一种立克次体多重荧光PCR检测方法
阅读：1029发布：2020-05-12
专利汇可以提供一种立克次体多重荧光PCR检测方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开一种立克次体多重 荧光 PCR检测方法，涉及PCR检测领域,从引物探针的特异性、反应体系的关键因子、质控构建等多个方面对多重荧光PCR进行了探索研究，建立了流行性斑疹伤寒、地方性斑疹伤寒、Q热3种立克次体多重实时荧光定量PCR方法，明显提高了三种立克次体检测的灵敏性和特异性，而且大大缩短三种立克次体病原体的检测周期，对于提高国境口岸的检疫通关速度，阻止传染病在国境口岸传入传出，成功应对突发公共卫生事件，保卫人民的生命和财产安全，具有重大的意义。，下面是一种立克次体多重荧光PCR检测方法专利的具体信息内容。
1.一种用于立克次体多重荧光PCR检测方法的引物探针组，其特征在于，该引物探针组包括三对引物探针；
三对引物探针分别命名为：
Q-F1——Q-R1——Q-P1；
PROW-F3——PROW-R3——PROW-P3；
TYPHI-F2——TYPHI-R2——TYPHI-P2；
三对引物探针序列为：
一种立克次体多重荧光PCR检测方法
技术领域
[0001] 本发明涉及PCR检测领域，更具体的说是涉及一种立克次体多重荧光PCR检测方法。
背景技术
[0002] 立克次体，是一种原核微生物，细胞多为球杆形，大小介于细菌和病毒之间，在真核细胞内营专性寄生（除个别外）。在自然界中主要在啮齿类动物（鼠类）和家畜（牛、羊、犬）等贮存宿主内繁殖。虱、蚤、蜱、螨等吸血节肢动物为主要传播媒介。
[0003] 立克次体引起的立克次体病是一种严重威胁人类健康的人兽共患自然疫源性传染病。立克次体病的主要临床表现是发热、头痛、全身不适和皮疹（Q热除外）等非特异临床症状，呈急性表现。由于缺乏典型临床表现，极易误诊为病毒类疾病和不明原因发热，而且各种立克次体对临床常用抗生素如抗细菌类青、链霉素，抗病毒类抗生素普遍不敏感，易导致病情加重，延误治疗。因此建立立克次体病快速准确的诊断方法尤为必要。然而，立克次体营养要求较高、难以培养，通常需要细胞及组织培养，给其实验室诊断带来一定的困难。目前实验室诊断方法包括血清学、病原学和分子生物学。血清学诊断在发病一周内往往检测不到抗体，不能用于早期诊断；而病原学诊断操作复杂，其分离率较低；目前基于PCR检测技术的分子生物学检测方法是最常用的特异快速早期诊断依据。
[0004] 荧光PCR技术作为一种高灵敏度、简便快速的检测方法已经在许多领域得到广泛应用，尤其是在立克次体检测方面成为快速检测、确诊的有效工具，但在实验室检测中，当样品量非常大时，单重荧光PCR在成本和时间方面就存在一定的劣势，迫切需要一种高通量、低成本、高效率的方法来进行批量的快速检测。为了克服单重荧光PCR的不足，同时采用多对引物扩增检测多个模板的多重荧光PCR应运而生。
[0005] 多重PCR的优点：(1)高效性，在同一反应管内同时检出多种病原菌或对多个目的基因进行扩增分析；(2)系统性，多重PCR很适宜对症状相同或易污染相同食品的一组病原菌进行分析；(3)经济简便性，多种病原菌在同一反应管中同时检出，将大大节省检测时间和试剂，为临床或食品安全检测提供更多更准确的信息；相对于单重荧光PCR，多重荧光PCR必须保证其灵敏度不低于单重荧光PCR的水平；避免各个引物对之间的相互干扰和各目的片段之间的非特异性扩增；引物和探针都要有相近的退火温度，使各目的片段有相近的扩增效率；还要保证不同探针所标记的荧光基团间无相互干扰，以及荧光PCR仪有相应的多个检测通道。
[0006] 综上所述，现有技术中，立克次体的传统检测方式存在着检测慢、诊断操作复杂的劣势；单重荧光PCR在成本和时间方面就存在一定的劣势；多重PCR虽然是快速检测病原体的有效手段，但因为引物探针的设计、反应体系的探索、质控的构建等诸多因素导致PCR灵敏度、稳定性和特异性降低，造成检测结果的误差，所以难以在临床、检验确诊领域推广。
