室及多个鞘液贮液室、多个废液贮液室及多个回收样品液贮液室，以及与这些贮液室分别流体连接的多个流道。进一步地，各上述样品液贮液室也可以在各上述鞘液贮液室内隔开形成，以避免各自液体相混合。进一步地，各上述样品液贮液室上也可以连接各样品液用流道；进一步地，各上述鞘液贮液室 上也可以连接一对鞘液用流道。进一步地，各上述样品液流道的侧面上也可以连接上述一对鞘液用流道。
[0143] 也可以采用以下结构，通过在各样品液流道上连接上述一对鞘液用流道，从而形成从上述样品液流的左右合流鞘流的流道，合流后的流道以平行的等间距形成，最下游连接到形成于流动室上的上述废液贮液室及上述回收样品贮液室上。
[0144] 根据本发明的应对多个待测样品的流式细胞仪，在多个上述流道的每一个上，利用使只能照射一个流道大小的光束依次以步进重复(step and repeat)方式照射光或流动室移动，来检测多个样品。
[0145] 在本发明的应对多个待测样品的流式细胞仪中，也可以通过使上述流动室的上述透明平板基板的上述流道侧面方向的两端倾斜，从而使从各上述流道内产生的侧方散射光在两端全反射，并导入检测系统进行检测。
[0146] 4.其它流式细胞仪
[0147] 在本发明的另一个实施方式中，提供一种流式细胞仪，其特征在于，在分析包含多个荧光分子的细胞时，具有如下功能：将由光照射产生的波长不同的两种荧光强度的比，对每个细胞显示分布；根据其值来评价包含在细胞中的多个荧光分子的丰度。此外，在另一个实施方式中，提供一种生物粒子分析装置，其特征在于，在对同时使用透过细胞膜的染色剂与不透过细胞膜的染色剂染色的细胞或细菌进行评价时，对于由激光照射产生的波长不同的两种荧光信号强度的比，根据其相对于之前设定的基准值的大小关系，来判定是死细胞还是活细胞。
[0148] 这些流式细胞仪或生物粒子分析装置，典型地至少具有激光照射光源和荧光测定装置，所述荧光测定装置的构成为检测多个波长区域的荧光。
[0149] 下面，参照附图，对本发明的更具体的实施方式进行说明，但本 发明的范围并不限定于这些实施方式。
[0150] 1)细胞分离方法及装置。
[0151] 使用图1详细说明实现一次性芯片内的细胞分离的本发明的细胞分离方法及装置。图1(A)图示了在从细胞分选流道100施加压力的情况下，该压力引起的液流，所述细胞分选流道100为在侧面连接到细胞流动的主流道上。在与流道中的压力相比足够低的负压的情况下，液流被拉入(“拉(PULL)”状态)。在与流道中的压力相比足够高的情况下，液流被推出(“推(PUSH)”状态)。目标细胞在主流道中流动并横穿分选流道的瞬间，施加拉或推的压力时，仅移动目标细胞是不可能的。即，在利用压力仅将特定的细胞分离到分离流道的情况下，由于力会波及到大范围的液体，使分离的空间分辨率变差。
[0152] 作为解决上述问题的方法，如图1(B)中所示，在主流道的侧面对置设置用于推和用于拉的分选流道，通常，主流道和分选流道之间不存在液流，但仅在应分离的目标细胞通过对置区域内的时间，产生推的压力和拉的压力。这种情况下，使推的流量与拉的流量几乎相同，将来自分选流道的压力影响主流道流体的区域大致限定在分选流道宽度上。该方法如图2所示。
[0153] 在图2中，包含细胞的样品溶液在形成于流动室内的流道1中流动，不包含细胞的鞘液在流道2中流动，通过合流，样品液以拧细的状态流动。在该样品流动的流道的侧面对置连接有两个分支流道4-1、4-2。流道4-1为用于拉的流道，流道4-2为用于推的流道。在流道4-1上连接有储存目标细胞的贮液室5、电磁阀7-1及气缸泵8-1。气缸泵8-1保持与流道1相比足够低的一定的压力，另一方面，在推的流道上连接有电磁阀7-2与气缸泵8-2。气缸泵8-2保持与流道1相比足够高的一定的压力。