技术领域
[0001] 本
发明涉及一种白菜成熟花粉细胞荧光原位杂交方法，属于分子细胞遗传学技术领域。
背景技术
[0002] 花粉（pollen）是开花
植物有性生殖的执行者，不仅对作物育性调控和
杂种优势的利用至关重要，而且是研究细胞分化发育机制的极好材料。花粉的发育包括小孢子发生（microsporogenesis）和雄配子体发生（male gametogenesis），小孢子发生是植物花药内的孢原细胞分化发育成花粉母细胞，然后经减数分裂形成单倍体小孢子；雄配子体发生是小孢子先通过1次不对称有丝分裂分
化成1个大而松散的营养细胞和1个小而紧实的生殖细胞，随后营养细胞不再分裂，而生殖细胞再经1次正常的有丝分裂形成两个精细胞（雄配子），即形成成熟的花粉粒（雄配子体）。在花粉发育过程中，减数分裂使亲本2个
体细胞基因组发生重组产生1个新的配子基因组，并在后来的有丝分裂过程中经历了程序化和自发性的变化，从而导致营养细胞和生殖细胞核遗传物质可能不同。近几年来，雄配子体遗传机制已经成为一个研究热点，利用不同的分子遗传技术及高通量组学技术，已发现一些调控雄配子体形成和花粉管生长的重要基因，也为营养细胞和生殖细胞的功能基因组特征研究提供了新的机遇。然而对于特异序列或基因在功能和命运完全不同的营养细胞与生殖细胞内表现差异的分子细胞遗传学研究极少。
[0003] 荧光原位杂交技术（fluorescent in situ hybridization，FISH）是20世纪80年代末在
放射性原位杂交技术的
基础上发展起来的一种非放射性分子细胞遗传技术，广泛应用于动植物细胞间期周期各个阶段的
染色体或特异DNA序列的研究，涉及遗传作图、基因
定位、染色体畸变检测、染色体重排、基因组结构和物种进化分析等许多方面。在植物上，花粉粒是一种唯一可
接触的细胞类型，且为单倍体，处于G1期，无内源多倍化。在花粉细胞上进行FISH杂交，有助于我们直接观察一些特异重复或基因序列或染色体通是否过了花粉发育阶段，并确定在营养细胞和生殖细胞是否存在不同。目前这还是一个新的研究领域，尚无相关研究报道。此外，开展花粉细胞荧光原位杂交，还存在一项非常具有挑战性的工作，即花粉粒外包被有坚硬的完全干燥的花粉壁，如何去除花粉壁的阻碍，使花粉细胞完全平铺在
载玻片上，以便探针能够穿过
细胞质渗入到核染色体，是影响花粉细胞荧光原位杂交能否成功地关键。
发明内容
[0004] 本发明提供一种白菜成熟花粉细胞荧光原位杂交的方法的目的，是针对白菜花粉粒含有坚硬的花粉壁、花粉细胞较难很好的平铺到载玻片上、探针不易渗入到花粉核、花粉细胞荧光原位杂交尚属空白等问题，该发明能利用制备的花粉细胞标本进行FISH杂交获得清晰的杂交
信号图片，反映出目标序列在营养细胞和生殖细胞不同的杂交模式。本发明为白菜花粉发育的分子细胞遗传学研究奠定了基础。
[0005] 本发明的基本原理是：花粉母细胞经减数分裂后形成单核小孢子，进一步经两次有丝分裂形成含1个大而松散的营养细胞和2个小而紧实的生殖细胞的成熟花粉（雄配子体）。在该过程中，减数分裂使亲本2个体细胞基因组发生重组产生1个新的单倍性配子基因组，并在有丝分裂过程中经历了程序化和自发的变化。通过花粉荧光原位杂交，可以揭示目标重复序列或特异基因是否在营养细胞和生殖细胞间存在差异，是否能够通过生殖细胞传递给后代。
[0006] 本发明的特点是：取白菜开花前1-2 d的花蕾，在50%
冰乙
酸溶液中分离出新鲜花粉粒，采用垂直压片法
破碎花粉壁，释放出完整的营养细胞与生殖细胞；细胞标本经预处理后与变性探针在80℃共变性3 min，直接进行原位杂交，获得了信号清晰的荧光杂交图片，揭示出目标DNA在营养细胞和生殖细胞中的组织差异。本发明通过以下步骤完成：（1）成熟花粉时期花蕾的确定
取不同大小的花蕾，剥取1枚花药置于洁净载玻片上，滴加一滴DAPI染色液，用
镊子轻轻
挤压释放出花粉粒，去掉花药壁，盖上盖玻片，用
滤纸吸去多余染液，拇指轻压，在荧光
