本发明与在测试样品中检测微生物存在的分析方法、试验手段、所用的组分以及制备这些组分的方法有关。原则上，本发明适用于测定涉及有关保健领域内的细菌，如为了辅助诊断对人类排泄物或体液（即尿、血液、粪便）进行分析，或者用于检测食品中的细菌污染。本发明能迅速、准确而又经济地检测特种细菌存在，因此在这些领域以及其它一些领域中具有重要的应用价值。

有许多检测细菌存在并 定其类型的方法。绝大多数方法是根据来自样品材料中未知细菌的生长情况建立的。在选择的培养基上使一种或多种细菌自身繁殖之后再进行分离并用显微镜观察、生理学试验，对抗生素的敏感性试验、细菌对各种染色剂的摄入以及血清学分析等进行分型。许多生物学材料，如食物或皮肤，均含有很多类细菌。但大多数这样的细菌就其试验目的（如毒素产生，病原体等）来说，并不是试验重点。因此，大多数试验所使用的培养基尽可能是选择培养基，它允许存在的欲被检测的细菌生长，而尽可能多地阻止那些对试验无用的细菌生长。这些加富培养基的例子很多，如用于培养肠道细菌的MacConkey培养基，以及用于培养厌氧生物的巯基醋酸盐肉汤培养基。

根据细菌的本身特性按排的这些试验进行是很慢的，因为在 定与查对它对抗生素的敏感性之前，必须先分离出有关的生物体。这些 步骤可能要花费多至几天的时间，而对人或动物的细菌性疾病来说，这段时间可能是很关键的。

对微生物进行计数和 定，以及检验它们对抗生素的敏感性是诊断医学微生物学的主要任务。为了完成这些目的和任务，业已建立和发展了许多有关技术，试验方法和培养基。然而，目前所应用的试验中尚没有一种能够经短时间（如几分钟或几小时）操作即可完成这些任务的。使用目前阶段技术方法，对细菌进行总存活菌计数需要18-24小时。通过测定三磷酸腺苷（ATP）含量来估计微生物生物量试验并不是特异性的，而且每毫升少于104-5个微生物的样品就不能测定。对特异种属细菌的计数通常需要选择性培养基，并且要进行长时间的培养。对已分离到的菌落的最后 定及对它们的抗生素敏感性检验常常需要在另一个生长周期进行并且需要附加试验。因此，完成细菌的计数、 定以及抗生素敏感性检测的全过程正常情况下也需要几天的时间。相反，现代医学长期以来一直在寻找与目前可利用的十分冗长的操作程序不同的快速诊断方法，它能够迅速检测到和 定出引起感染的细菌，并能在几分或几小时内获取它们对不同抗生素敏感性的信息。

业已研究和发展了许多种其它技术，以试图设计出能够克服常规培养中许多缺点的新方法。可使用光学显微镜检定临床样品中的细菌并可用以区分其间几个主要的菌群。但这一技术并不能辨别死菌和活菌，而且检定限度通常是在107细胞/毫升以上。已成功地发展了一些检测特异性菌种和菌属的免疫学方法，通过特异性抗体结合来区分细胞所具有的表面抗原，但这些方法需要有相对高浓度的细菌存在，并且还要有菌株特异性抗体。

所发展的其它方法包括基于检测细菌代谢产物如检测亚硝酸盐核苷酸（如三磷酸腺苷）的，检测从14C标记底物中释放出的14CO2，以及特异性酶等。这些技术也有许多缺点，包括：ATP可被试验样品中的酶降解，ATP可由非细菌材料如寄主的组织产生生物公害中存在有放射活性物质，以及具有相似活性的酶亦能从寄主中产生等。

颗粒计数仪器也已被应用于检测细菌。当电流穿过仪器中的小孔时，由于流经小孔的液体中存在颗粒，即引起测量仪器产生可记录信号。此方法除须使用复杂而又贵重的装置外，而且还是完全非特异的，需要精心使用，且要在无颗粒条件下进行。

其它一些类型的装置则用于检测特殊培养液中细菌的生长。用这些有关装置进行周期性的比浊度测量，浊度增加即表明细菌存在着增长。这种方法也是非特异的，而且需要所测细菌高浓度（≥107细胞/毫升）地存在。

根据上述对常规微生物学方法的若干要求和限制的总结，长期以来人们都在寻找一种能够迅速、灵敏、准确、而经济地在所述环境中进行特异地定量检测活细菌的技术和方法。尽管在密切相关的领域内的分析技术有了迅速进展，如放射免疫分析法、分光光度法、荧光测定法、微量量热法电化学技术等的发展，但在细菌学试验中所使用的主要技术仍保留了平板培养法。当今的这一技术仍然包括许多由巴斯德和20世纪初期的其它微生物学家所使用的同样材料和方法。

在生物学系统中，遗传重组一般不在    生物种间发生。然而，新的重组DNA技术方法现已可以使基因在相关和不相关生物体之间转移。由基因总构引起的遗传性的改变的可能性在工业和医学微生物 领域中具有特殊的应用价值。现在已能在体外从各种真核生物或原核生物来源中收集到贮存在DNA片段上的不同遗传信息。并且引入到能自我复制的遗传载体，即所谓克隆运载体中。另外，DNA片段，或整个基因也能用化学方法，按照理论上所期望的或已知序列进行合成，然后把它引入到一个选择好的运载体上。细菌质粒或噬菌体是常用的克隆运载体。质粒是一种存在于染色体外的独立遗传单位，由环形DNA链构成，可在大多数细菌和某些真核细胞中找到。噬菌体是DNA病毒，只寄生于细菌。杂交的遗传运载体则能被引入到经选择过的微生物寄主中，而微生物寄主本身则能作为有潜在能力的大量生产克隆化DNA的工厂。

经过转化的微生物常常并不能表达存在于克隆载体中的外源遗传信息。在外源基因组产生一种对寄主生物体有害的产物的那些前提下，这样的不表达的克隆运载体才有希望可被应用不表达的或低表达的克隆运载体是供献外源基因的备用来源，因为它也能被分离出来，也能引入到合适的表达载体中（即一种特行制备的或经过选择的质粒）应用已知的技术，将外源DNA安置在表达运载体的适当部位上，该部位的原有遗传序列能使外源遗传信息被转录（即从外源DNA转录出mRNA）和转译（即以转录出的mRNA为模板合成蛋白质），从而可得到外源DNA所编码的予期产物。通过转化使含有这种表达载体的微生物将作为制造外源DNA产物的工厂。

DNA可在体外用一类称为限制性内切酶的酶类在特定的部位被切断，以便准备将其插入一个适当的转移载体中。限制性内切酶是位点特异性内切酶类，主要是裂解双链DNA，但在有些情况中可裂解单链DNA。例如，Ⅱ类限制性内切酶是在特定序列上切断DNA。 相反，第Ⅰ类限制性内切酶则是随机地切断DNA并产生不均-产物。各种限制性内切酶酶介产生出不同长度和类型的DNA片段。例如，有些限制性内切酶在两条链同一位点切断DNA产生所谓的“平头”DNA片段。反之，另一些限制性内切酶则在离开互补链切点几个核苷处切断另一条DNA链并得到“粘性末端”DNA片段。因此，一个有造诣的重组DNA工艺的实际工作人员，通过创造性的选择处理主体DNA的内切酶，可以获得予期的DNA片段，之后在DNA连接酶的作用下将其连接起来。为了达到连接的目的，在被切断的DNA片段末端加上若干个核苷酸，并且将互补的脱氧核糖核苷酸加到克隆载体的两端（即使用所谓同型多聚物尾接法）。为得到要求的DNA融合产物而采用的另一个通用方法，是在克隆运载体或欲被克隆的DNA片段的一端或两端加上“接合体”或“接头片段”。接头片段是小段DNA，含有一个或多个限制性内切酶的识别序列。这样，含有遗传信息之DNA片段的酶切和拼接已告完成。已被克隆的并且插入寄主微生物体内的外源DNA片段的准确序列可用序列分析方法测定。

用于插入转移运载体的外源DNA片段可用几种方法得到。例如可由亲代DNA直接得到能被插入适当载体的DNA片段。另一种方法是从亲代系统中合成活跃部位中得到mRNA，之后用酶（反转录酶）合成与分离的mRNA互补DNA单链。再以此单链为模板合成双链DNA分子。以这种方式得到的双链DNA即为互补DNA（cDNA）。

一旦所期望的DNA序列成为已知，则用于体外克隆的基因，用在微生物中，生物组织中或细胞培养系统中表达的基因也都能被化学 合成。

由于重组DNA技术的出现，近年来在分子生物学领域内已取得了激动人心的进展。其中有些工作是针对诊断试验的。例如在人类胚胎时期便能检测许多遗传性疾病，甚至在没有显示出疾病本身未发现的疾病在亲代中的携带者，也可通过使用限制性内切酶和核酸杂交技术检测出来。用DNA或RNA特异性探针以及核酸杂交技术查明已知类型细菌之存在的研究也正在发展。然而，使用新颖的遗传构建方法，特别是用人工手段（体外的）进行部分或全部检测特殊生物体的技术尚未见报导，而这便是本发明的基础。本发明的较好技术环节是使用费希尔弧菌的发光系统。由我们发展的这一技术决不被限制在那个系统。凡在寄主细菌中表现表达明显增加从而确定该细菌是否存在的任何外源基因-引入系统也都能被应用。

涉及生物发光和化学发光的出版物很多〔参见（P.J.Herrig的“生物发光在运转中”（“Bioluminescence    in    Action”），Academic出版社，纽约，NY1978;（M.A.de    Luca    W.D.McElroy的“生物发光和化学发光”（Bioluminescence    and    Chemiluminescence”），Academic出版社、纽约，NY1981）。有关磷光和化学发光的美国专利有3958938号，3470373号，3567581号，3959081号，3567586号和4144134号。

