单碱基连续延伸流式靶向测序法
阅读：988发布：2020-07-02
专利汇可以提供单碱基连续延伸流式靶向测序法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种单 碱 基连续延伸流式靶向测序法，该方法利用含待测核酸 片段 互补序列的单链核苷酸片段、引物、微球、核酸聚合酶、 荧光 标记的ddNTP、核糖3'-OH被保护的荧 光标 记的dNTP、核糖3'-OH被保护的dNTP、核糖3'-OH去保护剂等，通过引物的单碱基延伸，得到了一系列适用于流式细胞仪检测核酸碱基序列的测序微球，将这些测序微球进一步经流式细胞仪进行检测，可以得到待测核酸片段的碱基序列。与现有测序法相比，本发明具有简洁、准确及数据易解读等显著优点，能广泛用于基因检测、 微 生物 检查、遗传学、外显子、单核苷酸多态性(SNP)、基因组学和 蛋白质 组学等核酸测序领域。，下面是单碱基连续延伸流式靶向测序法专利的具体信息内容。
1.单碱基连续延伸流式靶向测序法，其特征是包括以下步骤：
(1)将引导待测核酸片段合成的修饰单向引物或含待测核酸片段互补序列的单链核苷酸片段包被在微球表面，得包被微球；
(2)将包被微球、含待测核酸片段互补序列的单链核苷酸片段或引导待测核酸片段合成的修饰单向引物、缓冲液混合，所得混合物进行孵育杂交；
(3)缓冲液洗涤、悬浮微球，将微球分为两份，其中一份微球与核酸聚合酶、缓冲液、核糖3'-OH被保护的dNTP混合，所得混合物进行孵育；另一份微球与核酸聚合酶、缓冲液、荧光标记的ddNTP或/和核糖3'-OH被保护的荧光标记的dNTP混合，所得混合物进行孵育；
(4)将上一步与核糖3'-OH被保护的dNTP混合后进行孵育的微球进行洗涤，再加入核糖
3'-OH去保护剂，混合均匀；
(5)缓冲液洗涤、悬浮上一步的微球，将微球分为两份，其中一份微球与核酸聚合酶、缓冲液、核糖3'-OH被保护的dNTP混合，所得混合物进行孵育；另一份微球与核酸聚合酶、缓冲液、荧光标记的ddNTP或/和核糖3'-OH被保护的荧光标记的dNTP混合，所得混合物进行孵育；
(6)不断重复上述（4）和（5）的步骤，测序待测核酸片段n个碱基共需连续制备n群微球，共得到与荧光标记的ddNTP或/和核糖3'-OH被保护的荧光标记的dNTP混合后进行孵育的n群微球；
(7)如果利用上述步骤（6）的n群微球无法检测出所有的碱基，则替换步骤（3）和（5）的荧光标记的ddNTP或/和核糖3'-OH被保护的荧光标记的dNTP，更换容器，采用步骤（2）-（6）继续制备微球，共得到4×n或2×n群微球；
(8)将步骤（6）和（7）中得到的4×n、或2×n、或n群微球洗涤、悬浮后，上样流式细胞仪进行检测，即可得到待测核酸片段的碱基序列。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征是：所述荧光标记的ddNTP为荧光标记的ddATP、ddGTP、ddCTP和ddUTP/ddTTP中的至少一种；
优选的，所述核糖3'-OH被保护的荧光标记的dNTP为核糖3'-OH被保护的荧光标记的dATP、dGTP、dCTP和dUTP/dTTP中的至少一种；
优选的，所述核糖3'-OH被保护的dNTP为核糖3'-OH被保护的dATP、dTTP/dUTP、dGTP和dCTP的混合物；
优选的，微球上包被的是引导待测核酸片段合成的修饰单向引物时，步骤（2）中加入的是含待测核酸片段互补序列的单链核苷酸片段；微球上包被的是含待测核酸片段互补序列的单链核苷酸片段时，步骤（2）中加入的是引导待测核酸片段合成的修饰单向引物。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征是：所述荧光标记的ddNTP或核糖3'-OH被保护的荧光标记的dNTP被下述任意一种或多种的荧光物质进行标记：异硫氰酸荧光素、Alexa Fluor 610、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 700、菁染料Cy5、德克萨斯红、菁染料Cy3、菁染料Cy7、羟基荧光素、萤光黄、菁染料Cy5.5、罗丹明
110、ROX、罗丹明6G、TAMRA。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征是：步骤（3）和（5）中加入任意两种荧光标记的ddNTP或核糖3'-OH被保护的荧光标记的dNTP，得到n群微球，然后将步骤（3）和（5）中的两种荧光标记的ddNTP或核糖3'-OH被保护的荧光标记的dNTP替换为另两种荧光标记的ddNTP或核糖3'-OH被保护的荧光标记的dNTP，更换容器，采用步骤（2）-（6），得到n群微球，共得2n群微球。
5.根据权利要求1或4所述的方法，其特征是包括以下步骤：
(1)将引导待测核酸片段合成的修饰单向引物或含待测核酸片段互补序列的单链核苷酸片段包被在微球表面，得包被微球；
(2)容器Ⅰ中加入步骤（1）得到的包被微球、含待测核酸片段互补序列的单链核苷酸片段或引导待测核酸片段合成的修饰单向引物、缓冲液，混匀，进行孵育杂交；
(3)缓冲液洗涤、悬浮微球，留存部分微球在容器Ⅰ中，另一部分微球从容器Ⅰ中移至容器Ⅱ中，容器Ⅰ中加入核酸聚合酶、缓冲液、核糖3'-OH被保护的dNTP，进行孵育；容器Ⅱ中加入核酸聚合酶、缓冲液、两种荧光标记的ddNTP或两种核糖3'-OH被保护的荧光标记的dNTP，进行孵育，容器Ⅱ中所得测序微球记为A1；所述核糖3'-OH被保护的dNTP为核糖3'-OH被保护的dATP、核糖3'-OH被保护的dTTP/dUTP、核糖3'-OH被保护的dGTP和核糖3'-OH被保护的dCTP；
(4)洗涤容器Ⅰ中微球后，容器Ⅰ中再加入核糖3'-OH去保护剂，混合均匀；
(5)缓冲液洗涤、悬浮容器Ⅰ中的微球，留存部分微球在容器Ⅰ中，另一部分微球从容器Ⅰ中移至容器Ⅲ中，容器Ⅰ中加入核酸聚合酶、缓冲液、核糖3'-OH被保护的dNTP，进行孵育；容器Ⅲ中加入核酸聚合酶、缓冲液、两种荧光标记的ddNTP或两种核糖3'-OH被保护的荧光标记的dNTP，进行孵育，容器Ⅲ中所得测序微球记为A2；所述核糖3'-OH被保护的dNTP为核糖
3'-OH被保护的dATP、核糖3'-OH被保护的dTTP/dUTP、核糖3'-OH被保护的dGTP和核糖3'-OH被保护的dCTP；
(6)不断重复类似（4）和（5）的步骤，共得到n群加入荧光标记的ddNTP或核糖3'-OH被保护的荧光标记的dNTP进行孵育的测序微球，最后一群测序微球记为An，其中n为待测核酸片段的碱基数目；
(7)容器①中加入步骤（1）得到的包被微球、含待测核酸片段互补序列的单链核苷酸片段或引导待测核酸片段合成的修饰单向引物、缓冲液，混匀，进行孵育杂交；
(8)缓冲液洗涤、悬浮微球，留存部分微球在容器①中，另一部分微球从容器①中移至容器②中，容器①中加入核酸聚合酶、缓冲液、核糖3'-OH被保护的dNTP，进行孵育；容器②中加入核酸聚合酶、缓冲液、与步骤（3）中的不同的另外两种荧光标记的ddNTP或与步骤（3）中的不同的另外两种核糖3'-OH被保护的荧光标记的dNTP，进行孵育，容器②中所得测序微球记为B1；所述核糖3'-OH被保护的dNTP为核糖3'-OH被保护的dATP、核糖3'-OH被保护的dTTP/dUTP、核糖3'-OH被保护的dGTP和核糖3'-OH被保护的dCTP；
(9)洗涤容器①中微球后，容器①中再加入核糖3'-OH去保护剂，混合均匀；
(10)缓冲液洗涤、悬浮容器①中的微球，留存部分微球在容器①中，另一部分微球从容器①中移至新的容器③中，容器①中加入核酸聚合酶、缓冲液、核糖3'-OH被保护的dNTP，进行孵育；容器③中加入核酸聚合酶、缓冲液、与步骤（5）中的不同的另外两种荧光标记的ddNTP或与步骤（5）中的不同的另外两种核糖3'-OH被保护的荧光标记的dNTP，进行孵育，容器③中所得测序微球记为B2；所述核糖3'-OH被保护的dNTP为核糖3'-OH被保护的dATP、核糖3'-OH被保护的dTTP/dUTP、核糖3'-OH被保护的dGTP和核糖3'-OH被保护的dCTP；
(11)不断重复类似（9）和（10）的步骤，共得到n群加入荧光标记的ddNTP或核糖3'-OH被保护的荧光标记的dNTP进行孵育的微球，最后一群微球记为Bn，其中n为待测核酸片段的碱基个数；
(12)将A1-An和B1-Bn这些微球洗涤、悬浮，进一步经流式细胞仪进行检测，可以得到待测核酸片段的碱基序列。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征是：步骤（3）和（5）中，所述2种荧光标记的ddNTP为荧光标记的ddATP和荧光标记的ddTTP/ddUTP，所述2种核糖3'-OH被保护的荧光标记的dNTP为核糖3'-OH被保护的荧光标记的dATP和核糖3'-OH被保护的荧光标记的dTTP/dUTP；
步骤（8）和（10）中，所述荧光标记的ddNTP为荧光标记的ddGTP和荧光标记的ddCTP，所述核糖3'-OH被保护的荧光标记的dNTP为核糖3'-OH被保护的荧光标记的dGTP和核糖3'-OH被保护的荧光标记的dCTP。
7.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征是：所述微球为尺寸均一的微球、尺度编码的微球、不含荧光的微球或荧光编码的微球；
优选的，微球的直径为0.5-50μm ，更优选为1-10μm；
