用于膜电位测定的光遗传学探针
阅读：465发布：2020-05-15
专利汇可以提供用于膜电位测定的光遗传学探针专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供膜电位的光学测量方法，细胞和构建体。这些方法可用于采用现有 电极 方法不可 接触 到的细胞。本方法可用于，例如，高通量药物筛选试验中测定能够影响靶细胞膜电位的 试剂 。，下面是用于膜电位测定的光遗传学探针专利的具体信息内容。
1.一种在表达编码细菌视紫红质蛋白的核酸的细胞中测定膜电位的方法，该方法包括如下步骤：
a)用至少一个波长的光体外激发至少一个包含编码细菌视紫红质蛋白的核酸的细胞；
和
b)体外检测来自至少一个细胞的至少一个光学信号，其中与参考相比，通过至少一个细胞的发射荧光强度水平指示细胞膜电位。
2.如权利要求1所述的方法，其中细菌视紫红质蛋白是修饰的细菌视紫红质蛋白，与源自于天然的细菌视紫红质蛋白相比，其离子泵活性降低。
3.如权利要求2所述的方法，其中修饰的细菌视紫红质包括邻近希夫碱基的突变质子受体。
4.如前述权利要求任一项所述的方法，其中细菌视紫红质蛋白是变形菌视紫红质蛋白家族的成员。
5.如权利要求1-3任一项所述的方法，其中细菌视紫红质蛋白是古细菌视紫红质蛋白家族的成员。
6.如权利要求1-3任一项所述的方法，其中至少一个波长是在λ＝594-645nm之间的波长。
7.如权利要求1-3任一项所述的方法，其中细胞是原核细胞。
8.如权利要求1-3任一项中的方法，其中细胞是真核细胞。.
9.如权利要求8中的方法，其中真核细胞是哺乳动物细胞。
10.如权利要求8中的方法，其中真核细胞是干细胞或多能细胞或祖细胞。
11.如权利要求8中的方法，其中真核细胞是诱导多能细胞。
12.如权利要求8中的方法，其中真核细胞是神经元。
13.如权利要求8中的方法，其中真核细胞是心肌细胞。
14.如权利要求1-3任一项所述的方法，还包括将载体体外转染给至少一个细胞的步骤，所述载体包含编码细菌视紫红质蛋白的核酸。
15.如权利要求1-3任一项所述的方法，其中编码细菌视紫红质蛋白的核酸与细胞型特异的启动子可操作地连接。
16.如权利要求1-3任一项所述的方法，其中编码细菌视紫红质蛋白的核酸可操作地连接于膜-靶向的核酸序列。
17.如权利要求16所述的方法，其中膜-靶向核酸序列是质膜靶向核酸序列。
18.如权利要求16所述的方法，其中膜-靶向核酸序列是亚细胞区室靶向核酸序列。
19.如权利要求18所述的方法，其中亚细胞区室是选自于线粒体，内质网，突触小泡，内涵体或吞噬小体。
20.如权利要求19所述的方法，其中亚细胞区室是肌质网。
21.如权利要求1-3任一项所述的方法，其中编码细菌视紫红质蛋白的核酸可操作地连接于编码至少一个附加荧光蛋白的核酸。
22.如权利要求21所述的方法，其中至少一个附加荧光蛋白是能够指示细胞内离子浓度的荧光蛋白。
23.如权利要求22所述的方法，其中能够指示离子浓度的荧光蛋白是钙指示器。
24.如权利要求22所述的方法，其中能够指示离子浓度的荧光蛋白是pH指示器。
25.如权利要求21所述的方法，其中至少一个附加荧光蛋白能够进行非放射性荧光共振，使能量转移到细菌视紫红质，其能量转移速率取决于膜电位。
26.如权利要求21所述的方法，其中至少一个附加荧光蛋白是绿色荧光蛋白或其同系物。
27.如权利要求21所述的方法，其中荧光蛋白的亮度对膜电位或局部化学环境不敏感。
28.如权利要求21所述的方法还包括如下步骤：采用至少第一和第二波长的光体外激发至少一个细胞；和体外检测至少第一和第二光学信号，该信号由来自至少一个细胞的至少的第一和第二波长的激发引起。
29.如权利要求28所述的方法，其中第二波长在λ＝447-594nm之间。
30.如权利要求27-29任一项所述的方法，还包括如下步骤：计算细菌视紫红质的荧光发射与至少一个附加荧光蛋白的荧光发射的比率，以获取不依赖于表达水平差异的膜电位测定。
31.如权利要求1所述的方法还包括将至少一个细胞在体外暴露于能够或预期能够改变膜电位的刺激的步骤。
32.如权利要求31所述的方法，其中刺激是候选试剂。
33.如权利要求31所述的方法，其中刺激是细胞培养基组分的变化。
34.如权利要求31所述的方法，其中刺激是电流。
35.如权利要求1所述的方法，进一步包括在第一和至少第二时间点体外测定至少一个光学信号的步骤。
36.如权利要求35所述的方法，其中第一时间点是在将至少一个细胞暴露于刺激之前，至少第二时间点是将至少一个细胞暴露于刺激之后。
37.如权利要求1所述的方法包括多个细胞。
38.一种在表达编码细菌视紫红质蛋白的核酸的细胞中测定膜电位的方法，该方法包括步骤：
用至少一个波长的光激发至少一个包含编码细菌视紫红质蛋白的核酸的细胞；和检测来自至少一个细胞的至少一个光学信号，其中与参考相比，由至少一个细胞的发射荧光强度水平指示细胞膜电位。
39.如权利要求38所述的方法，其中细菌视紫红质蛋白是修饰的细菌视紫红质蛋白，与来自于天然的细菌视紫红质蛋白相比，该蛋白离子泵活性降低。
40.如权利要求39所述的方法，其中细菌视紫红质包括邻近希夫碱基的突变的质子受体。
41.如权利要求38-40任一项所述的方法，其中细菌视紫红质蛋白是变形菌视紫红质蛋白家族的成员。
42.如权利要求38-40任一项所述的方法，其中细菌视紫红质蛋白是古细菌视紫红质蛋白家族的成员。
43.如权利要求38-40任一项所述的方法，其中至少一个波长是在λ＝594-645nm之间的波长。
44.如权利要求38-40任一项所述的方法，其中细胞是原核细胞。
45.如权利要求38-40任一项所述的方法，其中细胞是真核细胞。
46.如权利要求45所述的方法，其中真核细胞是哺乳动物细胞。
47.如权利要求45所述的方法，其中真核细胞是干细胞或多能细胞或祖细胞。
48.如权利要求45所述的方法，其中真核细胞是诱导多能细胞。
49.如权利要求45所述的方法，其中真核细胞是神经细胞。
50.如权利要求45所述的方法，其中真核细胞是心肌细胞。
51.如权利要求38-40任一项所述的方法，进一步包括采用载体转染至少一个细胞的步骤，所述载体包括编码细菌视紫红质蛋白的核酸。
52.如权利要求38-40任一项所述的方法，其中编码细菌视紫红质蛋白的核酸与细胞型特异的启动子可操作地连接。
53.如权利要求38-40任一项所述的方法，其中编码细菌视紫红质蛋白的核酸可操作地连接于膜靶向的核酸序列。
54.如权利要求53所述的方法，其中膜靶向核酸序列是质膜靶向核酸序列。
55.如权利要求53所述的方法，其中膜靶向核酸序列是亚细胞区室靶向核酸序列。
56.如权利要求55所述的方法，其中亚细胞区室是选自于线粒体，内质网，突触小泡，内涵体或吞噬小体。
57.如权利要求56所述的方法，其中亚细胞区室是肌质网。
58.如权利要求38-40任一项所述的方法，其中编码细菌视紫红质蛋白的核酸可操作地连接于编码至少一个附加荧光蛋白的核酸。
59.如权利要求58所述的方法，其中至少一个附加荧光蛋白是能够指示细胞内离子浓度的荧光蛋白。
60.如权利要求59所述的方法，其中能够指示离子浓度的荧光蛋白是钙指示器。
61.如权利要求59所述的方法，其中能够指示离子浓度的荧光蛋白是pH指示器。
62.如权利要求58所述的方法，其中至少一个附加荧光蛋白能够进行非放射性荧光共振，使能量转移到细菌视紫红质，其能量转移速率取决于膜电位。
63.如权利要求58所述的方法，其中至少一个附加荧光蛋白是绿色荧光蛋白或其同系物。
64.如权利要求58所述的方法，其中荧光蛋白的亮度对膜电位或局部化学环境不敏感。
65.如权利要求58所述的方法，进一步包括如下步骤：采用至少第一和第二波长的光体外激发至少一个细胞；和体外检测至少第一和第二光学信号，该信号由来自至少一个细胞的至少第一和第二波长的激发引起。
66.如权利要求65所述的方法，其中至少第二波长在λ＝447-594nm之间。
67.如权利要求58所述的方法，进一步包括如下步骤：计算细菌视紫红质的荧光发射与至少一个附加荧光蛋白的荧光发射的比率，以获取不依赖于表达水平差异的膜电位测定。
68.如权利要求38所述的方法，进一步包括将体外至少一个细胞暴露于能够或预期能够改变膜电位的刺激的步骤。
69.如权利要求68所述的方法，其中刺激是候选试剂。
70.如权利要求68所述的方法，其中刺激是细胞培养基组分的变化。
71.如权利要求68所述的方法，其中刺激是电流。
72.如权利要求38所述的方法，进一步包括在第一和至少第二时间点体外测定至少一个光学信号的步骤。
73.如权利要求72所述的方法，其中第一时间点是在将至少一个细胞暴露于刺激之前，以及至少第二时间点是将至少一个细胞暴露于刺激之后。
74.如权利要求38所述的方法，包括多个细胞。
75.如权利要求38所述的方法，其中细胞是非人类细胞。
76.如权利要求26所述的方法，其中至少一个附加荧光蛋白是mOrange2或eGFP。
77.如权利要求63所述的方法，其中至少一个附加荧光蛋白是mOrange2或eGFP。
用于膜电位测定的光遗传学探针
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 依据美国法典第35部分119(e)条，本申请要求于2010年12月12日提交的第61/412，972号和2010年8月23日提交的第61/376，049号美国临时申请的权益，其内容以引用的方式全部并入本申请中。
技术领域
[0003] 本发明的领域是涉及用于光学测定磷脂双层间电位的方法，构建体和组合物。
背景技术
[0004] 附膜的生物结构可承受膜内外电压差。这种电压，又被称为膜电位，具有多种生物功能，包括传送信息（例如，在神经元中），在产生ATP中作为媒介物（例如，在细菌和线粒体中），为鞭毛电机提供动力（例如，在细菌中）和控制营养素、毒素和信号分子的跨膜运输（在细菌和真核细胞中）。
[0005] 尽管膜电位具有重要的的生物学作用，膜电位的测定还是非常困难的。电生理学是通过在膜两侧放置电极来直接记录电位差。电生理学实验设定慢，每次仅能测定一个或少数几个细胞，不能进入深层组织（例如，体内），不能作用于微小细胞（例如，细菌）、坚固细胞壁包围的细胞（例如，酵母）或活动的细胞（例如，精子），不能应用于长期测定，并且在测定中常会损坏或杀死细胞。
[0006] 因此，需要开发膜电位的新型测定方法。
发明内容
[0008] 该方法包括在细胞或细胞器上表达细菌视紫红质，将细胞暴露于光源下和检测细菌视紫红质发射出的荧光，其中通过发射的荧光强度反应膜电位。该方法无需使用电极就可以测定膜电位。该方法可进一步监测一个或多个外部刺激引起的细胞膜电位变化。这不仅有利于科研，并且，例如，在筛选影响膜电压能力的候选试剂中也是很重要的，例如，在药物筛选中。
[0009] 本发明还提供表达细菌视紫红质和修饰的细菌视紫红质的细胞，和编码修饰的古细菌视紫红质的核酸构建体，其在真核细胞中测定膜电位及其变化是有用的。在一些具体实施方式中，在此描述的光学传感器使其内源性离子泵活性下降，或相比于天然细菌视紫红质蛋白质，部分或全部活性得以抑制。这样光学感受器可测定电压，但通过构建的离子梯度不能参与改变电压。电压及其变化的检测能够可视化，并且使用光学系统及进行测定。
[0010] 本发明是基于，至少部分上是基于下述发现，该发现是细菌视紫红质蛋白如古细菌视紫红质或变形菌视紫红质以及其修饰的变型，具有降低的离子泵活性（与来自于天然的细菌视紫红质蛋白相比），能够被用作光学传感器在细胞内检测跨膜电压。也就是说，细菌视紫红质和修饰的细菌视紫红质蛋白可用于测定细胞的膜电位以及膜电位的变化。该构建体和方法也可用于组织和器官的体内成像，例如在斑马鱼上，由于电极尺寸的限制其不能用于研究。这不仅有利于科研，而且在筛选新型候选试剂在影响细胞的膜电压能力也是很重要的。
[0011] 我们已经开发了变形菌视紫红质光学质子传感器（PROPS），其主要作用于细菌细胞，以及基于古细菌视紫红质的荧光电压指示蛋白（VIPs）家族，其也作用于哺乳动物细胞，包括神经元和人类干细胞源性的心肌细胞。VIPs是以来自于古细菌视紫红质3（Arch）及其同系物的电压指示器为基础。这些蛋白以亚毫秒时间分辨率和亚微米空间分辨率指示电动力学。利用VIPs，我们通过在哺乳动物细胞和组织使用电动力学的光学检测表明非接触、高通量和高含量的测定方法。
[0012] 本文描述的光学传感器不受电极使用的限制，使电生理学研究可以在例如亚细胞区室中（例如，线粒体）或在小细胞中（例如，细菌）中进行。在此描述的光学传感器可用于药物筛选中，装置研究，以及真核和原核细胞电压变化的体内、体外成像中。
[0013] 我们描述电压指示器蛋白和表达此蛋白的构建体。该构建体具有任意的细胞型的特异性启动子，当细胞分化时启动子开启，例如，分化为神经元细胞，如神经元，或分化为心肌细胞，例如心肌细胞，浦肯野细胞或窦状细胞。该构建体可进一步包括靶信号如线粒体靶信号，其针对在所需膜位置的电压指示器蛋白。我们提供细胞，以及瞬时和稳定表达这些蛋白的细胞系，包括人类干细胞，如诱导多能细胞（iPSC）或胚胎干细胞（ESC），神经祖细胞，神经细胞，心脏祖细胞和心肌细胞。我们还描述了采用描述的电压指示器蛋白筛选药物的方法。
[0014] 本发明方法使用的细胞，不管是原核细胞还是真核细胞，都被典型的工程化表达细菌视紫红质或修饰的细菌视紫红质，而他们不能天然地表达用于本发明方法的细菌视紫红质蛋白。
[0015] 因此，在一个具体实施方式中，发明提供一种测定表达细菌视紫红质蛋白编码的核酸细胞膜电位的方法，该方法包括步骤（a），用至少一个波长的光通过体外、离体或体内激发至少一个包含编码细菌视紫红质蛋白的核酸的细胞，和步骤（b）体外、离体或体内检测来自至少一个细胞的至少一个光学信号，其中和参考相比，由至少一个细胞发射的荧光强度水平指示细胞膜电位。
[0016] 在发明的任一具体实施方式或方面的一些方面中，细菌视紫红质蛋白是修饰的细菌视紫红质蛋白，与来自于天然的细菌视紫红质蛋白相比，其离子泵活性降低。
[0017] 在发明的任一具体实施方式或方面的一些方面中，细菌视紫红质蛋白是变形菌视紫红质蛋白家族中的成员。
[0018] 在发明的任一具体实施方式或方面的一些方面中，细菌视紫红质蛋白是古细菌视紫红质蛋白家族的成员。
[0019] 在发明的任一具体实施方式或方面的一些方面中，至少一个波长在λ=594-645之间的波长，波长范围在λ=630-645nm之间的波长也是可以使用的。
[0020] 在发明的任一具体实施方式或方面的一些方面中，细胞是原核细胞。原核细胞可以是革兰阳性或革兰阴性。原核细胞可以是病原性的或非病原性的。
[0021] 在发明的任一具体实施方式或方面的一些方面中，细胞是真核细胞。
[0022] 在发明的任一具体实施方式或方面的一些方面中，真核细胞是哺乳动物细胞。
[0023] 在发明的任一具体实施方式或方面的一些方面中，真核细胞是干细胞、多能细胞或祖细胞。
[0024] 在发明的任一具体实施方式或方面的一些方面中，真核细胞是诱导多能细胞。
[0025] 在发明的任一具体实施方式或方面的一些方面中，真核细胞是神经细胞。
[0026] 在发明的任一具体实施方式或方面的一些方面中，真核细胞是心肌细胞。
[0027] 这些细胞可以体外培养或离体培养，或者可以是器官或组织的部分。典型的细胞包括细菌，酵母，植物细胞，和来自脊椎动物或无脊椎动物的细胞。在一些具体实施方式中，真核细胞是人类细胞。在一些具体实施方式中，真核细胞是非人类细胞。在一些具体实施方式中，细胞不天然地表达方法中使用的细菌视紫红质蛋白。
[0028] 在发明的任一具体实施方式或方面的一些方面中，该方法进一步包括将载体体外，离体或体内转染给至少一个细胞的步骤，所述载体包含编码细菌视紫红质蛋白的核酸。这些细胞可以被瞬时转染或稳定转染。
[0029] 在发明的任一具体实施方式或方面的一些方面中，编码细菌视紫红质蛋白的核酸与细胞型特异的启动子可操作地连接。
[0030] 在发明的任一具体实施方式或方面的一些方面中，编码细菌视紫红质蛋白的核酸可操作地连接于膜靶向序列。
[0031] 在发明的任一具体实施方式或方面的一些方面中，膜靶向序列是质膜靶向性序列。
[0032] 在发明的任一具体实施方式或方面的一些方面中，膜靶向序列是亚细胞区室靶向序列。
[0033] 在发明的任一具体实施方式或方面的一些方面中，亚细胞区室是选自于线粒体膜，内质网，肌质网，突触小泡，内涵体和吞噬小体。
[0034] 在发明的任一具体实施方式或方面的一些方面中，细菌视紫红质基因可操作地连接于编码附加荧光蛋白或生色团的核酸。
[0035] 在发明的任一具体实施方式或方面的一些方面中，至少一个附加荧光蛋白是能够指示细胞内离子浓度的蛋白。
[0036] 在发明的任一具体实施方式或方面的一些方面中，至少一个能够指示离子浓度的附加荧光蛋白是钙指示剂。
[0037] 在发明的任一具体实施方式或方面的一些方面中，能够指示离子浓度的荧光蛋白是pH指示剂。
[0039] 在发明的任一具体实施方式或方面的一些方面中，荧光蛋白的亮度对膜电位和局部化学环境不敏感，因此，和细菌视紫红质的荧光相比可作为参考。
[0040] 在发明的任一具体实施方式或方面的一些方面中，该方法还包括如下步骤：采用至少第一和第二波长的光体外、离体或体内激发至少一个细胞；和体外、离体或体内检测至少第一和第二光学信号，该信号由至少第一和第二波长的激发引起，其不同于来自至少一个细胞的至少第一波长。
[0041] 在发明的任一具体实施方式或方面的一些方面中，至少第二波长是在λ=447-594之间的波长。
[0042] 在发明的任一具体实施方式或方面的一些方面中，该方法还包括如下步骤：计算细菌视紫红质的荧光发射与附加荧光蛋白的荧光发射的比率，以获取不依赖于表达水平差异的膜电位测定。
[0043] 在发明的任一具体实施方式或方面的一些方面中，该方法还包括将至少一个细胞体外，离体或体内暴露于能够或预期能够改变膜电位的刺激的步骤。
[0044] 在发明的任一具体实施方式或方面的一些方面中，刺激是候选试剂。在一些具体实施方式中，给予至少一个候选试剂。在一些具体实施方式中，同时或顺序给予至少两个候选试剂的组合。
[0045] 在发明的任一具体实施方式或方面的一些方面中，刺激是细胞培养基组分的变化。
[0046] 在发明的任一具体实施方式或方面的一些方面中，刺激是电流。
[0047] 在发明的任一具体实施方式或方面的一些方面中，该方法还包括在至少第一时间点和至少第二时间点体外，离体或体内测定，至少一个光学信号的步骤。
[0048] 在发明的任一具体实施方式或方面的一些方面中，至少第一时间点是在将至少一个细胞暴露于刺激之前，至少第二时间点是将至少一个细胞暴露于刺激之后。
[0049] 在发明的任一具体实施方式或方面的一些方面中，本方法还包括测定来自于暴露在至少第一波长和至少第二波长的光学信号间的荧光比例的步骤。
[0050] 在发明的任一具体实施方式或方面的一些方面中，该方法包含使用多个细胞。例如在高通量测定模式中。例如，在此具体实施方式中，表达细菌视紫红质蛋白的多个细胞可以暴露于多个候选试剂中，例如候选药物，和筛选候选试剂影响细胞膜电位的能力。
[0051] 在发明的任一具体实施方式或方面的一些方面中，真核细胞是人类细胞。在一些具体实施方式中，真核细胞是非人类细胞。
[0052] 在另外的具体实施方式中，发明提供了分离和纯化的核酸，其编码古细菌视紫红质蛋白家族的修饰成员，与来自于古细菌视紫红质蛋白家族的天然成员相比，离子泵活性降低。
[0053] 在发明的任一具体实施方式或方面的一些方面中，与衍生源古细菌视紫红质蛋白家族天然成员相比，离子泵活性下降的古细菌视紫红质蛋白家族的修饰成员包括邻近希夫碱基的突变的质子受体。
[0054] 在发明的任一具体实施方式或方面的一些方面中，分离纯化的核酸可操作地连接于编码膜-靶向序列的核酸。
[0055] 在发明的任一具体实施方式或方面的一些方面中，膜-靶向序列的核酸是亚细胞膜-靶向序列。
[0056] 在发明的任一具体实施方式或方面的一些方面中，亚细胞膜是线粒体膜，内质网，肌质网，突触小泡，内涵体或吞噬小体。
[0057] 在发明的任一具体实施方式或方面的一些方面中，分离纯化的核酸可操作地连接于细胞型特异的启动子。
[0058] 在发明的任一具体实施方式或方面的一些方面中，分离纯化的核酸可操作地连接于编码附加荧光蛋白或生色团的至少一个核酸。
[0059] 在发明的任一具体实施方式或方面的一些方面中，附加荧光蛋白是绿色荧光蛋白或其同系物。
[0060] 在发明的任一具体实施方式或方面的一些方面中，分离纯化的核酸可操作地连接于编码附加荧光蛋白的核酸，该蛋白可经受荧光共振能量转移成为细菌视紫红质，其能量转移速率取决于膜电位。
[0061] 在发明的任一具体实施方式或方面的一些方面中，分离纯化的核酸还包括载体。
[0062] 在发明的任一具体实施方式或方面的一些方面中，该载体是病毒载体，如慢病毒载体或腺伴随病毒载体（AAV）。
[0063] 在另一个具体实施方式中，本发明提供了一种包括上述分离和纯化的核酸的试剂盒。核酸可以通过在缓冲液中或以干燥的形式例如适宜容器中冷冻干燥形式提供。在一些具体实施方式中，试剂盒还包括实施本发明中方法或测定的缓冲液和溶液。根据说明书中提供的描述，本领域技术人员可为该试剂盒挑选和选择合适的试剂。该试剂盒可以包括一个或多个转染试剂，一个或多个缓冲液，一个或多个细胞培养基，一个或多个容器，例如细胞培养皿或阵列，从而进行本发明中的方法或测定。该试剂盒中也可以包括进行测定操作的说明的说明书。
