一种改良的荧光原位杂交方法及其应用
阅读：503发布：2020-05-21
专利汇可以提供一种改良的荧光原位杂交方法及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供一种改良的 荧光 原位杂交方法及其应用，改良的荧光原位杂交方法包括如下步骤：标本处理、变性、探针处理、杂交和复染。本发明用荧光 显微镜 观察并统计细胞的荧光杂交 信号 ，对81例淋系增生性 疾病 患者作出精确的 染色 体分析，判断患者基因的缺失及分子遗传学异常，得出如下结论：分子遗传学分析不但有助于淋系白血病的诊断和 鉴别 诊断 ，而且还是临床监测病情缓解和复发、判断疗效的重要指标。在染色体核型分析 基础 上选用合适的荧光原位杂交探针和方法，可对大多数淋系白血病患者作出精确的染色体分析，各分子遗传学异常与患者 预后 相关。，下面是一种改良的荧光原位杂交方法及其应用专利的具体信息内容。
1.一种改良的荧光原位杂交技术，其特征在于，包括如下步骤：
（1）无菌抽取患者骨髓2 5ml，在净化台内调整单个核细胞数1 2×106/ml，注入1640培~ ~
养液，37℃24h培养；
（2）终止培养前加秋水仙胺应用液，然后低渗、预固定、固定、气干法制片，其余细胞悬液置-20℃保存；
（3）取出储存于-20℃的标本，换用新鲜的固定液，滴片，37℃2×SSC中浸泡30 35min，~
以体积分数为70%、85%、100%的乙醇中室温下梯度脱水，每梯度脱水2 4min；
~
（4）变性：在变性液中72℃变性2 4min，在70%、85%、100%的冰乙酸中梯度脱水，每梯度~
脱水2 4min，然后晾干；
~
（5）探针处理：1微升荧光素直接标记的着丝粒探针，加杂交液，混均后在75℃水浴中变性8 12min，然后置冰浴2 3min；
~ ~
（6）杂交：变性后的着丝粒探针随机加以于玻片杂交区域内，盖上玻片，封片后放入预热的湿盒中，37℃杂交过夜，杂交后的标本在72℃的0.4×SSC溶液中洗涤4 7min，然后用~
0.1%Triton X-100溶液洗涤2 4min；
~
（7）复染：复染2 4min，用荧光显微镜观察并统计细胞的荧光杂交信号。
~
2.根据权利要求1所述的荧光原位杂交方法，其特征在于，步骤（3）中，所述固定液包括甲醇和冰醋酸，所述甲醇和冰醋酸的重量比为3：1。
3.根据权利要求1所述的荧光原位杂交方法，其特征在于，步骤（4）中，所述冰乙酸的温度为-20℃。
4.根据权利要求1所述的荧光原位杂交方法，其特征在于，步骤（5）中，所述荧光素为Spectrum green 、 Spectrum red或两者的混合。
5.一种如权利要求1 4中任一项所述的改良的荧光原位杂交方法在制备淋系白血病基~
因缺失检测试剂盒中的应用。
一种改良的荧光原位杂交方法及其应用
技术领域
背景技术
[0002] 2001年WHO对淋巴造血组织肿瘤进行了新的分类，目前在临床上淋巴细胞增殖性疾病主要指淋巴细胞白血病及部分恶性淋巴瘤。淋巴细胞白血病是一种起源于B或T系淋巴细胞克隆性恶性增值性疾病，主要包括急性淋巴细胞白血病（acute lymphocytic leukemia,ALL）和慢性淋巴细胞白血病（chronic lymphocytic leukemia, CLL）。前者的特征是不成熟原幼淋巴细胞在血液、骨髓及淋巴组织中异常增殖和堆积。后者的特征是一种免疫功能不健全的成熟小淋巴细胞血液、骨髓及淋巴组织中慢性恶性增殖的疾病，最终导致正常造血功能衰竭。恶性淋巴瘤（lymphoma）是发生于淋巴结和/或结外部位淋巴组织的免疫细胞肿瘤，来源于淋巴细胞或组织细胞的恶变，分为非霍奇金淋巴瘤（Non-Hodgkin Lymphoma, NHL）和霍奇金淋巴瘤（Hodgkin Lymphoma, HL）两大类，其中以NHL为主，大约占到85%。常见的如滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤等等。近年来在我国随着病毒感染、环境污染、人口老龄化等因素，淋巴细胞增殖性疾病的发病率呈逐年上升趋势，严重威胁着人们的健康，部分患者总病程仅数月，部分患者即使不积极治疗仍能数年之久，有些初病时症状类似的患者，即使接收相同的治疗，但有完全不同的预后，因为建立明确的预后判断体系对于个体化治疗具有重要的临床意义。