优选的，所述微球为经羧基、氨基、羟基、酰肼基、醛基、氯甲基、环氧乙烷、抗体、核酸适配体、链霉亲和素、poly T、poly A、poly G、poly C、poly U和甲基化CpG结合结构域蛋白、二甲基胺、巯基中的至少一种进行修饰的微球，更优选为羧基化微球。
8.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征是：所述待测核酸片段为单链DNA片段；
优选的，所述核酸聚合酶为DNA依赖的DNA聚合酶；
优选的，所述修饰单向引物是经氨基、羧基、地高辛、生物素、poly A、poly G、poly C、poly T、poly U和甲基中的至少一种进行修饰的单向引物，更优选为经氨基修饰的单向引物。
9.根据权利要求1、2或5所述的方法，其特征是：每次孵育时，孵育体系中微球的终浓度均为5×102个/ml-2.5×108个/ml，核酸聚合酶的终浓度均为2-480 units/ml，每种荧光标记的ddNTP的终浓度均为0.1-50 μmol/L，每种核糖3'-OH被保护的荧光标记的dNTP的终浓度均为0.1-50 μmol/L，每种核糖3'-OH被保护的dNTP的终浓度均为0.1-50 μmol/L。
10.根据权利要求1或9所述的方法，其特征是：孵育在下述容器中进行：24孔板孔、24孔滤板孔、96孔板孔、96孔滤板孔、384孔板孔、384孔滤板孔、离心管或EP管，每次孵育所用的容器相同或者不同；
优选的，每次孵育的温度均为20-95℃，更优选为32-70℃；
优选的，每次孵育时，孵育体系的总体积均为10μl-10ml，更优选为10μl-1000μl。
单碱基连续延伸流式靶向测序法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种单碱基连续延伸流式靶向测序法，尤其涉及一种适用于流式细胞仪检测的测序微球的制备方法以及采用该测序微球检测核酸碱基序列的方法，属于基因测序技术领域。
背景技术
[0002] 基因组携带了生命个体的全部遗传信息，基因测序不但能够加深对疾病尤其是恶性肿瘤的分子机制理解，而且在指导靶向给药方面也发挥着重要作用。人类基因组学计划完成后，基因测序技术的发展更加迅猛，在临床实践和基础研究中的应用更加广泛。目前，核酸测序法已发展至三代，从最初第一代以Sanger测序为代表的直接检测技术和以连锁分析为代表的间接测序技术，到2005年以illumina公司的Solexa技术和ABI公司的SOLiD技术为标志的第二代测序（next-generation sequencing，NGS），到以SMRT、Nanopore法为代表的第三代测序，这些测序法虽然在不断地提高基因测序的效率和准确性，但仍然存在操作复杂和数据不易解读(如：基因结构重排和重复区域)等问题，制约了其大规模临床应用。
[0003] 流式细胞技术是利用流式细胞仪对单个细胞或颗粒进行多参数、快速的定量分析的技术，具有速度快、精度高、准确性好的优点，是先进的生物传感技术之一。已有基于引物或探针包被微球的流式细胞分析只能用于单碱基和核苷酸片段的识别，而不能用于碱基测序。因此发展一种适用于流式细胞仪的单碱基连续延伸流式靶向测序法具有重大价值。
发明内容
[0004] 本发明的目的是提供一种适用于流式细胞仪检测核酸碱基序列的单碱基连续延伸流式靶向测序法，该方法通过制备针对待测核酸序列的测序微球，再以流式细胞仪检测该测序微球，可以准确地识别待测核酸片段的碱基序列。
[0005] 目前，基因检测在遗传学、产前诊断、及伴随诊断等医学领域中有重要的应用。例如：通过基因检测确定患者特定基因片段的突变位点，能够指导靶向给药，提高肿瘤的治疗效果。而现有流式细胞技术仅能对单个碱基和寡核苷酸片段进行识别，而不能用于碱基测序。本发明提供了适用于流式细胞仪进行核酸测序的单碱基连续延伸流式靶向测序法，利用该方法制备测序微球并用流式细胞仪检测测序微球，能够得到具体的核酸碱基序列，进而可以解读基因突变的信息，对发病机理阐述、患病个体诊治都有重要意义。
[0006] 本发明的技术方案如下：一种单碱基连续延伸流式靶向测序法，该方法包括以下步骤：
(1)将引导待测核酸片段合成的修饰单向引物或含待测核酸片段互补序列的单链核苷酸片段包被在微球表面，得包被微球；
(2)将包被微球、含待测核酸片段互补序列的单链核苷酸片段或引导待测核酸片段合成的修饰单向引物（简称单向引物或修饰单向引物，下同）、缓冲液混合，所得混合物进行孵育杂交；
(3)缓冲液洗涤、悬浮微球，将微球分为两份，其中一份微球与核酸聚合酶、缓冲液、核糖3'-OH被保护的dNTP（deoxynucleoside triphosphate，脱氧核苷三磷酸）混合，所得混合物进行孵育；另一份微球与核酸聚合酶、缓冲液、荧光标记的ddNTP（dideoxynucleoside triphosphate，双脱氧核苷三磷酸）或/和核糖3'-OH被保护的荧光标记的dNTP混合，所得混合物进行孵育；
(4)将上一步与核糖3'-OH被保护的dNTP混合后进行孵育的微球进行洗涤，再加入核糖
3'-OH去保护剂，混合均匀；
(5)缓冲液洗涤、悬浮上一步的微球，将微球分为两份，其中一份微球与核酸聚合酶、缓冲液、核糖3'-OH被保护的dNTP混合，所得混合物进行孵育；另一份微球与核酸聚合酶、缓冲液、荧光标记的ddNTP或/和核糖3'-OH被保护的荧光标记的dNTP混合，所得混合物进行孵育；
(6)不断重复上述（4）和（5）的步骤，测序待测核酸片段n个碱基共需连续制备n群微球，共得到与荧光标记的ddNTP或/和核糖3'-OH被保护的荧光标记的dNTP混合后进行孵育的n群微球；
(7)如果利用上述步骤（6）的n群微球无法检测出所有的碱基，则替换步骤（3）和（5）的荧光标记的ddNTP或/和核糖3'-OH被保护的荧光标记的dNTP，更换容器，采用步骤（2）-（6）继续制备微球，共得到4×n或2×n群微球；
(8)将步骤（6）和（7）中得到的4×n、或2×n、或n群微球洗涤、悬浮后，上样流式细胞仪进行检测，即可得到待测核酸片段的碱基序列。
(1)将引导待测核酸片段合成的修饰单向引物或含待测核酸片段互补序列的单链核苷酸片段包被在微球表面，得包被微球；
(2)将包被微球、含待测核酸片段互补序列的单链核苷酸片段或引导待测核酸片段合成的修饰单向引物（简称单向引物或修饰单向引物，下同）、缓冲液混合，所得混合物进行孵育杂交；
(3)缓冲液洗涤、悬浮微球，将微球分为两份，其中一份微球与核酸聚合酶、缓冲液、核糖3'-OH被保护的dNTP（deoxynucleoside triphosphate，脱氧核苷三磷酸）混合，所得混合物进行孵育；另一份微球与核酸聚合酶、缓冲液、荧光标记的ddNTP（dideoxynucleoside triphosphate，双脱氧核苷三磷酸）或/和核糖3'-OH被保护的荧光标记的dNTP混合，所得混合物进行孵育；
(4)将上一步与核糖3'-OH被保护的dNTP混合后进行孵育的微球进行洗涤，再加入核糖
3'-OH去保护剂，混合均匀；
(5)缓冲液洗涤、悬浮上一步的微球，将微球分为两份，其中一份微球与核酸聚合酶、缓冲液、核糖3'-OH被保护的dNTP混合，所得混合物进行孵育；另一份微球与核酸聚合酶、缓冲液、荧光标记的ddNTP或/和核糖3'-OH被保护的荧光标记的dNTP混合，所得混合物进行孵育；
(6)不断重复上述（4）和（5）的步骤，测序待测核酸片段n个碱基共需连续制备n群微球，共得到与荧光标记的ddNTP或/和核糖3'-OH被保护的荧光标记的dNTP混合后进行孵育的n群微球；
(7)如果利用上述步骤（6）的n群微球无法检测出所有的碱基，则替换步骤（3）和（5）的荧光标记的ddNTP或/和核糖3'-OH被保护的荧光标记的dNTP，更换容器，采用步骤（2）-（6）继续制备微球，共得到4×n或2×n群微球；
(8)将步骤（6）和（7）中得到的4×n、或2×n、或n群微球洗涤、悬浮后，上样流式细胞仪进行检测，即可得到待测核酸片段的碱基序列。
[0007] 进一步的，上述方法中，所述n为待测核酸片段的碱基个数。
[0008] 进一步的，上述方法中，步骤（3）和（5）中加入的荧光标记的ddNTP或/和核糖3'-OH被保护的荧光标记的dNTP的种类为4种时，才能理论上利用所得测序微球得到待测核酸片段的所有碱基序列。根据步骤（3）和（5）中加入的荧光标记的ddNTP或/和核糖3'-OH被保护的荧光标记的dNTP的种类的不同，最终所得的测序微球的群数也不同，所述群的意思是每次所得的微球并非一个，而是多个，因此称之为群。根据荧光标记的ddNTP或/和核糖3'-OH被保护的荧光标记的dNTP的加入方式的不同，最终所得的测序微球的群数可以为n群、或2n群、或4n群。
[0009] 进一步的，微球上包被的是引导待测核酸片段合成的修饰单向引物时，步骤（2）中加入的是含待测核酸片段互补序列的单链核苷酸片段；微球上包被的是含待测核酸片段互补序列的单链核苷酸片段时，步骤（2）中加入的是引导待测核酸片段合成的修饰单向引物。