包含在样品液中的细胞通过激光照射区域3时，由细胞产生散射光及荧光。用光检测器检测上述光，对其信号强度进行定量化，并与预先设定的所需细胞的信号条件进行比较。通过 信号处理线路判定该细胞是否为所需细胞，如果是所需细胞的情况下，在该细胞通过分支流道的时间里，产生触发信号，根据该触发信号，使电磁阀7-1与7-2仅短时间呈开启状态。在开启状态期间，从流道4-2向主流道提供与从主流道向分支流道4-1流入的流量相同的流量，从而限定流道4-1与流道4-2之间的分选流，防止细胞分离的空间分辨率比流道4-1的宽度差。在上述方式中，作为产生脉冲压力的方法，通过连接定压泵与电磁阀，来独立控制分选力与分选产生时间长短。由于定压泵不产生气溶胶，因此适合用于生物危害。
[0154] 图3为基于推&拉的流速比流道27的流速慢，不能够放入分选贮液室5的情况下进行分离的方法。图3a)表示电磁阀为关闭(OFF)的情况。在下游侧与流道1、2对称地形成流道11、23、24。为了达到在层流上的流体力学效果，鞘液分离到流道23、24中，样品液1回收至流道11。图3b)表示电磁阀开启(ON)的情况。这种情况下，目标细胞因来自分选流道4-1、4-2的压力而产生的液流中，位置稍微从流道4-1偏移，并在流道27中流动。在下游侧，通过该偏移，目标细胞分离到流道23中。
[0155] 根据需要，为了避免细胞或细菌流入电磁阀，设置过滤器，从而能够起到防止由流动室外部向流道内混入细菌或细胞，防止样品向流动室外部散失的作用。
[0156] 下面，使用图4及图5，对实现一次性芯片内的细胞分离的实施方式进行说明。
[0157] 图4表示在一次性芯片型流动室上连接气缸泵和电磁阀的状态。一次性芯片的结构是在作为现有发明的专利文献14中记载的基础上，对称增加了图2所示的分选用流道4-1和流道4-2和各自的分选贮液室5-1、5-2。一次性芯片型流动室用透明树脂制成。作为树脂的种类，可以使用聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、环烯烃共聚物(COC)、甲基戊烯聚合物等。尤其在使用波长为350nm至410nm左右的UV 波长区域的激光作为照射光源的情况下，作为流动室的原料适合使用甲基戊烯聚合物。作为将分选贮液室也设置在流道4-2上的对称结构，连接电磁阀与气缸泵。对称结构是为了在电磁阀开启时，在同一时间，将相同的压力施加到流道27上。
[0158] 图5进一步表示了光学系统与控制系统电路间的连接关系。芯片的截面图为图4的BB截面。如图4所示，通过对芯片的上游侧施加气压，样品液与鞘液同时流入流道27，对比对置的分选流道4-1、4-2的区域稍上游的主流道的中央部照射激光52。细胞在通过该照射区域的瞬间，以脉冲形式产生散射光和荧光。散射光根据二向色镜(di chroic mirror)54和带通滤波器57，选择与照射激光相同的波长，用检测器61检测。在检测器61的前面设置遮光板60，消除激光透射光。荧光根据二向色镜55、56与带通滤波器58、59，用比照射激光长的波长，分割成多个波长区域，分别用不同的检测器62、63检测。各检测脉冲信号扩增并利用AD转换电路64数字化，利用微型计算机69判断多个检测信号是否满足预先设定的分离条件，在满足的情况下，在一定延迟时间后，将触发信号输出到电磁阀驱动66。将该延迟时间调整为细胞从激光照射区域流到分选流道4-1、4-2的区域为止的时间。收到触发信号的电磁阀驱动66，向电磁阀7-1、7-2输出仅开启一定时间的信号。将流道4-1和流道4-2的宽度设为相等的W，将细胞流经流道27的流速设为V，则阀为开启状态的时间长短优选设定为W/V(秒)。电磁阀开启时，目标细胞流入分选贮液室5。主流道与分选流道之间的液流，在阀7-1与阀7-