[0064] 在另一个具体实施方式中，本发明提供包括编码细菌视紫红质蛋白的核酸的分离细胞。该细胞典型地工程化表达细菌视紫红质蛋白。
[0065] 在发明的任一具体实施方式或方面的一些方面中，细菌视紫红质蛋白是修饰细菌视紫红质蛋白，与来自于天然的细菌视紫红质蛋白相比，其离子泵活性下降。
[0066] 在发明的任一具体实施方式或方面的一些方面中，修饰细菌视紫红质蛋白包括邻近希夫碱基的突变的质子受体。
[0067] 在发明的任一具体实施方式或方面的一些方面中，细菌视紫红质是变形菌视紫红质家族的成员。
[0068] 在发明的任一具体实施方式或方面的一些方面中，细菌视紫红质是古细菌视紫红质家族的成员。
[0069] 在发明的任一具体实施方式或方面的一些方面中，细胞是真核细胞。
[0070] 在发明的任一具体实施方式或方面的一些方面中，细胞是原核细胞。在一些具体实施方式中，原核细胞是革兰阳性细胞。在一些具体实施方式中，原核细胞是病原性细胞。
[0071] 在发明的任一具体实施方式或方面的一些方面中，修饰的细菌视紫红质基因可操作地连接于启动子。
[0072] 在发明的任一具体实施方式或方面的一些方面中，启动子是细胞型特异性启动子。
[0073] 在发明的任一具体实施方式或方面的一些方面中，编码修饰细菌视紫红质蛋白的核酸可操作地连接于膜靶向核酸。
[0074] 在发明的任一具体实施方式或方面的一些方面中，编码修饰细菌视紫红质蛋白的核酸可操作地连接于编码至少一个附加荧光蛋白或生色团的核酸。
[0075] 在发明的任一具体实施方式或方面的一些方面中，至少一个附加荧光蛋白是绿色荧光蛋白或其同系物。
[0076] 在发明的任一具体实施方式或方面的一些方面中，至少一个附加荧光蛋白是能够进行荧光共振能量转移，成为细菌视紫红质的蛋白，其能量转移速率取决于膜电位。
[0077] 在发明的任一具体实施方式或方面的一些方面中，至少一个附加荧光蛋白是亮度对膜电位和局部化学环境不敏感的荧光蛋白。
[0078] 在发明的任一具体实施方式或方面的一些方面中，细胞还包括编码能够指示细胞内离子浓度的荧光蛋白的核酸。
[0079] 在发明的任一具体实施方式或方面的一些方面中，细胞是干细胞，多能细胞，或诱导多能细胞，或其分化的或其未分化的子代细胞。
[0080] 在发明的任一具体实施方式或方面的一些方面中，分化细胞是神经元。
[0081] 在发明的任一具体实施方式或方面的一些方面中，分化细胞是心肌细胞。
[0082] 在一个具体实施方式中，本发明提供试剂盒，其包括上述描述的在适宜培养基或容器中的一个或多个细胞。该试剂盒可包括在适宜培养基中的冷冻细胞。该试剂盒包括其他试剂，如一个或多个缓冲液，一个或多个细胞培养基，和一个或多个容器。该试剂盒还可包括在此描述的方法中使用细胞的方法说明书。
[0083] 在另一个具体实施方式中，本发明提供用于膜电位光学测定的工程细胞的生产方法，包括用编码细菌视紫红质蛋白的核酸转染细胞的步骤。转染可以是瞬时或稳定转染。
[0084] 在一些具体实施方式中，细胞是原核细胞。该原核细胞是革兰阳性或革兰阴性。在一些方面中，原核细胞是致病菌。细胞还可以是干细胞，多能细胞，分化细胞或无限增殖化细胞或细胞株。细胞可以是器官或组织的分离细胞或一部分，如斑马鱼或非人类胚胎或人类胚胎。
[0085] 在此具体实施方式的一方面，和该具体实施方式的任一方面中，细菌视紫红质蛋白是修饰的细菌视紫红质蛋白。
[0086] 在此具体实施方式的一方面，和该具体实施方式的任一方面中，编码细菌视紫红质蛋白的核酸可操作地连接于分化的细胞型特异性启动子。
[0087] 在此具体实施方式的一方面，和该具体实施方式的任一方面中，编码细菌视紫红质蛋白的核酸可操作地连接于至少一个编码荧光蛋白或生色团的附加基因。
[0088] 在此具体实施方式的一方面中，至少一个编码荧光蛋白的附加基因是绿色荧光蛋白或其同系物。
[0089] 在此具体实施方式的一方面，和该具体实施方式的任一方面中，编码细菌视紫红质蛋白的核酸可选择地连接于能够指示细胞内离子浓度的荧光蛋白。
[0090] 本说明书提供了示例性核酸和核酸构建体，它们的核酸序列在附带的序列表中提供。具有代表性的是，通过突变该蛋白邻近希夫碱基的质子受体进行修饰，使修饰的视紫红质至少离子泵活性下降。然而，本发明意欲不受这些实施例的限制，因为类似光学测定用于许多现存细菌视紫红质蛋白是可能。任何该类蛋白可用于本发明的方法，且任何该类蛋白也可以修饰使其离子泵活性下降。附图说明
[0091] 图1显示在绿色变形菌视紫红质的D97N突变体中的电压灵敏度机理。左侧：绿色变形菌视紫红质（a）跨越磷脂双层膜（b）。右侧：视黄醛（c）的生色团放大图，其通过希夫碱基（d）与蛋白骨架共价结合。在野生型结构中的门冬氨酸97被突变为天冬酰胺（e），进而降低希夫碱基的pKa，从野生型的>12降低为9.8值，以消除质子泵的光循环。跨膜电压降的变化改变局部电化学电位从而使质子（f）位于希夫碱基上，从而改变酸碱平衡。视黄醛的吸收光谱和荧光取决于希夫碱基的质子化状态：质子化形式是有荧光，去质子化形式则没有荧光的。通过测定荧光确定跨膜电压。
[0092] 图2A-2D显示GPR D97N是跨膜蛋白，其显示强耐光和环境灵敏的荧光。表达GPR D97N的大肠杆菌细胞在633nm波长下受激发且通过在660–760nm之间的GPR D97N发射的荧光成像。蛋白位于细胞外围的蛋白可以作为跨膜蛋白。图2A显示pH7和pH11时GPR D97N在整个大肠杆菌的可见吸收光谱；图2B显示pH7和pH11时溶于辛基葡萄糖苷的纯化GPR D97N蛋白的荧光发射光谱；图2C显示在相同光照条件下GPR D97N和有机染料Alexa647(分子探针)的光漂白作用曲线。图2D显示通过可见吸收监测的野生型和GPRD97N突变体中希夫碱的pH滴定。D97N突变体的pKa是9.8，野生型蛋白的pKa是>12。
[0093] 图3显示GPR D97N发挥体内和体外pH功能的荧光强度。在两种情况下，由于希夫碱基的去质子化在高pH时荧光减弱。测定大肠杆菌细胞的pKa值，其通过附加羰基氰化物3-氯苯腙（CCCP）使质子可以渗透细胞膜。这样的处理是有必要的，因为质子从细胞质一侧连接于希夫碱基，在没有CCCP时，细胞在细胞外pH浮动的情况下可维持稳定的细胞质pH。由于细胞内的局部环境影响，细胞内和纯化蛋白内的pKa不同。
[0094] 图4A和图4B显示在表达GPRD97N的大肠杆菌中的荧光闪烁。图4A显示pH7.5时3个大肠杆菌的摄影软片。每次暴露100ms。单个细胞的亮度随时间变化。图4B显示pH7.5时单个细胞的闪烁图像。每个痕迹是50秒（s）的记录强度。实验开始后的时间在右侧显示。在1小时的实验中细胞持续闪烁。相同细胞显示为快速闪烁（0和7分钟），缓慢闪烁（28分钟）和‘铃声’行为（18分钟）。
[0095] 图5显示含有古细菌视紫红质3（Arch3，在一些情况下也称Ar-3）的制粒的图，如在合成生物学网站中所描述的（合成神经生物学的网址为org/protocols/protocoldetail/36/10）(world wide web at synthetic neuro biology.org/protocols/protocoldetail/36/10)。
[0096] 图6A-6E显示Arch是荧光电压指示器。图6A显示Arch作为电压传感器的模型。pH和膜电位均可改变希夫碱基的质子化。所示晶体结构为细菌视紫质。Arch的结构尚不明确。图6B显示纯化的Arch在中性的、高pH时的吸收光谱（实线）和荧光发射光谱（发射谱见虚线）。图6C上图显示表达Arch的HEK细胞，通过Arch荧光是可见的。图6C下图显示电压依赖性荧光的像素权重矩阵区。标尺10μm。图6D显示Arch发挥膜电位功能的荧光。荧光值在-150mV时分开。图6E显示膜电位在-70mV和+30mV之间Arch的阶梯状动态响应。上升和下降边缘的突增是电子补偿电路的人为产物。数据是20个循环的平均。插入图显示在低于0.5ms分辨率的显像系统中的瞬态特性。
[0097] 图7A-7D显示Arch3WT动作电位的光学记录。表达Arch-GFP的培养的大鼠海马神经元通过GFP荧光成像。Arch荧光显示为蓝绿色，电压依赖性荧光区显示为红色。图7A显示在一连串动作电位的单个实验记录中，通过直流电压记录（下图，虚线）和加权Arch3荧光（上图，实线）测定的整个细胞膜电位。插入图是在单个细胞中269个脉冲响应的平均峰值，用电压（虚线）和荧光（实线）表示。图7B显示单个细胞的多个脉冲序列记录。将注入电流200pA（黑色虚线表示）应用于表达Arch WT的神经元。通过多重电流注入的荧光容易地检测动作电位（灰线表示）。图7C显示动作电位的亚细胞定位。我们以一个表达Arch的神经突起的影像并制作指示像素的权重矩阵，如图中显示的图像，其荧光随着红色记录电位共同变化，覆盖在紫色的时间平均的Arch荧光。我们检测电活性细胞中的亚细胞区。该图顶部显示由每个指示区域对应荧光（F）测定的动作电位时间过程(均值除以n=100脉冲)。图中还显示动作电位的电子记录（V，图底部）。图7D显示一个神经元中动作电位的异质动态学，通过n=33脉冲的均值计算得来。像素图中的箭头标注的区域（见图片）滞后于其他细胞约～1ms（黑色箭头）。标尺5μm。
[0098] 图8A-8D表明Arch D95N显示具有电压依赖性荧光而不是光电流。图8A显示在Arch3WT和Arch3D95N突变体中的光电流，在固定为V=0的HEK细胞中表达。用波长2
λ=640nm，1800W/cm的光脉冲照射细胞。图8B显示Arch D95N荧光在-150mV和+150mV之间增加3倍，从-120mV到+120mV接近于线性灵敏度。插图显示电压灵敏度图片。标尺
5μm。图8C显示瞬态特性，其包含快于500μs的组分（响应的20%）和恒定41ms的组分。
图8D显示Arch D95N提供膜电位的准确估计，清楚的分辨电压梯度为10mV，从带有噪声荧
1/2
光对整个时间量程<12s准确度为260μV/(Hz) 进行电压估计。
λ=640nm，1800W/cm的光脉冲照射细胞。图8B显示Arch D95N荧光在-150mV和+150mV之间增加3倍，从-120mV到+120mV接近于线性灵敏度。插图显示电压灵敏度图片。标尺
5μm。图8C显示瞬态特性，其包含快于500μs的组分（响应的20%）和恒定41ms的组分。
图8D显示Arch D95N提供膜电位的准确估计，清楚的分辨电压梯度为10mV，从带有噪声荧
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光对整个时间量程<12s准确度为260μV/(Hz) 进行电压估计。
[0099] 图9A-9C显示用ArchD95N的动作电位的光学记录。图9A显示电子记录的表达Arch WT的神经元膜电位，其经过电流注入脉冲和激光照射(I=1800W/cm2，λ=640nm)。当细胞接近阈值时，照明产生了足够的光电流以抑制动作电位。灰色的条带指激光照射。在表达Arch D95N的神经元上图9B与图9A相同，显示照明对脉冲或静息电位无影响。我们提供了表达Arch D95N的神经元，显示Arch D95N荧光(试验中用蓝绿色显示)和电压依赖荧光区域(实验中用红色显示)。图9C显示一连串动作电位序列的单个实验记录中，通过电子记录和权重的ArchD95N荧光(顶部，荧光线)确定整个细胞膜电位(底部，电压线)。
[0100] 图10显示现有的基因编码的荧光电压指示器，根据其灵敏度和速度分类-两个决定指示器性能的关键参数。VSFPs，FLARE和SPARC代表基于GFP同系物与膜蛋白的融合的指示器。我们已经开发的的示例性蛋白是变形菌视紫红质光学质子传感器(PROPS)，Arch3WT，和Arch3D95N，在右上侧显示。PROPS在细菌中发挥作用，而Arch3WT和Arch3D95N在哺乳动物细胞中发挥作用。注意对数坐标轴。基于细菌视紫红质的电压指示器比其他指示器更灵敏，更迅速。
[0101] 图11A-11D显示在表达Arch3D95N–eGFP的单个HL-1小鼠心肌细胞中动作电位的光学记录。记录动作电位至多为1000s，不具有光毒性信号。这个实验是采用基因编码电压指示器首次定量测定心脏动作电位。我们显示了在D95N-GFP融合体中展示Arch D95N和GFP荧光的外罩。图11A显示膜片箝记录(虚线)和荧光(实线)测定的动作电位的比较。图11B-11D显示在不断增加的长间隔中单个HL-1细胞中的动作电位的光学记录。11D中的数据已校正光漂白作用。
[0102] 图12显示表达Arch3D95N-eGFP的人类诱导多能干细胞(iPS)衍生的心肌细胞中动作电位的光学记录。人类诱导多能干细胞(hiPSC)由细胞动力学有限公司（Cellular Dynamics Inc.）提供。细胞在MatTek皿中以每平方厘米上20000，50000或75000的细胞的密度进行培养，其中该培养皿涂有0.1%明胶。这些条件显示细胞是稀疏且不自发搏动的(20K)，融合单分子层是自发搏动(50K)的，和密集的单分子层(75K)。iPS细胞在培养基中培养并保持48小时，且其后每48小时供给维持培养基（均来自细胞动力学公司）（Cellular Dynamics Inc.）。根据生产说明书使用Mirus LT-1转染iPS细胞。在包括20uL 的试管中，加入200ng的DNA和1.2uL的LT-1转染试剂。DNA混合物
在室温下孵化20分钟。孵化过程中，将新鲜的维持培养基附加到iPS细胞中，DNA混合物滴加到平皿中。细胞在转染后的48小时到96小时成像。我们观察到毗邻细胞的同步搏动，表明VIPs可探测细胞间的传导。我们持续记录10分钟以上，几乎没有光毒性。如对该种群期望的，在细胞种群内，我们观察到了与心室的，心房的，和节的细胞的动作电位相匹配的细胞。药物的附加导致动作电位波形变化，该变化与常规膜片箝报告的记录变化相匹配。
在荧光对比时间的图片中细胞1荧光信息为实线，细胞2荧光为虚线。
在室温下孵化20分钟。孵化过程中，将新鲜的维持培养基附加到iPS细胞中，DNA混合物滴加到平皿中。细胞在转染后的48小时到96小时成像。我们观察到毗邻细胞的同步搏动，表明VIPs可探测细胞间的传导。我们持续记录10分钟以上，几乎没有光毒性。如对该种群期望的，在细胞种群内，我们观察到了与心室的，心房的，和节的细胞的动作电位相匹配的细胞。药物的附加导致动作电位波形变化，该变化与常规膜片箝报告的记录变化相匹配。
在荧光对比时间的图片中细胞1荧光信息为实线，细胞2荧光为虚线。
[0103] 图13实验证明了VIPs与GFP同系物融合蛋白构建体的开发的一系列改进的电压指示器。每个条状的长度表明蛋白序列或接头区域的长度。颜色表明相应蛋白荧光的颜色。所有的构建体用Arch WT和Arch D95N骨架进行构建。该构建体的序列在下面的序列表提供：
[0104]pADD247/248 SEQ ID NO:48
pADD286/287 SEQ ID NO:53
pADD292/293 SEQ ID NO:50
pADD294(D95N only) SEQ ID NO:54
pADD297/300 SEQ ID NO:51
pADD259/298 SEQ ID NOS:55和52，分别
Pfck:Arch3(WT/D95N)-EGFP SEQ ID NOS:56-57，分别
pADD269/270 SEQ ID NO:49
Pcmv:Arch3(WT/D95N)-GCaMP SEQ ID NOS:58-59，分别
pADD286/287 SEQ ID NO:53
pADD292/293 SEQ ID NO:50
pADD294(D95N only) SEQ ID NO:54
pADD297/300 SEQ ID NO:51
pADD259/298 SEQ ID NOS:55和52，分别
Pfck:Arch3(WT/D95N)-EGFP SEQ ID NOS:56-57，分别
pADD269/270 SEQ ID NO:49
Pcmv:Arch3(WT/D95N)-GCaMP SEQ ID NOS:58-59，分别
[0105] 图14A-14B实验证明了ssFRET的机制。图14A显示当视黄醛上的希夫碱基(SB)质子化，视黄醛的吸收光谱(实线)与GFP的发射光谱(虚线)重叠，且GFP的荧光淬灭。然而，视黄醛在该状态是具有荧光性的。图14B显示当SB去质子化，GFP荧光(实线)变成去-淬灭的，视黄醛荧光消失。
[0106] 图15显示ssFRET信号的距离依赖。随着mOrange2和Arch生色团之间的距离减小，ssFRET信号的强度增强。
[0107] 图16显示在pADD294中Arch3荧光和mOrange荧光的瞬态特性。在此将mOrange2信号倒置以便于与Arch3信号进行比较。时间过程的相似度与由ssFRET产生的mOrange2荧光调节一致。电压梯度是从-70mV到+30mV。
[0108] 图17A-17C显示Arch3WT和D95N的pH-依赖性光谱。图17A显示在中pH（粗线）和高pH（细线）时的Arch WT吸收。在中性pH，Arch的最大吸收在558nm。荧光发射（虚线）记录在溶解在1%DM中的2μM蛋白上，λexc=532nm。图17B显示的Arch D95N光谱与图17A的条件相同。最大吸收波长是585nm。图17C显示pH6–11之间记录在纯化蛋白的吸收光谱。在400–750nm之间的吸收光谱的奇异值分解用于计算发挥pH功能的质子化状态的SB百分数。该结果适于Hill功能以测定SB的pKa值。
[0109] 图18显示Arch3WT的频率响应。将振幅50mV和1Hz–1kHz频率的线性调频脉冲正弦波应用于表达Arch3WT（野生型）的HEK细胞。测定荧光膜电位 计算傅里叶转换在1kHz的报升是电子补偿电路的人工产物。插入图: 中的噪音的能谱，在电压1/2
箝为恒定V=0mV，显示470μV/(Hz) 的散射噪音限制的噪音基准，频率在10Hz之上。在此报告的噪声图片对成像系统是特异性的，最初作为Arch3的可能灵敏度的指示器。
箝为恒定V=0mV，显示470μV/(Hz) 的散射噪音限制的噪音基准，频率在10Hz之上。在此报告的噪声图片对成像系统是特异性的，最初作为Arch3的可能灵敏度的指示器。
[0110] 图19显示Arch3WT对10mV电压梯度的灵敏性。通过直接电压记录V，(粗体黑线，图片中显示阶梯状线)和权重Arch3荧光 (细实线，图片中显示锯齿状)测定整个细胞膜电位。
[0111] 图20显示Arch报告无外源性视黄醛的动作电位。我们通过无外源性视黄醛的Arch3荧光制作了海马神经体外（DIV）14天的影像。在一个电流脉冲中神经元膜电位的电子记录(粗体黑色实线)和荧光记录(非粗体线，图片中显示锯齿状线)。动作电位被清晰地分辨。
[0112] 图21显示Arch D95N的频率响应，采用和Arch3WT（图18）相同的测定方式测定。
具体实施方式
[0113] 发明详述
[0114] 本发明基于，至少部分基于以下研究发现，与来自于天然的细菌蛋白相比，细菌视紫红质蛋白或修饰细菌视紫红质蛋白的离子泵活性下降，使其可以用作光学探测的传感器，用于检测跨膜结构的电压，例如在出现于细胞膜上的细胞或亚细胞细胞器中。也就是说，细菌视紫红质蛋白和修饰细菌视紫红质蛋白可以用于测定细胞膜电位变化，包括原核细胞和真核细胞。在此描述的光学传感器不受电极使用的限制，可使电生理学研究在例如在亚细胞区室中（例如，线粒体）或在小细胞中（例如，细菌）进行。在此描述的光学感受器可用于药物筛选方法中，装置研究中与体内成像系统中。
[0115] 细菌视紫红质：光学电压感受器的设计
[0116] 细菌视紫红质是一大类蛋白，其特征在于7个跨膜区域和连接于蛋白核心的亚视黄基生色团（retinilydene chromophore）通过希夫碱基连接于赖氨酸(Beja,O.,等。自然411,786-789(2001))(Beja,O.,et al.Nature411,786-789(2001))。现已知5000多个细菌视紫红质，这些蛋白被发现于生命体的各界。在宿主中，细菌视紫红质蛋白发挥多种功能：
一些是光驱动性质子泵（菌视紫质，变形菌视紫红质），其他是光驱动离子通道（通道视紫红质），氯泵（嗜盐菌紫质），或单纯作为光感受器（传感视紫红质）。
一些是光驱动性质子泵（菌视紫质，变形菌视紫红质），其他是光驱动离子通道（通道视紫红质），氯泵（嗜盐菌紫质），或单纯作为光感受器（传感视紫红质）。
[0117] 亚视黄基生色团使细菌视紫红质具有罕见的光学特性。视黄醛的线性和非线性响应对蛋白宿主的相互作用是高度敏感的：静电环境的微小变化能导致吸收光谱的巨大变化。这些电-光的耦合为细菌视紫红质的电压敏感性提供了基础。
[0118] 在此描述的一些光学感受器是未经修饰的天然蛋白，用于未正常表达细菌视紫红质的细胞中，所述细菌视紫红质是被转染至细胞内的，例如真核细胞。例如，如实施例中显示，野生型Arch3可以用于神经原细胞，特别是用于检测膜电压及其变化。
[0119] 一些细菌视紫红质是源于细菌视紫红质蛋白，通过降低或抑制视紫红蛋白的光诱导离子泵以进行蛋白修饰。这些修饰使修饰的细菌视紫红质蛋白可以感受电压，而无需采用细胞本身的离子泵活性调节细胞膜电位，从而改变的系统电压。其他突变体将其它的有益性质传递给细菌视紫红质电压传感器，包括荧光亮度增强，耐光性提高，电压响应的动态范围与灵敏度之间的调和，响应速度提高，吸收光谱和发射光谱间的调和。