[0010] 进一步的，本发明以含待测核酸片段互补序列的单链核苷酸片段为模板，在核酸聚合酶催化下，一份微球通过加入核糖3'-OH被保护的dNTP而使单向引物末端延伸单个非荧光标记碱基，另一份微球通过加入荧光标记的ddNTP或/和核糖3'-OH被保护的荧光标记的dNTP而使单向引物末端延伸单个荧光标记碱基，该份微球保留用于碱基测序。单向引物末端延伸单个非荧光标记碱基后，通过加入核糖3'-OH去保护剂而使单向引物延伸链末端核酸核糖3'-OH去保护，然后将该份微球分成两份，一份继续继续加入核糖3'-OH被保护的dNTP，另一份加入荧光标记的ddNTP或/和核糖3'-OH被保护的荧光标记的dNTP，加入核糖3'-OH被保护的dNTP后，单向引物末端再次延伸单个非荧光标记碱基，加入荧光标记的ddNTP或/和核糖3'-OH被保护的荧光标记的dNTP后，单向引物末端延伸单个荧光标记碱基，所得微球保留用于测序。将加入核糖3'-OH被保护的dNTP孵育的微球再次加入核糖3'-OH去保护剂去保护，然后再次分为两份，按照上述相同的步骤分别加入核糖3'-OH被保护的dNTP和荧光标记的ddNTP或/和核糖3'-OH被保护的荧光标记的dNTP，以此类推，不断重复上述操作，直至得到测序n个碱基所需的所有测序微球。本发明选择加入荧光标记的ddNTP或/和核糖3'-OH被保护的荧光标记的dNTP进行孵育得到的微球为测序微球，这些测序微球可被流式细胞仪检测而用于识别待测核酸片段碱基序列。
[0011] 进一步的，上述制备方法中，所述微球为流式细胞技术所用的微球，例如聚苯乙烯微球，该微球可以通过市场购买得到。本发明所用微球可以是尺寸均一或者尺度编码的微球，也可以是不含荧光或者荧光编码的微球。微球的直径可以在0.5-50μm范围内选择，优选为1-10μm。
[0012] 进一步的，本发明微球为经过下述一种或多种方式进行修饰的微球：经羧基、氨基、羟基、酰肼基、醛基、氯甲基、环氧乙烷、抗体、核酸适配体、链霉亲和素、多聚胸苷酸(polythymidylic acid，poly T)、多聚腺苷酸(polyadenylic acid，poly A)、多聚鸟苷酸(polyguanylic acid，poly G)、多聚胞苷酸(polycytidylic acid，poly C)、多聚尿苷酸(polyuridylic acid，poly U)和甲基化CpG结合结构域(MBD)蛋白、二甲基胺、巯基中的至少一种进行修饰。微球修饰的目的是在微球表面引入可以与修饰单向引物或含待测核酸片段互补序列的单链核苷酸片段进行结合的基团，以便修饰单向引物或含待测核酸片段互补序列的单链核苷酸片段包被在微球表面。一般使用最广泛的是经过羧基进行修饰的微球，即羧基化微球。微球的修饰可以通过现有技术中报道的方法进行，也可以直接购买修饰的微球。
[0013] 进一步的，上述制备方法中，所述的待测核酸片段为单链脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid，DNA)片段，本发明所指的待测核酸片段指的是特定所需的某一片段，例如人类全基因组序列已经公开，其他动物或微生物的全基因组序列也有相关的报道，如果想要检测已知全基因组序列的人类、动物、微生物特定的某一段序列，那该段想要检测的序列即为待测核酸片段。针对该要检测的核酸片段的互补序列，设计单向引物。
[0014] 进一步的，上述制备方法中，所述单向引物是指以含待测核酸片段互补序列的单链核苷酸片段为模板、在核酸聚合酶催化下，能够在末端延伸碱基的引物。若要将单向引物包被到微球表面，就需对其进行修饰，以便单向引物上形成能够与微球上的修饰基团进行结合的基团。因此，本发明所用的包被在微球表面的修饰单向引物是经过氨基、羧基、地高辛、生物素、poly A、poly G、poly C、poly T、poly U和甲基中的至少一种进行修饰的单向引物。单向引物的设计和修饰可以送至相应的公司完成，例如上海生工公司。
[0015] 进一步的，上述制备方法中，将引导待测核酸片段合成的修饰单向引物或含待测核酸片段互补序列的单链核苷酸片段包被在微球表面，所述“包被”指的是修饰单向引物或单链核苷酸片段通过共价键或非共价键被固定在微球表面。本领域技术人员可以根据现有技术中公开的方法将修饰单向引物或含待测核酸片段互补序列的单链核苷酸片段包被在微球表面，例如通过静电吸附、化学键合等方式。
[0016] 进一步的，上述制备方法中，所述的核酸聚合酶为DNA依赖的DNA聚合酶，包括Taq DNA聚合酶、Klenow片段、测序酶（Sequenase）。
[0017] 进一步的，上述制备方法中，所述的dNTP为脱氧腺苷三磷酸(deoxyadenosine triphosphate，dATP)、脱氧鸟苷三磷酸(deoxyguanosine triphosphate，dGTP)、脱氧胞苷三磷酸(deoxycytidine triphosphate，dCTP)、脱氧尿苷三磷酸(deoxyuridine triphosphate，dUTP)、脱氧胸苷三磷酸(deoxythymidine triphosphate，dTTP)之一或者它们两种或两种以上的组合，脱氧尿苷三磷酸和脱氧胸苷三磷酸不同时出现。
[0018] 进一步的，上述制备方法中，所述的ddNTP为双脱氧腺苷三磷酸(dideoxyadenosine triphosphate，ddATP)、双脱氧鸟苷三磷酸(dideoxyguanosine triphosphate，ddGTP)、双脱氧胞苷三磷酸(dideoxycytidine triphosphate，ddCTP)、双脱氧尿苷三磷酸(dideoxyuridine triphosphate ddUTP)、双脱氧胸苷三磷酸
(dideoxythymidine triphosphate，ddTTP)之一或者它们两种或者两种以上的组合，双脱氧尿苷三磷酸和双脱氧胸苷三磷酸不同时出现。
(dideoxythymidine triphosphate，ddTTP)之一或者它们两种或者两种以上的组合，双脱氧尿苷三磷酸和双脱氧胸苷三磷酸不同时出现。
[0019] 进一步的，上述制备方法中，所述荧光标记的ddNTP和核糖3'-OH被保护的荧光标记的dNTP中，将ddNTP和核糖3'-OH被保护的dNTP进行荧光标记，以便在后续测序过程中使用，在本发明中，ddNTP和核糖3'-OH被保护的dNTP可以采用下述任意一种或多种的荧光物质进行标记：异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)、Alexa Fluor 610、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 700、菁染料Cy5(cyanine 5)、德克萨斯红(Texas Red)、菁染料Cy3(cyanine 3)、菁染料Cy7(cyanine 7)、羟基荧光素(FAM)、萤光黄(lucifer yellow)、菁染料Cy5.5(cyanine 5.5)、罗丹明110(rhodamine 110，R110)、ROX、罗丹明6G(rhodamine 6G，R6G)、TAMRA。
[0020] 进一步的，上述制备方法中，所述核糖3'-OH被保护的dNTP、荧光标记的ddNTP、核糖3'-OH被保护的荧光标记的dNTP可以从市场中购买得到，也可以参考«保护基化学»(武钦佩、李善茂 編著，化学工业出版社，北京，2007)、«Bioconjugate Techniques»(second edition,Greg T.Hermanson，Elsevier press,2008)中记载的方法自行制备。
[0021] 进一步的，上述制备方法中，所述缓冲液基本组成成分为Tris-HCl(pH7-7.5)、MgCl2、NaCl。
[0022] 进一步的，上述步骤（2）、（3）、（5）中，加入不同的成分配成孵育体系，然后控制合适的条件进行孵育。孵育可以在24孔板孔、24孔滤板孔、96孔板孔、96孔滤板孔、384孔板孔、384孔滤板孔、离心管、EP管等容器中进行，每次孵育所用的容器可以相同，也可以不同。每次孵育时，孵育体系的总体积均为10μl-10ml，优选为10μl-1000μl。孵育体系指的是每次孵育时将所需的各种成分混合形成的混合物。每次孵育时，孵育体系中微球的终浓度均为5×
102个/ml至2.5×108个/ml，核酸聚合酶的终浓度均为2-480 units/ml，每种核糖3'-OH被保护的dNTP的终浓度均为0.1-50 μmol/L，每种荧光标记的ddNTP的终浓度均为0.1-50 μmol /L，每种核糖3'-OH被保护的荧光标记的dNTP的终浓度均为0.1-50 μmol/L。核糖3'-OH被保护的dNTP为：核糖3'-OH被保护的dATP、核糖3'-OH被保护的dTTP/dUTP（dTTP/dUTP的意思是dTTP或dUTP，下同）、核糖3'-OH被保护的dGTP和核糖3'-OH被保护的dCTP的混合物，核糖3'-OH被保护的dATP、核糖3'-OH被保护的dTTP/dUTP、核糖3'-OH被保护的dGTP和核糖3'-OH被保护的dCTP中的任意一种的终浓度均为0.1-50 μmol/L。荧光标记的ddNTP为荧光标记的ddATP、荧光标记的ddTTP/ddUTP、荧光标记的ddGTP和荧光标记的ddCTP中的任意一种或几种，荧光标记的ddATP、荧光标记的ddTTP/ddUTP、荧光标记的ddGTP和荧光标记的ddCTP中的任意一种（如果加入的话）的终浓度均为0.1-50 μmol/L。核糖3'-OH被保护的荧光标记的dNTP为核糖3'-OH被保护的荧光标记的dATP、核糖3'-OH被保护的荧光标记的dTTP/dUTP、核糖3'-OH被保护的荧光标记的dGTP和核糖3'-OH被保护的荧光标记的dCTP中的任意一种或几种，核糖3'-OH被保护的荧光标记的dATP、核糖3'-OH被保护的荧光标记的dTTP/dUTP、核糖3'-OH被保护的荧光标记的dGTP和核糖3'-OH被保护的荧光标记的dCTP中的任意一种（如果加入的话）的终浓度均为0.1-50 μmol/L。