发明内容
[0007] 本发明提供一种立克次体多重荧光PCR检测方法，拟将多重PCR方法和荧光定量方法相结合，解决多重PCR检测的灵敏性、稳定性和特异性差的问题，克服单重荧光PCR在成本和时间方面存在的劣势，使得PCR检测既能同时诊断多种常见的立克次体病原体，又满足流行病学调查和快速检验的需求。
[0008] 为解决上述的技术问题，本发明采用以下技术方案：
[0009] 一种立克次体多重荧光PCR检测方法，包括如下步骤：
[0010] （1） 提取DNA；
[0011] （2） 设计引物和荧光探针，根据 TaqMan荧光探针PCR检测方法，确定引物和荧光探针的设计原则，分析Q热立克次体、普氏立克次体、莫氏立克次体基因的序列，针对每种病原体各设计三组引物和探针，探针分别标记不同染料，其中Q热立克次体探针荧光基团为FAM，猝灭基团为BHQ1；普氏立克次体探针荧光基团为HEX，猝灭基团为BHQ1；莫氏立克次体探针荧光基团为CalRed610，猝灭基团为BHQ2；设计的引物探针分别命名为：
[0012] Q-F1——Q-R1——Q-P1
[0013] Q-F2——Q-R2——Q-P2
[0014] Q-F3——Q-R3——Q-P3
[0015] PROW-F1——PROW-R1——PROW-P1
[0016] PROW-F2——PROW-R2——PROW-P2
[0017] PROW-F3——PROW-R3——PROW-P3
[0018] TYPHI-F1——TYPHI-R1——TYPHI-P1
[0019] TYPHI-F2——TYPHI-R2——TYPHI-P2
[0020] TYPHI-F3——TYPHI-R3——TYPHI-P3
[0021] （3） 合成阳物对照品：化学合成含目的扩增片段序列的质粒作为阳性对照品，将合成的产物分别命名为Q-Z1、Q-Z2、Q-Z3；PROW-Z1、PROW-Z2、PROW-Z3；TYPHI-Z1、TYPHI-Z2、TYPHI-Z3，分别对应每种病原体的三组引物探针；
[0022] （4） 配制阳物对照品：将Q-Z1按100000倍稀释后作为阳性对照品，标记为 Q-Z11，取Q-Z11稀释10倍，得到Q-Z12；再取Q-Z12稀释10倍，得到Q-Z13；再取 Q-Z13稀释10倍，得到Q-Z14；
[0023] 按照上面的稀释方法分别将Q-Z1、Q-Z2、Q-Z3；PROW-Z1、PROW-Z2、PROW-Z3；TYPHI-Z1、TYPHI-Z2、TYPHI-Z3分别稀释成：
[0024] Q-Z11、Q-Z12、Q-Z13、Q-Z14
[0025] Q-Z21、Q-Z22、Q-Z23、Q-Z24
[0026] Q-Z31、Q-Z32、Q-Z33、Q-Z34
[0027] PROW-Z11、PROW-Z12、PROW-Z13、PROW-Z14
[0028] PROW-Z21、PROW-Z22、PROW-Z23、PROW-Z24
[0029] PROW-Z31、PROW-Z32、PROW-Z33、PROW-Z34
[0030] TYPHI-Z11、TYPHI-Z12、TYPHI-Z13、TYPHI-Z14
[0031] TYPHI-Z21、TYPHI-Z22、TYPHI-Z23、TYPHI-Z24
[0032] TYPHI-Z31、TYPHI-Z32、TYPHI-Z33、TYPHI-Z34
[0033] （5） 选择引物和荧光探针，用每个病原体的三组引物和探针分别扩增各自对应的稀释好的阳性对照品，观察它们扩增的能力来确定最佳引物探针组；取稀释的三组质粒分别作为各自对应引物探针检测的样品，每组各浓度样本重复2次；