[0120] 在本发明中，例如消除细菌视紫红质中泵活性的突变体一般包括希夫碱基平衡离子的突变体；位于视紫红质蛋白的第三个跨膜螺旋（螺旋C）的羧基氨基酸（(Asp或Glu)。氨基酸序列是RYX(DE)，在此X是非保守氨基酸。羧基残基的突变直接影响质子传导途径，质子泵的消除。虽然也有其他可能突变，最典型的突变是Asn或Gln。基于这里描述的说明，本领域技术人员可以制造不同的突变，通过细菌视紫红质导致离子泵活性消失或降低。在一个具体实施方式中，发明的修饰的细菌视紫红质蛋白与发明的方法包括从Asp到Asn或Gln的突变，或者从Glu到Asn或Gln的突变。在一些具体实施方式中，蛋白基本上包括从Asp到Asn或Gln的突变，或从Glu到Asn或Gln的突变。在一些具体实施方式中，蛋白包括从Asp到Asn或Gln的突变，或从Glu到Asn或Gln的突变。
[0121] 在此提供的举例说明光学电压传感器与制造和使用上述传感器的说明。基于在此提供的说明书和实施例，与光学感受器相似工作方式的其他感受器是可以制备和使用的。
[0122] 表1a包括根据本发明有用的细菌视紫红质的例子。例如，本发明中消除细菌视紫红质中泵活性的突变一般包括希夫碱基平衡离子的突变；位于视紫红质蛋白的第三个跨膜螺旋（螺旋C）的羧基氨基酸（(Asp或Glu)。表1a指序列中的氨基酸位置，以此基因库（Genbank）号码作为举例。然而，基于在可用氨基酸序列中的变化，位置编码轻微变化。基于在此描述的基序说明，本领域技术人员可以轻易的制作相似突变使其成为其他细菌视紫红质基因，以具有相同的功能性质，也就是所讨论的细菌视紫红质的质子泵活性降低。
[0123]
[0124] 下表1b包括根据本发明方法所说明的可以被突变的附加视紫红质举例:
[0125]
[0126] 电压指示蛋白(VIP)
[0127] 我们已经开发了一系列基于古细菌视紫红质的荧光电压指示蛋白（VIPs），在哺乳动物细胞发挥作用，包括神经元和人类干细胞源性的心肌细胞。这些蛋白以亚毫秒时间分辨率和亚微米空间分辨率指示电动力学。利用膜电位的光学测定，我们示范了哺乳动物细胞和组织电动力学的非接触、高通量和高含量的研究。这些VIPs具有广泛作用，尤其是在真核细胞中，例如哺乳动物的，包括人类细胞。
[0128] 基于古细菌视紫红质3（Arch3）及其同系物我们开发了VIPs。Arch3是源于苏打盐红菌（H.sodomense），并被公认为是用于高效的黄/绿光神经沉默的遗传编码试剂。基因库中的基因序列：GU045593.1(合成构建体Arch3基因，完整的cds序列.9/28/2009提交).我们已表明这些蛋白集中于真核细胞核的质膜上，且显示电压依赖性荧光。
[0129] 我们还表明进一步改进的膜定位，在ArchT上具有可比性的电压敏感度，基因库中的基因序列：HM367071.1(合成构建体ArchT基因，完整的cds序列，5/27/2010提交)。ArchT是来源于嗜盐古菌（Halorubrum sp.）的古细菌视紫红质TP009:高效黄/绿光神经沉默的遗传编码试剂，比Arch3光敏感度的高于3.5倍。
[0130] 表1c总结了可用于构建病毒构建体的序列举例，该构建体基于古细菌视紫红质表达的电压指示器。
[0131]
[0132] 图10表明现有的遗传编码荧光电压指示器，根据其灵敏度和速度分类-决定指示器性能的两个关键参数。我们开发的蛋白是变形菌视紫红质光学质子传感器(PROPS)，Arch3WT，和Arch3D95N，在右上侧显示。PROPS仅在细菌中发挥作用，而Arch3WT和Arch3D95N在哺乳动物细胞中发挥作用。我们表面，表明基于细菌视紫红质的电压指示器比其他指示器更加迅速，且更加灵敏。
[0133] 表2显示荧光电压指示蛋白的近似特征，且包括荧光指示器的所有家族的代表成员。虽然在表2中的目录并不全面，本领域技术人员可容易地理解在本发明中有用蛋白类型的特征。
[0134]
[0135]
[0136] 图9显示在单个大鼠海马神经元中动作电位的光学记录。数据代表单个试验，其中脉冲是由给予电流脉冲引起的。荧光伴随个体动作电位，显示清晰的爆发。该实验是采用基因编码的电压指示器，首次稳定测定单个哺乳动物神经元中的动作电位。
[0137] 图11显示在表达Arch3D95N–eGFP的单个HL-1小鼠心肌细胞中动作电位的光学记录。动作电位记录至多为1000s，没有光毒性信号。该实验首次采用遗传编码的电压指示器定量测定心脏动作电位。
[0138] 图12显示在表达Arch3D95N–eGFP的人类诱导多能干细胞衍生的心肌细胞中动作电位的光学记录。人类诱导多能干细胞(hiPSC)是由细胞动力学有限公司（Cellular Dynamics Inc）提供。细胞在MatTek皿中以每平方厘米20000，50000或75000的细胞密度进行培养，其中该培养皿涂有0.1%明胶。这些条件显示细胞是稀疏且不自发搏动的(20K)，融合单分子层是自发搏动(50K)的，和密集的单分子层(75K)。iPS细胞在培养基中培养并保持48小时，且其后每48小时供给维持培养基（均来自细胞动力学公司）（Cellular Dynamics Inc.）。根据生产说明书采用Mirus LT-1转染iPS细胞。在包括20uL 的试管中，加入200ng的DNA和1.2uL的LT-1转染试剂。DNA混合物在室温下孵化20分钟。
孵化过程中，将新鲜的维持培养基附加到iPS细胞中，DNA混合物滴加到平皿中。细胞在转染后的48小时到96小时成像。
孵化过程中，将新鲜的维持培养基附加到iPS细胞中，DNA混合物滴加到平皿中。细胞在转染后的48小时到96小时成像。
[0139] 我们观察到毗邻细胞的同步搏动，表明VIPs可探测细胞间的传导。我们持续记录10分钟以上，用低光毒性。如对该种群期望的，在细胞种群内，我们观察到了与的心室的，心房的，和节的细胞的动作电位相匹配的细胞。药物的附加导致动作电位波形的变化，该变化与常规膜片箝报告的记录变化相匹配。
[0140] 具有附加或改进性质的细菌视紫红质和GFP同系物之间融合体的形成
[0141] 我们将VIPs与GFP-同系物融合，已开发一系列的改进的电压指示器。图16举例说明了这些构建体的例子，图16的说明提供了这些构建体的序列。新开发的传感器的新能力包括，例如，用以增强亮度的FRET光谱移动(ssFRET)和2-光子成像，比率电压成像，和用以同时测定电压和浓度的多峰传感器。
[0142] 用以增强亮度的FRET光谱移动(ssFRET)和2-光子成像
[0143] 第一代VIPs的关键限制是视黄醛的内源性荧光是暗的。成像需要专门系统，包括强烈的红光激光器，高数值孔径的物镜，和电子倍增CCD(EMCCD)相机。理想的是，所用的指示器足够明亮使其可以在一个常规的宽视野或同焦点的荧光显微镜，或2-光子同焦点显微镜中成像，用以体内应用。
[0144] 如图10所示，ssFRET提供一种更明亮的VIPs的方法。将GFP-同系物（种属上是指GFP）融合于细菌视紫红质（如，见图13）。视黄醛吸收光谱中的电压依赖性变化使GFP与视黄醛之间的非放射性荧光共振能量转移的电压依赖性速率产生。视黄醛在其吸收，荧光状态熄灭GFP，但视黄醛在非吸收，非荧光状态不会熄灭GFP。因此，可获取GFP和视黄醛的抗相关荧光发射。
[0145] 因此，在一种具体实施方式中，发明提供含有GFP的融合蛋白，所述GFP与细菌视紫红质或修饰的细菌视紫红质进行融合，例如古细菌视紫红质或变形菌视紫红质。该融合蛋白可用于本发明中的任一或所有方法中。
[0146] 为使GFP和视黄醛之间的ssFRET水平最大化，我们选择了GFP同系物，mOrange2，其放射与Arch3在其质子化状态的吸收有最大程度的重叠。随着生色团之间的距离增加FRET的速率迅速下降，因此，我们构建了一系列截短的构建体，该构建体中去除Arch3和mOrange2中的接头和非必须组成。图15显示随着Arch3和mOrange2之间的距离减小，ssFRET信号增强。同样的策略也可应用于从其他细菌视紫红质和GFP同系物形成ssFRET信号。
[0147] 我们已经看出Vm中mOrange2梯度的荧光响应时间和Arch D95N中的荧光响应时间相匹配。该现象和ssFRET是一致。在图9A和11中可观察到与Arch3WT融合的类似结果。
[0148] 比率电压成像
[0149] VIPs应用的的关键挑战是提取膜电位的准确值，不受光致漂白作用，照明强度的变化，细胞移动或蛋白表达水平的差异的系统性人工干扰。在可接触膜片箝的细胞中，在外界控制的情况下改变膜电位，膜片箝可校准荧光发挥膜电位功能。然而，VIPs的优势是他们功能的发挥在系统上难以接触膜片箝。在这些情况下，直接校正是不可能的。
[0150] Arch3(WT或D95N)和eGFP的融合能够实现膜电位的比率测定。可采用其他视紫红质来实现相似的比率测定，例如在本申请中描述的使用相同概念的那些视紫红质。eGFP荧光独立于膜电位，Arch3荧光和eGFP荧光的比率提供了膜电位的测定的方法，该膜电位不依赖于表达水平，照明或移动的变化。由于eGFP和Arch3之间的长接头，且eGFP的发射光谱和Arch3的吸收光谱重合较小，所以该结构不能进行ssFRET。
[0151] 用于电压和浓度同时测定的多峰传感器
[0152] 膜电位只是细胞内信号的多种机制之一。人们常希望将膜电位的变化与其他物质浓度的变化相关联，如Ca++，H+(例如pH)，Na+，ATP，cAMP。我们构建了带有pH荧光蛋白（pHluorin）的（荧光pH指示器）Arch与GCaMP3(荧光Ca++指示器)的融合。采用在此启示的概念，也可以使用与基于蛋白的其他荧光指示器的融合物能够进行其他形式的多峰成像。当编码细菌视紫红质的核酸可操作地连接于或融合于附加荧光离子敏感指示器时，离子浓度例如钠，钾，氯和钙，可以同时测定。
[0153] 附加荧光蛋白
[0154] 术语“附加荧光分子”指荧光蛋白而非细菌视紫红质。该分子可以包括，例如，绿色荧光蛋白及其同系物。
[0155] 荧光蛋白不是细菌视紫红质，这是众所周知的，且广泛地使用，例如，在作者为Rebekka M.Wachter的综述GFP相似的蛋白家族：结构，功能，光电物理和生物传感器的应用的引言和展望中即可找到例子(光化学与光生物学，第82卷，第2期，339–344页，2006年3月)(Photochemistry and Photobiology Volume82，Issue2，pages339–344，March2006)。此外，由Nathan C Shaner，Paul A Steinbach，和Roger Y Tsien写的综述，题目为选择荧光蛋白的指南(自然方法-2，905–909页(2005年))(Nature Methods-2，
905-909(2005))，提供了附加的有用荧光蛋白的例子。
905-909(2005))，提供了附加的有用荧光蛋白的例子。
[0156] 细胞内细胞器靶向的VIPs
[0157] 我们展示了细胞内细胞器靶向的VIPs，包括线粒体，内质网，肌质网，突触小泡和吞噬小体。因此，在具体实施方式中，本发明提供构建体，如表达构建体，如病毒构建体，其包括细菌视紫红质可操作地连接于蛋白靶向的序列，该序列使蛋白靶向于细胞内细胞器，包括线粒体，内质网，肌质网，突触小泡和吞噬小体。
[0158] 本发明还提供表达该构建体的细胞，进一步提供在表达该构建体的细胞中测定膜电位变化的方法，和筛选影响一个或多个细胞内细胞膜电位的候选试剂的方法。
[0159] 电压指示蛋白(VIPs)的主要优势
[0160] 新开发的VIPs显示高灵敏度。在哺乳动物细胞中，VIPs在-150mV和+150mV之间的荧光大约增加了3倍。在该范围内的大部分内响应是线性的。在1s间隔内我们能够测定膜电压的准确度<1mV。
[0161] 新开发的VIPs显示高速度。Arch3WT显示在<0.5ms内其瞬态特性显示为90%。神经元动作电位持续1ms，因此该速度达到神经元电活性成像的基准点。然而，Arch3WT保留光诱导的质子泵，因此，光照会使细胞轻微超极化。
[0162] 修饰的细菌视紫红质，Arch3D95N，有40ms的响应时间且缺乏光诱导的质子泵。虽然该构建体较慢的响应速度妨碍了膜电位检测及其在神经元中的变化，Arch3D95N已足够快可以指示其他类型细胞中的膜电位和动作电位，例如，在心肌细胞中，且在其使用时，不会干扰细胞的膜电位。
[0163] 新开发的VIPs还显示高耐光性。在光漂白作用之前产生的荧光光子数量上，VIPs与GFP是可以媲美的。我们对在哺乳动物细胞中的VIPs常规地观察了数分钟，没有发生光漂白作用或光毒性的迹象。VIPs与GFP或其他已知的荧光蛋白均无同源性。
[0164] 新开发的VIPs还显示远红外光谱。用633nm的激光激发VIPs，放射在近红外，峰值在710nm。红外放射比现有的荧光蛋白都远。这些波长与低细胞自发荧光和良好的组织传导性相一致。由于光谱可推进具有高信噪比的成像，与其他荧光探针的结合进行多谱成像，该特征使这些蛋白在动作电位的光学测定中尤其有用。
[0165] 新开发的VIPs还显示高的靶向性。我们已经在初级神经元培养，心肌细胞（HL-1和人类衍生的iPSC)，HEK细胞和格兰阳性细菌、格兰阴性细菌中做了VIPs成像。我们将VIP靶向于内质网和线粒体。这些构建体在线虫（C.elegans,）、斑马鱼和小鼠体内成像也是有用的。
[0166] 发明带有细菌视紫红质的构建体，还包括细胞型和/或时间特异的启动子，其可以对活生物体内任何光学可接触的细胞或细胞器的膜电位进行成像。
[0167] 在一种具体实施方案中，电压感受器的设计包括或基本上包括选择至少三个元素：启动子，细菌视紫红质电压传感器，一个或多个靶向的基序，和任意附属荧光蛋白。在下面的表1a，1b中和表3中列出了这些元素中每个元素的一些非限制性例子。在一种具体实施方式中，选择每栏中至少一个元素以制造具有预期特征的光学电压传感器。在一些具体实施方式中，在此描述的用于电压传感器的方法和组合物包括选择：1)细菌视紫红质蛋白，2)一个或多个突变，使蛋白对电压或其他大量感兴趣的具有敏感性，和消除光驱动充电泵，3)选择适宜用于宿主种属的密码子，4)一个启动子和靶向序列，用以在感兴趣的细胞型中表达蛋白和使蛋白靶向于有用的亚细胞结构，5)含有传统荧光蛋白的任意融合体用以提供比率成像，6)生色团用以插入细菌视紫红质，和7)光学成像电路。
[0168]
[0169] 在一种具体实施方式中，光学感受器基因是由传递载体编码的。这样的载体包括但不仅限于：质粒(例如：pBADTOPO，pCI-Neo，pcDNA3.0)，粘粒，和病毒（例如慢病毒，腺伴随病毒或杆状病毒）。
[0170] 在一种具体实施方式中，绿色吸收变形菌视紫红质(GPR)被用作初始分子。选择这个分子，是由于其具有相对的红移吸收光谱并且其在异源宿主例如大肠杆菌中容易表达。在其他的具体实施方式中，蓝色吸收变形菌视紫红质(BPR)用于电压光学传感器。在此思考的是，如在此述，野外发现的大量细菌视紫红质可设计为光学电压传感器。
[0171] 细菌视紫红质除了电压以外还对定量敏感。GPR和BPR的突变体，如在此所述，也对细胞内pH敏感。可以预期的是嗜盐菌紫质对局部氯化物浓度也是敏感的。
[0172] 在一种具体实施方式中，压力传感器是选自于细菌视紫红质蛋白（野生型或突变体），该蛋白提供在其吸收或荧光谱中电压诱导的移位。来自于这些构建体的初始序列的设计，初始序列包括但不限于表1a-1b中列出的序列，其列出了视紫红质和举例的突变体，所述举例的突变体可以制作为基因以提高蛋白产品性能的。
[0173] 用以最小化光诱导电荷泵送能力的突变体。视黄醛生色团通过希夫碱基连接于赖氨酸。保守的门冬氨酸作为质子接受器，与希夫碱基相邻。将该门冬氨酸突变为天冬酰胺来抑制质子泵。因此，在一些具体实施方式中，突变选自于该组，包括:D97N(绿色吸收变形菌视紫红质)，D99N(蓝色吸收变形菌视紫红质)，D75N(传感视紫红质II)，和D85N(菌视紫质)。在其他的具体实施方式中，可以突变为抑制泵活性的残基包括（使用菌视紫质编号）D96，Y199，和R82及其在其他细菌视紫红质中的他们的同系物。在另外的具体实施方式中，D95残基可以在古细菌视紫红质中突变来抑制质子泵（例如，D95N）。
[0174] 引进突变以使吸收光谱和发射光谱移动至期望的范围。邻近结合口袋的残基可被个别突变或组合地调节光谱使其在期望的吸收或发射波长。在菌视紫质中这些残基包括，但不仅限于，L92，W86，W182，D212，I119，和M145。相应的残基在其他细菌视紫红质中可能被突变。因此，在一些具体实施方式中，向修饰细菌视紫红质蛋白的突变在残基上进行，该残基选自于包含L92，W86，W182，D212，I119，M145的组。
[0175] 引进突变以使电压灵敏度的动态范围移动至期望谱带。这种突变通过转移希夫碱基附近的电子分布发挥作用，从而改变电压，所述电压是从该组增加或去除质子所需要的电压。在绿色吸收变形菌视紫红质中的电压移动突变包括，但不限于，E108Q，E142Q，L217D，个别地或组合地，例如使用绿色吸收变形菌视紫红质定位，或在其他视紫红质中相应的残基。在一种具体实施方式中，D95N突变被引进到古细菌视紫红质3中进而调节希夫碱基的pKa值到中性的pH。
[0176] 引入任意的突变以提高荧光的亮度和耐光性。当突变时可能限制结合口袋来增加荧光的残基，这样的残基包括（使用菌视紫质编号）但不仅限于Y199，Y57，P49，V213和V48。
[0177] 密码子选择
[0178] 大量哺乳动物基因，包括例如鼠类和人类基因，已成功在不同的宿主细胞中表达，包括细菌，酵母，昆虫，植物和哺乳宿主细胞。然而，尽管表达系统和DNA重组技术知识不断发展，当人们试图在选择的宿主细胞中表达外来的或合成的基因时，依然存在巨大障碍。例如，合成基因的翻译翻译，甚至当与强启动子耦合时，进展经常会比预期要慢很多。相同的情况在外来于宿主细胞的外源性基因经常出现。这种比预期的翻译翻译效率低常常是由于基因的蛋白编码区有密码子选择的结构，该结构与宿主细胞中高表达基因的结构不相似。众所周知，就这一点而言，在不同的有机体中密码子使用是具有高的偏好和变化的，且在密码子使用的偏好性可以改变肽延长的速率。人们也知道密码子使用模式与tRNA同功受体的相对丰度相关，编码高丰度和低丰度蛋白的基因显示他们密码子偏好是不同的。
[0179] 开发密码子优化技术用来提高翻译无效蛋白编码区的翻译动力学。这些技术是基于将很少或不经常在宿主细胞中使用的密码子替代为宿主细胞偏好的密码子。密码子的频率可源于文献资源报道的很多生物体高表达基因(见，例如，Nakamura et al.，1996，核酸研究24:214-215)(Nakamura et al.，1996，Nucleic Acids Res24:214-215)。这些频率以经常在‘生物范围平均偏差’中表达发生的百分数表示，所述发生是通过采集生物体的蛋白编码基因同义密码子用于编码相应的氨基酸的机会，其优选是高表达的。在一种具体实施方式中，细菌视紫红质蛋白的密码子在真核细胞中进行优化表达。在一种具体实施方式中，真核细胞是人类细胞。
[0180] 优选但并不是必需将细菌多核苷酸的所有密码子替代为同义密码子，所述同义密码子在真核细胞(例如，人类)中比第一密码子具有更高翻译效率。即使部分替代也可完成增加的表达。典型地，替代步骤影响至少母体多核苷酸的第一密码子的约5%，10%，15%，20%，25%，30%，更优选的是，至少约35%，40%，50%，60%，70%或更多。适宜的是，两种密码子之间的翻译效率差异和数量，选择第一密码子和同义密码子可以使在真核细胞中从合成多核苷酸生产的有用蛋白的水平至少是在真核细胞中从母体多核苷酸生产的有用蛋白水平的约110%，适宜的是至少150%，优选的是至少200%，更优选的是至少250%，更优选的是300%，更优选的是350%，更优选的是400%，更优选的是450%，更优选的是500%，甚至更优选的是
1000%。
1000%。
[0181] 一般而言，如果母体多核苷酸可以选择低和中等翻译效率的密码子，首先优选将一些或者更多优选所有的低翻译效率的密码子替代为具有中等，优选是高翻译效率的同义密码子。典型的是，用中等或高翻译效率密码子的替代低翻译效率密码子导致源自此构建体的合成多核苷酸的多肽产量显著增加。然而，还优选采用高翻译效率的密码子替代一些，或优选是全部的中等翻译效率的密码子，用以优化多肽的生产。
[0182] 将一个密码子取代为另外一个密码子可采用本领域已知的标准方法实现。例如母体多核苷酸的密码子修饰可通过多种已知的诱变技术进行影响，包括，例如寡核苷酸指导的诱变，采用简并寡核苷酸的诱变和区域特异性的诱变。体外诱变技术的举例如下：在美国专利号4,184,917，4,321,365和4,351,901或Ausubel等人的(现代分子生物学试验设计，John Wiley和Sons，Inc.1997)(CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，Inc.1997)和Sambrook等人的(分子克隆.实验手册，冷泉巷出版社，1989)(MOLECULAR CLONING.A LABORATORY MANUAL，Cold Spring Harbor Press，1989)的相关章节中有所描述。代替体内的诱变，合成的多核苷酸可采用如描述的易得的机械装置进行从头合成，例如在美国专利No.4，293，652中描述的。然而，值得注意的是，本发明不依赖于，且不针对于，任何用于构建合成多核苷酸的特定技术。
