本发明背景

水肿可以描述为间隙流体体积的增加。这通常是反常的，典型的需 要寻求减轻病况。这种病况常常是由于内皮渗透性过高使液体离开血 液血管系统造成的，通常与大分子外渗并在间质空间找到新的住处相 关。

有多种生理和生化机制解释个体中水肿和水肿状态形成。在一个 或多个这些机制中，一种重要的媒介是“血管内皮细胞生长。这种因 子上调血管内皮细胞中的运输，并造成多种血管层诸如皮肤，皮下组 织，腹膜壁，肠系膜，横膈膜，气管，支气管，十二指肠和子宫等的 渗透性增加。显著的血球渗出，穿过内皮的交换的改变，大分子在这 些部位的渗出和沉积以及延长的血压过低可能伴随这种增加的渗透性 效应。认为这些过程是促进新血管形成的前奏。VEGF由炎性T-细胞， 巨噬细胞，噬中性粒细胞和噬曙红细胞等在发炎部位表达。这种因子 可由组织缺氧，某些血管加压激素，生长因子，生殖激素和多种炎性 细胞因子上调。已经暗示VEGF-介导的血管渗透性与诸如肿瘤腹水， 子宫内膜异位，成人呼吸窘迫综合征(ARDS)，后心肺旁路-相关的血 压过低和渗透性过高发疱，对烧伤和创伤的水肿反应，糖尿病中的内 皮功能紊乱，卵巢高刺激综合症并发症，以及眼部水肿等疾病有关。

这样，显而易见抑制VEGF产生或活性是有益的，特别是阻断上面 列举的疾病的表现。特别地，能够抑制VEGF介导的渗透性过高和水肿 以及相关综合征的药剂对于缓和这些疾病是有用的。

蛋白质酪氨酸激酶。蛋白质酪氨酸激酶(PTK)包括大量不同类的 有酶活性的蛋白质。PTKs在控制细胞生长和分化上有重要作用(综述 参看Schlessinger & Ullrich，1992，Neuron 9：383-391)。

已经表明PTK的异常刺激，表达或突变能导致不受控制的细胞增 殖(例如恶性肿瘤生长)或关键的发育，调节或修复过程的缺陷。因 此，生物医学团体花费相当的财力来发现PTK家族成员的专一生物作 用，它们在分化过程中的功能，它们对肿瘤发生和其它疾病的参与， 它们的配体刺激活化的信号转导途径的生物化学基础以及新药物的开 发。

酪氨酸激酶可以是受体型的(有胞外，穿膜和胞内结构域)或非 受体型的(完全是胞内的)。

受体酪氨酸激酶(RTK)。RTKs包括一大家族的有不同生物活性的 穿膜受体。目前，至少鉴定了19个不同的RTK亚家族。受体酪氨酸激 酶(RTK)家族包括对多种细胞类型的生长和分化至关重要的受体 (Yarden和Ullrich，Ann.Rev.Biochem.57：433-478，1998；Ullrich 和Schlessinger，Cell 61：243-254，1990)。配体的结合激活RTK的 固有功能，导致受体和多种细胞第五的磷酸化，并随后导致多种细胞 反应(Ullrich & Schlessinger，1990，Cell 61：203-212)。这样， 与专一的生长因子(配体)的胞外相互作用起始了受体酪氨酸激酶介 导的信号转导，典型的随后是受体二聚化，刺激固有的蛋白质酪氨酸 激酶活性和受体转磷酸作用。这样就产生了胞内信号转导分子的结合 部位并导致与促进细胞反应的一系列胞质信号传导分子形成复合体。 (例如细胞分裂，分化，代谢效应，胞外微环境的改变)参看 Schessinger和Ullrich，1992，Neuron 9：1-20。

有SH2(src同源物-2)或磷酸酪氨酸结合(PTB)结构域的蛋白 质高亲合地与活化的酪氨酸激酶受体及其底物结合，将信号传导到细 胞内。两种结构域均识别磷酸酪氨酸。(SH2：Fantle等，1992，Cell 69：413-423；Songyant等，1994，Mol.Cell.Biol.14：2777-2785； Songyang等，1993，Cell 72：767-778；和Koch等，1991，Science 252：668-678；Schoelson，Curr.Opin.Chem.Biol.(1997)，1(2)， 227-234；Cowburn，Curr.Opi.Struct.Biol.(1997)，7(6)， 835-838)。已经鉴定了与受体酪氨酸激酶(RTK)相关的几种细胞间底 物(intercellular substrate)蛋白质。可以将它们分为两大类：(1) 有催化结构域的底物；和(2)缺少这种结构域但用作衔接子并与催化 活性分子相关的底物(Songyang等，1993，Cell 72：767-778)。受 体或蛋白质和它们的底物的SH2或PTB结构域的相互作用的专一性是 由磷酸化酪氨酸残基紧邻的周围的氨基酸残基决定的。例如，SH2结 构域和特定受体上磷酸酪氨酸周围的氨基酸序列之间的结合亲合性的 差别是与观察到的它们的底物磷酸化特性的差别相关的(Songyang等， 1993，Cell 72：767-778)。观察暗示，各受体酪氨酸激酶的功能不但 由其表达方式和配体可用性决定，而且由特定受体激活的下游信号转 导途径的排列以及这些刺激的时间选择和持续时间决定。这样，磷酸 化提供了重要的调节步骤，由特定的生长因子受体以及分化因子受体 补充，它决定了信号传导途径的选择性。

已经提示多种受体酪氨酸激酶和结合其上的生长因子在血管形成 中起作用，虽然有时是间接起作用(Mustonen和Alitalo，J.Cell Biol. 129：895-898，1995)。这种受体酪氨酸激酶的一种称为“胎肝激酶1” (FLK-1)，是RTKs的III型亚类中的一员。人FLK-1的另一种命名是 “含激酶插入结构域的受体(KDR)(Terman等，Oncogene 6：1677-83， 1991)。FLK-1/KDR的另一种命名是“血管内皮细胞生长因子受体2” (VEGFR-2)，因为它能高亲合性的结合VEGF。鼠的FLK-1/VEGFR-2也 被称为NYK(Oelrichs等，Oncogene 8(1)：11-15，1993)。已经分 离了编码小鼠，大鼠和人FLK-1的DNA并报道了核苷酸和编码的氨基 酸序列(Matthews等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，88：9026-30，1991； Terman等，1991，supra；Terman等，Biochem.Biophysic.Res.Comm. 187：1579-86，1992；Sarzani等，supra；和Millauer等，Cell 72： 835-846，1993)。诸如Millauer等，出处同上文等多种研究中暗示 VEGF和FLK-1/KDR/VEGFR-2是配体-受体对，在血管内皮细胞增殖和 血管形成和生长，分别称为血管发生和血管生成中起重要作用。

另一种命名为“fms样酪氨酸激酶-1”(Flt-1)的III型亚类RTK 与FLK-1/KDR有关(DeVries等，Science 255；989-991，1992； Shibuya等，Oncogene 5：519-524，1990)。Flt-1的另一个名字是 “血管内皮细胞生长因子受体1”(VEGFR-1)。迄今为止，发现 FLK-1/KDR/VEGFR-2和flt-1/VEGFR-1亚家族成员主要在内皮细胞上 表达。这些亚类成员专一的由血管内皮细胞生长因子(VEGF)配体家 族的成员刺激(Klagsburn和D’Amore，Cytokine & Growth Factor Reviews 7：259-270，1996)。血管内皮细胞生长因子(VEGF)，结合 Flt-1比结合FLK-1/KDR有更高的亲合性并且对血管内皮细胞促有丝 分裂(Terman等，1992，出处同上；Mustonen等，出处同上；DeVries 等，出处同上)。相信Flt-1在血管发育中对于内皮组织是重要的。 Flt-1的表达与小鼠胚胎的早期血管发育以及伤口愈合中的新血管形 成有关(Mustonen和Alitalo，出处同上)。Flt-1在成人器官诸如肾 小球中的表达暗示这种受体与细胞生长无关的另一功能(Mustonen和 Alitalo，出处同上)。

如上所述，最近的证据表明VEGF在刺激正常和病理的血管形成中 均起作用(Jackeman等，Endocrinology 133：848-859，1993；Kolch 等，Breast Cancer Research and Treatment 36：139-155，1995； Ferrara等，Endocrine Reviews 18(1)；4-25，1997；Ferrara等， Regulation of Angiogenesis(ed.L.D.Goldberg和E.M.Rosen)， 209-232，1997)。此外，VEGF与血管渗透性的控制和增强有关 (Connolly，等，J，Biol.Chem.264；20017-20024；Brown等， Regulation of Angiogenesis(ed.L.D.Goldberg和E.M.Rosen)， 233-269，1997)。

