技术领域
[0001] 本
发明属于
生物技术领域，具体地说，本发明涉及一种纳米微粒多色多重检测试纸的制备方法。
背景技术
[0002] 核酸检测技术可以用来检测病原体核酸，包括DNA和RNA。比起常规的血清学检测，核酸检测是直接检测病原体的脱
氧核糖核酸或核糖核酸，具有特异性强、灵敏度高等特点，可以大幅提高病原体检出率、缩短检测窗口期，极大提高了监测效率。
[0003] 现在的核酸检测技术大多是基于PCR原理，如常见的包括
荧光定量PCR(RealtimefluorescencequantitativePCR，RTFQPCR)技术，依赖核酸序列的扩增技术(NucleicAcidSequence-basedAmplification，NASBA)，滚环扩增技术
(RollingCircleAmplification，RCA)，环介导等温扩增技术(Loop-
mediatedIsothermalAmplification，LAMP)，转录介导的扩增技术
(TranscriptionMediatedAmplifi-cation，TMA)等。无论是荧光定量PCR还是其它PCR扩增技术，在检测核酸时都要借助高端、昂贵的仪器设备，操作复杂，监测条件要求高，而且很难实现病原体的多重检测。因此，本领域技术人员致
力于开发一种操作简单、快速、价格低廉，可实现多重核酸检测的技术。
发明内容
[0004] 本发明的目的在于提供一种纳米微粒多色多重检测试纸及其制备方法。
[0005] 本发明的第一方面，提供了一种用于核酸检测的纳米微粒检测试纸的制备方法，包括步骤：
[0006] (1)提供指示探针
[0007] 所述指示探针被设置用于与目标核酸序列的第一互补结合区特异性结合，所述指示探针的5’端结合有显色纳米微球结合，所述指示探针的3’端结合有生物素；
[0008] (2)提供捕获探针
[0009] 所述捕获探针被设置用于与目标核酸序列的第二互补结合区特异性结合，并且所述第一互补结合区和所述第二互补结合区至少间隔3个核苷酸；
[0010] (3)试纸条的制备
[0011] 所述试纸条包括依次排布的上样区、检测区、和吸
水区；所述检测区靠近所述上样区一侧包括检测线，所述检测线固定有所述捕获探针，所述检测区靠近所述吸水区一侧包括质控线，所述质控线固定有链霉亲和素。
[0012] 优选地，所述目标核酸序列数目≥2个；所述指示探针分别对应于各目标核酸序列，并且各指示探针5’端结合有不同
颜色的显色纳米微球；所述捕获探针分别对应于各目标核酸序列，并且各捕获探针一次分别固定于所述检测区的不同
位置。
[0013] 优选地，所述目标核酸序列数目≥3个，更优选地所述目标核酸序列数目≥5个。
[0014] 优选地，所述指示探针包括10～50个核苷酸。
[0015] 优选地，所述捕获探针包括10～50个核苷酸。
[0016] 优选地，所述步骤(3)中，将所述捕获探针固定于
硝酸纤维素膜上靠近所述上样区一侧形成所述检测线，将链霉亲和素固定于硝酸
纤维素膜上靠近所述吸水区一侧形成所述质控线。
[0017] 优选地，所述步骤(3)中，先使用CaCl2溶液在硝酸纤维素膜上划线，两条线之间的距离≥1.5mm，干燥后78℃～82℃
烘烤15min～20min；将捕获探针和链霉亲和素溶于水后划于CaCl2溶液划线上，干燥后60℃～65℃烘烤1h～2h。
[0018] 优选地，所述步骤(3)中，CaCl2溶液
质量分数为5％～15％。
[0019] 优选地，所述步骤(3)中，CaCl2溶液划线宽度为1mm。
[0020] 优选地，所述步骤(3)中，CaCl2溶液质量分数为10％。
[0021] 应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如
实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
[0022] 图1显示了本发明的纳米微粒多色多重检测试纸的结构。
[0023] 图2显示了本发明的纳米微粒多色多重检测试纸的检测原理。