显微镜下观察花粉的发育时期。
[0007] （2）成熟花粉细胞标本的制备压片：取开花前1-2 d的花蕾，剥取1枚新鲜花药，置于洁净载玻片上，滴一滴50%的冰乙酸溶液，用镊子轻轻挤压释放出花粉粒，去掉花药壁，盖上盖玻片，用拇指垂直轻压盖玻片使花粉壁破裂，释放出营养细胞和生殖细胞。
[0008] 去盖片：将标本玻片置于液氮中30 s，取出用刀片撬掉盖玻片。
[0009] 降解细胞质：向标本玻片目标区域滴加一滴50%~60%的冰乙酸溶液，置于45 ℃恒温台上保温3 min，使细胞质充分降解。
[0010] 固定：倾斜标本玻片，滴加新鲜的Cannoy固定液（酒精：冰乙酸=3:1）冲洗掉50%冰乙酸并固定3 min，自然
风干。
[0011] 镜检：装片于相差显微镜进行观察，将结构完整、生殖细胞和营养细胞清晰的玻片置于4 ℃
冰箱中短暂保存备用。
[0012] （3）探针的制备与标记用于原位杂交的45S rDNA和5S rDNA探针是以基因组DNA为模板通过PCR法扩增获得的，采用缺刻平移法分别进行Cy3.5-dCTP和Cy3- dUTP标记。
[0013] （4）荧光原位杂交花粉细胞标本预处理：将步骤（1）保存的标本制片在65 ℃条件下拷片30 min；然后分别进行RNase A酶和胃蛋白酶温育处理及甲
醛溶液固定，2×SSC漂洗后进行酒精脱
水，自然干燥。
[0014] 探针杂交液的配制与变性：将标记的荧光探针按适当比例与杂交液混合配制成20 μL的杂交液，在沸水浴中变性10 min，立即置于冰上冷浴5 min以上。
[0015] 共变性与杂交：将20 μL变性探针杂交液滴加到标本制片的目标区域，盖上盖玻片，置于80 ℃恒温台上共变性3 min，然后放入保湿的杂交盒中，置于37 ℃恒温箱中温育过夜。
[0016] 杂交后洗脱：在避光条件下将杂交后的标本制片移掉盖玻片后浸入2×SSC溶液中漂洗，然后在酒精中脱水；避光条件下自然干燥。
[0017] 复染：每张杂交标本玻片滴加含抗猝灭剂的 DAPI染色液，加盖盖玻片，室温避光下染色5 min以上。
[0018] 镜检：将原位杂交后的标本玻片装于德国蔡司荧光显微镜进行杂交信号观察，用Cooled CCD装置俘获图像并照相，用Adobe Photoshop CS
软件进行图象的合成。
[0019] 本发明取得的技术效果及优点如下：1）利用白菜成熟花粉细胞为靶相进行荧光原位杂交，目标探针在营养细胞和生殖细胞上获得了清晰且不同的杂交信号，为白菜花粉发育的分子细胞遗传学研究提供了技术支持。
[0020] 2）以50% 冰乙酸溶液为介质，采用拇指垂直轻压盖片的机械方法破碎新鲜花粉粒的花粉壁，释放出的花粉细胞完整，营养细胞和2个生殖细胞分散，技术简单，可操作性强。
[0021] 3）在现有荧光原位杂交技术方法操作中，靶相标本的变性一般是将经预处理的标本玻片浸入70%甲酰胺溶液（2×SSC配制）中于70 ℃变性2.5~3 min，然后经冷冻酒精脱水、自然干燥，再与变性探针杂交。本发明中花粉细胞标本经预处理后直接加变性探针在80 ℃恒温台上共变性3 min，即进行杂交，使试验过程简化，加快了试验
进程。
[0022] 4）采用开花前1-2 d的新鲜花蕾为材料，供应充足，取材方便；材料不需固定液固定，花粉粒新鲜，花粉壁易破碎。
[0024] 图1是DAPI染色的白菜成熟花粉粒（含1个大的营养细胞和2个小的生殖细胞）。
[0025] 图2是从新鲜花粉粒中释放出的三核花粉细胞。
[0026] 图3是大白菜‘B153’花粉细胞的FISH结果，红色为45S rDNA信号，黄色为5S rDNA信号。
[0027] 图4是油用白菜‘yellow sarson’花粉细胞的FISH结果，红色为45S rDNA信号，黄色为5S rDNA信号。
[0028]
具体实施方式
[0029] 以下通过实例进一步说明本发明，但不是用来限制本发明的保护范围。
[0030]
