使用工程化的细胞检测、监测或治疗疾病或病况的系统及制备和使用它们的方法
阅读：510发布：2020-09-28
专利汇可以提供使用工程化的细胞检测、监测或治疗疾病或病况的系统及制备和使用它们的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且提供了通过检测增加的机械模量或硬度或靶向具有增加的机械模量或硬度的组织来检测和 治疗 包括癌症、糖尿病、 纤维 化和自身免疫性 疾病 的疾病状态的方法。实施这些方法为这些疾病状态提供了特异性和局部的检测测定和疗法。提供了机械响应性细胞系统，其可通过靶向 肿瘤 微环境中的独特的 生物 物理性质和机械性质来选择性检测和治疗癌症转移。提供了通过使用机械响应性启动子逻辑来制备机械敏感性CAR T细胞的方法。提供了使用工程化的干细胞的血液检验，所述干细胞在细胞归巢于特定小生境后表达报告子并将报告子分泌至血液中，然后所述报告子可用血液检验来检测。在替代实施方案中，提供了能够以单分子或单细胞灵敏度检测血液中靶分子或细胞的超灵敏检测平台。，下面是使用工程化的细胞检测、监测或治疗疾病或病况的系统及制备和使用它们的方法专利的具体信息内容。
1.一种工程化的细胞或重组细胞，或
包括、掺入或使用所述工程化的细胞或重组细胞的多路复用系统或装置，或所述工程化的细胞或重组细胞、其多路复用系统或装置用于进行细胞工程化以靶向、检测或监测或治疗疾病的异常细胞或组织的方法或用途，
其包括：
(1)(a)提供细胞或改变所述细胞内容物以产生所述工程化的细胞的工程化方法，以及修饰所述细胞以在其中包含、包括或具有以下物质，或具有表达以下物质的能力：治疗剂、转化酶、酶原、抗体、外源蛋白、外源纳米颗粒、归巢剂或原先不存在于所述细胞中的任何分子或装置，或
(b)(所述工程化的细胞或重组细胞)在其中包含、包括或具有以下物质，或经修饰具有表达以下物质的能力：治疗剂、转化酶、酶原、抗体、外源蛋白、外源纳米颗粒、归巢剂或原先不存在于细胞中的任何分子或装置，
其中任选地，所述工程化的细胞或重组细胞是免疫细胞(任选T细胞)、间充质干细胞(MSC)、神经干细胞(NSC)、造血干细胞(HSC)或微生物，任选细菌，
以及任选地，将所述细胞工程化以包含至少一种具有表达以下物质的能力的外源核酸：治疗剂、转化酶、酶原、抗体、外源蛋白、外源纳米颗粒、归巢剂或原先不存在于所述细胞中的任何分子，并且所述核酸的表达处于机械响应性启动子(其中所述启动子通过所述细胞的环境的硬度的增加或与具有增加的机械模量或硬度的组织或环境的接触来进行激活)的控制之下(可操作地连接到机械响应性启动子)，并且任选地所述机械响应性启动子包括或为YAP/TAZ机械响应性启动子，
以及任选地，所述工程化的细胞或重组细胞包含归巢剂，或经工程化以包含外源归巢剂，其包含促进或增强所述工程化的细胞或重组细胞向某一或期望的小生境、包括但不限于肿瘤小生境迁移的蛋白或任何形式的分子，并且任选地，所述归巢剂由处于机械响应性启动子、任选YAP/TAZ机械响应性启动子的控制之下(可操作地连接到机械响应性启动子、任选YAP/TAZ机械响应性启动子)的核酸编码，
以及任选地，所述工程化的细胞或重组细胞包含治疗剂，或经工程化以包含外源治疗剂、任选直接治疗剂，所述治疗剂包括对其它细胞具有直接毒性或有益作用的蛋白质酶或任何形式的分子，以及任选地，所述治疗剂由处于机械响应性启动子、任选YAP/TAZ机械响应性启动子的控制之下(可操作地连接到机械响应性启动子、任选YAP/TAZ机械响应性启动子)的核酸编码，
以及任选地，所述工程化的细胞或重组细胞包含转化酶，或经工程化以包含外源转化酶，所述转化酶包括能够将有毒的、无活性或非活性分子转化成诊断剂或治疗剂的蛋白质酶或任何形式的分子，并且任选地，所述转化酶由处于机械响应性启动子、任选YAP/TAZ机械响应性启动子的控制之下(可操作地连接到机械响应性启动子、任选YAP/TAZ机械响应性启动子)的核酸编码，
以及任选地，所述工程化的细胞或重组细胞包含酶原，或经工程化以包含外源酶原，所述酶原包括能够被转化为直接治疗剂的蛋白质酶或任何形式的分子，并且任选地，所述酶原由处于机械响应性启动子、任选YAP/TAZ机械响应性启动子的控制之下(可操作地连接到机械响应性启动子、任选YAP/TAZ机械响应性启动子)的核酸编码，
以及任选地，所述工程化的细胞或重组细胞包含抗体或抗原结合剂，或经工程化以包含外源抗体或抗原结合剂，其中所述抗体或抗原结合剂包括能够结合至特定靶标的蛋白质抗体或任何形式的分子，并且任选地，所述抗体或抗原结合剂由处于机械响应性启动子、任选YAP/TAZ机械响应性启动子的控制之下(可操作地连接到机械响应性启动子、任选YAP/TAZ机械响应性启动子)的核酸编码，
以及任选地，所述工程化的细胞或重组细胞包含源自除所述工程化的细胞外的物种或从所述蛋白的天然形式修饰而来的外源蛋白，并且所述外源蛋白由处于机械响应性启动子、任选YAP/TAZ机械响应性启动子的控制之下(可操作地连接到机械响应性启动子、任选YAP/TAZ机械响应性启动子)的核酸编码，
以及任选地，所述工程化的细胞或重组细胞包含外源装置，任选纳米颗粒或包含所述原始细胞不具有的任何分子，
以及任选地，将所述机械响应性启动子、任选YAP/TAZ机械响应性启动子工程化至所述细胞中以驱动目标内源核酸，以及任选地使用CRISPR/Cas9或等效方法将所述机械响应性启动子工程化至所述细胞中；或
(2)(a)提供工程化的细胞或重组细胞，所述工程化的细胞或重组细胞具有经修饰的细胞内容物或包含外源因子以修饰所述细胞的分化、归巢、机械信号、细胞-细胞通信、可溶性因子、细胞外环境或对其它因子的响应的生理学或生物化学或生物物理学机制，或(b)(所述工程化的细胞或重组细胞)在其中包含、包括或已包含经修饰的细胞内容物，或包含外源因子以修饰所述细胞的分化、归巢、机械信号、细胞-细胞通信、可溶性因子、胞外环境或对其它因子的响应的生理学或生物化学或生物物理学机制，
其中任选地，修饰所述细胞的分化、归巢、机械信号、细胞-细胞通信、可溶性因子、细胞外环境或对其它因子的响应的生理学或生物化学或生物物理学机制的所述外源因子，由处于机械响应性启动子、任选YAP/TAZ机械响应性启动子的控制之下(可操作地连接到机械响应性启动子、任选YAP/TAZ机械响应性启动子)的核酸编码，
以及任选地，所述工程化的细胞或重组细胞的经修饰的分化机制在将细胞类型特异性从低改变至高后，改变所述工程化的细胞或重组细胞的位置和细胞内容物，以及任选地，所述工程化的细胞或重组细胞的经修饰的机械信号传导在接受来自细胞外基质或细胞外环境的硬度和/或交联信号后改变所述工程化的细胞或重组细胞的位置和细胞内容物，
以及任选地，所述工程化的细胞或重组细胞的经修饰的归巢机制包括归巢于某一小生境，
以及任选地，所述工程化的细胞的经修饰的细胞-细胞通信机制在与其它细胞相互作用后改变所述工程化的细胞的位置和细胞内容物，
以及任选地，通过所述工程化的细胞或重组细胞进行的经修饰的可溶性因子产生在接受所述细胞外环境中的因子后改变所述工程化的细胞或重组细胞的位置和细胞内容物，以及任选地，所述工程化的细胞或重组细胞的经修饰的细胞外环境响应于所述细胞外环境中的内容物而改变所述工程化的细胞或重组细胞的位置和细胞内容物，以及任选地，所述工程化的细胞或重组细胞的经修饰的化学条件改变所述工程化细胞的位置和/或细胞内容物，其中任选地，经修饰的工程化的细胞包含蛋白质、核酸、脂质、糖类、小分子、pH、温度、辐射或用于改变所述细胞的位置的任何其它因子；或(3)(a)提供如上述步骤(1)或(2)中所述的工程化的细胞或重组细胞，其中所述细胞经修饰以在其中具有、包含或含有至少一种具有表达以下物质的能力的外源核酸：治疗剂、转化酶、酶原、抗体、外源蛋白、外源纳米颗粒、归巢剂或原先不存在于所述细胞中的任何分子，并且所述核酸的表达是组成型的或可激活的(可诱导的)，或
(b)如上述步骤(1)或(2)中所述的工程化的细胞或重组细胞，其中所述工程化的细胞经修饰以在其中具有、包含或含有至少一种具有表达以下物质的能力的外源核酸：治疗剂、转化酶、酶原、抗体、外源蛋白、外源纳米颗粒、归巢剂或原先不存在于所述细胞中的任何分子，并且所述核酸的表达是组成型的或可激活的(可诱导的)，
其中任选地，所述外源核酸处于机械响应性启动子、任选YAP/TAZ机械响应性启动子的控制之下(可操作地连接到机械响应性启动子、任选YAP/TAZ机械响应性启动子)，其中任选地，无论所述细胞外环境如何，所述组成型表达持续进行，
其中任选地，所述可激活的或可诱导表达按照(2)中描述的机制开始，或可通过外源因子的表达来激活或诱导，以修饰所述细胞的分化、归巢、机械信号传导、细胞-细胞通讯、对可溶性因子或细胞外环境的暴露或对其它因子的响应的生理学或生物化学或生物物理学机制或因子表达，
其中任选地，所述细胞工程化是通过包括遗传学方法、任选CRISPR/Cas9方法或等效方法或非遗传学方法的方法进行的；或
(4)(a)提供工程化的细胞或重组细胞，所述细胞使得能够通过转化酶、直接治疗性酶、酶原、抗体或直接或间接辅助治疗过程的任何分子的表达来治疗疾病或病况，或(b)(所述工程化的细胞或重组细胞)在其中包含、包括或已含有转化酶、治疗性酶、酶原、抗体或直接或间接辅助治疗过程的任何分子，
其中任选地，所述转化酶、治疗性酶、酶原、抗体或直接或间接辅助治疗过程的分子由外源或内源核酸编码，所述外源或内源核酸处于机械响应性启动子、任选YAP/TAZ机械响应性启动子的控制之下(可操作地连接到机械响应性启动子、任选YAP/TAZ机械响应性启动子)，并且任选地，通过CRISPR/Cas9方法或等效方法将所述内源核酸工程化以与机械响应性启动子可操作地连接，
其中任选地，所述治疗包括使用转化酶或将治疗剂的非活性形式转化为其活性形式的任何蛋白或任何其它分子，
以及任选地，所述治疗包括使用指导所述细胞内含容物或细胞外环境的改变的直接治疗性酶，
以及任选地，所述治疗包括使用酶原或由所述工程化的细胞产生的任何蛋白或任何分子，其中其形式响应于(2)中所述的机制而从无活性改变成有活性，并以其活性形式递送疗效，
以及任选地，所述治疗包括使用由所述工程化的细胞产生的抗体或免疫球蛋白，所述抗体或免疫球蛋白直接或间接辅助治疗过程；或
(5)(a)提供工程化的细胞或重组细胞，所述细胞使得能够实现用于检测或诊断、伴随诊断或科学和研究工具的测定，或
(b)(所述工程化的细胞)包含编码蛋白的核酸，所述蛋白使得能够检测所述细胞，或者当所述细胞暴露于新环境、任选具有增加的机械模量或硬度的组织或环境时使得能够检测所述细胞，任选地，所述核酸处于机械响应性启动子、任选YAP/TAZ机械响应性启动子的控制之下(可操作地连接到机械响应性启动子、任选YAP/TAZ机械响应性启动子)，其中任选地，用于检测或诊断的测定效用由使得能够检测所述工程化的细胞的细胞位置和/或内容物的体外、体内、离体、原位或任何其它形式的测定组成，
以及任选地，伴随诊断效用由使得能够检测所述工程化的细胞的细胞位置和/或内容物的设备和/或平台组成，
以及任选地，伴随诊断效用由使得能够通过检测由所述细胞分泌至包括例如血液和尿液的生物流体中的探针(例如，酶)来实现细胞命运追踪和监测的设备和/或平台组成，以及任选地，所述探针在基因细胞疗法的情况下可以是治疗剂本身(例如，基因或蛋白)，或被工程化至所述细胞中的其它分子或试剂，
以及任选地，伴随诊断效用由允许来自生物样品的单分子检测的设备和/或平台组成，以及任选地，科学和/或研究工具效用由使用有利于生物过程的科学研究的所述工程化的细胞组成；或
(6)(a)提供工程化的细胞或重组细胞，所述细胞使得能够通过外源分子的表达来实现细胞基因疗法后的监测和安全性追踪，或
(b)(所述工程化的细胞或重组细胞)包含编码蛋白的核酸，所述蛋白使得能够通过外源分子的表达实现细胞基因疗法后的监测和安全性追踪，以及任选地，所述核酸处于机械响应性启动子、任选YAP/TAZ机械响应性启动子的控制之下(可操作地连接到机械响应性启动子、任选YAP/TAZ机械响应性启动子)；或
(7)(a)提供工程化的细胞或重组细胞，所述细胞直接或间接辅助治疗或改善癌症、癌症转移、组织纤维化、细胞命运追踪、糖尿病、伤口愈合、化妆品、骨质疏松症、再生医学或免疫性疾病，
(b)(所述工程化的细胞或重组细胞)包含编码蛋白的核酸，所述蛋白治疗或改善癌症、癌症转移、组织纤维化、细胞命运追踪、糖尿病、伤口愈合、化妆品、骨质疏松症、再生医学或免疫性疾病，并且任选地所述核酸处于机械响应性启动子、任选YAP/TAZ机械响应性启动子的控制之下(可操作地连接到机械响应性启动子、任选YAP/TAZ机械响应性启动子)，其中任选地，所述癌症或癌症转移包括当癌症扩散至除其起源处的组织中时的状况，并且所述除其起源处的组织具有足够的机械模量或硬度以激活(开启)所述机械响应性启动子，
以及任选地，所述组织纤维化包括纤维结缔组织过度形成的状况，并且任选地所述纤维结缔组织过度形成具有足够的机械模量或硬度来激活(开启)所述机械响应性启动子，以及任选地，所述细胞命运追踪包括在体内检测工程化的细胞的命运的方法，以及任选地，所述糖尿病包括长期高水平的血糖，
以及任选地，所述伤口愈合包括损伤组织的再生和重塑，
以及任选地，所述化妆品包括改善身体的外观，
以及任选地，所述骨质疏松症包括降低的骨质量和骨密度，
以及任选地，所述再生医学包括替换、工程化或再生人细胞、组织或器官以恢复或建立正常功能的过程，
以及任选地，所述免疫性疾病由由缺陷性或功能失常的免疫系统引起的疾病组成。
2.一种用于治疗、改善、预防或去除瘢痕组织的工程化的细胞或重组细胞，其中所述细胞包含：
(a)编码能够破坏或去除瘢痕组织的分泌型酶的外源核酸，
其中所述外源核酸的表达处于机械响应性启动子(其中所述启动子通过所述细胞的环境的硬度的增加，或与具有增加的机械模量或硬度的组织或环境的接触来进行激活)的控制之下(可操作地连接到该机械响应性启动子)，并且任选地所述机械响应性启动子包括YAP/TAZ机械响应性启动子或为YAP/TAZ机械响应性启动子，或
(b)编码能够破坏或去除瘢痕组织的分泌型酶的内源核酸，其中，任选地通过使用CRISPR/Cas9方法或等效方法或同源重组，将所述内源核酸工程化以与机械响应性启动子可操作地连接，
其中任选地，所述工程化的细胞或重组细胞能够靶向或结合至纤维化或瘢痕组织，或经工程化以靶向或结合至纤维化或瘢痕组织，
且任选地，所述工程化的细胞或重组细胞是干细胞、成纤维细胞、上皮细胞或免疫细胞，任选T细胞、淋巴细胞或巨核细胞。
3.一种用于治疗、改善、溶解、预防或去除有此需要的个体中的瘢痕组织或纤维化的方法，或
工程化的细胞或重组细胞用于治疗、改善、预防或去除瘢痕组织、纤维化的用途，或用于治疗、改善、预防或去除瘢痕组织、纤维化的工程化的细胞或重组细胞，其包括：
(a)提供如权利要求2所述的工程化的细胞或重组细胞，以及
(b)向所述有此需要的个体施用所述细胞。
其中任选地经治疗、改善、溶解、预防或去除的所述纤维化或瘢痕包括纤维化或与纤维化相关疾病相关的瘢痕，任选肺、肝、肾、心脏或血管纤维化，或伤口诱导的或手术诱导的瘢痕，或由心肌梗塞或心肌感染引起的瘢痕。
4.一种用于治疗、改善或预防响应于抗体或嵌合抗原受体(CAR)的病况的工程化的细胞或重组细胞，其中所述细胞包含：
(a)编码抗体、嵌合抗原受体(CAR)的外源核酸，其中所述抗体或CAR可治疗、改善或预防响应于抗体或嵌合抗原受体(CAR)的病况，
其中所述外源核酸的表达处于机械响应性启动子(其中所述启动子通过所述细胞的环境的硬度的增加或与具有增加的机械模量或硬度的组织或环境的接触来进行激活)的控制之下(可操作地连接该机械响应性启动子)，并且任选地所述机械响应性启动子包括YAP/TAZ机械响应性启动子或为YAP/TAZ机械响应性启动子，或
(b)编码抗体的内源核酸，其中，任选地通过使用CRISPR/Cas9方法或等效方法或同源重组，将所述内源核酸工程化以与机械响应性启动子可操作地连接，
其中任选地，所述工程化的细胞或重组细胞能够靶向或结合至特定或期望的细胞、器官或组织，或经工程化以靶向或结合至特定或期望的细胞、器官或组织，任选地所述工程化的细胞或重组细胞能够靶向或结合至癌症或肿瘤，任选实体肿瘤或癌症转移，以及任选地，所述工程化的细胞或重组细胞是干细胞、成纤维细胞、上皮细胞或免疫性细胞，任选T细胞、淋巴细胞或巨核细胞。
5.一种用于治疗、改善或预防有此需要的个体中的响应于抗体或嵌合抗原受体(CAR)的病况的方法，或
工程化的细胞或重组细胞用于治疗、改善或预防响应于抗体或嵌合抗原受体(CAR)的病况的用途，或
用于治疗、改善或预防响应于抗体或嵌合抗原受体(CAR)的病况的工程化的细胞或重组细胞，其包括：
(a)提供如权利要求4所述的工程化的细胞或重组细胞，和
(b)向所述有此需要的个体施用所述细胞，
其中任选地，所述响应于抗体或嵌合抗原受体(CAR)的病况是癌症或肿瘤，任选实体瘤或癌症转移。
6.一种用于将可检测的探针或分子，或治疗性分子递送至有此需要的个体中的经靶向的细胞、器官或组织的工程化的细胞或重组细胞，其中所述细胞包含：
(a)编码可检测的探针或分子或治疗性分子的外源核酸，
其中所述外源核酸的表达处于机械响应性启动子(其中所述启动子通过细胞环境的硬度的增加或与具有增加的机械模量或硬度的组织或环境的接触来进行激活)的控制之下(可操作地连接到该机械响应性启动子)，并且任选地所述机械响应性启动子包括YAP/TAZ机械响应性启动子或为YAP/TAZ机械响应性启动子，或
(b)编码治疗性分子或可检测分子的内源核酸，其中，任选地通过使用CRISPR/Cas9方法或等效方法或同源重组，将所述内源核酸工程化以与机械响应性启动子可操作地连接，其中任选地，所述工程化的细胞或重组细胞能够靶向或结合至特定或期望的细胞、器官或组织，或经工程化以靶向或结合至特定或期望的细胞、器官或组织，任选地所述工程化的细胞或重组细胞能够靶向或结合至癌症或肿瘤，任选实体瘤或癌症转移，其中任选地，所述可检测的探针或分子包含荧光蛋白，任选增强绿色荧光蛋白(eGFP)、β-半乳糖苷酶(β-gal)(任选大肠杆菌β-gal)、辣根过氧化物酶(HRP)或荧光素酶，并且任选地所述治疗性分子包括胞嘧啶脱氨酶(CD)，
以及任选地，所述可检测的探针或分子是分泌型可检测的探针或分子，以及任选地在由所述细胞分泌后，所述可检测的探针或分子在体液、任选血液或尿液中是可检测的，以及任选地，所述工程化的细胞或重组细胞是干细胞、成纤维细胞、上皮细胞或免疫细胞，任选T细胞、淋巴细胞或巨核细胞。
7.一种用于将可检测的探针或治疗性分子递送至有此需要的个体中的经靶向的细胞、器官或组织的方法，或
可检测的探针或治疗性分子用于检测或治疗有此需要的个体中的经靶向的细胞、器官或组织的用途，或
用于检测或治疗有此需要的个体中的经靶向的细胞，器官或组织的工程化的细胞或重组细胞，其包括：
(a)提供如权利要求6所述的工程化的细胞或重组细胞，和
(b)向所述有此需要的个体施用所述细胞，
其中任选地，通过所述可检测的探针或所述治疗性分子治疗或检测癌症或肿瘤，任选实体瘤或癌症转移。
8.一种非人转基因动物，其包含如权利要求1、权利要求2、权利要求4和/或权利要求6所述的工程化的细胞或重组细胞。
使用工程化的细胞检测、监测或治疗疾病或病况的系统及制
备和使用它们的方法
[0001] 相关申请
[0004] 本发明是在由美国国家卫生研究院(National Institutes of Health)(NIH)，DHHS颁发的第1DP2CA195763-01号和由DOD CDMRP颁发的第BC121644号的拨款下借助政府资助进行的。政府对本发明具有一定的权利。
技术领域
[0005] 本发明一般涉及生物分析、检测、筛选和治疗方法。特别地，在替代实施方案中，提供了通过检测增加的机械模量或硬度，或靶向具有增加的机械模量或硬度的组织来检测和治疗疾病状态(包括癌症、糖尿病、纤维化和自身免疫性疾病)的方法。实施这些方法为这些疾病状态(包括癌症、糖尿病，纤维化和自身免疫性疾病)提供了特异性和局部的检测测定和疗法。在替代实施方案中，提供了机械响应性细胞系统(MRCS)，其可通过靶向肿瘤或纤维化微环境中的独特的生物物理性质和机械性质来选择性检测和治疗癌症转移和纤维化相关疾病。在替代实施方案中，提供了使用经工程化以表达用于检测肿瘤和转移的报告子的间充质干细胞(MSC)的血液检验。在替代实施方案中，提供了使用表达报告子的工程化的细胞(例如，干细胞)进行的血液检验，其中在细胞归巢于特定小生境(例如，肿瘤小生境)后，它们将报告子分泌至血液中，然后可通过血液检验检测所述报告子。在替代实施方案中，提供了能够以单分子或单细胞灵敏度检测血液中的靶分子或细胞的超灵敏检测平台，例如所谓的集成式综合数字液滴检测(Integrated Comprehensive Digital Droplet Detection)(IC 3D)。在替代实施方案中，提供了工程化的T细胞或重组T细胞，所述细胞表达靶向在肿瘤细胞上表达的抗原的嵌合抗原受体(CAR)，并在肿瘤微环境中的生物物理性质和机械性质以及肿瘤抗原两者存在的情况下通过选择性机械响应性激活来治疗癌症转移。在替代实施方案中，提供了经工程化的非人类转基因动物，使得机械信号的不同强度可通过具有不同报告子(包括荧光蛋白)的机械敏感性启动子的阵列来检测。
[0006] 背景
[0007] 身体中的许多疾病状态，包括但不限于癌症、糖尿病、纤维化和自身免疫性疾病，尤其在早期阶段难以检测，甚至更难用常规方法治疗。
[0008] 目前的检测方法包括成像模态诸如正电子发射断层摄影(PET)、计算机断层摄影(CT)和磁共振成像(MRI)，以及生物学测试诸如组织学、聚合酶链反应(PCR)、流式细胞术和酶联免疫测定(ELISA)。这些方法具有缺点，诸如有限的灵敏度和特异性、检测时间长、使用刺激性或有害的造影剂和电离辐射、限于体内无功能性、组织活检所需的侵入性操作以及对广泛的样品制备或修饰的需要。
[0010] 细胞疗法的另一个障碍是缺乏监测和操纵移植细胞的命运(包括生物分布、归巢和植入、增殖、分化、细胞信号传导、治疗功效和潜在毒性)的工具和方法。
[0011] 检测和靶向治疗领域的主要挑战是找出合适的生物标志物来指示患病状态。不幸的是，由于患者之间的异质性，分子生物标志物通常是不可靠的。
[0012] 概述
[0013] 在替代实施方案中，提供工程化的细胞或重组细胞、多路复用系统或装置，以及使用它们进行细胞工程化以靶向、检测或监测或者治疗或改善异常细胞或患病组织诸如癌症的方法。在替代实施方案中，提供了工程化的细胞或重组细胞，或包含、掺入或使用工程化的细胞或重组细胞的多路复用系统或装置，或工程化的细胞或重组细胞、其多路复用系统或装置用于细胞工程化以靶向、检测或监测或者治疗疾病的异常细胞或组织的方法或用途，包括：
[0014] (1)(a)提供细胞或改变细胞内容物以产生工程化细胞的工程化方法，以及修饰细胞以在其中包含或具有治疗剂、转化酶、酶原、抗体、外源蛋白、外源纳米颗粒、归巢剂或原先不存在于细胞中的任何分子或装置，或具有表达其的能力，或
[0015] (b)(工程化的细胞或重组细胞)在其中包含、包括或具有治疗剂、转化酶、酶原、抗体、外源蛋白、外源纳米颗粒、归巢剂或原先不存在于细胞中的任何分子或装置，或经修饰以具有表达其的能力，
[0016] 其中任选地，工程化的细胞或重组细胞是免疫细胞(任选的T细胞)、间充质干细胞(MSC)、神经干细胞(NSC)、造血干细胞(HSC)或微生物，任选的细菌，
[0017] 以及任选地将细胞工程化以包含至少一种具有表达以下物质的能力的外源核酸：治疗剂、转化酶、酶原、抗体、外源蛋白、外源纳米颗粒、归巢剂或原先不存在于细胞中的任何分子，并且所述核酸的表达处于机械响应性启动子(其中所述启动子通过细胞环境的硬度的增加或与具有增加的机械模量或硬度的组织或环境的接触来进行激活)的控制之下(可操作地连接其上)，并且任选地机械响应性启动子包括或为YAP/TAZ机械响应性启动子，[0018] 以及任选地，工程化的细胞或重组细胞包含归巢剂，或经工程化以包含外源归巢剂，其包含促进或增强工程化的细胞或重组细胞向某一或期望的小生境(包括但不限于肿瘤小生境)迁移的蛋白质或任何形式的分子，并且任选地，归巢剂由处于机械响应性启动子(任选地YAP/TAZ机械响应性启动子)的控制之下(可操作地连接其上)的核酸编码，[0019] 以及任选地，工程化的细胞或重组细胞包含治疗剂，或经工程化以包含外源治疗剂，任选地直接治疗剂，其包含对其它细胞具有直接毒性或有益作用的蛋白质酶或任何形式的分子，以及任选地，治疗剂由处于机械响应性启动子(任选地YAP/TAZ机械响应性启动子)的控制之下(可操作地连接其上)的核酸编码，
[0020] 以及任选地，工程化的细胞或重组细胞包含转化酶，或经工程化以包含外源转化酶，其包含能够将有毒的、无活性或非活性分子转化成诊断剂或治疗剂的蛋白质酶或任何形式的分子，并且任选地，转化酶由处于机械响应性启动子(任选地YAP/TAZ机械响应性启动子)的控制之下(可操作地连接其上)的核酸编码，
[0021] 以及任选地，工程化的细胞或重组细胞包含酶原，或经工程化以包含外源酶原，其包含能够被转化为直接治疗剂的蛋白质酶或任何形式的分子，酶原由处于机械响应性启动子(任选地YAP/TAZ机械响应性启动子)的控制之下(可操作地连接其上)的核酸编码，[0022] 以及任选地，工程化的细胞或重组细胞包含抗体或抗原结合剂，或经工程化以包含外源抗体或抗原结合剂，其中所述抗体或抗原结合剂包含能够结合至特定靶标的蛋白质抗体或任何形式的分子，并且任选地，抗体或抗原结合剂由处于机械响应性启动子(任选地YAP/TAZ机械响应性启动子)的控制之下(可操作地连接其上)的核酸编码，
[0023] 以及任选地，工程化的细胞或重组细胞包含源自除所述工程化的细胞外的物种或从所述蛋白的天然形式修饰而来的外源蛋白，并且外源蛋白由处于机械响应性启动子(任选YAP/TAZ机械响应性启动子)的控制之下(可操作地连接其上)的核酸编码，
[0024] 以及任选地，工程化的细胞或重组细胞包含外源装置(任选纳米颗粒)或包含原始细胞不具有的任何分子，
[0025] 以及任选地将机械响应性启动子(任选YAP/TAZ机械响应性启动子)工程化至细胞中以驱动目标内源核酸，以及任选地使用CRISPR/Cas9或等效方法将机械响应性启动子工程化至细胞中；或
[0026] (2)(a)提供工程化的细胞或重组细胞，所述细胞具有经修饰的细胞内容物或包含外源因子以修饰所述细胞的分化、归巢、机械信号、细胞-细胞通信、可溶性因子、细胞外环境或对其它因子的响应的生理学或生物化学或生物物理学机制，或
[0027] (b)(工程化的细胞或重组细胞)在其中包含、包括或已包含经修饰的细胞内容物，或包含外源因子以修饰细胞的分化、归巢、机械信号、细胞-细胞通信、可溶性因子、胞外环境或对其它因子的响应的生理学或生物化学或生物物理学机制，
[0028] 其中任选地，修饰细胞的分化、归巢、机械信号、细胞-细胞通信、可溶性因子、细胞外环境或对其它因子的响应的生理学或生物化学或生物物理学机制的外源因子，由处于机械响应性启动子(任选YAP/TAZ机械响应性启动子)的控制之下(可操作地连接其上)的核酸编码，
[0029] 以及任选地，工程化的细胞或重组细胞的经修饰的分化机制在将细胞类型特异性从低至高改变后改变其位置和细胞内容物，
[0030] 以及任选地，工程化的细胞或重组细胞的经修饰的机械信号传导在接受来自细胞外基质或细胞外环境的硬度和/或交联信号后改变其位置和细胞内容物，
[0031] 以及任选地工程化的细胞或重组细胞的经修饰的归巢机制包括归巢于某一小生境，
[0032] 以及任选地，工程化的细胞的经修饰的细胞-细胞通信机制在与其它细胞相互作用后改变其位置和细胞内容物，
[0033] 以及任选地，通过工程化的细胞或重组细胞进行的经修饰的可溶性因子产生在接受细胞外环境中的因子后改变其位置和细胞内容物，
[0034] 以及任选地工程化的细胞或重组细胞的经修饰的细胞外环境响应于细胞外环境中的内容物而改变其位置和细胞内容物，
[0035] 以及任选地，工程化的细胞或重组细胞的经修饰的化学条件改变所述工程化的细胞的位置和/或细胞内容物，其中任选地，经修饰的工程化的细胞包含蛋白质、核酸、脂质、糖类、小分子、pH、温度、辐射或用于改变细胞位置的任何其它因子；或
[0036] (3)(a)提供如上述步骤(1)或(2)中所述的工程化的细胞或重组细胞，其中所述细胞经修饰以在其中具有、包含或含有至少一种具有表达以下物质的能力的外源核酸：治疗剂、转化酶、酶原、抗体、外源蛋白、外源纳米颗粒、归巢剂或原先不存在于细胞中的任何分子，并且核酸的表达是组成型的或可激活的(可诱导的)，或
[0037] (b)如上述步骤(1)或(2)中所述的工程化的细胞或重组细胞，其中所述工程化的细胞经修饰以在其中具有、包含或含有至少一种具有表达以下物质的能力的外源核酸：治疗剂、转化酶、酶原、抗体、外源蛋白、外源纳米颗粒、归巢剂或原先不存在于细胞中的任何分子，并且核酸的表达是组成型的或可激活的(可诱导的)，