论述遗传工程各个方面，特别是涉及重组DNA的文献数量迅速增加。已公开的涉及运载体、重组构成物、方法学以及新的微生物等领域的专利也很多，如美国专利4082613号，4184917号，4190495号，4195125号，4237224号，4468464号， 4259444号，4262090号，4262731号，4273874号，4259444号，4262090号，4262731号，4273874号，4321365号，4399216号，4340674号，4506013号，4503151号和4504584号。3930956号专利包括将未加工的细菌DNA转移到营养缺陷型中的内容。美国专利4104126号中则描述了噬菌体诱发细菌裂介的检测方法。

1983年，Engebrecht等人（J.恩格伯莱茨，K.涅尔松和M.西尔沃曼，1983，细菌的生物发光：由费希尔弧菌中分离及功能的遗传学分析，细胞32，773-781）描述了费希尔弧菌（MJ-1）DNA的BamHI酶切片段与质粒PACYC184连接而构建的各种重组质粒。这些重组质粒引入到大肠杆菌中，并使其在该菌中表达且与在费希尔弧菌中产生差不多水平的发光。其它涉及细菌发光的出版物包括：伯拉斯，R.等人的报告〔科学218，791-3（1982）〕;依万斯，J.E.等人“在大肠杆菌系统中体外合成细菌荧光素酶的亚单位”〔细菌学杂志，153：543-545（1983）〕;以及恩格伯莱茨，J和M.西尔沃曼的“细菌生物发光所必需的基因和基因产物 定”。（“Identification of gehes and gene prod uots necessary for bacterial bioluminescence”）〔美国国家科学院会议录（Proc.Natl.Acad.Sci.USA）81;4154-4158（1984）〕;J.恩格伯莱茨等人的“用光检测基因表达”〔科学227：1345-47（1985）〕。不包括荧光素酶的发光系统是已知的〔P.德索尔（Desole，P.）等人，临床实验室自动装置（Clin.Lab.Automation）3：391 -400（1983）〕。在这些出版物中均没有提到使用本技术以检测细菌。据本发明人的全面了解，在任何其它出版物中也都没有使用发光的基因以检测细菌或其他微生物。

本发明的一个目的是提供一种特异地 定细菌的快速试验方法。发明的另一个目的是提供一种能够检测和 定低浓度细菌的高度灵敏的测试方法。发明的再一个目的是提供一种能够对被检测细菌进行定量的试验方法。本发明还有一个目的是提供一种检测细菌对抗生素敏感性的试验方法。本发明的这些和另一些目的将在以下的描述中会使人明白的，特别会在附加的权利要求书中加以阐明。

多种植物和动物均表现有生物学上的化学发光作用。化学发光也在微生物中发现。〔即某些细菌（主要是酶生菌，如费希尔弧菌）、真菌和双鞭甲藻〕昆虫（如荧火虫，Photinus    Pyradis）、某些甲壳网动物（即Cypridine    hilgenderfi）、海蜇（水母）、蠕虫以及其它无脊椎动物，甚至哺乳动物。虽然发光的生物化学机制已知是各不相同的（即细菌中所见的发光系统不同于在荧火虫和双鞭甲藻所见的发光系统），但活生物体中光的产生大多是由荧光素酶催化的。细菌的荧光素酶是一种混合功能性氧化酶，含有两个不同的亚单位，各具有大约40000道尔顿的分子量。

在细菌费希尔弧菌中，参与发光系统的酶的合成是受一种小的传感分子即自体诱导物（autoinducer）调节的。细菌生长期间，自体诱导物在生长培养基中积聚，当自体诱导物的浓度达到一个阈值时，即诱发发光系统，导致成千倍增加光的产生。

新试验方法的较好元件是带有发光菌之（通常是酶生菌，如费希尔弧菌）发光系统的DNA片段。

当然，一个带有发光基因的细胞外DNA片段是不能发光的，但是如通过转导和转化的方法将其转移到一种适宜的活的寄主体内，该寄主的遗传和合成机器即可利用这个DNA片段而产生可发射的光。细胞内基因片段如果在被试生物体中表达很差或不被表达，并且只有当外源DNA经某些遗传学方法转移到要检测其存在或不存在的生物体中后，才能成为被表达条件时，则亦可使用这种细胞内基因片段。后一种方法可使用接合方法，即交配和由一个细胞向另一个细胞的基因转移。

通过噬菌体感染（转导）、转化或接合技术将DNA引入细菌细胞内，通常是受供体源的限制的：即DNA转移发生在同一个种的菌株群之间或者亲缘关系密切的种间。有些因子也会限制这种转移，这包括存在于许多菌种和/或其菌株之中的DNA修饰限制系统，也依赖于影响引入DNA的复制的寄主因子和细菌细胞壁上的噬菌体适当受体，噬菌体通过这些受体吸附于寄主细胞上并将其遗传物质注入寄主内。

接合和转化并没有很严格的菌株特异性。有些质粒通过接合不仅可以转移到同种寄主之中，它可转移到相近种寄主中。甚至有几种质粒可通过接合被转移到亲缘较远种的寄主内。转化作用甚至比接合更广的应用潜力，因为相当范围内的许多细菌能感受细胞外DNA。事实上，有许多细菌（如果不是大多数）可能在特殊条件下是可被转化的，但目前尚不知道如何做到，例如，大肠杆菌在正常情况下并不能有效地感受DNA，但在钙休克之后，这种细菌即可被诱发以高效率感受以外DNA。在应用转化方法中，一个限制因素是外源DNA的表达、复制或其遗传信息整合到寄主基因组中去的能力。

与转化和接合不同，转导则是有很高的菌株或菌种特异性的。某些噬菌感染一些菌种通常是关系很近的细菌;大多数则只感染一个单 一种菌株的特殊子菌株。通过使用不同种类的噬菌体品系去感染细菌的品系，可能将一个菌种的不同菌株排列成分类表，这便是所谓的噬菌体分型

重组DNA技术和分子遗传学允许那些产物很容易进行分析的基因引入，因而，如将大肠杆菌的lao    Z基因引入，即可导致被引入基因的表达，例如，用一种噬菌体去引入该基因，然后即可通过分析β-半乳糖苷酶形成的量测知噬菌体接着发生的感染过程。即使细菌细胞本身可能具有这种酶的基因，但也可进行这些测定-这是因为其内源水平可受到适当介质的抑制，而噬菌体遗传物质的扩增导致产生基因的众多拷贝。

本发明中虽然也有许多外源性遗传系统可被利用，但特别有用的还是费希尔弧菌的发光系统，并以其阐明我们的判定已知菌种是否存在的方法。只有少数几个菌种含有能将化学能转化为光能的基因，而其中的大多数又是酶生菌。绝大多数的菌种不含有这样的系统并且是不发光的。如果将产生光的基因引入一种不具有这种能力的细菌并使其在其中表达，那这种细菌将也能发射光。在这样的系统中的本底干扰是极低的（化学发光）。因为可检测到很低水平的光，所以基于这种方法的试验是很灵敏的和可定量的。

依据本发明，我们提供了检测环境中细菌特异类型和细菌组群的方法和组分，其中从合适的供体生物得到含有发光系统或其它遗传系统的外源DNA，通过转化、转导或接合等遗传学手段，转移到没有或含有相当低水平内源性DNA的寄主菌内。供体遗传物质进入待检测的生物体中，导致被引入系统的表达。这样的引入基因在待测生物 中的表达，就可以检测其存在与数量。另外，如果引入时加进抗生素，还可检测寄主生物体对抗生素的敏感性。本发明的一个较好方法包括将得自发光菌（或其它来源）的发光系统或其一部分转移到非发光寄主微生物内，接着在该寄主中表达荧光素酶或其它系统并伴随产生光或其它标记。本发明亦可用以检测试样中的抗生素，分析微生物对抗生素的敏感性，或者分析抗生素活性组分等。

另外，本方法亦可使用于任何在其进入欲被检测存在或不存在的这种细菌之前，细菌对之不能表达或表达很弱（差）的其它遗传系统。例如，引入编码酶或蛋白质（如大肠杆菌的β-半乳糖苷酶或鸡的卵白蛋白）的基因，可通过酶学分析，或者也可使用免疫分析法监测其表达水平，这些测定手段可以是基于pH改变或H+以外的离子浓度改变;或者特定分子的产生（如氨基酸、碱基、脂等）或特定分子的降解或消失;气体（如大肠杆菌产生的H2）的产生;颜色的形成或消失（如碱性磷酸酶催化对位硝基苯酚磷酸酯成为对位硝基苯酚）或者在给定波段具有特殊光吸收特性的分子或放射活性标记的分子的形成或消失，依赖于初级产物的次生分子的产生或消失等等。

发光细菌主要是酶生菌，典型的就是费希尔弧菌。含有发光系统的DNA来自发光细菌，荧火虫、双鞭甲藻或发光真菌类，可能是天然存在，在这里它们则都是来自其发光器官。另外，来自发光细菌或其他来源的含有发光系统的DNA或其部分DNA也可以用发光系统或来自发光来源的部分进行人工重组或合成。

在有细菌发光系统参予情况下，可望在培养基中会含一定量发光菌的自体诱导物，从中衍生出发光系统或其一部分，以便避免在寄主生物体内为形成自体诱导物所需要的长时间培养过程。如需要时，也 可以向培养环境中加入一种脂族醛，以加速和提高来自发光细菌的发光系统或其部分的表达。在这些例子中，可将发光系统以外的外源遗传标记物系统引入到适用的寄主中，这样也许有利于引入中间体、前体、酶底物或其它成分，以加速或提高标记物遗传系统的表达或表达的检测。