[0034] （6） 对多重荧光PCR检测体系进行优化，最初的荧光PCR检测体系为40μL体系，最初的荧光PCR检测循环参数设置为：94℃×2min，1个循环；94℃×15s→60℃×1min（荧光采集），40个循环； 优化探针用量，根据基本荧光PCR体系的扩增情况，对探针的用量进行调整，分别选择每条探针(20μM)体积 0.2μL、0.1μL、0.05μL进行优化，以对应的质粒作为检测样本，每组样本重复 2次； 优化Mg2+用量，根据基本荧光 PCR 体系的扩增情况，对Mg2+的用量进行调整，分别选择MgCl2(25 mM) 5μL、4μL、3.2μL进行优化； 优化反应条件，根据引物和探针的退火温度，分别选择 58℃、60℃、62℃进行优化。
[0035] （7） 对多重荧光PCR反应体系的方法学验证，①灵敏度验证，将约为10copies/mL5 4 3 3 2
质粒原液分别稀释成 10、10、5×10、10、5×10浓度，经优化好的体系确定该检测方法的灵敏度，且每组各浓度样本重复 2次；②稳定性验证，选择合适的质粒浓度重复10次进行稳定性验证；③特异性验证，以Q热立克次体、普氏立克次体、莫氏立克次体、土拉热弗朗西丝菌、鼠疫耶尔森氏菌 EV76株DNA为模板进行特异性验证；④模拟标本验证，以不携带立克次体的鼠体标本作为实验模板，将添加质粒的鼠体标本和不加质粒的鼠体标本作为对照，同时提取 DNA进行检测。
质粒原液分别稀释成 10、10、5×10、10、5×10浓度，经优化好的体系确定该检测方法的灵敏度，且每组各浓度样本重复 2次；②稳定性验证，选择合适的质粒浓度重复10次进行稳定性验证；③特异性验证，以Q热立克次体、普氏立克次体、莫氏立克次体、土拉热弗朗西丝菌、鼠疫耶尔森氏菌 EV76株DNA为模板进行特异性验证；④模拟标本验证，以不携带立克次体的鼠体标本作为实验模板，将添加质粒的鼠体标本和不加质粒的鼠体标本作为对照，同时提取 DNA进行检测。
[0036] 与现有技术相比，本发明的有益效果是：
[0037] （1）建立了流行性斑疹伤寒、地方性斑疹伤寒、Q热3种立克次体多重实时荧光定量PCR方法；
[0038] （2）明显提高了三种立克次体检测的灵敏性、稳定性和特异性，大大缩短三种立克次体病原体的检测周期；
[0040] 图1为组1的Q热立克次体引物和荧光探针检测结果图；
[0041] 图2为组2的Q热立克次体引物和荧光探针检测结果图；
[0042] 图3为组3的Q热立克次体引物和荧光探针检测结果图；
[0043] 图4为组4的普氏立克次体引物和荧光探针检测结果图；
[0044] 图5为组5的普氏立克次体引物和荧光探针检测结果图；
[0045] 图6为组6的普氏立克次体引物和荧光探针检测结果图；
[0046] 图7为组7的莫氏立克次体引物和荧光探针检测结果图；
[0047] 图8为组8的莫氏立克次体引物和荧光探针检测结果图；
[0048] 图9为组9的莫氏立克次体引物和荧光探针检测结果图；
[0049] 图10为三种立克次体探针用量优化检测结果图；
[0050] 图11为三种立克次体 Mg2+用量优化检测结果图；
[0051] 图12为反应条件1的优化检测结果图；
[0052] 图13为反应条件2的优化检测结果图；
[0053] 图14为反应条件3的优化检测结果图；
[0054] 图15为Q热立克次体灵敏度验证结果图；
[0055] 图16为普氏立克次体灵敏度验证结果图；
[0056] 图17为莫氏立克次体灵敏度验证结果图；
[0057] 图18为三重荧光PCR特异性验证结果图；
[0058] 图19为模拟标本验证结果图；
具体实施方式
[0059] 本发明的应用原理、作用与功效，通过如下实施方式予以说明。
[0060] 实施例1
[0061] 本发明提供的一种立克次体多重荧光PCR检测方法，包括如下步骤：
[0062] (1)提取DNA，采用经典的酚-氯仿法提取 DNA，具体步骤如下：
[0063] ①取适量动物组织放入 0.5 mL离心管中，置于200 µL TE缓冲液中窝旋震荡、离心、弃上清；再加入200 µL TE浸泡1h～3 h以去除乙醇的影响（新鲜样品不需浸泡；2年以上标本浸泡过夜）、离心、弃上清；