102个/ml至2.5×108个/ml，核酸聚合酶的终浓度均为2-480 units/ml，每种核糖3'-OH被保护的dNTP的终浓度均为0.1-50 μmol/L，每种荧光标记的ddNTP的终浓度均为0.1-50 μmol /L，每种核糖3'-OH被保护的荧光标记的dNTP的终浓度均为0.1-50 μmol/L。核糖3'-OH被保护的dNTP为：核糖3'-OH被保护的dATP、核糖3'-OH被保护的dTTP/dUTP（dTTP/dUTP的意思是dTTP或dUTP，下同）、核糖3'-OH被保护的dGTP和核糖3'-OH被保护的dCTP的混合物，核糖3'-OH被保护的dATP、核糖3'-OH被保护的dTTP/dUTP、核糖3'-OH被保护的dGTP和核糖3'-OH被保护的dCTP中的任意一种的终浓度均为0.1-50 μmol/L。荧光标记的ddNTP为荧光标记的ddATP、荧光标记的ddTTP/ddUTP、荧光标记的ddGTP和荧光标记的ddCTP中的任意一种或几种，荧光标记的ddATP、荧光标记的ddTTP/ddUTP、荧光标记的ddGTP和荧光标记的ddCTP中的任意一种（如果加入的话）的终浓度均为0.1-50 μmol/L。核糖3'-OH被保护的荧光标记的dNTP为核糖3'-OH被保护的荧光标记的dATP、核糖3'-OH被保护的荧光标记的dTTP/dUTP、核糖3'-OH被保护的荧光标记的dGTP和核糖3'-OH被保护的荧光标记的dCTP中的任意一种或几种，核糖3'-OH被保护的荧光标记的dATP、核糖3'-OH被保护的荧光标记的dTTP/dUTP、核糖3'-OH被保护的荧光标记的dGTP和核糖3'-OH被保护的荧光标记的dCTP中的任意一种（如果加入的话）的终浓度均为0.1-50 μmol/L。
[0023] 进一步的，上述步骤（2）、（3）、（5）中，每次孵育的温度均为20-95℃，优选为32-70℃。每次孵育的时间可以根据实际需要进行选择。
[0024] 进一步的，上述步骤（4）中，将孵育后的微球加入核糖3'-OH去保护剂，对核糖3'-OH进行去保护。所述核糖3'-OH去保护剂可以从市场中购买。核糖3'-OH去保护剂的终浓度为0.1-10mol/L。
[0025] 进一步的，上述步骤（3）和（5）中，将微球分为两份，其中一份微球中加入核糖3'-OH被保护的dNTP，另一份微球中加入荧光标记的ddNTP或/和核糖3'-OH被保护的荧光标记的dNTP。本发明上述方法根据待测核酸片段的碱基数目，不断的重复步骤（4）和（5）可以得到与待测核酸片段的碱基数目相同的群数的测序微球，例如待测核酸片段的碱基数目为n个时，重复步骤（4）和（5）得到n群测序微球，对这n群测序微球用流式细胞仪进行检测，微球群的顺序对应碱基排列顺序，由此可以得到待测核酸片段的碱基序列。当步骤（3）和（5）中加入4种荧光分别标记的ddATP、ddTTP/ddUTP、ddGTP、ddCTP或/和核糖3'-OH被保护的dATP、dTTP/dUTP、dGTP、dCTP时，仅制备n群测序微球并对其进行测序，就可以得到待测片段的碱基序列，例如当同时加入4种荧光分别标记的ddATP、ddTTP/ddUTP、ddGTP、ddCTP时，制备n群微球经过检测就能得到该核酸片段的碱基序列。而当步骤（3）和（5）中加入1-2种荧光分别标记的ddATP、ddTTP/ddUTP、ddGTP、ddCTP或/和核糖3'-OH被保护的dATP、dTTP/dUTP、dGTP、dCTP时，那仅n群测序微球就不能得到整个待测核酸片段的碱基序列，需要再进行步骤（7），即替换荧光标记的ddNTP或/和核糖3'-OH被保护的荧光标记的dNTP，更换容器，重复步骤（2）-（6），得到4×n或2×n群的测序微球，以保证所有位点的所有可能的碱基都能检测出来。在本发明某一具体实施方式中，仅加入2种荧光分别标记的ddNTP或2种荧光分别标记的核糖3'-OH被保护的dNTP时，得到的n群测序微球只能检测这两种特定的碱基，因此为了得到全部的碱基序列，需要替换荧光标记的ddNTP或核糖3'-OH被保护的荧光标记的dNTP，再重复实验，得到检测另两种碱基的n群测序微球，这些微球结合起来才能得到全部的碱基序列。
[0026] 进一步的，上述步骤（7）中，测序重复的次数取决于每次加入的荧光标记的ddNTP或/和核糖3'-OH被保护的荧光标记的dNTP种类的多少，每次加入的种类多，重复的次数就少一些，每次加入的少，重复的次数就多一些。当仅制备n群测序微球，一次性检测所有可能的碱基时，对流式细胞仪的配置要求较高，为了降低成本，使本发明方法适合于现有的流式细胞仪，优选制备2n群的测序微球。采用上述方法制备2n群微球时，先在步骤（3）和（5）中加入任意两种荧光标记的ddNTP或核糖3'-OH被保护的荧光标记的dNTP，得到n群微球，然后将步骤（3）和（5）中的两种荧光标记的ddNTP或核糖3'-OH被保护的荧光标记的dNTP替换为另两种荧光标记的ddNTP或核糖3'-OH被保护的荧光标记的dNTP，更换容器，重复步骤（2）-（6），得到n群微球，共得2n群微球。2n群微球与4n群微球相比，操作简便，与n群微球相比，对于流式细胞仪的配置要求低，测序成本低。每次加入的两种荧光标记的ddNTP或核糖3'-OH被保护的荧光标记的dNTP可以随意组合，例如可以先加入荧光标记的ddTTP/ddUTP和ddATP得到n群微球，再将它们替换成荧光标记的ddGTP和ddCTP得到n群微球；也可以先加入荧光标记的ddTTP/ddUTP和ddGTP得到n群微球，再将它们替换成荧光标记的ddATP和ddCTP得到n群微球；也可以先加入荧光标记的ddTTP/ddUTP和ddCTP得到n群微球，再将它们替换成荧光标记的ddATP和ddGTP得到n群微球等等。
[0027] 进一步的，本发明提供了一种单碱基连续延伸流式靶向测序的具体方法，包括以下步骤：(1)将引导待测核酸片段合成的修饰单向引物或含待测核酸片段互补序列的单链核苷酸片段包被在微球表面，得包被微球；
(2)容器Ⅰ中加入包被微球、含待测核酸片段互补序列的单链核苷酸片段或引导待测核酸片段合成的修饰单向引物、缓冲液，混匀，进行孵育杂交；
(3)缓冲液洗涤、悬浮微球，留存部分微球在容器Ⅰ中，另一部分微球从容器Ⅰ中移至容器Ⅱ中，容器Ⅰ中加入核糖3'-OH被保护的dNTP、核酸聚合酶、缓冲液，进行孵育；容器Ⅱ中加入荧光标记的ddNTP、核糖3'-OH被保护的荧光标记的dNTP之一或他们的组合、核酸聚合酶、缓冲液，进行孵育（优选的，每容器中液体终体积为10μl至10ml，混匀，20℃至95℃孵育）；
(4)洗涤容器Ⅰ中微球，容器Ⅰ中再加入核糖3'-OH去保护剂，混匀；
(5)缓冲液洗涤、悬浮容器Ⅰ中的微球，留存部分微球在容器Ⅰ中，其余微球从容器Ⅰ中移至容器Ⅲ中，容器Ⅰ中加入核糖3'-OH被保护的dNTP、核酸聚合酶、缓冲液，进行孵育；容器Ⅲ中加入荧光标记的ddNTP、核糖3'-OH被保护的荧光标记的dNTP之一或他们的组合、核酸聚合酶、缓冲液，进行孵育（优选的，每容器中液体终体积为10μl至10ml，混匀，20℃至95℃孵育）；
(6)不断重复类似(4)至(5)操作，测序核酸片段n个碱基共需连续制备n个容器的微球；
（所述微球为加入荧光标记的ddNTP或/和核糖3'-OH被保护的荧光标记的dNTP进行孵育的微球）；
(7)如果利用该n个容器的微球无法检测出所有的碱基，则需要替换步骤（3）和（5）的荧光标记的ddNTP或/和核糖3'-OH被保护的荧光标记的dNTP，更换容器，重复步骤（2）-（6），共得到4×n、或2×n个容器的微球，所有这些容器中的微球即为测序微球；
(8)将步骤（6）和（7）中得到的4×n、或2×n、或n群微球洗涤、悬浮后，进一步经流式细胞仪进行检测，可以得到待测核酸片段的碱基序列。
(2)容器Ⅰ中加入包被微球、含待测核酸片段互补序列的单链核苷酸片段或引导待测核酸片段合成的修饰单向引物、缓冲液，混匀，进行孵育杂交；
(3)缓冲液洗涤、悬浮微球，留存部分微球在容器Ⅰ中，另一部分微球从容器Ⅰ中移至容器Ⅱ中，容器Ⅰ中加入核糖3'-OH被保护的dNTP、核酸聚合酶、缓冲液，进行孵育；容器Ⅱ中加入荧光标记的ddNTP、核糖3'-OH被保护的荧光标记的dNTP之一或他们的组合、核酸聚合酶、缓冲液，进行孵育（优选的，每容器中液体终体积为10μl至10ml，混匀，20℃至95℃孵育）；
(4)洗涤容器Ⅰ中微球，容器Ⅰ中再加入核糖3'-OH去保护剂，混匀；
(5)缓冲液洗涤、悬浮容器Ⅰ中的微球，留存部分微球在容器Ⅰ中，其余微球从容器Ⅰ中移至容器Ⅲ中，容器Ⅰ中加入核糖3'-OH被保护的dNTP、核酸聚合酶、缓冲液，进行孵育；容器Ⅲ中加入荧光标记的ddNTP、核糖3'-OH被保护的荧光标记的dNTP之一或他们的组合、核酸聚合酶、缓冲液，进行孵育（优选的，每容器中液体终体积为10μl至10ml，混匀，20℃至95℃孵育）；
(6)不断重复类似(4)至(5)操作，测序核酸片段n个碱基共需连续制备n个容器的微球；
（所述微球为加入荧光标记的ddNTP或/和核糖3'-OH被保护的荧光标记的dNTP进行孵育的微球）；
(7)如果利用该n个容器的微球无法检测出所有的碱基，则需要替换步骤（3）和（5）的荧光标记的ddNTP或/和核糖3'-OH被保护的荧光标记的dNTP，更换容器，重复步骤（2）-（6），共得到4×n、或2×n个容器的微球，所有这些容器中的微球即为测序微球；
(8)将步骤（6）和（7）中得到的4×n、或2×n、或n群微球洗涤、悬浮后，进一步经流式细胞仪进行检测，可以得到待测核酸片段的碱基序列。