[0003] 既往评价诊疗及预后的指标主要依靠患者的临床表现、外周血、骨髓的细胞形态学、骨髓活检术、常规细胞遗传（CC）学、免疫分型等等，这些存在以下问题：第一、虽然细胞改变的质与量是形态学诊断的重要依据，但在不典型的原淋细胞、幼淋细胞、原粒细胞之间及同时表达髓系、淋系标志的细胞难于清晰区分；第二、CC技术只能分析中期细胞，受细胞周期及染色体分裂数量和质量的影响，因而可能导致核型分析失败或漏检伴有染色体畸变的微小克隆，并且操作费时费力，主观人为因素影响太大。如涂片制备的好坏、细胞计数多少、计数辨认和程度的估计等等导致CC对染色体异常的检出率很低。
[0004] 二十世纪八十年代在常规细胞遗传学、分子生物学和免疫学相结合的基础上发展起来的荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization ,FISH）技术，是利用已知核酸序列作为探针，以荧光素直接标记或先以生物素或地高辛等半抗原标记后与靶DNA进行杂交，再通过免疫细胞化学过程连接上荧光素标记物，最后在荧光显微镜下观察杂交信号，从而对标本中待测核酸进行定性、定位和定量分析。因此联合FISH技术不仅可明显提高淋系疾病的染色体异常检出率和准确率，而且具有独立的预后判断价值，在疾病诊断之初或进展时应做FISH染色体检查，以评估预后及指导临床治疗。
[0005] 在判断预后、指导治疗方面：常使用靶向探针GLP P53、GLP RB1、GLP ATM、GLP D13S25、CSP 12、GLP IGH/ GLP BCL2、GLP IGH/ GLP BCL6、GLP IGH/ GLP CCND1、BCR/ABL1、E2A-PBX1、TCR等等常用于诊断与危险分层治疗的指标。p53基因是迄今发现的与人类肿瘤联系最为密切的基因，几乎所有的人类肿瘤中均存在p53信号通路的异常。p53基因定位于人类染色体17p13.1，在细胞接受多种应激（如DNA损伤、药物、射线、癌基因等）信号后，DNA双链断裂，从而激活共济失调毛细血管扩张突变（ATM），进一步磷酸化p53，活化的p53可以激活p21WAF1/CIP1等多种基因，参与DNA损伤修复、细胞周期调节、老化及凋亡，进而抑制肿瘤。伴有p53突变的淋巴细胞疾病患者预后较差。FISH同时检测P53、ATM缺失、 RB1缺失和+12阳性，提示CLL总生存期短、预后差；GLP D13S25阳性，则提示CLL病人与预后好；BCR/ABL1融合基因阳性ALL，提示预后差，但可用靶向药物格列卫治疗；E2A-PBX1阳性主要见于前B细胞ALL，提示预后很差；TCR重排见于T-ALL，阳性预后差。14号染色体异常是淋巴瘤最常见的结构异常，绝大多数是由于伙伴染色体与14号染色体交互易位造成，从而形成部分淋巴瘤特殊的标记。如滤泡性淋巴瘤常出现t（14：18）阳性、套细胞淋巴瘤常出现t（11：14）阳性、弥漫性大B细胞淋巴瘤常出现GLP BCL6阳性，如出现阳性则提示预后均差。因此FISH技术使得临床上根据这些指标评估预后、制定个体化治疗方案成为可能。