[0038] 其中任选地，外源核酸处于机械响应性启动子(任选YAP/TAZ机械响应性启动子)的控制之下(可操作地连接其上)，
[0039] 其中任选地，无论细胞外环境如何，组成型表达持续进行。
[0040] 其中任选地，可激活的或可诱导表达依赖于(2)中描述的机制开始，或可通过外源因子的表达来激活或诱导，以修饰细胞的分化、归巢、机械信号传导、细胞-细胞通信、对可溶性因子或细胞外环境的暴露或对其它因子的响应的生理学或生物化学或生物物理学机制或因子表达，
[0041] 其中任选地，细胞工程化是通过包括遗传学方法，任选地CRISPR/Cas9方法或等效方法或非遗传学方法的方法；或
[0042] (4)(a)提供工程化的细胞或重组细胞，所述细胞使得能够通过转化酶、直接治疗性酶、酶原、抗体或直接或间接辅助治疗过程的任何分子的表达来治疗疾病或病况，或[0043] (b)(工程化的细胞或重组细胞)在其中包含、包括或已含有转化酶、治疗性酶、酶原、抗体或直接或间接辅助治疗过程的任何分子，
[0044] 其中任选地，转化酶、治疗性酶、原酶、抗体或直接或间接辅助治疗过程的分子由外源或内源核酸编码，所述外源或内源核酸处于机械响应性启动子(任选地，YAP/TAZ机械响应性启动子)的控制之下(可操作地连接其上)，并且任选地，通过CRISPR/Cas9方法或等效方法将内源核酸工程化以与机械响应性启动子可操作地连接，
[0045] 其中任选地，治疗包括使用转化酶或将治疗剂的非活性形式转化为其活性形式的任何蛋白或任何其它分子，
[0046] 以及任选地，治疗包括使用指导细胞内含容物或细胞外环境的改变的直接治疗性酶，
[0047] 以及任选地，治疗包括使用酶原或由工程化的细胞产生的任何蛋白质或任何分子，其中其形式响应于(2)中所述的机制而从无活性改变成有活性，并以其活性形式递送疗效，
[0048] 以及任选地，治疗包括使用由工程化的细胞产生的抗体或免疫球蛋白，所述抗体或免疫球蛋白直接或间接辅助治疗过程；或
[0049] (5)(a)提供工程化的细胞或重组细胞，所述细胞使得能够实现用于检测或诊断、伴随诊断或科学和研究工具的测定，或
[0050] (b)(工程化的细胞)包含编码蛋白的核酸，所述蛋白使得能够检测细胞，或者当细胞暴露于新环境，任选地具有增加的机械模量或硬度的组织或环境中时，使得能够检测细胞，任选地，所述核酸处于机械响应性启动子(任选YAP/TAZ机械响应性启动子)的控制之下(可操作地连接其上)，
[0051] 其中任选地，用于检测或诊断的测定效用由使得能够检测所述工程化的细胞的细胞位置和/或内容物的体外、体内、离体、原位或任何其它形式的测定组成，[0052] 以及任选地，伴随诊断效用由使得能够检测工程化的细胞的细胞位置和/或内容物的设备和/或平台组成，
[0053] 以及任选地，伴随诊断效用由使得能够通过检测由细胞分泌至生物流体(包括例如血液和尿液)中的探针(例如，酶)来实现细胞命运追踪和监测的设备和/或平台组成，[0054] 以及任选地，探针在基因细胞疗法的情况下可以是治疗剂本身(例如，基因或蛋白)，或被工程化至细胞中的其它分子或试剂，
[0055] 以及任选地，伴随诊断效用由允许来自生物样品的单分子检测的设备和/或平台组成，
[0056] 以及任选地，科学和/或研究工具效用由使用有利于生物过程的科学研究的工程化的细胞组成；或
[0057] (6)(a)提供工程化的细胞或重组细胞，所述细胞使得能够通过外源分子的表达来实现细胞基因疗法后的监测和安全性追踪，或
[0058] (b)(工程化的细胞或重组细胞)包含编码蛋白的核酸，所述蛋白使得能够通过外源分子的表达实现细胞基因疗法后的监测和安全性追踪，以及任选地，所述核酸处于机械响应性启动子(任选YAP/TAZ机械响应性启动子)的控制之下(可操作地连接其上)；或[0059] (7)(a)提供工程化的细胞或重组细胞，所述细胞直接或间接辅助治疗或改善癌症、癌症转移、组织纤维化、细胞命运追踪、糖尿病、伤口愈合、化妆品、骨质疏松症、再生医学或免疫性疾病，
[0060] (b)(工程化的细胞或重组细胞)包含编码蛋白的核酸，所述蛋白治疗或改善癌症、癌症转移、组织纤维化、细胞命运追踪、糖尿病、伤口愈合、化妆品、骨质疏松症、再生医学或免疫性疾病，并且任选地所述核酸处于机械响应性启动子(任选YAP/TAZ机械响应性启动子)的控制之下(可操作地连接其上)，
[0061] 其中任选地，癌症或癌症转移包括当癌症扩散至除其起源处的组织中时的状况，并且除其起源处的组织具有足够的机械模量或硬度以激活(开启)机械响应性启动子，[0062] 以及任选地，组织纤维化包括纤维结缔组织过度形成的状况，并且任选地纤维结缔组织的过度形成具有足够的机械模量或硬度以激活(开启)机械响应性启动子，[0063] 以及任选地，细胞命运追踪包括在体内检测工程化的细胞的命运的方法，[0064] 以及任选地，糖尿病包括长期高水平的血糖，
[0065] 以及任选地，伤口愈合包括损伤组织的再生和重塑，
[0066] 以及任选地，化妆品包括改善身体的外观，
[0068] 以及任选地，再生医学包括替换、工程化或再生人细胞、组织或器官以恢复或建立正常功能的过程，
[0070] 在替代实施方案中，提供了用于治疗、改善、预防或去除瘢痕组织的工程化的细胞或重组细胞，其中所述细胞包含：
[0071] (a)编码能够破坏或去除瘢痕组织的分泌型酶的外源核酸，
[0072] 其中所述外源核酸的表达处于机械响应性启动子(其中启动子通过细胞环境的硬度的增加或与具有增加的机械模量或组织或环境的接触来进行激活)的控制之下(可操作地连接其上)，并且任选地机械响应性启动子包括或为YAP/TAZ机械响应性启动子，或[0073] (b)编码能够破坏或去除瘢痕组织的分泌型酶的内源核酸，其中任选地通过使用CRISPR/Cas9方法或等效方法或同源重组，将所述内源核酸工程化以与机械响应性启动子可操作地连接，
[0074] 其中任选地，工程化的细胞或重组细胞能够靶向或结合至纤维化或瘢痕组织，或经工程化以靶向或结合至纤维化或瘢痕组织，
[0075] 任选地，工程化的细胞或重组细胞是干细胞、成纤维细胞、上皮细胞或免疫细胞，任选T细胞、淋巴细胞或巨核细胞。
[0076] 在替代实施方案中，提供了治疗、改善、溶解、预防或去除有此需要的个体中的瘢痕组织或纤维化的方法，或
[0077] 工程化的细胞或重组细胞用于治疗、改善、预防或去除瘢痕组织、纤维化的用途，或
[0078] 用于治疗、改善、预防或去除瘢痕组织、纤维化的工程化的细胞或重组细胞，其包含：
[0079] (a)提供本文提供的工程化的细胞或重组细胞，以及
[0080] (b)向有此需要的个体施用所述细胞。
[0081] 其中任选地经治疗、改善、溶解、预防或去除的纤维化或瘢痕包括纤维化或与纤维化相关疾病相关的瘢痕，任选肺、肝、肾、心脏或血管纤维化、或伤口诱导的或手术诱导的瘢痕、或由心肌梗塞或心肌感染引起的瘢痕。。
[0082] 在替代实施方案中，提供了用于治疗、改善或预防响应于抗体或嵌合抗原受体(CAR)的病况的工程化的细胞或重组细胞，其中所述细胞包含：
[0083] (a)编码抗体、嵌合抗原受体(CAR)的外源核酸，其中所述抗体或CAR可治疗、改善或预防响应于抗体或嵌合抗原受体(CAR)的病况，
[0084] 其中所述外源核酸的表达处于机械响应性启动子(其中所述启动子通过细胞环境的硬度的增加或与具有增加的机械模量或硬度的组织或环境的接触来进行激活)的控制之下(可操作地连接其上)，并且任选地机械响应性启动子包括或为YAP/TAZ机械响应性启动子，或
[0085] (b)编码抗体的内源核酸，其中任选地通过使用CRISPR/Cas9方法或等效方法或同源重组，将所述内源核酸工程化以与机械响应性启动子可操作地连接，
[0086] 其中任选地，工程化的细胞或重组细胞能够靶向或结合至特定或期望的细胞、器官或组织，或经工程化以靶向或结合至特定或期望的细胞、器官或组织，任选地工程化的细胞或重组细胞能够靶向或结合至癌症或肿瘤，任选实体肿瘤或癌症转移，
[0087] 以及任选地，工程化的细胞或重组细胞是干细胞、成纤维细胞、上皮细胞或免疫性细胞，任选T细胞、淋巴细胞或巨核细胞。
[0088] 在替代实施方案中，提供了用于治疗、改善或预防有此需要的个体中的响应于抗体或嵌合抗原受体(CAR)的病况的方法，或
[0089] 工程化的细胞或重组细胞用于治疗、改善或预防响应于抗体或嵌合抗原受体(CAR)的病况的用途，或
[0090] 用于治疗、改善或预防响应于抗体或嵌合抗原受体(CAR)的病况的工程化的细胞或重组细胞，其包含：
[0091] (a)提供本文提供的工程化的细胞或重组细胞，和
[0092] (b)向有此需要的个体施用所述细胞，
[0093] 其中任选地，响应于抗体或嵌合抗原受体(CAR)的病况是癌症或肿瘤，任选实体瘤或癌症转移。
[0094] 在替代实施方案中，提供了用于将可检测的探针或分子或治疗性分子递送至有此需要的个体中的经靶向的细胞、器官或组织的工程化的细胞或重组细胞，其中所述细胞包含：
[0095] (a)编码可检测的探针或分子或治疗性分子的外源核酸，
[0096] 其中所述外源核酸的表达处于机械响应性启动子(其中所述启动子通过细胞环境的硬度的增加或与具有增加的机械模量或硬度的组织或环境的接触来进行激活)的控制之下(可操作地连接其上)，并且任选地机械响应性启动子包括或为YAP/TAZ机械响应性启动子，或
[0097] (b)编码治疗性分子或可检测分子的内源核酸，其中任选地通过使用CRISPR/Cas9方法或等效方法或同源重组，将所述内源核酸工程化以与机械响应性启动子可操作地连接，
[0098] 其中任选地，工程化的细胞或重组细胞能够靶向或结合至特定或期望的细胞、器官或组织，或经工程化以靶向或结合至特定或期望的细胞、器官或组织，任选地工程化的细胞或重组细胞能够靶向或结合至癌症或肿瘤，任选地是实体瘤或癌症转移，
[0099] 其中任选地，所述可检测的探针或分子包含荧光蛋白，任选增强绿色荧光蛋白(eGFP)、β-半乳糖苷酶(β-gal)(任选大肠杆菌β-gal)、辣根过氧化物酶(HRP)或荧光素酶，并且任选地所述治疗性分子包括胞嘧啶脱氨酶(CD)，
[0100] 以及任选地，可检测的探针或分子是分泌型可检测探针或分子，以及任选地在由所述细胞分泌后，可检测的探针或分子在体液、任选血液或尿液中是可检测的，[0101] 以及任选地，工程化的细胞或重组细胞是干细胞、成纤维细胞、上皮细胞或免疫细胞，任选T细胞、淋巴细胞或巨核细胞。
[0102] 在替代实施方案中，提供了用于将可检测的探针或治疗性分子递送至有此需要的个体中的经靶向的细胞、器官或组织的方法，或
[0103] 或可检测的探针或治疗性分子用于检测或治疗有此需要的个体中的经靶向的细胞、器官或组织的用途，或
[0104] 用于检测或治疗有此需要的个体中的经靶向的细胞、器官或组织的工程化的细胞或重组细胞，其包括：
[0105] (a)提供本文提供的工程化的细胞或重组细胞，和
[0106] (b)向有此需要的个体施用所述细胞，
[0107] 其中任选地，通过可检测的探针或治疗性分子治疗或检测癌症或肿瘤，任选实体瘤或癌症转移。
[0108] 在替代实施方案中，提供了包含本文提供的工程化的细胞或重组细胞的非人转基因动物。
[0110] 出于所有目的，本文引用的所有出版物、专利、专利申请明确地通过引用并入本文。
[0111] 附图简述
[0112] 图1示意性说明本文提供的示例性实施方案的概述：监测和操纵移植的细胞的命运的示例性方法。提供了采用能够靶向、检测呈疾病状态的异常细胞或组织的工程化的(例如，经基因修饰的或重组的)细胞的系统。另外，移植的细胞能够响应于细胞或小生境特征，包括生物化学或物理标记，以产生例如用于成像和诊断目的的报告子分子或治疗疾病的治疗剂。这将允许更早和更准确的诊断以及治疗后监测和靶向治疗剂递送及治疗。提供了在体内追踪和监测移植的细胞数小时至数年的平台技术。代替目前使用的原位成像，提供了测量生物流体诸如血液或尿液中的分泌探针的方法，其中所述分泌与特定的细胞功能偶联。
[0113] 图2示意性说明用于进行细胞工程化和表达的示例性方法。在替代实施方案中，插入细胞的目标基因、标志物、治疗剂或探针由递送媒介物或通过非遗传方法携带。递送媒介物可以是基因组编辑工具(例如，CRISPR/Cas[1])或其他递送媒介物。为了通过插入来工程化细胞，可转染、病毒转导递送媒介物，或通过其它递送方法转染递送媒介物。
[0114] 图3示意性说明并列出用于实施本文提供的实施方案的细胞类型的几个示例。在替代实施方案中，将许多类型的细胞工程化以响应于某些微环境来选择性激活启动子和基因表达。这将允许选择最适合于特异性靶向、检测或治疗剂递送的细胞。例如，在替代实施方案中，使用间充质干细胞，因为它们对于肿瘤检测和癌症药物的递送是理想的，因为它们表现出天然的肿瘤向性。
[0115] 图4示意性说明用于遗传编辑策略的示例性方法。在替代实施方案中，从基因组DNA(左)或构建体(右)克隆对特定范围的硬度有反应的基因的启动子，并将其亚克隆入无启动子载体以驱动增强绿色荧光蛋白(eGFP)、荧光素酶(报告子)、胞嘧啶脱氨酶(治疗剂)等的表达。在替代实施方案中，将构建体永久性地转导入细胞诸如间充质干细胞(MSC)中，以产生稳定的工程化的MSC细胞系。
[0116] 图5A、图5B、图5C和图5D说明工程化细胞以呈现某一功能或起某一功能作用的示例性机制。在替代实施方案中，工程化的细胞可使用若干主要机制来解决诊断或治疗问题。(图5A)归巢：可将细胞工程化以增强至某一小生境(例如，炎症)的归巢能力。此外，归巢因子(例如，SDF-1)的启动子还可用于通过特异性靶向患病微环境来驱动报告子或治疗剂。
(图5B)硬度：可将细胞工程化以检测特定范围的组织硬度，并选择性激活启动子以进行基因表达。例如，一旦工程化的细胞(绿色)附着在更硬的交联胶原(红色交叉阴影)上，其即可被激活。未暴露于该更硬的微环境的细胞将保持失活(灰色)。(图5C)分化：工程化的干细胞可响应于其环境进行分化，以潜在地整合至损伤的组织并再生所述组织。(图5D)可溶性因子：工程化的细胞可分泌有用的可溶性因子，然后所述因子可驱动有用的下游信号通路。
(图5B)硬度：可将细胞工程化以检测特定范围的组织硬度，并选择性激活启动子以进行基因表达。例如，一旦工程化的细胞(绿色)附着在更硬的交联胶原(红色交叉阴影)上，其即可被激活。未暴露于该更硬的微环境的细胞将保持失活(灰色)。(图5C)分化：工程化的干细胞可响应于其环境进行分化，以潜在地整合至损伤的组织并再生所述组织。(图5D)可溶性因子：工程化的细胞可分泌有用的可溶性因子，然后所述因子可驱动有用的下游信号通路。
[0117] 图6A-D说明并列出使用本文提供的实施方案解决的问题的几个实例，包括(图6A)癌症转移，(图6B)组织纤维化/瘢痕溶解(纤维化相关疾病，包括肺、肝、肾、心脏和血管)，(图6C)细胞命运追踪(例如HSC移植后)，(图6D)心血管疾病(包括动脉粥样硬化)，糖尿病(例如，β细胞硬度指导的再生)，伤口愈合(例如，糖尿病性溃疡)，化妆品(例如，除皱剂，以再生脂肪组织和更新皮肤细胞：抗衰老治疗)，骨质疏松症(或任何类型的骨/肌肉再生)，再生医学和免疫性疾病。
[0118] 图7示意性说明通过使用单分子体外检测测定法检测其分泌标志物来在体内监测工程化的细胞的示例性方法的一般概述。在替代实施方案中，将细胞进行工程化，使其具有组成型分泌报告酶或在特异性启动子(例如，用于硬度感测的YAP(Yes-相关蛋白)和TAZ(具有PDZ结合基序的转录共激活因子，也称为WWTR1))之后的分泌报告酶。在替代实施方案中，在将工程化的细胞移植至动物或患者体内之后，报告酶将在细胞归巢于特定小生境(例如，肿瘤小生境)之后表达，并将酶分泌至血液/尿液中，所述酶可用血液/尿液检验来检测。在替代实施方案中，血液/尿液检验利用超灵敏检测方法，包括例如集成式综合数字液滴检测(IC 3D)。在IC 3D中，将血液/尿液样品在油中区划成皮升尺寸的液滴，每个液滴中含有一个酶或不含酶，含有报告酶的液滴将与它们的特定的发荧光的底物反应。可用3D粒子计数器检测荧光液滴。
[0119] 图8示意性说明用于实施替代实施方案的示例性超灵敏集成综合数字水滴检测(IC 3D)系统。在替代实施方案中，将试剂(例如，含有靶标的血液样品和针对靶标的传感器)在油中混合，产生包含一个靶标或不含靶标的皮升尺寸的油包水滴。在含靶标的液滴内，传感器和靶标将反应并产生荧光产物。可用3D粒子计数器检测荧光液滴，以测定与原始样品中包含的靶标数量相对应的荧光液滴的数量。
[0120] 图9是可用于分析生物样品中的分泌型探针以在体内监测移植的细胞的命运的单分子检测的示例性生物测定的列表，还列出了可用于工程化细胞以进行单分子检测测定的示例性探针。
[0121] 图10示意性说明用于酶微流控测定的示例性反应。在替代实施方案中，每个皮升液滴或微孔含有一个靶标(酶)或不含靶标(酶)。在靶标存在的情况下，荧光底物转变成荧光产物，从而产生荧光液滴或微孔。
[0122] 图11示意性说明用于核酸微流控测定的示例性反应。在替代实施方案中，每个皮升液滴或微孔含有一个靶DNA或RNA或不含靶DNA或RNA。在靶DNA或RNA存在的情况下，PCR、逆转录PCR(RT-PCR)、实时PCR或Taqman PCR被触发，从而产生荧光液滴或微孔。
[0123] 图12A和图12B以及图13C和图13D示意性说明用于治疗的治疗剂的靶向递送的实例。(图12A)转化酶：可将细胞工程化以表达转化酶，诸如胞嘧啶脱氨酶(CD)，然后所述酶在其已被施用后可将无活性的前药转化为活性药物。(图12B)直接治疗性酶：可将细胞工程化以直接表达治疗性酶，诸如基质金属蛋白酶(MMP)来处理组织纤维化。(图13C)酶原：例如半胱天冬酶原。(图13D)抗体：例如，曲妥珠单抗，其为抗癌药物。
[0124] 图14示意性说明用于工程化间充质干细胞(MSC)以产生用于检测和治疗肺中的乳腺癌转移的机械响应性细胞系统(MRCS)的示例性方法的概述。在替代实施方案中，MRCS通过与在转移性小生境(红色交叉阴影线)处发现的胶原交联相关联的特定范围的硬度来进行激活。肿瘤归巢MRCS可用于通过荧光或生物发光报告子(左侧)来检测转移性小生境，或特异性地在转移性小生境(右侧)处局部激活治疗剂。在替代实施方案中，将机械响应性干细胞系统(MRCS)用于阐明体内复杂的机械生物学，并通过靶向肿瘤小生境中的独特生物物理学提示来选择性检测和治疗癌症转移。
[0125] 图15A-P说明可感测体外硬度并在硬基底上开启eGFP信号的示例性机械响应性细胞系统(MRCS)的图像。将MRCS涂铺在(图15A、图15E、图15I、图15M)软(约1kPa)、(图15B、图15F、图15J、图15N)中等(约10kPa)、(图15C、图15G、图15K、图15O)硬(约40kPa)聚丙烯酰胺和(图15D、图15H、图15L、图15P)玻璃上。注意，eGFP响应于高硬度(大于10kPa)被开启，这表明该基于MSC的报告子对于硬度是特异的。(图15E-H)YAP/TAZ(红色)再定位也由硬度调节。
(图15A-D)显示eGFP(绿色)和(I-L)4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI，蓝色，细胞核复染色)。
比例尺＝50μm。
(图15A-D)显示eGFP(绿色)和(I-L)4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI，蓝色，细胞核复染色)。
比例尺＝50μm。
[0126] 图16A-L说明表明MRCS在体外是硬度特异性的示例性MRCS-eGFP的图像。将MRCS铺在硬的(约40kPa)聚丙烯酰胺上，并用(图16A、图16D、图16G、图16J)50μM布雷他汀和(图16B，E、图16H、图16K)10μM ML-7(肌球蛋白轻链激酶抑制剂)以及(图16C、图16F、图16I、图
16K)20μM PF228(局灶性黏着斑激酶抑制剂)处理。注意，(图16A-C)eGFP(绿色)被关闭，并且(图16D-F)YAP/TAZ(红色)在细胞质中，这表明MRCS感测是可逆的硬度依赖性的。(图16G-I)显示DAPI(蓝色，细胞核复染色)。比例尺＝50μm。
16K)20μM PF228(局灶性黏着斑激酶抑制剂)处理。注意，(图16A-C)eGFP(绿色)被关闭，并且(图16D-F)YAP/TAZ(红色)在细胞质中，这表明MRCS感测是可逆的硬度依赖性的。(图16G-I)显示DAPI(蓝色，细胞核复染色)。比例尺＝50μm。
[0127] 图17图解说明显示MRCS-eGFP在体外是硬度特异性的(通过在聚丙烯酰胺水凝胶上进行的MRCS的实时RT-PCR分析)的数据。eGFP(绿色)和YAP/TAZ下游因子(CTGF，青色和ANKRDI，紫色)的表达在硬基底上增加，并在软基底上被下调或通过机械感测抑制剂下调。这表明可根据硬度调节MRCS。**P<0.01。
[0128] 图18图解说明显示MRCS-荧光素酶(MRCS-Luc)在体外是硬度特异性的的数据。将MRCS-Luc接种在具有不同硬度的基底上。经显示，荧光素酶活性在硬基底上被上调，在软基底上被下调或通过机械感测抑制剂下调，表明MRCS是硬度依赖性的。D-荧光素：在MSC生长培养基中为150μg/ml。*P<0.05，**P<0.01。
[0129] 图19A-P说明显示MRCS-CD在体外是响应硬度的的图像。将MRCS涂铺在(图19A、图19E、图19I、图19M)软(约1kPa)(图19B、图19F、图19J、图19N)中等(约10kPa)(图19C、图19G、图19K、图19O)硬(约40kPa)聚丙烯酰胺和(图19D、图19H、图19L、图19P)玻璃上。注意，胞嘧啶脱氨酶(CD)响应于高硬度(大于10kPa)而被开启，表明该基于MSC的报告子对硬度是特异的。(图19E-H)YAP/TAZ(红色)再定位也由硬度调节。(图19A-D)显示CD(绿色)和(图19I-L)DAPI(蓝色，细胞核复染色)。比例尺＝25μm。
[0130] 图20图解说明显示基于硬度抑制剂研究，MRCS-CD在体外是硬度特异性的的数据。将MRCS铺在硬(约40kPa)聚丙烯酰胺上，并用(A、D、G、J)50μM布雷他汀和(B、E、H、K)10μM ML-7(肌球蛋白轻链激酶抑制剂)以及(C、F、I、K)20μM PF228(局灶性黏着斑激酶抑制剂)处理。注意，(图20A-C)胞嘧啶脱氨酶(CD)(绿色)被关闭，并且(图20D-F)YAP/TAZ(红色)在细胞质中，表明MRCS感测是可逆的硬度依赖性的。(G-I)DAPI(蓝色，细胞核复染色)。比例尺＝
50μm。
50μm。
[0131] 图21图解说明显示MRCS-CD在体外响应于硬度利用5-氟胞嘧啶(5-FC)杀死癌细胞的数据。在5-FC(800μg/ml)存在或不存在的情况下，将MRCS-CD在不同的硬度上与荧光素酶MDA-MB-231乳腺癌细胞(231:MRCS＝2:1)共培养：显示了总细胞增殖(2,3-双-(2-甲氧基-4-硝基-5-磺基苯基)-2H-四唑-5-羧酰苯胺，即，XTT测定)。所有数据仅用在某一硬度下的乳腺癌(231:MRCS＝1:0)进行归一化。**P<0.01，***P<0.001。
[0132] 图22示意性说明在体内用5-FC测试MRCS-CD的示例性动物实验的时间线。
[0133] 图23说明裸小鼠图片的图像，所述图像显示MRCS-CD在体内减少肺转移信号。裸小鼠的代表性图片接受了MRCS-CD处理。在癌症接种后6周，将组成型表达胞嘧啶脱氨酶(CD)(左上图)、MRCS-CD(左下图)的MSC、天然MSC(右上图)和磷酸盐缓冲盐水(PBS)(右下图)静脉内(i.v.)输注至裸小鼠中。获取腹膜内(i.p.)5-FC处理之前(D0，左图)和之后(D9，中图)以及长期结果(6周，右图)的荧光素酶成像。D-荧光素＝150mg/kg(腹膜内)。颜度：最小＝9X104；最大＝3X105。C-MSC：组成型阳性对照；N-MSC：天然MSC。
[0134] 图24图解说明显示MRCS-CD在体内(短期)减少肺转移信号的数据，其中荧光素酶信号的量与肺中的癌症质量成比例。相对转移指数(RMI)＝在D9(之后)时的荧光素酶读数/在D0(之前)时的荧光素酶读数。对于每一个组，n＝9。***P<0.001。
[0135] 图25图解说明显示MRCS-CD在体内(长期)减少肺转移信号的数据。在前药处理之前(第0周，红色)和之后(第6周)，荧光素酶信号的量与肺中的癌症质量成比例。肺转移指数(LMI)＝Log10[(测试小鼠的荧光素酶读数)/(健康小鼠荧光素酶读数的平均值)]，即健康小鼠的LMI＝0。对于每个组，n＝9。*P<0.05(C-MSC，第0周对比第6周)，**P<0.01(MRCS-CD，第0周对比第6周)。“第0周”组之间的差异无统计显著性。
[0136] 图26图解说明显示MRCS-CD增加小鼠存活的数据。在结合5-FC施用利用C-MSC(红色)、MRCS-CD(蓝色)、N-MSC(绿色)和PBS(黑色)处理的乳腺癌(MDA-MB-231)肺转移裸小鼠的卡普兰-迈耶存活曲线中，MRCS-CD处理的小鼠相较于N-MSC或PBS组中的小鼠显示了存活时间的增加。对于每个组，n＝9。
[0137] 图27A-E说明染色的肺切片的图像，其显示MRCS-CD在体内杀死癌细胞并具有最小的副作用。(图27A-E)用抗膜联蛋白V(绿色)和DAPI(蓝色)对在CD-MSC、MRCS-CD、N-MSC或DPBS输注后24小时处死的荷Luc-RFP-231肿瘤的裸小鼠和无肿瘤裸小鼠的肺冷冻切片进行染色。RFP信号(红色)表示存在肺转移。比例尺＝100μm。CD-MSC：组成型阳性对照；N-MSC：天然MSC。
[0138] 图28A-F说明来自荷瘤裸小鼠的肺的图片的图像，其显示组成型工程化的MSC(C-MSC)在体内导致肺组织损伤。通过末端脱氧核苷酸转移酶dUTP切口末端标记(TUNEL)测定获得的，在5-FC注射之前(图28A-C)和之后(图28D-F)利用组成型表达胞嘧啶脱氨酶(CD)(A、D)、天然MSC(图28B、图28E)的MSC和PBS(图28C，图28F)处理的荷瘤裸小鼠的肺的冷冻切片样品的代表性图片。这些数据表明组成型表达CD的MSC比天然MSC和PBS引起更多的肺组织损伤。辣根过氧化物酶(HRP)信号(棕色)代表受损的细胞核，绿色信号是正常细胞核的甲基绿复染色。比例尺＝100μm。
[0139] 图29A-D说明显示通过TUNEL测定获得的MRCS-CD在体内引起最小肺组织损伤的荷瘤肺的图片的图像。通过TUNEL测定获得的在5-FC注射之前(A、B)和之后(C、D)利用MRCS-CD处理的荷瘤肺(A、C)和健康肺(B、D)的冷冻切片样品的代表性照图。这些数据表明MRCS-CD引起最小的肺组织损伤。HRP信号(棕色)代表损伤的细胞核，绿色信号是正常细胞核的甲基绿复染色。比例尺＝100μm。
[0140] 图30图解说明显示MRCS-CD在TUNEL测定中在体内引起最小肺组织损伤的数据。5-FC处理之前和之后前后的TUNEL阳性细胞(％)的代表性量。n.s.，不显著的，*P<0.05，**P<0.01和****P<0.0001。
[0141] 图31A-D说明具有H&E染色的荷瘤肺的图片的图像，其显示MRCS-CD在肺中引起最小的肺组织损伤。通过H&E测定显示的在5-FC注射之后，利用(A)C-MSC、(B)MRCS-CD、(C)N-MSC和(D)PBS处理的荷瘤肺的冷冻切片样品的代表性图片。这些数据表明MRCS-CD引起最小的肺组织损伤。比例尺＝100μm。
[0142] 图32示意性说明MRCS如何治疗肺转移。在癌症接种后6周收获荷瘤小鼠和无肿瘤小鼠的肺，并在MRCS-CD处理后2周和8周收获荷瘤小鼠的肺。MRCS-CD和C-MSC组的处理后肺具有比N-MSC和PBS组少的肿瘤结节。
[0143] 图33说明显示在MRCS-CD处理后2周MRCS在体内显示最小的副作用(炎症)的小鼠图像，在C-MSC处理的组中观察到炎症，但在MRCS-CD处理的组中没有观察到炎症。
[0144] 图34说明显示在MRCS-CD处理后6周，MRCS在体内显示出最小的副作用(体重减轻)的小鼠图像，在C-MSC处理的组中观察到体重减轻(体瘦如柴的小鼠)，但在MRCS-CD处理的组中未观察到体重减轻。
[0145] 图35示意性说明在体内用5-FC测试MRCS-CD的示例性动物实验的时间线。在将表达萤火虫荧光素酶和红色荧光蛋白的MDA-MB-231(Fluc-RFP-231)皮下接种在裸小鼠的脂肪垫中后6周，进行体内Fluc成像(用D-荧光素(150mg/kg于DPBS中)腹膜内注射小鼠)，以监6