2为关闭状态下不发生，因此一旦收入分选贮液室5中的目标细胞在该处中被稳定地保存。
2为关闭状态下不发生，因此一旦收入分选贮液室5中的目标细胞在该处中被稳定地保存。
[0159] 如图4所示，在芯片上游侧的贮液室20的内部，虽然图中没有示出，但其通过定压泵施加了一定的气压。贮液室20的内部具有样品液贮液室10，在其内侧加入样品液，在其外侧加入鞘液。作为鞘液，优选使用磷酸盐缓冲液(PBS)。利用共通的气压，样品液1与 其左右的鞘液2向下游流动，待3条流道合流后，以样品液被鞘液拧细的状态在流道27中流动。流道27的宽度为80μm，深度为50μm。合流后的样品液宽度约为流道宽度的1/10。流道27具有从侧面对置的流道4-1、4-2，该流道与贮液室5连接。将波长为488nm的激光52照射到比该对置区域更上游侧仅数百μm处的流道27的中央部。上述光束大小为长度为50μm、宽度为20μm的椭圆。
[0160] 细胞在通过该照射区域的瞬间，以脉冲形式产生散射光和荧光。散射光利用二向色镜54和带通滤波器57，选择与照射激光相同的波长，用检测器61检测。在检测器61的前面设置遮光板60，消除激光透射光。荧光利用二向色镜55、56和带通滤波器58、59，用比照射激光长的波长，分割成多个波长区域，分别用不同的检测器62、63检测。各检测脉冲信号扩增并利用AD转换电路64数字化，利用微型计算机69判断多个检测信号是否满足预先设定的分离条件，在满足的情况下，在一定延迟时间后，将触发信号输出到电磁阀驱动66。使该延迟时间与细胞从激光照射区域流到分选流道4-1、4-2的区域为止的时间相同。收到触发信号的电磁阀驱动66，向电磁阀7-1、7-2输出仅开启一定时间的信号。将流道4-1和4-2的区域设为相等的W，将细胞流经流道27的流速设为V，则阀为开启状态的时间长短优选设定为W/V(秒)。电磁阀开启时，目标细胞进入分选贮液室5-1。主流道与分选流道之间的液流，在阀7-1与阀7-2为关闭状态下不发生，因此一旦进入分选贮液室5-1中的目标细胞在该处被稳定保存。此外，如图4所示的流动室，由于其下游侧形成有分离流道11、23、24，目标细胞根据由分选流道4-1和4-2导致的压力，移动量不足以进入分选贮液室5-1的情况下，在下游侧向流道23中分离。因此，如图4所示的流动室的结构为，在流道27的流速快的情况下，向流道23分离，在流速慢的情况下，对于分离到分选贮液室5-1中的流速，实现两阶段边际宽的分离。
[0161] 2)作为解决一次性芯片应对多个待测样品方面的侧方散射检测问题的方法的本发明的细胞分离方法及装置
[0162] 下面，使用图6和图7，对使用一次性芯片型多流道流动室的流式细胞仪的实施例进行说明。为了在无污染及残留为零的条件下检测多个待测样品，如图6所示，在一个芯片上形成8条样品流道，分别连接样品液贮液室31。为了避免在贮液室30中混合而分隔成的8个小室37为鞘液贮液室。在各小室内设置样品液贮液室。各小室具有两个鞘液贮液室与鞘液流道连接的端口。鞘液流和样品液流，其通过按照顺序对各小室施加气压，来控制连接到各个小室的样品液与鞘液的液流，通过仅对进行测定的样品液流入的小室施加压力，从而消除因样品液或鞘液的不必要的液流而产生的消耗。流道截面的大小与图4的流道截面大小相同。测量时的压力设定为从10kPa至20kPa之间的值，除了测量时以外的压力，设定为与下游部相同的大气压。在各个小室的内部共通的气压施加到鞘液与样品液上，向下游侧挤出。鞘液由鞘液端口32与基板内流道连接，与样品液从左右合流而流到下游侧。图7表示该芯片的截面图与测定光学系统。测定光学系统中利用透镜51的检测光学系统几乎与图5相同，但增加了对流道进行图像观察的光学系统。其为1％反射镜、成像用透镜81和相机82。