[0028] 进一步的，本发明还提供了一种优选的单碱基连续延伸流式靶向测序法，包括以下步骤：(1)将引导待测核酸片段合成的修饰单向引物或含待测核酸片段互补序列的单链核苷酸片段包被在微球表面，得包被微球；
(2)容器Ⅰ中加入步骤（1）得到的包被微球、含待测核酸片段互补序列的单链核苷酸片段或引导待测核酸片段合成的修饰单向引物、缓冲液，混匀，进行孵育杂交；
(3)缓冲液洗涤、悬浮微球，留存部分微球在容器Ⅰ中，另一部分微球从容器Ⅰ中移至容器Ⅱ中，容器Ⅰ中加入核酸聚合酶、缓冲液、核糖3'-OH被保护的dNTP，进行孵育；容器Ⅱ中加入核酸聚合酶、缓冲液、两种荧光标记的ddNTP或两种核糖3'-OH被保护的荧光标记的dNTP，进行孵育，容器Ⅱ中所得测序微球记为A1；所述核糖3'-OH被保护的dNTP为核糖3'-OH被保护的dATP、核糖3'-OH被保护的dTTP/dUTP、核糖3'-OH被保护的dGTP和核糖3'-OH被保护的dCTP；优选的，每容器中反应终体积为10μl至10ml，混匀，20℃至95℃孵育；
(4)洗涤容器Ⅰ中微球，容器Ⅰ中再加入核糖3'-OH去保护剂，混匀；
(5)缓冲液洗涤、悬浮容器Ⅰ中的微球，留存部分微球在容器Ⅰ中，另一部分微球从容器Ⅰ中移至容器Ⅲ中，容器Ⅰ中加入核酸聚合酶、缓冲液、核糖3'-OH被保护的dNTP，进行孵育；容器Ⅲ中加入核酸聚合酶、缓冲液、两种荧光标记的ddNTP或两种核糖3'-OH被保护的荧光标记的dNTP，进行孵育，容器Ⅲ中所得测序微球记为A2；所述核糖3'-OH被保护的dNTP为核糖
3'-OH被保护的dATP、核糖3'-OH被保护的dTTP/dUTP、核糖3'-OH被保护的dGTP和核糖3'-OH被保护的dCTP；优选的，每容器中反应终体积为10μl至10ml，混匀，20℃至95℃孵育；
(6)不断重复类似（4）和（5）的步骤，共得到n群加入荧光标记的ddNTP或核糖3'-OH被保护的荧光标记的dNTP进行孵育的测序微球，最后一群测序微球记为An，其中n为待测核酸片段的碱基数目；
(7)容器①中均加入步骤（1）得到的包被微球、含待测核酸片段互补序列的单链核苷酸片段或引导待测核酸片段合成的修饰单向引物、缓冲液，混匀，进行孵育杂交；
(8)缓冲液洗涤、悬浮微球，留存部分微球在容器①中，另一部分微球从容器①中移至容器②中，容器①中加入核酸聚合酶、缓冲液、核糖3'-OH被保护的dNTP，进行孵育；容器②中加入核酸聚合酶、缓冲液、与步骤（3）中的不同的另外两种荧光标记的ddNTP或与步骤（3）中的不同的另外两种核糖3'-OH被保护的荧光标记的dNTP，进行孵育，容器②中所得测序微球记为B1；所述核糖3'-OH被保护的dNTP为核糖3'-OH被保护的dATP、核糖3'-OH被保护的dTTP/dUTP、核糖3'-OH被保护的dGTP和核糖3'-OH被保护的dCTP；优选的，每容器中反应终体积为10μl至10ml，混匀，20℃至95℃孵育；
(9)洗涤容器①中微球后，容器①中再加入核糖3'-OH去保护剂，混匀；
(10)缓冲液洗涤、悬浮容器①中的微球，留存部分微球在容器①中，另一部分微球从容器①中移至容器③中，容器①中加入核酸聚合酶、缓冲液、核糖3'-OH被保护的dNTP，进行孵育；容器③中加入核酸聚合酶、缓冲液、与步骤（5）中的不同的另外两种荧光标记的ddNTP或与步骤（5）中的不同的另外两种核糖3'-OH被保护的荧光标记的dNTP，进行孵育，容器③中所得测序微球记为B2；所述核糖3'-OH被保护的dNTP为核糖3'-OH被保护的dATP、核糖3'-OH被保护的dTTP/dUTP、核糖3'-OH被保护的dGTP和核糖3'-OH被保护的dCTP；优选的，每容器中反应终体积为10μl至10ml，混匀，20℃至95℃孵育；
(11)不断重复类似（9）和（10）的步骤，共得到n群加入荧光标记的ddNTP或核糖3'-OH被保护的荧光标记的dNTP进行孵育的测序微球，最后一群测序微球记为Bn，其中n为待测核酸片段的碱基个数；
(12)将A1-An和B1-Bn这些微球洗涤、悬浮，进一步经流式细胞仪进行检测，即得待测核酸片段的碱基序列。
(2)容器Ⅰ中加入步骤（1）得到的包被微球、含待测核酸片段互补序列的单链核苷酸片段或引导待测核酸片段合成的修饰单向引物、缓冲液，混匀，进行孵育杂交；
(3)缓冲液洗涤、悬浮微球，留存部分微球在容器Ⅰ中，另一部分微球从容器Ⅰ中移至容器Ⅱ中，容器Ⅰ中加入核酸聚合酶、缓冲液、核糖3'-OH被保护的dNTP，进行孵育；容器Ⅱ中加入核酸聚合酶、缓冲液、两种荧光标记的ddNTP或两种核糖3'-OH被保护的荧光标记的dNTP，进行孵育，容器Ⅱ中所得测序微球记为A1；所述核糖3'-OH被保护的dNTP为核糖3'-OH被保护的dATP、核糖3'-OH被保护的dTTP/dUTP、核糖3'-OH被保护的dGTP和核糖3'-OH被保护的dCTP；优选的，每容器中反应终体积为10μl至10ml，混匀，20℃至95℃孵育；
(4)洗涤容器Ⅰ中微球，容器Ⅰ中再加入核糖3'-OH去保护剂，混匀；
(5)缓冲液洗涤、悬浮容器Ⅰ中的微球，留存部分微球在容器Ⅰ中，另一部分微球从容器Ⅰ中移至容器Ⅲ中，容器Ⅰ中加入核酸聚合酶、缓冲液、核糖3'-OH被保护的dNTP，进行孵育；容器Ⅲ中加入核酸聚合酶、缓冲液、两种荧光标记的ddNTP或两种核糖3'-OH被保护的荧光标记的dNTP，进行孵育，容器Ⅲ中所得测序微球记为A2；所述核糖3'-OH被保护的dNTP为核糖
3'-OH被保护的dATP、核糖3'-OH被保护的dTTP/dUTP、核糖3'-OH被保护的dGTP和核糖3'-OH被保护的dCTP；优选的，每容器中反应终体积为10μl至10ml，混匀，20℃至95℃孵育；
(6)不断重复类似（4）和（5）的步骤，共得到n群加入荧光标记的ddNTP或核糖3'-OH被保护的荧光标记的dNTP进行孵育的测序微球，最后一群测序微球记为An，其中n为待测核酸片段的碱基数目；
(7)容器①中均加入步骤（1）得到的包被微球、含待测核酸片段互补序列的单链核苷酸片段或引导待测核酸片段合成的修饰单向引物、缓冲液，混匀，进行孵育杂交；
(8)缓冲液洗涤、悬浮微球，留存部分微球在容器①中，另一部分微球从容器①中移至容器②中，容器①中加入核酸聚合酶、缓冲液、核糖3'-OH被保护的dNTP，进行孵育；容器②中加入核酸聚合酶、缓冲液、与步骤（3）中的不同的另外两种荧光标记的ddNTP或与步骤（3）中的不同的另外两种核糖3'-OH被保护的荧光标记的dNTP，进行孵育，容器②中所得测序微球记为B1；所述核糖3'-OH被保护的dNTP为核糖3'-OH被保护的dATP、核糖3'-OH被保护的dTTP/dUTP、核糖3'-OH被保护的dGTP和核糖3'-OH被保护的dCTP；优选的，每容器中反应终体积为10μl至10ml，混匀，20℃至95℃孵育；
(9)洗涤容器①中微球后，容器①中再加入核糖3'-OH去保护剂，混匀；
(10)缓冲液洗涤、悬浮容器①中的微球，留存部分微球在容器①中，另一部分微球从容器①中移至容器③中，容器①中加入核酸聚合酶、缓冲液、核糖3'-OH被保护的dNTP，进行孵育；容器③中加入核酸聚合酶、缓冲液、与步骤（5）中的不同的另外两种荧光标记的ddNTP或与步骤（5）中的不同的另外两种核糖3'-OH被保护的荧光标记的dNTP，进行孵育，容器③中所得测序微球记为B2；所述核糖3'-OH被保护的dNTP为核糖3'-OH被保护的dATP、核糖3'-OH被保护的dTTP/dUTP、核糖3'-OH被保护的dGTP和核糖3'-OH被保护的dCTP；优选的，每容器中反应终体积为10μl至10ml，混匀，20℃至95℃孵育；
(11)不断重复类似（9）和（10）的步骤，共得到n群加入荧光标记的ddNTP或核糖3'-OH被保护的荧光标记的dNTP进行孵育的测序微球，最后一群测序微球记为Bn，其中n为待测核酸片段的碱基个数；
(12)将A1-An和B1-Bn这些微球洗涤、悬浮，进一步经流式细胞仪进行检测，即得待测核酸片段的碱基序列。
[0029] 进一步的，本发明还提供了一种更为优选的单碱基连续延伸流式靶向测序法，包括以下步骤：(1)将引导待测核酸片段合成的氨基修饰单向引物或含待测核酸片段互补序列的单链核苷酸片段包被在直径1μm至10μm的羧基化聚苯乙烯微球表面，得包被微球；
(2)基于全自动移液工作站，96孔滤板A的孔Ⅰ中加入包被微球、含待测核酸片段互补序列的单链核苷酸片段或引导待测核酸片段合成的修饰单向引物、缓冲液，混匀，进行孵育杂交；
(3)缓冲液洗涤、悬浮微球，留存部分微球在96孔滤板A的孔Ⅰ中，另一部分微球从96孔滤板A的孔Ⅰ中移至96孔滤板B的孔Ⅰ中，96孔滤板A的孔Ⅰ中继续加入核酸聚合酶、缓冲液、核糖3'-OH被保护的dATP、核糖3'-OH被保护的dUTP/dTTP、核糖3'-OH被保护的dGTP、核糖3'-OH被保护的dCTP，96孔滤板B的孔Ⅰ中继续加入核酸聚合酶、缓冲液、荧光标记的ddATP、荧光标记的ddUTP/ddTTP，96滤孔板A、B的孔Ⅰ中反应总体积均为10μl-1000μl，两孔均混匀、37℃孵育60秒，其中96孔滤板B的孔Ⅰ中孵育后所得测序微球记为A1；
(4)抽滤、洗涤96孔滤板A的孔Ⅰ中的微球，96孔滤板A的孔Ⅰ中再加入核糖3'-OH去保护剂，混匀；
(5)缓冲液洗涤、悬浮96孔滤板A的孔Ⅰ中微球，留存部分微球在96孔滤板A的孔Ⅰ中，另一部分微球从96孔滤板A的孔Ⅰ中移至96孔滤板B的孔Ⅱ中；
