一种诱导人成纤维细胞重编程成骨细胞的方法
阅读：47发布：2020-05-11
专利汇可以提供一种诱导人成纤维细胞重编程成骨细胞的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及了一种将人 成 纤维 细胞 重编程并诱导成骨细胞的方法，它包括：解冻复苏成纤维细胞，待细胞生长至对数期后利用5μM reversine处理人成纤维细胞4d，之后利用成骨细胞诱导液进行诱导，7d后可将其诱导为成骨细胞的方法。本发明可以简单快速地获得成骨细胞，本发明为 基础 研究带来便捷，为临床应用带来前景。，下面是一种诱导人成纤维细胞重编程成骨细胞的方法专利的具体信息内容。
1.一种诱导人成纤维细胞重编程成骨细胞的方法，其特征在于，步骤如下：
（1）人成纤维细胞经reversine处理
5
将人成纤维细胞密度调整为1×10 个细胞/ml，接种于6孔板中，待细胞生长至对数期后利用5μM的reversine处理成纤维细胞4天后，细胞的形态由原来的长梭型变为扁平，细胞间隙不明显，紧贴在培养板上，细胞的大小变成原细胞两或多倍，具有双核或多核；
（2）利用成骨细胞诱导液诱导成骨细胞
将reversine处理前后的成纤维细胞的培养基弃去，更换为成骨细胞诱导培养液，此-2
后，每隔23天更换一次培养液，持续诱导7天，其中所述诱导培养液为1×10 Mβ-甘油磷-7
酸 + 50mg/L Vc + ×10 M地塞米松 + 10%FBS + 低糖-DMEM培养基。
一种诱导人成纤维细胞重编程成骨细胞的方法
技术领域
背景技术
[0002] 细胞重编程是目前生命科学中最为活跃和重要的研究领域之一，细胞重编程不仅在基础理论研究中，而且在应用研究中都有着重要的作用。谱系重编程( lineage reprogramming) 作为诱导重编程的一项新策略是直接将成熟细胞转分化为其他类型的功能细胞或祖细胞，这项技术不仅在再生医学领域具有广阔的应用前景，而且在动物生物技术中也应用广泛。它不但避免了伦理争议，还提供了便利的重编程方法，同时也为基因表达调控的研究提供了重要的手段。
[0003] 普遍认为，要使已分化细胞从一种类型转变为另一种，往往需要回到一个未分化的阶段，即不论是通过核移植、细胞融合还是借助于一些特定因子的介导来实现重编程都会经历一个回到“起点”的过程。2008年，哈佛大学Douglas Melton教授领导的研究小组将一种已分化的成体细胞原位转变成另一类型的功能细胞，但并没有预先退回到多能干细胞状态。2010年1月27日，美国斯坦福大学医学院的Marius Wernig等宣布，他们在诱导细胞重编程实验中绕过诱导型多能干细胞( induced pluri-potent stem cells，iPS)这一步骤，首次在体外将小鼠胚胎和成体成纤维细胞直接转化为具有功能的神经元。
[0004] 2006年， Yamanaka课题组通过对多达24种的染色质重塑因子进行多能性诱导能力测试发现，由Oct-3/4、Sox2、c-Myc和KLF4等四种因子引起的基因重排可获得在形态、增殖和畸胎瘤形成能力等方面与胚胎干细胞(embryonic stem cell ESCs)细胞相似的小鼠iPS。2007年，人iPS细胞诞生，该成果被视为重编程研究领域一个“里程碑”式的突破。值得注意的是，虽然iPS细胞产生于一个近乎完全扭转了的“发育”过程，且几乎所有的表观遗传学标记都已被抹去，但它却还必须在体外经诱导成为成熟的功能细胞(如神经元、成骨细胞和心肌细胞等)后才可应用于临床。正当大部分人都把目光聚集iPS细胞的时候，另外一种可使成熟细胞退回到祖细胞状态甚至直接转变细胞类型的策略开始引起了人们的注意。早在1973年，Eguchi和Okada就提出了转分化(transdifferentiation)的概念，其是指一种分化完全的细胞丢失其原有表型而转变为其他类型细胞的现象。2002年，Brockes和Kumar发现在成年蝾螈四肢再生过程中，皮肤、肌肉和软骨细胞均先去分化成为祖细胞，再分化形成新的四肢。经过此种转变，许多表观遗传标记得以保存，且获得的祖细胞或成熟细胞可直接用于临床2007年3月， Science杂志的一项研究成果揭示，一个早为人知的神经元调节蛋白p75NTR可能在肝脏修复过程中起重要作用，其有希望成为控制肝脏疾病药物的一个有效靶标。2008年8月，波士顿Dana-Farber癌症研究所的科研人员发现，小鼠棕色脂肪前体细胞中的转录调节因子PRDM16基因缺失会造成棕色脂肪的特质消失并促进其向肌细胞分化。这一发现让人们有望将多余的白色脂肪转化为棕色脂肪，增大抗击肥胖症的可能性，更为重要的是，脂肪细胞很有希望成为谱系重编程的下一个突破口。