[0064] ②加入10 µL STE+PK溶液，用烧熔的枪头研磨至溶液状态，再加190 µL（标本量大时加 390 µL）STE+PK溶液,混匀以分离组织；将离心管置于55℃旋转混合仪上水浴消化 2～3小时以消化蛋白；
[0065] ③加入等体积饱和酚，上下颠倒混匀，12 000 rpm离心3min，取上清于另一离心管中；加入等体积酚/氯仿（1/1），上下颠倒混匀，12 000 rpm离心3 min，取上清于另一离心管中，加入氯仿/异戊醇（体积比为24/1），上下颠倒混匀，12 000rpm离心3 min，取上清于另一离心管中，以上步骤为了尽可能地去除蛋白及杂质，但要防止酚、氯仿、异戊醇对样品的污染；
[0066] ④加入 1/10体积预冷 ，3M NaAc和2倍体积预冷无水乙醇，上下颠倒混匀，沉淀过夜或-20℃半小时使 DNA析出，12 000 rpm低温离心15 min，弃上清，加入70%乙醇，用手指轻弹管壁（至沉淀浮起），12 000rpm低温离心15 min，弃尽上清；自然干燥或 55℃温箱干燥约 10 min，加入 50 µL或25 µL TE（或灭菌水）溶解 DNA，-4℃冰箱保存备用；
[0067] (2)设计引物和荧光探针，根据 TaqMan荧光探针 PCR检测方法，确定引物和荧光探针的设计原则，所述定引物和荧光探针的设计原则为： 引物和探针的长度：每条引物长度为 18～25个碱基，荧光探针长度为20～30个碱基； 引物和探针中GC%要求在 30%～70％，且荧光探针的Tm值应高于引物的Tm值5℃以上； 引物和探针自身、引物和探针之间的 3'端尽可能避免碱基配对；④引物和探针自身、引物和探针之间尽可能避免 6对以上的连续碱基配对；⑤选用的引物和探针要求设计在靶基因中的保守区，和其它物种无交叉反应；⑥探针位于一对引物之间的区域；⑦多个引物间避免形成二聚体，尤其是在3'端；⑧多个引物和探针的退火温度接近；⑨扩增的目的片段长度有差异，但是差异不大；遵循上述设计原则，分析Q热立克次体、普氏立克次体、莫氏立克次体基因的序列，针对每种病原体各设计三组引物和探针，探针分别标记不同染料，其中Q热立克次体探针荧光基团为FAM，猝灭基团为BHQ1；普氏立克次体探针荧光基团为HEX，猝灭基团为BHQ1；莫氏立克次体探针荧光基团为CalRed610，猝灭基团为BHQ2；设计的引物探针分别命名为：
[0068] Q-F1——Q-R1——Q-P1
[0069] Q-F2——Q-R2——Q-P2
[0070] Q-F3——Q-R3——Q-P3
[0071] PROW-F1——PROW-R1——PROW-P1
[0072] PROW-F2——PROW-R2——PROW-P2
[0073] PROW-F3——PROW-R3——PROW-P3
[0074] TYPHI-F1——TYPHI-R1——TYPHI-P1
[0075] TYPHI-F2——TYPHI-R2——TYPHI-P2
[0076] TYPHI-F3——TYPHI-R3——TYPHI-P3
[0077] 设计的引物探针序列如表1：
[0078] 表1 引物探针序列
[0079]
[0080] (3)合成阳物对照品：化学合成含目的扩增片段序列的质粒作为阳性对照品，将合成的产物分别命名为Q-Z1、Q-Z2、Q-Z3；PROW-Z1、PROW-Z2、PROW-Z3；TYPHI-Z1、TYPHI-Z2、TYPHI-Z3，分别对应每种病原体的三组引物探针；
[0081] (4)配制阳物对照品：将Q-Z1按100000倍稀释后作为阳性对照品，标记为Q-Z11，取Q-Z11稀释10倍，得到Q-Z12；再取Q-Z12稀释10倍，得到Q-Z13；再取 Q-Z13稀释10倍，得到Q-Z14；
[0082] 按照上面的稀释方法分别将Q-Z1、Q-Z2、Q-Z3；PROW-Z1、PROW-Z2、PROW-Z3；TYPHI-Z1、TYPHI-Z2、TYPHI-Z3分别稀释成：