(6)96孔滤板A的孔Ⅰ和96孔滤板B的孔Ⅱ中均再加入核酸聚合酶、缓冲液，96孔滤板A的孔Ⅰ中继续加入核糖3'-OH被保护的dATP、核糖3'-OH被保护的dUTP/ddTTP、核糖3'-OH被保护的dGTP、核糖3'-OH被保护的dCTP，96孔滤板B的孔Ⅱ中继续加入荧光标记的ddATP、荧光标记的ddUTP/ddTTP，96孔滤板A孔Ⅰ、96孔滤板B孔Ⅱ的反应总体积均为10μl-1000μl，两孔均混匀、37℃孵育60秒，其中96孔滤板B的孔Ⅱ中孵育后所得测序微球记为A2；
(7)不断重复类似(4)至(6)操作，共得到n群加入荧光标记的ddATP、荧光标记的ddUTP/ddTTP进行孵育的测序微球，最后一群测序微球记为An，其中n为待测核酸片段的碱基个数；
(8)将上述(3)、(6)中“荧光标记的ddATP、荧光标记的ddUTP/ddTTP”，更换为“荧光标记的ddGTP、荧光标记的ddCTP”，在96孔滤板C中重复类似(2)至(7)的操作，共得到n群加入荧光标记的ddGTP、荧光标记的ddCTP进行孵育的测序微球，第一群测序微球记为B1,最后一群测序微球记为Bn，其中n为待测核酸片段的碱基个数；上述步骤(7)中制得的A1-An群微球用于识别待测核酸片段中的胸腺嘧啶(T)以及腺嘌呤(A)，步骤(8)中制得的B1-Bn群微球用于识别待测核酸片段中的胞嘧啶(C)或鸟嘌呤(G)；
(9)将A1-An和B1-Bn这些微球洗涤、悬浮，进一步经流式细胞仪进行检测，即得待测核酸片段的碱基序列。
(2)基于全自动移液工作站，96孔滤板A的孔Ⅰ中加入包被微球、含待测核酸片段互补序列的单链核苷酸片段或引导待测核酸片段合成的修饰单向引物、缓冲液，混匀，进行孵育杂交；
(3)缓冲液洗涤、悬浮微球，留存部分微球在96孔滤板A的孔Ⅰ中，另一部分微球从96孔滤板A的孔Ⅰ中移至96孔滤板B的孔Ⅰ中，96孔滤板A的孔Ⅰ中继续加入核酸聚合酶、缓冲液、核糖3'-OH被保护的dATP、核糖3'-OH被保护的dUTP/dTTP、核糖3'-OH被保护的dGTP、核糖3'-OH被保护的dCTP，96孔滤板B的孔Ⅰ中继续加入核酸聚合酶、缓冲液、荧光标记的ddATP、荧光标记的ddUTP/ddTTP，96滤孔板A、B的孔Ⅰ中反应总体积均为10μl-1000μl，两孔均混匀、37℃孵育60秒，其中96孔滤板B的孔Ⅰ中孵育后所得测序微球记为A1；
(4)抽滤、洗涤96孔滤板A的孔Ⅰ中的微球，96孔滤板A的孔Ⅰ中再加入核糖3'-OH去保护剂，混匀；
(5)缓冲液洗涤、悬浮96孔滤板A的孔Ⅰ中微球，留存部分微球在96孔滤板A的孔Ⅰ中，另一部分微球从96孔滤板A的孔Ⅰ中移至96孔滤板B的孔Ⅱ中；
(6)96孔滤板A的孔Ⅰ和96孔滤板B的孔Ⅱ中均再加入核酸聚合酶、缓冲液，96孔滤板A的孔Ⅰ中继续加入核糖3'-OH被保护的dATP、核糖3'-OH被保护的dUTP/ddTTP、核糖3'-OH被保护的dGTP、核糖3'-OH被保护的dCTP，96孔滤板B的孔Ⅱ中继续加入荧光标记的ddATP、荧光标记的ddUTP/ddTTP，96孔滤板A孔Ⅰ、96孔滤板B孔Ⅱ的反应总体积均为10μl-1000μl，两孔均混匀、37℃孵育60秒，其中96孔滤板B的孔Ⅱ中孵育后所得测序微球记为A2；
(7)不断重复类似(4)至(6)操作，共得到n群加入荧光标记的ddATP、荧光标记的ddUTP/ddTTP进行孵育的测序微球，最后一群测序微球记为An，其中n为待测核酸片段的碱基个数；
(8)将上述(3)、(6)中“荧光标记的ddATP、荧光标记的ddUTP/ddTTP”，更换为“荧光标记的ddGTP、荧光标记的ddCTP”，在96孔滤板C中重复类似(2)至(7)的操作，共得到n群加入荧光标记的ddGTP、荧光标记的ddCTP进行孵育的测序微球，第一群测序微球记为B1,最后一群测序微球记为Bn，其中n为待测核酸片段的碱基个数；上述步骤(7)中制得的A1-An群微球用于识别待测核酸片段中的胸腺嘧啶(T)以及腺嘌呤(A)，步骤(8)中制得的B1-Bn群微球用于识别待测核酸片段中的胞嘧啶(C)或鸟嘌呤(G)；
(9)将A1-An和B1-Bn这些微球洗涤、悬浮，进一步经流式细胞仪进行检测，即得待测核酸片段的碱基序列。
[0030] 进一步的，上述测序方法中，所得测序微球为n群、或2n群、或4n群，保证能检测出该核酸片段每个位点的正确碱基，在检测时，测序微球的制备顺序对应碱基排列顺序，将检测结果进行整合，即可得到该核酸片段的整个碱基序列。
[0031] 进一步的，上述测序方法中，所述核酸片段为单链DNA片段。该核酸片段可以是任意生物的核酸片段，可以是人体的、也可以是动物体的、也可以是微生物的。本发明方法简洁、结果准确、数据易解读，在基因检测、疾病筛查、基因指导靶向给药、单核苷酸多态性等领域有很好的应用前景。
[0032] 进一步的，上述测序方法中，通过选择编码微球和调控测序微球的制备过程可以并行检测得多个核酸片段序列。
[0033] 本发明通过引物的单碱基连续延伸，建立了一种单碱基连续延伸流式靶向测序法，应用该方法可以得到测序微球，这些测序微球经流式细胞仪检测可以得到待测核酸片段的碱基序列。与现有测序法相比，利用本发明的单碱基连续延伸流式靶向测序法进行核酸靶向测序具有简洁、准确及易解读等显著优点，适用于流式细胞仪检测核酸碱基序列，能广泛用于基因检测、微生物检查、遗传学、外显子、单核苷酸多态性(SNP)、基因组学和蛋白质组学等核酸测序领域，在疾病筛查、基因指导靶向给药，尤其是在肿瘤伴随诊断领域有很好的应用前景。附图说明
[0034] 图1是实施例1的单碱基连续延伸流式靶向测序法流程图。A. 单向引物包被微球；B. 含待测核酸片段互补序列的单链核苷酸片段与单向引物杂交；C. 以含待测核酸片段互补序列的单链核苷酸片段为模板，在核酸聚合酶催化下，微球包被引物末端连续延伸单个荧光标记碱基；D. 流式细胞仪检测微球以识别碱基序列。
[0035] 图2是EGFR基因T790M核酸片段的Sanger测序图，其中图2A为野生型T790M核酸片段Sanger测序图；图2B为突变型T790M核酸片段Sanger测序图。
[0036] 图3是并行靶向测序EGFR基因exon 21 L858R核酸片段(野生型质粒DNA片段)、exon 18 G719X核酸片段(野生型和突变型质粒片段的混合物)的混合样本起始第1个碱基测序的流式点图，其中图3(i)为胸腺嘧啶(T)的检测结果，图3(ii)为腺嘌呤(A)的检测结果，图3(iii)为胞嘧啶(C) 的检测结果，图3(iv)为鸟嘌呤(G)的检测结果；从结果看，exon 21 L858R起始第1位的碱基为胸腺嘧啶(T)，exon 18 G719X起始第1位的等位碱基为腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)。
具体实施方式
[0037] 下面给出了本发明的具体实施例，这是对本发明的进一步说明，而不是限制本发明的范围。
[0038] 实施例中使用的功能化聚苯乙烯微球购自美国Spherotech, Inc.，菁染料Cy3标记的ddATP、菁染料Cy3标记的ddGTP、菁染料Cy5标记的ddGTP、FITC标记的ddUTP、FITC标记的ddCTP、ROX标记的ddCTP购自美国PE公司，核糖3'-OH被保护的dNTP、核糖3'-OH去保护剂购自山东信力科生物科技有限公司，DNA聚合酶Sequenase、DNA聚合酶klenow片段为ThermoFisher Scientific公司产品。
[0039] 如无特别说明，下述不对称PCR产物、修饰单向引物按照现有技术中报道的PCR扩增方法获取或者委托相应的公司完成。
[0040] 实施例1、EGFR基因T790M核酸片段的单碱基连续延伸流式靶向测序[图1](1)从NCBI Genebank上查到EGFR基因T790M片段的碱基序列，根据该序列设计单向引物，并进行氨基修饰，经氨基修饰的单向引物为：5’GGAAGCCTACGTGATGG CCA3’，将该氨基修饰单向引物包被在直径7μm的羧基化聚苯乙烯微球表面；(2)基于全自动移液工作站，96孔滤板A的孔Ⅰ中加入4×105个引物包被微球、T790M片段（野生型/突变型质粒混合物）不对称PCR产物、缓冲液，进行2min 65℃、自然冷却45分钟的孵育杂交；缓冲液洗涤、悬浮微球，吸取96孔滤板A的孔Ⅰ中4000个微球至96孔滤板B的孔Ⅰ中，96孔滤板A的孔Ⅰ中继续加入10 units的DNA聚合酶Sequenase、缓冲液、10μM核糖3'-OH被保护的dATP、10μM核糖3'-OH被保护的dUTP、10μM核糖3'-OH被保护的dGTP、10μM核糖3'-OH被保护的dCTP，96孔滤板B的孔Ⅰ中继续加入10 units的DNA聚合酶Sequenase、缓冲液、
0.5μM菁染料Cy3标记的ddATP、0.5μM FITC标记的ddUTP，每孔终体积10μl-1000μl，混匀，37℃孵育60秒；
(3)抽滤洗涤96孔滤板A的孔Ⅰ中微球，96孔滤板A的孔Ⅰ中再加入核糖3'-OH去保护剂，混匀；
(4)缓冲液抽滤洗涤、悬浮96孔滤板A的孔Ⅰ中微球，吸取96孔滤板A的孔Ⅰ中4000个微球至96孔滤板B的孔Ⅱ中；
(5)96孔滤板A的孔Ⅰ、96孔滤板B的孔Ⅱ中均再加入10 units的DNA聚合酶Sequenase、缓冲液，96孔滤板A的孔Ⅰ中继续加入10μM核糖3'-OH被保护的dATP、10μM核糖3'-OH被保护的dUTP、10μM核糖3'-OH被保护的dGTP、10μM核糖3'-OH被保护的dCTP，96孔滤板B的孔Ⅱ中继续加入0.5μM菁染料Cy3标记的ddATP、0.5μM FITC标记的ddUTP，每孔终体积10μl-1000μl，混匀，37℃孵育60秒；