包含激光的照射光学系统与检测光学系统为固定状态，采取移动搭载了芯片的自动载置台来对8条流道进行测定的方式。在8条流道的芯片中，由于是通过射出成型制备的，因此从制备上流道间的限制来看，将8条份的移动距离设为5mm。载置台的移动，通过图像识别将激光的照射位置调节到第一端的No1流道上。然后，用一定压力对与No1流道连接的上游贮液室加压，仅使样品液在No1流道中流动，开始检测。No1流道的检测结束后，向连接于No1上的上游贮液室的加压设为0，使其为大气压。然后移动载置台，使激光照射位置调节到No2流道上，对连接在No2流道上的贮液室加压，开始检测。直 至No8流道依次重复上述操作。测定中的侧方散射光，将平面基板的端面在约为45度的斜面上向下反射，入射到设置于下侧的由透明树脂形成的导光块45上，经由连接在导光块上的光纤，利用带通滤波器43，用光检测器44仅检测与照射激光相同波长的光。在两端的导光块集光后检测得到的侧方散射信号，进行求和检测。图7表示两端的测定散射光用两个检测器进行检测，变为信号后检测总和的方法。与此相对，也可以使连接在两端导光块上的光纤接合到一个检测器上进行检测。导光块45的宽度，由于在8条流道的芯片中，需要比8条份的移动距离大，因此设定为10mm。如上所述，实现了以下装置，在一次性芯片型的8流道芯片中，用一个芯片连续检测8个待测样品的前方散射、侧方散射和多个荧光信号检测。
[0163] 如图6所示，在一个透明的平面基板上形成有多个流道，连接在上游侧贮液室30与下游侧贮液室34上。为了避免贮液室在各流道间样品液相混合，贮液室为每个流道隔开的结构。图7表示该芯片的截面图与测定光学系统。测定光学系统中利用透镜51的检测光学系统几乎与图5相同，但增加了对流道进行图像观察的光学系统。其为1％反射镜、成像用透镜81与相机82。在此，通过图像识别来掌握流道与激光照射位置的关系，反馈给载置台的移动，从而能够自动调节激光位置与流道的位置。激光与检测光学系统为固定状态，在自动载置台上，通过步进重复扫描依次照射芯片的各流道的中心区域。侧方散射光将平面基板的端面在约为45度的斜面上向下反射，入射到设置于下侧的由透明树脂形成的导光块45上，经由连接在导光块上的光纤，利用带通滤波器43，仅透射与照射激光相同波长的光，并用光检测器44检测。
[0164] 图8a)表示多个流道中，激光照射左端的流道中心的情况下，芯片与两端导光块间的位置关系。图8b)表示多个流道中，激光照射右端的流道中心的情况下，芯片与两端导光块间的位置关系。将导光 块的扫描方向的宽度设为比扫描范围的距离大的值，以使在任何情况下，在两端反射的侧方散射光均入射到导光块上。进一步地，将在两端导光块上集光检测到的侧方散射信号进行加法运算，从而降低检测到的侧方散射光的检测灵敏度对各流道的依赖性。作为求和的方法，也可以将连接于两端导光块上的光纤直接接合到一个检测器上。
[0165] 3)作为准确检测测定样品液中所包含的粒子浓度的方法的本发明的细胞分离方法及装置
[0166] 下面，使用图6与图9，对准确检测溶液中粒子浓度的方法的实施例进行说明。为了准确测定浓度，对投入到样品液贮液室中的样品液量全部进行检测，用计数的细胞除以液量。因此，采取以下方法，在包含气泡的状态下测定样品液的总量，测定后将气泡从数据中去除，从而准确检测细胞浓度。图6中的样品液贮液室31的容量为100μL。因此，将包含细胞的50μL样品液加入样品液贮液室31中，测定时间设为6分钟，流量设为10μL/min。于是，约5分钟时样品液消失，约1分钟为包含气泡的检测。图9a)为测定被称为MCF-7的来自乳癌的细胞，但由于测定了样品液整体而含有气泡。气泡是在样品液消失后，被样品贮液室挤压的空气在流道内形成的，并通过测定区域，使检测数增大。比细胞大的分布(前方散射信号FS大)在样品溶液消失后，产生图9a)的A分布。