[0083] Q-Z11、Q-Z12、Q-Z13、Q-Z14
[0084] Q-Z21、Q-Z22、Q-Z23、Q-Z24
[0085] Q-Z31、Q-Z32、Q-Z33、Q-Z34
[0086] PROW-Z11、PROW-Z12、PROW-Z13、PROW-Z14
[0087] PROW-Z21、PROW-Z22、PROW-Z23、PROW-Z24
[0088] PROW-Z31、PROW-Z32、PROW-Z33、PROW-Z34
[0089] TYPHI-Z11、TYPHI-Z12、TYPHI-Z13、TYPHI-Z14
[0090] TYPHI-Z21、TYPHI-Z22、TYPHI-Z23、TYPHI-Z24
[0091] TYPHI-Z31、TYPHI-Z32、TYPHI-Z33、TYPHI-Z34
[0092] (5)选择引物和荧光探针，用每个病原体的三组引物和探针分别扩增各自对应的稀释好的阳性对照品，观察它们扩增的能力来确定最佳引物探针组；取稀释的三组质粒分别作为各自对应引物探针检测的样品，每组各浓度样本重复2次。
[0093] 荧光PCR检测体系为40μL体系，荧光PCR检测循环参数设置为：94℃×2min，1个循环；94℃×15s→60℃×1min（荧光采集），40个循环,其组分如表2所示：
[0094] 表2 荧光PCR检测体系
[0095]
[0096] 其中，Q热立克次体引物和荧光探针检测结果如图1、图2和图3，由图可知Q热立克次体检测引物探针最优组合为Q-F1—Q-R1—Q-P1，如表3所示：
[0097] 表3 Q热立克次体引物和荧光探针检测结果
[0098]
[0099] 注：“+”表示检测结果为阳性，“-”表示检测结果为阴性。
[0100] 普氏立克次体引物和荧光探针检测结果如图4、图5和图6，由图可知普氏立克次体检测引物探针最优组合为PROW-F3— PROW-R3—PROW-P3，如表4所示：
[0101] 表4 普氏立克次体引物和荧光探针检测结果
[0102]
[0103] 注：“+”表示检测结果为阳性，“-”表示检测结果为阴性。
[0104] 莫氏立克次体引物和荧光探针检测结果如图7、图8和图9，由图可知莫氏立克次体检测引物探针最优组合为TYPHI-F2—TYPHI-R2—TYPHI-P2，如表5所示：
[0105] 表5 莫氏立克次体引物和荧光探针检测结果
[0106]
[0107] 注：“+”表示检测结果为阳性，“-”表示检测结果为阴性。
[0108] 综上，确定了Q热立克次体、普氏立克次体、莫氏立克次体三重荧光PCR检测方法的的引物探针最优组合分别为：Q-F1—Q-R1—Q-P1、PROW-F3— PROW-R3—PROW-P3、TYPHI-F2—TYPHI-R2—TYPHI-P2。
[0109] (6)对多重荧光PCR检测体系进行优化
[0110] ①优化探针用量，根据基本荧光PCR体系的扩增情况，对探针的用量进行调整，分别选择每条探针(20μM)体积 0.2μL、0.1μL、0.05μL进行优化，以对应的质粒作为检测样本，每组样本重复 2次，荧光PCR检测体系为40μL体系，三个组的反应体系组分设置如表6所示；以最终确定的引物探针对应的三组质粒作为检测样本，每组样本重复2次：
[0111] Q-Z11、Q-Z12、Q-Z13、Q-Z14
[0112] PROW-Z31、PROW-Z32、PROW-Z33、PROW-Z34
[0113] TYPHI-Z21、TYPHI-Z22、TYPHI-Z23、TYPHI-Z24
[0114] 表6 探针用量优化检测体系组分表
[0115]
[0116] 由图 10可以看出，只有组2的各样本检测阳性率均为100%，因此，将组 2 的探针用量定为试剂盒内的探针用量，即每条探针(20μM)用量为0.1μL。
[0117] 三种立克次体探针用量优化检测结果如表7所示：