在寄主生物体中，含有得自发光菌或其它来源的发光系统或发光系统一部分的DNA，通过RNA聚合酶的作用被转录成mRNA，之后mRNA被翻译成发光系统蛋白质。借助于闪烁计数器甚至可检测到单个细菌的光发射。

从而可以看出，依据本发明，由两个非发光部分    之间相互作用而产生发光：即被检测的生物体和上述含有来自发光细菌或其它来源之发光系统或发光系统一部分的DNA之间的相互作用，而产生发光。因此，根据任何显示出超过本底的化学发光，便可确定有寄主微生物存在;相反地，如果没有超出本底水平的化学发光，则可证明不存在寄主微生物。这样一种技术是以前从未提出过的。

依据本发明，有可能作出标准曲线以显示它们的关系，例如可画出发光水平或其它表达系统水平与所检测的细菌浓度之间相互关系的标准曲线。使用这一曲线，可大致估计出环境中细菌的量。

通过转化、转导或接合的传递，可将含有来自适当供体的发光或其它标志物系统的DNA转移到寄主生物体中。有许多微生物种属可作为噬菌体的寄主以及保留或接受质粒。这样的菌属的例子有：挨希氏杆菌属、气杆菌属、沙门氏杆菌属、志贺氏杆菌属、克雷伯氏菌属、变形杆菌属、假单胞菌属、葡萄球菌属、链球菌属、衣原体属、枝原体属、肺炎球菌属、奈瑟氏菌属、梭菌属、芽孢杆菌属、棒状杆菌属、 分枝杆菌属、Camphybacter、弧菌属、沙雷氏菌属、肠杆菌属、普罗威登斯菌属、色素杆菌属、布鲁氏菌属、耶尔森氏菌属、嗜血杆菌属以及博德特氏杆菌属。

为特异而收集的噬菌体应对被检测的细菌是特异的。如需要时，可用不同的噬菌体进行一系列试验，这些实验既可连续进行也可以同时进行。

有些噬菌体可通过包装DNA来构建，把含有得自发光细菌或其它适当生物来源的发光系统，或发光系统一部分或其他供体标记系统的DNA与合适的噬菌体衣壳进行包装构建。另外噬菌体亦可用限制性内切酶通过重组DNA技术再用包装或不包装进行构建。再者，也可通过自然发生的遗传重组机制构建含有全部或部分发光或其它系统的噬菌体。这一技术也包括了使用人工重组和自然重组。

为了接合，本发明提供了可在转移复制子中含有发光系统或发光系统一部分的细菌菌株。复制子可以是细菌染色体的或质粒的。可通过噬菌体或遗传重组（自然的或人工的）将发光系统或发光系统一部分引入，这样发光基因即可共价结合于转移的遗传物质上。另外，任任何其他遗传系统，其初级和次生产物如早期所述那样可被测定，那末也可以用同样方式进行。为了说明起见，拿发光作为切合而又特殊的例子阐述本发明比较一般的原则基础。

例如，依据本发明的接合，可使用Hfr（高频率接合）的细菌菌株，它是带有发光系统的温和噬菌体的溶源菌株。显然另一类Hfr株或供体株也可通过遗传重组天然的或人工的或通过加入遗传物质得到使得Hfr菌株或供体株带有发光系统或发光系统一部分。

在完成根据本发明所叙述的试验中，寄主生物体所进行的代谢活 动涉及发光或其它供体系统的形成;这包括蛋白质合成和产生还原能力的过程。影响这些过程或改变细胞完整性的抗微生物试剂能取消或降低供体遗传系统（即发光等）的形成。因此根据本发明可能测定细菌对各种抗菌试剂如抗生素的敏感性。为此，在给定的抗菌剂存在下，受到DNA转移之被试细菌的特殊类型和类群，以及被表述之供体遗传系统（即发光）的动力学-是寄主细菌的蛋白质合成能力和总代谢的函数，都能被检定。最好同时进行试验，即一种细菌是处于没有任何抗菌剂的条件下，而其它的几种细菌每种都处于有特殊抗菌剂的条件下，通过比较这些试验的结果，即可得到被试细菌对各种抗菌剂之敏感性的结论。

特殊试验方法的描述

1、材料和方法

Ⅰ、生长培养基

A、LB（Lennox肉汤培养基）。（Lennox，E.S.1955，“通过噬菌体转导寄主联锁的遗传性状”，Pl.Virology    l：190-206）。〔10克胰蛋白胨;5克NaCl：5g酵母提取物;1升蒸馏水;4毫升1N    NaOH〕。

1、培养皿：加入琼脂15克/升。

2、于121℃蒸汽高压灭菌15分钟。

3、按说明加入：（a）氨苄青霉素30毫克/升;（b）氯霉素30毫克/升;（c）四环素15毫克/升。

B、FT〔10克胰蛋白胨;5克NaOH;2克麦芽糖;10毫升1摩尔MgSO4;1升蒸馏水〕

1、于121℃蒸汽高压灭菌15分钟。

2、按说明须加入：（a）氨苄青霉素30毫克/升;（b）氯霉素30毫克/升;（c）四环素15毫克/升。

C、用于噬菌体的T〔10克胰蛋白胨;5克NaCl;10琼脂;1升H2O〕

1、于121℃蒸汽高压灭菌15分钟。

D、TA（Top Agar）〔10克胰蛋白胨;5克NaCl;6.5克琼脂;1升H2O〕

1、于121℃蒸汽高压灭菌15分钟。

E、复合液体培养基（ASMRP）和复合固体培养基按Ulitzur等人所述的方法制备（Ulitzur，S.，Weiser，I.和S.Yannai    1980：“一种用于测定诱变化合物的新的、灵敏的和简单的生物发光试验”，Mutation    Res.74：113-124）。

Ⅱ、菌株和DNA

A、细菌菌株

1、MM294大肠杆菌K12    ehdA    thi    Pro    hsdR（Backman，K.，Ptashne，M.和W.Gilbert，1976：带有噬菌体之cI基因的质粒的构建。Proc.Natl.Acad.Sci.USA73：4174-4178）。

2、JM101大肠杆菌K12    endA    thi    SbsB    Sup    lac-pro/F′traD    ProAB    IacI    Iac    z△M15（Vieira，J.和J.Messing，1982：“PUS质粒，一种用于插入诱变和序列分析以及带有合成的通用引物的M13mp7衍生系统”，Gene    19：259-268）。

3、W3110大肠杆菌K12F-野生型（Yanofsky，C Horn，V.，Bonner，M.和S.Stasiowski，1971：“大肠杆菌色氨酸操纵子之前三个基因在突变体中的极性和酶功能”，Genefics 69：409-433）。

4、AT    2448大肠杆菌K12    Hfr    H    thi    met。

5、CSHI    大肠杆菌K12    lac    trp    sbrA（Miller，J.H.1972：分子遗传学实验。冷春港实验室，Cold    Spring    Harbor，N.Y.）。

6、普通变形杆菌。

7、白色葡萄球菌。

8、产气气桿菌    62-1（Gibson，F.，1968：分支酸，94-79页，W.E.M.Lands编辑的“生物化学制备”，12卷，John    Wiley父子出版公司，纽约）。

B、噬菌体株

1、入cI+野生型。

2、入卡龙30（Maniatis，T.，Fritsch，E.F. 和J.Sambrook，1982：冷泉港实验室，Cold    Spring    Harbor，N.Y）。

2、入cI    1857    S    7（Miller，J.H.，1972：分子遗传学实验。冷泉港实验室，Cold    Spring    Harbor，N.Y.）。

4、λcI-b2。

5、λcI    S57    S7    plac5（Miller，OP.Cit.）。

C、质粒和DNA

1、PBR，322    4.364碱基，含有氨苄青霉素和四环素抗性基因（Bolivar，F.，Rodriguez，R.L.，Greene，P.L.，Betlach，M.C.，Heynecker.H.L.，Boyer，H.W.，Crosa，J.H.和Falkow，S.，1977：新的克隆载体的构建和鉴定。Ⅱ，多用途的克隆系统。Gene    2：95-113）。转化后，这些抗生有利于检测质粒或其重组体的存在。

2、4.3碱基的PACYC184    A质粒，含有对四环素和氯霉素抗性基因（Chang，A.C.Y.，和Cohen，S.N.，1978：自P15A隐性微小质粒衍生来的可放大的多拷贝DNA克隆运载体的构建和鉴定，J.Bacteriol.134：1141-1156）。

Ⅲ、噬菌体技术

主要使用Miller（loc    cit.）所介绍的技术，所不同只是所用平板培养基为T，液体培养基为FT。

Ⅳ、细菌DNA的制备应用Marmur的方法（Marmur，J.1961：从微生物中分离脱氧核糖核酸的方法。J.Molec    Biol.3：208-218）。

Ⅴ、限制性内切酶的使用和来源

限制性内切酶购自BRL，New    England    Biolabs，Boehringer和Amersham。按照New    England    Biolabs公司产品说明书介绍的方法用这些酶降解DNA，不同的只是在所有各例中均以100微克/毫升白明胶代替牛血清白蛋白。DNA浓度不超过2微克/20微升。

A、琼脂糖凝胶

1、2克琼脂糖（Sigma商品目录A6013号）。

2、200毫升TAE缓冲液（LX）;TAE缓冲液10X：

（a）484克Sigma    7-9Tris（羟甲基氨基甲烷）商品目录TI379号（Tris    HCl）;

（b）27.2克醋酸钠;（c）10.5克NaCl;

（d）7.5克乙二胺四乙酸二钠;（e）17毫升浓盐酸;（f）925毫升蒸馏水;（g）pH8.2（25℃）;