[0183] 细菌视紫红质（例如GPR）的基因在大肠杆菌中表达较好，但在真核宿主中表达欠佳。在一种具体实施方式中，为了能在真核中表达，我们设计并合成了适于真核细胞(例如，人类)密码子选择的基因变型。该程序可采用公开可得的软件应用于任何基因，例如基因设计软件2.0包（the Gene Designer2.0package）(互联网上可用的网址为dna20.com/genedesigner2/)(available on the world wide web at dna20.com/genedesigner2/)。在此，一些“人化的”基因是指在名字前面加上字母“h”，例如hGPR。在此和实施例中描述的Arch3视紫红质及其突变体用人类选择密码子全部优化。
[0184] VIPs在筛选靶向于如下组织或过程的药物中的应用
[0185] 在本申请中公开的构建体可用于药物筛选方法中，例如，以神经系统为靶向的药物。在表达特异性离子通道的细胞培养中，无需对细胞中使用膜片箝的劳动，一次即可筛选出激动剂或拮抗剂。在神经元培养中，人们可以探测药物对动作电位的引起，传播，和突触传导的效果。在人类iPSC-衍生神经元的应用能够使遗传决定的神经病学疾病的研究，和环境应激响应的研究得以开展（例如，缺氧症）。
[0186] 类似的，在此提供的使用构建体的光学电压传感提供了一个新颖的和显著改善的方法用于筛选药物，所述药物是调整心脏动作电位及其胞间传播的药物。这些筛选不仅有助于测定候选药物的安全性还可以辨别新的心脏药物的先导。由于hERG抑制与长QT综合征的病人的心室纤维性颤动相关，所以鉴别与hERG通道相互作用的药物是一个极具潜力的方向。在人类iPSC衍生心肌细胞中的应用使遗传决定的心脏状态研究，和环境应激响应的研究得以开展（例如，缺氧）。
[0187] 此外，本发明中的构建体可用于生长和伤口愈合研究方法中。在正常和非正常生长中，以及组织修复中的电子信号的角色很少能被理解。VIPs使长时间的组织，器官和生物体的生长和愈合中的电压动力学研究得以开展，且开发调整这些动力学的药物。
[0188] 还在另外的实施方式中，发明提供影响线粒体膜电位的药物筛选方法。线粒体在衰老，癌症和神经变性疾病中扮演重要角色。目前没有用于线粒体膜电位的好的探针。VIPs提供这样的探针，其使调整线粒体活动的药物研究能够开展。
[0189] 发明还提供筛选药物的方法，该药物可调整大范围医学上，工业上和环境上重要微生物的电生理学。
[0190] 在我们发现VIPs之前，还没有在任何完整原核生物中进行膜电位的测定。我们发现细菌有复杂的电动力学。VIPs能够筛选调整大范围医学上，工业上和环境上重要微生物的电生理学的药物。例如，我们发现大肠杆菌中电活动性和流出泵相互关联。
[0191] 膜电位的变化也与巨噬细胞的激活相关。然而，由于膜片箝很难应用于游动细胞，使该过程很难理解。VIPs使巨噬细胞和其他游动细胞的电生理学研究得以开展，包括精子细胞的生育力研究。因此，发明的VIPs可用于筛选药物或试剂的方法，例如，筛选影响免疫性和免疫疾病和生育力的药物或试剂。
[0192] 实施例描述了在大鼠海马神经，小鼠HL-1心肌细胞和人类iPS衍生的心肌细胞中VIPs的表达。在所有的细胞型中，单个动作电位(APs)很容易观察到。我们测定了药物对AP波形的影响。
[0193] 例如，在一种具体实施方式中，发明提供一种方法，其中表达细菌视紫红质的细胞进一步暴露于能够或预期能够改变膜电位的刺激。
[0194] 可以使用的刺激包括候选试剂，例如候选药物，有机小分子或无机小分子，较大的有机分子，及其任何组合的分子库。人们也可以使用已知药物的组合，例如抗生素和候选试剂的组合去筛选可能增加一个或多个现有药物如抗生素的有效性的试剂。
[0195] 发明的方法也有助于体外毒性筛选和药物开发。例如，采用在此描述的方法，可以使来自诱导多能细胞的人类心肌细胞，稳定表达修饰古细菌视紫红质，其中质子泵活性显著降低或消失。上述细胞对于药物开发中的体外毒性筛选是十分有用的。
[0196] PROPS:源自于GPR的光遗传电压传感器
[0197] GPR有7个分光镜可区分的状态，穿过光循环。原则上任何两个状态的之间的转变对膜电位都是敏感的。在一种具体实施方式中，希夫碱基的酸碱平衡被选择为波长移动转变，因此传感器的名字：变形菌视紫红质光学质子传感器(PROPS)。PROPS性质及其使用的特征在实施例部分进行描述。下面提供的是对PROPS进行的简要讨论。
[0198] 已知的是，野生型GPR的吸收光谱灵敏地依赖于希夫碱基的质子化状态。当质子化时，最大吸收是在545nm，和当去质子化时，最大吸收在412nm。当GPR吸收一个质子，视黄醛进行13-反式到顺式的异构化，引起质子从希夫碱基跳跃到邻近的Asp97中，导致吸收从545nm转移到412nm。在此描述的PROPS设计希望概括这种转移对膜电位变化的反应。
[0199] 作为最佳电压传感器，野生型GPR的两方面可被改变。首先，希夫碱基的pKa值可以从其野生型的12转变为接近周围pH的数值。当pKa～pH，质子化状态对膜电压具有最大的灵敏度。第二，最适宜的情况是，由于电压探针不应该扰乱研究中的数量，因此可消除内源性电荷泵能力。然而，在一些情况下，野生型的细菌视紫红质可被使用，例如我们的实施例中显示的，如Arch3WT，在神经元中发挥作用以测定膜电位。
[0200] 在一种具体实施方式中，单个点突变引起GPR中的两个改变。从Asp97到Asn的突变消除了邻近希夫碱基的负电荷，且使希夫碱基上的质子不稳定。pKa从12转变为9.8。在野生型的GPR中，在光循环的第一步Asp97也作为质子受体，因此去除该氨基酸可消除质子泵。GPR的这种突变体是指PROPS。
[0201] 类似的是，在源自于BPR的类似的电压传感器中，从Asp99到Asn的类似的突变降低了希夫碱基的pKa值，且消除了质子泵光循环。因此，在一种具体实施方式中光学传感器是源自于BPR，在BPR中氨基酸残基Asp99突变为Asn。
[0202] 在GPR中，附加的突变使pKa转向更接近生理学数值7.4。具体来说，Glu108到Gln的突变和Glu142到Gln的突变，各自或其组合导致pKa的下降并电压灵敏度的进一步增加。除了在此讨论的那些，很多突变可导致pKa的附加变化和PROPS光学性质的改善，在此对这些突变也做了考虑。
[0203] 表达载体和靶向序列
[0204] 在细胞中可采用表达载体表达光学传感器。术语“载体”是指核酸序列可以插入的载体DNA分子以将其引入宿主细胞。“表达载体”是专门的载体，其包括在宿主细胞中用于目的基因表达的必需的调控区。在一些具体实施方式中，目的基因可操作地连接于载体的其他序列。在一些具体实施方式中，病毒载体优选是复制缺损型，例如可通过去除编码用于复制的所有的病毒核酸来实现。复制缺损型病毒载体仍将保留其传染特性，以和复制型载体相似的方式进入细胞，然而，一旦允许进入细胞，复制缺损型病毒载体不可复制或繁殖。术语“可操作地连接”是指将编码序列表达必需的调控序列放置在DNA分子中合适的、与编码序列相关的位置进而影响编码序列的表达。相同的定义有时也应用于在表达载体中的编码序列和转录控制因子（例如，启动子，增强子和终止子）的布置上。
[0205] 很多病毒载体或病毒相关载体在本领域已为我们所熟知。这些载体可用作核酸构建体的载体进入细胞。为了，构建体可以被整合和打包地进入到非复制、缺陷型病毒基因中，像腺病毒，腺伴随病毒(AAV)，或单纯性疱疹病毒(HSV)或其他病毒，包括逆转录病毒和慢病毒载体，用于感染或传导至细胞内。载体可以掺合或可以不掺合到细胞的基因组中。必要时，这些构建体可能包括用于转染的病毒序列。可选地，该构建体可以掺合到能够附加型复制的载体中，例如，EPV和EBV载体。当表达调控序列控制和调节多核苷酸序列的转录和翻译时，在此描述的载体中引入的物质可操作地连接于表达调控序列。术语“可操作地连接”包括包括一个待表达多核苷酸序列之前的合适的起始信号（例如，ATG），并保持正确的阅读框进而使其在表达调控序列的控制下表达多核苷酸序列，和生产期望的编码多核苷酸序列的多肽。在一些实施例中，插入物质的转录受启动子序列（或其他转录调控序列）控制，该序列在预期表达的细胞中控制重组基因的表达。也可以理解的是，当然插入物质受到转录调控序列的控制，该转录调控序列相同于或异于那些控制蛋白自然存在形式的转录的序列。在一些实例中，启动子序列通过细胞内合成机制，或引入的合成机制识别，这对于启动特定基因的转录是所需要的。
[0206] “诱导型启动子”是指能够直接或间接激活一个或多个DNA序列或基因转录，其对于“调控物”（例如多西环素）或“刺激”（例如加热）是有反应的。在没有“调控物”或“刺激”时，DNA序列或基因就不能大体上被转录。术语“大体上未转录”或“大体上未表达”是指转录水平比在适宜刺激或调控物存在时观察到的转录水平低至少100倍，优选至少200倍，300倍，400倍，500倍或更多。在此使用的术语“刺激”和/或“调控物”是指化学试剂，例如代谢产物，小分子或直接暴露于生物体的生理应激，例如冷，热，毒素，或病原体或致病实际试剂的作用。包括诱导型启动子的重组细胞可能通过外部应将刺激或试剂将细胞暴露于调控试剂或刺激，或者将生物体暴露于适宜的环境条件或活着的病原体暴露于调控试剂或刺激。诱导型的启动子只有在调控试剂或刺激存在时启动转录。诱导型的启动子的例子包括四环素应答元件，和源于β干扰素基因，热休克基因，金属硫蛋白基因或任何可从甾体激素响应基因得到的启动子。可用于执行本发明中方法的诱导型启动子包括由激素和激素类似物调控的那些启动子，例如黄体酮，蜕化激素和糖皮质激素以及受四环素，热休克，重金属离子，干扰素，和乳糖操纵子激活化合物调控的启动子。这些系统的综述请看Gingrich和Roder的《神经科学年度总览21》，1998，页码377-405（Gingrich and Roder,1998,Annu Rev Neurosci21,377-405）。组织特异性的表达在基因表达领域已经极具特征，且组织特异和诱导型启动子在本领域为我们所熟知。这些启动子在引入目标细胞后用于调节外来基因的表达。
[0207] 启动子序列可能是“细胞型特异性启动子”或“组织特异性的启动子”，意思是作为启动子的核酸序列，也就是说，调节所选的可操作地连接于启动子的核酸序列的表达，这影响在需要测定膜电位的特异性细胞或组织中所选核酸序列的表达。在一些具体实施方式中，细胞型特异性启动子是渗漏细胞型特异性启动子。术语“渗漏”启动子是指，其最初调整在一细胞型中的选出的核酸的表达，但是也引起在其他细胞中的表达。对于外源性基因的表达，尤其是神经细胞，可采用神经元特性烯醇化酶启动子(见Forss-Petter等人.，1990，神经元，第5卷，页码：187-197)(see Forss-Petter et al.，1990，Neuron5:187-197).。对于在多巴胺能神经元中的外源性基因表达，可采用酪氨酸羟化酶启动子。对于垂体细胞中的表达，可采用垂体后叶素特异性的启动子，例如POMC(Hammer等人，1990，分子内分泌学.第4卷，页码：1689-97)(Hammer et al.，1990，Mol.Endocrinol.4:1689-97)。肌肉特异性启动子的例子包括，例如，α-肌球蛋白重链启动子和MCK启动子。其他在哺乳动物细胞中有效的细胞特异性的启动子在此也受到关注。该启动子提供一种便利方式，用于控制外源性基因在细胞培养或哺乳动物细胞中的表达。
[0208] 在一些具体实施方式中，表达载体是慢病毒载体。对在此描述的方法和组合物有用的慢病毒载体可包括真核启动子。该启动子可以是任何诱导型启动子，包括合成的启动子，可作为启动子在真核细胞中发挥作用。例如，真核启动子可以是，但不限于，蜕皮激素诱导型启动子，E1a诱导型的启动子，四环素诱导型的启动子等，在本领域是公知的。此外，在此使用的慢病毒载体还可包括可选择的标记物，可包括启动子和可选择特性的编码序列。编码可选择标记物的核苷酸序列在本领域是公知的，包括那些编码基因产品的序列，所述基因产品具有对抗生素或抗代谢物耐受的性质，或满足营养缺陷型要求。这样序列的例子包括，但不仅限于，编码胸苷激酶活性的序列或对氨甲喋呤，安比西林，卡那霉素，氯霉素，嘌呤霉素，博来霉素和其他药物耐受的序列。
[0209] 在一些具体实施方式中，病毒载体是腺伴随病毒载体（AAV）。AAV能够转染分裂细胞和非分裂细胞，且可能将其基因组掺入到宿主细胞的基因组中。
[0210] 载体类型的选择也取决于是否希望表达是稳定的或瞬时的。
[0211] 发明还提供遗传工程表达细胞用以表达细菌视紫红质，例如VIPs或PROPS。该细胞被工程化以瞬时地或稳定地表达VIP或PROPS。
[0212] 发明提供瞬时表达细胞与稳定表达细菌视紫红质的细胞和细胞系的生产方法。
[0213] 瞬时表达。本领域普通技术人员是能够工程化细胞的，所述细胞可被瞬时转染进而表达在此描述的VIPs或PROPS的细胞。用于核酸瞬时表达的转导和转化方法对于本领域技术人员是公知的。
[0215] VIP或PROP在真核细胞中的稳定表达。本领域普通技术人员是能够工程化细胞的，所述细胞稳定表达在此描述的VIPs或PROPS的细胞。这些方法也是基因工程中常规使用的。可在肝细胞基本方法中，由Lanza and Klimanskaya编辑，2008年出版，学术出版社（Essential Stem Cell Methods,edited by Lanza and Klimanskaya,published in2008,Academic Press），找到试验方案的例子。例如，人们可生产整合到基因组和包括可选择的标记物的病毒，，然后用该病毒感染细胞，筛选表达标记物的细胞，这些细胞就是将病毒掺合到他们的基因组中。例如，根据已建立的程序步骤，人们可在HEK细胞中生产具有嘌呤霉素可选择标记物的VSV-g假型病毒。一般而言，如果FACS分类是有必要的，可以使用干细胞特异性的启动子来编码GFP。hiPSC培养物在胚胎纤维母细胞(EF)饲养层或在补充EF的纤维母细胞生长因子条件培养基的基质胶中培养。细胞被胰消化酶离解为单个细5
胞的混悬液。该细胞可被平板培养，例如，以1x10细胞在预处理的组织培养6-孔板上，例如预处理是用基质胶预处理的。为了维持细胞的未分化状态，可以使用例如EF的条件培养
5 6
基。平板培养6小时后，可以加入病毒上清液到粘附的细胞中（每1x10细胞使用5x10 IU病毒)。加入6μg/mL硫酸精蛋白来增强病毒传染。细胞与病毒培养24小时；清洗，通常采用PBS进行，带有选择标记物的新鲜培养基，例如，1μg/mL嘌呤毒素。每隔2天用附加的嘌呤霉素取代培养基。1周后存活的细胞重新平板培养，例如，采用悬滴法生成基因稳定掺合的EBs。
胞的混悬液。该细胞可被平板培养，例如，以1x10细胞在预处理的组织培养6-孔板上，例如预处理是用基质胶预处理的。为了维持细胞的未分化状态，可以使用例如EF的条件培养
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基。平板培养6小时后，可以加入病毒上清液到粘附的细胞中（每1x10细胞使用5x10 IU病毒)。加入6μg/mL硫酸精蛋白来增强病毒传染。细胞与病毒培养24小时；清洗，通常采用PBS进行，带有选择标记物的新鲜培养基，例如，1μg/mL嘌呤毒素。每隔2天用附加的嘌呤霉素取代培养基。1周后存活的细胞重新平板培养，例如，采用悬滴法生成基因稳定掺合的EBs。
[0216] 在一些具体实施方式中，仅在生物体内的单个细胞型中表达光学电压传感器（例如，Arch3D94N）是有利的，并进一步，如果希望的话，把传感器直接表达在细胞内的特殊亚细胞结构。上游启动子控制基因表达的时间和地点。制造构建体优化在所有的真核细胞中表达。在一种具体实施方式中，光学电压传感器是受神经元特异性启动子控制的。
[0217] 选择启动子序列使蛋白表达限制在特殊类型细胞和环境条件上。常见的启动子序列包括，但不限于，CMV（细胞巨化病毒启动子，哺乳动物细胞的通用启动子），14x UAS-E1b（与反式作用子Ga14相组合，该启动子可以在一系列广泛的真核生物中对转基因表达进行组合控制。组织特异性表达可通过将Gal4放置于合适的启动子之下进行，然后采用Gal4驱动UAS控制的转基因。），HuC（驱动在斑马鱼和其他硬骨鱼中的全神经元（pan-neuronal）表达），ara（可以在细菌中用阿拉伯糖调控表达）和lac（可以在细菌中采用IPTG调控表达）。
[0218] 在一些具体实施方式中，光学电压传感器还包括定位序列或靶向序列以传感器朝向或安排到亚细胞细胞器或生物膜的特定的面。优选的定位序列提供高特异性的蛋白定位，其在其他亚细胞区室中最小的积累。将蛋白定向到亚细胞结构的定位序列举例见下面的表4。
[0219]
[0220]
[0221]
[0222] 定位信号的其他例子是有描述的，例如在，Stryer，L.和W.H.Freeman的生物化学（第4版）中35章（1995）的“蛋白靶向”（“Protein Targeting”,chapter35of Stryer,L.,Biochemistry(4th ed.).W.H.Freeman,1995），和Alberts等人的细胞分子生物学第12章(页码551-598)，第3版，(1994)，加兰出版公司（Chapter12(pages551-598)of Molecular Biology of the Cell,Alberts et al.third edition,(1994)Garland Publishing Inc.）。在一些具体实施方式中，多于一个分离定位基序通过细胞机器用于提供正确的定位安排。例如，通过采用N-末端信号序列和C-末端GPI锚着点或跨膜区，可以将蛋白精确定位安排到质膜的细胞外的一面。
[0223] 典型的是，定位序列几乎可位于蛋白的氨基酸序列的任何位置。在一些情况下，定位序列通过可变数量的氨基酸可被分裂为彼此分离的两块。通过标准重组DNA的方法制备该构建体在本领域是公知的。例如：描述在Maniatis等人的分子克隆实验手册，冷泉巷实验室，纽约，1989（Maniatis,et al.,Molecular Cloning A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,N.Y,1989)。
[0224] 靶向于质膜:在一些具体实施方式中，设计的构建体包括信号序列用来优化蛋白使其定位于质膜。这些可包括，例如，来自于β2烟碱乙酰胆碱受体
(MRGTPLLLVVSLFSLLQD(SEQ ID NO:17)，用一个字母氨基酸代码表示)的C-末端信号序列，和/或来自于Kir2.1，(FCYENEV)(SEQ ID NO:18)的内质网输出基序。
(MRGTPLLLVVSLFSLLQD(SEQ ID NO:17)，用一个字母氨基酸代码表示)的C-末端信号序列，和/或来自于Kir2.1，(FCYENEV)(SEQ ID NO:18)的内质网输出基序。
[0225] 原生质定位的附加改进可通过加入高尔基输出序 列(例如.源自 Kir2.1:RSRFVKKDGHCNVQFINV(SEQ ID NO:19)) 和 膜 定 位 序 列 ( 例 如，源 自Kir2.1:KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:20))(Gradinaru，V. 等 . 细 胞 (2010))(Gradinaru,V.et al.Cell(2010))获得。在一些具体实施方式中，选择靶向序列用于调控细胞内蛋白的传输使其达到预期的亚细胞结构。在一种具体实施方式中，蛋白靶向于真核细胞中的质膜。在这种情况下，靶向序列可按照下面的策略进行设计：Gradinaru等人的，“多元化和扩展光遗传学的分子和细胞方法”期刊：细胞第141卷，页码：154-165(2010年)（Molecular and Cellular Approaches for Diversifying and Extending Optogenetics,”Cell141,154-165(2010)）。术语“信号序列”指将蛋白靶向于亚细胞位置的N-末端区域，例如，内质网（ER），且因此通向质膜。在光遗传学电压传感器中使用的信号序列是源自于蛋白β2-n-乙酰胆碱受体(SS B2nAChR)和PPL的。此外，细菌视紫红质蛋白上有内源性信号序列可以被固定以用于适宜的亚细胞靶向作用。运输信号（TS）可以任意插入到细菌视紫红质的基因组C-末端和附属荧光蛋白N末端的。在一种具体实施方式中，像Gradinaru等人说明的那样运输信号是源自于Kir2.1蛋白。在另外的具体实施方式中，ER输出基序插入到附属荧光蛋白的C末端。
[0226] 靶向于线粒体:为了测定线粒体膜电位或研究线粒体，人们希望将PROPS定位于线粒体内膜或线粒体外膜，这种情况下，可在视紫红质蛋白加入适宜的信号序列。
[0227] 光遗传学电压传感器可以靶向于线粒体内膜。按照在例如A.Hoffmann，V.Hildebrandt，J.Heberle，和G.Büldt，“光活性线粒体：光驱动的质子泵体内转移到裂殖酵母属稷酒的线粒体内膜，”美国科学院院报，PNAS，页码：9367-9371(1994年 )（A.Hoffmann,V.Hildebrandt,J.Heberle,and G.Büldt,“Photoactive
mitochondria:in vivo transfer of a light-driven proton pump into the inner mitochondrial membrane of Schizosaccharomyces pombe,”Proc.Natl.Acad.Sci.USA91,PNAS9367-9371(1994)）中描述的方法就可以实现。