[0118] 表7 三种立克次体探针用量优化检测结果汇总表
[0119]
[0120] ②优化Mg2+用量，根据基本荧光 PCR 体系的扩增情况，对Mg2+的用量进行调整，分别选择MgCl2(25 mM) 5μL、4μL、3.2μL进行优化；荧光PCR检测体系为40μL体系，三个组的反应体系组分设置如表8所示：
[0121] 表8 Mg2+用量优化检测体系组分表
[0122]
[0123] 以对应的梯度稀释质粒作为检测样本，每组样本重复2次：
[0124] Q-Z11、Q-Z12、Q-Z13、Q-Z14
[0125] PROW-Z31、PROW-Z32、PROW-Z33、PROW-Z34
[0126] TYPHI-Z21、TYPHI-Z22、TYPHI-Z23、TYPHI-Z24
[0127] 由图11可以看出，组1和组2各样本检测阳性率均为100%，但是如果当Mg2+浓度过高时，可能会影响其特异性，因此选择Mg2+浓度较低的组2作为最佳的浓度，即MgCl2(25 mM)用量为4.0μL。
[0128] 三种立克次体Mg2+用量优化检测结果如表9所示：
[0129] 表9 三种立克次体Mg2+用量优化检测结果汇总表
[0130]
[0131] ③优化反应条件，根据引物和探针的退火温度，分别选择58℃、60℃、62℃进行优化：
[0132] 反应条件 1：94℃×2min----1个循环
[0133] 94℃×15s→58℃×1min（荧光采集）----40个循环
[0134] 反应条件 2：94℃×2min----1个循环
[0135] 94℃×15s→60℃×1min（荧光采集）----40个循环
[0136] 反应条件 3：94℃×2min----1个循环
[0137] 94℃×15s→62℃×1min（荧光采集）----40个循环
[0138] 以对应的梯度稀释质粒作为检测样本，每组样本重复2次：
[0139] Q-Z11、Q-Z12、Q-Z13、Q-Z14
[0140] PROW-Z31、PROW-Z32、PROW-Z33、PROW-Z34
[0141] TYPHI-Z21、TYPHI-Z22、TYPHI-Z23、TYPHI-Z24
[0142] 根据探针和MgCl2用量优化结果，荧光PCR检测体系40μL设置如10所示：
[0143] 表10 反应条件的优化检测体系组分表
[0144]
[0145] 由图12、图13和图14可以看出，反应条件2中全部样品检测均为阳性，因此反应条件2的反应参数作为最终的反应参数，即荧光PCR检测循环参数设置为：94℃×2min，1cycle；94℃×15s→60℃×1min（荧光采集），40个循环；反应条件的优化检测结果如表11所示：
[0146] 表11 反应条件的优化检测结果汇总表
[0147]
[0148] 注：“+”表示检测结果为阳性，“-”表示检测结果为阴性。
[0149] 综上所述，优化后的多重荧光PCR检测体系如表10，优化后的反应条件为：94℃×2min，1cycle；94℃×15s→60℃×1min（荧光采集），40个循环。
[0150] (7)实施例3对多重荧光PCR反应体系的方法学验证
[0151] ①灵敏度验证，将约为10copies/mL质粒原液分别稀释成 105、104、5×103、103、5×102浓度，经优化好的体系确定该检测方法的灵敏度，以稀释好的阳性质粒为检测样本，每组各浓度样本重复2次；
[0152] 由图15、图16和图17可以看出，样本浓度为5×103copies/mL时，阳性检出率为100%；当样本浓度为 1×103copies/mL时，部分样本未检出；当样本浓度为 5×102copies/mL时，样本阳性率为 0%，具体如表12所示。
[0153] 表12 三种立克次体灵敏度验证结果汇总表
[0154]
[0155] 注：N/A表示未检出。