（ⅰ）向各DNA样品（1-20升）中加入溶于甘油的4微升溴酚兰。

（ⅱ）凝胶电泳在缓冲液40-250毫安培电流中进行直到染料泳动-适当距离后停止。

3、必要时，用限制性内切酶HindⅢ或EcoRI将λcI857    S7    DNA酶介，用作分子大小的参照标准使用。应用回归分析法确定分子长度的log值与泳动 距离之间的关系。当相关系数大于r＝0.99时，这个标准则被认为是可接受的。

4、将凝胶放在塑料盘中，用足够的水复盖以进行染色。加入七滴浓度为10毫克/毫升的溴化乙锭（Sigma    E8751），并将盘子轻轻倾斜使之扩散。15分钟后吸去过多的染料，用水冲洗凝胶后用无染料的水再复盖之。15分钟后除去水，将凝胶放在长波长紫外光盒上即可看到DNA条带。用柯达TriX胶片照相。

Ⅵ、连接

加入十分之一体积的3N乙酸钠和2.2体积的经重蒸馏过的96%乙醇沉淀经限制性内切酶酶介的DNA。于-70℃冷冻后放在干冰-乙醇浴中用Eppendorf离心机在Eppendorf管中离心10分钟，小心除掉并弃去上清液，用100微升70%乙醇洗沉淀团块，离心3分钟，去除并弃去上清，用真空在干燥器中将沉淀团块抽干，再将团块再悬浮于水中。连接反应在20μl内含4微升5倍浓缩的激酶-接头缓冲液（Maniatis等人，loc.cit.）和1微升DNA连接酶（New    England    Bilabs产品，产品目录202号，400单位/毫升）中进行，于25℃保温12-16小时。DNA浓度通常为0.5-1.0微克/20微升反应液。

Ⅶ、质粒DNA的制备

A、小体积制备粗制质粒DNA。

1、将含有质粒的菌株在含抗生素的LB培养基中于37℃ 培养过夜，因质粒赋于细菌对该抗生素的抗性，故只有带有这种特定质粒的细菌才能增殖。

2、取1毫升细胞悬液，在Eppendorf离心机中离心20秒。

3、弃去上清并将沉淀团块再悬浮于50微升STET缓冲液（8%蔗糖，5%Triton-100，50毫摩尔二乙胺四乙酸二钠，50毫摩尔（羟甲基氨基甲烷）-HCl，PH8.0）。

4、加入4微升浓度为10毫克/毫升的溶菌酶（Sigma产品，目录号L6876）。

5、将悬液在沸水中沉浸40秒钟。

6、立刻将悬液在Eppendorf离心机（5412型）中离心20分钟。

7、将上清小心移入另一离心管中，弃去沉淀团块。

8、加50微升异丙醇，混合离心管内容物，置于乙醇-干冰浴中，-70℃放置10分钟。

9、在Eppendorf离心机中离心10分钟。

10、除去上清。于真空下将沉淀团块抽干10分钟。

11、将沉淀团块重新悬浮于50微升0.3摩尔乙酸钠溶液中。

12、加150微升重蒸乙醇，混合离心管内容物，并在乙醇-干冰浴中-70℃放置10分钟。

13、离心10分钟，小心倾去上清。

14、加200微升冷（-20℃）70%乙醇冲洗沉淀团 块，但不搅散团块。

15、离心2分钟，倾去上清，于真空下抽干沉淀团块。

16、加20微升H2O使沉淀团块重新悬浮。

17、对于大多数质粒，约可回收1微克相当纯的质粒DNA。

B、用氯化铯-溴化乙锭平衡密度梯度离心方法制备高度纯化的质粒DNA。

1、将1升培养物在含有适当抗生素的LB培养基中培养12-16小时，以使只含特殊质粒的细菌生长。

2、把培养物放在四个250毫升离心杯中于0℃冷却并以5000×g离心10分钟。弃去上清。

3、用20毫升含1毫摩尔二乙胺四乙酸（EDTA）的25毫摩尔Tris-HCl缓冲液（pH7.9）洗沉淀团块。

4、再将各沉淀团块悬浮于7.5毫升在50毫摩尔Tris-HCl（PH8.0）中配制成的25%蔗糖液中，并将各份重新悬浮的沉淀团块转移入40毫升聚丙烯管（Oak    Ridge型）中。

5、加15毫升溶菌酶（Sigma产品，产品目录号L6876）该溶菌酶在0.25摩尔Tris-HCl（PH8.0）中以5毫克/毫升浓度临用时配制，混合并于0℃保持5分钟。

6、加3毫升0.25摩尔NaEDTA（PH8.0），混合并于0℃保持5分钟。

7、加温至室温并加1毫升十二烷基磺酸钠（SDS）溶液（在50毫摩尔Tris-HCl中制成12.5%，PH8.0）。用轻轻倒置混合之并放置15分钟。

8、冷却至0℃并加25毫升5摩尔NaCl。用轻轻倒置混合之并于0℃放置30分钟。

9、于-4℃，以43，000g（Sorvall    SS-34转头19，000转/分）离心45分钟。

10、将四份上清（各约12毫升）轻轻倒入四个40毫升的聚丙烯管中，弃去沉淀团块，用等体积水稀释。

11、RNA酶在T1缓冲液中于80℃加热20分钟使任何DNA酶失活后，在各管加50微升（10毫克/毫升，Sigma产品，产品目录号R 5503）。T1缓冲液：10毫摩尔MgSO4，0.5毫摩尔CaCl2，0.1%白明胶，6毫摩尔Tris-HCl，PH8.0。于37℃留存1小时。

12、冷却并加4毫升用STE缓冲液饱和的苯酚。STE缓冲液：10毫摩尔Tris-HCl（PH7.9），10毫摩尔NaCl，1毫摩尔EDTA。充分混合并于0℃以16000g离心15分钟。

13、从各管中小心把上层（液相），倾入一个250毫升离心并中。加四分之一体积的5毫摩尔NaCl并混合之。加入两倍（总）体积量的乙醇并混和之。于-20℃放置至少12小时。

14、以9，000转/分离心45分钟。弃去上清。加50毫升70%乙醇并轻轻洗沉淀团块。以9，000转/分离心20分钟。移除并弃去上清。于真空下将沉淀团块干燥15分钟，重新悬浮于5毫升STE缓冲液中。

15、加STE使含DNA溶液达到46.2毫升。加45克氯化铯，再加1.8毫升溶于STE缓冲液的浓度为10毫克/毫升的溴化乙锭（Sigma产品，产品目录号E8751）溶液。调整溶液，使其折光率rD在1.3870-1.3880之间（ρ＝1.565-1.576）。

16、向6个3×5/8英吋的同质异晶聚合物管内各吸移10毫升混合物，试管加帽并以石腊油充填，用Ti50转头以38，000转/分于15℃离心48小时。

17、使用1英寸20号针头和3毫升注射器吸出较低的带（用紫外光灯观察）。用等体积异丙醇抽提溴化乙锭四次（储备品保存用CsCl饱和的STE缓冲液）。

18、用4体积水稀释分离的水溶液再加2倍总体积的乙醇（96%），于-20℃保存12小时。于40毫升聚丙烯管中于-4℃以19，000转/分离心1小时。丢弃上清。将沉淀物倾出于真空下干燥15分钟。将DNA提取物重新悬浮于1毫升STE缓冲液中。

Ⅷ、转化（参照M.Mandel和A.Higa，1970：依赖钙的噬菌体DNA感染，J.Molec、Biol，53：159-162）。

将欲作转化的细菌菌株于37℃在LB培养基中生长过夜。以1：200稀释度加入新鲜LB培养液，于37℃通气培养，直到其于600毫微米的吸光率（A）为0.5。在冰浴中冷却培养物（原始体积），之后用Backman离心机（JA20转头）于0℃以7000转/分离心7分钟。将细胞重新悬浮于同体积冰冷的0.1摩尔MgCl2 中，并按上述条件再次离心。将细胞沉淀物再重新悬浮于原体积一半的0.1摩尔CaCl2中并于冰浴中放置30分钟。如前一样离心该悬浮并再次悬浮于原体积十分之一体积的0.1摩尔CaCl2中。这些细胞就是转化感受态细胞。

取0.2毫升经浓缩并经CaCl2处理过的细胞与1-100微升含0.1-2微克DNA的溶液混合。混合物于0℃放置30分钟，在42℃水浴中加热3分钟并再次在冰浴中放置20分钟。之后加0.8毫升LB培养基并将培养物于37℃放置1小时，因为细胞正在从经钙休克中恢复过来，故可允许基本上没有细胞分裂的情况下表达抗生素抗性。将培养物分成几部分加于LB平板（含适当抗生素）上。对照组包括未转化的但经Ca++处理的细胞以及用已知量未酶解的质粒转化的细胞。

Ⅸ、PBTK5的构建及进入MM294大肠杆菌的转化。

用限制性内切酶Sal    I30单位将费希尔弧菌菌株MJ1的DNA（8微克）在37℃酶解处理3小时。质粒pBR322的DNA（6微克）也作同样处理。用琼脂糖凝胶电泳以检测样品，查对酶解是否接近完全。

用醋酸钠-乙醇沉淀酶切的DNA并将干燥的沉淀物重新悬浮于水中。用400单位DNA连接酶催化使2微克费希尔弧菌（V.fischeri）DNA与0.5克pBR322 DNA连接。加入200微升H2O和40微升STE饱和的苯酚终止反应。涡动混合物并离心。上清液用醋酸钠-乙醇沉淀，并将连接过的DNA的沉淀物重新悬浮于40微升H2O中。