测转移信号。将1x10个工程化的MSC全身施用至无肿瘤小鼠和荷瘤小鼠中(第0天)。用前药(5-FC，500mg/kg于DPBS中)腹膜内注射小鼠，每天2次，持续5天(第2-6天)，以及每天一次，持续2天(第7-8天)。使用IVIS Lumina在第0天和第10天测量体内Fluc活性，以在底物施用后10分钟开始数据采集。在第10天将每组一只小鼠安乐死以用于离体测定。保留其余的小鼠进行存活实验。
测转移信号。将1x10个工程化的MSC全身施用至无肿瘤小鼠和荷瘤小鼠中(第0天)。用前药(5-FC，500mg/kg于DPBS中)腹膜内注射小鼠，每天2次，持续5天(第2-6天)，以及每天一次，持续2天(第7-8天)。使用IVIS Lumina在第0天和第10天测量体内Fluc活性，以在底物施用后10分钟开始数据采集。在第10天将每组一只小鼠安乐死以用于离体测定。保留其余的小鼠进行存活实验。
[0146] 图36图解说明显示MRCS-CD在体内利用前药减小原发性肿瘤尺寸的数据。用如上所述的MRCS-CD和前药处理在乳腺脂肪垫中具有原发性肿瘤的小鼠。从第0天开始每天测量肿瘤尺寸。从治疗开始后6天开始，MRCS-CD和C-MSC组的肿瘤体积的负变化高于N-MSC组中的肿瘤体积的负变化。
[0147] 图37图解说明显示MRCS-CD在体内利用前药减小原发性肿瘤尺寸的数据(左图)以及说明显示MRCS-CD在体内利用前药减小原发性肿瘤尺寸的小鼠图像(右图)。用如上所述的MRCS-CD和前药处理在乳腺脂肪垫中具有原发性肿瘤的小鼠。从第0天开始每天测量肿瘤尺寸。从治疗开始后6天开始，MRCS-CD和C-MSC组的肿瘤体积的负变化高于N-MSC组中的肿瘤体积的负变化。
[0148] 图38图解说明显示MRCS-CD在体内利用前药减少来自原发性肿瘤的荧光素酶信号的数据。利用如上所述的MRCS-CD和前药处理在乳腺脂肪垫中具有原发性肿瘤的小鼠。测量Fluc活性，来自MRCS-CD和C-MSC组的原发性肿瘤的Fluc减少，而N-MSC和PBS组中的增加。
[0149] 图39A-C说明显示MRCS-CD在体内引起原发性肿瘤组织损伤的组织切片图像。在5-FC存在的情况下利用(图39A)C-MSC、(图39B)MRCS-CD和(图39C)N-MSC处理的皮下(s.c.)MDA-MB-231乳腺癌原发性肿瘤的冷冻切片样品的代表性图片。如上所述，在第10天将小鼠安乐死，并收获组织。这些数据表明MRCS-CD引起原发性肿瘤的组织损伤。HRP信号(棕色)代表损坏的细胞核，绿色信号是正常细胞核的甲基绿复染色。比例尺＝100μm。
[0150] 图40示意地说明工程化的间充质干细胞(MSC)检测癌症的示例性用途。在替代实施方案中，将分泌人源化Gaussia荧光素酶(hGluc，绿色)的工程化的MSC(灰色)全身性施用至癌症(在这种情况下为乳腺癌肺转移)患者中。在替代实施方案中，工程化的MSC归巢于肿瘤(青色)小生境并持续存在，将hGluc分泌至血液中。然后可收集患者血液，并测量hGluc活性。
[0151] 图41A-C图解说明数据，图41B还说明连续稀释的图像，所述数据和图像显示人源化Gaussia荧光素酶(hGluc)在体外分泌并且在血液中是稳定的。(图41A)将表达人源化Gaussia荧光素酶(hGluc-MSC)和天然MSC(N-MSC)的间充质干细胞接种至96孔板上。24小时后收获无细胞条件培养基(CM)。以20μM的终浓度加入hGluc底物腔肠素(CTZ)。立即使用平读板仪(在波长300-700nm处的吸光度，曝光时间＝2s)测量hGluc活性。(图41B)在PBS中进行hGluc-MSC CM的系列稀释，并以20μM的终浓度加入CTZ。用IVIS Lumina(暴光时间＝0.5s)测量hGluc活性。颜度：最小＝6.64e8；最大＝8.93e9。(图41C)收获hGluc-MSC的CM，并将其在37℃下与人血清一起孵育10分钟、2小时、8小时或24小时。以20μM的终浓度加入CTZ，并立即测量hGluc活性(暴光时间＝2s)。可在100％血清中检测到hGluc活性。****P<
0.0001。误差条：平均值±SD。
0.0001。误差条：平均值±SD。
[0152] 图42A说明小鼠图像，图42B-C说明染色的组织切片的图像，图42D图解说明数据，所述小鼠图像、切片图像和数据显示间充质干细胞归巢于肿瘤位点并且相较于在健康小鼠中持续更长时间。(图42A)在将eGFP-231静脉内接种至(NOD-SCIDγ)NSG小鼠中后5周，将1x106个Fluc-RFP-MSC全身性施用至无肿瘤(顶部)和荷瘤(底部)小鼠中。然后用D-荧光素(150mg/kg，于杜尔贝科氏磷酸盐缓冲盐水(DPBS)中)腹膜内注射小鼠，并在不同的时间点(MSC输注后2小时、6小时、24小时、7天和10天)使用IVIS Lumina测量体内Fluc活性，以在底物施用后10分钟开始数据采集(曝光时间＝60s；每组中，n＝4)。MSC在无肿瘤小鼠中被更快地清除。色标：最小＝6.50e4；最大＝7.50e5。用抗eGFP(绿色)和抗Fluc(红色)抗体对在Fluc-RFP-MSC输注后10天处死的(图42B)无肿瘤小鼠和(图42C)荷eGFP-231肿瘤的小鼠的肺冷冻切片进行染色。MSC被观察到归巢于肿瘤小生境。比例尺：50μm。(图42D)对不同时间点测量的Fluc活性进行定量，并将其针对2小时的时间点点进行归一化。误差条：平均值±SEM。*P<0.05。每组中，n＝4。
[0153] 图43A说明染色的组织切片的图像，图43B图解说明显示Gaussia荧光素酶(hGluc)在鼠血液中具有活性并且信号在荷瘤小鼠中被升高的数据。(图43A)用DAPI对在Dil标记的hGluc-MSC施用后10天处死的荷瘤小鼠的肺冷冻切片进行染色，然后通过荧光显微术进行成像。观察到MSC(红色)归巢于肿瘤小生境(浓蓝色)。比例尺：100μm。(图43B)在将Fluc-RFP-231静脉内接种至NSG小鼠中后5周，将1x106个hGluc-MSC全身性施用至无肿瘤和荷瘤小鼠中。然后收集鼠血液，并在加入底物后立即用IVIS Lumina在不同时间点(MSC输注后6小时、24小时、7天和10天)测量hGluc活性。对在不同时间点测量的hGluc活性进行定量，并将其针对6小时的时间点进行归一化。误差条：平均值±SEM。*P<0.05。曝光时间＝30s。每组中，n＝4。
[0154] 图44示意性说明机械响应性细胞系统(“瘢痕消除者”)用于研究、检测和处理组织纤维化的示例性用途。纤维化组织，诸如硬变肝，可用全身性输注的工程化的干细胞治疗。干细胞(灰色)将感知患病组织(黄色)内的纤维化灶的较高硬度，并且在这些区域中选择性激活以分泌治疗纤维化的治疗剂(绿色)，诸如MMP。
[0155] 图45示意性说明通过移植后可溶性报告子追踪细胞命运的实例。在替代实施方案中，用不同谱系特异性分泌的可溶性报告子工程化细胞。在替代实施方案中，在将工程化的细胞输注入患者或动物。在细胞归至特定小生境并将报告子分泌至血液后，收集一小部分血液(或其它生物液体)。然后将收集的血液与不同的对于每种报告子是特异性发荧光底物一起包封至皮升尺寸的液滴中。在报告子存在的情况下，液滴将变得发荧光，荧光的颜色反映细胞谱系。例如，在每个谱系特异性启动子(例如，骨启动子-Gluc、肌肉启动子-HRP等等)之后，用不同的外源可溶性报告酶对干细胞进行工程化。特定报告酶可在干细胞分化成相应的细胞系后表达(例如，当干细胞已分化成骨细胞等时表达Gluc)，并从细胞中分泌出来。在将工程化的干细胞移植至受者中后，可通过对血液中的分泌报告酶进行血液检验来监测细胞的分化和谱系比例。将血液检验与超声检测方法，诸如集成式综合数字液滴检测(IC
3D)结合。将血液样品在油中分隔成皮升尺寸的液滴，每个液滴中含有一个酶或不含酶，含有报告酶的液滴将与它们的特异性荧光底物反应。可用3D粒子计数器检测荧光液滴。
3D)结合。将血液样品在油中分隔成皮升尺寸的液滴，每个液滴中含有一个酶或不含酶，含有报告酶的液滴将与它们的特异性荧光底物反应。可用3D粒子计数器检测荧光液滴。
[0156] 图46说明显示本文提供的工程化的干细胞用作测量组织硬度以及在体内和体外研究机械生物学的科学工具“硬度尺”的示例性用途的图像。(左图)从基因组DNA克隆响应特定范围的硬度的所列基因的启动子，并将其亚克隆入无启动子载体以驱动荧光蛋白的表达。在替代实施方案中，将构建体永久性转导入间充质干细胞(MSC)以产生稳定的工程化的MSC细胞系。(右图)。在替代实施方案中，报告子仅在适当的机械环境存在的情况下才被开启。
[0157] 图47示意性说明如本文中提供的具有可溶性标志物的示例性工程化的细胞的早期检测的实例。在特定启动子(例如用于组成型表达的β-肌动蛋白)后，用外源可溶性报告酶(例如β-半乳糖苷酶(β-gal))工程化HSC。在替代实施方案中，在将工程化的干细胞移植至患者体内之后，报告酶表达并分泌至血液中，这可以用血液检验来检测。在替代实施方案中，将血液检验与超灵敏检测方法诸如集成式综合数字液滴检测(IC 3D)相结合。
[0158] 图48A说明小鼠的图像，图48B图解说明显示Luc-MSC在体内归巢于转移性小生境的数据。(图48A)显示MSC输注后12小时全身性输注的Luc-MSC的体内荧光素酶成像的代表性图片。(图48B)全身性输注后不同时间点处的荷eGFP-231肿瘤的裸小鼠和无肿瘤裸小鼠的肺中的Luc-MSC的荧光素酶活性的定量。相较于在无肿瘤小鼠中，MSC在荷瘤小鼠中持续更长时间，直至它们在大约1周内被清除。在指定的时间点用IVIS Lumina进行体内荧光素酶成像。相对Luc活性＝Log2[(用Luc-MSC输注的测试小鼠的荧光素酶读数)/(用DPBS注射的对照小鼠的荧光素酶读数的平均值)]。即，注射DPBS的小鼠的RLA＝0，对于荷瘤裸小鼠，n＝4，对于无肿瘤裸小鼠，n＝3。误差条：平均值±SEM。*P<0.05，**P<0.01。
[0159] 图49A说明小鼠的图像，图48B图解说明显示MRCS在体内响应于转移性小生境归巢和特异性激活的数据。(图49A)输注后12小时对全身性输注的MRCS-Luc的体内荧光素酶成像的代表性图片。(图49B)全身性输注的MRCS-Luc在荷eGFP-231肿瘤的裸小鼠的肺中被开启，但在无肿瘤的小鼠中不被开启。相对Luc活性(RLA)＝Log2[(用MRCS-Luc输注的小鼠的荧光素酶读数)/(用DPBS注射的对照小鼠的荧光素酶读数的平均值)]。即，注射DPBS的小鼠的RLA＝0。在全身性输注MRCS-Luc后的不同时间点测量荷瘤小鼠和无肿瘤小鼠的RLA，并将其绘图。对于荷瘤小鼠，n＝4，对于无肿瘤裸小鼠，n＝3。误差条：平均值±SEM。*P<0.05和**P<0.01。
[0160] 图49C和图49D分别说明在用抗-Luc(红色)(针对肺转移)、抗CD(绿色)(针对由MRCS-CD表达的胞嘧啶脱氨酶)和DAPI(蓝色)对MRCS-CD输注后24小时处死的荷Luc-RFP-231肿瘤的NSG小鼠和无肿瘤NSG小鼠的肺冷冻切片染色的图像。观察到MRCS-CD归巢于肿瘤位点并被特异性激活以在肿瘤位点表达CD。白色箭头表示肺转移位点和表达MRCS-CD的CD(开启的)的共定位。比例尺＝50μm。
[0161] 图50A和图50B说明显示MRCS-eGFP在体内响应于转移性小生境的异性激活的肺冷冻切片的图像。观察到MRCS-eGFP在NSG小鼠中归巢于肿瘤位点并在该位点被特异性开启。用抗-Luc(红色)(针对肺转移)、抗eGFP(针对由MRCS-eGFP表达的eGFP)(绿色)和DAPI(蓝色)对MRCS-eGFP输注后24小时处死的荷Luc-RFP-231肿瘤的小鼠(图50A)和无肿瘤小鼠(图
50B)的肺冷冻切片进行染色。白色箭头表示肺转移位点和表达eGFP的MRCS-eGFP(被开启的)的共定位。比例尺＝100μm。
50B)的肺冷冻切片进行染色。白色箭头表示肺转移位点和表达eGFP的MRCS-eGFP(被开启的)的共定位。比例尺＝100μm。
[0162] 图51A-C说明显示MRCS在体内响应于转移性小生境中的机械提示的特异性激活的肺冷冻切片的图像。(图51A-C)用抗Luc(红色)(针对肺转移)、抗CD(洋红色)(针对由MRCS-CD表达的胞嘧啶脱胺酶)和抗eGFP(绿色)(针对MRCS-CD追踪)对eGFP共转染的MRCS-CD输注后24小时处死的荷Luc-RFP-231肿瘤的NSG小鼠和无肿瘤NSG小鼠的肺冷冻切片进行染色。还呈现了胶原网络(青色)的二次谐波产生(SHG)成像，该成像并覆盖了IHC成像。数据表明MRCS-CD及其特异性激活与肺转移位点以及胶原交联和线性化网络共定位。比例尺＝50μm。
使用ImageJ和Matlab产生并处理了多个高质量的图像，然后将平铺成大的拼接图像。然后从平铺图像中提取每个代表性图片。
使用ImageJ和Matlab产生并处理了多个高质量的图像，然后将平铺成大的拼接图像。然后从平铺图像中提取每个代表性图片。
[0163] 图52A-D图解说明(图52A、图52D)和通过图像(图52B、图52C)显示具有组成型胞嘧啶脱氨酶(CD)表达的MSC(CD-MSC)能够在体外在5-FC存在的情况下杀死癌细胞。通过(图52A)RT qPCR和(图52B)免疫荧光染色验证了胞嘧啶脱氨酶(CD)的表达。CD(绿色)；DAPI(蓝色，细胞核复染色)。天然MSC(N-MSC)被包括在小组中作为对照(图52A和图52C)。在图A中，将N-MSC的CD mRNA表达归一化为“1”。N-MSC不表示CD。(图52D)进行XTT测定以显示表达CD的MSC在不同浓度的5-FC存在的情况下是自杀剂。只有当表达CD的MSC和前药5-FC都存在时，MSC的增殖才被高度降低。
[0164] 图52E-J说明来自在800μg/ml 5-FC存在或不存在的情况下，利用CD-MSC和表达RFP的MDA-MB-231乳腺癌细胞(231:MSC＝2:1)进行的共培养实验的染色的乳腺癌的图像。经显示，约95％的乳腺癌细胞被杀死，并且其余的乳腺癌细胞是凋亡的，然而5-FC对照没有高汇合度，这表明CD-MSC-5-FC系统足以杀死相邻的乳腺癌细胞。显示了RFP(红色)和有视野(BF)。比例尺＝100μm。误差条：平均值±SD。***P<0.001。
[0165] 图53图解说明显示当与天然MSC(N-MSC)相比时，工程化的MSC可表达高度升高的水平的酶基质金属蛋白酶-1(MMP-1)以帮助降解在病理性纤维化期间形成的过量胶原交联的数据。将C-MSC工程化以使用CMV启动子组成型表达MMP-1。*P<0.05。误差条：平均值±SD。
[0166] 图54A说明染色的小鼠的图像，图54B图解说明显示在门静脉注射后MSC至纤维化和健康肝脏的归巢和保留的数据。将MSC工程化以表达萤火虫荧光素酶(Fluc)。使用IVIS Lumina在每个时间点(6小时、12小时、24小时、48小时和72小时)测量相对Fluc活性。将每个测试的小鼠图像的活性针对对照小鼠图像进行归一化以消除背景信号，然后将其报告为与6小时时的平均患病信号(其在该标度上为1)相比的比例。误差条：平均值±SD。
[0167] 图55A示意性说明双态硬度尺的遗传回路(genetic circuit)，图55B图解说明显示机械敏感性启动子(MSP)驱动报告与正向靶向的沉默构建体共表达的开启-状态的红色荧光蛋白(RFP)(其被2A肽基序切割)的表达的数据。正向靶向的沉默构建体包含通过柔性接头结构域与表观遗传学沉默结构域(ESD)融合的Gal4DNA结合结构域(GAL4DBD)。可使用的表观遗传学沉默结构域的实例是KRAB或HDAC4。GAL4DBD-ESD结合上游激活序列(UAS)，并且表征沉默报告关闭状态的绿色荧光蛋白(GFP)的组成型表达。将该回路位点特异性地整合至遗传安全港(GSH)诸如人细胞系中的AAVS1和鼠细胞系中的mROSA26中。使用同源性定向修复(HDR)和CRISPR/Cas9靶向内切核酸酶实现位点特异性整合。(图55B)不同硬度下的遗传回路输出的实例。荧光蛋白(FP)输出强度随不同的输入基底硬度而变化。在该实施中，在低硬度下RFP不被高度表达，因为机械敏感性启动子未被激活。因此，GAL4DBD-ESD片段也不被表达，因此不会沉默其它组成型表达的GFP。当细胞结合至具有逐渐增加的硬度的基底时，GAL4DBD-ESD片段通过沉默哺乳动物组成型启动子来逐渐减少GFP表达。
[0168] 图56A示意性地说明多状态硬度尺的遗传回路，图55B图解说明显示一系列机械敏感性启动子(MSP)单个地驱动多种荧光蛋白(RFP、GFP、BFP)的表达的数据。每个MSP已被调整为在特定硬度范围内可被逆地激活和去激活。对MSPa，硬度低，对于MSPb，硬度中等，对于MSPc，硬度高。遗传回路的每个元件都被染色质绝缘体(诸如HS4芯绝缘体或其它绝缘体)“绝缘”。这些序列阻断相邻表达的基因的上游和下游效应。此类测序还减少长期表观遗传学沉默。将回路元件再次插入遗传安全港(GSH)位点以最低限度地扰动宿主细胞/动物。(图56B)在一定的硬度输入范围内的荧光蛋白(FP)输出强度的实例。对于低硬度基底上的细胞只有RFP被强烈表达。在中等强度下，主要表达GFP。而在高硬度下，主要表达BFP。
[0169] 图57A-C示意性说明示例性机械响应性CAR T细胞用于靶向和治疗癌症转移的用途。MRCS系统可适应T细胞疗法。(图57A)机械敏感性与门控嵌合抗原受体(CAR)T细胞由从通过血浆分离置换法(1)从患者分离的外周血单核细胞(PBCM)形成，然后使用携带靶向CAR(诸如HER2-CAR)的慢病毒构建体将分离的T细胞工程化(2)，所述构建体只在细胞与具有高硬度的ECM结合时才表达。最后，将这些细胞扩增并输注入患者(3)。(图57B)使用机械响应性启动子来驱动靶向典型实体瘤标志物诸如HER2的CAR的表达。只有当T细胞与硬基底结合时，这些T细胞才表达CAR。然而，在HER2-CAR发现其靶标以激活T细胞之前，T细胞仍然无活性。(图57C)HER2阳性细胞激活T细胞并导致肿瘤细胞的杀伤。
[0170] 除非另有说明，各附图中的相同参考符号表示相同的元件。
[0171] 详述
[0172] 在替代实施方案中，提供了通过检测增加的机械模量或硬度或靶向具有增加的机械模量或硬度的组织来检测和治疗疾病状态(包括癌症、糖尿病、纤维化和自身免疫性疾病)的方法。这些方法的实施为这些疾病状态(包括癌症、糖尿病、纤维化和自身免疫性疾病)提供了特异性和局部的检测测定和疗法。
[0173] 提供了细胞监测和操作的方法，所述使得经修饰的细胞能够检测例如许多疾病状态的异常组织特征的小生境、响应和操纵所述小生境。这将允许更早和更准确的诊断以及治疗后监测。细胞不断地与它们的小生境相互作用，所述小生境包括来自例如周围细胞外基质(ECM)的复杂生物化学和生物物理学信号的阵列。尽管在历史上不受重视，但最近已经显而易见的是，细胞微环境的物理和机械性质(所谓的“机械小生境”)调节重要的细胞功能。
[0174] 提供了将治疗剂选择性递送至患病区域的方法。这将允许具有更少副作用的更具针对性和更有效的治疗。提供了利用干细胞响应基质硬度以使用硬度响应性启动子驱动报告子表达的内生能力的方法。在替代实施方案中，响应于特定范围的基质硬度而被上调的基因的启动子响应于离散范围的硬度而捕获并合成调控输入。使用这些启动子来驱动报告子或治疗剂的表达产生响应于在病理组织中发现的基质硬度范围的机械响应性细胞系统(MRCS)。
[0175] 在替代实施方案中，提供了采用工程化的(例如，遗传重组的或非遗传修饰的)细胞的系统，所述细胞能够靶向、检测疾病状态的异常细胞或组织。另外，移植的细胞能够响应包括生物化学或物理标志物的细胞或小生境特征，以产生例如用于成像和诊断目的的报告子分子或用于治疗疾病的治疗剂(图1)。
[0176] 在替代实施方案中，提供了在体内追踪和监测移植的细胞数分钟和数小时至数天和至数年的平台技术，该技术依赖于生物流体诸如血液或尿液中的分泌探针的测量，所述分泌探针与特定的细胞功能偶联。
[0177] 在替代实施方案中，提供了工程化的细胞或重组细胞，或工程化方法，所述细胞或方法改变细胞的内容物以包括直接治疗剂、转化酶、酶原、抗体、外源蛋白、外源纳米颗粒或原先不存在于细胞中的任何分子(图2)。
[0178] 在替代实施方案中，工程化的细胞或重组细胞包括但不限于干细胞(例如，MSC、HSC等)、免疫细胞(例如，淋巴细胞、巨核细胞等)或任何其它细胞(例如，上皮细胞、成纤维细胞等)和微生物诸如细菌(图3)。在替代实施方案中，遗传工程化方法是组成型的或可激活的。在替代实施方案中，用于工程的基因来自基因组DNA或构建体(图4)。
[0179] 在替代实施方案中，工程化的细胞响应或干扰系统的机制包括但不限于分化、机械信号、细胞-细胞通信、可溶性因子、细胞外环境或对其它因子的响应(图5)，其中分化包括工程化的细胞在将细胞类型特异性从低改变成高时改变其位置和细胞内容物，机械信号包括工程化的细胞在接受来自细胞外基质或细胞外环境的硬度和/或交联信号后改变其位置和细胞内容物，细胞-细胞通信包括工程化的细胞在与其它细胞相互作用后改变其位置和细胞内容物，可溶性因子包括工程化的细胞在接受细胞外环境中的因子后改变其位置和细胞内容物，细胞外环境包括工程化的细胞响应于细胞外环境中的内容物而改变其位置和细胞内容物，其它因子包括改变工程化的细胞的位置和细胞内容物的任何化学物质或条件，包括但不限于蛋白质、核酸、脂质、碳水化合物、小分子、pH、温度、辐射或任何其它因子。
[0180] 在替代实施方案中，提供了用于治疗或诊断疾病或病况的方法，所述疾病或病况包括但不限于：癌症转移、组织纤维化、细胞命运追踪、糖尿病、伤口愈合、化妆品、骨质疏松症、再生医学或免疫性疾病(图6)。
[0181] 在替代实施方案中，提供了用于检测具有可溶性标志物的工程化的细胞的方法(图7)。用由在特定硬度感测启动子(即，用于硬度感测的YAP/TAZ)控制下的核酸表达的外源可溶性报告酶对细胞进行工程化。在将工程化的干细胞移植至患者体内后，报告酶在细胞归巢于特定小生境(例如肿瘤小生境)之后表达，并将酶分泌到血液中，这可通过血液检验来检测。将血液检验超声检测方法(诸如集成式综合数字液滴检测(IC 3D))或其他单分子检测技术结合。在IC 3D中，具体地，将血液样品在油中分隔成皮升尺寸的液滴，每个液滴含有一个酶或不含酶，含有报告酶的液滴可与它们的特异性荧光底物反应。可用3D粒子计数器检测荧光液滴。在IC 3D中，将试剂(例如，含有靶标的血液样品和靶标的传感器)在油中混合，产生含有一个靶标或不含靶标的皮升尺寸的油包水液滴。在含靶标的液滴中，传感器和靶标可以反应并产生荧光产物。可用3D粒子计数器检测荧光液滴，以测定与原始样品中包含的靶标数量相对应的荧光液滴的数量(图8)
[0182] 在替代实施方案中，提供了用于通过表达包括但不限于以下物质递送靶向疗法的方法：转化酶、直接治疗性酶、酶原、抗体或直接或间接辅助治疗过程的任何分子(图12和13)。转化酶(例如，胞嘧啶脱氨酶)包括将治疗剂的非活性形式转化为其活性形式的蛋白或任何其它分子。直接治疗性酶(例如，MMP)包括直接改变其它细胞或细胞外环境的内容物的酶。酶原(例如，半胱天冬酶-3)包括由工程化的细胞产生的蛋白或任何分子，并且响应于先前描述的机制而将其从无活性改变成有活性，并以其活性形式递送疗效。抗体(例如，曲妥珠单抗)可包括由工程化的细胞产生的免疫球蛋白，并直接或间接辅助治疗过程。
[0183] 在替代实施方案中，该系统使得能够实现用于检测或诊断、伴随诊断或科学和研究工具的测定。用于检测或诊断的测定包括使得能够检测工程化的细胞的细胞位置和/或内容物的测定的体外、体内、离体、原位或任何其它形式(图7、14、40和45)。伴随诊断包括设备和/或平台，其使得能够检测目前的专利技术不能实现的工程化的细胞的细胞位置和/或内容物的检测(图8、10和11)。科学和/或研究工具包括有利于生物过程的科学研究的工程化的细胞的使用(图46)。
[0184] 在替代实施方案中，提供了通过使用机械响应性启动子逻辑(即，逻辑门诸如多输入与门或顺序级与门)和如本文提供的机械响应性启动子系统来产生机械敏感性CAR T细胞(或其它细胞，包括但不限于其它免疫细胞或干细胞和成体细胞或其它细菌或其它微生物)的方法。这些细胞的生物和治疗活性独特地依赖于机械信号(包括但不限于LOXL1和/或LOXL2或生物物理学刺激诸如缺氧和/或氧化应激)和/或病理学标志物(包括但不限于肿瘤抗原诸如HER2或EGFRvIII)，所述信号和/或标志物通过(包括但不限于)工程化的嵌合抗原受体(CAR)启动细胞应答(图57)。可将靶向这些生物物理学提示与工程化的细胞组合以靶向其它信号，尤其是生物化学提示。总之，本文所述的实施方案使得能够设计可靶向与细胞相关或围绕细胞的生物物理学和/或生物化学或其它信号以以最小化的副作用有效地治疗疾病的细胞，。
[0185] 在替代实施方案中，使用逻辑门控遗传回路以逻辑依赖性方式将本文提供的工程化的细胞(包括但不限于CAR T细胞)与新型单链可变片段(scFv)或其它合成启动子融合或将所述工程化的细胞工程化，以靶向生物物理学提示的其它方面，诸如交联生物标志物、缺氧条件、氧化应激条件。
[0186] 在替代实施方案中，提供了非人转基因动物，其中在非人转基因动物(包括但不限于小鼠、大鼠、兔、绵羊或驴)中报告了机械信号的不同强度。机械信号的不同强度可通过机械敏感性启动子的阵列检测，并使用发信号部分诸如报告子或装置，包括荧光蛋白(包括但不限于蓝色荧光蛋白、绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白)的阵列读出。在替代实施方案中，使用模块化转移载体将此类遗传回路元件插入遗传安全港位置。
[0187] 间充质干细胞(MSC)可用作产生MRCS的载体。MSC是可从多个成体组织包括骨髓和脂肪衍生的多能细胞。特别地，由于其内在的再生和免疫调节特征，已将MSC作为治疗剂进行了测试。MSC正被研究以用于治疗各种各样的疾病，包括糖尿病、心肌梗塞、中风和自身免疫性疾病[2]。MSC也是世界上首个获得临床批准的制造的干细胞产品(即，由Osiris制造的在加拿大被批准用于治疗移植物抗宿主病(GvHD))[2]，并且用于200项个正在进行的clinicaltrials.gov上所列的试验，表明它们可为用于人的诊断和治疗用途的安全来源。
[0188] Engler等以前已对暴露于不同范围的基质硬度的MSC进行了微阵列分析，以确定在每组条件下特异性表达的基因。我们将该数据用作设计响应基质硬度输入的MRCS的起点。这包括利用PCR从人基因组DNA克隆TUBB3(β3-微管蛋白，神经源性谱系)、MYOD1(MyoD，肌源性谱系)和RUNX2(RunX2或CBFα1，成骨性谱系)基因启动子的约3.0kBp启动子。然后将这些启动子亚克隆入无启动子载体中以驱动红色、黄色和绿色荧光蛋白的去稳定形式(TUBB3-RFPd，MYOD-YFPd和RUNX2-GFPd)的表达(图4、46)。GFPd具有60-90分钟的半衰期，允许启动子活性的近实时成像。我们已经从人基因组DNA成功克隆了这些启动子。TUBB3在小于1kPa的硬度下被诱导，MYOD1在9-25kPa的范围内强烈表达，RUNX2在大于25kPa的硬度下16,17
强烈表达 。此外，还亚克隆与RUNX2的上游转录因子YAP(Yes相关蛋白)和TAZ(具有PDZ结合基序的转录共激活因子，也称为WWTR1)结合的启动子以驱动GFPd的表达。YAP/TAZ已被报道为通过例如细胞骨架和Rho GTP酶的机械提示的传感器和介质20，其调节YAP/TAZ核定位，从而影响YAP/TAZ用作转录因子的功能20,21。对于所有实验，我们利用来自德克萨斯A&M健康科学中心的人骨髓MSC(第3-6段)。对于构建体的转导，我们使用慢病毒转导，这产生稳定和强健的工程化的MSC细胞系。我们已发现在组织培养塑料上培养构建的MRCS不会导致启动子的异常激活。
强烈表达 。此外，还亚克隆与RUNX2的上游转录因子YAP(Yes相关蛋白)和TAZ(具有PDZ结合基序的转录共激活因子，也称为WWTR1)结合的启动子以驱动GFPd的表达。YAP/TAZ已被报道为通过例如细胞骨架和Rho GTP酶的机械提示的传感器和介质20，其调节YAP/TAZ核定位，从而影响YAP/TAZ用作转录因子的功能20,21。对于所有实验，我们利用来自德克萨斯A&M健康科学中心的人骨髓MSC(第3-6段)。对于构建体的转导，我们使用慢病毒转导，这产生稳定和强健的工程化的MSC细胞系。我们已发现在组织培养塑料上培养构建的MRCS不会导致启动子的异常激活。
[0189] 我们选择了TUBB3、MYOD1和RUNX2启动子用于初步筛选过程，因为以前的验证报告显示可变水平的基质硬度足以诱导它们的转录[3,4]。我们还筛选出被鉴定为响应基质硬度而被调节的多个其它基因启动子以确保整个生理学硬度范围的覆盖(包括神经源性：TUBB4、GDNF和STAT3；肌原性：MYOG、PAX7和MEOX2；成骨性：BGLAP、SMAD1和BMP6)，以及与TUBB3、MYOD1和RUNX2的的关键上游转录因子YAP/TAZ(例如，YAP(Yes相关蛋白)和TAZ(具有PDZ结合基序的转录共激活因子，也称为WWTR1，参见例如，DuPont等(2011)Nature 474:
179-183；Wrighton,(2011年7月)Nature Reviews Molecular Cell Biology 12:404-
405))结合的启动子。值得注意的是，我们已经发现，我们的具有YAP/TAZ启动子的MRCS，当被接种至聚丙烯酰胺水凝胶上时，通过以比例强度表达GFPd，能够感测不同的硬度(约
1kPa、约10kPa和约40kPa)，(图15)。
实施例
179-183；Wrighton,(2011年7月)Nature Reviews Molecular Cell Biology 12:404-
405))结合的启动子。值得注意的是，我们已经发现，我们的具有YAP/TAZ启动子的MRCS，当被接种至聚丙烯酰胺水凝胶上时，通过以比例强度表达GFPd，能够感测不同的硬度(约
1kPa、约10kPa和约40kPa)，(图15)。
实施例
[0190] 实施例1：肿瘤猎手：研究、检测和治疗癌症转移的机械响应性细胞系统：
[0191] 提供了机械响应性细胞系统(“MRCS”)，其可通过靶向肿瘤微环境中的独特生物物理性质和机械性质来选择性检测和治疗癌症转移。癌症转移导致超过90％的癌症死亡，然而目前的治疗均不直接靶向转移癌。对于乳腺癌，具体地，约1/8的美国妇女将在她们的一生中发展浸润性乳腺癌，每年导致40,000例死亡。几乎所有的乳腺癌死亡都是由于癌症在称为转移[5]的过程中从乳腺扩散到其它器官造成的，所述转移基本上是不可治愈的，中位存活期只有2至3年。广泛转移的切除常常是不可行的，并且化学治疗剂(包括紫杉烷和抗代谢物)在治疗弥散性疾病方面令人沮丧地无效且常伴有严重的副作用。因此，目前用于转移性乳腺癌的疗法主要集中于延长存活期和缓解期[5,6]。
[0192] 治疗癌症转移的另一个主要挑战是微转移(已经扩散到远端器官的少数癌细胞)通常太小，以至于无法通过常规诊断测试诸如计算机断层摄影(CT)和磁共振成像(MRI))来检测。事实上，只有很小百分比的患者在诊断时表现出临床可检测的转移。重要的是，已知微转移能够经历休眠期和逃避化学疗法。现在认为可在乳腺癌进展期间早期发生的微转移可导致癌症复发[6]。因此，检测微转移的能力将使我们能够在早期阶段(此时治疗最有效)鉴定处于高危复发风险的患者。不幸的是，目前的微转移检测技术不灵敏(即，CT和MRI)或者需要侵入性活检程序(例如，前哨淋巴结或肺活检)，从而使得它们不适合于临床应用。
[0193] 因此，存在对在早期鉴定转移的灵敏检测方法和对特异性靶向乳腺癌转移治疗以降低目前的全身性疗法的死亡率和副作用的明确巨大需要。
[0194] 细胞不断地与它们的小生境相互作用，所述小生境包括来自周围细胞外基质(ECM)的复杂生物化学和生物物理学信号的阵列。尽管在历史上不受重视，但最近已经显而易见的是，细胞微环境的物理和机械性质(所谓的“机械小生境”)调节重要的细胞功能。具体地，已经阐明了基质硬度(或弹性)在驱动乳腺癌转移中的重要作用。增加的基质硬度(主要由增加的胶原沉积和通过赖氨酰氧化酶(LOX)蛋白产生的交联驱动的)主要通过整联蛋[7,8]白信号传导的调节来促进乳腺癌迁移、侵袭、细胞可塑性和最终转移 。有趣的是，LOX积累在空间上与小鼠转移模型和人患者中转移的存在相关[9]。在乳腺癌转移的小鼠模型中，原发性乳腺肿瘤的LOX分泌导致促进转移形成的肺离散区域中胶原交联[9-13]。LOX在转移性小生境中的沉积与胶原线性化和肺实质中胶原-胶原共价键的形成相关，两者都显著增加基质硬度[7]。我们推理，LOX诱导的转移性小生境的独特机械性质为特异性靶向肺转移的诊断剂和治疗剂的开发提供了吸引人的靶标。
[0195] 提供了基于细胞的系统，其特异性地响应转移性小生境处的机械环境提示以靶向乳腺癌转移。由于基质与肺转移形成的密切相关性以及其长半衰期(以年计测量的)(这使其难以产生抗性)，因此基质硬度是吸引人的治疗靶标[14]。间充质干细胞(MSC)是用于产生机械响应性细胞系统(MRCS)的此类方法的有前景的载体(图14)。MSC是可以从多个成体组织(包括骨髓和脂肪)衍生的多能细胞[15,16]。MSC是在骨髓移植(Prochymal，Osiris Therapeutics)以外首次被批准用于人的干细胞治疗，并被用于clinicaltrials.gov上所列的200多项正在进行的试验的基础[17]。重要的是，全身性输注的MSC在体内优先归巢至肿瘤(包括原发性乳腺肿瘤和肺转移两者)并与肿瘤整合[18,19]。这假定地归因于由肿瘤产生的趋化因子对MSC的募集，这使它们成为用于在癌症治疗中局部递送治疗剂的吸引人的载体[18,19]。
[0196] 提供了用于操纵组织机械性质以调节MSC命运的方法：组织和基质硬度足以驱动[3,4,20]参与MSC分化的基因的表达 。具体地，类似于脑的软基质(小于1kPa的杨氏模量(Young’s modulus))指导MSC进入神经源性谱系，而与肌肉和骨骼类似的较硬基质(5至
75kPa)通过整联蛋白和局灶性黏着斑依赖性机制指导它们进入肌源性和成骨性谱系。重要的是，MSC所响应的硬度范围包括在正常乳腺和肺组织(小于1kPa)以及浸润性癌症和转移[21]
灶(高10-15倍的硬度)中发现的那些硬度范围 。
75kPa)通过整联蛋白和局灶性黏着斑依赖性机制指导它们进入肌源性和成骨性谱系。重要的是，MSC所响应的硬度范围包括在正常乳腺和肺组织(小于1kPa)以及浸润性癌症和转移[21]
灶(高10-15倍的硬度)中发现的那些硬度范围 。
[0197] MSC分化固有地是转录程序，每个谱系由特征性转录因子的表达定义。因此，这允许我们使用调节参与MSC分化的基因的启动子来驱动基质硬度响应性报告子或治疗剂的表达。支持我们的假设：MSC可特异性响应于转移性小生境处的组织硬度的差异是以下的观察结果：在小鼠癌症模型中静脉内输注的MSC明确地假定转移性肺但非正常肺中的成骨分化[18]。
[0198] 提供了直接靶向乳腺癌转移灶的机械环境提示，以用于局部和特异性递送诊断报告子和抗肿瘤剂的MRCS。
[0199] 方法
[0200] MSC响应于基质硬度的内生能力用于用硬度响应性启动子驱动报告子的表达。响应于特定范围的基质硬度而被上调的基因的启动子响应于离散范围的硬度而捕获并合成调节输入。通过使用这些启动子来驱动报告子或治疗剂的表达，提供了响应于在转移性小生境中发现的基质硬度范围的MRCS。
[0201] 原发性乳腺肿瘤的LOX分泌导致胶原蛋白在转移性小生境处的与增加的基质硬度[11]相关的增加的线性化和交联 。基于以前的报道，很明显的是：1)胶原线性化和交联是基质硬度的强替代标志物，以及2)募集至转移性肺的外源MSC假定与在正常肺中未观察到的增加的基质硬度相关的成骨分化特征谱[18,22]。此处，我们在体内验证了转移性小生境中的MRCS，并测试了使用MRCS在体内检测转移和测量原位组织硬度的可行性。
[0202] 作为乳腺癌转移至肺的模型，我们使用MDA-MB-231异种移植模型作为分泌大量LOX的MDA-MB-231细胞，这导致转移所必需的肺中胶原原纤维交联增加[9]。另外，LOX的抑制足以预防MDA-MB-231细胞的乳腺癌转移[12]。简言之，将用荧光素酶和RFP稳定转导并悬浮在基质胶/PBS中的MDA-MB-231细胞以原位植入/全身性输注入成年雌性裸小鼠。输注后7周，我们用IVIS成像系统监测来自肺中的转移癌细胞的荧光素酶表达。在注意到与仅使用基质胶或PBS注射的对照组相比荧光素酶活性显著增加后，我们然后处死小鼠并收集肺组织，观察到来自转移癌细胞的明显增长的RFP信号。上述数据显示，我们已经成功建立了体内MDA-MB-231异种移植模型。将进一步分析肺的转移存在(细胞角蛋白(CK)染色)以及通过免疫染色获得的LOX积累的证据。一个重要的对照是只注射基质胶或PBS(以了解LOX和CK染色的正常模式)的小鼠。该实验将确定了解MRCS的递送的转移动力学的重要时间点。
[0203] 将荷瘤小鼠分成4个实验组，每组接受一次静脉输注1x 106个MRSC报告子(TUBB3、MYOD1、RUNX2和YAP/TAZ/GFPd)之一；类似地对对照无肿瘤小鼠进行分组和输注。1x 106个MSC的输注足以有效地将MRCS递送至转移性小生境；先前的研究表明，输注后一周，被被动地捕获在肺微脉管系统中的MSC已经被清除，其余的MSC特异性地位于转移灶处[22]。
[0204] MSC可用作机械环境的被动式传感器和载体。我们在多个时间点研究了MRCS激活，以确定MRCS被特异性地和强劲地激活的最早时间点，以使MSC为修饰它们在转移灶中的局部环境而发挥的任何潜在生物学作用(例如，蛋白酶和ECM组分的分泌[19])最小化。输注后1、2、3和7天处死小鼠，以如下所述研究通过共聚焦显微术测定的MRCS从肺部的清除以及我们的报告子的激活状态。我们还对如上所述的转移和转移性小生境的标志物进行染色，以确定报告子激活区域是否与转移和LOX相关。我们还确定了报告子强度与周围基质硬度之间的相关性(使用原子力显微术(AFM)微压痕)。启动子工程化允许我们实现MRCS信号与组织硬度之间的足够强的相关性，以产生基于细胞的硬度“尺”作为在体内原位询问生物组织的机械性质的全新型方法。
[0205] 提供了将成像剂和治疗剂选择性递送至转移性肺机械环境的方法。为了确定哪个报告子构建体(TUBB3、MYOD1、RUNX2或YAP/TAZ)最适合于这项任务，我们对肺切片进行基于图像的分析。简言之，提供了方法：1)定量肺中每个GFPd报告子的积分荧光强度，2)将强度分箱至“无”、“低”和“高”组中，以及3)定量“高”箱中的转移和/或LOX积累与报告子强度之间的平均距离。具有“高”报告子活性与转移灶/LOX积累之间最短距离的报告子将被选为在随后实验中用于靶向递送的转移性小生境特异性启动子。提供了在先前描述的时间点提取的肺组织的分析，以确定MRCS输注后在转移性小生境处产生强劲和特异性信号的最佳时间。
[0206] 提供了用于检测高危患者中的微转移或转移的肺实质特征的变化的方法。作为原理论证，我们工程化我们的MRCS来驱动替代GFPd(MRCS-Luc)的去稳定化的荧光素酶代表达。在响应于如针对荧光报告子所描述的离散范围的硬度而体外表征荧光素酶活性后，我们在未经工程化以表达荧光素酶的MDA-MB-231细胞的异种移植后的多个时间点向小鼠施用MRCS-Luc细胞。我们在处死小鼠和收集肺部之前测量了体内肺内的荧光素酶活性。分析肺的如上所述的转移负荷和LOX免疫染色，以确定转移和转移前小生境形成的这些标志物是否与来自MRCS-Luc的荧光素酶信号相关。
[0207] 为了局部治疗乳腺癌至肺的转移，我们利用在转移性小生境处被最特异性地和强劲地激活的报告子来局部激活前药。由于在大多数临床试验中使用的MSC的静脉内递送导致大量MSC在肺脉管系统中的初始捕获，因此需要仅在转移性小生境处对前药进行局部激活而非组成型表达药物来在避免肺和其它器官系统中的潜在不利毒性[18,22]。为此，我们工程化MRCS以响应于在转移灶中发现的特定范围的基质硬度而表达前药转化酶。响应于适当的硬度，转化酶将经由旁观者效应将全身性施用的无活性前药转化成能够杀死MSC和附近癌细胞的活性药物[23]。这种方法不仅能更有效地靶向乳腺癌转移灶，而且可避免全身性疗法的副作用。
[0208] 为了设计用于局部药物激活的MRCS，我们利用被确定为对于上述转移性小生境是特异的报告子。对于鉴定的报告子结构，我们用胞嘧啶脱氨酶(CD)的基因替换了GFPd。CD用作前药转化酶，将前药5-氟胞嘧啶(5-FC)转化成强效抗代谢物5-氟尿嘧啶(5-FU)。这导致5-FC经由旁观者效应而被局部激活，其中凋亡的MRCS局部释放CD[23]。这种技术已经显示出巨大的希望，并且目前是使用神经干细胞(NSC)治疗胶质母细胞瘤的临床试验的基础[23,24]。另外，我们利用其中CD被组成型表达的载体作为重要对照来了解和定量5-FC的全局性MSC激活的肺部和全身性毒性。将如上所述转导MSC。
[0209] 对于体内动物实验，经由尾静脉用FLuc-RFP-231癌细胞静脉内(i.v.)输注裸小鼠。在癌症接种后6周，用D-荧光素(150mg/kg，于DPBS中)腹膜内(i.p.)注射小鼠以观察来自萤火虫荧光素酶(Fluc)的癌症信号。将动物分为四个处理组：C-MSC(组成型表达的CD细胞)、MRCS-CD、N-MSC(天然MSC对照)和PBS对照。然后在第0天向荷瘤小鼠和无肿瘤健康对照小鼠i.v.输注MSC或PBS。通过以12小时间隔每天两次i.p.注射癌症前药(5-FC,00mg/kg，于DPBS中)，持续5天(第1-5天)，然后每24小时一次再持续2天(第6-7天)来处理小鼠。然后在第9天使用IVIS Lumina成像系统在体内处理后观察到Fluc活性。D-荧光素给药后10分钟开始图像采集。在第1天和第9天将来自每个实验组的一只小鼠安乐死以用于离体组织成像和测定。我们利用先前描述的水凝胶验证我们的MRCS响应于基质硬度而对CD的调节。我们首先通过使用原子力显微术(AFM)，然后对CD(Abcam)染色来使CD转录/翻译与局部硬度关联。为了验证功能性CD的局部产生和旁观者效应的功效，我们将MDA-MB-231细胞与我们的MRCS在具有不同硬度的水凝胶上共培养，其中将5-FC添加至培养物中。我们利用AFM和用于调亡的测定(TUNEL)测量局部硬度，以确定凋亡是否与硬度相关。
[0210] 为了检查我们的MRCS治疗肺转移的功效，我们利用上述MDA-MB-231异种移植模型来探查我们的局部疗法对弥散性乳腺癌的作用。建立肺转移灶后，如用荧光素酶成像所测量的，我们输注了1x 106个我们的MRCS-CD。在允许MRCS-CD激活进行足够的时间(在先前的体内和体外实验中通过经验确定)后，我们经由腹膜内注射施用在生理盐水中单次全身输注液5-FC；两天后，处死小鼠，并通过免疫组织化学和免疫荧光分析冷冻石蜡包埋的肺切片。重要对照包括输注了未转导的MSC和组成型表达CD的MSC的无肿瘤小鼠和MDA-MB-231异种移植小鼠。
[0211] 结果
[0212] 结果的主要量度包括1)肺转移灶数(用抗荧光素酶或CK抗体染色)，2)总转移肺负荷(来自活小鼠的荧光素酶成像和针对小鼠特异性GAPDH归一化的荧光素酶基因的来自肺组织的基因组DNA的实时PCR)，和3)内源肺组织中的凋亡(肺中的TUNEL染色)。定量所有量度，并分析其的实验与对照条件之间的显著差异性。这些实验允许我们确定我们的疗法在消除转移方面是否高效以及是否更具选择性，使正常肺组织避开化学疗法的有害作用。
[0213] 具有工程化的报告子-eGFP构建体(MRCS-eGFP)的MRCS显示出感测不同的硬度并且仅在硬基底上选择性激活GFP表达的能力，如通过体外免疫荧光成像所见(图15)。在软的神经源性基底(1kPa)上涂铺的MSRC-eGFP未能显示GFP表达(图15A)，但可在更硬的成骨性基底(大于40kPa)上看到GFP(图15C和15D)。还观察到YAP/TAZ定位受基底硬度调节。YAP/TAZ在较软的基底(神经源性，1kPa和肌原性，10kPa)(图15E和15F)上失活并位于细胞质中，但在较硬的基底(图15G和15H)上被激活并位于细胞核中。核共定位可从DAPI核复染中看出。
[0214] 还显示了MRCS-eGFP感测为可逆硬度依赖性的(图16)。通过添加布雷他汀和ML-7(肌球蛋白轻链激酶抑制剂)或PF228(局灶性黏着斑激酶抑制剂)，使涂铺在硬的激活性基底(约40kPa)上的细胞失活。这可从GFP荧光的缺乏(图16A-C)和从YAP/TAZ至细胞质的共定位(图16D-F)中看出。对接种的MRCS-eGFP细胞进行实时RT-PCR，以定量eGFP和两个YAP/TAZ下游因子(CTGF(结缔组织生长因子)和ANKRDI(含锚蛋白重复结构域的蛋白1))的相对mRNA表达水平(图17)。表达水平在软基底(1kPa和10kPa)上涂铺的细胞与在硬基底(40kPa和玻璃)上涂铺的细胞之间显著不同。当与在硬的激活性基底上的未抑制的细胞相比较时，还发现表达水平在前述抑制剂存在的情况下被显著降低。在硬基底上涂铺的N-MSC是对照。该数据证实了MRCS-eGFP基因表达的特异性硬度依赖性。
[0215] 与MRCS-eGFP类似，还发现具有工程化的报告子-Luc构建体的MRCS(MRCS-Luc)在体外具有硬度特异性(图18)。在软基底(1kPa和10kPa)上涂铺的MRCS-Luc和在硬基底(40kPa和玻璃)上涂铺的细胞的相对荧光素酶活性水平显著降低。当与硬的激活性基底上的未抑制的细胞相比时，还发现表达水平在布雷他汀、ML-7或PF228存在的情况下显著降低。组成型表达荧光素酶的C-MSC用作阳性对照，且无荧光素酶活性的N-MSC用作阴性对照。
[0216] 具有工程化的报告子-CD构建体的MRCS(MRCS-CD)在体外也感测不同的基底硬度(图19)。在软基底(1kPa)上涂铺的MSRC-CD未能显示GFP表达(图19A)，但可在较硬的成骨性基底(>40kPa)上看到CD(图19C和19D)。还观察到YAP/TAZ定位受基底硬度调节(图19E-H)。
[0217] 还显示了MRCS-CD感测是可逆硬度依赖性的(图20)。通过添加布雷他汀和ML-7(肌球蛋白轻链激酶抑制剂)或PF228(局灶性黏着斑激酶抑制剂)，使在硬的激活性基底(约40kPa)上涂铺的细胞失活。这可从GFP荧光的缺乏(图20A-C)和从YAP/TAZ对细胞质的共定位(图20D-F)看出。
[0218] 为了测试MRCS-CD治疗癌症的功能作用，将MRCS-CD与表达荧光素酶的MDA-MB-231人乳腺癌细胞(231细胞与MRCS的比例为2:1)共培养(图21)。将细胞在具有不同硬度(从软的(1kPa)变化至玻璃)的基底上共培养5天。将细胞在含有5-FC(800μg/mL)或不含5-FC的培养基中共培养。然后使用XTT测定来测定每种条件下的细胞增殖的相对量。将所有数据针对仅具有MDA-MB-231细胞而无MRCS的对照样品进行归一化。结果显示，当将MRCS-CD与231细胞在较硬(10kPa及更高)基底上共培养时，在5-FC存在的情况下，显著降低癌细胞增殖。在软(1kPa)基底上，在5-FC与无5-FC之间增殖变化不显著。组成型表达CD的C-MSC对照看到癌症细胞增殖的最大幅度下降，而无表达的CD的N-MSC对照未看到癌细胞增殖的显著变化。从该实验我们可以得出结论：在癌症前药5-FC存在的情况下，引起增加的CD表达的增加的基底硬度导致减少的癌细胞增殖。
[0219] 从体外实验，我们得出结论：可对MRCS工程化以特异性响应于不同的基底硬度和选择性表达目标基因。然后可将细胞用于表达报告子基因诸如eGFP或荧光素酶用于检测目的，或用于表达在靶向治疗中起辅助作用的治疗性基因。
[0220] 如上所述和如图22中所见，进行体内实验。此处显示实验的2个重复，在处理后第0天、第9天和第6周对荧光素酶癌症信号进行成像(图23)。对信号进行定量，并将处理后第9天的信号除以处理前第0天的信号，以获得倍数变化(相对转移指数，RMI)(图24)。RMI为1表示处理前后无变化。数据显示，与N-MSC和PBS处理组相比，C-MSC和MRCS-CD处理组具有显著减小的RMI。当将处理后第6周的信号针对无肿瘤对照小鼠进行归一化时，长期定量显示相同的趋势(图25)。数据显示，与N-MSC和PBS处理组相比，C-MSC和MRCS-CD处理组具有显著减小的肺转移指数。
[0221] 为了检查经工程化以组成型表达萤火虫荧光素酶(Luc-MSC)的MSC是否能够归巢于肺中的转移位点，我们将Luc-MSC全身性地输注至在肺中集结有eGFP-231乳腺癌细胞的小鼠和无肿瘤对照小鼠中。我们发现Luc-MSC归巢于肺转移位点并保持在其中(图48)。
[0222] 然后，我们使用MRCS-Luc研究MRCS是否可归巢于肿瘤位点并在肿瘤位点被特异性激活，所述MRCS-Luc用作MRCS-CD的替代物并且允许我们在体内使用诱导的荧光素酶容易地追踪移植的MRCS并监测其激活。我们证明了全身性输注的MRCS-Luc归巢于荷eGFP-231肿瘤的小鼠的肺中的肿瘤位点并且仅所述位点被诱导表达荧光素酶(图49A和49B)。反映了MRCS在肿瘤位点处归巢和激活的集合功能结果的观察到的荧光素酶信号，在荷瘤小鼠中持续存在长达1-2天(图49A)。我们还使用离体免疫组织化学(IHC)证实了MRCS-CD在荷Luc-RFP-231肿瘤的小鼠中的体内归巢和激活。我们证明了MRCS-CD与CD在荷瘤(但非无肿瘤)小鼠的肺切片中的癌症位点处共定位并且在所述位点处被局部激活以表达CD(图49C和49D)。对于MRCS-eGFP的输注观察到类似的结果(图50)。综上所述，这些数据表明，MRCS在体内选择性归巢于转移性小生境并在其中被特异性激活。
[0223] 对膜联蛋白V进行染色以测定凋亡显示了MRCS-CD在转移位点处的特异性激活(图27D)，而在无肿瘤组织上没有见到可比较的膜联蛋白V信号(图27E)。CD-MSC处理组对膜联蛋白V染色呈阳性，非特异性地表明广泛的组织损伤(图27A)。用N-MSC或DPBS处理的小鼠对肿瘤但非对膜联蛋白V染色呈阳性(图27B和27C)，表明天然MSC或DPBS输注不引起细胞毒性。
[0224] 在第1天和第9天使用TUNEL测定评估组织损伤。增加的棕色HRP信号指示对肺组织内的细胞核的损伤增加。来自处理前和处理后的每个处理组和健康对照的代表性图像示于图28和29中。TUNEL阳性细胞占总细胞百分比的定量显示对于C-MSC，组织损伤显著增加，而对于N-MSC和PBS，组织损伤无显著变化(图30)。MRCS-CD在处理过程中确实造成肺损伤，但是这种损伤明显低于C-MSC引起的损伤。重要的是，当向无肿瘤小鼠施用时，MRCS-CD不会引起显著的组织损伤。
[0225] 为了进一步研究我们的MRCS如何与具有独特机械性质的转移性小生境相互作用，我们共转导了MRCS-CD以组成型表达eGFP作为细胞追踪物。然后，在MRCS全身输注至荷瘤(图51A和51B)和无肿瘤(图51C)小鼠后24小时(第1天)，我们用离体IHC染色进行SHG成像。如在SHG-IHC重叠图像上观察到的，在荷瘤肺中观察到显著更多的MRCS(特征在于组成型表达的eGFP)。重要的是，eGFP标记的MRCS-CD的CD优先在与更线性化的胶原交联相关的癌症区域中被激活(图51A)。相比之下，在较少线性化的非癌症区域(图51B)或在无肿瘤肺中几乎无MRCS被激活以表达CD(图51C)。综上所述，这组数据连同我们以前的MRCS肿瘤归巢数据(图49和图50)和MRCS-CD诱导的转移位点处的细胞凋亡(图27D)强烈地表明MRCS在体内的激活和肿瘤杀死功能由独特的癌症相关机械提示特异性介导。
[0226] 讨论
[0227] 提供了直接询问基质硬度的治疗系统，并将其应用于将药剂局部递送至乳腺癌转移灶。该系统对于超过150,000位携带转移性乳腺癌生活的美国人在增加疗效同时还有改善与全身化学疗法相关的症状方面具有重要的临床意义。提供了MRCS以应用于靶向1)乳腺癌中的原发性肿瘤和其它器官系统(例如，肝、脑和骨髓)中的转移以及2)其它类型的癌症和癌症转移中的异常组织硬度的疗法。
[0228] 提供了通过靶向“转移前小生境”(通过在转移前小生境中直接激活前药来破坏转移形成所必需的募集的骨髓CD11b细胞或通过工程化MRCS以分泌基质重塑酶诸如金属蛋白酶以降低小生境的硬度)来防止转移的方法9。重要的是，在许多临床试验中，MSC已被证明对于人中的移植是安全的，并且在加拿大已被批准用于患有移植物抗宿主病(GvHD)的儿童。
[0229] 提供了灵敏地和选择性检测微转移(尤其是在它们的早期阶段)的诊断工具。提供了使用荧光和生物发光成像的方法。可以在与HSV-1-tk报告子基因整合以催化胸苷类似物[18F]FEAU的磷酸化后，通过例如正电子发射断层摄影(PET)对系统进行成像。在该系统中，[18F]FEAU的磷酸化形式在表达HSV-1-tk基因的细胞内积累，从而有利于利用PET成像[25]。提供了通过用荧光报告子突出显示转移区域或高浸润潜力来指导手术干预的方法；使用全身性施用的荧光探针的类似方法已用于突出显示癌细胞以便进行手术[26]。
[0230] 优势
[0231] 示例性系统具有优于目前的微转移成像技术的主要优点，因为它们可通过检测局部微环境的性质来放大来自较少数量的细胞的信号，并且其可以在体内使用而不需要活检或侵入性技术。MRCS可以是用于诊断微转移和用于监测高危患者群体的治疗的常规做法。此外，我们的系统将提供有用的工具来研究癌症转移及其与机械小生境的相互作用的新生物学。例如，包含硬度“尺”的示例性方法允许以目前不可能的动态方式在体内实时测量和监测肿瘤微环境中的硬度。此类系统允许研究肿瘤细胞如何响应化疗疗法而重塑它们的机械小生境，这可开发新型癌症治疗剂。
[0232] 本质上，组织内的细胞“感觉”并且感知机械环境提示(例如，力、硬度)并且将该信息转导成下游功能诸如浸润、迁移或分化。此类机械小生境在发展、止血和疾病进展(包括癌症)中起着至关重要的作用，因此用作下一代治疗剂的新兴靶标。基质硬度由于其长半衰期(以年计测量的)(使得其难以产生抗性)而为癌症治疗剂的极具吸引力的靶标[14]。受先前发现：1)硬度在转移性小生境中显著增加，和2)提供了根据微环境硬度来实现MSC分化为特定谱系的方法启发，提供了通过首次直接靶向转移性小生境的机械环境提示进行的癌症转移的治疗。通过使用经工程化以响应于基质硬度变化的细胞，提供了用于以比目前的技术诸如CT或MRI更高的分辨率检测转移的方法，而且还有靶转移用于局部激活治疗剂。
[0233] 我们的系统还利用MSC特异地归巢于转移灶的能力。MSC至肿瘤和转移灶的天然“主动”归巢(和随后的整合)能力使得能够将“货物”有效地递送至靶位点。这避免了与被动递送(即，通过直接施用或聚合物纳米颗粒)相关的许多障碍，包括穿透内皮，和与肿瘤相关的增加的压力。特别地，由于它们的尺寸小、对于器官高度分散和低血管化，转移性肿瘤可能不太容易接近全身性输注的化学治疗剂或靶向纳米颗粒。与前药转化酶/5-氟胞嘧啶系统的局部且特异性递送组合的此类主动且特异性靶向，允许我们以最小的副作用接近局部治疗剂浓度，这对于化学治疗剂的全身性输注是不可能的。
[0234] 另外，示例性MRCS系统产生全新的技术来在体内探测组织的天然机械性质。尽管先前的研究已确定基质硬度与浸润性和转移密切相关，但目前的测量硬度的方法涉及利用原子力显微术(AFM)或压缩装置的离体测量。另外，这些技术缺乏直接测量与细胞相互作用的ECM的硬度的分辨率；相反，其测量包含目标组织的ECM和细胞组分两者的较大区域的平均硬度。提供了用于原位测量基质硬度的基于细胞的荧光“尺”，其为在疾病进展和体内响应疗法期间动态询问原发性肿瘤的机械环境、转移灶和基质硬度变化的范式转换法。
[0235] 风险
[0236] 潜在的警告是，MSC本身可在体内修饰局部机械环境。先前已有人提出天然MSC正调节和负调节癌症进展[15]。然而，我们假设，即使发生这种情况，但最终的分化状态仍将取决于转移性小生境的初始特性并与其相关联。为了缓解这一潜在问题，我们将探查MSC随时间推移的分化状态，并努力使用在转移性小生境处发生特异性报告子激活的快速时间点[19]。事实上，我们推理，我们的MRCS可允许我们将来研究MSC在肿瘤进展中的作用，这是[16]该领域的热门话题 。特别地，我们在开发MRCS(特别是启动子驱动的报告子)过程中产生的工具也将用于探查在癌症进展和治疗响应过程中原发性肿瘤、转移灶和其它器官中的外源和内源MSC的分化状态。
[0237] 虽然几个器官(包括肌肉(12kPa)和骨(25-40kPa)[4])接近或超过浸润性乳腺癌的组织硬度，并可能促进我们的MRCS激活，我们预计由于MSC至癌症和转移灶的固有归巢能力和它们从非发炎或受伤组织的快速清除，这将不是个主要问题[15,16]。虽然MSC将遇到血管内皮细胞、基底膜和ECM组分(每种都有它们自己的特征硬度)，当被运输至转移性小生境时，我们没有预料到这会永久影响报告子活性[4]。特别地，这些机械相互作用中的许多相互作用涉及剪切应力，所述剪切应力不调控MSC分化。另外，先前的研究已确定机械响应性基因的表达是快速可逆的16，我们将另外表征和优化该性质。
[0238] 尽管先前的报告表明，每个基因上游的近端3kBp足以调控其转录，但对其它刺激(诸如缺氧或炎症)的响应可能会干扰机械特异性激活。如果发生这种情况，我们将经由良好建立的全质粒定点诱变，去除针对缺氧和炎症的响应元件，诸如HIF-1α和NF-κB共有序列。我们的鉴定基质硬度响应性启动子元件以产生合成启动子的生物信息学方法还将避免天然启动子中不想要的响应元件的潜在混杂效应。