[0156] 以Ct值为纵坐标，模板拷贝数的对数值为横坐标做标准曲线，所得Q热立克次体Y=-2.80x+39.65，相关系数 R2=0.9904；普氏立克次Y=-2.9515x+40.868，相关系数R2=0.9914；莫氏立克次体 Y=-2.8915x+40.01，相关系数R2=0.9956。
[0157] 因此，三重荧光PCR 检测方法的分析灵敏度约为500copies/mL（5×103×4÷40）。
[0158] ②稳定性验证，选择合适的质粒浓度重复10次进行稳定性验证，选择105 copies/mL浓度质粒重复检测3次，由表13可以看出，Q热立克次体、普氏立克次体、莫氏立克次体的变异系数分别为1.29%，1.60%，1.97%，检测性能稳定，结果可靠，具有可靠的稳定性；
[0159] 表13三重荧光PCR稳定性验证结果
[0160]
[0161] ③特异性验证，以Q热立克次体、普氏立克次体、莫氏立克次体、土拉热弗朗西丝菌、鼠疫耶尔森氏菌EV76株DNA为模板进行特异性验证，于中国检验检疫科学院卫检所进行三种立克次体荧光PCR的特异性验证，如图18所示，Q热立克次体、普氏立克次体、莫氏立克次体出现特异性扩增，而土拉热弗朗西丝菌、鼠疫耶尔森氏菌EV76株未出现扩增；
[0162] ④模拟标本验证，以不携带立克次体的鼠体标本作为实验模板，将添加质粒的鼠体标本和不加质粒的鼠体标本作为对照，同时提取DNA进行检测，于中国检验检疫科学院卫检所开展模拟标本验证，由图19可以看出添加质粒的鼠体标本中检出Q热立克次体、普氏立克次体、莫氏立克次体，而不加质粒的鼠体标本未检出。
[0163] 反应结果应同时符合阴性对照无扩增曲线而阳性对照Ct<35有明显扩增曲线2个条件，否则，实验结果无效。
[0164] 阴性结果：普氏立克次体HEX通道无Ct值或Ct>40，且无明显扩增曲线，则判定为普氏立克次体核酸荧光PCR检测阴性；莫氏立克次体CalRed 610通道无Ct值或Ct>40，且无明显扩增曲线，则判定为莫氏立克次体核酸荧光PCR检测阴性；Q热立克次体FAM通道无Ct值或Ct>40，且无明显扩增曲线，则判定为Q热立克次体核酸荧光PCR检测阴性。
[0165] 阳性结果：普氏立克次体HEX通道Ct值≦38，并有明显扩增曲线，则判定为普氏立克次体核酸荧光PCR检测阳性；莫氏立克次体CalRed 610通道Ct值≦38，并有明显扩增曲线，则判定为莫氏立克次体核酸荧光PCR检测阳性；Q热立克次体FAM通道Ct值≦38，并有明显扩增曲线，则判定为Q热立克次体核酸荧光PCR检测阳性。
[0166] 可疑结果：普氏立克次体HEX通道Ct值在38～40之间的样本应重做，若重做结果仍然有明显扩增曲线，则判定为普氏立克次体核酸荧光PCR检测阳性，否则为阴性。莫氏立克次体CalRed 610通道Ct值在38～40之间的样本应重做，若重做结果仍然有明显扩增曲线，则判定为莫氏立克次体核酸荧光PCR检测阳性，否则为阴性。Q热立克次体FAM通道Ct值在 38～40之间的样本应重做，若重做结果仍然有明显扩增曲线，则判定为Q热立克次体核酸荧光PCR检测阳性，否则为阴性。
[0167] 综上所述，本实施例的灵敏度约为500copies/mL；Q热立克次体、普氏立克次体、莫氏立克次体的变异系数分别为1.29%，1.60%，1.97%，检测性能稳定，结果可靠，具有可靠的稳定性；Q热立克次体、普氏立克次体、莫氏立克次体出现特异性扩增，而土拉热弗朗西丝菌、鼠疫耶尔森氏菌EV76株未出现扩增，说明本发明具备特异性；添加质粒的鼠体标本中检出Q热立克次体、普氏立克次体、莫氏立克次体，而不加质粒的鼠体标本未检出，实验结果与预期一致。
[0168] 如上所述即为本发明的实施例。本发明不局限于上述实施方式，任何人应该得知在本发明的启示下做出的结构变化，凡是与本发明具有相同或相近的技术方案，均落入本发明的保护范围之内。
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