(6)按照步骤(3)至(5)的操作，将96孔滤板A的孔Ⅰ中微球进行洗涤、加入核糖3'-OH去保护剂、洗涤后重分为两孔，96孔滤板A的孔Ⅰ中加10 units的DNA聚合酶Sequenase、缓冲液、10μM核糖3'-OH被保护的dATP、10μM核糖3'-OH被保护的dUTP、10μM核糖3'-OH被保护的dGTP、10μM核糖3'-OH被保护的dCTP，96孔滤板B的孔Ⅲ中加10 units的DNA聚合酶Sequenase、缓冲液、0.5μM菁染料Cy3标记的ddATP、0.5μM FITC标记的ddUTP，按（3）-（5）的步骤重复操作，连续在96孔滤板B中制备76孔微球；
(7)将上述(2)、(5)、(6)中的“0.5μM菁染料Cy3标记的ddATP、0.5μM FITC标记的ddUTP”，更换为“0.5μM菁染料Cy3标记的ddGTP、0.5μM FITC标记的ddCTP”，在96孔滤板C中按照步骤（2）-（6）的流程重复类似操作，连续制备76孔微球。
0.5μM菁染料Cy3标记的ddATP、0.5μM FITC标记的ddUTP，每孔终体积10μl-1000μl，混匀，37℃孵育60秒；
(3)抽滤洗涤96孔滤板A的孔Ⅰ中微球，96孔滤板A的孔Ⅰ中再加入核糖3'-OH去保护剂，混匀；
(4)缓冲液抽滤洗涤、悬浮96孔滤板A的孔Ⅰ中微球，吸取96孔滤板A的孔Ⅰ中4000个微球至96孔滤板B的孔Ⅱ中；
(5)96孔滤板A的孔Ⅰ、96孔滤板B的孔Ⅱ中均再加入10 units的DNA聚合酶Sequenase、缓冲液，96孔滤板A的孔Ⅰ中继续加入10μM核糖3'-OH被保护的dATP、10μM核糖3'-OH被保护的dUTP、10μM核糖3'-OH被保护的dGTP、10μM核糖3'-OH被保护的dCTP，96孔滤板B的孔Ⅱ中继续加入0.5μM菁染料Cy3标记的ddATP、0.5μM FITC标记的ddUTP，每孔终体积10μl-1000μl，混匀，37℃孵育60秒；
(6)按照步骤(3)至(5)的操作，将96孔滤板A的孔Ⅰ中微球进行洗涤、加入核糖3'-OH去保护剂、洗涤后重分为两孔，96孔滤板A的孔Ⅰ中加10 units的DNA聚合酶Sequenase、缓冲液、10μM核糖3'-OH被保护的dATP、10μM核糖3'-OH被保护的dUTP、10μM核糖3'-OH被保护的dGTP、10μM核糖3'-OH被保护的dCTP，96孔滤板B的孔Ⅲ中加10 units的DNA聚合酶Sequenase、缓冲液、0.5μM菁染料Cy3标记的ddATP、0.5μM FITC标记的ddUTP，按（3）-（5）的步骤重复操作，连续在96孔滤板B中制备76孔微球；
(7)将上述(2)、(5)、(6)中的“0.5μM菁染料Cy3标记的ddATP、0.5μM FITC标记的ddUTP”，更换为“0.5μM菁染料Cy3标记的ddGTP、0.5μM FITC标记的ddCTP”，在96孔滤板C中按照步骤（2）-（6）的流程重复类似操作，连续制备76孔微球。
[0041] (8)将步骤（6）制备的76孔微球和步骤（7）制备的76孔微球抽滤洗涤，分别上样流式细胞仪进行检测。
[0042] 因为DNA片段中不含有尿嘧啶(U)，所以当检测结果显示为尿嘧啶时该碱基即为胸腺嘧啶(T)。上述(6)中制得的96孔滤板B中的76孔微球用于测序T790M片段中的胸腺嘧啶(T)、腺嘌呤(A)，上述(7)中制得的96孔滤板C中的76孔微球用于测序T790M片段中的胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)。
[0043] 将所有检查结果进行整合，得到T790M核酸片段的测序结果为：GCGTG GACAA CCCCC ACGTG TGCCG CCTGC TGGGC ATCTG CCTCA CCTCC ACCGT GCAGC TCATC AC(C→T，T790M)GCA GCTCA T，第67位的碱基同时出现C和T的结果，说明该核酸片段中同时存在野生型和突变型。该检测结果与样本Sanger测序法一致，从图2A中可以看出，野生型T790M质粒DNA片段的靶点碱基为C(条形框内)；从图2B中可以看出，突变型T790M质粒DNA片段的靶点碱基为T(条形框内)。
[0044] 实施例2、EGFR基因T790M核酸片段的单碱基连续延伸流式靶向测序(1)从NCBI Genebank上查到EGFR基因T790M的碱基序列，依据该序列人工合成野生型/突变型质粒，以质粒为模板，不对称PCR合成含T790M靶点片段互补序列的单链DNA片段，根据该单链DNA片段设计单向引物，并将该单链DNA片段包被在直径5μm的二甲基胺修饰的聚苯乙烯微球表面，得包被微球；
(2)基于全自动移液工作站，96孔滤板A的孔Ⅰ中加入4×105个包被微球、单向引物、缓冲液，进行2min 65℃、自然冷却45分钟的孵育杂交；缓冲液洗涤、悬浮微球，吸取96孔滤板A的孔Ⅰ中4000个微球至96孔滤板B的孔Ⅰ中，96孔滤板A的孔Ⅰ中继续加入100 units的DNA聚合酶Sequenase、缓冲液、20μM核糖3'-OH被保护的dATP、20μM核糖3'-OH被保护的dUTP、20μM核糖3'-OH被保护的dGTP、20μM核糖3'-OH被保护的dCTP，96孔滤板B的孔Ⅰ中继续加入100 units的DNA聚合酶Sequenase、缓冲液、2μM菁染料Cy3标记的ddATP、2μM FITC标记的ddUTP、
2μM菁染料Cy5标记的ddGTP、2μM ROX标记的ddCTP，每孔终体积10μl-1000μl，混匀，37℃孵育60秒；
(3)抽滤洗涤96孔滤板A的孔Ⅰ中微球，96孔滤板A的孔Ⅰ中再加入核糖3'-OH去保护剂，混匀；
(4)缓冲液抽滤洗涤、悬浮96孔滤板A的孔Ⅰ中微球，吸取96孔滤板A的孔Ⅰ中4000个微球至96孔滤板B的孔Ⅱ中；
(5)96孔滤板A的孔Ⅰ、96孔滤板B的孔Ⅱ中均再加入100 units的DNA聚合酶Sequenase、缓冲液，96孔滤板A的孔Ⅰ中继续加入20μM核糖3'-OH被保护的dATP、20μM核糖3'-OH被保护的dUTP、20μM核糖3'-OH被保护的dGTP、20μM核糖3'-OH被保护的dCTP，96孔滤板B的孔Ⅱ中继续加入2μM菁染料Cy3标记的ddATP、2μM FITC标记的ddUTP、2μM菁染料Cy5标记的ddGTP、2μM ROX标记的ddCTP，每孔终体积10μl-1000μl，混匀，37℃孵育60秒；
(6)按照步骤(3)至(5)的操作，将96孔滤板A的孔Ⅰ中微球进行洗涤、加入核糖3'-OH去保护剂、洗涤后重分为两孔，96孔滤板A的孔Ⅰ中加100 units的DNA聚合酶Sequenase、缓冲液、20μM核糖3'-OH被保护的dATP、20μM核糖3'-OH被保护的dUTP、20μM核糖3'-OH被保护的dGTP、20μM核糖3'-OH被保护的dCTP，96孔滤板B的孔Ⅲ中加入100 units的DNA聚合酶Sequenase、缓冲液、2μM菁染料Cy3标记的ddATP、2μM FITC标记的ddUTP、2μM菁染料Cy5标记的ddGTP、2μM ROX标记的ddCTP，按（3）-（5）的步骤重复操作，连续在96孔滤板B中制备76孔微球；
(7)将步骤（6）制备的96孔滤板B中的76孔微球洗涤，上样流式细胞仪进行检测即可一次性得到检测结果。
(2)基于全自动移液工作站，96孔滤板A的孔Ⅰ中加入4×105个包被微球、单向引物、缓冲液，进行2min 65℃、自然冷却45分钟的孵育杂交；缓冲液洗涤、悬浮微球，吸取96孔滤板A的孔Ⅰ中4000个微球至96孔滤板B的孔Ⅰ中，96孔滤板A的孔Ⅰ中继续加入100 units的DNA聚合酶Sequenase、缓冲液、20μM核糖3'-OH被保护的dATP、20μM核糖3'-OH被保护的dUTP、20μM核糖3'-OH被保护的dGTP、20μM核糖3'-OH被保护的dCTP，96孔滤板B的孔Ⅰ中继续加入100 units的DNA聚合酶Sequenase、缓冲液、2μM菁染料Cy3标记的ddATP、2μM FITC标记的ddUTP、
2μM菁染料Cy5标记的ddGTP、2μM ROX标记的ddCTP，每孔终体积10μl-1000μl，混匀，37℃孵育60秒；
(3)抽滤洗涤96孔滤板A的孔Ⅰ中微球，96孔滤板A的孔Ⅰ中再加入核糖3'-OH去保护剂，混匀；
(4)缓冲液抽滤洗涤、悬浮96孔滤板A的孔Ⅰ中微球，吸取96孔滤板A的孔Ⅰ中4000个微球至96孔滤板B的孔Ⅱ中；
(5)96孔滤板A的孔Ⅰ、96孔滤板B的孔Ⅱ中均再加入100 units的DNA聚合酶Sequenase、缓冲液，96孔滤板A的孔Ⅰ中继续加入20μM核糖3'-OH被保护的dATP、20μM核糖3'-OH被保护的dUTP、20μM核糖3'-OH被保护的dGTP、20μM核糖3'-OH被保护的dCTP，96孔滤板B的孔Ⅱ中继续加入2μM菁染料Cy3标记的ddATP、2μM FITC标记的ddUTP、2μM菁染料Cy5标记的ddGTP、2μM ROX标记的ddCTP，每孔终体积10μl-1000μl，混匀，37℃孵育60秒；