培养3并制备好用于转化的受体菌株MM294。对照转化 组含1微克pBR322 DNA（loc.Cit.）。转化后将细胞加于含氨苄青霉素的LB平板上。不加DNA的细胞不产生菌落。在对照转化组中得到264×106个转化体/微克pBR322 DNA。连接的混合物得到3.2×104个转化体/微克细菌DNA，总共得到6×104个转化体。经检查四环素抗性基因的插入失活（因为Sal I位点在四环素抗性基因上，故外源DNA的插入致使该基因失活），结果发现这些转化突变型中有5%含费希尔弧菌DNA的插入片段，从而得到大约3000个有插入片段的菌落。而这些菌落中有七个是发光的。

对这七个含DNA的菌落分析后，选出一个含有质粒（pBTK5）-具有单一的约8千碱基的插入片段和两个Sal    I位点的菌株。这一结果与Engebreht等人（loc.Cit）所述的实验结果相符。

Ⅹ、PAChv-1的构建及其对MM294大肠杆菌的转化。从含有按照上述Ⅸ得到pBTK5质粒的MM294菌株中提取并用CsCl-溴化乙锭纯化该质粒DNA，再用限制性内切酶Sal    I酶介，通过琼脂糖凝胶电泳查对酶切部分。pACYC184质粒DNA用同样方法制备，用Sal    I酶切并依上述方法分析。连接并转化到MM294大肠杆菌细胞中后，用标准方法对有氯霉素抗性（来自pACYC184）和发光（30℃）的菌落进行分析。保留含质粒（pAChv-1）的菌株，并列入永久保存菌株（ATCC53133）因其具有pACYC184的骨架和插入到pACYC184之Sal    I位点的能产生光的8千碱基片段。

Ⅺ、λL1、λL4、λL5、λL28、λL32、λL35和λL40的构建。

按Maniatis（loc.cit.）所述的方法，纯化噬菌体λ卡龙（Charon）30DNA（0.3微克），用限制性内切酶Sal I酶切并与按上述方法Ⅸ中所述作相同酶切得到的pBTK 5DNA（0.5微克）连接。连接后用醋酸钠-乙醇沉淀DNA，干燥沉淀物并重新悬浮于5微升H2O中。

按Maniafis的报导（loc.cit.）中介绍的B.Hohn方法制备包装DNA的混合物。连接好后DNA的包装是依照Maniatis（Loc.cit.）的设计方案进行的，并用在FT培养基中生长到静止期的MM294倒平板。用把噬菌斑移入内含1ml FT培养基，0.1ml MM294菌生长的FT培养液的闪烁瓶内以检查能产生光的噬斑。使用巴士德吸管将个别噬斑移入1毫升10毫摩尔MgSO4中。将其中之0.1毫升移入小瓶。

能产生光的噬斑的噬菌体被纯化两次，制取平板裂物并用加几滴氯仿以储存噬菌体制品。这些噬菌体于27℃在FT培养基中感染生长的菌株MM294，从而对噬菌体的光产生性质进行 定。向二重瓶内加自体诱导物（Nealson，K.H.，Platt，T.，和Hastings，J.W.，1970，细菌发光系统合成和活性的细胞控制。J.Bacteriol，104：313-322）。有时λL1、λL35和λL40产生光比其它的噬菌体明显晚，所产生的光也相对地少，如果噬菌体感染发生在有自体诱导物存在时，则所发射 光的量即大大增加。噬菌体株λL4、λL5、λL28和λL32于感染后15-20分钟内产生光，而且所发射的光量，随时间而增加并于约1小时后达到最大。自体诱导物对这些噬菌体所产生的光量没有显著影响。

因为已被克隆的含有光基因的片段是用限制性内切酶Sal I酶切的，这个片段插入到用同一酶酶切的λ卡龙30上，可能有两个不同的定向。一种定向中，荧光素酶和醛基因（Engebrecht Op.cit.）接近λ的N基因，而ux操纵子的调节基因则靠近λ的J基因。在这个定向中，醛基因和荧光素酶基因的转录将只依赖于由lux的启动子转录，因为转录方向是与λ的PL启动子的转录方向相反。在此情况下，自体诱导物应该并且能够刺激光产生。λL1、λL35和λL40很可能就是在这个定向上有插入片段的噬菌体，因为它们的光发射明显地受到自体诱导物的激发。

第二个可能的定向是lux操纵子的调节基因靠近λ的N基因，而醛基因和荧光素酶基因则在J基因一侧。因为醛和荧光素酶基因的转录方向与λ的PL启动子转录方向相同，所以这些基因不仅用它们自身的启动子转录，而且甚至更多的是用PL启动子开始转录。这样，向这些噬菌体感染的细菌培养物中加入自体诱导物，对光产生应是很小或者没有影响。

这些噬菌体中的两种即λL4和λL28，已作了研究，发现它们的插入方向与基于上述生理观察和理论推论所预期的方向相一致。按Manialis（Op.cit.）所述的方法，用CsCl梯度纯化噬菌体作为DNA来源，从λL4和λL28制备噬菌体DNA。

琼脂糖凝胶电泳显示用限制性内切酶Sal    I酶切这些DNA可 产生三个大的片段，其中两个较大的条带是λ卡龙30的臂，其为噬菌体增殖所必需的，最小的条带约8.8千碱基，与从pBTK5用同一酶酶切的带相同。因此，在两种噬菌体中插入的DNA片段似乎与最初来自费希尔弧菌属的克隆片段相同。在λL4和λL28中插入的方向可通过用Pst    I限制性内切酶酶解区别。λ卡龙30具有正常λ序列，直到大约第23616碱基对（Hendrix    R.W.，Roberts，J.M。，Stahl，F.W.和Weisberg，R.A1983：λⅡ，冷泉港实验室，Cold    Spring    Harbor，纽约，附录Ⅱ，PP519-676）之后缺失从约近碱基对23616至28312间的b1007碱基28312到34449间序列又正常。在碱基34449处一个较早期序列本身重复并且这个重复是以碱基对22346开始。该重复继续到碱基对23616，之后缺失（b1007）直到碱基对28312。从这个碱基对开始，正常序列继续到大约碱基对35384，在这一点上第二个不同类型的缺失，即KH54开始，并去掉DNA直到碱基对37925。之后正常序列继续到大约碱基对40502，在这一点上第三个类型（nin5）缺失去掉DNA直到碱基对43307。在这个碱基对之后序列正常，直到DNA末端碱基对48502（这些数字是作为正常噬菌体λ的正常碱基对等同序数给出的;见图9）。可见λ卡龙30含有1个重复和4个缺失（其中两个是相同的）。λ卡龙30中的各种限制性内切酶酶切位点（见图10）的等同序号可在Hendrix的文章（Op.Cit.）之附录Ⅲ中见到。他们估计噬菌体λ卡龙30有46757个碱基对。根据已发表的资料，该噬菌体似乎应有46331个碱基对，但就我们目的来说，这一差异并不重要。

λ卡龙30中由Pst    I酶切得到的限制片段的图式可从上面对其DNA序列的描述计算出来。除去内在的Sal    I片段并插入lux操纵子Sal    I片段之后，这一图式当然会被改变。Pst    I位点到碱基对22425，将与正常λ相同，也即与λ卡龙30相同。在λ卡龙30中位点22425和32009之间的部分（含有除去4696碱基对的b1007）将会产生一个4888碱基对的片段，该片段也出现于本文所述的“发光”噬菌体中。然而，该DNA插入将改变PstI位点在碱基对22425处和末端之间的样式（与正常λ同位）。由λ卡龙30除去内在Sal    I片段之后，λDNA碱基对32256处（大多数末端Pst    I位点保留）和噬菌末端将不存在PstI位点，这是因为λ卡龙30中碱基对37005处的PstI位点因KH54缺失而被删除。在含有lux操纵子的Sal    I片段中有一个PstI位点，其位置很接近末端（离开末端约200碱基对），而且位于操纵子的调节区域内。

据此，如果lux操纵子的Pst I位点接近于λ中最后的PstI位点，则Pst I酶切将产生出一个约700碱基对的小片段和一个约18-19千碱基对的大片段。这应是予期的λL1、λL35和λL40的酶切图式。相反地，如果lux片段的Pst I位点是向着λ的远中端，那么就会得到两个约近乎相等大小的片段（大约9和11千碱基）。λL4和λL28DNA经酶切后得到是后一种图式，这便肯定了我们以下的推测：即lux操纵子的荧光素酶和醛基因定位到λ的近侧端，并且具有如由PL启动子转录相同的转录方向。

可能提出的最后一个问题是，λL4和λL28的结构与噬菌体和插入DNA之间它们的Sal    I连接点有关。λ卡龙30有四个 Sal    I位点，这四个位点被分成两对;在各对位点内，两位点仅仅被499个碱基对分开，而两位点对之间的距离约近7000碱基对。当λ卡龙30用作运载体并用Sal    I限制性内切酶酶切而产生λL4和λL28时，位点对之间片段将可被lux操纵子片段所替代。是否重组噬菌体含有2，3或4个Sal    I位点尚不甚清楚。如果只有两个Sal    I位点，则lux操纵子和λDNA之间的连接是在λ的最远中和最近中Sal    I位点处;如果有四个Sal    I位点，则lux片段便连接到λ卡龙30的两个最里面的Sal    I位点。如有3个Sal    I位点，即表明有一对Sal    I位点仍存在于插入片段的一端，而另一端是一个单一的Sal    I位点。