具体实施方式
[0024] 本发明将可以捕获目标基因(DNA、RNA)的单链DNA序列(捕获探针)固定在硝酸纤维素膜的特
定位置上，质量控制区域固定链霉亲和素。另外，可以和该目标基因的其他位点序列互补的单链DNA被用作DNA探针，该单链DNA探针的两段分别与生物素和特定颜色的纳米微球相偶联成为指示探针。当目标基因、指示探针同时存在并和硝酸纤维素膜上的捕获探针相互作用，携带颜色的纳米微球被富集到捕获探针的位置，从而观察到特定位置颜色的变化。而当目标基因不存在时捕获探针所在的特定位置颜色不发生变化。
[0025] 在一张硝酸纤维素膜上的不同位置同时放置不同的捕获探针，而与之对应的指示探针携带不同颜色的纳米微球，这些指示探针在同一个体系中和目标基因结合，然后同时与已经固定有捕获探针的硝酸纤维素膜作用，捕获探针显色处则该目标基因为阳性，质控区域由于捕获了未结合指示探针而呈现特定的颜色(根据探针数量和携带颜色而不同，如黑色)。
[0026] 适用范围与优势：
[0027] PCR扩增产物分析，可替代PCR产物琼脂糖凝胶
电泳分析，具有操作简单、检测时间短、结果直观、可同时分析多个大小相近产物，结果保存时间长等优点；进行核酸杂交分析，较普通杂交分析具有
分辨率更高、结果更直观等优势；用于核酸
信号放大系统，高分辨率分析核算信号，避免出现分析误差，具有检测周期短、技术要求低、误差小等优势。
[0028] 根据本发明的纳米微粒多色多重检测试纸根据以下原理设计：
[0029] 1.探针设计
[0030] 捕获探针：可与目标核酸序列的特定区域特异性互补结合。
[0031] 指示探针：5‘端与多色的纳米微粒结合，3’端与生物素结合，序列与目标核酸序列特定区域特异性互补结合(区别于捕获探针区域)。
[0032] 2.显色膜设计
[0033] 条形：从左到右依次为“上样区”、“试纸区”、“吸水区”。试纸区从左到右依次用特异的捕获探针划线，干燥后热烤的方式固定，最右端用链霉亲和素划线作为质控线。
[0034] 3.指示探针捕获目标基因
[0035] 单链目标基因直接室温反应20分钟。
[0036] 双链目标基因90℃反应5分钟，迅速降温至室温。
[0037] 4.显色试纸反应
[0038] 条形：指示探针捕获后的反应体系加到上样区，1-10分钟后观察各条检测线和质控线的显色情况。
[0039] 5.结果分析
[0040] 质控线(颜色根据多色微球的数量确定)反应作为反应可信的
基础。在此基础上检测线或检测点显示正确的颜色的为阳性，不显色或显色与设计颜色不同为阴性或错误检测。
[0041] 上述探针均可用人工合成的方法进行制备，可以采用本领域的已知技术将指示探针与显色纳米微粒(微球)的结合，以及和生物素进行结合。探针的合成以及探针与标记物的结合，一般委托商业化的生物科技公司完成。
[0042] 下面结合具体实施例，进一步陈述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条件如美国Sambrook.J等著《分子克隆实验室指南》(黄培堂等译，北京：科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。以下实施例中所用的实验材料和
试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。
[0043] 实施例1试纸条分析目标基因
[0045] A、5’ATCTAGGTACTCTAGGACTAATAGCCAACCGCTACT 3’(SEQ ID NO.1)
[0046] B、5’CCTAAGTCATGGCTTGAATCTGAGTCCTGAATCT 3’(SEQ ID NO.2)
[0047] C、5’AGAGTTCGAATCGTACAAGTTACTACGTATATCGT 3’(SEQ ID NO.3)
[0048] D、5’TGAACGTCCAGTGCAGTACTGCCTCGAGTCGACTT 3’(SEQ ID NO.4)