mitochondria:in vivo transfer of a light-driven proton pump into the inner mitochondrial membrane of Schizosaccharomyces pombe,”Proc.Natl.Acad.Sci.USA91,PNAS9367-9371(1994)）中描述的方法就可以实现。
[0228] 细胞
[0229] 根据发明所述有用细胞包括真核细胞和原核细胞。真核细胞包括非哺乳无脊椎动物细胞，例如酵母，植物，和线虫，与非哺乳脊椎动物例如鱼和鸟。细胞还包括哺乳动物细胞，包括人类细胞。细胞还包括无限增殖化的细胞系例如HEK，HeLa，CHO，3T3，它们在药物筛选方法应用中尤其有用。这些细胞还包括干细胞，多能细胞，祖细胞，和诱导多能细胞。分化的细胞包括从干细胞分化的细胞，还包括多能细胞和祖细胞。
[0230] 在一些具体实施方式中，细胞进行体外培养或离体培养。在一些具体实施方式中，细胞是部分的器官或生物体。
[0231] 在一些具体实施体重，细胞是“人工细胞”或生物工程学制造的“合成细胞”。(见，例如，通过化学合成基因组控制的细菌细胞的产生，作者：Daniel G.Gibson等人，期刊：科学2010年7月2日:第329卷，编码：5987页码：52-56；Cans，Ann-Sofie，Andes-Koback，Meghan，和Keating，Christine D.通过水细胞质模仿的微型组织在巨型小囊泡定位类脂膜区。美国化学会志，2008).(Creation of a Bacterial Cell Controlled by a Chemically Synthesized Genome，Daniel G.Gibson et al.，Science2July2010:Vol.329no.5987pp.52-56；Cans，Ann-Sofie，Andes-Koback，Meghan，and Keating，Christine D.Positioning Lipid Membrane Domains in Giant Vesicles by Micro-organization of Aqueous Cytoplasm Mimic.J.Am.Chem.Soc.，2008)。
[0232] 该方法也可应用于任何其他膜结合结构，其不一定是分类为细胞。这种膜结合结构可用于携带发明的细菌视紫红质蛋白，例如通过将携带发明的细菌视紫红质蛋白细胞膜碎片与该膜融合。
[0233] 细胞还包括斑马鱼心肌细胞；免疫细胞(除了下面注明的特定的细胞株，所有的初级鼠类和人类培养，与iPS衍生细胞株)，包括B细胞(例如，人类Raji细胞株，和DT40鸡细胞株)，T细胞(例如，人类Jurkat细胞株)，巨噬细胞，树突细胞，和中性白细胞(例如，HL-60株)。此外，可采用神经胶质细胞：星形细胞和少突胶质细胞；胰脏β细胞；肝细胞；非心肌细胞；内分泌细胞例如滤泡旁细胞和嗜铬细胞；和酵母细胞。细胞还包括神经细胞，例如神经元。
[0234] 细胞也可以是革兰阳性细菌或革兰阴性细菌，和任一革兰类型的病原性细菌。病原性细胞有助于该方法应用，例如，在筛选新的抗生素方面，所述新的抗生素是通过影响膜电位来加速细菌细胞毁灭的抗生素，或与影响膜电位的试剂组合来影响膜电位进而加速细菌细胞毁灭的抗生素，或在抑制抗生素外排的化合物研究方面。
[0235] 基本上任何细胞膜电位，或任何磷脂双层围成的结构的均可采用在此描述的方法和组合物进行测定。可测定的细胞例子是原代细胞，例如，原代肝细胞，原代神经细胞，原代成肌细胞，原代间质干细胞，原代祖细胞，或是已建立的细胞株细胞。细胞能够进行分裂可以是不必要的；在此描述的方法中可使用终末分化的细胞。在本文上下文中，细胞可以是任何类型的细胞，包括但不限于：上皮的，内皮的，神经的，脂肪的，心脏的，骨骼肌的，纤维母细胞，免疫细胞，肝脏的，脾的，肺的，循环的血细胞，生殖细胞，肠胃的，肾脏的，骨髓的和胰脏的细胞。细胞可以是细胞株，干细胞，或从任何组织分离的原代细胞，包括但不限于脑，肝，肺，肠，胃，脂肪，肌肉，睾丸，子宫，卵巢，皮肤，脾脏，内分泌器官和骨骼等。当细胞在体外条件下，和常规组织培养条件下培养，该方法可以使用，这对本领域技术人员来说是熟知。用于不同细胞的分离和培养方法是本领域的技术人员的常识。细胞可以是原核细胞，真核细胞，哺乳动物细胞或人类细胞。在一种具体实施方式中，细胞是神经元或其他脑细胞。在一些具体实施方式中，细胞是心肌细胞。在一些具体实施方式中，细胞从诱导多能细胞中分化得来的心肌细胞。
[0236] 参考值
[0237] 发明提供在表达编码细菌视紫红质蛋白的核酸的细胞中测定膜电位的方法，该方法包括如下步骤：（a）用至少一个波长的光激发至少一个包含细菌视紫红质蛋白编码核酸的细胞，与（b），检测来自至少一个细胞的至少一个光学信号，其中和参考相比，由至少一个细胞发射的荧光强度水平可指示细胞的膜电位。
[0238] 在此使用的术语“参考”是指本领域技术人员在该方法中可使用的任何类型的基线值。在一些具体实施方式中，参考是未暴露于能够改变或预期能够改变膜电位刺激的细胞。在一种具体实施方式中，参考是用细菌视紫红质转染的相同细胞但不同时间点观察到的。在另外的具体实施方式中，参考是可操作地与细菌视紫红质融合的的绿色荧光蛋白（GFP）同系物的荧光。
[0239] 检测修饰的细菌视紫红质的荧光
[0240] 在发明的方法中，光源激发细胞，以致发射可检测到的荧光。激发光的波长取决于荧光分子。例如，在实施例中的古细菌视紫红质构建体采用波长在λ=594nm和λ=645nm范围变化的光是可激发的。可以选择地，范围可以在λ=630-645nm之间。例如，经常使用的氦氖激光器发射在λ=632.8nm，可用于激发在这些分子的荧光发射。
[0241] 在一些具体实施方式中使用第二个光。例如，如果细胞表达参考荧光分子或用于测定细胞另一个特征的荧光分子，例如pH或钙浓度。这种情况下，第二波长是不同于第一波长。有用波长的例子包括在λ=447-594nm范围内的波长，例如，λ=473nm，λ=488nm，λ=514nm，λ=532nm，和λ=561nm。
[0242] VIPs最大优势的发挥所需要的硬件和软件取决于测定类型，这对于本领域技术人员基于在此提供的信息容易优化和选择的。目前的仪器容易使用或适应于VIPs和PROPs的检测。决定仪器类型的因素包括，精密度和准确度，速度，穿透深度，多路递送和通量。
[0243] 精密度与准确度:在确定检测系统中，人们应该估计是否需要电压的绝对或相对测量。膜电位的绝对测定是通常是采用两个激发波长或两个激发波长的比率完成的。单个细胞中的相对电压变化可采用单谱带激发和检测来执行。
[0244] 速度:为了测定神经元的动作电位，需要亚毫秒时间分辨率。这需要高速度的CCDs，或可扫描定制轨迹的高速共聚焦显微镜。缓慢的动力学和准稳态的电压可通过常规相机测定。这些测定可用在，例如，在针对心脏细胞筛选试剂的方法和测定中使用，例如心肌细胞。
[0245] 穿透深度:在深度组织中的成像可能需要共聚焦显微镜或侧板照明显微镜。可选地，深度成像可能需要非线性显微镜的发展，包括双光子荧光或倍频效应。常规的落射荧光显微镜成像对培养的细胞效果很好，且全内反射荧光（TIRF）在粘连细胞成像中提供特别高的信噪比。
[0246] 与其他光学成像和调控的多路递送：可以将VIPs成像与其他结构和功能的成像组合，例如pH，钙，或ATP。还可以将VIPs成像和膜电位的光遗传学控制进行组合，所述膜电位的光遗传学控制是例如采用通道视紫红质，嗜盐菌紫质，和古细菌视紫红质。如果光学测定和控制被结合于反馈回路中，其就可以启用所有的光学膜片箝来探测任何膜的动态电响应。
[0248] 细菌视紫红质中电压诱导位移的分光镜读出装置
[0249] 细菌视紫红质的分光镜状态一般按照他们的吸收光谱分类。然而，有些情况在单个细胞中的蛋白不足以仅通过吸光度检测光学移位。所有的下述光学成像技术均可用于探测其他状态依赖性的光谱性质。
[0250] a)荧光
[0251] 我们发现很多细菌视紫红质蛋白及其突变体产生可测定的荧光。例如，PROPS荧光采用500和650nm之间波长的光激发，发射的峰在710nm。在较长的激发波长下PROPS的光漂白作用速率下降，因此更好的激发波长光谱在红波段，近似633nm。这些波长与任何其他荧光蛋白的激发和发射波长相比距离红光更远，这是体内成像非常期待的特性。此外，PROPS的荧光显示可忽略的光漂白作用，与所有其他已知荧光完全相反。当在633nm激发时，在光漂白作用之前PROPS和GFP发射相当可观数量的光子。因此，细菌视紫红质构成了一类新的高度耐光、膜结合荧光标记物。
[0252] 由于只有质子化形式荧光，我们还发现PROPS的荧光对希夫碱基的质子化状态极其敏感。因此在质子化中电压诱导的变化导致荧光的变化。
[0253] 在一些具体实施方式中，PROPS荧光的检测是采用例如荧光显微镜，荧光分析仪，荧光激活细胞分类术（FACS）的荧光细胞分类等进行检测。
[0254] b)荧光共振能量转移(FRET)的光谱移动
[0255] FRET是在生物物理学和生物化学中，是有用的定量分子动力学工具，例如蛋白-蛋白相互作用，蛋白-DNA相互作用和蛋白构象变化。为了监测两个分子间的复合物的形成（例如，视黄醛和细菌视紫红质），他们中的一个用供体标记，另一个用受体标记，并将这些荧光标记的分子混合。当他们被分裂时，通过供体激发检测供体发射。另一方面，由于两分子的相互作用当供体和受体邻近时(1-10nm)，主要观察到受体发射，由于从供体到受体的分子间的FRET。
[0256] 附加于细菌视紫红质的荧光分子可将其激发能转移到视黄醛，但只有当视黄醛的吸收光谱与荧光基团发射光谱重叠时。视黄醛吸收光谱的变化导致荧光基团荧光亮度的改变。为了执行FRET光谱移动，荧光蛋白和细菌视紫红质电压传感器相融合，而监测蛋白的荧光。和直接荧光相比，这个方法的优点在于荧光蛋白的放射比视黄醛的更加明亮，但缺点在于较小分数变化的荧光的非直接读出装置。
[0257] 在一些具体实施方式中，在细菌视紫红质中的吸收光谱中的电压诱导变化是通过采用FRET的光谱移动检测的。
[0258] c)视紫红质光学光锁定成像(ROLI)
[0259] 很多视黄醛状态的吸收光谱被短暂脉冲光暂时改变。在ROLI，“泵”束的周期脉冲可传递到样品。第二“探针”束测定在某一波长下样品的吸光度，该波长下泵束光诱发了吸光度的巨大变化。因此，泵束在探针束的透射强度中表示了周期调节。这些周期性的强度的变化通过锁定成像系统检测。与常规的吸收成像相反，ROLI提供视黄醛特异性的对照。高频率的泵调节使其可以检测吸光度的微小变化。
[0260] 在一些具体实施方式中，PROPS的荧光采用细菌视紫红质锁定成像系统检测。
[0261] d)拉曼
[0262] 拉曼光谱是一种可以在系统中检测震动，转动和其他低频率震荡模式的技术。该技术依赖于单色光的非弹性散射（例如，可见光，近红外光或近紫外光）。单色光和分子震动，震动量子或系统中的其他刺激相互作用，导致激光光子的能量变化。能量的转移提供系统中有关震动量子模式的信息。
[0263] 已知在细菌视紫红质分子中的视黄醛有很强的共振拉曼信号。该信号依赖于生色团周围的静电环境，因此对电压是敏感。
[0264] 在一些具体实施方式中，在细菌视紫红质拉曼光谱中的电压诱导的变化通过拉曼显微镜进行检测。
[0265] e)二次谐波产生(SHG)
[0266] 二次谐波产生，在本领域也称为“倍频”，是非线性光学过程，在该过程中，与非线性物质相互作用的光子被有效“组合”进而形成具有两倍能量的光子，从而具有最初光量子两倍的频率，一半的波长。
[0267] 从细胞膜内的菌视紫质的定向薄膜上可观察到SHG信号。SHG是光学电压传感器视黄醛周围静电环境的有效探针。此外，SHG成像包括用穿透深入组织的红外光激发。因此，采用在此描述的光学传感器的SHG成像可用于三维光学电压传感。
[0268] 在一些具体实施方式中，采用SHG成像可检测到细菌视紫红质的倍频光谱中的电压诱导变化。
[0269] 具有产生光学信号部分的融合蛋白
[0270] 虽然响应电压变化时细菌视紫红质蛋白是自身有荧光性，在一些应用中，希望或有必要提高荧光水平或提供另外的光学信号（例如，比色信号）进而检测电压变化。而且，产生光学信号的部分可附属于细菌视紫红质来监测视紫红质蛋白的亚细胞定位。因此，在一些具体实施方式中，修饰细菌视紫红质蛋白还包括产生光学信号的部分，因此增强从修饰细菌视紫红质测得的光学信号或实施视紫红质蛋白的定位研究。
[0271] 例如，GFP家族或其同系物荧光蛋白基因可以任意附加或如权利要求书提到的“可操作地连接”于编码细菌视紫红质的核酸。在一种具体实施方式中，荧光蛋白的鉴定，其与电压传感复合物接头，和接头定位，是为了实现两个功能的其中之一而整个蛋白序列对进行选择：作为基因表达产物水平和分布的指示器；或者是作为电压的可选读出装置，独立于视黄醛的内源性荧光。
[0272] 例如，当荧光蛋白作为蛋白定位的指示器时，它可实现定量光学电压测定，所述定量光学电压测定是由细胞间的表达水平差异不能引起混乱。荧光蛋白和细菌视紫红质的荧光可以同时测定，且这两中信号比率提供了独立于浓度的膜电位测定。
[0273] 在一种具体实施方式中，细菌视紫红质蛋白是包括荧光蛋白的PROPS融合蛋白。例如，PROPS的N末端与荧光蛋白Venus融合。该蛋白提供稳定的参考，该参考通过细胞内PROPS定位指示，且可以进行Venus和PROPS荧光的比率成像。因为这技术对细胞内蛋白总量不敏感，比率成像使膜电位的定量测定成为可能。其他荧光蛋白可用于代替Venus而具有类似效果。在一些具体实施方式中，荧光多肽选自如下组中：GFP，YFP，EGFP，EYFP，EBFB，DsRed，RFP及其荧光变异体
[0274] 在一种具体实施方式中，细菌视紫红质是古细菌视紫红质融合或可操作地连接于附加荧光蛋白，例如GFP或其同系物。
[0275] 生色团
[0276] 在自然环境下，细菌视紫红质包括作为光学活性元素的视黄醛的结合分子。这些蛋白也结合和折叠在很多其他有相似结构的，可能的较好光学性质的生色团周围。具有锁定环的视黄醛类似物不能进行顺-反异构化，因此具有较高的荧光量子产量(Brack，T.等.生物物理学杂志，第65卷，页码：964-972(1993年))(Brack，T.et al.Biophys.J.65，964-972(1993))。具有吸电子取代基的视黄醛类似物具有的希夫碱基其具有比天然视黄醛更低pKa的，因此可能对电压更敏感。(Sheves，M.，等.美国国家科学院院报.第83卷，页码：3262-3266(1986)；Rousso，I.，等.生物化学，第34卷， 页 码：12059-12065(1995)).(Sheves，M.，et al.Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.83，
3262-3266(1986)；Rousso，I.，et al.Biochemistry34，12059-12065(1995)).视黄醛分子的共价键改性可能导致光学电压传感器具有显著提高的光学特征和电压灵敏度。
3262-3266(1986)；Rousso，I.，et al.Biochemistry34，12059-12065(1995)).视黄醛分子的共价键改性可能导致光学电压传感器具有显著提高的光学特征和电压灵敏度。
[0277] 在此描述的方法和组合物的优势
[0278] 光学电压传感器的关键品质因素是其响应速度和其灵敏度（每100mV膜电位变化时荧光的变化分数）。图10比较了以前使用基于蛋白的荧光电压指示器和在此关注的那些指示器的这些属性。附加重要的属性包括：将指示器靶向于特定细胞或亚细胞结构的能力，耐光性和低光毒性。
[0279] 前期基于蛋白的工作集中于将一个或多个荧光蛋白融合到跨膜电压传感区域。电压变化诱导了在电压传感区域中的构象变化，其移动荧光蛋白且改变他们的荧光。多重大型蛋白区构象转换的依赖性使这些方法不可避免的变缓慢。另外，大多数电压传感区域的构象转换是微小的，导致荧光的小的变化。
[0280] 来自VSFP2.x家族的最敏感指示器在每100mV的荧光变化为ΔF/F=10%。VSFP2.x蛋白响应在大约100毫秒，太慢而不能检测神经元中1ms的动作电位。(Perron，A.等.内分泌分子神经科学.第2卷(2009)；Mutoh，H.等.公共科学图书馆-综合，第4卷，页码：e4555(2009))(Perron，A.et al.Front Mol Neurosci.2(2009)；Mutoh，H.et al.PLoS One4，e4555(2009)).电压传感器的SPARC家族有1ms的响应时间，但显示每100mV的荧光变化<1%。(Baker，B.J.等.神经科学方法杂志。第161卷，页码：32-38(2007)；Ataka，K.和Pieribone，V.A.生物物理学杂志.第82卷，页码：509-516(2002))(Baker，B.J.et al.J.Neurosci.Methods161，32-38(2007)；Ataka，K.&Pieribone，V.A.Biophys.J.82，509-516(2002))。在此描述的本研究之前，二十年的荧光电压传感器研究尚未得出可以表示体内个体神经动作电位的蛋白。
[0281] 科学家已开发了显示电压敏感的荧光的有机小分子染料。这些亲脂分子掺入到细胞膜，在该处电压导致构象转换或电子能级跃迁，和因此导致的光学性质的变化。这些分子响应迅速（一般小于1ms），灵敏度高达每100mV34%，但是不能定向，常难以传输，且毒性较大。(Krauthamer，V.，等.荧光杂志，第1卷，页码：207-213(1991)；Fromherz，P.，等。欧洲生物物理学杂志.第37卷，页码：509-514(2008)；Sjulson，L.和Miesenbock，G.神经科学杂志.第28卷，页码：5582(2008))，见例如美国专利，专利号：7867282，6107066和 5661035).(Krauthamer，V.，et al.J.Fluoresc.1，207-213(1991)；Fromherz，P.，et al.Eur.Biophys.J.37，509-514(2008)；Sjulson，L.&Miesenbock，G.J.Neurosci.28，
5582(2008))，see e.g.US Patent Nos.7，867，282，6，107，066，and5，661，035)。这些光学电压传感器中，无一使用配置“向后”运行的细菌视紫红质蛋白，该蛋白使膜电位变化转换为光学可测的信号的变化。
5582(2008))，see e.g.US Patent Nos.7，867，282，6，107，066，and5，661，035)。这些光学电压传感器中，无一使用配置“向后”运行的细菌视紫红质蛋白，该蛋白使膜电位变化转换为光学可测的信号的变化。
[0282] 在此描述的光学电压传感器方法是不同于前期努力的方向的。如在此所述，使用的蛋白在自然环境下有强的光电耦合。在自然环境下的细菌视紫红质将太阳光转换为膜电位。在此描述的光学电压传感器利用其逆转方面的作用，将膜电位转换为容易检测的光学信号。如图12所示，就关键品质因素而言，典型的细菌视紫红质电压传感器(PROPS，Arch3WT，Arch3D95N)胜过其他基于蛋白的指示器。
[0283] 光学传感器递送介导的膜融合
[0284] 膜融合反应在真核细胞中是普遍的。膜通过如下过程进行细胞内融合，包括：内吞作用，细胞器形成，细胞器间运输，与构成的和调节的胞吐作用。细胞间的，膜融合发生在精子卵融合和肌原细胞融合。
[0285] 膜融合已通过使用脂质体进行人工诱导，其中的细胞膜和脂质体膜融合，还通过不同化学试剂，诱导细胞-细胞融合进而产生异核体。显示诱导生物膜融合的自然存在的蛋白主要是包膜病毒的融合蛋白。因此，在一些具体实施方式中，光学传感器采用包括促融合蛋白的脂质体。
[0286] 普遍认为在生理条件下的膜融合是蛋白介导的。这已致使了包括促进融合蛋白(质蛋白体)的毒性下降的脂质体的开发。(见，例如，Cheng，Hum.基因疗法.第7卷，页码:275-282(1996)；Hara等，基因，第159卷，页码:167-174(1995)；和Findeis等，生物工程进展，第11卷，页码:202-205(1993))(Cheng，Hum.Gene Ther.7:275-282(1996)；Hara et al.，Gene159:167-174(1995)；and Findeis et al.，Trends Biotechnol.，
11:202-205(1993))。
11:202-205(1993))。
[0287] 最终显示诱导生物膜细胞间融合的唯一蛋白是那些包膜病毒和源自无包膜病毒的两个蛋白。所有的膜病毒编码蛋白，是融合病毒外膜和细胞膜的结果。这些病毒融合蛋白对于易感细胞的感染是必要的。来自包膜病毒的融合蛋白的作用机制已成为蛋白介导的膜融合的范例。(见，例如，White，生理学年鉴，第52卷，页码:675-697(1990)；和White，科学，第258卷，页码:917-924(1992)).(White，Ann.Rev.Physiol.，52:675-697(1990)；and White，Science，258:917-924(1992)).
