一种新疆沙冬青染色体荧光原位杂交的方法
专利汇可以提供一种新疆沙冬青染色体荧光原位杂交的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及细胞遗传学与分子 生物 学技术领域，具体涉及一种新疆沙冬青 染色 体 荧光 原位杂交的方法。通过制备染色体玻片标本、18SrDNA、5SrDNA和端粒探针制备与探针变性、探针与染色体共变性、杂交与杂交后洗脱、制片与 信号 检测步骤，建立新疆沙冬青染色体荧光原位杂交技术，本发明是一种快速、精确的染色体荧光原位杂交技术，观察到分散好、荧 光信号 强的染色体分裂相，能更好地辨析新疆沙冬青染色体，以应用于新疆沙冬青的核型分析与进化研究。，下面是一种新疆沙冬青染色体荧光原位杂交的方法专利的具体信息内容。
1.一种新疆沙冬青染色体荧光原位杂交的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：染色体玻片标本的制备，新疆沙冬青种子在28℃温箱中常规培养，待根尖生长至2-
3厘米时，切下生长旺盛的根尖在1.5毫升离心管中保持湿润，置密闭容器中用N2O处理2.5小时，取出根尖用90%冰醋酸处理10分钟，即转入70%乙醇中固定，置-20℃长期备用，取固定后的2-3个根尖，用蒸馏水洗净，切生长点放入含1%果胶酶和2%纤维素酶的缓冲液中，37℃解离45分钟，离心先后用冷蒸馏水，无水乙醇洗涤两遍，最后放入30微升冰醋酸中，每张玻片滴5微升左右悬液展片，空气干燥后放紫外交联仪处理固定染色体，镜检分散良好的染色体玻片，置-20℃长期备用；
S2：18SrDNA、5SrDNA和端粒探针制备与探针变性，选取同属于豆科的植物大豆5SrDNA和18SrDNA序列设计引物，以新疆沙冬青为模板扩增重复序列，采用Nick translation法制备探针，端粒采用拟南芥端粒DNA序列为探针，Am13引物为fwd和Am13以新疆沙冬青为模板扩增重复序列。
2.分别标记FITC绿色和Texas Red红色荧光；
S3：探针与染色体共变性，制备好的染色体玻片，经过120-125毫焦/平方厘米的紫外交联仪处理1分钟固定染色体，在染色体位置加5微升的探针，其质量不超过100纳克，盖上盖玻片，放入密闭保湿的饭盒中，在沸水中煮沸15分钟，迅速冷却变性的染色体和探针；
S4：杂交与杂交后洗脱，遮光变性的玻片和探针，取出玻片放入55℃烘箱中，经过大于4小时的保温复性杂交，取出玻片置于含2×SSC溶液的玻片染色缸中，室温漂洗5分钟，去除玻片，接着转至另一含2×SSC溶液的玻片染色缸，55℃漂洗25分钟，取出玻片，空气晾干后保湿；
S5：制片与信号检测，在制备好的玻片上滴加荧光染料5微升DAPI和5微升2×SSC溶液，盖上盖玻片，在盖玻片上覆上吸水纸，用橡皮敲打1-2分钟，使用德国DM750M徕卡金相显微镜观察，找到良好的染色体分裂相，用不同的激发光获得，蓝色，红色和绿色的杂交信号；用Lecia CW4000 FISH software进行图像采集与合成。
3.如权利要求1所述的新疆沙冬青染色体荧光原位杂交的方法，其特征在于，所述步骤S2中的Nick translation法制备探针，成分为：DNA (200纳克/毫升)，10.0微升；10×Nick translation缓冲液，2.0微升；荧光标记的dNTP(1mM)，0.5微升；无荧光标记的dNTPs(2 mM)，2.0微升；DNA 聚合酶I(10U/微升)，8.0微升；DNase (100 mU/微升)，0.4微升；总体积
22.9微升；制备方法为：混合物混匀后放入PCR仪15°C保温2小时；加入175微升的含140纳克/微升鲑鱼精DNA的5× TAE pH 5.2终止反应，并混匀，加入500微升大于2小时沉淀探针后16000rpm；离心30分钟，70%乙醇洗涤2遍，加入100微升的2×SSC溶解探针，使探针终浓度为20纳克/微升，-20℃避光储存备用。
4.如权利要求1所述的新疆沙冬青染色体荧光原位杂交的方法，其特征在于，所述新疆沙冬青的核型模式为2n = 2x =18= 2m(SAT)+4m +10sm+2st。
一种新疆沙冬青染色体荧光原位杂交的方法
技术领域
背景技术
发明内容
3厘米时，切下生长旺盛的根尖在1.5毫升离心管中保持湿润，置密闭容器中用N2O处理2.5小时，取出根尖用90%冰醋酸处理10分钟，即转入70%乙醇中固定，置-20℃长期备用，取固定后的2-3个根尖，用蒸馏水洗净，切生长点放入含1%果胶酶和2%纤维素酶的缓冲液中，37℃解离45分钟，离心先后用冷蒸馏水，无水乙醇洗涤两遍，最后放入30微升冰醋酸中，每张玻片滴5微升左右悬液展片，空气干燥后放紫外交联仪处理固定染色体，镜检分散良好的染色体玻片，置-20℃长期备用；
S2：18SrDNA、5SrDNA和端粒探针制备与探针变性，选取同属于豆科的植物大豆5SrDNA和18SrDNA序列设计引物，以新疆沙冬青为模板扩增重复序列，采用Nick translation法制备探针，端粒采用拟南芥端粒DNA序列为探针，Am13引物为fwd和Am13以新疆沙冬青为模板扩增重复序列。分别标记FITC绿色和Texas Red红色荧光；