[0239] 最后，CD/5-FC系统的旁观者效应可能太强或太弱，以至于不能在不影响正常肺的同时有效地治疗转移灶。存在经由启动子的转录调控来局部递送治疗剂(包括我们将探查的胸苷激酶、TRAIL和IFN-β)的多种替代方法。另外，将进行将我们的系统应用于转移乳腺癌至肺的自发性本生模型的实验，以充分验证我们的MRCS平台的可推广性。将进行长期存活研究(其中在建立肺转移后并且在用MRCS治疗之前除去原发性肿瘤)以将MRCS充分验证为用于临床翻译的现实可行的治疗。另外，由于增加的基质硬度也与原发性肿瘤的局部浸润和脉管系统的紊乱相关联，因此靶向原发性肿瘤的这些硬区域可靶向肿瘤的最浸润区[7]域，且可促进脉管系统的重整化以用于治疗 。
[0240] 在替代实施方案中，使用硬度感测序列：CACATTCCA(SEQ ID NO:1)，包括例如最小鸡TnT启动子(SEQ ID NO：2)
[0241] CACATTCCACACATTCCACTGCAAGCTTGAGACACATTCCACACATTCCACTGCAAGCTTGGCCAGTGCCAAGTTGAGACACATTCCACACATTCCACTGCAAGCTTGAGACACATTCCACACATTCCACTGCAAGCTTCTAGAGATCTGCAGGTCGAGGTCGACGGTATCGATAAGCTTGGGGGTGGGCGCCGGGGGGACCTTAAAGCCTCTGCCCCCCAAGGAGCCCTTCCCAGACAGCCGCCGGCACCCACCGCTCCGTGGGAC
[0242] LV-PL4无启动子载体克隆方案
[0243] 1)用某一限制性酶将无启动子载体(GenTarget，Inc.目录号LV-PL4)消化1小时；
[0244] 2)载体去磷酸化
[0245] a)向用任何缓冲液中的任何限制性内切酶切割的1-5μg DNA中添加1/10体积的10X南极磷酸酶反应缓冲液；
[0246] b)添加1μl南极磷酸酶(5u)并混合；
[0247] c)在37℃下孵育15分钟以进行5′延伸或生成平端；
[0248] d)在65℃下热灭活5分钟；
[0249] 3)在1％琼脂糖凝胶中运行消化的/去磷酸化的产物，切割目标条带(7088bp)并进行凝胶纯化。于-20℃下保存；
[0250] 4)插入片段的产生：
[0251] a)插入片段的PCR扩增或
[0252] b)使用某一限制性酶切断插入物；
[0253] 5)使用PCR纯化或凝胶纯化试剂盒(步骤3)来纯化片段；
[0254] 6)连接：
[0255] a)使用 HD Cloning Plus试剂盒(Clontech Laboratories Inc.)将来自步骤3的线性化的无启动子载体和来自步骤5的插入片段在50℃下融合15分钟或[0256] b)使用T4连接酶连接纯化的线性化载体和插入物；
[0257] 7)将来自步骤6的输注产物转化入Stellar感受态细胞(Clontech Laboratories Inc.)；
[0258] 8)将转化的细胞涂板在Amp-LB板上，并在37℃下孵育过夜(16小时)
[0259] 9)挑拣几个集落并将其在37℃下于Amp-LB肉汤中培养过夜(16小时)，并在少量制备之前进行集落PCR；
[0260] 10)少量制备，并且通过用限制性酶切割并运行1％琼脂糖凝胶来验证最终质粒的大小。
[0261] 慢病毒转导方案
[0262] 11)在转染前24小时，将足够的293T细胞(GenTarget Inc；目录号：TLV-C)(牛血清(FBS)和1％PenStrep(P/S)的10ml DMEM的10cm培养皿上)；
[0263] 12)转染前2至3小时，用不含P/S的新鲜培养基更换培养基；
[0264] 13)转染( LTX和PLUSTM试剂)
[0265] a)在1.5ml Opti-MEM/减血清培养基中稀释下面所示的质粒DNA。通过上下吹打两次进行充分混合；
[0266]
[0267]
[0268] *转移质粒＝启动子+插入无启动子载体(GenTarget Inc；目录号：LV-PL4)的CDS[0269] b)在使用前轻轻混合PLUSTM试剂，将15.5ul PLUSTM试剂直接添加至稀释的DNA(试剂A)。轻轻混合并在室温下孵育5分钟；
[0270] c)向1.5ml 减血清培养基(试剂B)中添加31μlLTX。轻轻混合。在5分钟内进行下一步；
[0271] d)轻轻混合试剂A和B，并在室温下孵育30分钟；
[0272] e)从293T细胞吸出培养基，并用5ml 减血清培养基漂洗两次；
[0273] f)将试剂混合物添加至293T细胞上，并轻轻混合；
[0274] g)在37℃下于CO2孵育箱中孵育4小时，并添加3ml含有20％FBS的无P/S DMEM；
[0275] h)孵育过夜(16小时)，并用6ml含有10％FBS的无P/S DMEM替换培养基；
[0276] 14)在6孔板中一式三份MSC，其汇合率为70％至80％；
[0277] 15)收获病毒：
[0278] a)在步骤3h(第一批)后48小时收集293T细胞的上清液；
[0280] c)添加120μl 5mg/ml硫酸鱼精蛋白(于DMEM中，无菌过滤的)，以产生100μg/ml的终浓度；
[0281] d)用5ml新鲜的无P/S DMEM来重填培养皿；
[0282] e)步骤3h后72小时，重复病毒收获步骤5a-c；
[0283] f)抽吸病毒，并用新鲜培养基替换培养基，并且孵育6小时，然后用10μg/ml嘌呤霉素选择48小时，然后以后用1～2μg/ml嘌呤霉素维持工程化的细胞；
[0284] 6)如有必要，可将病毒在-80℃下储存。
[0285] 转移质粒：
[0286] LV-PL4-CMV::CD
[0287] CMV增强子+启动子：pcDNA3.1(+)/Luc2＝tdT,Addgene 43904
[0288] 输注引物：
[0289] (SEQ ID NO：3)正向(Fw)：ggtggtggatccTGTACGGGCCAGATATACGC
[0290] (SEQ ID NO：4)反向(Rv)：ggtggtggatccGCCAGCTTGGGTCTCCCTAT
[0291] FCY::FUR(融合的胞嘧啶脱氨酶(CD))：pSelect-zeo-Fcy::Fur,InvivoGen,Inc.目录号：psetz-fcyfur
[0292] 输注引物：
[0293] (SEQ ID NO:5)Fw:ggtggtatcgatgccaccATGGTCACAGGAGGC
[0294] (SEQ ID NO:6)Rv:ggtggtatcgatAGCTAGCTCAGGTTTAGACACAGTAG
[0295] 无启动子载体(GenTarget，Inc目录号LV-PL4)(SEQ ID NO：7)
[0296]ggatccTGTACGGGCCAGATATACGCGTTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCTCTGGCTAACTAGAGAACCCACTGCTTACTGGCTTATCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCCAAGCTGGCgGATCCGTATACATcgatgccaccATGGTCACAGGAGGCATGGCTTCAAAGTGGGACCAGAAGGGCATGGACATTGCCTATGAGGAGGCTGCTCTGGGCTACAAGGAGGGAGGGGTCCCAATTGGTGGCTGCCTCATCAACAACAAGGATGGCAGTGTCCTGGGCAGGGGCCACAACATGAGGTTCCAGAAGGGCAGTGCCACCCTGCATGGGGAGATCAGCACCCTGGAGAACTGTGGCAGGCTGGAGGGCAAGGTCTACAAGGACACCACTCTGTACACCACCCTCAGCCCTTGTGACATGTGCACAGGGGCCATCATCATGTATGGCATTCCCAGGTGTGTGGTGGGAGAGAATGTCAACTTCAAGTCAAAAGGAGAGAAGTACCTCCAGACCAGGGGCCATGAGGTGGTTGTGGTGGATGATGAGAGGTGCAAGAAGATTATGAAGCAGTTCATTGATGAGAGACCCCAGGACTGGTTTGAGGACATTGGGGAGGCCTCTGAGCCCTTCAAGAATGTGTACCTCCTCCCCCAGACCAACCAACTCCTGGGACTCTACACCATCATCAGGAACAAGAACACCACCAGGCCAGACTTCATCTTCTACAGTGACAGGATCATCAGGCTCCTGGTGGAGGAGGGCCTCAACCACCTCCCTGTGCAGAAGCAGATTGTGGAGACTGACACCAATGAGAACTTTGAGGGAGTGTCTTTCATGGGCAAGATTTGTGGGGTGTCCATTGTGAGGGCTGGGGAGAGCATGGAGCAGGGCCTGAGGGACTGTTGCAGGAGTGTGAGGATTGGCAAGATCCTGATCCAGAGGGATGAGGAGACTGCCCTGCCCAAGCTGTTCTATGAGAAGCTCCCTGAAGACATCTCTGAGAGGTATGTCTTCCTCCTGGACCCCATGCTGGCAACTGGAGGCTCTGCAATCATGGCCACTGAGGTGCTCATCAAGAGGGGAGTCAAGCCTGAGAGGATCTACTTCCTCAACCTCATCTGCTCAAAGGAGGGCATTGAGAAGTACCATGCTGCCTTCCCTGAAGTGAGGATTGTCACTGGGGCTCTGGACAGGGGCCTGGATGAGAACAAGTACCTGGTCCCTGGCCTGGGAGACTTTGGGGACAGATACTACTGTGTCTAAACCTGAGCTAGCTatcgatgggcccactagtgtcgacgctagctctagatgtacaaagtggtgctagcactctcagtacaatctgctctgatgccgcatagttaagccagtatctgctccctgcttgtgtgttggaggtcgctgagtagtgcgcgagcaaaatttaagctacaacaaggcaaggcttgaccgacaattgcatgaagaatctgcttagggttaggcgttttgcgctgcttcgcgatgtacgggccagatatacgcgtatctgaggggactagggtgtgtttaggcgaaaagcggggcttcggttgtacgcggttaggagtcccctcaggatatagtagtttcgcttttgcatagggagggggaaatgtagtcttatgcaatactcttgtagtcttgcaacatggtaacgatgagttagcaacatgccttacaaggagagaaaaagcaccgtgcatgccgattggtggaagtaaggtggtacgatcgtgccttattaggaaggcaacagacgggtctgacatggattggacgaaccactgaattccgcattgcagagatattgtatttaagtgcctagctcgatacaataaacgccatttgaccattcaccacattggtgtgcacctccaaagcgctcaccatgaccgagtacaagcccacggtgcgcctcgccacccgcgacgacgtccccagggccgtacgcaccctcgccgccgcgttcgccgactaccccgccacgcgccacaccgtcgatccggaccgccacatcgagcgggtcaccgagctgcaagaactcttcctcacgcgcgtcgggctcgacatcggcaaggtgtgggtcgcggacgacggcgccgcggtggcggtctggaccacgccggagagcgtcgaagcgggggcggtgttcgccgagatcggcccgcgcatggccgagttgagcggttcccggctggccgcgcagcaacagatggaaggcctcctggcgccgcaccggcccaaggagcccgcgtggttcctggccaccgtcggcgtctcgcccgaccaccagggcaagggtctgggcagcgccgtcgtgctccccggagtggaggcggccgagcgcgccggggtgcccgccttcctggagacctccgcgccccgcaacctccccttctacgagcggctcggcttcaccgtcaccgccgacgtcgaggtgcccgaaggaccgcgcacctggtgcatgacccgcaagcccggtgcctgaactagttaggtttaaacacgcgtaccggttagtaatgatcgacaatcaacctctggattacaaaatttgtgaaagattgactggtattcttaactatgttgctccttttacgctatgtggatacgctgctttaatgcctttgtatcatgctattgcttcccgtatggctttcattttctcctccttgtataaatcctggttgctgtctctttatgaggagttgtggcccgttgtcaggcaacgtggcgtggtgtgcactgtgtttgctgacgcaacccccactggttggggcattgccaccacctgtcagctcctttccgggactttcgctttccccctccctattgccacggcggaactcatcgccgcctgccttgcccgctgctggacaggggctcggctgttgggcactgacaattccgtggtgttgtcggggaagctgacgtcctttccatggctgctcgcctgtgttgccacctggattctgcgcgggacgtccttctgctacgtcccttcggccctcaatccagcggaccttccttcccgcggcctgctgccggctctgcggcctcttccgcgtcttcgccttcgccctcagacgagtcggatctccctttgggccgcctccccgcctggcgatggtacctttaagaccaatgacttacaaggcagctgtagatcttagccactttttaaaagaaaaggggggactggaagggctaattcactcccaacgaagacaagatctgctttttgcttgtactgggtctctctggttagaccagatctgagcctgggagctctctggctaactagggaacccactgcttaagcctcaataaagcttgccttgagtgcttcaagtagtgtgtgcccgtctgttgtgtgactctggtaactagagatccctcagacccttttagtcagtgtggaaaatctctagcagtagtagttcatgtcatcttattattcagtatttataacttgcaaagaaatgaatatcagagagtgagaggaacttgtttattgcagcttataatggttacaaataaagcaatagcatcacaaatttcacaaataaagcatttttttcactgcattctagttgtggtttgtccaaactcatcaatgtatcttatcatgtctggctctagctatcccgcccctaactccgcccatcccgcccctaactccgcccagttccgcccattctccgccccatggctgactaattttttttatttatgcagaggccgaggccgcctcggcctctgagctattccagaagtagtgaggaggcttttttggaggcctagggacgtacccaattcgccctatagtgagtcgtattacgcgcgctcactggccgtcgttttacaacgtcgtgactgggaaaaccctggcgttacccaacttaatcgccttgcagcacatccccctttcgccagctggcgtaatagcgaagaggcccgcaccgatcgcccttcccaacagttgcgcagcctgaatggcgaatgggacgcgccctgtagcggcgcattaagcgcggcgggtgtggtggttacgcgcagcgtgaccgctacacttgccagcgccctagcgcccgctcctttcgctttcttcccttcctttctcgccacgttcgccggctttccccgtcaagctctaaatcgggggctccctttagggttccgatttagtgctttacggcacctcgaccccaaaaaacttgattagggtgatggttcacgtagtgggccatcgccctgatagacggtttttcgccctttgacgttggagtccacgttctttaatagtggactcttgttccaaactggaacaacactcaaccctatctcggtctattcttttgatttataagggattttgccgatttcggcctattgg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[0297] LV-PL4-GTIIC：：CD
[0298] GTIIC硬度感测启动子：Addgene 34615：8xGTIIC-荧光素酶(Dupont，Nature，2011)
[0299] 输注引物：
[0300] (SEQ ID NO：8)Fw：AATTTTATCGGGATCCCGAGCTCTTACGCGTGCTA
[0301] (SEQ ID NO：9)Rv：CGATGTATACGGATCCtttatATCGTCCCACGGAGCG
[0302] FCY：：FUR(融合的胞嘧啶脱氨酶(CD))：pSelect-zeo-Fcy：：Fur，InvivoGen，Inc.目录号：psetz-fcyfur
[0303] 输注引物：
[0304] (SEQ ID NO：10)Fw：ggtggtatcgatgccaccATGGTCACAGGAGGC
[0305] (SEQ ID NO：11)Rv：ggtggtatcgatAGCTAGCTCAGGTTTAGACACAGTAG
[0306] 无启动子载体(GenTarget，Inc目录号LV-PL4)(SEQ ID NO：12)
[0307]ggatccCGAGCTCTTACGCGTGCTAGCCCGGGCTAGCCCGGCCAGTGCCAAGTTGAGACACATTCCACACATTCCACTGCAAGCTTGAGACACATTCCACACATTCCACTGCAAGCTTGGCCAGTGCCAAGTTGAGACACATTCCACACATTCCACTGCAAGCTTGAGACACATTCCACACATTCCACTGCAAGCTTCTAGAGATCTGCAGGTCGAGGTCGACGGTATCGATAAGCTTGGGGGTGGGCGCCGGGGGGACCTTAAAGCCTCTGCCCCCCAAGGAGCCCTTCCCAGACAGCCGCCGGCACCCACCGCTCCGTGGGACGATataaagGATCCGTATACATcgatgccaccATGGTCACAGGAGGCATGGCTTCAAAGTGGGACCAGAAGGGCATGGACATTGCCTATGAGGAGGCTGCTCTGGGCTACAAGGAGGGAGGGGTCCCAATTGGTGGCTGCCTCATCAACAACAAGGATGGCAGTGTCCTGGGCAGGGGCCACAACATGAGGTTCCAGAAGGGCAGTGCCACCCTGCATGGGGAGATCAGCACCCTGGAGAACTGTGGCAGGCTGGAGGGCAAGGTCTACAAGGACACCACTCTGTACACCACCCTCAGCCCTTGTGACATGTGCACAGGGGCCATCATCATGTATGGCATTCCCAGGTGTGTGGTGGGAGAGAATGTCAACTTCAAGTCAAAAGGAGAGAAGTACCTCCAGACCAGGGGCCATGAGGTGGTTGTGGTGGATGATGAGAGGTGCAAGAAGATTATGAAGCAGTTCATTGATGAGAGACCCCAGGACTGGTTTGAGGACATTGGGGAGGCCTCTGAGCCCTTCAAGAATGTGTACCTCCTCCCCCAGACCAACCAACTCCTGGGACTCTACACCATCATCAGGAACAAGAACACCACCAGGCCAGACTTCATCTTCTACAGTGACAGGATCATCAGGCTCCTGGTGGAGGAGGGCCTCAACCACCTCCCTGTGCAGAAGCAGATTGTGGAGACTGACACCAATGAGAACTTTGAGGGAGTGTCTTTCATGGGCAAGATTTGTGGGGTGTCCATTGTGAGGGCTGGGGAGAGCATGGAGCAGGGCCTGAGGGACTGTTGCAGGAGTGTGAGGATTGGCAAGATCCTGATCCAGAGGGATGAGGAGACTGCCCTGCCCAAGCTGTTCTATGAGAAGCTCCCTGAAGACATCTCTGAGAGGTATGTCTTCCTCCTGGACCCCATGCTGGCAACTGGAGGCTCTGCAATCATGGCCACTGAGGTGCTCATCAAGAGGGGAGTCAAGCCTGAGAGGATCTACTTCCTCAACCTCATCTGCTCAAAGGAGGGCATTGAGAAGTACCATGCTGCCTTCCCTGAAGTGAGGATTGTCACTGGGGCTCTGGACAGGGGCCTGGATGAGAACAAGTACCTGGTCCCTGGCCTGGGAGACTTTGGGGACAGATACTACTGTGTCTAAACCTGAGCTAGCTatcgatgggcccactagtgtcgacgctagctctagatgtacaaagtggtgctagcactctcagtacaatctgctctgatgccgcatagttaagccagtatctgctccctgcttgtgtgttggaggtcgctgagtagtgcgcgagcaaaatttaagctacaacaaggcaaggcttgaccgacaattgcatgaagaatctgcttagggttaggcgttttgcgctgcttcgcgatgtacgggccagatatacgcgtatctgaggggactagggtgtgtttaggcgaaaagcggggcttcggttgtacgcggttaggagtcccctcaggatatagtagtttcgcttttgcatagggagggggaaatgtagtcttatgcaatactcttgtagtcttgcaacatggtaacgatgagttagcaacatgccttacaaggagagaaaaagcaccgtgcatgccgattggtggaagtaaggtggtacgatcgtgccttattaggaaggcaacagacgggtctgacatggattggacgaaccactgaattccgcattgcagagatattgtatttaagtgcctagctcgatacaataaacgccatttgaccattcaccacattggtgtgcacctccaaagcgctcaccatgaccgagtacaagcccacggtgcgcctcgccacccgcgacgacgtccccagggccgtacgcaccctcgccgccgcgttcgccgactaccccgccacgcgccacaccgtcgatccggaccgccacatcgagcgggtcaccgagctgcaagaactcttcctcacgcgcgtcgggctcgacatcggcaaggtgtgggtcgcggacgacggcgccgcggtggcggtctggaccacgccggagagcgtcgaagcgggggcggtgttcgccgagatcggcccgcgcatggccgagttgagcggttcccggctggccgcgcagcaacagatggaaggcctcctggcgccgcaccggcccaaggagcccgcgtggttcctggccaccgtcggcgtctcgcccgaccaccagggcaagggtctgggcagcgccgtcgtgctccccggagtggaggcggccgagcgcgccggggtgcccgccttcctggagacctccgcgccccgcaacctccccttctacgagcggctcggcttcaccgtcaccgccgacgtcgaggtgcccgaaggaccgcgcacctggtgcatgacccgcaagcccggtgcctgaactagttaggtttaaacacgcgtaccggttagtaatgatcgacaatcaacctctggattacaaaatttgtgaaagattgactggtattcttaactatgttgctccttttacgctatgtggatacgctgctttaatgcctttgtatcatgctattgcttcccgtatggctttcattttctcctccttgtataaatcctggttgctgtctctttatgaggagttgtggcccgttgtcaggcaacgtggcgtggtgtgcactgtgtttgctgacgcaacccccactggttggggcattgccaccacctgtcagctcctttccgggactttcgctttccccctccctattgccacggcggaactcatcgccgcctgccttgcccgctgctggacaggggctcggctgttgggcactgacaattccgtggtgttgtcggggaagctgacgtcctttccatggctgctcgcctgtgttgccacctggattctgcgcgggacgtccttctgctacgtcccttcggccctcaatccagcggaccttccttcccgcggcctgctgccggctctgcggcctcttccgcgtcttcgccttcgccctcagacgagtcggatctccctttgggccgcctccccgcctggcgatggtacctttaagaccaatgacttacaaggcagctgtagatcttagccactttttaaaagaaaaggggggactggaagggctaattcactcccaacgaagacaagatctgctttttgcttgtactgggtctctctggttagaccagatctgagcctgggagctctctggctaactagggaacccactgcttaagcctcaataaagcttgccttgagtgcttcaagtagtgtgtgcccgtctgttgtgtgactctggtaactagagatccctcagacccttttagtcagtgtggaaaatctctagcagtagtagttcatgtcatcttattattcagtatttataacttgcaaagaaatgaatatcagagagtgagaggaacttgtttattgcagcttataatggttacaaataaagcaatagcatcacaaatttcacaaataaagcatttttttcactgcattctagttgtggtttgtccaaactcatcaatgtatcttatcatgtctggctctagctatcccgcccctaactccgcccatcccgcccctaactccgcccagttccgcccattctccgccccatggctgactaattttttttatttatgcagaggccgaggccgcctcggcctctgagctattccagaagtagtgaggaggcttttttggaggcctagggacgtacccaattcgccctatagtgagtcgtattacgcgcgctcactggccgtcgttttacaacgtcgtgactgggaaaaccctggcgttacccaacttaatcgccttgcagcacatccccctttcgccagctggcgtaatagcgaagaggcccgcaccgatcgcccttcccaacagttgcgcagcctgaatggcgaatgggacgcgccctgtagcggcgcattaagcgcggcgggtgtggtggttacgcgcagcgtgaccgctacacttgccagcgccctagcgcccgctcctttcgctttcttcccttcctttctcgccacgttcgccggctttccccgtcaagctctaaatcgggggctccctttagggttccgatttagtgctttacggcacctcgaccccaaaaaacttgattagggtgatggttcacgtagtgggccatcgccctgatagacggtttttcgccctttgacgttggagtccacgttctttaatagtggactcttgttccaaactggaacaacactcaaccctatctcggtctattcttttgatttataagggattttgccgatttcggcctattggttaaaaaatgagctgatttaacaaaaatttaacgcgaattttaacaaaatattaacgcttacaatttaggtggcacttttcggggaaatgtgcgcggaacccctatttgtttatttttctaaatacattcaaatatgtatccgctcatgagacaataaccctgataaatgcttcaataatattgaaaaaggaagagtatgagtattcaacatttccgtgtcgcccttattcccttttttgcggcattttgccttcctgtttttgctcacccagaaacgctggtgaaagtaaaagatgctgaagatcagttgggtgcacgagtgggttacatcgaactggatctcaacagcggtaagat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在专利项目中使用的其它质粒和吸引人的序列：