[0288] 大多数包膜病毒融合蛋白是相对大的，多聚体的，I型膜蛋白，以流行性感冒病毒HA蛋白为代表的，低pH活化的融合蛋白，和在中性pH发挥作用的仙台病毒F蛋白。这些是病毒的结构性蛋白，其具有定向在在病毒体外表面具有多数融合蛋白，进而促进了在病毒颗粒和细胞膜之间的相互作用。
[0289] 根据来自包膜病毒的融合蛋白作用机制，病毒膜和细胞膜的融合由两性α螺旋区域介导，即指存在于病毒融合蛋白的融合肽基序。这种类型融合肽基序一般是17到28残基长，疏水的（平均疏水性约为0.6±0.1），且包括高含量的甘氨酸和丙氨酸，一般为36%±7%。(White，生理学年鉴，第52卷，页码:675-697(1990年)(White，Annu.Rev.Physiol.，52:675-697(1990).
[0290] 所有的包膜病毒融合蛋白被认为是通过大量的构象变化发挥作用，通过利用能量克服热力学屏障，促进膜融合。这些构象变化通过形成卷曲螺旋结构的七个重复区域频繁地介导。(见Skehel和Wiley，细胞，第95卷，页码：871-874(1998))(Skehel and Wiley，Cell，95:871-874(1998)).识别在触发膜融合中的重要的融合肽基序已导致使用包括融合肽基序的小肽，进而提高脂质体-细胞的融合(见，例如，Muga等，生物化学，第33卷，页码:4444-4448(1994))(see，for example，Muga et al.，Biochemistry33:4444-4448(1994))。
[0291] 包膜病毒融合蛋白也触发细胞-细胞融合，导致多核体的形成（合胞体）。在感染细胞内的病毒融合蛋白的合成导致融合蛋白通过内质网和高尔基传输系统到细胞膜的传输，是感染细胞的传染性子病毒颗粒的组装和出芽中的必要步骤(Petterson，微生物和免疫学的当代课题，第170卷，页码：67-106(1991)).(Petterson，Curr.Top.Micro.Immunol.，170:67-106(1991))。融合蛋白的合成，运输和折叠是由多个成分促进，包括用以使蛋白靶向于细胞间的传输途径的信号肽，用以N连接的糖类附加于蛋白的糖基化信号，和使蛋白锚定在细胞膜内的跨膜区。这些蛋白已用于重建的脂蛋白体(‘病毒小体’)，以增强在细胞培养和体内的蛋白介导的脂质体细胞融合。(见，例如，Ramani等，欧洲生物化学学会联盟通讯，第404卷，页码:164-168(1997)；Scheule等，美国呼吸系统细胞和分子生物学杂质，第13卷，页码:330-343(1995)；和Grimaldi，病毒学研究，第146卷，页码:289-293(1995))(see，for example，Ramani et al.，FEBS Lett.，404:164-168(1997)；Scheule et al.，Am.J.Respir.Cell Mol.Biol.，13:330-343(1995)；and Grimaldi，Res.Virol.，146:289-293(1995))。
[0292] 因此，在一些在此描述的方法和组合物的具体实施方式中，给予细胞或受试者包括修饰细菌视紫红质和融合蛋白的胶粒，脂质体或其他的人工膜，进而通过膜融合介导光学传感器蛋白递送到达细胞。在优选的具体实施方式中，组合物还包括靶向序列使递送系统靶向于特定细胞型。必要时，人工膜组合物的外源性类脂还包括靶向基序（例如，配基），该基序结合于哺乳动物细胞以利于进入。例如，该组合物可包括作为配基的结合于哺乳动物外源凝集素的无唾液酸糖蛋蛋白（例如，肝脏无唾液酸糖蛋白受体），帮助进入哺乳动物细胞。可靶向于特定细胞表面标记物的单链抗体在此也考虑用作靶向基序。靶向部分可包括，例如，药物，受体，抗体，抗体碎片，适体，肽，维生素，糖类，蛋白，黏附分子，糖蛋白，糖残基或氨基葡聚糖，治疗试剂，药物或这些的组合。根据采用在此描述的光学感受器评估的预期靶细胞，技术人员可轻易设计各种修饰人工膜的靶向部分。
[0293] 对于采用递送介导的膜融合方法，考虑使用的光学传感器在异源表达系统中表达和制造。为了用于多种细胞型或种属，可制作不同表达载体，该载体包括编码光学传感器的核酸，或包括如在此描述的用于表达光学传感器的衍生物。为了在预期细胞中有效基因转录和翻译，表达载体应有必需的5’上游和3’下游的调控元件，例如启动子序列，核蛋白体识别和结合TATA框，和3’UTR AAUAAA转录终止序列。在一些具体实施方式中，光学传感器在外源表达系统中生成然后纯化，以生产脂质介导的传输试剂与预期细胞型融合。在这样的具体实施方式中，表达载体可有附加的序列如6X-组氨酸(SEQ ID NO:21)，V5，硫氧还蛋白，谷胱甘肽-S-转移酶，c-Myc，VSV-G，HSV，FLAG，麦芽糖结合肽，金属结合肽，HA和“分泌物"信号肽(例如，蜜蜂蜂毒肽Pho，BiP)，这些被掺合到表达重组光学传感器中以便于纯化。此外，在这些序列后面可有掺合的酶消化位点，在附加序列不需要以后，便于附加序列的酶排除。这些附加序列在光学传感表达的检测是有用的，用于亲和力色谱的蛋白纯化，以提高重组蛋白在宿主细胞质中的溶解度，用于更好的蛋白特别是小肽的表达，和/或用于排泄出表达的重组蛋白进入培养基，进入到原核细菌的周质或酵母细胞的原生质球。重组光学传感器的表达可在宿主细胞中构成或可被诱导，例如采用硫酸铜，糖，例如半乳糖，甲醇，甲胺，硫胺素，四环素，杆状病毒感染，和（异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷)IPTG，稳定的人造乳糖类似物，取决于选择的宿主和载体系统的。
[0294] 其他表达载体和宿主细胞的例子是pET载体(Novagen)，pGEX载体(Amersham Pharmacia)，和pMAL载体(纽英伦技术有限公司)(New England labs.Inc.)用于在大肠杆菌宿主细胞中的蛋白表达，例如BL21，BL21(DE3)和AD494(DE3)pLysS，Rosetta(DE3)和Origami(DE3)(Novagen)；基于CMV强启动子的pcDNA3.1(Invitrogen)和pCIneo载体(Promega)用以在哺乳动物细胞系中表达，例如在CHO，COS，HEK-293，Jurkat和MCF-7；机能不全的腺病毒载体的复制载体pAdeno X，pAd5F35，pLP-Adeno-X-CMV(Clontech)，pAd/CMV/V5-DEST，pAd-DEST载体(Invitrogen)用以在哺乳动物细胞中腺病毒介导的基因转TM移和表达；pLNCX2，pLXSN和pLAPSN逆转录病毒载体与来自Clontech的Retro-X 系统应TM
用，用以在哺乳动物细胞中逆转录介导的基因转移和表达；pLenti4/V5-DEST ，pLenti6/TM
V5-DEST ，和pLenti6.2/V5-GW/lacZ(Invitrogen)用以在哺乳动物细胞中慢病毒介导的基因转移和表达；腺伴随病毒表达载体如pAAV-MCS，pAAV-IRES-hrGFP，和pAAV-RC载体(Stratagene)用以在哺乳动物细胞中腺伴随病毒介导的基因转移和表达；BACpak6杆状病TM
毒(Clontech)和pFastBac HT(Invitrogen)用以在草地夜蛾（Spodopera frugiperda9）(Sf9)和Sf11昆虫细胞株中表达；pMT/BiP/V5-His(Invitrogen)用以在旋乃德果蝇S2（Drosophila Schneider S2）细胞中表达；毕赤酵母属表达载体pPICZα，pPICZ，pFLDα和pFLD(Invitrogen)用以在毕赤酵母（Pichia pastoris）和载体中表达，pMETα和pMET用以在甲醇赤酵母中表达；pYES2/GS和pYD1(Invitrogen)载体用以在酿酒酵母中表达。在莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）中的大规模表达异源蛋白的最新进展由Griesbeck C等人描述在2006分子生物技术，第34卷，页码:213-33和Fuhrmann M.2004，分子医学方法，第94卷，页码:191-5（2006Mol.Biotechnol.34:213-33and Fuhrmann M.2004，Methods Mol Med.94:191-5.）。通过同源重组的方法将外来的异源编码序列插入到细胞核，叶绿体和线粒体基因组中。叶绿体表达载体p64可用于在叶绿体中表达外源蛋白，该叶绿体表达载体p64携带多能叶绿体可选择的标记物氨基糖苷类腺嘌呤转移酶(aadA)，其可以抗大观霉素或链霉素。生物发射基因枪方法可用于将载体引入到藻类。一旦它进入叶绿体，就从基因枪颗粒中释放外源性DNA，并通过同源重组整合到叶绿体基因组。
用，用以在哺乳动物细胞中逆转录介导的基因转移和表达；pLenti4/V5-DEST ，pLenti6/TM
V5-DEST ，和pLenti6.2/V5-GW/lacZ(Invitrogen)用以在哺乳动物细胞中慢病毒介导的基因转移和表达；腺伴随病毒表达载体如pAAV-MCS，pAAV-IRES-hrGFP，和pAAV-RC载体(Stratagene)用以在哺乳动物细胞中腺伴随病毒介导的基因转移和表达；BACpak6杆状病TM
毒(Clontech)和pFastBac HT(Invitrogen)用以在草地夜蛾（Spodopera frugiperda9）(Sf9)和Sf11昆虫细胞株中表达；pMT/BiP/V5-His(Invitrogen)用以在旋乃德果蝇S2（Drosophila Schneider S2）细胞中表达；毕赤酵母属表达载体pPICZα，pPICZ，pFLDα和pFLD(Invitrogen)用以在毕赤酵母（Pichia pastoris）和载体中表达，pMETα和pMET用以在甲醇赤酵母中表达；pYES2/GS和pYD1(Invitrogen)载体用以在酿酒酵母中表达。在莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）中的大规模表达异源蛋白的最新进展由Griesbeck C等人描述在2006分子生物技术，第34卷，页码:213-33和Fuhrmann M.2004，分子医学方法，第94卷，页码:191-5（2006Mol.Biotechnol.34:213-33and Fuhrmann M.2004，Methods Mol Med.94:191-5.）。通过同源重组的方法将外来的异源编码序列插入到细胞核，叶绿体和线粒体基因组中。叶绿体表达载体p64可用于在叶绿体中表达外源蛋白，该叶绿体表达载体p64携带多能叶绿体可选择的标记物氨基糖苷类腺嘌呤转移酶(aadA)，其可以抗大观霉素或链霉素。生物发射基因枪方法可用于将载体引入到藻类。一旦它进入叶绿体，就从基因枪颗粒中释放外源性DNA，并通过同源重组整合到叶绿体基因组。
[0295] 无细胞表达系统也给予关注。无细胞表达系统提供很多优于基于传统细胞表达方法的优势，包括支持蛋白折叠的反应条件修饰容易，对产物毒性的灵敏度降低，和适合于高通量策略，例如快速表达筛选或生产大量蛋白，归因于反应时间和反应体积的降低。无细胞表达系统可使用质粒或线状DNA。并且，翻译效率的提高使产量为每1毫升反应混合液大于1毫克蛋白。能够高产量生产蛋白的无细胞翻译系统的例子在Spirin AS.等，科学杂志，第
242卷，页码:1162(1988)中做了描述（AS.et.al.，Science242:1162(1988)）。该方法使用了缓冲液加液的恒流设计以遍及反应混合液和翻译的多肽产品的连续除去，其中恒流缓冲液包括的氨基酸，三磷酸腺苷(ATP)，和鸟苷三磷酸(GTP)。该系统使用大肠杆菌溶胞产物以提供无细胞的连续性加液缓冲液。连续流动系统是与真核和原核表达载体均可兼容。作为例子，膜本体蛋白EmrE多药物运载体的大规模无细胞生产在Chang G.等，科学，第310卷，页码:1950-3(2005)中有所描述（Chang G.el.al.，Science310:1950-3(2005)）。其他TM
商品化的可用的无细胞表达系统包括Expressway 无细胞表达系统(Invitrogen)，其利用基于大肠杆菌的体外系统，进行有效的，耦合的转录和翻译反应进而在试管反应容量中生产出多达毫克量的活性重组蛋白；快速翻译系统(RTS)(Roche Applied Science)也采用基于大肠杆菌的体外系统；且TNT偶联网织红细胞裂解物系统(Promega)采用基于家兔的网状细胞的体外系统。
242卷，页码:1162(1988)中做了描述（AS.et.al.，Science242:1162(1988)）。该方法使用了缓冲液加液的恒流设计以遍及反应混合液和翻译的多肽产品的连续除去，其中恒流缓冲液包括的氨基酸，三磷酸腺苷(ATP)，和鸟苷三磷酸(GTP)。该系统使用大肠杆菌溶胞产物以提供无细胞的连续性加液缓冲液。连续流动系统是与真核和原核表达载体均可兼容。作为例子，膜本体蛋白EmrE多药物运载体的大规模无细胞生产在Chang G.等，科学，第310卷，页码:1950-3(2005)中有所描述（Chang G.el.al.，Science310:1950-3(2005)）。其他TM
商品化的可用的无细胞表达系统包括Expressway 无细胞表达系统(Invitrogen)，其利用基于大肠杆菌的体外系统，进行有效的，耦合的转录和翻译反应进而在试管反应容量中生产出多达毫克量的活性重组蛋白；快速翻译系统(RTS)(Roche Applied Science)也采用基于大肠杆菌的体外系统；且TNT偶联网织红细胞裂解物系统(Promega)采用基于家兔的网状细胞的体外系统。
[0296] 光学电压传感器的应用
[0297] 在此提供的领域中，改进的光学电压指示器可用于商业和科研事业。
[0298] 药物筛选
[0299] 最新文献报道“在销售前100的药物中，15个是总市场值大于$150亿的离子通道调节器，其总市场值大于$150亿”(Molokanova，E.和Savchenko，A.，当日药物发现，第13卷，页码：14-22(2008))(Molokanova，E.&Savchenko，A.Drug Discov.Today13，14-22(2008))。然而，由于缺乏好的膜电位指示器，对于新型离子通道调节器的研究受到限制。(Przybylo，M.，等，荧光杂志，页码：1-19(2010))(Przybylo，M.，et al.J.Fluoresc.，
1-19(2010)).在一些具体实施方式中，在此描述的光学传感器用于测定或监控响应于候选离子通道调节剂的膜电位变化。这种筛选方法可通过同时筛选细胞内多个候选离子通道调节剂而实现高通量模式。
1-19(2010)).在一些具体实施方式中，在此描述的光学传感器用于测定或监控响应于候选离子通道调节剂的膜电位变化。这种筛选方法可通过同时筛选细胞内多个候选离子通道调节剂而实现高通量模式。
[0300] 干细胞
[0301] 神经系统和心脏中的很多遗传疾病缺乏好的动物模型。在一些具体实施方式中，在此描述的光学传感器在干细胞，诱导多能细胞或从脐带血或羊水分离的干细胞，或已知携带或侵袭有遗传缺陷源于人类或胎儿的胚胎干细胞中表达。在一些具体实施方式中，胚胎干细胞是非人类起源的。可选地，光学传感器在干细胞子代中表达，祖细胞，或是分化细胞，例如心脏或神经细胞。电压指示器的在这些细胞型中的表达提供有关这些细胞的电生理学和膜电位对候选试剂或周围环境变化的响应信息(例如，缺氧)。此外，电压指示器在干细胞中的表达使干细胞分化和发展为电活性的细胞型和组织的研究得以开展。
[0302] 遗传缺陷可能是单个基因改变，或缺失，插入，复制或重排或一个或多个核酸，包括大型的染色体改变。
[0303] 根据本领域技术人员熟知的方法，干细胞可被分离和处理。描述制作和使用方法的专利，例如，灵长类胚胎干细胞在，如美国专利号：7,582,479；6,887,706；6,613,568；6,280,718；6,200,806；和5,843,780中描述。此外，例如源于的人类脐带血衍生的非限制性体细胞干细胞在美国专利7,560,280中描述，来自人类脐带血的华顿氏胶祖细胞在美国专利7,547,546中描述。
[0304] 诱导多能干细胞可通过下述描述的方法生产，例如通过美国专利申请公开号20110200568和欧洲专利申请公开号01970446和美国专利申请公开号US2008/0233610中描述的方法生产。其他生产和使用诱导多能干细胞的方法在美国专利申请10/032,191，题目“采用改编的供体染色质或供体细胞克隆哺乳动物的方法”和10/910，156，题目“改变细胞命运的方法”中有所描述。这些专利申请与改变细胞状态的技术相联系，例如人类皮肤细胞，通过将细胞DNA暴露于另外的具有不同属性的重编程细胞中的细胞质。在制备诱导多能干细胞中使用重编程因素包括OCT4，SOX2，NANOG，cMYC，LIN28基因表达的详细描述，可在例如PCT/US2006/030632中找到。
[0305] 分化干细胞或多能细胞使之成为分化的细胞的方法是本领域普通技术人员公知的。
[0306] 脑成像
[0307] 人类大脑通过在其1011神经元中传递电脉冲发挥作用。这些放电模式是每个人类思想和动作的起因。但目前没有很好的方法观察在未受损的大脑中大规模模式的电活动性。(Baker，B.J.等，神经科学方法，第161卷，页码：32-38(2007)；Baker，B.J.等.脑细胞生物学，第36卷，页码：53-67(2008)).(Baker，B.J.et al.J.Neurosci.Methods161，32-38(2007)；Baker，B.J.et al.Brain Cell Biology36，53-67(2008)).