[0006] 淋巴细胞增生性疾病的治疗失败一直是临床难题。虽然经过常规支持、化疗或骨髓移植达到临床和血液学的完全缓解（CR），但体内仍然残留有少量的幼稚细胞，即微小残留病灶（minimal residual diease,MRD），是复发的根源所在。只有分子水平检测、诊疗才能反映其本质。因此分子细胞遗传学的研究在淋系增生性疾病的诊断、病情发展和预后判断、制定个体化治疗方案等方面中有着至关重要的作用，因此研究临床上与淋巴细胞增生性疾病诊疗、预后密切相关的问题，开辟靶向治疗的新途径，提高诊疗效果，具有非常重要的临床价值和广阔的应用前景。
发明内容
[0007] 本发明要解决的技术问题是提供一种改良的荧光原位杂交方法及其应用，有助于临床诊疗及判断预后，同时对阐明淋巴细胞增生性疾病的发病机制有重要的临床价值，具有广阔的应用前景。
[0008] 为解决上述技术问题，本发明的实施例提供一种荧光原位杂交技术，包括如下步骤：（1）无菌抽取患者骨髓2 5ml，在净化台内调整单个核细胞数1 2×106/ml，注入1640培~ ~
养液，37℃24h培养；
（2）终止培养前加秋水仙胺应用液，然后低渗、预固定、固定、气干法制片，其余细胞悬液置-20℃保存；
（3）取出储存于-20℃的标本，换用新鲜的固定液，滴片，37℃2×SSC中浸泡30 35min，~
以体积分数为70%、85%、100%的乙醇中室温下梯度脱水，每梯度脱水2 4min；
~
（4）在变性液中72℃变性2 4min，在70%、85%、100%的冰乙酸中梯度脱水，每梯度脱水2~ ~
4min，然后晾干；
（5）探针处理：1微升荧光素直接标记的着丝粒探针，加杂交液，混均后在75℃水浴中变性8 12min，然后置冰浴2 3min；
~ ~
（6）杂交：变性后的着丝粒探针随机加以于玻片杂交区域内，盖上玻片，封片后放入预热的湿盒中，37℃杂交过夜，杂交后的标本在72℃的0.4×SSC溶液中洗涤4 7min，然后用~
0.1%Triton X-100溶液洗涤2 4min；
~
（7）复染：复染2 4min，用荧光显微镜观察并统计细胞的荧光杂交信号。
~
养液，37℃24h培养；
（2）终止培养前加秋水仙胺应用液，然后低渗、预固定、固定、气干法制片，其余细胞悬液置-20℃保存；
（3）取出储存于-20℃的标本，换用新鲜的固定液，滴片，37℃2×SSC中浸泡30 35min，~
以体积分数为70%、85%、100%的乙醇中室温下梯度脱水，每梯度脱水2 4min；
~
（4）在变性液中72℃变性2 4min，在70%、85%、100%的冰乙酸中梯度脱水，每梯度脱水2~ ~
4min，然后晾干；
（5）探针处理：1微升荧光素直接标记的着丝粒探针，加杂交液，混均后在75℃水浴中变性8 12min，然后置冰浴2 3min；
~ ~
（6）杂交：变性后的着丝粒探针随机加以于玻片杂交区域内，盖上玻片，封片后放入预热的湿盒中，37℃杂交过夜，杂交后的标本在72℃的0.4×SSC溶液中洗涤4 7min，然后用~
0.1%Triton X-100溶液洗涤2 4min；
~
（7）复染：复染2 4min，用荧光显微镜观察并统计细胞的荧光杂交信号。
~
[0009] 其中，步骤（3）中，所述固定液包括甲醇和冰醋酸，所述甲醇和冰醋酸的重量比为3：1。
[0010] 其中，步骤（4）中，所述冰乙酸的温度为-20℃。
[0011] 优选的，步骤（5）中，所述荧光素为Spectrum green 、 Spectrum red或两者的混合。
[0013] 本发明的上述技术方案的有益效果如下：本发明应用体外细胞培养技术、热变性姬姆萨显带技术（RHG）、在常规细胞遗传学分析的基础上，运用荧光原位杂交（FISH）等分子生物学检测技术，拟观察19例急性淋系白血病（ALL）患者、62例慢性淋系白血病（CLL）患者探讨分子细胞遗传学异常与临床相关性，研究染色体变化的基因位点，观察不同的染色体异常在淋系增生性疾病患者中对诊疗及预后的意义，寻找到与患者诊断及预后的染色体标志物，观察在使用相应药物后生存期、无病进展期等的改变，明确FISH技术对于指导患者个体化治疗的临床价值。本发明首次提出从淋巴细胞增生性疾病的分子染色体异常作为研究窗口寻找预后的可行性，首次提出借鉴淋巴细胞增生性疾病的分子染色体异常来权衡的治疗措施，并且对阐明淋系增生性疾病的发病机制有重要的临床价值，同时为分子靶向治疗提供可靠的理论依据，进行分子学水平诊疗，因而本发明的技术方案具有独特的创新之处。