(6)按照步骤(3)至(5)的操作，将96孔滤板A的孔Ⅰ中微球进行洗涤、加入核糖3'-OH去保护剂、洗涤后重分为两孔，96孔滤板A的孔Ⅰ中加100 units的DNA聚合酶Sequenase、缓冲液、20μM核糖3'-OH被保护的dATP、20μM核糖3'-OH被保护的dUTP、20μM核糖3'-OH被保护的dGTP、20μM核糖3'-OH被保护的dCTP，96孔滤板B的孔Ⅲ中加入100 units的DNA聚合酶Sequenase、缓冲液、2μM菁染料Cy3标记的ddATP、2μM FITC标记的ddUTP、2μM菁染料Cy5标记的ddGTP、2μM ROX标记的ddCTP，按（3）-（5）的步骤重复操作，连续在96孔滤板B中制备76孔微球；
(7)将步骤（6）制备的96孔滤板B中的76孔微球洗涤，上样流式细胞仪进行检测即可一次性得到检测结果。
[0045] 经数据分析，得到T790M核酸片段的测序结果为：GCGTG GACAA CCCCC ACGTG TGCCG CCTGC TGGGC ATCTG CCTCA CCTCC ACCGT GCAGC TCATC AC(C→T，T790M)GCA GCTCA T，第67位的碱基同时出现C和T的结果，说明该核酸片段中同时存在野生型和突变型。
[0046] 该EGFR基因T790M核酸片段样本Sanger法测序结果与本发明测序结果一致。
[0047] 实施例3、EGFR基因exon 21 L858R、exon 18 G719X点突变的单碱基连续延伸流式靶向测序(1)从NCBI Genebank上查到EGFR基因包含exon 21 L858R、exon 18 G719X靶点的碱基序列，根据这两个序列分别设计单向引物，并在单向引物末端进行生物素修饰，经生物素修饰的exon 21 L858R单向引物为：5’TGTCAAGATCACAGATTTTGGGC3’；经生物素修饰的exon 18 G719X单向引物为：5’CTGAATTCAAAAAGATCAAAGTGCTG3’，将生物素修饰的两单向引物分别包被在直径约3μm的PE-Cy5编码的链霉亲和素修饰的两群聚苯乙烯微球表面；
(2)基于全自动移液工作站，96孔滤板A的孔Ⅰ中加入20000个exon 21 L858R引物包被微球、20000个exon 18 G719X引物包被微球、exon 21 L858R片段(野生型质粒片段)与exon
18 G719X片段(野生型/突变型质粒片段的混合物)混合样本的两重不对称PCR产物、缓冲液，进行2min 65℃、自然冷却45分钟的孵育杂交；缓冲液洗涤、悬浮微球，吸取96孔滤板A的孔Ⅰ中2000个微球至96孔滤板B的孔Ⅰ中，96孔滤板A的孔Ⅰ中继续加入50 units的DNA聚合酶klenow片段、缓冲液、5μM核糖3'-OH被保护的dATP、5μM核糖3'-OH被保护的dUTP、5μM核糖
3'-OH被保护的dGTP、5μM核糖3'-OH被保护的dCTP，96孔滤板B的孔Ⅰ中继续加入50 units 的DNA聚合酶klenow片段、缓冲液、5μM菁染料Cy3标记的ddATP、5μM FITC标记的ddUTP，每孔终体积10μl-1000μl，混匀，37℃孵育15分钟；
(3)抽滤洗涤96孔滤板A的孔Ⅰ中微球，96孔滤板A的孔Ⅰ中再加入核糖3'-OH去保护剂，混匀；
(4)缓冲液抽滤洗涤、悬浮96孔滤板A的孔Ⅰ中微球，吸取96孔滤板A的孔Ⅰ中2000个微球至96孔滤板B的孔Ⅱ中；
(5)96孔滤板A的孔Ⅰ、96孔滤板B的孔Ⅱ中均再加入50 units的DNA聚合酶klenow片段、缓冲液，96孔滤板A的孔Ⅰ中继续加入5μM核糖3'-OH被保护的dATP、5μM核糖3'-OH被保护的dUTP、5μM核糖3'-OH被保护的dGTP、5μM核糖3'-OH被保护的dCTP，96孔滤板B的孔Ⅱ中继续加入5μM菁染料Cy3标记的ddATP、5μM FITC标记的ddUTP，每孔终体积10μl-1000μl，混匀，37℃孵育15分钟；
(6)按照步骤(3)至(5)的操作，将96孔滤板A的孔Ⅰ中微球进行洗涤、加入核糖3'-OH去保护剂、洗涤后重分为两孔，96孔滤板A的孔Ⅰ中加入50units的DNA聚合酶klenow片段、缓冲液、5μM核糖3'-OH被保护的dATP、5μM核糖3'-OH被保护的dUTP、5μM核糖3'-OH被保护的dGTP、5μM核糖3'-OH被保护的dCTP，96孔滤板B的孔Ⅲ中加入50 units的DNA聚合酶klenow片段、缓冲液、5μM菁染料Cy3标记的ddATP、5μM FITC标记的ddUTP，按（3）-（5）的步骤重复操作，连续在96孔滤板B中制备10孔微球；
(7)将上述(2)、(5)、(6)中的“5μM菁染料Cy3标记的ddATP、5μM FITC标记的ddUTP”，更换为“5μM菁染料Cy3标记的ddGTP、5μM FITC标记的ddCTP”，在96孔滤板C中按照步骤（2）-（6）的流程重复类似操作，连续制备10孔微球。
(2)基于全自动移液工作站，96孔滤板A的孔Ⅰ中加入20000个exon 21 L858R引物包被微球、20000个exon 18 G719X引物包被微球、exon 21 L858R片段(野生型质粒片段)与exon
18 G719X片段(野生型/突变型质粒片段的混合物)混合样本的两重不对称PCR产物、缓冲液，进行2min 65℃、自然冷却45分钟的孵育杂交；缓冲液洗涤、悬浮微球，吸取96孔滤板A的孔Ⅰ中2000个微球至96孔滤板B的孔Ⅰ中，96孔滤板A的孔Ⅰ中继续加入50 units的DNA聚合酶klenow片段、缓冲液、5μM核糖3'-OH被保护的dATP、5μM核糖3'-OH被保护的dUTP、5μM核糖
3'-OH被保护的dGTP、5μM核糖3'-OH被保护的dCTP，96孔滤板B的孔Ⅰ中继续加入50 units 的DNA聚合酶klenow片段、缓冲液、5μM菁染料Cy3标记的ddATP、5μM FITC标记的ddUTP，每孔终体积10μl-1000μl，混匀，37℃孵育15分钟；
(3)抽滤洗涤96孔滤板A的孔Ⅰ中微球，96孔滤板A的孔Ⅰ中再加入核糖3'-OH去保护剂，混匀；
(4)缓冲液抽滤洗涤、悬浮96孔滤板A的孔Ⅰ中微球，吸取96孔滤板A的孔Ⅰ中2000个微球至96孔滤板B的孔Ⅱ中；
(5)96孔滤板A的孔Ⅰ、96孔滤板B的孔Ⅱ中均再加入50 units的DNA聚合酶klenow片段、缓冲液，96孔滤板A的孔Ⅰ中继续加入5μM核糖3'-OH被保护的dATP、5μM核糖3'-OH被保护的dUTP、5μM核糖3'-OH被保护的dGTP、5μM核糖3'-OH被保护的dCTP，96孔滤板B的孔Ⅱ中继续加入5μM菁染料Cy3标记的ddATP、5μM FITC标记的ddUTP，每孔终体积10μl-1000μl，混匀，37℃孵育15分钟；
(6)按照步骤(3)至(5)的操作，将96孔滤板A的孔Ⅰ中微球进行洗涤、加入核糖3'-OH去保护剂、洗涤后重分为两孔，96孔滤板A的孔Ⅰ中加入50units的DNA聚合酶klenow片段、缓冲液、5μM核糖3'-OH被保护的dATP、5μM核糖3'-OH被保护的dUTP、5μM核糖3'-OH被保护的dGTP、5μM核糖3'-OH被保护的dCTP，96孔滤板B的孔Ⅲ中加入50 units的DNA聚合酶klenow片段、缓冲液、5μM菁染料Cy3标记的ddATP、5μM FITC标记的ddUTP，按（3）-（5）的步骤重复操作，连续在96孔滤板B中制备10孔微球；
(7)将上述(2)、(5)、(6)中的“5μM菁染料Cy3标记的ddATP、5μM FITC标记的ddUTP”，更换为“5μM菁染料Cy3标记的ddGTP、5μM FITC标记的ddCTP”，在96孔滤板C中按照步骤（2）-（6）的流程重复类似操作，连续制备10孔微球。
[0048] (8)将步骤（6）制备的76孔微球和步骤（7）制备的76孔微球抽滤洗涤，分别上样流式细胞仪进行检测。
[0049] 上述(6)中制得的96孔滤板B中10孔微球用于并行测序exon 21 L858R、exon 18 G719X片段中的胸腺嘧啶(T)、腺嘌呤(A)，上述(7)中制得的96孔滤板C中10孔微球用于并行测序exon 21 L858R、exon 18 G719X突变片段中的胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)。
[0050] 将所有流式细胞仪检查结果进行整合，得到exon 21 L858R核酸片段的测序结果为：TGGCCAAACT；exon 18 G719X核酸片段的测序结果为：G(G→A,G719X)GCTC CGGTG。这两段核酸片段的第一位碱基的检测结果如图3所示，exon 21 L858R核酸片段的起始第一位碱基为T，不存在突变；而exon 18 G719X片段的起始第一位碱基同时出现G和A，说明该核酸片段中同时存在野生型和突变型。
[0051] 该EGFR基因核酸片段样本Sanger测序法结果与本发明测序结果一致。
[0052] 实施例4按照实施例1的方法对EGFR基因T790M核酸片段进行测序，不同的是：每个孵育体系中，核酸聚合酶的终浓度均为200 units/ml，每种荧光标记的ddNTP的终浓度均为10 μmol/L，每种核糖3'-OH被保护的dNTP的终浓度均为10 μmol/L。检测结果与实施例1相同。
[0053] 实施例5按照实施例1的方法对EGFR基因T790M核酸片段进行测序，不同的是：每个孵育体系中，核酸聚合酶的终浓度均为2 units/ml，每种荧光标记的ddNTP的终浓度均为50μmol/L，每种核糖3'-OH被保护的dNTP的终浓度均为50μmol/L，延长孵育时间。检测结果与实施例1相同。
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