已经报道了由mRNA的可变剪接产生的不同形式的VEGF，包括 Ferrara等描述的四种(J.Cell.Biochem.47：211-218，1991)。 Ferrara等如前面所述鉴定了分泌的和主要的细胞相关种类的VEGF， 并且已知该蛋白以二硫键连接的双体形式存在。

最近鉴定了多个VEGF的相关同系物。但是，并未阐明它们在生理 和病理过程中的作用。此外，在多种组织中VEGF家族的成员通常与 VEGF共表达，并且通常能够与VEGF形成异二聚体。如下所述，这种 特性可能改变了异二聚体的受体专一性和生物学效应，并进一步使它 们的专一作用的阐明变的复杂(Korpelainen和Alitalo， Curr.Opin.Cell Biol.，159-164，1988以及其中引用的文献)。

胎盘生长因子(PIGF)的氨基酸序列与VEGF序列有显著的同源性 (Park等，J.Biol.Chem.269：25646-54，1994；Maglione等 Oncogene 8：925-31，1993)。类似VEGF，不同种类的PIGF来自mRNA 的不同拼接，并且蛋白质以双体形式存在(Park等，出处同上)。PIGF-1 和PIGF-2可以高亲和性的结合到Flt-1，并且PIGF-2还强烈结合到 neuropilin-1(Migdal等，J.Biol.Chem.273(35)：22272-22278)， 但均不与FLK-1/KDR结合(Park等，supra)。已经报道，在VEGF低 浓度存在时，PIGF能加强VEGF对内皮细胞的血管渗透性和促有丝分 裂效应(据称是由于异二聚体的形成)(Park等，出处同上)。

VEGF-B以两种同工型形式(167和185个残基)产生，看来也与 Flt-1/VEGFR-1结合。它可能通过调节尿激酶型纤溶酶原激活剂和纤 溶酶原激活抑制剂1的表达和活性在调节胞外基质降解，细胞粘附， 和迁移中起作用(Pepper等，Proc.Nstl.Acad.Sci.U.S.A.(1998)， 95(20)：11709-11714)。

最初将VEGF-C作为主要由淋巴内皮细胞表达的VEGFR-3/Flt-4 的配体进行了克隆。全加工形式的VEGF-C亦可结合KDR/VEGFR-2并刺 激体外内皮细胞的增殖和迁移以及体内模型中的血管形成 (Lymboussaki  等Am.J.Pathol.(1998)，153(2)：395-403； Witzenbichler等Am J.Pathol.(1998)153(2)，381-394)。VEGF-C 的过量表达仅造成淋巴管的增殖和扩大，但血管不受影响。与VEGF不 同，VEGF-C的表达不受组织缺氧的诱导(Ristimake等，J.Biol.Chem. (1998)，273(14)，8413-8418)。

最近发现的VEGF-D结构上与VEGF-C非常类似。报道VEGF-D结 合和激活至少两种VEGFRs，VEGFR-3/Flt4和KDR/VEGFR-2。它最早作 为c-fos可诱导的成纤维细胞的促细胞分裂剂，得以克隆，并且最主要 在肺和皮肤的间充质细胞中表达(Achen等，Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A.(1998)，95(2)，548-553以及其中的参考文献)。

当注射到皮肤组织时，Miles检测表明VEGF-C和VEGF-D体内诱 导血管渗透性(PCT/US97/14696；WO98/07832，Witzenbichler等，出 处同上)。这些配体在它们表达的组织中调节血管渗透性过高和内皮反 应中的生理作用和重要性还不确定。

基于不断发现的其它VEGF和VEGFRs同系物以及配体和受体异二 聚的先例，这些VEGF同系物的作用可能涉及形成VEGF配体二聚体， 和/或受体异二聚体，或结合到还未发现的VEGFR(Witzenbichler等， 出处同上)。最近的报道还暗示，neuropilin-1(Migdal等，出处同上) 或VEGFR-3/Flt-4(Witzenbichler等，出处同上)以及KDR/VEGFR-2 之外的受体的可能参与造成诱导血管渗透性(Stacker，SA，Domagala， T.，Nice，E.，和Wilks，A.F.，“Angiogenesis and Cancer” Conference，Amer.Assoc.Cancer Res.，Jan.1998，Orlando，FL； Williams，Diabetelogia 40：S118-120(1997))。

开发调节PTKs的化合物。考虑到推测的PTKs对细胞增殖的控制， 调节和调制，以及与反常的细胞增殖相关的疾病和紊乱的重要性，已 经使用多种方法进行了大量尝试来鉴定受体和非受体酪氨酸激酶“抑 制剂”，包括使用突变体配体(U.S.申请No.4,966,849)，可溶性受 体和抗体(申请No.WO 94/10202；Kendall & Thomas，1994， Proc.Natl.Acad.Sci 90：10705-09；Kim等，1993，Nature 362： 841-844)，RNA配体(Jellinek等，Biochemistry 33：10450-56； Takano等，1993，Mol.Bio.Cell 4：358A；Kinsella，等192，Exp.Cell Res.199：56-62；Wright，等，1992，J.Cellular Phys.152：448-57) 以及酪氨酸激酶抑制剂(WO 94/03427；WO 92/21660；WO 91/15495； WO94/14808；U.S.专利No.5，330，992；Mariani，等，1994， Proc.Am.Assoc.Cancer Res.35：2268)。

近来已经尝试鉴定用作酪氨酸激酶抑制剂的小分子。例如，已经 描述双单环，双环或杂环芳基化合物(PCT WO 92/20642)以及1，2 亚乙烯基-氮杂吲哚衍生物(PCT WO 94/14808)通常作为酪氨酸激酶 抑制剂。已经描述将苯乙烯基化合物(U.S.专利No.5,217,999)， 苯乙烯基取代的吡啶基化合物(U.S.专利No.5,302,606)，某些喹 唑啉衍生物(EP申请No.0 566 266 A1)；Expert Opin.Ther.Pat. (1998)，8(4)；475-478，硒基吲哚(seleoindoles)和硒化物(PCT WO 94/03427)，三环多羟基化合物(PCT WO 92/21660)以及苄基膦 酸化合物(PCT WO 91/15495)用作酪氨酸激酶抑制剂的化合物来治疗 癌症。已经描述将苯胺基噌啉(PCT WO 97/34876)和喹唑啉衍生物化 合物(PCT WO 97/22596；PCT WO 97/42187)作为血管形成和血管渗 透性的抑制剂。

此外，已经尝试鉴定作为丝氨酸/苏氨酸激酶抑制剂的小分子。特 别是已经描述可以将双(吲哚基马来酰亚胺)化合物抑制特定的PKC 丝氨酸/苏氨酸激酶同工型，该酶的功能障碍与VEGF-相关疾病中血管 渗透性的改变有关(PCT WO 97/40830；PCT WO 97/40831)。

因此，需要鉴定通过调制受体或非受体酪氨酸激酶活性特异性抑 制酪氨酸信号转导的有效大分子和小有机分子，用以调节和调制反常 或不适当的细胞功能，细胞增殖或分化。特别地，鉴定专一抑制酪氨 酸激酶功能的方法和化合物是有益的，该功能对于形成导致水肿，渗 漏，渗出，和大分子外渗和沉积以及相关疾病的血管渗透性过高是必 要的。

本发明概述

本发明涉及通过抑制KDR酪氨酸激酶的细胞信号传导功能来抑制 血管渗透性过高。本发明还通过选择性破坏KDR/VEGF-2的催化性激酶 反应而不明显影响Flt-1/VEGFR1或其它酪氨酸激酶活性而提供一种 抑制血管渗透性过高的方法。与目前的包括诸如倾向于产生多种不需 要的副作用的类固醇等材料的治疗方法相比较，依据本发明起作用的 药剂有明显的药理学优势。本发明的这些方法还优选于使用较低专一 性的激酶抑制剂，包括那些抑制多种VEGF受体的，因为这些方法不会 直接扰乱其它激酶的重要的正常生理功能。作为抑制血管内皮渗透性 过高的结果，也通过抑制KDR的酪氨酸激酶活性抑制了随后的水肿， 相关血细胞渗出，穿过内皮的分子交换的改变，外渗，渗漏，渗出的 形成。由于后面的事件常常导致过量的基质沉积，异常的基质增殖和 器官功能障碍，抑制KDR酪氨酸激酶也可用于治疗多种有这些病因学 特征的非癌症疾病。此外，通过抑制KDR酪氨酸激酶的活性，也将结 合到KDR酪氨酸激酶受体的VEGF-相关活化配体造成的血管低血压最 小化。