[0005] 2009年3月，美国科学家在cell杂志上发表文章称首次成功从iPS细胞中移除了外源基因，而原细胞仍具备干细胞特性，此项改进将避免外源基因可能引起的癌变等潜在危险，提高外源因子诱导重编程的安全等级。干细胞在体内外的生物学特性差异显著，因此建立有效的动物模型和方法体系，追踪发育和修复过程中特定类型细胞在分子水平上的变化，是鉴别关键基因，找寻重编程作用靶点，认识表观遗传学机制的重要环节。将病人自身的体细胞直接转化成多种功能细胞以用于临床治疗是再生医学的梦想。在过去的两年间，全世界对于该领域的研究热情空前高涨，人们尝试了多种策略去启动重编程事件以获得新的细胞类型。作为诱导重编程的一项新策略，人们对谱系重编程的系统研究才刚刚起步，尽管前路充满了挑战，但我们仍乐观地看到了其成为未来再生医学重要组成部分的优势和希望。正如波士顿儿童医院的干细胞生物学家George Daley在评论Marius Wernig等人新取得的研究成果时所言，“这是一项激动人心的工作，并有可能成为继Yamanaka的突破之举之后一轮新的研究浪潮的开始”。
[0006] 在谱系重编程临床应用前，还需解决一些问题。首先是谱系重编程的诱导效率较低，可采用化学物质、低氧环境和寻找更优的转录因子等方法进一步提高诱导效率。其次是目的细胞增殖能力较差，将供体细胞先重编程为祖细胞提供了相应的解决手段。再次是临床应用的安全性：第一，目前常用的慢病毒和逆转录病毒载体可能会引起基因插入突变，对此可采用和iPS技术相似的方法，如使用游离质粒载体、融合蛋白和转座子等多种技术手段进行改善；第二，对于目的细胞和d然细胞的差异性需要验证，判断其是否真正能行使细胞代替功能；第三，目的细胞的纯化问题，即如何有效的去除杂细胞的污染，包括供体细胞、未完全转化的细胞及少量其他细胞，第四，目的细胞发挥功能的持久性，需验证获得的功能细胞在体内的维持时间。
[0007] 2004年 Chen 等将C2C12 成肌细胞置于含不同化学小分子物质的培养基中培养4 d，然后再转移至含有成骨诱导因子的培养基中诱导其向成骨细胞分化。在筛选了近50000 种化学小分子物质后，该团队发现其中一种化学小分子2，6 二甲基嘌呤衍生物C21H27N7O（即reversine），可以使C2C12 细胞重新编程，并能在不同培养条件下诱导分化为成骨细胞或脂肪细胞，首次发现利用化学小分子可诱导分化成熟的成体细胞转变成类干细胞。化学小分子诱导细胞重新编程转变为类干细胞有其独特优势：①诱导过程短，药物可快速高效到达靶细胞；②可控性，可以准确控制药物达到需要的浓度；③与基因转染相比，操作简便且诱导效率高；④成本低，化学小分子一旦确定可以大规模生产。
[0008] 本发明提出了一种利用Reversine提高人成纤维细胞重编程并诱导成骨细胞的方法。
发明内容
[0009] 本发明提出了一种简单、快速可以将人成纤维细胞可以诱导分化为成骨细胞的方法。
[0010] 为了完成本发明目的，本发明采用以下技术方案：
[0011] （1）解冻复苏人成纤维细胞;
[0012] （2）待细胞生长至对数期后利用5μM的reversine处理成纤维细胞4d；
[0013] （3）reversine处理成纤维细胞4d后加入成骨细胞诱导液进行诱导；
[0014] （4）诱导7d中央可见到类似结节状的结构；
[0015] （5）经茜素红、RT-PCR鉴定为成骨细胞。
具体实施方式
[0016] 1、成纤维细胞经Reversine处理
[0017] 调整细胞的密度为1×105个细胞/ml接种于6孔板中，待细胞生长至对数期后利用5μM的reversine处理成纤维细胞4d后，细胞的形态由原来的长梭型变为扁平，细胞间隙不明显，紧贴在培养板上，细胞的大小，变成原细胞两或多倍，具有双核甚至多核。
[0018] 2、利用成骨细胞诱导液诱导成骨细胞
[0019] 将reversine处理前后的成纤维细胞的培养基弃去，更换为成骨细胞诱导培养液-2 -7（10 M β-甘油磷酸+50mg/L Vc+10 M 地塞米松+10% FBS+低糖-DMEM培养基），此后，每隔2~3d更换一次培养液，持续诱导7d。成骨诱导分化前3d，细胞增殖速度加快，到第5d时，细胞的体积开始增大，第 7d时，细胞形态呈多样性，密集生长，中央可见到类似结节状的结构，部分细胞呈层叠样生长，显微镜下可见细胞层表面有小块物质聚集，折光性很强，高倍镜下见细胞胞浆内的颗粒样物质浓度增高；并大量团聚，高倍镜下可见局部细胞外基质沉积。