[0049] E、5’TCGACTGCTAGTCAGACACAGGATCAATCCAATGCA 3’(SEQ ID NO.5)
[0050] 以上全为人工序列，为单链DNA序列，由上海捷瑞
生物工程有限公司合成。将这些序列溶解后进行不同组合的混合，将混合的不同组合做好标记。
[0051] (二)指示探针
[0052] 人工合成如下指示探针a、b、c、d、e，分别与步骤(一)中的目标基因片段A、B、C、D、E的5’端下划线部分互补
配对：
[0053] a、5’CTAGAGTACCTAGAT 3’(SEQ ID NO.6)(绿色微球)
[0054] b、5’AAGCCATGACTTAGG 3’(SEQ ID NO.7)(红色微球)
[0055] c、5’TACGATTCGAACTCT3’(SEQ ID NO.8)(蓝色微球)
[0056] d、5’TGCACTGGACGTTCA 3’(SEQ ID NO.9)(紫色微球)
[0057] e、5’CTGACTAGCAGTCGA 3’(SEQ ID NO.10)(黄色微球)
[0058] 以上人工序列5’端以
氨基、羧基的方式连接不同颜色的显色纳米微球，3’端以生物素标记，人工序列的合成和标记由上海捷瑞生物工程有限公司完成。将5个彩色微球标记的序列混合，记作“指示探针
混合液”。
[0059] (三)捕获探针
[0060] 人工合成如下指示探针a’、b’、c’、d’、e’，分别与步骤(一)中的目标基因片段A、B、C、D、E的3’端下划线部分互补配对：
[0061] a’、5’AGTAGCGGTTGGCTATTA 3’(SEQ ID NO.11)
[0062] b’、5’AGATTCAGGACTCAG 3’(SEQ ID NO.12)
[0063] c’、5’ACGATATACGTAGTA 3’(SEQ ID NO.13)
[0064] d’、5’AAGTCGACTCGAGGC 3’(SEQ ID NO.14)
[0065] e’、5’TGCATTGGATTGATC 3’(SEQ ID NO.15)
[0066] 以上序列全为人工序列，由上海捷瑞生物工程有限公司合成。
[0067] (四)试纸条制备：
[0068] 将CaCl2溶于水中(质量分数为10％)，然后使用CaCl2溶液在硝酸纤维素膜上划线，划线宽度1mm，两条线的间隔距离为2mm，划线位置即为后续捕获探针的固定位置，干燥后80℃烘烤20min；将上述制备的捕获探针a’、b’、c’、d’、e’和链霉亲和素溶于水(50μg/ml)后，划于CaCl2溶液划线上(划线宽度1mm，两条线的间隔距离为2mm)，干燥后60℃烘烤2小时。在硝酸纤维素膜左侧设置上样区，右侧与吸水纸相连。
[0069] 本
发明人在研究中发现，短的核苷酸序列(低于100bp)很难牢固的固定于硝酸纤维素膜上，捕获探针固定不良会导致后续检测过程中，条带弥散，甚至无法显示条带，近而出现假阴性的结果。经过反复试验，
申请人发现，先用CaCl2溶液在硝酸纤维素膜上划线，烘烤后在相同位置使用捕获探针进行划线，能够非常牢固的将较短的核苷酸序列固定于硝酸纤维素膜。经过优化，确定了最优的CaCl2溶液浓度(质量分数)为5％～15％，CaCl2溶液划线后烘烤条件为78℃～82℃烘烤15min～20min。
[0070] (五)目标基因检测：
[0071] 1、序列标记：向目标基因的混合物100μl中加入指示探针混合液100μl，充分混合，室温反应20分钟。
[0072] 2、上样：将试纸条平放，反应液加到左侧的上样区，等待液体逐渐往右侧吸水纸移动。
[0073] 结果判定：反应完毕，以最右侧黑色条带为系统质控标志，若最右侧条带为黑色则进行分析其他条带。其他条带区域颜色与设计颜色一致或无色则可进一步分析。颜色显色与设计条带颜色一致的显色条带，表示样本目标条带阳性。条带无颜色，表示样本目标条带阴性，如图2所示。
[0074] 在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或
修改，这些等价形式同样落于本申请所附
权利要求书所限定的范围。