λ卡龙30的7千碱基内部片段要被去掉的，因为假如不是这样，lux操纵子的加入将导致被包装的噬菌体DNA分子太长。

在一个凝胶板上能看到留有3或4个Sal    I位点时产生的小（499碱基对）片段，但不能确定有3个还是4个位点，因每一对给出一个大小相同的片段。为解决这个问题须进行限制性内切酶ScaI酶切，因为Sca    I在一对的两个Sal    I位点之间酶切λDNA。这样，如果一个或两个Sca    I位点消失，则没有或有一对Sal    I位点留在重组λ中。在lux操纵子中没有Sca    I位点。Sca    I在位点16420、18683、25684、27262和32801碱基对处切断野生型λDNA。在λ卡龙30中，16420和18683处的位点存在，而在25684和27262处的位点缺失。因为λ野生型中有两对Sal    I位点而不是一对，所以λ卡龙30中32801上的位点出现两次。在入卡龙30中除在碱基对16420和18683上的位点外，在碱基对28391和35819处还有一个ScaI位点。ScaI酶切后，λ卡 龙30被切为16420、2263、9708、7428和10938碱基对片段。具有lux操纵子和只保留2个Sal    I位点的重组噬菌体，在Sca    I酶切后将得到16420、2263和一个大约28000碱基对的片段。存在3个Sal    I位点的，在用Sca    I酶切后，根据一对Sal    I位点是否仍留在远中或近中端，则既可得到有16420、2263、9708和大约19000碱基对的图式，或者得到有16420、2263、大约18500和10938碱基对的图式。存在两对Sal    I位点，经Sca    I酶切后将产生出16420、2263、9708、大约9300和10938碱基对的片段。

由Sca    I核酸内切酶酶切分析的结果可知，λL4含有4个Sal    I位点，而λL28有3个Sal    I位点。λL28保留Sal    I位点的近中对和来自λ卡龙30的最远中Sal    I位点。λ野生型、λ卡龙30、λL4和λL28的这一结构在图9上图解分别为10、11和12。

Ⅻ、能转移发光的Hfr株的构建。

将Hfr大肠杆菌K12菌株AT2446变成为发光噬菌体λL28溶源性菌株，这可通过以λL28和λcI+同时感染AT2446来完成。后一种噬菌体为提供整合功能、整合的λatt位点以及活化阻遏物基因以产生溶源化所必需。：λL28中这三者均缺乏。通过继后用本身不能致溶源但能杀死非溶源源菌的λCIb2噬菌体攻击除掉非溶源细胞。分离出产生光的、紫外光诱导后产生噬菌体及携带发光基因的幸存细胞。

ⅩⅢ、生物发光检测。

将体内发光试样放在闪烁瓶内，用与Mitchell和Hastings所述相似的光电倍增管光度计（Mitchell，G.W.，和Hastings，J.W.，1971：一种稳定的廉价固态，光电倍增管光度计。Anal.Biochem.39：243-250）检测。当发光强度低于106量子/秒时，于25℃使用的闪烁计数仪（Paokard 2001型）该仪器应在3H定位上不重合。发光是使用Hastings和Weber的标准（Hastings，J.W.，和G.Weber，1963：各方同源的总量子通量。J.Opt.Amer，53：1410-1415）以每秒量子（量子/秒）表示。

ⅩⅣ、从费希尔弧菌MJ-1制备自体诱导物。

为了制备含自体诱导物的无细菌条件培养基，把费希尔弧菌MJ-1接种在ASWRP液体培养基中，于22℃震摇培养。将有高度发光的生长对数期晚期培养物（80-100Klett单位，滤器66）于4℃以10，000g离心15分钟。使上清液通过0.22微米孔径的滤膜（Millipore公司产品）除菌。这些制品于4℃可储存长达30天而不丧失活性。

对费希尔弧菌自体诱导物的生物学分析使用先前Nealson所述的方法进行（Nealson，K.H.，Platt，T.，和Hastings，J.W.，1970：细菌发光系统之合成与活性的细胞控制。J.Bacteriol.104：313-322）。

ⅩⅤ、β-半乳糖苷酶的分析

依据Miller的方法（Op.cit.）进行分析。应用氯仿和SDS（十二烷基磺酸钠）以使细胞能透过邻硝基苯半乳糖苷（ONPG）。

ⅩⅥ、保存。

已经说明，本发明的构建物（即质粒和噬菌体）已在美国标准菌种保藏中心（ATCC）（Rockville，MD    20852，U.S.A.）作永久保存。

2、图的目录

本发明附图图解的说明如下：

图1：用噬菌体λL28转导方法检测大肠杆菌菌株W3110;

图2：用噬菌体λL4转导以检测大肠杆菌菌株W3110;

图3：用1微克pBTK5    DNA转化以检测大肠杆菌K菌株MM294不同浓度。

图4：在用1微克pBTK5    DNA转化检测大肠杆菌菌株MM294中细胞浓度和光发射出现之间的相互关系;

图5：于各种抗生素存在下用1微克pBTK5    DNA转化大肠杆菌菌株MM294时发光的动力学;

图6：用1微克pBTK5    DNA转化大肠杆菌菌株MM294的特异性;

图7：用接合方法检测大肠杆菌菌株W3110;

图8：用噬菌体λcI    857    S7    plac    5转导以检测大肠杆菌菌株CSH1;

图9：λ野生型的相对的限制性内切酶酶切位点图谱;

图10：λ卡龙30的相对的限制性内切酶酶切位点图谱;

图11：λL4的相对的限制性内切酶酶切位点图，拓朴特征，从lux启动子转录，以及从PL转录示意图。

图12：λL28的相对的限制性内切酶酶切位点图，拓朴特征，从lux启动子转录，以及从PL转录示意图。

3、特定实施例

通过以下实施例进一步说明本发明。这些实施例只是作为范例以阐明本发明的一般的和广泛的原则，无论如何不能将其看作是对本发明的限制。

实施例1：用噬菌体λL28转导检测大肠杆菌菌株W3110。

将大肠杆菌W3110接种在FT培养液中30℃培养生长到对数前期。将培养物稀释10倍，取两份每份1毫升并把此样品移入无菌闪烁瓶中。每瓶加25微升λL28，效价为5×109PFU/毫升（PFU＝噬斑形成单位）。依前述材料和方法Ⅺ部分中所述制备λL28（ATCC 40183号）噬菌体。将瓶置于闪烁计数仪中，于25℃温育并按上述材料和方法ⅩⅢ中所述将发光作为时间的函数检测。图1所表示的是温育60和120分钟后作为大肠杆菌浓度之函数的发光量。本底计数为15，000opm。

实施例2：用噬菌体λL4转导以检测大肠杆菌菌株W3110。

将大肠杆菌在FT培养液中培养。用盐水（100毫升）稀释培养物，分别得到终浓度为101、102、103和104细胞/毫 升的稀释液。将各为100毫升的样品通过0.45微米M：llipore滤膜用面向上放置在无菌闪烁瓶中进行过滤。各瓶加1毫升含λL4（7×107PFU/毫升）的培养液。λL4依上述材料和方法Ⅺ制备的。按上述材料和方法ⅩⅢ所述，于22℃培养40、60和100分钟后测定各瓶的发光量。图2表示光发射（CPM）和大肠杆菌的细胞浓度之间的关系。

实施例3：用λcI    857    plac    5转导以检测大肠杆菌菌株CSH1。

大肠杆菌菌株CSH1在FT培养基中，于37℃震荡培养。37℃培养20小时后，在LB平板上肉眼计数，检定每毫升的细胞数目。用FT无菌培养基将对数生长的细胞稀释2倍。各瓶内加入异丙基硫代半乳糖苷（Sigma产品，产品目录号15502），使其终浓度达到100毫摩尔。

加λcI 857 plac5噬菌体，达到终浓度为109噬斑形成单位/毫升。终体积为2毫升。将小瓶于37℃震荡培养45分钟。之后加2毫升Z缓冲液（Miller，op.cit.）再加0.1毫升氯仿和0.05毫升SDS（0.1%）。借助涡动混匀器将小瓶内容物混合（30秒）并向各瓶加0.8毫升ONPG（8毫克/毫升）。ONPG用0.1摩尔磷酸钠缓冲液PH7.0中配制。将小瓶于37℃用轻微震荡培养60分钟，并加2毫升Na2CO3（1摩尔）终止反应。用Bausch和Lomb Spectronic 20分光光度计于420毫微米（邻位硝基苯酚）和550毫微米（由细胞物质引起的混浊）检测显色反应。

图8所表示的是作为细菌浓度之函数的（用酶学分析法所测得的）β-半乳糖苷酶的量。

实施例4：用pBTK5转化以检测大肠杆菌K菌株MM294。

依上述材料和方法Ⅸ中所述从费希尔弧菌DNA的发光系统片段和质粒PBR322制备重组DNA pBTK5。取1微克pBTK5DNA转化悬浮于0.2毫升CaCl2中的不同浓度的大肠杆菌K菌株MM294。转化后，将细胞移入含有0.8毫升LB及0.2毫升加有自体诱导物（依上述材料和方法ⅩⅣ制备）的LB培养基的闪耀瓶内。各瓶中细胞浓度分别为105、106、107和108细胞/毫升。图3表示四种不同浓度大肠杆菌细胞之光发射的动力学;图4说明这些实验中细胞浓度与光发射出现之间的相互关系。本底光发射为1000opm。

实施例5：各种抗生素存在下大肠杆菌菌株MM294的转化。

按实施例3的方法完成转化并将转化了的细菌于各种抗生素存在下继续培养。氨苄青霉素（AMP）30微克/毫升;氯霉素（CAP）10微克/毫升;卡那霉素（KAN）30微克/毫升;四环素（TET）10微克/毫升。图5表示有或没有抗生素时发光的动力学。本底光发射计数为1000cpm。

实施例6：用pBTK5    DNA转化多种细菌。用实施例3的方法完成转化。用于转化的受体细菌有大肠杆菌菌株MM294，产气气杆菌菌株62-1，普遍变形杆菌和白色葡萄球菌。图6表示 作为时间函数的光发射水平（Cpm），从中可以看出只有大肠杆菌被转化而其它三种细菌则未被转化。这一结果证明了用重组DNA    pBTK5转化的特异性。本底计数为1000    opm。