[0167] 测定后，从测常数据中去除检测时刻后的数据时，可知能够在保留细胞分布或细胞以外的异物的状态下去除A分布。这是由于A分布为在测量的后半段，来自于样品液消失时刻之后所产生的气泡的分布。进一步地，能够判断与A分布一同被去除的分布为来自气泡的分布。
[0168] 在一次性芯片中，流道连接于样品液贮液室的下侧。在样品液贮液室中加入100微升，检测全部的该样品液，设定粒子的计数为10000个，则应该能够导出粒子的浓度为100000个/毫升。但是，这在现 有方法中是不可能的。即，从样品液消失后，马上以高频率产生表示与粒子不同分布的气泡，该气泡分布成为对粒子计数的障碍。在通常的流式细胞仪中，由于一般是从上方在样品液容器中吸出样品液的方式，因此不进行样品液总量的检测，也不能进行。因此，为了用一次性芯片来准确检测浓度，下面对不受气泡影响的检测样品液总量的方法进行叙述。由于气泡是在样品液消失之后产生，因此将检测时间从最后数据起按时间回溯，从检测到的数据中去除，从而能够获得去除了气泡分布的仅为粒子的数据。用作为本发明人的发明的专利文献14中记载的芯片检测全部样品液而获得的，包含气泡分布的数据如图9a)所示。横轴为前方散射，纵轴为荧光信号强度。图9b)为从全部数据中去除后部分检测时间的数据。可知前方散射光强度大的分布已被去除。关注来自该气泡的分布中的一个分布，若从检测的最后开始去除数据，直至该分布消失为止，则能够去除气泡。由此，能够测定全部样品液，能够求出准确的粒子浓度。
[0169] 4)流式细胞仪的多维数据分析方法及其显示方法和装置。
[0170] 图10(A)表示两种荧光检测信号FL1、FL2的波长区域与两种荧光分子A、B的光谱。在将细胞用A和B两种荧光分子进行荧光染色的情况下，对利用FL1和FL2的荧光信号求出细胞内的A分子与B分子的丰度的方法进行说明。荧光检测信号FL1与FL2之间，存在由荧光光谱的形状规定的关系。其为比例一定的关系。例如，荧光光谱A的FL1的检测波长区域的面积设为A1，FL2的检测波长区域的面积设为A2，则FL1与FL2的检测信号强度比为A1/A2。即，用数学式表达如下。
[0171] FL1/FL2＝A1/A2 (1)
[0172] 若变形为对数图表，则为
[0173] LogFL1＝LogFL2+Log(A1/A2) (2)
[0174] 同样地，荧光光谱B的情况下的FL1/FL2，其信号强度比为B1/ B2。即，[0175] FL1/FL2＝B1/B2 (3)
[0176] 若变形为对数图表，则为
[0177] LogFL1＝LogFL2+Log(B1/B2) (4)
[0178] 因此，在检测用荧光分子A进行了荧光染色的细胞的情况下，FL1与FL2的对数轴的散布图，为如图10(B)中黑圈所示的线性分布。同样地，在用荧光分子B进行了荧光染色的细胞的情况下，为白圈所示的线性分布。这样一来，在散布图中，荧光光谱不同的粒子，其纵轴的截距值分布于不同的直线上。下面，考虑荧光分子A与荧光分子B两者均存在的情况。将各自的数分别设为x和y，则信号强度FL1与FL2如下式5和式6所示。
[0179] FL1＝A1x+B1y (5)
[0180] FL2＝A2x+B2y (6)
[0181] 根据式5和式6得出下式。
[0182] LogFL1＝LogFL2+Log[(A1x+B1y)/(A2x+B2y)] (7)
[0183] 如图11(A)所示，该式表示存在于式2与式4所示的两条直线间的直线，根据x和y的比例，其位置会改变。
[0184] 取式5与式6的比，进行变形，则从FL1/FL2求出x/y，得到下式。