通过将专一抑制KDR酪氨酸激酶活性的化合物用药，本发明还提 供了抑制个体中血管渗透性过高和水肿形成的治疗方法。 本发明的详细描述

本发明公开了通过抑制KDR酪氨酸激酶的细胞信号传导功能来抑 制血管渗透性过高的一种方法。本发明还公开了通过使用选择性抑制 KDR的细胞信号传导功能的药剂来抑制血管渗透性过高的一种方法。 通过鉴定和使用有效阻碍KDR细胞信号传导和随之的血管渗透性过高 的依据本发明的方法的高选择性KDR抑制剂，建立了KDR在介导对 VEGF的血管渗透性反应中的必要作用。证明了这种高选择性KDR抑制 剂在调制血管渗透性的效果，而不需抑制较高亲合性受体 VEGFR-1/Flt-1功能。这种特性比使用较低选择性地破坏其它非-KDR 激酶的功能的药剂的现存的治疗方法应当会提供更好的治疗耐受性。

当血管内皮细胞生长因子(VEGF)或其它活化配体(诸如HIV Tat 蛋白质，VEGF-C或VEGF-D)结合到分布于血管内皮细胞表面的KDR 酪氨酸激酶受体，就激活了KDR酪氨酸激酶。虽然未发现天然存在的 KDR的激酶-激活突变体和截短体，但在EGFR和Tie-2受体激酶中已 有报道。因而亦可预期KDR的组成性激活的情况。KDR酪氨酸激酶也 可以称作FLK-1酪氨酸激酶，NYK酪氨酸激酶或VEGFR-2酪氨酸激酶。

除了刺激血管形成，以及内皮细胞迁移和增殖，VEGF还诱导血管 的渗透性过高。结果是，液体从血流中穿过血管壁进入间质空间，从 而形成水肿区域。血细胞渗出也常常伴随这种反应。类似的，过量的 血管渗透性过高能够破坏重要的组织和器官中(例如肺和肾)穿过内 皮的正常的分子交换，从而导致器官功能障碍，大分子渗出，以及常 与促进的基质增殖相伴的基质沉积。当发生于限制的腔隙时，水肿(例 如脑水肿)可能会导致损伤的器官功能和损伤。

可以使用多种方法抑制KDR的细胞信号传导功能：阻断活化配体 的产生，阻断活化配体结合到KDR酪氨酸激酶受体，防止受体二聚体 化和转磷酸作用，抑制KDR酪氨酸激酶的酶活性(抑制酶的磷酸化能 力)或通过其它机制破坏其下游的信号传导(D.Mukhopedhyay等， Cancer Res.58：1278-1284(1998)及其参考文献)。依据此处公开 的方法，选择性破坏KDR细胞信号传导功能的这类方法将会减少血管 渗透性过高，以及相关的渗出，随之的水肿形成和基质沉淀。

多种化合物有所需的KDR酪氨酸激酶抑制特性。化合物中包括结 合胞外KDR受体结构域或细胞激酶的酶部分或可替代地，结合VEGF 本身的抗体(此后意思是包括单链抗体构建体)。这些抗体干涉VEGF 结合到KDR酪氨酸激酶受体和/或重要地，干涉KDR酪氨酸激酶细胞信 号传导地功能。结合到KDR酪氨酸激酶地抗体可能作为VEGF的拮抗剂 或更通常地，作为VEGF激活剂的拮抗剂。或者，这些抗体可能阻断功 能性受体二聚体化或它们是KDR酪氨酸激酶抑制剂。与VEGF或活化配 体结合的抗体是VEGF或活化配体的中和抗体。必需知道这类VEGF中 和抗体可能通过KDR和F1t-1受体阻断VEGF反应，并且典型的对单一 活化配体专一。在多数情况下，通过Flt-1受体阻断VEGF反应不是必 需或期望的。由于已经报道VEGFR识别VEGF的不同表位，期望的对 KDR激活的专一阻断可以通过使用专一结合并“掩蔽”VEGF或其它活 化配体的KDR-结合表位的抗体来完成。

可以抑制KDR酪氨酸激酶活性，从而将血管渗透性过高和形成水 肿最小化的其它化合物包括肽和有机分子。肽包括KDR和KDR结合片 段的可溶性胞外结构域。其它有用的肽是VEGF或VEGF相关的生长因 子的突变体(例如VEGF-C，VEGF-D或HIV Tat蛋白质以及它们的融合 蛋白)，它们结合并阻断进一步与此受体的配体结合但不刺激二聚体 化，活化或KDR酪氨酸激酶转磷酸作用。这类突变体可以是单体或非 功能性异二聚体，从而阻断天然二聚体VEGF或活化配体的结合。类似 地，可以成功的使用其它的阻断受体二聚体化和/或激活的肽或小分 子。这些化合物亦作为活化配体的拮抗剂或是KDR酪氨酸激酶活性的 抑制剂。优选的化合物是小有机分子。

此外，抑制活性功能性KDR酪氨酸激酶的生物合成或正确呈递的 诸如KDR-专一性核酶，反义多聚核苷酸(诸如反义mRNA)或细胞内单 链抗体(ScFv)等分子将可有效阻断KDR-介导的对VEGF的反应。可以 将分子引入预制的细胞或可在细胞内诱导它们的产生(例如通过使用 适当的腺病毒，反转录病毒或杆状病毒载体)。

本发明的优选化合物具有抑制KDR细胞信号传导功能的特性但不 会显著抑制Flt-1的细胞信号传导功能(Flt-1酪氨酸激酶也称为 VEGFR-1酪氨酸激酶)。KDR酪氨酸激酶和Flt-1酪氨酸激酶均是通过 VEGF分别结合到KDR酪氨酸激酶受体和flt-1酪氨酸激酶受体激活 的。由于Flt-1酪氨酸激酶活性可能介导内皮维持和血管功能的重要 事件，抑制这种酶活性或相关的转导信号可能导致毒性或不利的副反 应。至少，这种抑制对于阻断血管渗透性过高的诱导和形成水肿不是 必需的，因此对于个体而言是浪费和无价值的。本发明的优选化合物 是独特的，因为它们抑制由活化配体激活的一个VEGF-受体酪氨酸激 酶(KDR)的活性但是不抑制其它的受体酪氨酸激酶，诸如也是由某种 活化配体激活的Flt-1。本发明的最优选的化合物因此在其酪氨酸激 酶抑制活性上是有选择性的。