实施例7：接合方法检测大肠杆菌菌株W3110。

按材料和方法Ⅻ所述构建含有发光基因的HfrH（高频率接合）菌株。将该菌株放在含有链霉素（2.5微克/毫升）的LB培养基中于37℃培养2小时。将细胞洗一次并稀释到LB培养基使细胞终密度为107细胞/毫升。向以1毫升等分的这种培养物中加入不同浓度的（非发光）大肠杆菌菌株W3110细胞。将混合好的培养物于37℃不震荡培养30分钟，之后取培养物置于闪烁计数仪中于24℃进行发光检测。图7表示在不同浓度大肠杆菌W3110受体细胞存在下，发光产生作为时间的函数（由0时间开始）。

实施例8：分离、克隆和外源基因转移进入微生物寄主的一般方法，以及用引入的供体基因系统的表达来检测受体寄主。

前面已经谈到，除了荧光素酶和β-半乳糖苷酶之外，还可根据本发明的方法按检测目的将酶或其它系统引入宿主生物体内。能被选择的系统或酶。由于它容易用这些方法能被检测到，或者由于它是独一的，可以查明在生物体中它的不存在。以前所述的荧光素酶系统即具有这两方面的性质，因此是本发明优先选用的。为了用类似于检测荧光素酶的方法检测微生物，还可使用编码蛋白质的基因如其存在可通过它们对某些波长的光的吸收〔如血红蛋白〕或通过特异性抗体，经放射标记或连接到便于被检测的酶（ELISA）上或其它化合物如 生物素上。在其它情况下，编码那些其单一产物或多数产物能直接或间接地被测定或者其一种底物的消失也能被同样测出的酶的基因，更是适用的。这样的酶的例子将在下面的几个实施例中给出。测定方法可以是基于气体的释放或被溶解气体之浓度的降低、pH改变、产物或底物可用分光光度法或色谱法直接测量、或通过去偶联反应间接测量，或用次级复合物（如生物素-抗生物素蛋白）的抗体检测，或通过使用放射标记的化合物等检测。这些用于 定目的的测量方法只是在这里罗列出来，而不是想要限制本发明的范围，但是想指出这种系统类型可以接合我们的方法使用。有代表性的酶、蛋白质或酶系在与其相当的遗传结构被装配后即可用于检测微生物。这种装配可包括自然重组或使用体外重组技术，亦可两者兼用。有许多可能性及设计方案是与本发明相一致的。

包括外源基因和引入寄主生物体的各种分离、克隆和转移方法均可很便利地在本发明中应用。例如，可分离出供体生物（细菌、酵母等）的DNA，并用限制性内切酶Sau 3A部分酶解，以产生一组包含整个供体基因组的交迭片段。可通过甘油或蔗糖梯度离心或琼脂糖凝胶电泳方法制备特定大小的片段。这些片段含有外伸的5′单链末端，具有结构5′GATC-双链DNA;可用T4DNA连接酶与用限制性内切酶（Bam HI、Bgl Ⅱ、Bcl Ⅰ、Sau 3A）酶介产生适当和相类似的单链末端的适当运载体分子相连接。这样运载体的例子便是用限制性内切酶Bam HI切断的λ卡龙28（Maniatis等，Op.cit.）。连接好的DNA就可被转化，如果要求包装可继包装后，进入适当寄主（缺少限制系统）中。含有所要的外源系统或酶之序列的病毒DNA既可通过酶活性、免疫技术、也可 用合成的或天然的DNA探针以及核酸杂交方法进行检测。Maniatis等人（Op.cit.）已详细描述了上述的多种克隆和检测技术。其次，亚克隆供体基因并与强有力的细菌启动子（如大肠杆菌的plao或噬菌体λ的PR）连接。然后用重组（自然的、体外的两者兼用的）技术将启动子-基因片段转移到一种接合质粒（如RP4或F因子）、可转化构件（如质粒pBR322）或一种适当噬菌体（如λ或T4）中。

如此转移到受体宿主微生物中的被表达的供体基因或基因系统即可用以 定宿主生物体。可选用一种适当方法以监测宿主生物体中供体遗传系统的活性（如由荧光素酶引起光产生;酶学反应的终产物或中间体;气体排出等）。因此，自供体生物中基因的分离、克隆及向受体寄主微生物内转移外源基因，以及通过对其中所含之外源基因表达的监测以 定宿主微生物，均影响到本发明的实施效果。

实施例9：使用得自外来供体的醇脱氢酶或其它NAD氧化还原酶基因系统转移到受体宿主微生物中以检测该宿主的方法

醇脱氢酶（E.C.1、1、1、1;醇：NAD氧化还原酶）是一种许多种生物如酵母、人和芽胞杆菌产生的酶。可通过重组DNA技术分离到编码这种酶的单个基因或基因族。用实施例8的方法分离作为供体生物酵母的DNA，用限制性内切酶处理、克隆、与一个有效的细菌启动子相连并由一个适宜的运载体（最好是噬菌体）转移到受体宿主微生物中。

之后便可通过前面所提到的涉及检测荧光素酶和β-半乳糖苷酶的相似技术和实验设计，用醇脱氢酶（ADH）检测特定微生物的存 在。在使用ADH的情况下，将不能直接地监测光产生;而是测定NAD+向NADH的转化。在醇和NAD+存在下，ADH催化，其产物是NADH、H+和乙醛的反应。通过测定340毫微米波长的吸光率或于适当的醛存在下测定细菌荧光素酶而测知NADH的存在和浓度（Stanley，P.E.：酶学方法，第LⅦ卷，M.A.Delucs编，Academio出版社1978，New York，San Francisco，Londen，215-222页）。

还有许多其它的DNA氧化还原酶也如ADH（酶的E.C.组1.1.1，1.2.1，1.3。1，1.4.1.，1.5.1和1.8.1）一样适用于检定宿主微生物。例如L-丙氨酸脱氢酶（E.C.1.4.1.1.，L-丙氨酸：NAD氧化还原酶）也能由NAD+产生NADH。另外，这种酶当L-丙氨酸被转化为丙酮酸和氨时，能催化由L-丙氨酸释放出NH3，要测定的产物是NH3而不是NADH。其它氧化还原酶是以O2代替NAD+作为电子受体（E.C.1。1.3，1.2.3，1.3.3和1。4.3），可用氧电极测知溶解之氧的消失。

实施例10：使用得自外来供体编码转移酶的遗传系统并转移到受体宿主微生物以检测该宿主的方法。

连同在文中所述的本发明之方法，也可用转移酶系统 定微生物。用实施例8的方法，分离含有选择过的转移酶基因的适当供体生物的DNA，用限制性内切酶酶解、克隆、连接到一个有效的细菌启动子上，并用适当的载体（最好是噬菌体）转移到一种受体宿主微生物中。例如，在2-酮戊二酸存在下，L-酪氨酸;2-酮戊二酸氨基转移 酶（E.C.26.1.5）催化由L-酪氨酸产生对位羟苯基丙酮酸，而对位羟苯基丙酮酸则可从测定330毫微米的吸光率监测（Hadar，R.，Slonim，A。，和Kuhn，J.，1976.在D-色氨酸在被大肠杆菌利用中D-色氨酸氧化酶的作用。J.Bacteriol125：1096-1104）。第二个转移酶的例子是半乳糖激酶（ATP：D-半乳糖-1-磷酸转移酶;E.C.2.7.1.6）其活性表现于ATP的消失和β-D-半乳糖-1-磷酸的产生。对于特殊选择的转移酶可使用其它相应的检测方法。

实施例11：使用得自外来供体的水解酶、裂合酶或异构酶遗传系统并转移到受体宿主微生物以检测该宿主的方法。

除了前面所述的酶以外，还可使用水解酶、裂合酶和异构酶系统连同本发明的方法 定微生物。使用实施例8的方法，分离含有选择过的酶（水解酶、裂合酶或异构酶）的适当供体生物的DNA，用限制性内切酶酶解，克隆，连接于一个有效的细菌启动子，并通过适当的运载体（最好是噬菌体）转移到受体寄主微生物。例如，可以用许多方法检测硷性磷酸酶（E.C.3.1.3.1，（正）磷-酯磷酸水解酶）活性，其中之一是通过由对位硝基苯磷酸酯释放对位硝基苯，而对位硝基苯的浓度则可通过分光光度法于420毫微米波段在碱性PH条件下测得，以同样方法邻位硝基苯也能用于检测β-半乳糖苷酶〔E.C.3.2.1.23〕活性。某些裂合酶如天冬氨酸-1-脱羧酶（E.C.4.1.1.11，L-冬氨酸-1-羧酶）和鸟氨酸脱羧酶（E.C.4.1.1.17，L-鸟氨酸羧化酶）可通过PH的改变而检测出CO2（作为H2CO3）的释放，故也是 同样适用的。异构酶如谷氨酸消旋酶（E.C.5.1.1.3）也能被使用。在使用谷氨酸消旋酶中，谷氨酸由D型转变到L型，可以与L-谷氨酸氧化酶测定系统结合起来接在常规方法之后。

实施例12：使用得自外来供体氧化酶遗传系统并转移到受体寄主微生物以检测该寄主的方法。

将酶活性引入该酶活性低或没有该酶活性的目的宿主微生物中。使用实施例8的方法，从适当供体生物中分离含有经选择的酶（即氧化酶）的DNA，用限制性内切酶处理，克隆化，连接于一个有效的细菌启动子并通过适当载体（最好是一种得有特异性的噬菌体）转移到受体寄主微生物中。在本发明中可应用的酶，包括，例如D-色氨酸氧化酶（Hadar等，Op.Cit.），这种酶在大肠杆菌中几乎不存在，将导致高水平的酶活性的突变基因引入大肠杆菌，可通过从D-色氨酸产生的吲哚丙酮酸进行检测。也可将含大肠杆菌之bio    B基因的构件连到强有力的启动子上，即可使去硫代生物素很快转化为生物素，后者则可基于抗生物素蛋白对生物素的高度亲和力进行检测。