[0185] x/y＝[(B1/B2)-(FL1/FL2)]/[(FL1/FL2)-(A1/A2)](B2/A2) (8)[0186] 式8的右边第一项，B1/B2为用100％B进行染色的样品数据求得的常数，A1/A2为用100％A进行染色的样品数据求得的常数，FL1/FL2为样品的测定数据。第2项，是以相同分子数的A和B分别进行染色的样品的FL2比例求得的常数。因此，对于每个检测出的细胞，能够求出x/y的值。如图11(B)所示，将纵轴表示为FL1/FL2的对数比例，则该轴的值为依赖于x/y的分布。作为图11(B)的横轴，通过采用表示细胞大小的前方散射信号强度(FS)，能够同时表示x/ y信息与细胞大小信息。横轴也可以取FS意外的信号。本发明中，如该FL1/FL2那样，将成为分析重要的量的数据作为分析的指数(index)，表示为图表的轴，从而实现将多维信息汇总成一维信息并进行表示，以及通过对该指数设定阈值来实现定量判定。
[0187] 下面，对上述数据分析的实施例进行说明。图12中表示在使用透过生物膜的核染色剂SYTO9和不透过生物膜的核染色剂PI两种核染色剂并分析存活判定的情况下的现有分析方法。与此相对，本发明定义了用于存活判定的指数，以用该指数设定的阈值为基础自动进行存活判定。用图12和图13对该方法进行说明。FL1的波长区域约为500nm至550nm，FL2的波长区域为570nm至610nm。如图12的分布所示，现有的存活(LIVE)&死亡(DEAD)分析区分为存活分布(仅用SYTO9染色的分布)与死亡分布(用SYTO9与PI两者进行染色的分布)。这种区分方法依赖于人的图像识别。因此，本发明中，为了自动判定存活和死亡，制作了定量指数，在该指数上设定判定的阈值，作为区分存活与死亡的方法。具体地，为了分析细胞的存活&死亡，用透过细胞膜的核染色剂SYTO9与不透过细胞膜的核染色剂PI两种染色剂，用如下草案进行染色。准备在1mL的PBS中加入了1.5μL 3.34mM的SYTO9与1.5μL 30mM的PI的染色溶液，从该溶液中取2μL加入到200μL的样品液中，在黑暗条件下进行20分钟染色反应。
[0188] 图12为通过上述处理，将称为MCF-7的细胞进行染色并测量的结果。在该散布图中，存活分布为仅用SYTO9进行染色的细胞的分布，表示一个线性分布。另一方面，死亡分布由于利用细胞膜的破损而也被PI染色，因此为双重染色状态。在该分布中，SYTO9的染色量与PI的染色量之间的比例几乎一定。因此，死亡分布的位置与存活分布的位置相比向下方偏离，呈直线分布。
[0189] 下面如公式9所示，在考虑FL1/FL2时，其值的对数表示直线的纵轴截距。因此，FL1/FL2的对数，在比较存活分布的值与死亡分布 的值时，存活分布的值变大。图13为用上述方法调查抗菌剂对绿脓菌的效果的图表。其为使抗菌剂混入一定时间后，用SYTO9和PI染色20分钟，测定FL1/FL2的柱状图分布。在不混入抗菌剂的情况下，表示单一峰的分布，但如果混入抗菌剂，则产生小值的分布，如果提提高抗菌剂的浓度，则可得到小值的分布比例变大的结果。图13中用虚线表示的值为存活判定的阈值，其为通过预先分别测定100％活菌和100％死菌获得的分布界限来设定的值，以该阈值为基准，能够自动进行存活判定。因此，可知FL1/FL2作为自动判定存活的指数是有效的。若将上述内容用公式进行说明时，如下所示。如公式9所示，在考虑FL1/FL2时，如变形为公式10可知，该值的对数表示图12中图表直线的纵轴截距。因此，随着FL1/FL2从存活变化为死亡，能够推测到值会变小，因此适合作为存活分析的指数。
[0190] FL1/FL2＝△ (9)
[0191] LogFL1＝LogFL2+Log△ (10)