具体实施方式
[0014] 为使本发明要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚，下面将结合具体实施例进行详细描述。
[0015] 实施例1：一种改良的荧光原位杂交技术，包括如下步骤：（1-1）无菌抽取患者骨髓2 5ml，在净化台内调整单个核细胞数1 2×106/ml，注入1640~ ~
培养液，37℃24h培养；
（1-2）终止培养前加秋水仙胺应用液，然后低渗、预固定、固定、气干法制片，其余细胞悬液置-20℃保存；
（1-3）取出储存于-20℃的标本，换用新鲜的固定液，滴片，37℃2×SSC中浸泡30min，以体积分数为70%、85%、100%的乙醇中室温下梯度脱水，每梯度脱水2min；
其中，所述固定液包括甲醇和冰醋酸，而甲醇和冰醋酸的重量比为3：1。
培养液，37℃24h培养；
（1-2）终止培养前加秋水仙胺应用液，然后低渗、预固定、固定、气干法制片，其余细胞悬液置-20℃保存；
（1-3）取出储存于-20℃的标本，换用新鲜的固定液，滴片，37℃2×SSC中浸泡30min，以体积分数为70%、85%、100%的乙醇中室温下梯度脱水，每梯度脱水2min；
其中，所述固定液包括甲醇和冰醋酸，而甲醇和冰醋酸的重量比为3：1。
[0016] （1-4）在72℃的体积分数70％甲酰胺+2×SSC的变性液中72℃变性3min，在70%、85%、100%的冰乙酸中梯度脱水，每梯度脱水2min，然后晾干；
其中，所述冰乙酸的温度为-20℃。
其中，所述冰乙酸的温度为-20℃。
[0017] （1-5）探针处理：1微升荧光素直接标记的着丝粒探针，加杂交液，混均后在75℃水浴中变性10min，然后置冰浴3min；其中，所述荧光素为Spectrum green 、 Spectrum red或两者的混合。
[0018] 所述杂交液的配制如下：8μl体积分数25％DS，20μl 20×SSC混合，取上述混合液50μl，与5μl DF混合即成，其终浓度为体积分数10％DS，2×SSC，体积分数50％DF。
[0019] （1-6）杂交：变性后的着丝粒探针随机加以于玻片杂交区域内，盖上玻片，封片后放入预热的湿盒中，37℃杂交过夜，杂交后的标本在72℃的0.4×SSC溶液中洗涤5min，然后用室温的0.1%Triton X-100溶液洗涤2min；（1-7）复染：用复染溶液（PI/antifade或DAPI/antifade）复染2min，然后用荧光显微镜观察并统计细胞的荧光杂交信号，作出精确的染色体分析，判断患者基因的缺失及分子遗传学异常。
[0020] 实施例2：一种改良的荧光原位杂交技术，包括如下步骤：（2-1）无菌抽取患者骨髓2 5ml，在净化台内调整单个核细胞数1 2×106/ml，注入1640~ ~
培养液，37℃24h培养；
（2-2）终止培养前加秋水仙胺应用液，然后低渗、预固定、固定、气干法制片，其余细胞悬液置-20℃保存；
（2-3）取出储存于-20℃的标本，换用新鲜的固定液，滴片，37℃2×SSC中浸泡31.5min，以体积分数为70%、85%、100%的乙醇中室温下梯度脱水，每梯度脱水2min；
其中，所述固定液包括甲醇和冰醋酸，而甲醇和冰醋酸的重量比为3：1。
培养液，37℃24h培养；
（2-2）终止培养前加秋水仙胺应用液，然后低渗、预固定、固定、气干法制片，其余细胞悬液置-20℃保存；