[0309] 神经活动的光学成像也可形成为带有残疾的人的改进大脑-机器界面的基础。对于在大脑中的成像，通过将光学传感器直接注射到待测位点（带有或不带有附随的电穿孔）或采用病毒载体递送光学传感器。可选地，也可能通过转基因生物体，或通过应用Cre-Lox重组系统给予光学传感器。
[0310] 微生物学
[0311] 细菌是很多未知功能的离子通道的宿主(Martinac，B.，等.生理学评论，第88卷，页码：1449(2008))(Martinac，B.，et al.Physiol.Rev.88，1449(2008))。大多数细菌太小而不能直接电生理测定，因此它们电学特征几乎是完全未知的。
[0312] 一旦在大肠杆菌中表达PROPS，我们发现大肠杆菌进行先前未知的电脉冲行为。在实施例部分描述的数据是对任何细菌中的自发电脉冲的首次报道。这个结果确立了电压传感器在微生物的有用性。
[0313] 此外，我们发现在大肠杆菌中的电子脉冲与阳离子膜可渗透的染料外流物耦合。因此电子脉冲和其他阳离子物质，包括抗生素，相互关联是合理的。光学电压指示器证明在筛选抗生素外流抑制剂方面是有用的.
[0314] 光学电压传感器会开启成千上万个微生物种属的电生理学，这些微生物已被证实太小而不能通过传统的电生理学探测。该信息有助于理解细菌生理学在医学，工业和生态的应用。
[0315] 线粒体和新陈代谢疾病
[0316] 线粒体是膜围成的细胞器，在真核细胞中作为ATP工厂。膜电压为线粒体ATP合酶提供能量。线粒体的机能障碍已经涉及多种神经变性疾病，糖尿病，癌症，心血管疾病和衰老。因此对测定体内线粒体膜电位也很大兴趣，但是目前可用的技术却非常有限。(Verburg，J.和Hollenbeck，P.J.神经科学杂志，第28卷，页码：8306(2008)；Ichas，F.，等，细胞，第89卷，页码：1145-1154(1997)；Johnson，L.V.，等。美国科学院院刊，第
77 卷，页 码：990(1980)).(Verburg，J.&Hollenbeck，P.J.J.Neurosci.28，8306(2008)；
Ichas，F.，et al.Cell89，1145-1154(1997)；Johnson，L.V.，et al.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.77，990(1980)).
77 卷，页 码：990(1980)).(Verburg，J.&Hollenbeck，P.J.J.Neurosci.28，8306(2008)；
Ichas，F.，et al.Cell89，1145-1154(1997)；Johnson，L.V.，et al.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.77，990(1980)).
[0317] 在此描述的光学电压传感器(PROPS)的例子可用肽序列标记(Hoffmann，A.，等.美国科学院院刊，第91卷，页码：9367(1994))(Hoffmann，A.，et al.Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.91，9367(1994).)，该序列指向于线粒体内膜或线粒体外膜，在此处它作为线粒体膜电位的光学指示器发挥作用。
[0318] 在人类细胞和脊椎动物模型中成像(例如，大鼠，小鼠，斑马鱼)
[0319] 如在实施例2中所述，我们也在HEK293T细胞中表达了Arch3。在HEK293T细胞中Arch3的荧光在倒置荧光显微镜中容易成像，显微镜具有红外照射(λ=640nm，I=540W/cm2)，高数值孔径物镜，Cy5滤光镜套件和EMCCD相机。细胞展示的荧光主要定位于质膜(图.6C)。不表达Arch3的细胞不具有荧光性。细胞在连续10分钟曝光下显示17%光漂白作用，且在此间隔保持正常的形态学。
[0320] 如通过整个细胞电压箝所测，表达Arch3的HEK细胞的荧光对膜电位非常敏感。我们开发了一套规则系统已在加权和中结合像素强度，其输出的结果是对采用常规电生理学测定的膜电位的最佳估计。图6C显示像素-权重矩阵的例子，其指示电压敏感的蛋白定位于细胞膜，细胞内的Arch3产生荧光，但没有电压依赖性信号。在-150mV和+150mV之间荧光通过因子2增加，在整个范围响应接近线性(图6D)。在上升和下降边缘，膜电位每一步的荧光响应发生在我们成像系统的500μs时间分辨率内(图6E)。正弦式变化的膜电位的应用导致正弦式变化的荧光；在f=1kHz，荧光摆动保持其低频率振幅的55%(图18)。Arch31/2
报告电压阶梯小到10mV，在时间量程<12s准确度为625μV/(Hz) (图19)。
报告电压阶梯小到10mV，在时间量程<12s准确度为625μV/(Hz) (图19)。
[0321] 采用病毒递送，我们测定了Arch3在培养的大鼠海马神经元中作为电压指示器。表达Arch3的神经元显示定位于细胞膜的荧光的电压依赖性变化。在整个细胞电流箝下，给予细胞注射200pA的电流脉冲，细胞显示脉冲。个别脉冲伴有清晰的可辨认的荧光增加(图7A)。在2kHz图像采集速率下，荧光(脉冲振幅:基线噪音)的信噪比是10.5。发现脉冲的规则系统正确的鉴定了99.6%的脉冲（基于和同时记录的膜电位相比）(图7B)，其中假阳性率为0.7%(n=269脉冲)。观察累计曝光4分钟的单个细胞，没有检测到在静息电位或脉冲频率的变化。
[0322] 在亚细胞分辨率下通过平均单个脉冲的多个瞬时记录的胶片，我们将动作电位动力学成像(图7C)。在体细胞中和体细胞附近，光学测定的动作电位波形是一致的，且与电记录的波形相匹配。然而，在很窄的动作电位峰中，延迟达1ms(图7D)。这些观察结果和多个箝在单个神经元中的记录一致(Stuart，G.J.和Sakmann，B.体细胞动作电位到大脑神经锥体细胞细胞树突的有效繁殖，自然，第367卷，页码：69-72(1994))；(Stuart，G.J.&Sakmann，B.Active propagation of somatic action potentials into neocortical pyramidal cell dendrites.Nature367，69-72(1994))；但是该记录是需要技术的，且仅探测膜电位在少数点上的变化。我们显示Arch3可用于描绘动作电位的细胞内动力学。类似的，希望其他古细菌视紫红质可作为膜电位指示器在真核细胞中发挥作用。
[0323] 因此，利用Arch3模型系统，我们显示通过古细菌视紫红质和修饰的古细菌视紫红质可检测哺乳动物膜电位。
[0324] 基因递送方法
[0325] 采用常规的基因递送方法，将编码发明的细菌视紫红质蛋白的核酸引入细胞或器官或感兴趣的生物体。为了受试者细胞膜电位变化的成像，将其给予受试者。在一种具体实施方式中，光学传感器通过表达载体引入细胞。
[0326] 目前应用于干细胞工程的不同基因递送方法包括病毒和非病毒载体，和生物或化学转染方法。这些方法在使用的系统中可产生稳定的或瞬时的基因表达。
[0327] 病毒基因递送系统
[0328] 由于转染的高效率，遗传修饰病毒已被广泛应用于基因到干细胞的递送。
[0329] DNA病毒载体
[0330] (i)腺病毒
[0331] 腺病毒是双链的，非包膜的和包括36kb病毒基因组的十二面体病毒(Kojaoghlanian等，2003)(Kojaoghlanian et al.,2003)。根据他们的表达是发生在DNA复制之前还是之后，他们的基因被分为早期(E1A，E1B，E2，E3，E4)，和延迟型(IX，IVa2)和主要晚期(L1，L2，L3，L4，L5)基因。描述了可在很宽范围的器官上传染和复制的多于51种人类腺病毒血清型。该病毒分为如下亚组：A—包括高频率和短潜伏期的肿瘤，B—致癌微弱的，和C—不形成肿瘤的(Cao等，2004；Kojaoghlanian等，2003)(Cao et al.，2004；
Kojaoghlanian et al.，2003)。
Kojaoghlanian et al.，2003)。
[0332] 这些病毒用于产生一系列用于基因转移细胞工程的载体。通过去除产生有4kb克隆能力的载体的E1基因(病毒复制所需的)生产病毒载体的初始代。E3(对宿主免疫反应相关)附加的去除使其具有8kb的克隆能力(Bett等，1994；Danthinne和Imperiale，2000；Danthinne 和 Werth，2000)(Bett et al.，1994；Danthinne and Imperiale，2000；
Danthinne and Werth，2000)。载体的第二代通过去除E2区(病毒复制所需的)和/或E4区(参与宿主细胞凋亡抑制)并结合E1或E3删除。该得到的载体有10-13kb的克隆能力(Armentano等，1995)。通过删除除了末端反向重复(ITRs)和顺式作用包装信号的整个病毒序列生产第三代"易消化的"载体。这些载体有25kb的克隆能力(Kochanek等，2001)且在休眠细胞和分裂细胞中保留高转染率。
Danthinne and Werth，2000)。载体的第二代通过去除E2区(病毒复制所需的)和/或E4区(参与宿主细胞凋亡抑制)并结合E1或E3删除。该得到的载体有10-13kb的克隆能力(Armentano等，1995)。通过删除除了末端反向重复(ITRs)和顺式作用包装信号的整个病毒序列生产第三代"易消化的"载体。这些载体有25kb的克隆能力(Kochanek等，2001)且在休眠细胞和分裂细胞中保留高转染率。
[0333] 重要的是，腺病毒载体不能正常地整合到宿主细胞的基因组中。但是他们显示具有瞬时基因递送到成体干细胞的效力。这些载体有一系列优势和劣势。重要的优势是他们在高滴定度下可以放大，且能够传染大范围的细胞。(Benihoud等，1999；Kanerva和Hemminki，2005)(Benihoud et al.，1999；Kanerva and Hemminki，2005).由于他们在不同储藏条件的稳定性，该载体一般容易处理。腺病毒类型5(Ad5)已被成功地用于在人类和小鼠干细胞中递送基因(Smith-Arica等，2003)(Smith-Arica et al.，2003)。在很多情况下，腺病毒不能整合到宿主细胞遗传物质中被认为是一个劣势，因为其使用仅可以进行治疗基因的瞬时表达。
[0334] 下面提供实施例是用来表明，本领域技术人员采用表达本发明的细菌视紫红质的构建体，可轻易使细胞转导到真核细胞中，例如哺乳动物细胞。例如，在评估间充质干细胞的软骨形成能力研究中，当TGF-beta1和骨形成蛋白-2(BMP-2)通过腺病毒介导的表达被递送，发现软骨形成与瞬时表达蛋白的水平和持续时间密切相关。转基因表达在所有的聚集物中是极短暂的，7天后显示显著降低。在修饰表达>100ng/ml TGF-beta1或BMP-2的聚集物中软骨形成被抑制；然而，这部分由于曝光于高腺病毒载量的抑制效应(分子理论.2005，8月；12(2):219-28.体外初级间质的干细胞的基因诱导的软骨形成.Palmer G D，Steinert A，Pascher A，Gouze E，Gouze J N，Betz O，Johnstone B，Evans C H，Ghivizzani S C).(Mol.Ther.2005August；12(2):219-28.Gene-induced chondrogenesis of primary mesenchymal stem cells in vitro.Palmer G D，Steinert A，Pascher A，Gouze E，Gouze J N，Betz O，Johnstone B，Evans C H，Ghivizzani S C)。在第二种模式，采用携带重组人类骨形成蛋白(BMP-7)基因的腺病毒转导的大鼠脂肪衍生干细胞，对于用于BMP基因治疗的自体来源的干细胞显示希望的结果。然而，通过体外测定碱性磷酸酶评价的活性是暂时的，且第8天达到峰值。因此结果与在软骨形成模式中发现的结果相似。(细胞疗法。2005；7(3):273-81)(Cytotherapy.2005；7(3):273-81).
[0335] 因此对不需要稳定基因表达的实验，腺病毒载体是一个好的选择。
[0336] 基于Ad类型5的腺病毒载体已显示通过初级受体，柯萨奇病毒和腺病毒受体（CAR），有效且瞬时引入外源基因。然而，有些种类的干细胞，例如MSC和造血干细胞，由于缺乏CAR表达，不能采用传统的基于Ad类型5的腺病毒载体有效转导。为了克服这个问题，纤维修饰的腺病毒载体和基于腺病毒另外血清型的腺病毒载体已被开发。（分子药物科学.2006年3月-4月，第3卷(2):95-103.腺病毒载体介导的基因转移进入干细胞。Kawabata K，Sakurai F，Koizumi N，Hayakawa T，Mizuguchi H.基因转移和调节实验室，国家生物创新学院，大阪，567-0085，Japan)(Mol.Pharm.2006March-April;3(2):95-103.Adenovirus vector-mediated gene transfer into stem cells.Kawabata K,Sakurai F,Koizumi N,Hayakawa T,Mizuguchi H.Laboratory of Gene Transfer and Regulation,National Institute of Biomedical Innovation,Osaka567-0
085,Japan)..
085,Japan)..
[0337] 这些修饰可以容易地应用于在此描述的细菌视紫红质构建体的应用用，特别是干细胞相关应用。
[0338] (ii)腺-相关病毒
[0339] 腺相关病毒(AAV)是普遍存在的，非细胞病变的，非复制性的，其是ssDNA细小病毒家族动物病毒成员(G.Gao等，AAV载体的新重组血清类型。现代基因治疗。2005年6月；5(3):285-97)(G.Gao et al.，New recombinant serotypes of AAV vectors.Curr Gene Ther.2005June；5(3):285-97).AAV是有4.7kb基因组的微小二十面体病毒。这些病毒有特征末端，其包括折叠于发夹构建体的回文重复。他们复制在辅助病毒的帮助下，常是很多腺病毒血清型中一个。在没有辅助病毒时，他们整合到人类基因组(AAVS1)在染色体的特异性部位19且持续潜伏形式，直到辅助病毒感染发生。(Atchison等，1965，1966)(Atchison et al.，1965，1966)。AAV可从不同的种属转导细胞型，包括小鼠，大鼠和猴子。在这些血清类型中，AAV2是研究最多的且广泛应用的基因传递载体。其基因组编码两个大的开放阅读框(ORFs)复制初始蛋白（rep）和冷适应蛋白（cap）。rep基因编码4个蛋白Rep78，Rep68，Rep52和Rep40，他们在病毒生命周期的在不同阶段具有重要作用。(例如DNA复制，转录调控，位点特异性整合，用于病毒包装的单链基因组累积).cap基因编码3个病毒衣壳蛋白VP1，VP2，VP3(Becerra等.，1988；Buning等，2003)(Becerra et al.，1988；Buning et al.，2003)。基因组的3'末端作为第二条链合成的引物且有末端决定位置(TRS)，该序列和染色体19的序列是相同的，可作病毒的整合序列使用。(Young和Samulski，2001；Young等，2000)(Young and Samulski，2001；Young et al.，2000).
[0340] 这些病毒与腺病毒相似在于他们能够感染大范围的分裂细胞和非分裂的细胞。与腺病毒不同的是，他们在人类基因组的特异性位点可整合到宿主基因组。不幸的是，由于他们是相当庞大的基因组，AAV载体转移外源基因插入物的能力是有限的(Wu和Ataai，2000)(Wu and Ataai，2000)。
[0341] RNA病毒载体
[0342] (i)逆转录病毒
[0343] 逆转录病毒的基因组包括2个相同的单链正义RNAs拷贝，7-10kb长，编码3个基因；核心蛋白（gag），反转录酶（pol）和病毒外壳蛋白（env），长末端重复序列(LTR)位于于侧面(Yu和Schaffer，2005)(Yu and Schaffer，2005)。gag基因编码核心蛋白衣壳，其包括基质和核壳体成分，所述核壳体成分是gag前体蛋白的分裂产物。pol基因编码病毒蛋白酶，逆转录酶和衍生于gag-pol前体基因的整合酶。env基因编码介导病毒侵入的包膜糖蛋白。逆转录病毒基因组重要特征的是在每个基因组末端有LTRs的存在。这些序列促进病毒DNA合成的开启，调节前病毒DNA到宿主基因组的整合和在病毒基因转录调节中作为启动子发挥作用。逆转录病毒被再分为3个普通组：肿瘤逆转录病毒(莫洛尼鼠白血病病毒，MoMLV)，慢病毒(HIV)，和泡沫病毒(泡沫病毒)(foamy virus)(Trowbridge等，2002)(Trowbridge et al.，2002)。
[0344] 基于逆转录病毒的载体一般用于基因治疗的整合载体。这些载体一般有大约8kb的克隆能力，通过完全删除除了LTRs和顺式作用包装信号以外的病毒序列而产生。
[0345] 逆转录病毒的载体在基因组的随机位点整合。与此相关问题包括潜在的插入诱变，和源自于LTR的潜在致癌活性。LTR的U3区隐藏启动子和增强子元件，因此当该区域从载体删除时导致自身灭活载体的产生，LTR驱动的转录由此被阻止。然后内部启动子可用于驱动转基因的表达。
[0346] 大鼠中干细胞基因转移的初步研究，增加了将基因转移到人类将同样有效的希望(O'Connor和Crystal，2006)(O'Connor and Crystal，2006)。采用可用的逆转录病毒载体转染多谱系的长期再生干细胞的基因转移在小鼠中依旧是更加有效的。
[0347] (ii)慢病毒
[0348] 慢病毒是逆转录病毒家族的成员。(M.Scherr等，采用慢病毒载体将基因转移到造血干细胞。现代基因治疗。2002年2月；2(1):45-55)，与肿瘤逆转录病毒相比，他们有更复杂的基因组和复制循环(Beye等，2002)(Beyer et al.，2002)。他们与简单逆转录病毒的不同在于因为他们拥有附加的调控基因和成分，例如介导病毒转录的转活的反式作用转录基因（tat）(Sodroski等，1996)(Sodroski et al.，1996)和介导非拼接病毒RNA的核输出的rev基因(Cochrane等，1990；Emerman和Temin，1986)(Cochrane et al.，1990；Emerman and Temin，1986)。
[0349] 慢性病毒病毒载体是从人类免疫缺陷病毒(HIV-1)，通过去除导致病毒复制的病毒无活性所需的基因得来。虽然他们缺乏复制基因，载体依旧可有效整合到宿主基因组，使其可以进行转基因稳定表达。这些载体有的其他优势包括低毒性和感染不同细胞型的能力。慢病毒载体也可以从猿，马和猫的起源开发而来，但是源自人类免疫缺陷病毒(HIV)的载体最为常见。(Young等，2006).(Young et al.，2006).
[0350] 通过删除除了LTRs和顺式作用包装信号以外的完全病毒序列而生产慢病毒载体。最终载体有大约8kb的克隆能力。这些载体与逆转录病毒载体的区别特征是他们能够转导分裂细胞和非分裂细胞与终末分化细胞(Kosaka等，2004).(Kosaka et al.，2004)。慢病毒递送系统在人类间质细胞和胚胎干细胞具有高感染率能力。在Clements等人的研究中，对慢病毒骨架进行修饰以表达单的和双的顺反子转基因，并用于传递用于人类干细胞基因表达的特定沉默的小发夹核糖核酸。(组织工程，2006年7月；12(7):1741-51.人类成年和胚胎干细胞中基因表达的慢病毒控制。Clements M O，Godfrey A，Crossley J，Wilson S J，Takeuchi Y，Boshoff C).(Tissue Eng.2006July；12(7):1741-51.Lentiviral manipulation of gene expression in human adult and embryonic stem cells.Clements M O，Godfrey A，Crossley J，Wilson S J，Takeuchi Y，Boshoff C).[0351] 病毒载体的一些特性的总结在下表
[0352]
[0353] 非病毒递送系统
[0354] (i)促进基因融合的方法
[0355] 除了上述讨论的基于病毒的载体外，可使用缺乏病毒序列的其它载体系统。可选择的策略包括常规质粒转移和通过使用整合酶和转位酶技术应用靶向基因的整合。这些代表载体整合的重要新技术，具有效率高的并且在他们的整合中定位是特异性的优势。目前3个重组酶系统可用于基因工程：噬菌体P1的cre重组酶(Lakso等，1992；Orban等，1992)(Lakso et al.，1992；Orban et al.，1992)，酵母2微米质粒的FLP(翻转酶)(Dymecki，1996；Rodriguez等，2000)(Dymecki，1996；Rodriguez et al.，2000)，和从链霉菌噬菌体IC31分离的整合酶(Ginsburg和Calos，2005)(Ginsburg and Calos，2005)。这些重组酶每一个识别特定的靶整合位点。Cre和FLP重组酶分别催化称为lox P(交换部位)在34bp回文序列和FRT(FLP重组酶靶）整合。噬菌体整合酶催化哺乳动物基因组中两个短att识别位点之间的位点特异性的，单向重组。重组结果是当att的位点在两个不同DNA分子存在时进行整合，当att位点在同一个分子时进行删除或转化。人们已发现其在组织培养细胞（体外）和小鼠（体内）发挥作用。
[0356] 睡美人(SB)转座子含有2个末端反向重复序列，其各自含有340个碱基对(Izsvak等，2000)(Izsvak et al.，2000)。该系统指导特定构建体从供体质粒精确转移到哺乳动物染色体。从质粒载体到染色体位点的转座子的切除和整合SB转位酶介导的，其可以通过顺式或反式方式传递到细胞内。(Kaminski等，2002)(Kaminski et al.，2002)。染色体整合的转座子中的基因可在整个细胞生命中表达。SB转座子在TA-二核苷酸碱基对进行随机整合，虽然侧翼序列可影响整合。
[0357] 将载体引入细胞的物理方法
[0358] (i)电穿孔
[0359] 电穿孔依赖于简单、高电压电脉冲的使用，其通过克服其电容在膜上产生瞬时的孔。该方法的一个优点是其可以用于在大多数细胞型中稳定表达和瞬时表达。该技术依赖于磷脂膜间相对微弱的疏水和亲水相互作用性质，且能够在紊乱之后恢复最初状态。一旦膜被透化，极性分子可被高效的递送到细胞。大的带电荷分子，像DNA和RNA，通过电泳梯度驱动的过程进入细胞。脉冲的振幅支配细胞表面上可被透化的总面积，脉冲持续时间决定了透化程度(Gabriel和Teissie，1997)(Gabriel and Teissie，1997)。细胞的透化状态取决于脉冲的强度。强脉冲可导致不可逆的透化，对细胞不可修补的损伤并最终导致细胞死亡。正是由于这个原因，电穿孔可能是基因递送方法中最粗糙的，且它一般需要更大量的DNA和细胞。该方法的效果取决于很多决定性因素，例如细胞大小，复制和脉冲应用过程中的温度(Rols和Teissie，1990)(Rols and Teissie，1990)。
[0360] 该技术最大的有益的特征是DNA可以直接转移到细胞核中，增加了其被整合到宿主细胞组的可能性。即使是难于转染的细胞采用该方法也能被稳定转染。(Aluigi等，2005；Zernecke等，2003).(Aluigi et al.，2005；Zernecke et al.，2003)。在电穿孔中使用的转染过程的修饰已导致了称为为核转染的有效基因转移方法的发展。核转染TM.技术是基于电穿孔的非病毒基因转移技术，该技术已被证明是转染难以转染的细胞株和包括MSC的原代细胞的有效工具。(Michela Aluigi，干细胞第24卷，No.2，2006年2月，页码：454-461).(Michela Aluigi，Stem Cells Vol.24，No.2，February2006，pp.454-461).