已知VEGF促使血管渗透性过高和水肿形成。VEGF是由在发炎部 位的炎性T-细胞，巨噬细胞，噬中性粒细胞和噬曙红细胞等表达的。 这种因子的产生很快由组织缺氧，某些血管加压激素，生长因子，生 殖激素和多种炎性细胞因子上调。实际上，与许多其它生长因子的表 达或给药相关的血管渗透性过高和水肿看来是通过VEGF的产生介导 的。血管渗透性过高，相关的水肿，改变的穿内皮的交换和大分子渗 出，其常常伴随血细胞渗出，会导致过量的基质沉积，异常的基质增 殖，纤维化等。因此，VEGF-介导的渗透性过高可显著地促使有具有这 些病因学特征的疾病。例如： (1)VEGF在损伤性银屑病皮肤的表皮有显著增高。该因子强力刺激 与银屑病相关的皮肤内皮细胞增殖和微血管渗透性过高。 (2)在烧伤和严重烫伤后，常会损害了主要器官。这可以通过由局部 缺血-重灌注损伤，内脏组织的膨胀和水肿，即内皮细胞损伤导致的不 可控制的“介质疾病(mediator disease)”表明。对于烧伤受害者， 吸入伤害是一个主要的致死原因。气管支气管上皮的蜕皮以及组合富 含蛋白质的渗出物形成的气管的脱落物可能导致阻塞这些气管。组合 吸入烧伤和组织缺氧随之暴露于高浓度氧气(尝试帮助个体)通过造 成肺的累积变化使情况恶化，诸如扩散渗出物形成，出血到气管以及 血管壁的水肿变化。在烧伤和多种创伤后受害者的循环血清VEGF水平 显著增加(高至20倍)并且可能使这些并发症的主要媒介(Grad等， Clin.Chem.Lab.Med.36：379-383，1998)。 (3)晒伤也与水肿的形成有关。已知在暴露于紫外线后VEGF的产生 也会上调。产生水肿的其它皮肤疾病包括blistering symptomatic erythedema(肢痛症)，persistent acrodema和大疱疾病(bullous diseases)诸如多形红斑，天疱疮样疱(bullous pemphigoid)和疱 疹样皮炎(dermatitis herpetiformis)(即急性或慢性炎症)。水肿 斑和roseacea诸如与毛细管扩张相关的疾病是表明水肿的进一步的 疾病。 (4)增强的微血管渗透性和水肿是炎症和肿瘤疾病的共同特征。脑瘤 诸如神经蚀质瘤，形成肿瘤的或肿瘤周围的脑水肿和充液性囊肿，以 及meningiomas，伴随大量的脑水肿，是这类疾病的例子。局部的高 水平的VEGF与这些疾病相关。恶性腹水液体和肿瘤渗出物(特别是恶 性胸膜和心包渗出物)的诱导是这类产生水肿的疾病的进一步的例子， 并且已知涉及VEGF产生。此外，头部创伤产生的水肿可产生震荡病损 害大脑功能。类似地，已证实交通性脑积水涉及诸如已知调制VEGF产 生的IGF-1和TGF-B1等细胞因子。 (5)在诸如形成鼻息肉，宫颈息肉和胃增生息肉的一些慢性炎症中会 发生水肿。在这些情况下，证实炎性细胞在水肿状态发生中起重要作 用，至少部分是通过产生VEGF。 (6)细胞因子激活的噬曙红细胞可是VEGF的重要来源，从而促进了 在过敏性炎症部位形成组织水肿。水肿和渗出物是在过敏和迟发型过 敏反应中产生的常见并发症；有时还包括过敏症。VEGF特别地与不对 抗组胺剂或阿司匹林响应的反应有关，并且在毒漆和接触性皮炎中观 察到它的上调。此外，肺结核，某些病毒感染，血管性水肿，荨麻疹 (hives)和运动诱导的过敏症亦是可能涉及VEGF的这类过敏和迟发 型过敏反应的例子。作为药物敏感或过敏反应或施用VEGF-上调生长 因子或细胞因子(例如IGF-1，FGF-2或IL-2)的结果，常常也会形 成水肿。放射过敏反应和放射性皮炎也与血管渗透性过高有关。 (7)VEGF涉及眼部新血管形成，导致糖尿病性视网膜病和微血管病， 年龄-相关的黄斑变性导致的失明以及暴露于过高的氧产生的新生儿 失明。在很多情况下，这些病症前都有斑或其它眼部水肿。已经确认 VEGF是眼部局部缺血和血管水肿中虹膜，角膜和视网膜新血管形成的 主要介体。在有渗出物和基质沉积作为随后的血管形成基础的多种眼 部疾病中，VEGF诱导的血管渗透性过高促进血液-视网膜屏障的破坏。 角膜新血管形成是化学烧伤，角膜发炎和水肿后的主要后果。最近的 证据显示，VEGF与这类眼部创伤后的过程有关。已经使用铁的螯合剂 去铁胺临床治疗癌症病人。但是，这种治疗常诱发斑水肿。在病人中 获得的这种铁螯合剂的浓度诱导VEGF mRNA在研究的所有正常和肿瘤 细胞系中的表达有3-5倍的增加，暗示VEGF很可能是水肿形成的介体。 VEGF过量产生和水肿导致的增加的眼内压力会导致不适当的基质沉 积，视觉扭曲，视乳头盘变化，视野缺陷并且可能导致青光眼。血管 渗透性过高还常常与结膜炎有关。 (8)新生儿和成人的慢性肺病来自于肺损伤和不充分的修复过程。已 经报道在多种肺损伤的动物模型中有VEGF产生。肺内皮细胞的破坏也 是氧过高性肺损伤的特征。在从氧过高恢复时，II型小泡细胞上调 VEGF并随后导致肺内皮细胞增殖和再生。然而，这些结果可能造成穿 过肺内皮细胞和肺水肿的破坏的交换。哮喘和支气管炎常常涉及支气 管血管扩张，血管充血，支气管壁水肿和渗出，导致气道黏膜增厚和 支气管内腔变窄。有蛋白渗出和反常基质生长的水肿典型的与这些现 象互相交缠。通过相关过程，在成人呼吸窘迫综合征中形成肺水肿。 成人呼吸窘迫综合征的原因包括肺炎，有毒物质的吸入，肺挫伤，近 似淹溺和吸入胃内容物。 (9)皮质类固醇，诸如可的松，氢化可的松，属于最常使用的治疗水 肿的治疗剂。它们是VEGF表达的强烈抑制剂。现在相信这种特性显著 促进了这些类固醇的为人熟知的抗水肿效果。但是，它们多能的生物 学活性也会造成不期望的副反应。类固醇激素以及它们的激动剂和拮 抗剂也能显著影响VEGF的产生，特别是在生殖组织中。子宫内膜炎和 子宫内膜异位可以发生在怀孕，月经周期或性激素治疗当中。月经的 肿胀和绞痛与血管渗透性过高有关。他莫昔芬，一种降低乳腺癌风险 的药物，也增加子宫细胞增殖和肿瘤发生率。这种类固醇类似物，以 及雌二醇，造成子宫水肿和细胞增殖，而它们显示涉及局部VEGF产生 的增加。卵巢超刺激综合征(ovarian hyperstimulation syndrome) 是影响排卵感应的严重并发症。这类综合征的最严重的表现是形成大 块的卵巢增大和多发性囊肿，腹水，血浓缩和液体在第三-空间的积累。 用人绒毛膜促性腺激素刺激后由于卵巢的黄体化粒膜细胞等分泌的 VEGF引发的增加的毛细血管渗透性相信在这些综合征中起关键作用。 已经证实在斯坦力-利文撒尔综合征中，VEGF在多囊性卵巢 (polycystic ovaries)的卵泡膜细胞增殖性卵巢基质中过量表达。 (10)在中风的动物模型中证实在瞬时中脑动脉阻塞后，在神经元 和软膜细胞中有VEGF基因表达的快速分化诱导。VEGF可能有助于大 脑细胞从局部缺血伤害，诸如中风，头部创伤或脑梗死中的恢复，但 是大脑损伤也会由于脑水肿的伴随形成而恶化。疟疾也可能作为VEGF- 诱导的脑部局部缺血的结果而诱发水肿。因为肿瘤毛细血管缺乏正常 的血脑屏障功能，会产生脑肿瘤相关的脑水肿和充水性囊肿。神经蚀 质瘤细胞原位释放的VEGF最可能在病人中引起成蚀质细胞瘤肿瘤的 诊断组织病理学特征和临床特征，包括增加的脑水肿。腕管综合征伴 随增加的神经水化和常常伴随增加的胞外基质沉积(陷夹神经病)。神 经周围的组织中增加的VEGF水平通过诱导血管渗透性，液体流出和基 质沉积到神经周组织造成神经陷夹。 (11)作为对低氧的反应，组织中VEGF的产生显著的上调。因而， 观察到在坏死，局部缺血，梗死，闭塞，贫血，循环系统损伤或其它 氧丧失区域中，VEGF水平增加并且常常有血管渗透性过高，水肿和渗 出。造成“高空病”的低氧压也会导致快速的VEGF产生，它可能是不 适应的人发生威胁生命的脑和肺水肿(HACE和HAPE)的原因。 (12)VEGF的过量表达同样也与作为放射损伤，风湿性疾病，狼疮， 心肌梗死，创伤或药物反应结果的血管渗透性过高造成的心包和胸膜 渗出有关。在肺或乳腺癌，淋巴瘤和白血病病人的尸体解剖中常常观 察到VEGF过量表达与心包和胸膜渗出就不奇怪了。在风湿性关节炎个 体的肿胀关节的滑液中VEGF的量亦有显著升高。扭伤和骨折，虽然与 对促进血管形成和愈合有益的某些肿胀和血管渗透性过高有关，但可 能伴随疼痛和过量的不期望的水肿。类似的，预期VEGF与有渗出的滑 膜炎和半月板损伤等病况(例如“膝盖中有水”)有关。 (13)与循环限制有关的溃疡(例如褥疮性，重力性和曲张性溃疡) 也常常伴随水肿和蛋白质渗出物。糖尿病并发症通常作为提高的循环 葡萄糖水平(高血糖)和形成高级糖基化终产物(AGE)的结果而产生， 常常伴随损伤的循环。这些病况，单独或组合在一起，已知刺激VEGF 的产生以及随之的能导致多种糖尿病并发症的血管渗透性过高。 (14)由于肾足细胞的显著的组成型产生内源性VEGF和已知的提 高的VEGF水平的血管渗透性过高效应，肾病诸如微白蛋白尿，蛋白尿， 少尿电解质不平衡(常常作为糖尿病的并发症)和肾病综合征(特别 是烧伤，休克或创伤后低氧诱导的)可能依据本发明进行治疗。 (15)蛋白质渗出物和血球渗出，通常伴随水肿并导致过量的基质 沉积和基质增殖，造成其它疾病的发展。这些疾病包括粘滞性过高综 合征，肝硬变，纤维化(fibroses)，疙瘩疤痕以及形成不希望的疤痕 组织。抑制VEGF-介导的渗透性过高会阻止这类疾病的发展。 (16)已知有显著量的VEGF同工型贮存在血小板，肥大细胞等以及 胞外基质当中。在特定情况下，这些VEGF/VPF贮藏物可以迅速释放并 且从而造成急性血管渗透性过高。