[0309] 萤火虫荧光素酶-红色荧光蛋白(Fluc-RFP)融合蛋白：pcDNA3.1(+)/Luc2＝tdT，Addgene 43904
[0310] 人源化Gaussia荧光素酶(hGluc)：pSV40Gluc质粒，New England BioLabs,Inc.目录号：N0323S。
[0311] 基质金属肽酶1(MMP1):MMP1(NM_002421)人cDNA ORF克隆，Origene Technology,Inc目录号：RG202460
[0312] β-半乳糖苷酶：pOPINVL,Addgene 26040
[0313] 实施例2：用于癌症血液检验的干细胞方法：
[0314] 引言
[0315] 癌症是人发病和死亡的主要原因，并且其起源、生物标志物和检测仍难以精确找到[5]。虽然早期检测已经被证明是有效管理和治疗癌症的有用和通常必要的第一步[27]，但在早期鉴定癌症(尤其是占90％以上的癌症死亡率小的肿瘤和转移灶)仍然是一个挑战[6,28]。基于成像的癌症检测方法是非侵入性的，但常见的缺点包括高成本、低特异性或分辨率，以及使用潜在刺激性造影剂的使用[27]。例如，正电子发射断层摄影(PET)、计算机断层摄影(CT)及其组合(PET-CT)被广泛用于对肿瘤鉴定和分期，但需要高剂量的电离辐射并具有有限的特异性和分辨率[29]。其它成像方式，诸如磁共振成像(MRI)和超声波，不使用辐射，但仍然无法实现小于数毫米的空间分辨率[30,31]。另一方面，组织活检是侵入性的，并且受困于对异质性肿瘤呈假阴性，并且从多个小的弥散性肿瘤(例如，转移灶)获得活检标本是不切实际的。癌症筛查还利用生物标志物(包括循环肿瘤细胞、外来体、蛋白质和核酸)的检测。最近，科学家已开发了基于纳米颗粒的合成生物标志物，其由可在肿瘤蛋白酶切割后释放、随后在尿液中检测的大量编码的(mass-encoded)肽[32,33]组成。然而，此类方法仍然依赖于经由增强的通透性和滞留(EPR)效应进行的纳米颗粒至癌症的被动递送，以及依赖于有限类型的内源性蛋白(所述两者都是癌症类型特异性的)。然而，癌症生物标志物的发现只导致了临床诊断中使用的少数几种生物标志物，因为癌症生物标志物常常受困于低灵敏度和特异性[34]。
[0316] 特别地，癌症异质性和进化使得依赖分子生物标志物进行癌症检测成为挑战[5]。例如，常用的前列腺癌的癌症生物标志物前列腺特异性抗原(PSA)和乳腺癌的BRCA1/2基因突变分别只能鉴定每种癌症类型中的约25％和10％至25％的患者[35-37]。事实上，已经广泛接受的是，单个生物标志物通常缺乏有用诊断所必需的灵敏度和特异性。有趣的是，最近的研究表明大多数癌症是由随机事件引起的，而不是可预测的突变引起的[38]。因此，寻找识别不具有共同遗传基础的多种类型的癌症的生物标志物可能不如以前认为的有前途。总之，存在对灵敏的早期癌症和转移性测试的显然未得到满足的临床需要，所述测试可以不依赖于来自健康对照和共有类似症状(例如，炎症)的其它病况的特定生物标志物，”普遍”鉴定许多类型的癌症，以及区分不同(亚)类型的处于不同阶段的癌症。
[0317] 细胞，包括免疫细胞和干细胞，用作自主和适应剂，并且这些性质最近已被用于癌症治疗和药物递送[15,39-41]。特别地，由于其内在的再生和免疫调节特征，间充质干(或基质)细胞(MSC)已被测试为治疗剂[16,19,42-45]。正在研究MSC治疗各种疾病，包括糖尿病、心肌梗塞、中风和自身免性疫疾病[2,46,47]。MSC也是世界上第一个获得临床批准的制造的干细胞产品(即，由Osiris制造的 在加拿大被批准用于治疗移植物抗宿主病(GvHD)[47]
) ，表明它们可以是用于人中诊断和治疗用途的安全来源。重要的是，全身性输注的MSC优先归巢于肿瘤并与其整合，所述肿瘤包括不同解剖位置中的原发性肿瘤和转移灶[2]。正如我们最近已综述的[16]，现在越来越多的证据表明，MSC拥有涉及各种粘附分子(如，P-选择蛋白和VCAM-1)以及肿瘤衍生的细胞因子、趋化因子和生长因子(例如，CXCL12和PDGF)的用于肿瘤向性的白细胞样主动归巢机制。这种选择性和主动归巢能力使MSC成为用于在正在进行的临床试验中局部递送治疗剂以治疗癌症(包括神经胶质瘤、黑色素瘤、乳腺癌和肺转移)的吸引人的载体[2,39]。另外，用探针(如荧光素酶)工程化的MSC已被用于对肿瘤进行原位检测和成像[43,48]。然而，目前用于注射后细胞追踪的成像方法诸如PET/SPECT和MRI受到癌症检测的相同的上述缺点限制[43]。
) ，表明它们可以是用于人中诊断和治疗用途的安全来源。重要的是，全身性输注的MSC优先归巢于肿瘤并与其整合，所述肿瘤包括不同解剖位置中的原发性肿瘤和转移灶[2]。正如我们最近已综述的[16]，现在越来越多的证据表明，MSC拥有涉及各种粘附分子(如，P-选择蛋白和VCAM-1)以及肿瘤衍生的细胞因子、趋化因子和生长因子(例如，CXCL12和PDGF)的用于肿瘤向性的白细胞样主动归巢机制。这种选择性和主动归巢能力使MSC成为用于在正在进行的临床试验中局部递送治疗剂以治疗癌症(包括神经胶质瘤、黑色素瘤、乳腺癌和肺转移)的吸引人的载体[2,39]。另外，用探针(如荧光素酶)工程化的MSC已被用于对肿瘤进行原位检测和成像[43,48]。然而，目前用于注射后细胞追踪的成像方法诸如PET/SPECT和MRI受到癌症检测的相同的上述缺点限制[43]。
[0318] 外源性MSC可用作简单的癌症血液检验的基础(图7)。提供了用分泌的报告子工程化的MSC，无论肿瘤的类型和位置如何，所述MSC都可主动且特异性地归巢于肿瘤位点，并且与健康微环境中的MSC相比，在其中持续更长的时间。向荷乳腺癌细胞的小鼠全身性施用经工程化以表达人源化Gaussia荧光素酶(hGluc)[49-52]的MSC，所述MSC表现出肿瘤向性和持久性，并将hGluc分泌至荷瘤小鼠的血流中。因此，提供了用分泌的报告子工程化的MSC，以用作用于广泛癌症筛查和监测的血液检验。
[0319] 材料和方法
[0320] 细胞系和细胞培养
[0321] 人骨髓MSC获自得克萨斯A&M健康科学中心(Texas A&M Health Science Center)，并被扩增至3-6代内。将细胞在37℃下于含有5％CO2的加湿孵育箱中常规地维持在补充有15％胎牛血清(FBS,Atlanta Biologicals,GA)和1％青霉素-链霉素(PenStrep,100U/ml,Life Technologies)的最低必需培养基α(MEMα，Life Technologies)中。人乳腺癌细胞系MDA-MB-231获自美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)(ATCC，VA)。将这些细胞在无CO2的加湿孵育箱中于37℃下生长在含有L-谷氨酰胺(Corning，NY)并且补充有10％FBS和1U/ml PenStrep的莱博维茨氏L-15培养基(Leibovitz’s L-15medium)中。将293T-LV细胞系(Gen Target，CA)在37℃下于含有5％CO2的加湿孵育箱中培养在补充有15％FBS、非必需氨基酸(NEAA,1X,100U/ml,Life Technologies)和1U/ml PenStrep的杜尔贝科氏改良伊格尔培养基(Dulbecco’s Modified Eagle Medium)(DMEM，Life Technologies)中。
[0322] 慢病毒载体的产生
[0323] 本研究中使用以下慢病毒载体：LV-eGFP、LV-Fluc-RFP和LV-hGluc。将来自pUCBB-eGFP(Addgene#32548)、pcDNA3.1(+)/Luc2＝tdT(Addgene#32904)和pSV40-Gluc(New England BioLabs)的目标序列克隆入无启动子慢病毒转移载体LV-PL4(GenTarget,CA)中。
[0324] 慢病毒转导
[0325] 使用 LTX和PLUSTM试剂(Life Technologies)将所有慢病毒构建体在293T-LV细胞[53]中包装(pMD2.G,Addgene#12259；pRSV-Rev,Addgene#12253；pMDLg/pRRE,Addgene#12251)为慢病毒(LV)载体。通过在含有100μg/ml硫酸鱼精蛋白(Sigma)的培养基中孵育病毒体用LV转导MSC和乳腺癌细胞。在用含有10μg/ml嘌呤霉素(MP Biomedicals,CA)的培养基选择后，使用荧光显微术显示细胞的荧光蛋白表达。
[0326] 体外生物发光测定
[0327] 将表达萤火虫荧光素酶(Fluc)的LV-Fluc-RFP MSC(Fluc-RFP-MSC)或表达人源化Gaussia荧光素酶(hGluc)的LV-hGluc MSC(hGluc-MSC)以连续稀释的浓度接种。在用PBS(Lonza)洗涤细胞后，添加荧光素酶底物(150μg/ml D-荧光素对于Fluc,Perkin Elmer,MA或20μM腔肠素(CTZ)对于hGluc,NanoLight Technologies,AZ)，然后如先前所述对Fluc和hGluc的活性进行成像[54]。收获hGluc-MSC的条件培养基(CM)并过滤。然后将5μl CM与人血清(Atlanta Biologicals,GA)混合(在将其用或不用PBS稀释至0％、5％、50％或100％的终血清浓度的情况下)，在37℃下在指定的不同时间孵育，并用20μM CTZ(200μl的终体积中的终浓度)测定hGluc活性。如所描述的[55]收集小鼠血液，并添加至1/4体积的EDTA(Sigma)溶液(50mM，pH＝8.0)中。将5μl血液与100μl的100μM CTZ混合，并立即测量hGluc活性。使用IVIS Lumina(Caliper LifeSciences,MA)或读板仪(BioTek,VT)进行所有生物发光测定。以一式三份测量所有上述样品。
[0328] 细胞移植和体内成像
[0329] 将0.5x 106个(2.5x 106/ml，于DPBS中)LV-Fluc-RFP MDA-MB-231(Fluc-RFP-231)或LV-eGFP MDA-MB-231(eGFP-231)乳腺癌细胞静脉内(i.v.)植入NOD-SCIDγ(NSG)小鼠(5[56]周，#005557,The Jackson Laboratory)中。5周后，如所描述的 ，测量来自Fluc-RFP-231细胞的体内Fluc活性。简言之，在将D-荧光素(150mg/kg，于DPBS中,Lonza)腹膜内(i.p.)注射至小鼠中后10分钟，用IVIS Lumina对体内Fluc信号进行成像。将1x 106个hGluc-MSC或Fluc-RFP-MSC(5x106/ml，于DPBS中)全身性输注至荷乳腺癌细胞的小鼠中和输注至健康对
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照小鼠中。通过在37℃下孵育20分钟，用Dil亲脂性染料(5μl/10 个细胞，Life Technologies)标记hGluc-MSC，然后进行输注。用2至3％的异氟烷(Western Medical Supply,CA)麻醉小鼠，并在指定的时间点测量体内Fluc活性。使用IVIS Lumina进行成像(在每种情况下n＝4)。所有动物实验和程序均经加利福尼亚大学尔湾分校(University of California,Irvine)(UCI)动物护理和使用委员会(Institution of Animal Care and Use Committee)批准(IACUC协议号2012-3062)后进行，并根据动物福利保障(Animal Welfare Assurance)(#A3416.01)进行。
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照小鼠中。通过在37℃下孵育20分钟，用Dil亲脂性染料(5μl/10 个细胞，Life Technologies)标记hGluc-MSC，然后进行输注。用2至3％的异氟烷(Western Medical Supply,CA)麻醉小鼠，并在指定的时间点测量体内Fluc活性。使用IVIS Lumina进行成像(在每种情况下n＝4)。所有动物实验和程序均经加利福尼亚大学尔湾分校(University of California,Irvine)(UCI)动物护理和使用委员会(Institution of Animal Care and Use Committee)批准(IACUC协议号2012-3062)后进行，并根据动物福利保障(Animal Welfare Assurance)(#A3416.01)进行。
[0330] 组织处理和免疫组织化学
[0331] 收集组织并在Tissue- O.C.TTM化合物(Sakura Finetek，CA)中快速冷冻，在4％多聚甲醛(Amresco,OH)中进行或不进行过夜固定，并在30％蔗糖溶液(Amresco,OH)中孵育过夜。通过低温恒温器获取8μm厚的切片，并按照免疫组织化学方案对eGFP(绵羊多克隆IgG，Pierce Biotechnology)和Fluc(兔多克隆IgG，Abcam)进行染色。简言之，将载玻片在丙酮(Thermo Fisher Scientific)中于-20℃下固定10分钟，在0.1％Triton X-100(Sigma)中透化10分钟，并在含有5％正常驴血清(Sigma)的0.1％Triton X-100中封闭30分钟。将第一抗体从原液以1:100稀释并在4℃下施加过夜。将载玻片在1X PBS中洗涤，然后将第二抗体(缀合于Alexa 488的驴抗绵羊IgG，缀合于Alexa 594的驴抗兔IgG，Jackson Immunoresearch,PA)从原液以1:500稀释，并在室温下施加30分钟。将载玻片在PBS中洗涤并用DPX(Sigma)或Fluoromount-G(Southern Biotech,AL)进行固定。将PBS中的DAPI(50μg/ml，Life Technologies)添加至载片上，然后进行固定。
[0332] 统计分析
[0333] 当比较2组时，通过学生t检验分析数据，并且当比较超过2组时，通过ANOVA分析数据。数据表示为平均值±SD或平均值±SEM，并且在P<0.05时，差异被认为是显著的。
[0334] 结果
[0335] 人源化Gaussia荧光素酶在体外从工程化的MSC分泌，并且在血液是稳定的。
[0336] 如上所述，用慢病毒稳定地转导人骨髓间充质干细胞(MSC)以表达分泌的人源化Gaussia荧光素酶(hGluc)。为了确定hGluc是否由MSC以活性形式分泌，在MSC以不同的浓度(100个、1000个、2500个或5000个细胞/cm2)接种后24小时从hGluc-MSC收获无细胞条件培养基(CM)。加入底物腔肠素(CTZ)，并测量两种细胞和CM的hGluc活性(图41A)。测量的hGluc活性随着细胞数量的增加而增加(图41A)。另外，CM中的hGluc活性为细胞内部的3-6倍(图41A)，表明由工程化的MSC表达的hGluc如预期的那样以活性形式分泌。用PBS连续稀释hGluc-MSC CM，并且在体外测量hGluc活性，并发现其呈现浓度的线性函数，与早期报道一致[54,57,58](图41B)。为了证明来自hGluc-MSC的荧光素酶活性在血液中是否是可检测的和足够稳定的，将人血清直接(100％)与hGluc-MSC CM混合，或将在PBS中连续稀释的人血清与hGluc-MSC CM混合。hGluc活性在24小时共孵育后保持可检测(P<0.0001)，并且hGluc活性随时间推移未显著降低(图41C)，表明hGluc-MSC在体外血液测定中可以是稳定的标志物。如报道，这两种荧光素酶是底物特异性的，并且没有观察到交叉反应。总体而言，这些数据显示，工程化的MSC表达的hGluc在体外分泌，在人血清中稳定长达24小时，并显示底物特异性酶活性。
[0337] 工程化的MSC归巢于肿瘤位点，并且相较于在荷瘤小鼠中持续更长时间。
[0338] 由于据报道MSC天然地归巢于肿瘤位点[42,43]，我们然后在我们的实验中测试了这一现象，作为使用分泌hGluc的MSC作为癌症检测和定位的诊断工具的初始步骤。用eGFP或Fluc-RFP标记人乳腺癌衍生的MDA-MB 231细胞，并将其静脉内(i.v.)植入免疫缺陷型NOD-SCIDγ(NSG)小鼠以建立乳腺癌的简单体内小鼠模型，所述乳腺癌已转移在肺中[59,60]。由于hGluc由MSC分泌，以及由于其在利用IVIS Lumina的整个动物成像条件下的稀释和有限的信号[61](数据未显示)，我们使用利用细胞内Fluc-RFP[62]工程化的MSC原位进行MSC在肿瘤中的实时成像和定位。Fluc-RFP-MSC同时用红色荧光蛋白(RFP)标记，以评估Fluc转导效率，并在随后的离体免疫组织化学中对任何共定位的MSC和肿瘤细胞进行成像。
[0339] 为了研究荷癌症的小鼠与健康小鼠之间的MSC归巢的任何差异，将1x106个Fluc-RFP-MSC全身性注射至具有或不具有乳腺癌的小鼠中。麻醉小鼠，并在于指定的时间点上将D-荧光素底物i.p.施用至小鼠中后测量体内Fluc活性。体内成像证明，在全身性施用后长达10天，MSC在荷瘤小鼠中是可检测的(图42A)。离体免疫组化数据证实，工程化的MSC在体内归巢于肿瘤小生境(图42C和43A)。正如我们所假设的，工程化的MSC在荷瘤肺中持续显著更长的时间，特别是在较后的时间点(图42A)，与在不同的癌症模型上进行的几个先前的研究一致[16,42]。然后我们定量Fluc信号，并发现荷瘤小鼠与无肿瘤小鼠之间的显著差异在MSC输注后24小时出现，并持续至输注后10天(图42D，n＝4，P<0.05)。这些结果表明，与无肿瘤肺相比，工程化的MSC可归巢于荷瘤肺和在其中停留显著更长的时间。因此，与健康动物相比，工程化的MSC在荷瘤动物中的体内持续性可为广泛的癌症检测提供可行的“标志物”。
[0340] 可在荷瘤小鼠的血液中测定MSC分泌的hGluc。
[0341] 我们接下来研究了经工程化以表达hGluc的MSC是否可用于检测乳腺癌至肺的转移。由于其高灵敏度、缺乏与其它底物的非特异性交叉反应性以及在宽浓度范围内的线性信号，因此选择hGluc作为本研究中的报告子(图41B)。另外，hGluc具有短的体内半衰期(20分钟)，这允许进行反复实时测试而无需过多的信号积累，但较长的体外半衰期(6天)，允许方便的样品储存[54]。由于hGluc是分泌的，因此其不能用作共定位MSC和肿瘤的标志物，如在图42C中对于细胞内Fluc看到的。因此，在这组实验中，我们用Dil亲脂性染料对hGluc-MSC进行了染色，然后将其i.v.输注至小鼠中。与Fluc-RFP-MSC一样，可在输注后达10天在肿瘤小生境中检测到Dil-MSC(图43A)。在指定的时间点收集小鼠血液，并测量hGluc活性。虽然如所预测检测到的信号随着时间的推移迅速衰减，但是始于MSC施用后48小时并持续至输注后10天(图43B)，荷瘤小鼠与无肿瘤小鼠之间血液中的hGluc的差异是显著的，表明全身性输注的hGluc-MSC可用于在该鼠模型中用于潜在开发用于癌症检测的简单血液测定。总之，这组数据支持使用具有分泌型hGluc的工程化的MSC作为癌症存在的血液检验的可行性。
[0342] 讨论
[0343] 癌症、特别是转移灶的早期检测，是有效治疗和消除癌症的必要和通常至关重要的第一步。常规成像工具和基于分子生物标志物的测定对于大多数癌症的常规筛查通常是复杂的、昂贵的和/或侵入性的；最重要的是，它们往往不具备在早期阶段鉴定异质性癌症的灵敏度和特异性。
[0344] 提供了基于干细胞的检测系统，其可通过用微创手术收集少量血液来检测癌症，包括转移灶。我们的工程化的MSC可归巢于肿瘤位点，并且与健康小鼠相比，可在其中持续存在显著更长的持续时间。与目前的成像示踪剂相比，源自工程化的干细胞的信号持续时间更长[29]，并且不需要重复施用。通过单次施用，可在长时间期间持续监测肿瘤的存在，从而使MSC成为用于实时癌症检测的便捷工具。与无细胞系统(例如，抗体和纳米颗粒)相比，MSC与肿瘤之间的天然相互作用涉及复杂的适应感测和响应系统，这使得能够更高效和更特异地报告癌症和转移灶。因此，这种肿瘤归巢的内在生物学性质潜在地允许我们的干细胞方法“普遍”鉴定许多癌症，而不管其起源、类型和解剖位点。另外，基于干细胞的探针递送还可避免与被动递送(即，通过直接施用或经由EPR效应的聚合物纳米颗粒)相关的许多障碍，包括穿透内皮和与肿瘤相关的增加的压力。因此，我们的简单无创的基于干细胞的血液检验可用于常规癌症筛查，检测小的肿瘤和转移灶，以及在治疗过程中监测癌症进展和复发。
[0345] 由于MSC不仅具有肿瘤向性，而且还具有对骨髓以及炎症和损伤位点的向性[19,44]，因此当使用基于MSC的方法检测癌症时，区分那些病况与癌症仍然很重要。另外，鉴于高度的癌症异质性，提供了用于用可激活的癌症类型特异性探针工程化MSC以提高测定特异性的系统。提供了可有效区分癌症(亚)类型和阶段以及区分癌症和共有类似症状(包括炎症和损伤)的其它病症的测试小组。
[0346] 选择MSC是因为它们可以容易地从多个成年组织[63](包括骨髓和脂肪)获得，因此避免了伦理问题。MSC在培养中也相对容易扩增，并且可被容易地工程化以表达功能性治疗剂或报告子[15,19]。重要的是，临床批准的 和数百个其它正在进行的临床试验已经证明，同种异体MSC对于在无严格免疫抑制方案的情况下在人中使用来说通常是安全的。尽管如此，由于MSC本身可参与癌症进展或消退，[16]因此需要进一步考虑。MSC与癌症之[15,16]间的相互作用仍然不完全清楚 ，不同的报告表明来自内源性和外源性MSC对癌症进展的冲突发现[16,64,65]。因此，可能需要安全性测试和优化来更好地控制癌症检测后我们的工程化的MSC的命运。为了减轻这个潜在的问题，例如，可将自杀基因[24]工程化至我们的基于MSC的系统中，以便在完成癌症检测测试后，可使用外源性施用的药物来消除剩余的工程化的MSC。此外，我们的系统还可用作与其它治疗组合的伴随诊断，例如，鉴定某些患者和监测副作用。最后，提供了基于细胞的血液测定，其是用于监测移植的细胞的命运和功能以及用于评估它们所在的体内微环境的新平台。
[0347] 结论
[0348] 提供了使用MSC的天然肿瘤归巢能力进行癌症检测的简单血液检验，以进一步工程化它们以用最佳生物相容性和动力学参数表达分泌型报告子或标志物，例如荧光素酶。与我们目前的鼠研究类似，这些“报告子MSC”可被开发用于鉴定人中小的肿瘤或转移灶的存在，否则这些肿瘤或转移灶不能被现有成像模式检测到。我们希望这种简单的“现成”的基于同种异体干细胞的诊断测试可用于常规筛查、检测和监测癌症。
[0349] 实施例3
[0350] 瘢痕消除者：研究、检测和处理组织纤维化的机械响应性细胞系统
[0351] 背景：关于组织纤维化的目前问题
[0352] 纤维化是通常在身体中作为对损伤的响应形成的过度的纤维结缔组织，即瘢痕形成。纤维化可作为正常愈合过程的一部分形成，其中细胞放置细胞外基质(ECM)以闭合伤口，然后在稍后阶段溶解纤维化，以用新的功能组织代替其。相反，由于许多疾病过程诸如感染或自身免疫响应，因此可能形成病理性纤维化。在该情况下，没有解决愈合过程，且剩余的ECM仍然存在。这种瘢痕组织通常比正常组织硬许多倍并且不具功能性，甚至可能阻碍周围组织的正常功能，从而潜在地导致器官衰竭和死亡[66]。
[0353] 身体中的大多数器官可受到病理性纤维化影响。归因于组织纤维化的并发症的一些常见病况包括特发性肺纤维化、心力衰竭、肝硬化和器官移植后的肾衰竭。纤维化也是医疗植入物和生物材料领域的一个问题，其中身体对异物的反应可能导致永久性炎症和瘢痕形成[67]。
[0354] 目前，病理组织纤维化的特异性治疗方法非常少(如果有的话)。大多数只是防止进一步损伤的方法，诸如一般抗炎和免疫抑制药物。更严重的纤维化病况诸如特发性肺纤维化通常会在几年内导致器官衰竭和死亡。因此，非常需要更有针对性和有效的方法来处理组织纤维化。
[0355] 提供了特异性靶向和治疗组织纤维化的工程化的细胞。特别地，由于几种固有特性，间充质干细胞(MSC)用于此目的。MSC具有免疫豁免性，相对容易地从多个组织来源获得，具有至炎症位点的天然归巢，并且可分泌有帮助的抗纤维化和抗炎因子。此外，MSC存在异位组织形成或对健康组织的损伤的机会较低。
[0356] 与天然细胞相比，工程化的MSC可实现更特异的靶向并且可表达更有用的因子。具体对组织纤维化而言，MSC可被工程化来表达蛋白质，诸如在正常组织重塑中天然分解ECM的基质金属蛋白酶(MMP)。在慢性病理性纤维化病例中，缺乏分解ECM并解决纤维化愈合事件的天然过程。因此，MSC可用于原位靶向和递送治疗性蛋白以溶解多余的瘢痕组织。
[0357] 提供了经工程化以表达基质金属蛋白酶-1(MMP-1)或胶原酶1(一个已知其分解间质胶原的MMP家族的成员)的MSC。几项研究已经显示出MMP-1对组织纤维化的治疗益[68-70]处 。然而，这些先前的研究的大多集中在转基因实验而不是直接递送，因此缺乏特异性和靶向效应。硬度感测启动子将允许工程化的细胞仅在与硬的纤维化组织的接触中选择性激活MMP-1的表达。这将允许进行组织纤维化的体内特异性检测和靶向治疗(图44)。
[0358] 提供了平台技术，所述技术将允许细胞用许多其它因子进行工程化，所述因子也已在治疗组织纤维化中显示前景，诸如肝细胞生长因子(HGF)、MMP家族的其它成员、TGF-β等。
[0359] 提供的工程化的细胞可特异性地靶向和递送治疗性蛋白质以溶解过度的组织纤维化，从而改善器官功能。
[0360] 实验设计
[0361] 体外研究：
[0362] 提供了通过插入治疗性基因(通过如图2中看到的转染)工程化的的细胞。为了验证工程化的细胞的特异性激活，还可将MSC工程化以表达在硬度感测启动子之后的报告子基因，诸如绿色荧光蛋白(GFP)。然后，可将MSC可涂铺在硬和软的基底上，并对报告子的存在进行成像。成功地工程化的细胞应当只在硬的基底上激活报告子，从而激活治疗性基因。在体内，这将翻译成只在组织的纤维化区域而非健康的无瘢痕组织上分泌MMP-1的工程化的MSC。
[0364] 为了测试工程化的MSC中的MMP的蛋白质表达水平，从经工程化以过表达和分泌MMP-1的MSC收集条件培养基。使用ELISA定量培养基中的蛋白质水平。图53显示，与天然MSC相比，MMP-1在工程化的细胞中的表达水平高得多。可使用蛋白质印迹和qPCR定量mRNA表达。可使用对于MMP-1是特异的基于FRET的测定来测量酶活性的功能测定。
[0365] 体内研究：
[0366] 由于纤维化可影响大多数器官，因此提供了几种动物模型来测试工程化的细胞对体内纤维化的影响。一些模拟人体组织纤维化的鼠模型是博来霉素诱导的肺纤维化、异丙肾上腺素诱导的全局性心脏纤维化(global cardiac fibrosis)和四氯化碳(CCl4)诱导的肝纤维化。
[0367] 可以使用IVIS Lumina进行体内实时成像，以显示输注的MSC至目标器官的定位。在肝纤维化的鼠模型中，首先用CCl4注射小鼠以诱导纤维化形成，持续6周。然后，经由门静脉注射表达萤火虫荧光素酶的MSC，并在接下来的72小时内对小鼠进行活体成像，以追踪细胞的归巢和滞留。图54显示注射后细胞保留在肝脏中至少2天。