4、结果

A、转导

噬菌体通过吸附接着就将其DNA注入适宜细菌宿主而体内进行自身增殖。自然条件下，噬菌体基因有时可通过代替和/或插加连接到细菌基因上。特定情况下，某些噬菌体会包装偶然来自该种噬菌体以外其它来源（即染色体、质粒或其它种噬菌体）的DNA。前者称 为局限性转导，后者称为普遍性转导。这两种现象均导致DNA由一个细菌转移到另一个细菌。产生局限性转导噬菌体的一种更现代的方法可以通过重组DNA技术来完成。可构建携带我们要求之基因的噬菌体，而且在其中不会使主要噬菌体基因丢失。如果存在一种适合的宿主，这样的噬菌体将会有效地引入这些克隆好的基因。如果存在它们的表达所需要的原件，那么这些基因将会高效表达，因为在噬菌体生长，它的染色体要增殖成好多拷贝。

根据本发明的突出特征，将可把带有V.fischeri之发光基因的DNA片段从质粒pBTK5转移到大肠杆菌噬菌体λ中。通过适当的构建亦可转移其它供体遗传系统。

通过感染，噬菌体吸附于能够起到宿主作用的特定细菌，被包装的噬菌体头部DNA即注入细菌细胞内。一旦该DNA进入细菌内部，则它就利用宿主的功能系统，经转录并翻译以产生发光酶（荧光素酶及醛合成所必须的酶）或其它可被引入的酶系统。

发光系统的使用是本发明之突出特征所在。因为无论噬菌体还是细菌，其本身都不能发射光，所以继感染后的发光水平可被用以检测细菌的存在，而光发射的量则反映出噬菌体-细菌复合体的数目。在有过多噬菌体存在时，发光量也能反映细菌的浓度。使用这样技术，可以一小时内检测浓度小于104个大肠杆菌细胞/毫升的样品（图1）。当含有细菌的样品通过Millipore HA0.45微米滤器过滤浓缩后，可检测出小至10个细胞/毫升的细菌浓度。

当存在一种对寄主细胞敏感的抗生素时，感染性噬菌体便不能完成其溶菌周期，发光量会降低或者没有光发射。阻断DNA、RNA或蛋白质合成的抗生素被试验时，显示出光的较低输出。影响细胞壁合成或膜完整性的抗生素也出现相似的结果。因此，某种细菌类型， 通过带有发光基因噬菌体的感染如能被检测出来，则该细菌寄主对抗生素的敏感性，也能够通过测定抗生素对光发射的影响很快地被测知。

如图3所示，细菌的存在亦可通过酶学方法，使用转导技术检测。存在有足够数目的细菌细胞时，被带有β-半乳糖苷酶编码之基因的噬菌体感染，结果便由其重新合成β-半乳糖苷酶，后者的存在和活性则可用酶分析法测定。感染之复合体的数目越大，所产生的酶的量越多。

利用带有色氨酸酶基因的λ噬菌体和缺失色氨酸酶活性的菌株也可完成相类似的实验，同样地，这种细菌的存在会导致酶产生，但要有相对高的细胞浓度（109细胞/毫升）时才能检测到。

某种单一细菌的菌种内。噬菌体一般只能在某些或所有菌株上生长。有时某种类型的噬菌体能感染几种细菌，但这些菌种几乎都是亲缘关系密切的。通过选择适当的噬菌体类型，能够检测如予定的那种特异的细菌，这就是说，不仅能够在这种试验中检测细菌的存在，而且也能迅速地检测某些特定类型细菌的存在或不存在。例如期望检测大肠杆菌，可将携带发光基因的噬菌体与噬菌体在这种细菌范围内所有已知菌株的寄主相混合，从而迅速而特异地检测到这种细菌的存在。

B、转化

这些实验说明通过用携带生物发光基因或其它供体基因的相亲和的DNA转化细菌以检测这些细菌的存在，用这一技术还可测知细菌的大致数目、它们的分类位置及它们对抗生素的敏感性。

当分别用材料和方法Ⅸ及Ⅹ部分得到质粒pBTK5和pAChv-1转化大肠杆菌菌杆JM101和MM294时，于几小时内即可发射 出可检测到的光，没有加DNA或只有DNA的则是暗的。光发射的水平为本底的几千倍。

在另一实验中测定了当所加DNA为恒定（1微克）而所加细胞数不同时的光发射量。结果如图3所示，说明光发射开始的时间是与细胞浓度呈负相关。这一点清楚地显示于图4中，图4中是对光发射开始的时间对细胞浓度作图，所得到的线性关系表明该方法亦可用于估计细胞浓度。

用产生光的基因转化的另一个应用是在于检测细菌对抗生素的敏感性。方法中使用的质粒是pBTK5（1微克）和菌株MM294。转化后加入抗生素并检测它们对光发射的影响。实验的对照组是没有加质粒DNA的经CaCl2处理的细胞，以及没有加抗生素的经过转化的细胞。图5表示的是得到的实验结果。卡那霉素（30微克/毫升）和氯霉素（30微克/毫升）完全阻止光产生。四环素（10微克/毫升）相对于不加抗生素的对照组引起了90%的降低。氨苄青霉素（30微克/毫升）实际上刺激光产生。氨苄青霉素不会抑制或轻微抑制光产生是已予想到的，因为pBTK5带有氨苄青霉素抗性的基因。未予想到的刺激作用可能是由于选择增加复制的进入之质粒，或者是由于通过bla基因（氨苄青霉素抗性）启动子增加了光基因的转录。由此，可通过用生物发光基因转化，可很迅速地检测某细菌群体对某种抗生素（这些实验中用的氯霉素、四环素和卡那霉素）的敏感性。细菌的抗性（抗氨苄青霉素）也能迅速测出。此外，还能迅速地确定作为其浓度之函数的抗生素的活性（四环素与氯霉素和卡那霉素比较）。通过该试验也能测定亚最适浓度或部分抗性（四环素）。

转化的另一个特点是它的特异性。如上所示，本方法能很快地检 测大肠杆菌的两个菌株。当一个实验是用pBTK5    DNA转化大肠杆菌、普通变形杆菌、白色葡萄球菌和产气气杆菌时，只有大肠杆菌发射光（图6）。正因为气杆菌属和变形杆菌属与大肠杆菌关系相当密切，故这一点显示出这个试验方法具有很高的特异性。

C、接合

某些细菌具有向其它细胞（接受体）供出其DNA的能力。这一过程即所谓接合是由质粒介导的;质粒是环状DNA分子，其存在对细胞的健康常常不是必要的。并不是所有的质粒都能启动接合，而只有具有转移基因的质粒才能够有此功能。当质粒是作为游离的非整合分子存在时，它通常介导其自身由供体向受体转移，并且只是偶然转移其它质粒或细菌染色体分子。然而，当一个接合质粒整合到染色体中时，它主要是转移染色体，而在转移自身中很少成功。可能的受体的范围取决于接合质粒本身。例如，质粒RP4在亲缘关系相当远的革兰氏阴性菌之间能进行自身转移，而质粒F+能自身转移去的菌少得多，只是关系密切的类型。

大肠杆菌K12菌株AT2446是按前述材料和方法Ⅻ所述方法成双溶源性的Hfr菌株。AT2446是-HfrH菌株，因此将其DNA转移到自0分钟开始的受体。供体DNA由（Bachmann，B.J.和K.B.Low，1980：大肠杆菌K12联锁图，第6版，Microbiol.Rev.44：1-56）-第一个细菌染色体标记thr顺时钟方向转移，而在大约最后91分钟转移BalB。因为噬菌体λ的附着位点是在17分钟，故HfrH应该相当早地并以很高效率转移溶源性病毒（在这种情况中是多个病毒） 当λ向非溶源菌株发生转移时，即会出现接合子诱导。这种现象是进入胞浆的病毒基因组缺乏λ的阻遏物结果所造成。没有基因阻遏物，基因即开始自我表达噬菌体本身从细菌染色体上切离出来，并进入溶菌环。这就是导致每个细胞大约有300个λ的基因组，并将以高水平表达发光基因，这是因为它们由λ启动子PL启动而高效转录，而该启动子过去是被抑制的。

在这些菌株中会出现某些本底光发射，这是因为发光基因将会用它们自身的启动子进行表达。我们已发现，本底光通过用亚致死浓度的链霉素培养供体菌株可在很大程度上得到抑制。发现链霉素能选择地抑制发光系统的诱导，而几乎不影响生长的速度。

实施例6中描述了一项说明应用接合和发光的实验，结果如图7所示，可以看出发射之光量在一个给出的供体浓度时是与受体细胞的浓度直接相关的。图7中曲线表明了发射光与受体浓度之间的线性关系。抗生素如氯霉素（10微克/毫升）和链霉素（100微克/毫升），当菌在交配期间放入时，可完全地抑制发射光的增加。

使用这一技术，有可能确定样品中细菌的存在、数量和其对抗生素的敏感性。接合并不只限于Hfr菌株或溶源性噬菌体。任何含有在寄主生物体中，在可移动的复制子中，不存在或表达很弱的发光系统或部分或其它供体遗传系统的菌株均可应用。复制子可以是细菌染色体或质粒。发光系统或其部分或者其它遗传系统，可通过噬菌体或遗传重组天然的或人工的等方法而被引入，从而发光基因或其它基因即可共价结合于转移的遗传物质上。因此接合的应用相似于上述的光偶联的转导和转化。