从这些不同的例子，明显地水肿发生在多种生理条件下并且 VEGF/VPF或相关类似物强烈的牵涉水肿形成和外渗。本发明的化合物 将与斑点水肿，无晶状体/假无晶状体囊样斑点水肿，成视网膜细胞瘤， 眼局部缺血，眼部炎性疾病或感染，脉络膜黑素瘤，铁螯合剂治疗诱 导的水肿性副作用，肺水肿，胸膜渗漏，心包渗漏，心肌梗死，类风 湿性疾病，创伤或过敏性炎症部位的组织水肿，慢性炎症部位的息肉 水肿，脑水肿，脑肿瘤充液性囊肿(brain tumor fluid-filled cysts)， 交通性脑积水，与烧伤导致的器官损伤相关的水肿以及吸入烧伤损伤 导致的水肿等等有关的水肿状态最小化。本发明的化合物还将与皮肤 烧伤，水疱，多形红斑，水肿性斑和其它皮肤疾病，脑肿瘤，与癌症 相关的腹水和多种渗漏，腕管综合征，高空病，过敏和过敏症和超敏 反应反应，放射过敏反应，放射性皮炎，青光眼，结膜炎，成人呼吸 窘迫综合征，哮喘，支气管炎，卵巢性高刺激综合征(ovarian hyperstimulation syndrome)，多囊性卵巢综合征(polycystic ovary syndrome)，月经肿胀和绞痛，中风，头部创伤，脑梗死或闭塞，溃疡， 扭伤，骨折，与滑膜炎相关的渗漏，糖尿病并发症，肝硬变以及给药 生长因子等等有关的水肿状态最小化。本发明的化合物也可以用于治 疗微白蛋白尿症，蛋白尿症，尿过少，电解质失调，肾病综合征，粘 滞性过高综合征，渗出物(exudates)，纤维性(fibrose)，疤痕疙瘩 以及不希望的疤痕组织的形成。

本发明的化合物可以与一种或多种其它药物组合给药，这些药物 能够抑制或防止VEGF的产生，弱化对VEGF的细胞内反应，抑制血管 渗透性过高，减少炎症或抑制或防止形成水肿。只要给药过程适当， 可以将本发明的化合物在其它药物之前或之后或与其它药物同时给 药。其它的药物包括但不限于抗-水肿类固醇，NSAIDS，ras抑制剂， 抗-TNF药物，抗-IL1药物，抗组胺剂PAF-拮抗剂，COX-1抑制剂，COX-2 抑制剂，NO合酶抑制剂，PKC抑制剂以及PI3激酶抑制剂。本发明的 化合物和其它的药物可以加合或协同地起作用。因而，将这些抑制血 管渗透性过高和/或抑制水肿形成的药物的组合给药，比单独将任一种 药物单独给药更能够减轻血管渗透性过高或水肿的有害效应。

由于水肿的形成通常由血流的液体渗出造成，在渗漏发生时常常 会产生低血压。低血压也可以作为VEGF或VEGF激活剂结合到血管内 皮细胞上的VEGF受体的结果而出现。看起来本发明的化合物通过抑制 作为VEGF(或其它活化配体)结合到这种受体的结果的KDR的细胞信 号传导功能将低血压的发展最小化。当将本发明的化合物向个体给药 时抑制个体的低血压。 药物制剂

可以以治疗或改善血管渗透性过高，水肿以及相关疾病的剂量将本 发明的化合物本身向病人给药或将其与适当的载体或赋形剂混合形成 药物组合物给药。还可以将这些化合物的混合物作为简单混合物或适 当的制剂型药物组合物对病人给药。治疗有效剂量进一步是指化合物 的量足以防止水肿，VEGF-相关渗透性过高和/或VEGF-相关低血压的 发展。将本发明的化合物制剂化和给药的技术可在“雷明顿药物科学 (Remington’s Pharmaceutical Sciences)”Mack Publishing Co.， Easton，PA，最新版本中找到。 给药途径

适当的给药途径可以是，例如包括口服，滴眼液的，直肠的，透粘 膜的，表面的，或肠给药；肠胃外给药，包括肌肉内的，皮下的，髓 内的注射，以及鞘内的，直接心室内的，静脉内的，腹膜内的，鼻内 的，或眼内的注射。

此外，可以将化合物局部而不是全身用药，例如，通过将化合物直 接注射道水肿部位，常常是储存或缓释制剂。

另外，可以通过靶向药物释放系统使用该药物，例如，使用内皮细 胞-专一性抗体包被的脂质体。 组合物/制剂

本发明的药物组合物可以通过已知的方式制造，例如，通过常规 的混合，溶解，制成颗粒，制成糖衣丸，研磨，乳化，包囊，夹裹或 冷冻干燥程序。

这样，通过常规方式，使用一种或多种生理可接受载体，包括促 进将活性化合物制成可用作药物的制剂的赋形剂和助剂，可以将用于 本发明的药物组合物形成制剂。合适的制剂依赖于选择的给药途径。

对于注射，可以将本发明的药剂制成水溶液，优选的在生理兼容 的缓冲液中诸如Hanks溶液，Ringer溶液，或生理盐水缓冲液。对于 穿过粘膜的给药，将对于要渗透的屏障适当的渗透剂用于制剂中。这 种渗透剂在本技术领域通常可知。

对于口服给药，可以将活性组合物与本技术领域熟知的药物学可 接受载体组合容易的形成制剂。这类载体使本发明的组合物可以形成 片剂，丸剂，糖衣丸，胶囊，液体，凝胶，糖浆，淤浆，悬浮液等等， 用于要治疗的病人口服消化。通过将活性组合物和固体赋形剂组合获 得用于口服的药物制剂，可选的研磨产生的混合物，并且在如果需要 加入适当的助剂后处理颗粒混合物，获得片剂或糖衣丸核心。适当的 赋形剂，特别地是，填充剂诸如糖，包括乳糖，蔗糖，甘露醇，或山 梨醇；纤维素制剂诸如，例如玉米淀粉，小麦淀粉，稻米淀粉，马铃 薯淀粉，白明胶，黄芪胶(gum tragacanth)，甲基纤维素，羟丙基甲 基纤维素，羟基甲基纤维素钠，和/或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。如果需 要，可以加入分解剂，诸如交联聚乙烯吡咯烷酮，琼脂，或藻酸或它 的盐诸如藻酸钠。

给糖衣丸核心提供合适的包被。为此目的，可以使用浓缩的糖溶 液，它可选的包含阿拉伯树胶(gum arabic)，滑石，聚乙烯吡咯烷酮， carbopol gel，聚乙二醇，和/或二氧化钛，天然漆溶液(lacquer solutions)，以及合适的有机溶剂或溶剂混合物。可以将染色剂或色 素加入片剂或糖衣丸包被，用于鉴别或表征活性化合物剂量的不同组 合。

可以用作口服的药物制剂包括用明胶制成的推入配合胶囊，以及 用明胶和可塑剂诸如甘油或山梨醇制成的软的，密封的胶囊。推入配 合胶囊可能包含与填充剂诸如乳糖，粘合剂诸如淀粉，和/或润滑剂诸 如滑石或硬脂酸镁以及可选的与稳定剂混合的活性组分。在软胶囊中， 活性化合物可以溶于或悬浮于合适的液体，诸如脂肪油，液体石蜡， 或液体聚乙二醇。此外，可以加入稳定剂。所有用于口服的制剂应当 是适合口服给药的剂量。

对于口腔含化给药，组合物可能采取传统方式配制的片剂或锭剂。

对于吸入给药，本发明使用的化合物常规的通过压力包装以气雾 剂喷射传递或喷雾器传递，使用适当的推进剂，例如二氯二氟甲烷， 三氯氟甲烷，二氯四氟甲烷，二氧化碳或其他合适的气体。对于压缩 气雾剂，可能提供阀释放测定量来确定剂量单位。用于吸入或吹入器 的例如明胶等制成的胶囊或筒可以通过含有化合物的粉末混合物以及 适当的粉末基质诸如乳糖或淀粉来制成。

可以将化合物制成肠胃外给药制剂，通过注射例如快速(bolus) 注射或连续注射给药。用于注射的制剂可能是单位剂量形式例如在安 瓿或多剂量容器，加上防腐剂。组合物可以采取在油或水赋形剂中的 悬液，溶液或乳状液形式，并可能含有制剂化制剂诸如悬浮，稳定和/ 或分散剂。