[0368] 可经由PCR在体内输注细胞后确认治疗性基因表达。组织学可用于经由结缔组织染色(诸如马松式三色(Masson’s Trichrome)或天狼星红)定量纤维化的程度。免疫组织学研究可证实输注的MSC和纤维化区域的共定位。二次谐波发生(SHG)成像也可用于确定组织内纤维化的定位和程度。纤维化组织对比健康组织的机械性能可用原子力显微术(AFM)来表征。
[0369] 实施例4：细胞追踪器：使用利用IC 3D的血液检验的细胞状态追踪系统[0370] 细胞移植的当前问题
[0371] 目前的技术无法在长时间内准确地实时监测体内细胞的状态(即移植后MSC的细胞命运)，并且不可能精确地确定移植后细胞的位置、功能、活性、存在，从而系统的扰动是不可用的。另外，许多程序需要较长的时间来确定移植是否成功(即，HSC移植)。例如，造血干细胞移植(HSCT)平均需要28天来确定程序的成功，这缩短了用于挽救第一次移植失败的可能的第二次移植的窗口。因此，存在对移植后追踪细胞的状态的急迫的临床需求。
[0372] 提供了可以最小侵入性监测移植的干细胞的命运和功能的系统，用于最少数量的细胞的超灵敏检测，可在长时间内监测并且没有不利影响。示例性实施方案概述于图7中；例如，用在特异性启动子(即，用于硬度感测的YAP/TAZ)之后的外源可溶性报告酶对细胞进行工程化。在将工程化的干细胞移植至患者体内后，报告酶将在细胞归巢于特定小生境(例如，肿瘤小生境)后表达，并将酶分泌到血液中，这可以用血液检验来检测。将血液检验与超灵敏检测方法诸如集成式综合数字液滴检测(IC 3D)相耦合。将血液样品分隔成在油中的皮升尺寸的液滴，每个液滴中含有一种酶或不含酶，并且含有报告酶的液滴将与其特异性发荧光底物反应。可用3D粒子计数器检测荧光液滴。因此，可通过简单的血液检验来实时监测移植细胞的存在和功能。除了细胞存在以外，该系统还可用于追踪移植后细胞的谱系和命运(图45)。用不同谱系特异性分泌的可溶性报告子对细胞进行工程化。将工程化的细胞输注至患者体内。在细胞归巢于特定的小生境并将报告子分解至血液中后，收集一小部分血液。然后将收集的血液与不同的对于每种报告子是特异性发荧光底物一起封装在皮升尺寸的液滴中。由于报告子的存在，液滴将变成发荧光的，且荧光的颜色反映细胞谱系。例如，用在每个谱系特异性启动子(例如，骨启动子-Gluc、肌肉启动子-HRP等)之后的不同的外源可溶性报告酶对干细胞进行工程化。特异性报告酶将在干细胞分化成相应的细胞谱系后表达(例如，当干细胞分化成骨细胞等时表达Gluc)并从细胞中分泌出来。在将工程化的干细胞移植至接受者中后，可通过血液中分泌的报告酶的血液检验来监测细胞的分化和谱系比率。将血液检验与超灵敏检测方法诸如集成式综合数字液滴检测(IC 3D)耦合。将血液样品分隔成在油中的皮升尺寸的液滴，每个液滴中含有一种酶或不含酶，并且含有报告酶的液滴将与其特异性发荧光底物反应。可用3D粒子计数器检测荧光液滴。
[0373] 先前已经证明了IC 3D具有低至每毫升1个分子的检测灵敏度。将试剂(例如，含有靶标的血液样品和靶标的传感器)在油中混合，产生包含一个靶标或不含靶标的皮升尺寸的油包水液滴。在含靶标的液滴中，传感器和靶标将反应并产生荧光产物。可用3D粒子计数器检测荧光液滴，以确定荧光液滴的数量，该数量对应于原始样品中包含的靶标数量。假设一个干细胞可能产生1000个报告子，则10个干细胞将产生每毫升约1至10个报告子。目前的技术(例如，流式细胞术)不能检测到体内10个干细胞的存在，而我们的可溶性报告子IC 3D系统能够检测到每毫升血液1-10个分子。另外，大多数干细胞(即，MSC、NSC)归巢于其小生境，并且在移植后变得不可移动，这使得它们不能用于大多数当前的检测方法。
[0374] 提供了使用可溶性报告子的方法，例如血液检验，所述方法在血液样品中可准确地评估细胞状态，并且这种血液检验比当前方法(例如，流式细胞术，PCR等)更灵敏。
[0375] 实验设计
[0376] 为了实现检测系统，关键组成部分之一是工程化至细胞中的外源性酶。报告酶的要求是它们必须是外源性的、高活性的、非致病性的，具有合适的半衰期。我们已鉴定了一组具有上述特性的酶，包括大肠杆菌(E.coli)β-半乳糖苷酶(大肠杆菌β-gal)和辣根过氧化物酶(HRP)。这两种酶已被用于体内研究而无毒性报告，并且已经用单酶活性测定法验证。我们已用针对人血清具有交叉反应性表征了大肠杆菌β-半乳糖苷酶，并发现人血清与大肠杆菌β-gal或荧光素二-β-D-吡喃半乳糖苷(FDG)(大肠杆菌β-gal的底物)没有交叉反应性。
[0377] 接下来，将大肠杆菌β-gal克隆入具有组成型启动子(例如β-肌动蛋白)的转导载体中，将其用于工程化小鼠HSC。将工程化的HSC移植至其骨髓已经用5-氟尿嘧啶(5-FU)致死性耗竭的接受小鼠中。移植后，连续监测大肠杆菌β-gal含量，并将其与流式细胞术数据进行比较，以验证平台。
[0378] 在验证平台之后，将多个报告酶工程化至干细胞中(每个报告酶在特异性谱系启动子之后)，以研究其它干细胞系统(例如，MSC、NSC、诱导的多能干细胞(iPSC)等)。
[0379] 实施例5：移植后造血干细胞植入的早期检测
[0380] 背景
[0381] 白血病是儿童中最常见的癌症，约占所有病例的30％[71]。来自紧密匹配的供体的含有造血干细胞(HSC)的骨髓的移植代表了儿童恶性肿瘤的最佳疗法[72]。然而，HSC移植(HSCT)可引起临床并发症。在4％的病例中发生HSC重建患者免疫系统失败[73]。
[0382] 移植失败的早期预测允许及时的第二HSCT或其它治疗干预。然而，目前的技术诸如流式细胞术需要2-4周来确定HSCT的成功或失败[74]，并且只能在回收后检测移植后嵌合性[75]，而不能精确地监测HSCT的早期失败。因此，存在对在移植后以微创方式早期追踪HSC状态的未得到满足的临床需求。目前的原位细胞成像方法(包括PET/SPECT和MRI)受到低特[76]异性、分辨率和潜在刺激性造影剂的使用的限制 。事实上，无法监测和操纵移植细胞在人中的命运仍然是成功的细胞移植的最大瓶颈。
[0383] 提供了超灵敏检测平台，例如，所谓的集成式综合数字液滴检测(IC 3D)，能够以单分子或单细胞灵敏度检测血液中的靶分子或细胞[77]。HSC可用于追踪HSCT，其将HSC谱系追踪与我们的IC 3D组合(图47)；具体地，可工程化HSC以成组成型表达分泌型β-半乳糖苷酶(β-gal)作为HSC的可溶性报告子，并且血液β-gal水平与HSC数量相关。还可在谱系特异性启动子(例如对于T细胞谱系，为CD3启动子-β-gal/FDG对，对于B细胞谱系，为Ig-E启动子HRP/QuantaBlu对)之后中用可溶性报告子对HSC进行工程化。可用上述IC 3D系统测定血液中的可溶性报告子水平。由于大量的报告酶可由一个细胞分泌，所以预期利用可溶性报告子可比目前的标准流式细胞术更早得多地检测到HSC植入和谱系重构。
[0384] 即使在体内单细胞水平上，移植细胞的功能也可使用示例性超灵敏血液测定来纵向监测，所述超灵敏血液测定测量针对特定细胞功能编码的分泌型探针。
[0385] 实验设计
[0386] 使用IC 3D检测血液中的可溶性报告子
[0387] IC 3D可在单分子水平上检测血液中的可溶性报告子，以及体外表征报告子(酶及其底物)。将使用大肠杆菌β-半乳糖苷酶(β-gal)，因为其先前已在体外[78]和体内[79]用单酶检测进行了证明，其中血浆半衰期短于60分钟[80]且可在采血后持续5小时[81]。
[0388] 提供了1)利用常规方法以及IC 3D的重组酶测定；IC 3D将报告酶-检测荧光传感器封装在皮升尺寸的液滴中，并用高通量液滴计数系统检测含有报告酶的液滴。我们的数据已表明可封装单个β-gal，并用荧光显微镜将其可视化。可优化液滴尺寸和反应条件，以确保IC3D的单酶灵敏度。
[0389] 实验2：用分泌型探针对HSC进行工程化和表征
[0390] 在组成型启动子(例如β-肌动蛋白)和谱系特异性启动子(例如对于T细胞谱系，为CD3启动子-β-gal/FDG对，对于B细胞谱系，为Ig-E启动子-HRP/QuantaBlu对)的下游用报告酶对HSC进行遗传工程化。我们将使用已被安全用于临床试验中的慢病毒转移载体[82,83]。报告酶表达将用IC 3D来表征。
[0391] 实验3：测试用于HSCT体内表征的谱系追踪/IC 3D法
[0392] 使用以下先前的工作[84]制备的同类系小鼠HSCT模型：方法包括1)利用5-氟尿嘧啶(5-FU)和辐照对CD45.2小鼠进行致死性骨髓耗竭，2)将工程化的CD45.1HSC移植至耗竭的CD45.2小鼠中[85,86]。
[0393] 在骨髓消融和HSCT后，收集外周血液以监测：1)血液β-gal水平(经由IC 3D)，和2)血液-CD45.1细胞类型的含量(在移植后24H、72H、7D、14D、21D和28D经由流式细胞术)。这些实验允许我们检测各种重建的供体细胞，包括嗜中性粒细胞以及T和B淋巴细胞，以验证模型的成功。血液β-gal水平与HSC细胞计数的相关性也将允许我们确定移植是否成功，从而提供临床上有用的信息。
[0394] 实施例6：硬度尺的体内硬度检测：用于测量天然细胞环境中的组织硬度的机械感测细胞
[0395] 背景：对体内硬度检测的需要
[0396] 机械生物学是新兴的研究领域，其集中于物理提示诸如硬度对细胞和组织生理学的影响。而先前的生理研究主要集中在生物化学途径，现在人们认识到，组织的机械性质也是发育、功能和疾病状态的核心。异常组织硬度是许多病理状态诸如纤维化、炎症和癌症的标志。例如，与健康组织相比，癌可以具有高至10倍的弹性模量[87]。在天然细胞环境中检测体内组织硬度的能力可以是在生理和病理状况的背景下研究机械生物学的有力工具。该知识将对开发直接靶向作为新型生物标志物的生物物理学提示的未来诊断剂和治疗剂具有广泛的意义。
[0397] 然而，这一领域的主要挑战是研究体内的机械生物学，特别是机械生物学提示与其天然环境中的细胞的相互作用。组织机械研究的现有方法分为两大类：成像和机械测试。成像模式，特别地包括弹性成像技术，受困于灵敏度和分辨率较差，且不能以高时空分辨率在细胞水平上研究机械生物学。使用原子力显微术(AFM)压痕和微流变学的组织离体机械测试需要侵入性活检，并且不复制天然生物条件。
[0398] 提供了用于在天然微环境中灵敏地检测组织硬度的基于细胞的平台。通过机械转导，细胞可将其周围的机械提示转换为可检测的生物化学信号。例如，已经确定，单独的组织和基质硬度可驱动间充质干细胞(MSC)和其它常用的模型癌细胞系(包括MDA-MB-231、MCF-7)中的差异基因表达。软基质，例如，使MSC通过表达特征启动子和转录因子定向至神经源性谱系[88]。MSC激活不同遗传途径的该内生能力可用于驱动硬度响应性报告子或治疗剂的表达。癌细胞系差异表达硬度响应性报告子的能力可用于研究原发性和转移性癌症模型的机械生物学。
[0399] 细胞可用许多不同的启动子进行工程化，所述启动子在处于一定硬度范围内的基底上选择性激活。从基因组DNA中克隆响应于特定范围的硬度的所列基因的启动子，并将其亚克隆入无启动子载体中以驱动荧光蛋白的表达。然后可将该构建体永久性转导入细胞诸如间充质干细胞(MSC)中，以产生稳定的工程化的MSC细胞系。我们的每一个报告子只能在适当的机械环境存在的情况下开启(图46)。例如，利用神经源性启动子TUBB3后跟RFPd报告子基因工程化的细胞将仅在软(0.1-1kPa)基底上激活并表达RFPd。
[0400] 或者，提供了其它更复杂的工程化的遗传回路，可以如图55和56中所述以及如下文中所详述构建它们。
[0401] 提供了“硬度尺”工具(包括工程化的细胞)，和使用它们的方法，其中示例性工具包括具有在不同基底硬度下选择性激活的不同工程化的启动子的细胞混合物，在不同基底硬度下的选择性激活形成“硬度尺“工具。所述细胞将能够在体内局部检测和报告组织的硬度，并进一步了解体内细胞微环境。
[0402] 提供了工程化的MSC，其可用作新型工具，用于通过体内响应于差异基底硬度而表达特异性报告子基因来研究组织机械生物学。提供了基于细胞的硬度传感器，其揭示了细胞在其天然环境中实际上“感觉”的东西，并且代表了在体内以细胞分辨率在天然生物过程、疾病进展和对疗法的响应过程中动态询问基质硬度的机械环境的范式转换方法。
[0403] 实验设计
[0404] 利用硬度响应性启动子对MSC进行工程化
[0405] 已经鉴定了几种硬度感测启动子：TUBB3(β3-微管蛋白，神经源性的)、MYOD1(MyoD，肌原性的)和RUNX2(RunX2或CBFα1，成骨性的)[2]。从人基因组DNA中分离启动子，然后将其克隆入含有具有不同颜色的去稳定化的荧光蛋白(例如，RFPd、GFPd、BFPd)的序列的报告子构建体中。经由核转染来转导人骨髓MSC。到目前为止，我们已成功地分离了所述目标启动子。
[0406] 或者，可以构建更复杂的工程化的遗传回路来更精细地阐明体内机械响应性质。首先，可使用双态硬度尺来更精确地筛选上文所列的的各种启动子。可以研究通过报告合成启动子的开启状态和关闭状态的双态模型功能。在开启状态下，RFP表达，表明机械敏感性启动子的功能性表达，而在关闭状态下，GFP表达，表明机械敏感性启动子的功能性阻遏。
例如，如所描述的，将各种机械敏感性合成启动子(MSP)克隆在报告子(例如，RFP)的上游(图55)。这些合成启动子使用与下述最小鸡TNT启动子融合的上述各种基因的已知启动子区来构建。天然启动子的区域可基于它们与转录起始位点的接近度来选择。因此，RFP的表达水平由合成启动子的机械敏感性驱动。将RFP下游的另一个片段与RFP共表达，但使用2A肽序列翻译后自我蛋白水解切割[89]。作为另一个实例，GAL4DBD-ESD片段是Gal4DNA结合结构域(GAL4DBD)与表观遗传学沉默结构域(ESD)的融合蛋白(图55)。ESD表示可用于(诸如HDAC或KRAB)表观遗传地和可逆地沉默靶向启动子(如先前已所述的)的表达的各种ESD片段[90]。该片段结合至天然不存在于哺乳动物细胞中的上游激活序列(UAS)(因为其来自酵母)，从而对于哺乳动物细胞来说是直系同源的。先前已广泛描述了Gal4-UAS的细节[89,91]。
当UAS序列与典型的哺乳动物启动子(诸如，尤其是EF1α或CMV)相邻时，下游GFP被组成型表达，从而报告机械敏感性回路的关闭状态。当Gal4DBD-ESD片段结合至UAS序列时，ESD片段表观遗传地修饰启动子序列，从而沉默GFP表达。结合伴随表达RFP，遗传回路的该次级状态报告了开启状态。我们看到示例性荧光蛋白强度(FP强度)输出(图55B)。在本实施方案中，在低硬度值(在本实施例中低于10kPa)下，仅表达GFP。在中等硬度值(约10kPa)下，GFP和RFP均被表达。而在高硬度值下，仅表达RFP。
例如，如所描述的，将各种机械敏感性合成启动子(MSP)克隆在报告子(例如，RFP)的上游(图55)。这些合成启动子使用与下述最小鸡TNT启动子融合的上述各种基因的已知启动子区来构建。天然启动子的区域可基于它们与转录起始位点的接近度来选择。因此，RFP的表达水平由合成启动子的机械敏感性驱动。将RFP下游的另一个片段与RFP共表达，但使用2A肽序列翻译后自我蛋白水解切割[89]。作为另一个实例，GAL4DBD-ESD片段是Gal4DNA结合结构域(GAL4DBD)与表观遗传学沉默结构域(ESD)的融合蛋白(图55)。ESD表示可用于(诸如HDAC或KRAB)表观遗传地和可逆地沉默靶向启动子(如先前已所述的)的表达的各种ESD片段[90]。该片段结合至天然不存在于哺乳动物细胞中的上游激活序列(UAS)(因为其来自酵母)，从而对于哺乳动物细胞来说是直系同源的。先前已广泛描述了Gal4-UAS的细节[89,91]。
当UAS序列与典型的哺乳动物启动子(诸如，尤其是EF1α或CMV)相邻时，下游GFP被组成型表达，从而报告机械敏感性回路的关闭状态。当Gal4DBD-ESD片段结合至UAS序列时，ESD片段表观遗传地修饰启动子序列，从而沉默GFP表达。结合伴随表达RFP，遗传回路的该次级状态报告了开启状态。我们看到示例性荧光蛋白强度(FP强度)输出(图55B)。在本实施方案中，在低硬度值(在本实施例中低于10kPa)下，仅表达GFP。在中等硬度值(约10kPa)下，GFP和RFP均被表达。而在高硬度值下，仅表达RFP。
[0407] 接下来，还描述了多态硬度尺遗传回路。我们看到一系列概述的对低、中、高硬度敏感的机械敏感性合成启动子(MSPa、MSPb、MSPc)(图56A)。这些是在上述双态回路中首先被筛选的启动子。然后使用先前作为实例描述的模块化装配方法的改进版将单个表达单元(启动子-荧光报告子-多聚腺苷酸化信号)克隆入大的载体中[92]。这些表达单元由指示的不同染色质绝缘体(图56A中的INS)分隔，以使一种机械敏感性启动子的表达与相邻基因的作用绝缘，并降低构建体被表观遗传沉默的可能性。绝缘体序列的细节，诸如核心HS4序列已在之前描述过[93]。我们看到示例性输出，其中每个荧光报告子由于每个合成启动子的敏感性范围而主要在所需的硬度范围内表达(图55B)。在双状和多态模型中，这些工程化的遗传回路均被特异性地整合至哺乳动物的遗传安全港位置(诸如人细胞的AAVS1基因座或鼠细胞的mROSA26基因座)中[94]。这些构建体的整合是经由同源性定向修复进行的并由如先前所述的CRISPR/Cas9内切核酸酶启动。[1]
[0408] 体外验证工程化的MSC：
[0409] 为了验证细胞报告子基因表达，将细胞培养在胶原包被的聚丙烯酰胺水凝胶上，通过丙烯酰胺和双丙烯酰胺的相对浓度确定可调硬度。具有每个启动子的MSC在其相应的硬度范围内选择性激活。上游机械转导因子诸如YAP和TAZ的抑制可以验证细胞启动子仅响应于基质硬度，但不响应于非特异性因子诸如炎症或缺氧。
[0410] 在替代实施方案中，使用硬度感测序列：CACATTCCA，包括例如最小鸡TnT启动子(SEQ ID NO：13)
[0411] CACATTCCACACATTCCACTGCAAGCTTGAGACACATTCCACACATTCCACTGCAAGCTTGGCCAGTGCCAAGTTGAGACACATTCCACACATTCCACTGCAAGCTTGAGACACATTCCACACATTCCACTGCAAGCTTCTAGAGATCTGCAGGTCGAGGTCGACGGTATCGATAAGCTTGGGGGTGGGCGCCGGGGGGACCTTAAAGCCTCTGCCCCCCAAGGAGCCCTTCCCAGACAGCCGCCGGCACCCACCGCTCCGTGGGAC
[0412] 转移质粒：
[0413] LV-PL4-CMV：：eGFP
[0414] CMV增强子+启动子：pcDNA3.1(+)/Luc2＝tdT，Addgene 43904
[0415] 输注引物：
[0416] (SEQ ID NO：14)Fw：ggtggtggatccTGTACGGGCCAGATATACGC
[0417] (SEQ ID NO：15)Rv：ggtggtggatccGCCAGCTTGGGTCTCCCTAT增强型绿色荧光蛋白(eGFP)：Addgene：32548：pUCBB-eGFP无启动子载体(GenTarget，Inc目录号LV-PL4)(SEQ ID NO：16)
[0418]GgatccTGTACGGGCCAGATATACGCGTTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCTCTGGCTAACTAGAGAACCCACTGCTTACTGGCTTATCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCCAAGCTGGCgGATCCATATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAAATGCATCCATGGCGGCCGCCTCGAGCATCACCATCACCATCACTGATTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCATGTACTAGTGTCGACGCTAGCTCTAGATGTACAAAGTGGTGCTAGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGTATCTGCTCCCTGCTTGTGTGTTGGAGGTCGCTGAGTAGTGCGCGAGCAAAATTTAAGCTACAACAAGGCAAGGCTTGACCGACAATTGCATGAAGAATCTGCTTAGGGTTAGGCGTTTTGCGCTGCTTCGCGATGTACGGGCCAGATATACGCGTATCTGAGGGGACTAGGGTGTGTTTAGGCGAAAAGCGGGGCTTCGGTTGTACGCGGTTAGGAGTCCCCTCAGGATATAGTAGTTTCGCTTTTGCATAGGGAGGGGGAAATGTAGTCTTATGCAATACTCTTGTAGTCTTGCAACATGGTAACGATGAGTTAGCAACATGCCTTACAAGGAGAGAAAAAGCACCGTGCATGCCGATTGGTGGAAGTAAGGTGGTACGATCGTGCCTTATTAGGAAGGCAACAGACGGGTCTGACATGGATTGGACGAACCACTGAATTCCGCATTGCAGAGATATTGTATTTAAGTGCCTAGCTCGATACAATAAACGCCATTTGACCATTCACCACATTGGTGTGCACCTCCAAAGCGCTCACCATGACCGAGTACAAGCCCACGGTGCGCCTCGCCACCCGCGACGACGTCCCCAGGGCCGTACGCACCCTCGCCGCCGCGTTCGCCGACTACCCCGCCACGCGCCACACCGTCGATCCGGACCGCCACATCGAGCGGGTCACCGAGCTGCAAGAACTCTTCCTCACGCGCGTCGGGCTCGACATCGGCAAGGTGTGGGTCGCGGACGACGGCGCCGCGGTGGCGGTCTGGACCACGCCGGAGAGCGTCGAAGCGGGGGCGGTGTTCGCCGAGATCGGCCCGCGCATGGccgagttgagcggttcccggctggccgcgcagcaacagatggaaggcctcctggcgccgcaccggcccaaggagcccgcgtggttcctggccaccgtcggcgtctcgcccgaccaccagggcaagggtctgggcagcgccgtcgtgctccccggagtggaggcggccgagcgcgccggggtgcccgccttcctggagacctccgcgccccgcaacctccccttctacgagcggctcggcttcaccgtcaccgccgacgtcgaggtgcccgaaggaccgcgcacctggtgcatgacccgcaagcccggtgcctgaactagttaggtttaaacacgcgtaccggttagtaatgatcgacaatcaacctctggattacaaaatttgtgaaagattgactggtattcttaactatgttgctccttttacgctatgtggatacgctgctttaatgcctttgtatcatgctattgcttcccgtatggctttcattttctcctccttgtataaatcctggttgctgtctctttatgaggagttgtggcccgttgtcaggcaacgtggcgtggtgtgcactgtgtttgctgacgcaacccccactggttggggcattgccaccacctgtcagctcctttccgggactttcgctttccccctccctattgccacggcggaactcatcgccgcctgccttgcccgctgctggacaggggctcggctgttgggcactgacaattccgtggtgttgtcggggaagctgacgtcctttccatggctgctcgcctgtgttgccacctggattctgcgcgggacgtccttctgctacgtcccttcggccctcaatccagcggaccttccttcccgcggcctgctgccggctctgcggcctcttccgcgtcttcgccttcgccctcagacgagtcggatctccctttgggccgcctccccgcctggcgatggtacctttaagaccaatgacttacaaggcagctgtagatcttagccactttttaaaagaaaaggggggactggaagggctaattcactcccaacgaagacaagatctgctttttgcttgtactgggtctctctggttagaccagatctgagcctgggagctctctggctaactagggaacccactgcttaagcctcaataaagcttgccttgagtgcttcaagtagtgtgtgcccgtctgttgtgtgactctggtaactagagatccctcagacccttttagtcagtgtggaaaatctctagcagtagtagttcatgtcatcttattattcagtatttataacttgcaaagaaatgaatatcagagagtgagaggaacttgtttattgcagcttataatggttacaaataaagcaatagcatcacaaatttcacaaataaagcatttttttcactgcattctagttgtggtttgtccaaactcatcaatgtatcttatcatgtctggctctagctatcccgcccctaactccgcccatcccgcccctaactccgcccagttccgcccattctccgccccatggctgactaattttttttatttatgcagaggccgaggccgcctcggcctctgagctattccagaagtagtgaggaggcttttttggaggcctagggacgtacccaattcgccctatagtgagtcgtattacgcgcgctcactggccgtcgttttacaacgtcgtgactgggaaaaccctggcgttacccaacttaatcgccttgcagcacatccccctttcgccagctggcgtaatagcgaagaggcccgcaccgatcgcccttcccaacagttgcgcagcctgaatggcgaatgggacgcgccctgtagcggcgcattaagcgcggcgggtgtggtggttacgcgcagcgtgaccgctacacttgccagcgccctagcgcccgctcctttcgctttcttcccttcctttctcgccacgttcgccggctttccccgtcaagctctaaatcgggggctccctttagggttccgatttagtgctttacggcacctcgaccccaaaaaacttgattagggtgatggttcacgtagtgggccatcgccctgatagacggtttttcgccctttgacgttggagtccacgttctttaatagtggactcttgttccaaactggaacaacactcaaccctatctcggtctattcttttgatttataagggattttgccgatttcggcctattggttaaaaaatgagctgatttaacaaaaatttaacgcgaattttaacaaaatattaacgcttacaatttaggtggcacttttcggggaaatgtgcgcggaacccctatttgtttatttttctaaatacattcaaatatgtatccgctcatgagacaataaccctgataaatgcttcaataatattgaaaaaggaagagtatgagtattcaacatttccgtgtcgcccttattcccttttttgcggcattttgccttcctgtttttgctcacccagaaacgctggtgaaagtaaaagatgctgaagatcagttgggtgcacgagtgggttacatcgaactggatctcaacagcggtaagatccttgagagttttcgccccgaagaacgttttccaatgatgagcacttttaaagttctgctatgtggcgcggtattatcccgtattgacgccgggcaagagcaactcggtcgccgcatacactattctcagaatgacttggttgagtactcaccagtcacagaaaagcatcttacggatggcatgacagtaagagaattatgcagtgctgccataaccatgagtgataacactgcggccaacttacttctgacaacgatcggaggaccgaaggagctaaccgcttttttgcacaacatgggggatcatgtaactcgccttgatcgttgggaaccggagctgaatgaagccataccaaacgacgagcgtgacaccacgatgcctgtagcaatggcaacaacgttgcgcaaactattaactggcgaactacttactctagcttcccggcaacaattaatagactggatggaggcggataaagttgcaggaccacttctgcgctcggcccttccggctggctggtttattgctgataaatctggagccggtgagcgtgggtctcgcggtatcattgcagcactggggccagatggtaagccctcccgtatcgtagttatctacacgacggggagtcaggcaactatggatgaacgaaatagacagatcgctgagataggtgcctcactgattaagcattggtaactgtcagaccaagtttactcatatatactttagattgatttaaaacttcatttttaatttaaaaggatctaggtgaagatcctttttgataatctcatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctaccaactctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgttcttctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagctatgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttcctggccttttgctggccttttgctcacatgttctttcctgcgttatcccctgattctgtggataaccgtattaccgcctttgagtgagctgataccgctcgccgcagccgaacgaccgagcgcagcgagtcagtgagcgaggaagctggaagggctaattcactcccaaagaagacaagatatccttgatctgtggatctaccacacacaaggctacttccctgattagcagaactacacaccagggccaggggtcagatatccactgacctttggatggtgctacaagctagtaccagttgagccagataaggtagaagaggccaataaaggagagaacaccagcttgttacaccctgtgagcctgcatgggatggatgacccggagagagaagtgttagagtggaggtttgacagccgcctagcatttcatcacgtggcccgagagctgcatccggagtacttcaagaactgctgatatcgagcttgctacaagggactttccgctggggactttccagggaggcgtggcctgggcgggactggggagtggcgagccctcagatcctgcatataagcagctgctttttgcctgtactgggtctctctggttagaccagatctgagcctgggagctctctggctaactagggaacccactgcttaagcctcaataaagcttgccttgagtgcttcaagtagtgtgtgcccgtctgttgtgtgactctggtaactagagatccctcagacccttttagtcagtgtggaaaatctctagcagtggcgcccgaacagggacttgaaagcgaaagggaaaccagaggagctctctcgacgcaggactcggcttgctgaagcgcgcacggcaagaggcgaggggcggcgactggtgagtacgccaaaaattttgactagcggaggctagaaggagagagatgggtgcgagagcgtcagtattaagcgggggagaattagatcgcgatgggaaaaaattcggttaaggccagggggaaagaaaaaatataaattaaaacatatagtatgggcaagcagggagctagaacgattcgcagttaatcctggcctgttagaaacatcagaaggctgtagacaaatactgggacagctacaaccatcccttcagacaggatcagaagaacttagatcattatataatacagtagcaaccctctattgtgtgcatcaaaggatagagataaaagacaccaaggaagctttagacaagatagaggaagagcaaaacaaaagtaagaccaccgcacagcaagcggccgctgatcttcagacctggaggaggagatatgagggacaattggagaagtgaattatataaatataaagtagtaaaaattgaaccattaggagtagcacccaccaaggcaaagagaagagtggtgcagagagaaaaaagagcagtgggaataggagctttgttccttgggttcttgggagcagcaggaagcactatgggcgcagcgtcaatgacgctgacggtacaggccagacaattattgtctggtatagtgcagcagcagaacaatttgctgaGGGCTATTGAGGCGCAACAGCATCTGTTGCAACTCACAGTCTGGGGCATCAAGCAGCTCCAGGCAAGAATCCTGGCTGTGGAAAGATACCTAAAGGATCAACAGCTCCTGGGGATTTGGGGTTGCTCTGGAAAACTCATTTGCACCACTGCTGTGCCTTGGAATGCTAGTTGGAGTAATAAATCTCTGGAACAGATTTGGAATCACACGACCTGGATGGAGTGGGACAGAGAAATTAACAATTACACAAGCTTAATACACTCCTTAATTGAAGAATCGCAAAACCAGCAAGAAAAGAATGAACAAGAATTATTGGAATTAGATAAATGGGCAAGTTTGTGGAATTGGTTTAACATAACAAATTGGCTGTGGTATATAAAATTATTCATAATGATAGTAGGAGGCTTGGTAGGTTTAAGAATAGTTTTTGCTGTACTTTCTATAGTGAATAGAGTTAGGCAGGGATATTCACCATTATCGTTTCAGACCCACCTCCCAACCCCGAGGGGACCCGACAGGCCCGAAGGAATAGAAGAAGAAGGTGGAGAGAGAGACAGAGACAGATCCATTCGATTAGTGAACGGATCTCGACGGTATCGGTTAACTTTTAAAAGAAAAGGGGGGATTGGGGGGTACAGTGCAGGGGAAAGAATAGTAGACATAATAGCAACAGACATACAAACTAAAGAATTACAAAAACAAATTACAAAAATTCAAAATTTTATCG[0419] LV-PL4-GTIIC：：eGFP
[0420] GTIIC硬度感测启动子：Addgene 34615：8xGTIIC-荧光素酶(Dupont，Nature，2011)
[0421] 输注引物：
[0422] (SEQ ID NO:17)Fw:AATTTTATCGGGATCCCGAGCTCTTACGCGTGCTA
[0423] (SEQ ID NO:18)Rv:CGATGTATACGGATCCtttatATCGTCCCACGGAGCG
[0424] 增强型绿色荧光蛋白(eGFP)：Addgene：32548：pUCBB-eGFP
[0425] 无启动子载体(GenTarget,Inc目录号LV-PL4)(SEQ ID NO：19)
[0426]GgatccCGAGCTCTTACGCGTGCTAGCCCGGGCTAGCCCGGCCAGTGCCAAGTTGAGACACATTCCACACATTCCACTGCAAGCTTGAGACACATTCCACACATTCCACTGCAAGCTTGGCCAGTGCCAAGTTGAGACACATTCCACACATTCCACTGCAAGCTTGAGACACATTCCACACATTCCACTGCAAGCTTCTAGAGATCTGCAGGTCGAGGTCGACGGTATCGATAAGCTTGGGGGTGGGCGCCGGGGGGACCTTAAAGCCTCTGCCCCCCAAGGAGCCCTTCCCAGACAGCCGCCGGCACCCACCGCTCCGTGGGACGATataaagGATCCATATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAAATGCATCCATGGCGGCCGCCTCGAGCATCACCATCACCATCACTGATTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCATGTACTAGTGTCGACGCTAGCTCTAGATGTACAAAGTGGTGCTAGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGTATCTGCTCCCTGCTTGTGTGTTGGAGGTCGCTGAGTAGTGCGCGAGCAAAATTTAAGCTACAACAAGGCAAGGCTTGACCGACAATTGCATGAAGAATCTGCTTAGGGTTAGGCGTTTTGCGCTGCTTCGCGATGTACGGGCCAGATATACGCGTATCTGAGGGGACTAGGGTGTGTTTAGGCGAAAAGCGGGGCTTCGGTTGTACGCGGTTAGGAGTCCCCTCAGGATATAGTAGTTTCGCTTTTGCATAGGGAGGGGGAAATGTAGTCTTATGCAATACTCTTGTAGTCTTGCAACATGGTAACGATGAGTTAGCAACATGCCTTACAAGGAGAGAAAAAGCACCGTGCATGCCGATTGGTGGAAGTAAGGTGGTACGATCGTGCCTTATTAGGAAGGCAACAGACGGGTCTGACATGGATTGGACGAACCACTGAATTCCGCATTGCAGAGATATTGTATTTAAGTGCCTAGCTCGATACAATAAACGCCATTTGACCATTCACCACATTGGTGTGCACCTCCAAAGCGCTCACCATGACCGAGTACAAGCCCACGGTGCGCCTCGCCACCCGCGACGACGTCCCCAGGGCCGTACGCACCCTCGCCGCCGCGTTCGCCGACTACCCCGCCACGCGCCACACCGTCGATCCGGACCGCCACATCGAGCGGGTCACCGAGCTGCAAGAACTCTTCCTCACGCGCGTCGGGCTCGACATCGGCAAGGTGTGGGTCGCGGACGACGGCGCCGCGGTGGCGGTCTGGACCACGCCGGAGAGCGTCGAAGCGGGGGCGGTGTTCGCCGAGATCGGCCCGCGCATGGccgagttgagcggttcccggctggccgcgcagcaacagatggaaggcctcctggcgccgcaccggcccaaggagcccgcgtggttcctggccaccgtcggcgtctcgcccgaccaccagggcaagggtctgggcagcgccgtcgtgctccccggagtggaggcggccgagcgcgccggggtgcccgccttcctggagacctccgcgccccgcaacctccccttctacgagcggctcggcttcaccgtcaccgccgacgtcgaggtgcccgaaggaccgcgcacctggtgcatgacccgcaagcccggtgcctgaactagttaggtttaaacacgcgtaccggttagtaatgatcgacaatcaacctctggattacaaaatttgtgaaagattgactggtattcttaactatgttgctccttttacgctatgtggatacgctgctttaatgcctttgtatcatgctattgcttcccgtatggctttcattttctcctccttgtataaatcctggttgctgtctctttatgaggagttgtggcccgttgtcaggcaacgtggcgtggtgtgcactgtgtttgctgacgcaacccccactggttggggcattgccaccacctgtcagctcctttccgggactttcgctttccccctccctattgccacggcggaactcatcgccgcctgccttgcccgctgctggacaggggctcggctgttgggcactgacaattccgtggtgttgtcggggaagctgacgtcctttccatggctgctcgcctgtgttgccacctggattctgcgcgggacgtccttctgctacgtcccttcggccctcaatccagcggaccttccttcccgcggcctgctgccggctctgcggcctcttccgcgtcttcgccttcgccctcagacgagtcggatctccctttgggccgcctccccgcctggcgatggtacctttaagaccaatgacttacaaggcagctgtagatcttagccactttttaaaagaaaaggggggactggaagggctaattcactcccaacgaagacaagatctgctttttgcttgtactgggtctctctggttagaccagatctgagcctgggagctctctggctaactagggaacccactgcttaagcctcaataaagcttgccttgagtgcttcaagtagtgtgtgcccgtctgttgtgtgactctggtaactagagatccctcagacccttttagtcagtgtggaaaatctctagcagtagtagttcatgtcatcttattattcagtatttataacttgcaaagaaatgaatatcagagagtgagaggaacttgtttattgcagcttataatggttacaaataaagcaatagcatcacaaatttcacaaataaagcatttttttcactgcattctagttgtggtttgtccaaactcatcaatgtatcttatcatgtctggctctagctatcccgcccctaactccgcccatcccgcccctaactccgcccagttccgcccattctccgccccatggctgactaattttttttatttatgcagaggccgaggccgcctcggcctctgagctattccagaagtagtgaggaggcttttttggaggcctagggacgtacccaattcgccctatagtgagtcgtattacgcgcgctcactggccgtcgttttacaacgtcgtgactgggaaaaccctggcgttacccaacttaatcgccttgcagcacatccccctttcgccagctggcgtaatagcgaagaggcccgcaccgatcgcccttcccaacagttgcgcagcctgaatggcgaatgggacgcgccctgtagcggcgcattaagcgcggcgggtgtggtggttacgcgcagcgtgaccgctacacttgccagcgccctagcgcccgctcctttcgctttcttcccttcctttctcgccacgttcgccggctttccccgtcaagctctaaatcgggggctccctttagggttccgatttagtgctttacggcacctcgaccccaaaaaacttgattagggtgatggttcacgtagtgggccatcgccctgatagacggtttttcgccctttgacgttggagtccacgttctttaatagtggactcttgttccaaactggaacaacactcaaccctatctcggtctattcttttgatttataagggattttgccgatttcggcctattggttaaaaaatgagctgatttaacaaaaatttaacgcgaattttaacaaaatattaacgcttacaatttaggtggcacttttcggggaaatgtgcgcggaacccctatttgtttatttttctaaatacattcaaatatgtatccgctcatgagacaataaccctgataaatgcttcaataatattgaaaaaggaagagtatgagtattcaacatttccgtgtcgcccttattcccttttttgcggcattttgccttcctgtttttgctcacccagaaacgctggtgaaagtaaaagatgctgaagatcagttgggtgcacgagtgggttacatcgaactggatctcaacagcggtaagatccttgagagttttcgccccgaagaacgttttccaatgatgagcacttttaaagttctgctatgtggcgcggtattatcccgtattgacgccgggcaagagcaactcggtcgccgcatacactattctcagaatgacttggttgagtactcaccagtcacagaaaagcatcttacggatggcatgacagtaagagaattatgcagtgctgccataaccatgagtgataacactgcggccaacttacttctgacaacgatcggaggaccgaaggagctaaccgcttttttgcacaacatgggggatcatgtaactcgccttgatcgttgggaaccggagctgaatgaagccataccaaac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[0427] 在专利项目中使用的其它质粒和吸引人的序列：
[0428] 萤火虫荧光素酶-红色荧光蛋白(Fluc-RFP)融合蛋白：pcDNA3.1(+)/Luc2＝tdT，Addgene 43904
[0429] 人源化Gaussia荧光素酶(hGluc)：pSV40Gluc质粒，New EnglandBioLabs，Inc.目录号：N0323S。
[0430] 基质金属肽酶1(MMP1)：MMP1(NM_002421)人cDNA ORF克隆，Origene Technology，Inc目录号：RG202460
[0431] β-半乳糖苷酶：pOPINVL，Addgene 26040
[0432] 实施例7：伤口愈合
[0433] 伤口愈合是一种复杂的生物过程，其涉及许多类型的细胞和因子的协调来修复和恢复损伤的组织。对损伤的正常响应通常包括三个阶段：炎症、新组织形成和重塑[95]。在该过程中，身体的作用是阻止感染，激活不同细胞的迁移和增殖以修复组织，以及重塑新组织以使身体恢复动态平衡。然而，在具有诸如糖尿病性足溃疡的潜在原因的损伤中，正常的愈[96]合过程可能受损 。这导致不愈合的慢性伤口。
[0434] 糖尿病性足溃疡是由神经病和局部缺血引起的慢性创伤的常见病例，并在其一生中影响多达25％的1型和2型糖尿病的人。糖尿病性足病也是下肢截肢的主要原因[97]。由于全球糖尿病患病率高，因此糖尿病性足溃疡引起的并发症提出了需要解决的重要问题。除了生活方式改变以外，目前的几种治疗方法包括皮肤移植、高压氧治疗、负压敷料和生长因子疗法。然而，由于糖尿病性足溃疡具有复杂的潜在原因，并且经受持续的机械应激，所以这些治疗通常是不足的，因此导致需要截肢。
[0435] 间充质干细胞(MSC)是糖尿病性足溃疡的有希望的治疗方法。MSC天然分泌可有助于伤口愈合过程的各种因子，并已经被研究用于人体试验[98]。然而，这些先前的研究使用未经修饰的自体细胞，并且愈合得以改善的机制仍然不确定。
[0436] 提供了工程化的MSC来阐明伤口愈合以及增强未工程化的细胞的天然效应的机制；另外，由于足底组织的溃疡区域具有增加的模量[99]，因此通过使用硬度感测启动子选择性激活愈合因子的表达。被提供用于工程化的MSC表达的治疗性基因是血管内皮生长因子(VEGF)，已显示其改善血管生成和伤口闭合[100]。
[0437] 实施例8：机械敏感性CAR T细胞
[0438] 大多数患有实体瘤转移(包括具有已知标志物(诸如HER2)的实体瘤转移)的临床患者将死于其疾病[101]。患者治疗的独特方法是利用患者自身的免疫系统。最近将其用于临床试验的一种这样的方法是遗传修饰T细胞，以经由表达嵌合抗原受体(CAR)来靶向肿瘤细胞上表达的抗原，CAR是经工程化以识别细胞表面抗原并以抗原依赖性方式激活T细胞的抗原受体[102]。使用经遗传修饰的表达CAR的细胞治疗患有实体瘤转移的患者的尝试取得了非常有限的成功，并且在一些情况下是致死的[103,104]。此处，我们描述可如何将本文提供的示例性机械敏感性启动子用于使用逻辑门控遗传回路，以逻辑依赖方式独特地设计靶向癌症的CAR T细胞。
[0439] 背景
[0440] 虽然CAR类似于内源性T细胞受体触发T细胞激活，但该技术对于针对实体瘤的临床应用的主要限制是在特定肿瘤微环境中表达CAR的能力。现有技术中描述的所有先前的CAR都使用组成型启动子[105-107]。因此，即使在输注之前，在经遗传修饰之后，CAR被连续表达并且总是存在于T细胞表面膜上。因此，当这些CAR T细胞与中靶脱肿瘤抗原结合时，它们在患者的不期望的位置上激活导致致死后果的T细胞反应。
[0441] 此处，我们描述如何通过使用机械响应性启动子逻辑和本文提供的机械响应性启动子，我们可降低中靶脱肿瘤T细胞激活的比率。其周围ECM和肿瘤微环境通常因由于上述过程(诸如胶原纤维的交联)而导致的增加的机械硬度而被重塑的实体瘤。其CAR仅在诸如特定肿瘤微环境中表达的经CAR修饰的T细胞，将用作与逻辑门，因为T细胞激活将需要肿瘤抗原(诸如HER2/EGFRvIII[103,108])的存在和具有独特机械-提示(诸如高机械硬度)的肿瘤微环境的存在。
[0442] 示例性实施方案描述于例如图57中。显示了对T细胞进行工程化的方法(图57A)。首先，收获(通过血浆分离置换法)并分离患者来源的T细胞。然后，使用例如慢病毒构建体，或使用如先前已显示的[109]用于至T细胞内的位点特异性整合的CRISPR/Cas9遗传修饰这些T细胞。最后，选择这些工程化的T细胞，扩增所述T细胞，并将其重新输注入患者体内。一旦这些细胞被重新输注入患者体内，它们被设计来降低中靶脱肿瘤特异性，从而增加患者的存活能力，如所显示的(图57B和57C)。
[0443] 在其它实施方案中，提供了复杂逻辑门诸如多输入与门或顺序级与门；任选地使用先前描述的和已在T细胞中显示的方法[110,111]。这些方法可用于工程化其CAR需要在局部肿瘤微环境中存在多种特异性刺激物的T细胞。例如，可经由靶向LOXL1和/或LOXL2的合成受体来特异性地靶向胶原交联。先前已经发现对这些酶具有特异性的单链抗体[112,113]。
[0444] 作为实例，通过以模块化方式融合三种主要组分来产生合成受体。首先，经由单链可变片段结构域(scFv)来检测靶酶。然后，来自小鼠Notch蛋白的跨膜结构域将受体靶向至膜，并允许在第三结构域的scFv结合后进行特异性细胞内切割。该最后的结构域是遗传回路的下游组分的转录激活因子。这些转录切换蛋白是可变化的，并可以从永久地将回路在状态之间切换的转录切换蛋白变化成仅在恒定输入信号后才允许转录激活的瞬时激活因子。在第一类中的是丝氨酸整合酶(诸如Bxb1/PhiC31)，这些蛋白可用于位点特异性地除去抑制所需靶蛋白表达的基因组区段(如在上文实施例6中使用的那样)。在第二类中的是也如上文所述的反式激活因子诸如GAL4DBD系统，但这次与反式激活VP16结构域融合[91]。
[0445] 其它生物物理学刺激可以是诸如缺氧，并且氧化应激可使用新型经修饰的合成启动子来靶向，并且可将这些启动子耦合以产生更复杂的逻辑门控CAR T细胞，其仅在具有某一硬度、胶原交联、氧浓度以及一氧化氮合酶和活性氧种类(ROS/NOS)浓度的生物物理学约束的肿瘤微环境中激活。可组合使用靶向这些生物物理学提示与工程化细胞来靶向其它信号，尤其是生物化学提示。综上所述，此处报导的本文提供的实施方案使得能够设计这样的细胞，所述细胞可靶向生物物理学和/或生物化学或其它信号相关的细胞或周围细胞以以最小副作用有效地治疗疾病。
[0446] 实施例9：机械敏感性转基因小鼠
[0447] 非人转基因动物模型可用于筛选药物，并且通常用作发育过程的研究模型。本实施例描述了本文所述的示例性工程化的非人类动物的用途，所述动物的细胞用报告其局部环境的机械敏感性质的遗传回路进行修饰。此类回路具有能够使用报告分子或装置诸如荧光蛋白来报告在动物发育期间存在的生物物理性质(例如，变化的硬度)和微环境的持续机械状态的效用。
[0448] 背景
[0449] 机械生物学已被描述为新兴领域。研究这一领域的主要形式是使用工程化的体外模型或野生型动物模型。即，已使用已在组织培养中诸如在先前描述的精确实验[114]，[115]中生长的工程化的细胞，研究了细胞的机械性质以及细胞如何与具有不同硬度的基底反应。
[0450] 相反，虽然研究动物组织的机械性质是很常见的，但未曾有出于研究整个动物的机械生物学的特定目的而对非人动物进行工程化。尽管先前的生理研究主要集中在生物化学途径上，但研究所有组织的机械性质将是独特地有用的，因为这些性质已被证明对发育、功能和疾病状态是重要的。在天然动物背景中体内检测组织硬度的能力可以是研究机械生物学的有力工具，以及可作为评价干扰机械小生境的方法的模型。先前的转基因动物模型已被建立，并获得专利以研究癌基因[116]和抗体的产生[117]。
[0451] 用于研究体内动物模型的机械生物学的当前工具分为两类：成像和机械测试，如上文实施例6中所述。已开发用于体外组织培养的相同工具已被用于体内动物模型，诸如不同的体内成像模式、组织的离体机械测试。然而，不存在将体内成像测量与机械硬度值发生关联的工具。
[0452] 在替代实施方案中，如实施例6和上文中其它地方所述，在遗传回路中，用许多不同的启动子对细胞进行了工程化，所述启动子在具有不同硬度的基底上选择性激活。已使用位点特异性整合方法[118]将类似的遗传回路广泛地整合至许多细胞类型[92]和动物模型中。将此类遗传回路位点特异地工程化至非人动物模型中。
[0453] 实验设计：
[0454] 提供了用于在体内感测硬度的工程化的机械敏感性转基因小鼠，并且在替代实施方案中，使用上述实施例6中描述的工程化的遗传回路，特别是所描述的双态和多态变型(图55和56)制备所述转基因动物。使用先前描述的模块化载体装配方法[92]的略微改进版构造这些回路。修饰所述质粒构建体，使得CRISPR/Cas9启动的同源性定向修复靶向至小鼠基因组上的mROSA26基因座[94]。然后使用先前描述的方案[118]将这些遗传构建体插入C57BL/6小鼠。
[0455] 体内验证机械敏感性回路
[0456] 为了在体内验证机械敏感性报告子系统，首先可使用在胶原包被的聚丙烯酰胺水凝胶上培养的工程化的细胞来构建标准曲线。改变丙烯酰胺和双丙烯酰胺的相对浓度产生具有可调硬度的水凝胶。形成具有多个已知硬度范围的水凝胶，覆盖从0.1kPa至40kPa的范围。将使用机械敏感性遗传回路工程化的稳定表达细胞在具有不同硬度的胶原包被的水凝胶上培养，并使用标准落射荧光显微镜进行成像。测量数千个细胞的每种荧光报告子的平均表达。使用所有细胞的平均表达值和标准偏差来构建在该范围内的每个基底硬度值的荧光强度值的分布。将这种分布用于构建各种荧光蛋白强度如何随不同硬度变化的标准曲线。然后将该标准曲线用来使来自体内小鼠模型的已知荧光强度值与已知的机械硬度值发生关联。
[0457] 然后，对切片的小鼠组织样品进行成像以计算并测量不同器官的整个组织切片上的荧光强度的变化。将横跨每个组织的荧光蛋白强度转换成每个切片的硬度“图谱”，并将其用于构建整个小鼠的硬度“3D模型”。针对来自常规机械测试方法(诸如，横跨每个组织切片的原子力显微镜术(AFM))的体内测量验证该数据。
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