S3：探针与染色体共变性，制备好的染色体玻片，经过120-125毫焦/平方厘米的紫外交联仪处理1分钟固定染色体，在染色体位置加5微升的探针，其质量不超过100纳克，盖上盖玻片，放入密闭保湿的饭盒中，在沸水中煮沸15分钟，迅速冷却变性的染色体和探针；
S4：杂交与杂交后洗脱，遮光变性的玻片和探针，取出玻片放入55℃烘箱中，经过大于4小时的保温复性杂交，取出玻片置于含2×SSC溶液的玻片染色缸中，室温漂洗5分钟，去除玻片，接着转至另一含2×SSC溶液的玻片染色缸，55℃漂洗25分钟，取出玻片，空气晾干后保湿；
S5：制片与信号检测，在制备好的玻片上滴加荧光染料5微升DAPI和5微升2×SSC溶液，盖上盖玻片，在盖玻片上覆上吸水纸，用橡皮敲打1-2分钟，使用德国DM750M徕卡金相显微镜观察，找到良好的染色体分裂相，用不同的激发光获得，蓝色，红色和绿色的杂交信号；用Lecia CW4000 FISH software进行图像采集与合成。
图3为新疆沙冬青18S rDNA（绿色）和端粒（红色）核型分析图；
图4为新疆沙冬青5S rDNA（绿色，白色箭头）和Am13（红色）信号点分布图像；
图5为新疆沙冬青5S rDNA（绿色）和Am13（红色）核型分析图；
图6为新疆沙冬青18SrDNA、5SrDNA、Am13和端粒（Telomere）核型分析模式图；
图7为新疆沙冬青的 5S rDNA (a-d)红色 和 18S rDNA (e-h)绿色荧光原位杂交结果图。
具体实施方式
3厘米时，切下生长旺盛的根尖在1.5毫升离心管中保持湿润，置密闭容器中用N2O处理2.5小时，取出根尖用90%冰醋酸处理10分钟，即转入70%乙醇中固定，置-20℃长期备用，取固定后的2-3个根尖，用蒸馏水洗净，切生长点放入含1%果胶酶和2%纤维素酶的缓冲液中，37℃解离45分钟，离心先后用冷蒸馏水，无水乙醇洗涤两遍，最后放入30微升冰醋酸中，每张玻片滴5微升左右悬液展片，空气干燥后放紫外交联仪处理固定染色体，镜检分散良好的染色体玻片，置-20℃长期备用；
S2：18SrDNA、5SrDNA和端粒探针制备与探针变性，选取同属于豆科的植物大豆5SrDNA和18SrDNA序列设计引物，5s-fwd(5’tgcgatcataccagcactaatg-3’)；5s-rev(5’-tgcaacacgaggacttcc-3’)和18s-fwd(5’-AAGTCGTAACAAGGTTTC-3’)；18s-rev(5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)以新疆沙冬青为模板扩增重复序列，采用Nick translation法制备探针，端粒采用拟南芥端粒DNA序列为探针，Am13(GenBank accession no.EF094988)引物为fwd(5’-CAAATCAGGCATGCAAATAA-3’) 和rev(5’-TGTATGCTCTTACTGCTTTGGA-3’)以新疆沙冬青为模板扩增重复序列。分别标记FITC绿色和Texas Red红色荧光；
S3：探针与染色体共变性，制备好的染色体玻片，经过120-125毫焦/平方厘米的紫外交联仪处理1分钟固定染色体，在染色体位置加5微升的探针，其质量不超过100纳克，盖上盖玻片，放入密闭保湿的饭盒中，在沸水中煮沸15分钟，迅速冷却变性的染色体和探针；
S4：杂交与杂交后洗脱，遮光变性的玻片和探针，取出玻片放入55℃烘箱中，经过大于4小时的保温复性杂交，取出玻片置于含2×SSC溶液的玻片染色缸中，室温漂洗5分钟，去除玻片，接着转至另一含2×SSC溶液的玻片染色缸，55℃漂洗25分钟，取出玻片，空气晾干后保湿；
S5：制片与信号检测，在制备好的玻片上滴加荧光染料5微升DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚)和5微升2×SSC溶液，盖上盖玻片，在盖玻片上覆上吸水纸，用橡皮敲打1-2分钟，使用德国DM750M徕卡金相显微镜观察，找到良好的染色体分裂相，用不同的激发光获得，蓝色，红色和绿色的杂交信号；用Lecia CW4000 FISH software进行图像采集与合成。
175微升的含140纳克/微升鲑鱼精DNA的5× TAE pH 5.2终止反应，并混匀，加入500微升大于2小时沉淀探针后16000rpm；离心30分钟，70%乙醇洗涤2遍，加入100微升的2×SSC溶解探针，使探针终浓度为20纳克/微升，-20℃避光储存备用。
2×SCC溶液：水与20×SCC溶液体积比为9:1的溶液；
140纳克/微升鲑鱼精：将140毫克鲑鱼精粉末溶于1升蒸馏水，沸水溶解5分钟后-20℃保存。
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