肠胃外给药的药物制剂包括活性化合物水溶形式的水溶液。另外， 可以将活性化合物的悬液制备成适当的油性注射悬浮液。适当的亲脂 溶剂或赋形剂包括脂肪油诸如芝麻油，或合成脂肪酸酯，诸如油酸乙 酯盐或甘油三酯，或脂质体。水注射悬液可能包含增强悬液粘度的物 质，诸如羧基甲基纤维素钠，山梨醇，或葡聚糖。可选的，悬液还可 能含有合适的稳定剂或增加化合物溶解性的药剂以制备高浓度的溶 液。

或者，活性成分可以是粉末形式，在使用前用适当的赋形剂例如 无菌无热原水构建。

该化合物也可以制成直肠用的组合物，诸如栓剂或停滞灌肠剂， 例如，含有常规的栓剂基质如可可黄油或其它甘油酯。

除了前面描述的制剂，还可以将该化合物制成储存制剂。这种长 效制剂可以通过移植给药(例如皮下或肌肉内或通过肌肉内注射)。这 样，例如，可以将该化合物与聚合物或疏水物质(例如作为在可接受 油中的乳状液)或离子交换树脂，或作为少量地可溶的衍生物，例如 少量地可溶性盐形成制剂。

用于本发明的疏水性化合物的药物载体的例子是助溶剂系统，包 括苄醇，一种非极性表面活性剂，一种易与水混合的有机多聚物，以 及一种水相。助溶剂系统可能是VPD共溶剂系统。VPD是3％w/v苄醇， 8％w/v非极性表面活性剂吐温80，和65％w/v聚乙二醇300，在无水 酒精中制成所需体积。VPD助溶剂系统(VPD：5W)含有在5％葡萄糖水 溶液1∶1稀释的VPD。这种助溶剂系统能很好的溶解疏水性化合物， 并且它自身在系统给药时毒性很低。正常的，助溶剂系统的含量变化 可以相当大而不会破坏其溶解性和毒性特征。此外，助溶剂组分的一 致性可以改变：例如，可以使用其它的低毒性非极性表面活性剂代替 多乙氧基醚；聚乙二醇的片段大小可以改变；可以使用其它的生物兼 容多聚物代替聚乙二醇，例如聚乙烯吡咯烷酮；并且可以使用其它的 糖或多糖代替葡萄糖。

或者，可以使用将疏水性药物化合物给药的其它给药系统。脂质 体和乳剂是为人熟知的将疏水性药物给药的赋形剂或载体。虽然通常 毒性更大，但也可以使用某些有机溶剂诸如二甲基亚砜。此外，可以 使用缓释系统将该化合物给药，诸如含有治疗药剂的固体疏水性多聚 物半透膜基质。已经确定了多种缓释材料，它们为本技术领域数量技 术人员熟知。基于其化学性质，缓释胶囊可以在几周内至超过100天 的时间释放该化合物。根据治疗药剂的化学性质和生物学稳定性，可 以使用其它的蛋白稳定策略。

药物组合物还可能包括适当的固体或凝胶相载体或赋形剂。这类 载体或赋形剂包括但不限于碳酸钙，磷酸钙，不同的糖，淀粉，纤维 素衍生物，明胶，以及多聚物诸如聚乙二醇。

本发明的许多有机分子化合物可以以与药物学相容的反离子的盐 测定形式提供。可以与酸，包括但不限于盐酸，硫酸，醋酸，乳酸， 酒石酸，琥珀酸等形成药物相容的盐。在水或其它质子溶剂中盐比相 应的游离碱形式溶解性更好。 有效剂量

本发明中适用的药物组合物包括含有能达到预期目的的有效量活 性成分的组合物。更特定地，治疗有效量意思是对要治疗的对象可以 有效防止发生或减轻现有症状的量。本技术领域熟练人员有能力确定 有效量。

有效剂量的本化合物能够充分抑制KDR的信号传导功能，从而抑 制血管渗透性过高而不会由于抑制Flt-1或其它酪氨酸激酶功能造成 明显的副反应。可以通过体外检测测定KDR酪氨酸激酶的剂量-依赖性 抑制确定具有这类活性的化合物。在类似的[ATP]/Km(ATP)和底物条件 下，优选的化合物对KDR的IC50比对Flt-1或其它PTK’s的IC50显著 地低(理想地，对KDR酪氨酸激酶有～100倍选择性)。

对于本发明方法中使用的任何化合物，开始可以从细胞检测估计 治疗有效剂量。例如，可以在细胞和动物模型中确定剂量，以获得循 环浓度范围包括细胞检测中确定的IC50(即达到对细胞信号传导功能 KDR最大抑制的一半的测试的化合物的浓度，该功能通常是反应于 VEGF或另一活化的刺激)。在3至5％血清白蛋白存在下测定的细胞IC50 可能近似于血浆蛋白质对该化合物的结合效应。可以利用这些信息来 准确的测定对人的有效剂量。此外，用于系统给药的最优选的化合物 以在血浆中安全地获取的水平在完整细胞中有效的抑制细胞信号传导 功能KDR。

治疗有效剂量是指化合物的量改善病人的症状。可以通过标准药 物学程序在细胞培养或实验动物中测定这类化合物的毒性和治疗效 果，例如测定最大容许剂量(MTD)和ED50(50％最大反应的有效剂量)。 毒性和治疗效果的剂量比率是治疗指数，可以用MTD和ED50的比率来 表达。显示高的治疗指数的化合物是优选的。从这些细胞培养检测和 动物研究获得的资料可以用于确定在人体使用的剂量范围。这些化合 物的剂量优选的处于循环浓度的范围内，其包括极少或无毒性的ED50。 根据使用的剂量形式和使用的给药途径，剂量可以在该范围内变化。 医生可以根据病人状况选择准确的制剂，给药途径和剂量。(参看例如 Fingle等，1975，“The Pharmacological Basis of Therapeutics”， Ch.1pl)。在治疗危急情况时，可能需要接近MTD的快速大量或输注 给药，以获得快速的效果。

可以单个调节剂量和间隔，以提供足以保持KDR调制效果或最小 有效浓度(MEC)的活性成分在血浆中的水平。对于每一种化合物MEC 是不同的，但是可以根据体外资料估计；例如使用此处描述的检测方 法测定的达到KDR酪氨酸激酶50-90％抑制所需的浓度。达到MEC的所 需剂量依赖于个体特征和给药途径。然而可以使用HPLC检测或生物测 定确认血浆浓度。

使用MEC值还可以确定给药间隔。应当使用这样的治疗方案给药， 即在10-90％，优选的在30-90％以及更优选的在50-90％的时间内保持 血浆水平在MEC之上，直到达到预期的对症状的改善。在局部给药或 选择性摄入时，药物的有效局部浓度可能与血浆浓度无关。

给药的组合物的量当然会依赖于要治疗的对象，依赖于对象的体 重，痛苦的严重性，给药方式以及开处方医生的判断。 包装

如果需要，组合物可以是包装或分配器装置形式，其中可能包含 一个或多个含活性组分的单位剂量形式。包装例如可以是金属或塑料 箔，诸如发泡包装。包装或分配器装置可以附有给药说明。还可以制 备含有将本发明化合物与兼容的药物载体形成的制剂的组合物，置于 适当的容器，标记上治疗的病况。标记的适当的病况可能包括治疗水 肿，抑制血管渗透性过高和渗出，基质沉积，最小化VEGF-相关的低 血压，以及类似的病况。

实施例 I.体外PTK检测

可以使用下面的体外检测确定本发明的不同化合物对一种或几 种PTK的活性和效果水平。使用本技术领域熟知的技术根据相同的方 法可以设计对其它酪氨酸激酶的类似检测。 A.使用杆状病毒系统产生KDR酪氨酸激酶：

使用从HUVEC细胞分离的cDNA通过PCR产生了人KDR胞内结构 域(氨基酸789-1354)的编码序列。同时在此蛋白质的N-末端引入了 poly-His6序列。将这段片段克隆到转染载体pVL1393的Xba 1和Not 1位点。使用BaculoGold转染试剂(PharMingen)通过共转染产生了 重组杆状病毒(BV)。噬斑纯化重组BV并通过Western检测证实。为 了产生蛋白质，将SF-9细胞在SF-900-II培养基以2×106/ml生长， 并以每细胞0.5噬斑形成单位(MOI)进行感染。感染后48小时收获 细胞。 B.纯化KDR