（2-3）取出储存于-20℃的标本，换用新鲜的固定液，滴片，37℃2×SSC中浸泡31.5min，以体积分数为70%、85%、100%的乙醇中室温下梯度脱水，每梯度脱水2min；
其中，所述固定液包括甲醇和冰醋酸，而甲醇和冰醋酸的重量比为3：1。
[0021] （2-4）在72℃的体积分数70％甲酰胺+2×SSC的变性液中72℃变性4min，在70%、85%、100%的冰乙酸中梯度脱水，每梯度脱水2min，然后晾干；
其中，所述冰乙酸的温度为-20℃。
其中，所述冰乙酸的温度为-20℃。
[0022] （2-5）探针处理：1微升荧光素直接标记的着丝粒探针，加杂交液，混均后在75℃水浴中变性10min，然后置冰浴3min；其中，所述荧光素为Spectrum green 、 Spectrum red或两者的混合。
[0023] 所述杂交液为8μl体积分数25%DS、20μl 20×SSC混合。
[0024] 所述杂交液的配制如下：40μl体积分数50％DS，20μl 20×SSC，40μl ddH2O混合，取上述混合液50μl，与5μl DF混合即成。其终浓度为体积分数10％DS，2×SSC，体积分数50％DF。
[0025] （2-6）杂交：变性后的着丝粒探针随机加以于玻片杂交区域内，盖上玻片，封片后放入预热的湿盒中，37℃杂交过夜，杂交后的标本在72℃的0.4×SSC溶液中洗涤7min，然后用室温的0.1%Triton X-100溶液洗涤4min；（2-7）复染：用10μl复染溶液（PI/antifade或DAPI/antifade）复染2min，然后用荧光显微镜观察并统计细胞的荧光杂交信号，作出精确的染色体分析，判断患者基因的缺失及分子遗传学异常。
[0026] 实施例3：一种改良的荧光原位杂交方法在制备淋系白血病基因缺失检测试剂盒中的应用，比如用于检测淋系白血病患者p53基因的缺失。
[0027] 对接诊的19例急性淋系白血病（ALL）患者、62例慢性淋系白血病（CLL）患者应用本发明的荧光原位杂交技术（Fluorescence in Situ hybridization， FISH）检测分析。前者应用特异性探针BCR/ABL、MLL、IHG、C-MYC、TEL/AML1，后者应用D13S25(13q14.3)、RB1(13q14)、ATM(11q22.3)、p53(17p13)、CSP12 检测分析。
[0028] 在81例淋系白血病中：49例检出分子遗传学异常，占58.02%（47/81）。其中19例ALL患者，7例存在1种及1种以上分子遗传学异常，占36.84%（7/19）；3例存在2种及2种以上分子遗传学异常，占15.79%（3/19），其中最为常见的BCR/ABL阳性4例，占21.05%（4/19），其它依次为MLL、IHG、C-MYC、TEL/AML1。
[0029] 62例CLL患者，42例存在1种及1种以上分子遗传学异常，占67.74%（42/62）；10例存在2种及2种以上分子遗传学异常，占16.13%（10/62），其中最常见为13q14.3占41.94%（26/62），其它依次为13q14、+12 、11q22.3、17p13。
[0030] 由上述数据可知：分子遗传学分析不但有助于淋系白血病的诊断和鉴别诊断，而且还是临床监测病情缓解和复发、判断疗效的重要指标。在染色体核型分析基础上选用合适的荧光原位杂交探针和方法，可对大多数淋系白血病患者作出精确的染色体分析，各分子遗传学异常与患者预后相关。
[0031] 以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
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