[0192] 图14为相对于目前用作存活分析的图12的散布图，将同一测定结果用使用了本发明的存活判定指数的散布图进行表示。将纵轴设为FL1/FL2，进一步地，将横轴设为表示细胞大小的前方侧散射强度信号FS，从而实现了将细胞的存活信息与细胞大小信息在一个二维散布图中进行表达。在该图14的散布图中，对于测定样品MCF-7细胞，表示出死亡细胞的大小小于存活细胞的大小的结果。
[0193] 如上上述，作为流式细胞仪的多维数据的表示方法，根据测定目的，采用由信号强度间的运算式定义的指数作为图表显示的轴，从而能够增加用二维散布图表达的信息量。图15为对细胞的两种表面标记，一个用FITC荧光标记抗体染色，另一个用PE荧光标记抗体染色的样品的测定数据中，用PE/(FITC+PE)作为纵轴，用FS作为横轴的表示例。在此，PE及FITC为荧光校正后的荧光量，是与各自的荧光分子数成比例的量。该指数是作为表示两种表面标记的表达比 例的量来进行定义的，图15为在一张图表中表示两种表面标记的表达比率对细胞大小依赖性的表示例。根据该指数的值，能够对每个细胞分析关于各个细胞的表达比例的过量和不足。此外，作为用来评价检测的细胞是一个细胞还是多个聚集的细胞的指数，可以定义(信号脉冲面积)/(信号脉冲时间长短)等。白细胞等浮游类细胞以单一细胞状态流动，但血液中的癌细胞等不限于以单一状态在血液中循环。在这种评价中，与是否聚集无关，需要评价细胞数。该指数在分析是否聚凝中发挥作用。
[0194] 如上上述，这种通过多个信号之间的运算，定义适合分析内容的指数，用该指数的值定量评价各个细胞的特性的方法具有很多优点。作为其优点有：通过将多维信息汇总为一个指数，能够用一个二维散布图表达基于三种以上信号的信息；通过预先对该指数设定判定阈值，实现对各个细胞的定量判定。该方法在定量医疗诊断中有效。
[0195] 工业实用性
[0196] 本发明适合用作无残留、无交叉污染的1)细胞分选仪、2)能够检测侧方散射光的流式细胞仪、3)准确检测细胞密度的装置、4)不需要荧光校正的多重染色分析装置，以及使用这些装置的细胞分离、分析方法等。
[0197] 附图标记说明
[0198] 1…样品液流道
[0199] 2…鞘液流道
[0200] 3…照射光
[0201] 4-1…分选流道(“拉”侧)
[0202] 4-2…分选流道(“推”测)
[0203] 5…分选贮液室
[0204] 6…过滤器
[0205] 7-1、7-2…电磁阀
[0206] 8-1…负压定压泵
[0207] 8-2…正压定压泵
[0208] 9-1…分离对象细胞
[0209] 9-2…非分离对象细胞
[0210] 10…样品液贮液室
[0211] 11…回收样品液贮液室
[0212] 20…鞘液贮液室
[0213] 22…鞘液用端口
[0214] 23…鞘液回收端口
[0215] 24…鞘液回收端口
[0216] 25…芯片用基板
[0217] 27…流道
[0218] 31…样品液贮液室
[0219] 32…鞘液用端口
[0220] 34…废液贮液室
[0221] 35…回收样品液贮液室
[0222] 36…样品液
[0223] 37…鞘液贮液室
[0224] 39-1、39-2…侧方散射检测用反射面
[0225] 40…激光束扫描区域
[0226] 41…流道
[0227] 50…激光光源
[0228] 51…物镜
[0229] 52…激光
[0230] 53…被分选流道4-1与4-2夹着的区域。
[0231] 54、55、56…二向色镜
[0232] 57、58、59…带通滤波器
[0233] 60…透射激光遮断用空间过滤器
[0235] 62、63…光电倍增管
[0236] 64…AD转换器
[0237] 69…AD转换器
[0238] 70…键盘
[0239] 71…显示装置
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