向1升细胞培养物的细胞沉淀中加入50ml Triton X-100裂解 缓冲液(20mM Tris，pH8.0，137mM NaCl，10％甘油，1％Triton X-100， 1mM PMSF，10μg/ml抑蛋白酶肽，1μg/ml亮抑蛋白酶肽)裂解表达 (His)6KDR的SF-9细胞(氨基酸789-1354)。在Sorval SS-34转头中 4℃下将细胞裂解液在19,000rpm离心30分钟。将细胞裂解液上5ml NiCl2螯合琼脂糖柱，用50mM HEPES，pH7.5，0.3M NaCl平衡。使 用含有0.25M咪唑的相同缓冲液洗脱KDR。使用SDS-PAGE和测定激 酶活性的ELISA检测(下面)分析柱级分。将纯化的KDR交换到25mM HEPES，pH7.5，25mM NaCl，5mM DTT缓冲液并在-80℃保存。 C.人Tie-2激酶的产生和纯化

使用从人胎盘分离的cDNA作为模板通过PCR产生人Tie-2细胞 内结构域(氨基酸775-1124)的编码序列。在N-末端引入了poly-His6 序列并将这个构建体克隆到转染载体pVL1939的Xbal和Notl位点。 使用BaculoGold转染试剂(PharMingen)通过共转染产生了重组杆状 病毒(BV)。噬斑纯化重组BV并通过Western检测证实。为了产生蛋 白质，将SF-9细胞在SF-900-II培养基以2×106/ml生长，并在0.5 MOI 进行感染。筛选中使用的His标记的激酶的纯化类似于描述的KDR的。 D.人Flt-1酪氨酸激酶产生和纯化

使用了杆状病毒表达载体pVL1393(Phar Mingen，Los Angeles， CA)。将编码poly-His6的核苷酸序列置于编码完整的人Flt-1胞内激 酶结构域(氨基酸786-1338)的核苷酸区的5′端。使用从HUVEC细胞 分离的cDNA库通过PCR产生了编码激酶结构域的核苷酸序列。组氨酸 残基使得可以用类似于KDR(B部分)和ZAP70(F部分)的方式亲和 纯化该蛋白质。以0.5感染复数感染SF-9昆虫细胞并在感染后48小 时收获。 E.Lck和EGFR酪氨酸激酶的来源

Lck或截短型的Lck可以购买(例如Upstate Biotechnology Inc.，Saranac Lake，NY or Santa Cruz Biotechnology，Inc.，Santa Cruz，CA)或使用常规方法从已知的天然或重组来源纯化。EGFR购自 Sigma(Cat#E-3641；～500 units/50μl)，EGF配体从Oncogene Research Products/Calbiochem(Cat#PF011-100)获得。 F.ZAP70酪氨酸激酶的产生

使用了杆状病毒表达载体pVL1393(Phar Mingen，Los Angeles， CA)。将编码poly-His6的核苷酸序列置于编码完整的ZAP70(氨基酸 1-619)的核苷酸区的5′端。使用从Jurkat永生化T-细胞分离的cDNA 库通过PCR产生了编码ZAP70编码区的核苷酸序列。组氨酸残基使得 可以亲和纯化(参看B部分)蛋白质。LVPRGS桥构成了凝血酶蛋白酶 切的识别序列，从而可以从酶中除去亲和标记。以0.5感染复数感染 SF-9昆虫细胞并在感染后48小时收获。 G.纯化ZAP70

在含有20mM Tris，pH8.0，137mM NaCl，10％甘油，1％Triton X-100，1mM PMSF，1μg/ml亮抑蛋白酶肽，10μg/ml抑蛋白酶肽和 1mM原钒酸钠的缓冲液中裂解SF-9细胞。将可溶性裂解液上螯合琼脂 糖Hi Trap柱(Pharmacia)，用50mM HEPES，pH7.5，0.3M NaCl平衡。用250mM咪唑洗脱融合蛋白。将回收的酶在-80℃下保存在含 有50mM HEPES，pH7.5，50mM NaCl和5mM DTT的缓冲液中。 H.PTK的酶联免疫吸附测定(ELISA)

使用了酶联免疫吸附测定(ELISA)检测和测量酪氨酸激酶活性 的存在。根据例如Voller等，1980年，在Rose和Friedman编著的 临床免疫学手册，第二版，Am.Soc.of Microbiology，Washington， D.C.pp359-371中“酶联免疫吸附测定”中描述的已知方法进行ELISA。

对于特定的PTK改进公开的测定活性的方法。例如，下面提供了 进行KDR的ELISA实验的优选方法。将本方法改编用于测定对RTK家 族其它成员，以及非受体酪氨酸激酶的化合物的活性，均在本领域人 员能力范围内。为了测定抑制剂选择性，将一种通用PTK底物(例如 poly(Glu4Tyr)的随机共聚物，分子量20,000-50,000)与ATP(典型 的5μM)一起，在测定中以大约两倍的表观Km的浓度使用。 体外KDR的ELISA

使用了下面的程序测定本发明的化合物对KDR酪氨酸激酶活性 的抑制效应： 缓冲液和溶液： PGT∶Poly(Glu，Tyr)4∶1 -20℃贮存粉剂。将粉剂溶于磷酸盐缓冲液(PBS)成为50mg/ml溶 液。在-20℃储存为1ml等份。在制平板时，在Gibco PBS中稀释至 250μg/ml。 反应缓冲液： 100mM Hepes，20mM MgCl2，4mM MnCl2，5mM DTT，0.02％BSA，200μM NaVO4，pH7.10 ATP：在-20℃贮存为100mM等份。在水中稀释到20μM 洗涤缓冲液： 含0.1％Tween 20的PBS 抗体稀释缓冲液： 在PBS中的0.1％牛血清白蛋白(BSA) TMB底物： 在使用前将TMB底物与过氧化物溶液以9∶1混合或使用来自Neogen 的K-Blue底物。 终止溶液： 1M磷酸 流程 1.制备板

在PBS中将PGT贮存液(50mg/ml，冷冻)稀释到250μg/ml。在 Corning改进平底高亲和ELISA板(Corning#25805-96)上每孔加入 125μl。在空白孔中加入125μl的PBS。用密封带覆盖并在37℃温育 过夜。用250μl洗涤缓冲液液清洗1次并在37℃干燥培养箱中干燥2 小时。 使用前将覆盖的板在密封袋中4℃储存。 酪氨酸激酶反应： -在20％DMSO水溶液中制备4×浓度的抑制剂溶液。 -制备反应缓冲液 -制备酶溶液使其在50μl中达到所需的单位，例如对于KDR，制成 1ng/μl，在反应中是每孔50ng。贮存在冰上。

-从100mM贮存水溶液制出4×ATP溶液至20μM。

贮存在冰上 -每孔加入50μl酶溶液(依据激酶的比活，典型地是5-50ng酶/孔) -加入25μl 4×抑制剂。 -加入25μl 4×ATP用于抑制剂测定。 -在室温温育10分钟。 -每孔加入50μl 0.05N HCl终止反应 -洗板 **反应的最终浓度： ATP：5μM 5％DMSO 抗体结合 -通过两步稀释(100×，然后200×)在含0.1％BSA的PBS中将1mg/ml 等份的PY20-HRP(Pierce)抗体(一种磷酸酪氨酸抗体)稀释至 50ng/ml。 -每孔加入100μl Ab。在室温下温育1小时。在4℃温育1小时。 -洗4×板。 颜色反应 -制备TMB底物并每孔加入100μl。 -在650nm检测OD直到达到0.6。 -用1M磷酸终止。在板读数仪上摇动。 -在450nm迅速读出OD。

酶制剂的优化的温育时间和酶反应条件可轻微地变化并对各批 依经验确定。

对Fltl，Tie-2，EGFR和ZAP70使用了类似的测定条件。对于Lck， 在类似的测定条件下使用的反应缓冲液是100mM MOPSO，pH6.5，4mM MnCl2，20mM MaCl2，5mM DTT，0.2％BSA，200mM NaVO4。 PKC激酶来源

可以购买PKC的催化亚基(Calbiochem)。 PKC激酶测定

按照公开发表的流程进行放射活性激酶测定(Yasuda，I.， Kirshimoto，A.，Tanaka，S.，Tominaga，M.，Sakurai.A.， Nishizuka，Y.Biochemistry and Biophysical Research Communication 3：166，1220-1227(1990))。简言之，所有的反应在 由50mM Tris-HCl pH7.5，10mM MgCl2，2mM DTT，1mM EGTA，100μM ATP，8μM肽，5％DMSO和33P ATP(8Ci/mM)构成的激酶缓冲液中进行。 化合物和酶混合在反应容器中，通过加入ATP和底物的混合物起始反 应。加入10μl终止缓冲液(在75mM磷酸中的5mM ATP)终止反应 后，将部分混合物点到磷酸纤维素滤纸上。室温下在75mM磷酸中将点 的样品洗3次，5至15分钟。通过液体闪烁记数定量掺入的放射标记。 雌激素受体结合测定