实施例1 以45S rDNA和5S rDNA探针在大白菜‘B153’成熟花粉细胞的荧光原位杂交为例对本发明进行说明。
[0031] （1）成熟花粉时期花蕾的确定于大白菜‘B153’盛花期，取1-5 d能开花的大小不一的花蕾，每个花蕾剥取1枚花药置于洁净载玻片上，滴加一滴DAPI染色液，用镊子轻轻挤压释放出花粉粒，去掉花药壁，盖上盖片，用拇指轻压，在荧光显微镜下镜检花粉的发育时期，确定开花前1-2 d的花蕾内花粉已发育为成熟的三核花粉粒（（图1）。
[0032] （2）成熟花粉细胞标本的制备压片：取开花前1-2 d的大花蕾，剥取1枚新鲜花药置于洁净载玻片上，滴一滴50%的冰乙酸溶液，用镊子轻轻挤压释放出花粉粒，去掉花药壁，盖上盖玻片，用拇指垂直轻压盖玻片使花粉壁破裂，释放出营养细胞和生殖细胞（图2）。
[0033] 去盖片：将标本玻片置于液氮中30 s，取出用刀片撬掉盖玻片。
[0034] 降解细胞质：滴加一滴50%的冰乙酸溶液，置于45 ℃恒温台上保温3 min，使细胞质充分降解。
[0035] 固定：滴加新鲜的Cannoy固定液（酒精：冰乙酸=3:1）冲洗掉50%冰乙酸并固定3 min，自然风干。
[0036] 镜检：装片于相差显微镜进行观察，将结构完整、生殖细胞和营养细胞清晰的玻片置于4℃冰箱中短暂保存备用。
[0037] （3）探针的制备与标记采用CTAB法提取大白菜‘B153’的基因组DNA，以其为模板，通过PCR法扩增获得45S rDNA和5S rDNA
片段，扩增产物经纯化后采用缺刻平移法分别进行Cy3.5-dCTP和Cy3- dUTP的荧光素标记。
[0038] （4）荧光原位杂交花粉细胞标本预处理：将步骤（1）保存的标本制片在65 ℃条件下拷片30 min；然后分别进行RNase A酶和胃蛋白酶温育处理及甲醛溶液固定，2×SSC漂洗后进行酒精脱水，自然干燥。
[0039] 探针杂交液的配制与变性：每张玻片的杂交液体系为20 μL，包含2×SSC、10%
硫酸葡聚糖、50%去离子甲酰胺以及适当浓度的荧光探针，混匀后在沸水浴中变性10 min，然后立即置于冰上冷浴5 min以上。
[0040] 共变性与杂交：将20 μL变性探针杂交液滴加到标本制片的目标区域，盖上盖玻片，置于80 ℃恒温台上共变性3 min，然后放入保湿的杂交盒中，置于37 ℃恒温箱中温育过夜。
[0041] 杂交后洗脱：在避光条件下将杂交后的标本制片移掉盖玻片后浸入2×SSC溶液中，漂洗3次，每次5 min，然后依次在70％、95%、100％的酒精中脱水3 min；自然干燥。
[0042] 复染：每张杂交标本玻片滴加14 μL含抗猝灭剂的 DAPI染色液，加盖盖玻片，室温避光下染色5 min以上。
[0043] 镜检：将原位杂交后的标本玻片装于德国蔡司荧光显微镜进行杂交信号观察，用Cooled CCD装置俘获图像并照相，最后用Adobe Photoshop CS软件进行图象的合成，得到如图3所示图像。
[0044]实施例2 以核糖体45S rDNA和5S rDNA探针在油用白菜‘yellow sarson’成熟花粉细胞的荧光原位杂交为例对本发明进行说明。
[0045] （1）成熟花粉细胞玻片标本的制备于油用白菜‘yellow sarson’盛花期，取开花前1-2d 的大花蕾，剥取1枚新鲜花药置于洁净载玻片上，后续制片方法步骤同实施例1。
[0046] （2）探针的制备与标记采用CTAB法提取油用白菜‘yellow sarson’的基因组DNA，以其为模板，通过PCR法扩增获得45S rDNA和5S rDNA片段，PCR反应体系组成、反应条件、扩增产物纯化及探针标记同实施例1。
[0047] （3）荧光原位杂交①标本的预处理同实施例1。
[0048] ②探针杂交液的配制与变性同实施例1。
[0049] ③共变性与杂交同实施例1。
[0050] ④杂交后洗脱同实施例1。
[0051] ⑤DAPI复染同实施例1。
[0052] ⑥镜检同实施例1，得到如图4所示图像。