[0020] 3、茜素红染色鉴定
[0021] ① 将旧的诱导液吸除，将诱导后的细胞暴露，利用PBS清洗细胞3次；
[0022] ② 取含4%多聚甲醛的固定液固定细胞30min；
[0023] ③ 去固定液，利用2%的茜素红染液，37℃，孵育30min，可放在培养箱中进行；
[0024] ④ 弃去茜素红染色液，利用超纯水清洗3次以上，以避免出现假阳性或者扩散的现象；
[0025] ⑤ 在倒置显微镜下观察诱导细胞的着色情况，拍照。
[0026] ⑥ 对照组以相同步骤进行染色并拍照。
[0027] 4、RT-PCR检测成骨细胞特异性基因表达鉴定
[0028] 利用RT-PCR检测处理组与对照组的成骨细胞特异性基因的表达情况。首先，提取细胞的总RNA进行反转录。利用成骨细胞特异性基因：Ⅰ型胶原(Collagen typeⅠ)和骨桥蛋白(Osteopontin，OPN)的引物，检测基因表达情况。
[0029] （1） 细胞收集
[0030] 将要进行检测的细胞，按常规方法消化收集细胞，1200rpm/min离心8min后，利用PBS洗涤细胞沉淀2次。
[0031] （2） 细胞总RNA的提取
[0032] ① 用1ml 的Trizol将沉淀后的细胞接触并充分吹打，将细胞的悬液移至1.5ml的离心管中，于室温下静置5min，以充分裂解细胞；
[0033] ② 将200μl的氯仿抽提液加入到上述离心管中，上下颠倒震荡混匀，在室温下静置2-3min后待反应液分层；
[0034] ③ 将离心管置于低温的高速离心机中，在4℃和12000rpm/min的条件下，连续离心12min。发现离心后的液体明显被分为3层，按照从上到下依次被分为为水相层、中间层及有机相层，而要提取的RNA正处于上层的水相层中；
[0035] ④ 将水相层吸出后转移至另一个1.5ml的EP管中，在其中加入400μl的异丙醇来沉淀核酸，混匀后于室温条件下，静置10min；
[0036] ⑤ 仍然于4℃，12000rpm/min条件下，离心管中的液体，12min。离心后可以发现有白色的沉淀在管底出现；
[0037] ⑥ 吸出上清液并弃之，用DEPC水配制的75%乙醇洗涤沉淀2次；
[0038] ⑦ 4℃，12000rpm/min，离心8min；
[0039] ⑧ 小心弃去上清液，在室温条件下晾干，待白色沉淀转变为无色；
[0040] ⑨ 在提取的RNA沉淀中加入20-40μl的ddFree水进行溶解；
[0041] ⑩ 利用紫外分光光度计，来测定260nm和280nm下的OD值以及RNA的浓度。若提取的RNA无污染、无降解，则OD260/280的值应该在1.8-2.0之间为准。
[0042] 在RNA提取过程中，所用的器具均需要用DEPC水提前处理24h以上，于121℃高压灭菌30min后，于烘箱内烘干备用。
[0043] （3）cDNA的合成
[0044] 利用TaKaRa RNA PCR Kit将提取的总RNA进行反转录合成扩增cDNA。
[0045] 反应体系：MgCl2 2.0μl，10×RT Buffer 1.0μl，dNTP Mixture(各10mM)1.0μl，Rnase Free H2O 3.75μl ，AMV Reverse Transcriptase 0.5μl，Rnase Inhibitor 0.25μl，Random 9mers 0.5μl ，RNA 1.0μl
[0046] 反应条件：30℃ 10min ，2℃ 30min，99℃ 5min，5℃ 5min，合成的cDNA于-20℃保存备用。
[0047] （4）引物设计
[0048] 相关基因序列均从NCBI网站上获得，经过比对分析选取CDS区保守序列，利用Primer Premier 5.0软件设计出的特异性引物 (表1)。提供引物设计的单位是上海生工生物技术有限公司。Collagen typeⅠ)和骨桥蛋白(Osteopontin，OPN)
[0049] 表 1诱导分化细胞标记基因引物序列
[0050]
[0051] RT-PCR 反 应 体 系：dNTP(2.5mM)2.0μl，10×Buffer2.5μl，Takara EX-Taq HS0.25μl，ddH2O16.75μl，上游引物(10μM)1.0μl，下游引物(10μM)1.0μl，cDNA模板1.5μl，总体积25μl
[0052] 反应条件：
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