使用Shein等Cancer Res.45：4192(1985)(以参考文献并于 此处)的反应条件在4℃温育20小时后，测定了1nM放射标记的17β- 雌二醇对MCF-7哺乳动物癌细胞的细胞溶胶中的人雌激素受体的结 合。温育后，将细胞溶胶级分与葡聚糖-包被的木炭悬液混合，4℃保 持10分钟，离心，然后收集上清液。使用液体闪烁鸡尾酒法(Formula 989 Packard)用闪烁记数仪(LS 6000，Beckman)测定木炭上清中 保留的结合放射活性。同时在8种浓度双份检测化合物，以获得竞争 曲线来评价抑制活性。结合到雌激素受体的专一放射性配体定义为在 过量未标记的17β-雌二醇(6μM)存在下测定的总结合与非特异性结 合的差异。 结果

获得了有下面结构式的代表性化合物的下列抑制浓度：     检测     化合物的IC50     KDR     0.2μM     Flt-1     ＞50.0μM     Lck     ＞50.0μM     TIE2     ＞50.0μM     ZAP70     ＞50.0μM     EGFR     ＞50.0μM     PKC     ≥20μM     雌激素受体   ＞10.0μM(＜10％inh@10μM)

这些结果证明，本发明和此处例举的化合物有对KDR酪氨酸激酶 的显著抑制活性并且特别选择性地作为KDR酪氨酸激酶的抑制剂。 II.细胞RTK检测

使用下面的细胞检测测定本发明的不同化合物对KDR的活性和 效应。对于其它酪氨酸激酶，使用适当的抗体试剂和诸如免疫沉淀和 Western印迹等本技术领域熟知的技术，可以按同样的方法设计类似 的检测。 A.Western印迹测定的在人脐静脉内皮细胞(HUVEC)中VEGF-诱导的 KDR磷酸化。 1.从Clonetics(San Diego，CA)购买HUVEC细胞(来自混合供体) 并根据手册指导进行培养。只使用早期传代(3-8)进行检测。使用完 全EBM培养基(Clonetics)在100mm平皿(Falcon for tissue culture；Becton Dickinson；Plymouth，England)中培养细胞。 2.为了评价化合物的抑制活性，将细胞胰蛋白酶消化并以0.5-1.0×105 细胞/孔接种到6-孔聚簇平板(Costar；Cambridge，MA)。 3.接种3-4天后，平板90-100％铺满。从所有的孔中除去培养基，用 5-10ml PBS清洗细胞并与5ml不含添加剂(即血清饥饿)的EBM 基本培养基温育18-24小时。 4.将系列稀释的抑制剂在1ml EBM培养基中加到细胞，终浓度为25μM， 5μM，或1μM并在37℃温育1小时。然后将人重组VEGF(165)(R&D Systems)加到所有孔中，在2ml的EBM培养基中的终浓度是50ng/m1 并在37℃温育10分钟。使用未处理或只用VEGF处理的对照细胞评价 背景磷酸化或VEGF诱导的磷酸化。 5.然后用5-10ml含有1mM原钒酸钠(Sigma)的冷PBS清洗所有的 孔，并在含有蛋白酶抑制剂(PMSF 1mM，抑蛋白酶肽1μg/ml，胃蛋白 酶抑制剂1μg/ml，亮抑蛋白酶肽1μg/ml，钒酸钠1mM，氟化钠 1mM)和1μg/ml DNA酶的200μl RIPA缓冲液(50mM Tris-HCl pH7， 150mM NaCl，1％NP-40，0.25％脱氧胆酸钠，1mM EDTA)(所有化 学药品来自Sigma Chemical Company，St Louis，MO)中裂解和刮下 细胞。将裂解物在14,000rpm离心30分钟除去核。 6.通过加入冷(-20℃)乙醇(2倍体积)至少1小时或至多过夜， 沉淀等量的蛋白质。在含有5％β-巯基乙醇(BioRad；Hercules，CA) 的Laemli样品缓冲液中重建沉淀物并煮沸5分钟。使用聚丙烯酰胺凝 胶电泳(6％，1.5mm Novex，San Deigo，CA)分离蛋白质并使用Novex 系统转移到硝酸纤维素膜。用牛血清白蛋白(3％)封闭后，在4℃用 抗-KDR多克隆抗体(C20，Santa Cruz Biotechnology；Santa Cruz， CA)或抗-磷酸酪氨酸单克隆抗体(4G10，Upstate Biotechnology， Lake Placid，NY)过夜探测。清洗并与HRP-缀合的羊抗-兔或羊-抗- 鼠IgG的F(ab)2温育1小时后，使用发射化学发光(ECL)系统 (Amersham Life Sciences，Arlington Height，IL)显示条带。 结果

有下列结构的一种代表性化合物I的抑制浓度是：     HUVEC     化合物的细胞IC50     KDR磷酸化     5-10μM 还证实了这种化合物的KDR酪氨酸激酶选择性(参见地I部分)。

这些结果证明，本发明的适当化合物对VEGF-诱导的内皮细胞中 KDR酪氨酸激酶的酪氨酸磷酸化有显著抑制活性。 III.子宫水肿模型

本试验测定化合物抑制雌激素刺激后开始的几个小时发生的小鼠 子宫重量的急性增加的能力。已知子宫重量增加的早期发作是由于子 宫脉管系统增高的渗透性造成的水肿引起的。Cullinan-Bove和Koss (Endocrinology(1993)，133：829-837)证明了雌激素-刺激的子 宫水肿与子宫的VEGF mRNA的升高的表达有密切的暂时关系。使用 VEGF的中和单克隆抗体证实了这些结果，该单抗能显著降低雌激素刺 激后子宫重量的急性增加(WO 97/42187)。因此，这一系统可以作为 抑制VEGF-介导的渗透性过高和水肿的体内模型。 材料：所有的激素以冻干粉购自Sigma(St.Louis，MO)或Cal Biochem (La Jolla，CA)并根据供应商说明来制备。 赋形剂组分(DMSO，Cremaphor EL)购自Sigma(St.Louis，MO)。 小鼠(Balb/c，8-12周龄)购自Taconic(Germantown，NY)并依据 研究所动物照料和使用委员会指南(institutional Animal Care and Use Committee Guidelines)在无病原动物培养设备内喂养。 方法： 第一天：向Balb/c小鼠腹膜内(i.p.)注射12.5单位的孕马血清促 性腺激素(PMSG)。 第三天：小鼠通过i.p.接受人绒毛膜促性腺激素(hCG)。 第四天：将小鼠随机化并分为5-10只的各组。根据溶解性和赋形剂以 1-200mg/kg的剂量范围通过腹膜内(i.p.)，静脉内(i.v.)或口服 (p.o.)途径将实验化合物给药。赋形剂对照组只接受赋形剂，两组 未处理。 典型地，30分钟后，向实验组，赋形剂组和一个未处理组i.p.注射 17β-雌二醇(500μg/kg)。2-3小时后，通过二氧化碳吸入杀死动物。 中线切口后，通过切割子宫颈紧下方以及子宫与输卵管之间的连接部 分分离和取出各子宫。小心的除去脂肪和结缔组织，不影响称重前子 宫的完整性。将处理组的平均体重与未处理的或赋形剂处理组的相比 较。通过Student检验确定显著性。使用未刺激的对照组监测雌二醇 反应。 结果

对于100mg/kg剂量的三种途径给药，获得了有下列结构式的代表 性化合物对雌二醇刺激后子宫水肿的抑制百分数。     给药途径     ％抑制     P值     p.o.     17     ns     i.v.     57     0.01     i.p.     52     0.04

此处证明化合物I在体外抑制激酶活性方面是KDR-选择性的，并 且能有效阻断响应于VEGF-刺激的KDR的细胞自磷酸化。

这些结果证明选择性地抑制KDR功能的本发明的合适的化合物如 化合物I有效地阻断水肿的形成。结果还证实对这种化合物的i.v.和 i.p.给药特别有效。重要的是，用多种结构不同的KDR功能的选择性 抑制剂也获得类似的抗水肿效果。 等价物

虽然参考优选实施方案具体地公开和描述了本发明，本领域熟练 人员将会理解不需背离附录的权利要求书定义的本发明的精神和范围 即可进行形式和细节的多种改变。只使用常规方法，本领域熟练人员 将会认识到或能够判断此处具体描述的本发明的特定实施方案的等价 物。这类等价物将包含在本发明的范围内。