[0361] 基于生物分子的方法
[0362] (i)蛋白转导区(PTD)
[0363] PTD是短肽，无需使用内吞途径或蛋白通道即可被运输到细胞。它们的输入机制不是很清楚，但它甚至可以在低温下发生。(Derossi等.1996)(Derossi et al.1996)。2个最常用的自然存在的PTDs是人类免疫缺陷病毒转录区域(TAT)的反式激活的激活子和控制触角基因转录因子的同源结构域。除了这些自然存在的PTDs，还有一些能够自发的跨越细胞膜的人工肽。(Joliot和Prochiantz，2004)(Joliot and Prochiantz，2004).这些肽可以共价地连接于PNA（肽核酸）的拟肽骨架以帮助它们递送到细胞。
[0364] (ii)脂质体
[0365] 脂质体是类似于细胞膜的合成囊泡。当脂质分子用水搅动时，它们自发形成球状双膜区室，包围水中心形成脂质体。它们可与细胞融合，并使“包装”材料转移到细胞。脂质体已成功的用于把基因，药物，报告蛋白和其他分子递送到细胞内(Felnerova等，2004)(Felnerova et al.，2004)。脂质体的优势在于其是天然生物分子（类脂）制成，并且具有非免疫原性的。
[0366] 在形成过程中不同的亲水分子可被掺入它们。例如，当带正电荷首基的类脂和重组DNA混合时，它们可形成脂复合物，在该脂复合物中负电荷的DNA与脂分子的正电荷首基进行复合。然后这些复合物可通过内吞途径进入细胞并把DNA递送到溶酶体室。DNA分子在二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)的帮助下可逃出区室，并被递送到可被转录核内(Tranchant等，2004)(Tranchant et al.，2004)。
[0367] 尽管其简单，由于血浆蛋白的吸附作用，他们被网状内皮系统迅速清除，因此脂质体的转染效率低。稳定化处理脂质体的很多方法已采用，包括用低聚糖修饰脂质体表面，由此立体稳定化处理脂质体。(Xu等，2002)(Xu et al.，2002).
[0368] (iii)免疫脂质体
[0369] 免疫脂质体是带有被插入到其膜特异性抗体的脂质体。抗体选择性地结合于目标细胞上的特定表面分子以促进摄取。靶向于抗体的表面分子是优选被细胞吸收的分子，因此进行结合，整个复合物被吸收。该方法通过增强脂质体成分的细胞内释放提高转染效率。这些抗体可通过不同的类脂锚被插入到脂质体表面或连接到移植脂质体表面的聚乙二醇末端。除了提供基因递送的特异性，抗体还可为脂质体提供保护罩，在被内源性RNAses或蛋白水解酶摄取后帮助限制其降解(Bendas，2001)。为了进一步阻止脂质体和内容物在溶酶体区室的降解，可使用pH敏感的脂质体(Torchilin，2006)。这些脂质体通过细胞器内与内涵体膜的融合增强了脂质体内容物到胞质溶胶的释放，因为他们变得不稳定且易于在酸的pH下融合。
[0370] 一般而言，非病毒基因递送系统没有像病毒基因递送系统一样，作为基因递送到干细胞的方式被广泛应用。然而，在观察转染成活力，成体神经干/祖细胞增殖和分化到3个神经谱系神经元的研究中显示了有前途的结果。非病毒，非脂质体基因递送系统(ExGen500和FuGene6)的转染率在细胞的16%(ExGen500)到11%(FuGene6)之间。FuGene6处理的细胞在其生育力或增殖率上并未不同于未转染细胞，然而在转染ExGen500后这些特征是显著降低的。重要的是，两个试剂都不能影响转染后的分化模式。在移植到体外器官型海马体切片培养后，两个试剂都可用于遗传标记细胞，并追踪其到3个神经谱系的分化（基因医学2006年1月；8(1):72-81.成体神经干/祖细胞的有效非病毒转染，不影响生育力，增殖或分化。Tinsley R B，Faijerson J，Eriksson P S)(J Gene Med.2006January；8(1):72-81.Efficient non-viral transfection of adult neural stem/progenitor cells，without affecting viability，proliferation or differentiation.Tinsley R B，Faijerson J，Eriksson P S)。
[0371] (iv)基于聚合物的方法
[0372] 聚左旋赖氨酸(PLL)T质子化的ε-氨基和带负电荷的DNA分子相互作用形成可用于基因递送的复合物。这些复合物相当不稳定并显示凝聚倾向(Kwoh等，1999)(Kwoh et al.，1999)。发现与聚乙二醇(PEG)的结合导致复合物的稳定性增加。(Lee等，2005，Harada-Shiba等，2002)(Lee et al.，2005，Harada-Shiba et al.，2002)。为了具有一定程度的组织特异性，也可以使用靶分子例如组织特异性抗体(Trubetskoy等，1992，Suh等，2001)(Trubetskoy et al.，1992，Suh et al.，2001)。
[0373] 另外的已被用于转染细胞的基因携带者是聚乙烯亚胺(PEI)，其也与DNA形成复合物。由于胺的存在而具有不同pKa值，它有能力从内涵体区室逃脱。(Boussif等，1995)(Boussif et al.，1995).研究发现PEG移植到PEI复合物上可降低细胞毒性和这些复合物的聚集反应。这也可用于结合的抗体组合以使其具有组织特异性。(Mishra等，2004，Shi等，2003，Chiu等，2004，Merdan等，2003)(Mishra et al.，2004，Shi et al.，2003，Chiu et al.，2004，Merdan et al.，2003).
[0374] 靶向基因传递-位点特异性的重组
[0375] 在某些具体实施方式中，在特定启动子调控下，包括靶载体和进一步含有重组位点(例如.，Lox位点，FRT位点)的非人类，转基因动物可与包含重组酶(例如，Cre重组酶，FLP重组酶)的非人类，转基因动物进行杂交。已经证明这些位点特异性的重组系统，尽管大多数是微生物起源，在更高级的真核生物中发挥作用，例如植物，昆虫和小鼠。在经常使用的位点特异性重组系统中，可能有提到的Cre/Lox和FLP/FRT系统。常用的策略包括通过同源重组或常规基因转移将loxP(或FRT)位点插入到ES细胞染色体，然后递送Cre(或FLP)到后者以进行催化重组反应。在两个loxP(或FRT)位点间的重组可在ES细胞或受精卵，通过Cre瞬时表达或利用Cre转基因小鼠获得。这样一个体细胞诱变策略可以进行重组的空间调控，因为重组表达是由对给定组织或给定细胞特异性的启动子调控。
[0376] FRT系统的详细描述在例如美国专利号7736897中找到。
[0377] 当再生产时，P1噬菌体采用Cre-lox重组来循环和促进其基因组DNA的复制。由于这样的发现，噬菌体的重组策略已发展为一项基因组操作的技术。因为对小鼠基因组而言cre基因和loxP位点不是天然的，它们通过转基因技术引入到小鼠基因组中(Nagy A.2000.Cre重组酶:基因组剪裁的普遍性试剂.生殖26:99-109)(Nagy A.2000.Cre recombinase:the universal reagent for genome tailoring.Genesis26:99-109).loxP位点的定向和定位决定Cre重组是否诱发删除，倒位或染色体易位(Nagy A.2000.Cre重组酶:基因组剪裁的普遍性试剂.生殖26:99-109)(Nagy A.2000.Cre recombinase:the universal reagent for genome tailoring.Genesis26:99-109)。cre/lox系 统 已 被成功地应用于哺乳动物细胞培养，酵母，植物，小鼠，和其他生物体。(Araki K，Imaizumi T，Okuyama K，Oike Y，Yamamura K.1997.Cre在胚胎干细胞中的瞬时表达的重组效率:与各种启动子的比较。生物化学杂志(东京)122:977-82)(Araki K，Imaizumi T，Okuyama K，Oike Y，Yamamura K.1997.Efficiency of recombination by Cre transient expression in embryonic stem cells:comparison of various promoters.J Biochem(Tokyo)122:977-82).Cre-lox的大部分成功是由于其简易性。它仅需要两个成分:(a)Cre重组酶:催化在两个loxP位点之间重组的酶；和(b)LoxP位点:特异性的34-碱基对bp序列，包括一个8-bp的核心序列，重组在此发生，和两个侧面13-bp反向重复序列。
[0378] 细胞介导的递送
[0379] 在一种具体实施方式中，采用，例如表达光学传感器的细胞递送本发明的光学传感器。细胞给予受试者的多种方式为本领域技术人员所熟知。该方法可包括全身注射，例如静脉注射或将细胞植入到受试者的目标位点。细胞可被插入递送设备，其便于通过注射促进引入或促进植入受试者。该设备可包括试管，例如导管用于注射细胞和液体进入受试者身体。在一种优选的具体实施方式中，导管另外还有针头，例如注射器，通过其将本发明的细胞引入到受试者的预期位置。用于递送的细胞可以以不同形式被制备。例如，当其包括于这样的递送设备时，细胞悬浮在溶液或凝胶中或嵌入到载体基质中。细胞可能与药物可接受载体或稀释液混合，本发明的细胞在其中保持活力。药物可接受载体和稀释液包括盐，缓冲水溶液，溶剂和/或分散介质。该载体和稀释液的使用在本领域公知的。溶液优选是无菌的和流动的。优选地，溶液在制造和储存条件下是稳定的，且通过使用，例如，尼泊金类，三氯叔丁醇，苯酚，抗坏血酸，硫汞柳酸钠及其类似物预防微生物例如细菌和真菌的污染。如在此所述，发明的溶液，通过将细胞掺合到药物可接受的载体或稀释液进行制备，如果需要的话，可在虑过灭菌后加入上面列举的所需的其他成分制备。优选的细胞给药方法是相对非侵袭性的，例如，通过静脉注射，吸入法的肺递送，口服递送，口腔，阴道，局部或鼻内给药。
[0380] 然而，细胞给予途径取决于待治疗的组织，可以包括植入或直接注射。细胞递送的方法为本领域的技术人员所熟知，且药物领域技术人员可以推断使用在此描述的方法和组分。细胞给药的直接注射技术也可用于刺激在整个脉管系统的血细胞渗出，或者到特定器官的脉管系统，例如，肝，或肾或任何其他器官。这包括脉管系统非特异性的靶。通过选择特定的注射位点可以靶向任何器官，例如，肝门小静脉。可选地，可以进行全身以进入到身体的任何小静脉。该方法有助于提高年老患者的干细胞数量。此外，细胞可发挥作用来填充空白的干细胞壁龛或产生新的干细胞以补充器官，进而改进器官功能。例如，细胞可能占据周皮细胞在脉管系统内的位置。细胞递送可用于定位活性血管生成的位点。如果希望这样，将哺乳动物或受试者可用试剂进行预处理，例如给予试剂以增强细胞对组织的靶向性(例如，归巢因子)，且被置于该位点以促进细胞对目标组织的靶向作用。例如，在全身递送配体靶向细胞的系统递送之前，可将归巢因子)直接注射到组织。
[0381] 我们已描述采用干细胞的方法，例如，采用神经干细胞通过全身给药和通过颅内给药以递送试剂，导向目标至肿瘤或大脑受伤部位。(见，例如，美国专利号：7655224和7393526)(U.S.Patent Nos.7，655，224；and7，393，526).因此，人们可修饰该细胞使其表达希望电压传感器以递送进入到器官，例如大脑。
[0382] 如在说明书和所附权利要求书中使用的，单数形式“一个”“一”和“该”包括复数引用，除非上下文清楚的指明了其他情况。因此，例如，引用“该方法”包括一个或多个方法，和/或在此描述的类型的步骤，和/或本领域技术人员一旦读到该公开资料和等等就将会明白这些信息。
[0383] 当然，上面的详细描述和下面的实施例仅是用作示例性说明的，且不应当作为对本发明的保护范围的限制。在不背离本发明的精神和范围的前提下，对公开的具体实施方式可做各种变化和修饰，这对本领域技术人员是显而易见的。进一步地，出于描述和公开的目的，所有的专利，专利申请和经鉴定的出版物在此通过引用明确并入本文。例如，出版物中所述的方法可能与本发明一起使用。仅提供这些在本申请日之前公开的出版物。这方面的任何内容不应被解释为发明人承认其没有权利依据在先发明或任何其他原因先于该出版公开的。所有针对日期的声明或针对这些文档内容的描述是以对于申请人来说可用的信息为基础，而不包含针对这些文件的日期和内容的正确性的任何承诺。
[0384] 一些定义
[0385] 在此使用的术语“光学传感器”指用于产生指示跨膜电压降的光学信号的细菌视紫红质蛋白，其植入于该膜。
[0386] 在此使用的短语“下降的离子泵活性”是指与源自于天然的细菌视紫红质蛋白的内源性离子泵活性相比，修饰细菌视紫红蛋的内源性离子泵活性降低至少10%，所述修饰的+细菌视紫红质蛋白衍生自天然的细菌视紫红质蛋白。细菌视紫红质最常泵的离子是H和--
Cl 。在一些具体实施方式中，修饰细菌视紫红质蛋白的离子泵的活性比相应的天然细菌视紫红质蛋白的内源性离子泵活性低至少20%，至少30%，至少40%，至少50%，至少60%，至少
70%，至少80%，至少90%，至少95%，或至少99%。
Cl 。在一些具体实施方式中，修饰细菌视紫红质蛋白的离子泵的活性比相应的天然细菌视紫红质蛋白的内源性离子泵活性低至少20%，至少30%，至少40%，至少50%，至少60%，至少
70%，至少80%，至少90%，至少95%，或至少99%。
[0387] 在一些具体实施方式中，修饰细菌视紫红质无可检测的离子泵活性。
[0388] 如在此所用，术语“内源性离子泵活性”指对光刺激应答时发生的通过天然细菌视紫红质蛋白的离子运动。
[0389] 如在此所用，术语“天然细菌视紫红质蛋白"或”自然细菌视紫红质蛋白”指从细菌(例如，细菌的，古细菌的，或真核的)来源中制备的或分离的视紫红质蛋白。该天然细菌视紫红质蛋白，当分离后，大体上保留和天然环境(例如，在细菌细胞中)中细菌视紫红质蛋白相似的特性(例如pKa，离子泵活性等)。在此描述方法中一些有用的细菌视紫红质蛋白的非限制例子包括，绿色吸收变形菌视紫红质(GPR；GenBank登录号AF349983)，蓝色吸收变形菌视紫红质(BPR，GenBank登录号AF349981)，嗜盐菌（Natromonas pharaonis）传感视紫红质II(NpSRII；GenBank登录号Z35086.1)，和菌视紫质(BR；GenBank序列NC_010364.1，核苷酸1082241-1083029编码的蛋白，，其中1082241被指定为此处的1，GenBank登录号M11720.1，或如，例如Beja O，等人所述，(2000).科学289(5486):1902–1904)，和古细菌视紫红质(见例如，Chow B.Y等，自然463:98-102(2010)和本申请的实施例).
[0390] 如在此所用，术语”修饰细菌视紫红质蛋白”指包括至少一个突变的天然细菌视紫红质蛋白。突变可以在核酸序列(例如，基因组或mRNA序列)，可选地，可以包括氨基酸置换。这种氨基酸置换可以使保守突变或非保守突变。如本领域所公知的，氨基酸的“保守置换”或多肽的“保守置换突变体”指的氨基酸置换包括:1)多肽骨架结构(例如，β层或α螺旋结构)；2)氨基酸的电荷或疏水性；或3)侧链的庞大特性。更具体来说，熟知的术语"亲水残基"涉及丝氨酸或苏氨酸。"疏水集团"指亮氨酸，异亮氨酸，苯丙氨酸，缬氨酸或丙氨酸。"正电荷残基"涉及赖氨酸，精氨酸或组氨酸。"负电荷残基"指天冬氨酸或谷氨酸。具有"庞大侧链"的残基指苯丙氨酸，色氨酸或络氨酸。为了避免有关命名规则带来的疑惑，术语“D97N”或指定其他氨基酸置换的相似术语是指在蛋白序列的97位置的Asp(D)被Asn(N)置换。D97N的“保守置换突变体”可置换保守氨基酸变体的Asn(N)，而不是D。
[0391] 专有名词"保守氨基酸置换"是本领域公知的，指用相似特性的氨基酸置换特定氨基酸(例如，相似电荷或疏水性，相似的大小)。例子包括门冬氨酸置换谷氨酸，或异亮氨酸置换亮氨酸。在下面的表5中给出了保守氨基酸置换的例子。保守置换突变体和变体会具有：1)有与母体序列相关的唯一的保守氨基酸置换，2)有与母体序列至少90%序列相同优选是至少95%相同，96%相同，97%相同，98%相同或99%；和3)如在此定义的术语，保持电压敏感的活性。
[0392]
[0393]
[0394]
[0395] 非保守突变是除了上表提到的保守置换的任何其他氨基酸置换。
[0396] 制造保守氨基酸置换为本领域的技术人员所公知的，包括但不限于，采用寡核苷酸定点突变和聚合酶链式反应。通过本领域已知的和/或在此描述的方法，可以表达和测定光学传感器变异体的电压传感活性，pKa，和荧光检测，以验证光学传感器期望的活性通过氨基酸置换还得以保持或增强。令人期待的是在此描述的光学传感器的保守氨基酸置换变异体在传感电压上比母体光学传感器具有增强的活性或更加优的特性。通过不改变编码光学传感器的编码氨基酸序列的突变，也可在编码光学传感器的核酸中进行某些的沉默或中性的错义突变。这些突变类型有助于优化密码子选择，该密码子选择用于改进在希望细胞型中的重组蛋白的表达和生产。在载体中编码光学传感器的核酸的特异性位点定向诱变可用于创造氨基酸突变体和置换体。采用例如来自 的位点定向的诱变试剂盒，根据生产说明书，可实施位点定向的诱变，
或通过本领域的任何已知方法进行。
或通过本领域的任何已知方法进行。
[0397] 如在此所用，术语”膜电位”指细胞内外之间的电压的计算差。在一种具体实施方式中，膜电位，ΔV，通过等式ΔV=V内r–V外.确定。例如，如果外侧电位是100mV，内侧电位是30mV，那么差值是–70mV。在静息条件下，膜电位主要是由具有极大电导率的离子跨膜决定的。在很多细胞中，膜电位是由钾决定的，其获得约为-70mV的静息膜电位。因此按照惯例，静息状态下的细胞具有负的膜电位。在一些细胞中，当膜电位达到即为等于阈电位，或大于阈电位时，触发动作电位，并且细胞进行去极化(例如，膜电位大幅增加)。在很多情况下，当细胞进行去极化时，膜电位翻转并达到正值(例如，55mV)。在去极化向静息膜电位的后紧跟膜电位解析过程中，细胞可“超极化”。术语“超极化”指膜电位比静息电位更加负的，而术语“去极化”指膜电位比静息电位更少的负（甚至是正的）。膜电位变化可由离子通过嵌入膜的离子通道或离子泵的运动引发。任何细胞的跨膜电位都是可以测定的，包括维持跨膜(例如，质膜，线粒体内膜和外膜等)离子梯度的离子通道或离子泵。
[0398] 如在此所用，术语“膜电位变化”是指相比于在对照条件(例如，无试剂，损伤的细胞沟通等)的静息膜电位，ΔV增加（或减少）至少1mV，其可以是自发的或对例如环境或化学刺激(例如，细胞与细胞之间的沟通，离子通道调节，与候选试剂的接触等)的响应。在一些具体实施方式中，相比于类似细胞在对照条件下的膜电位，膜电位ΔV增加至少10mV，至少15mV，至少20mV，至少25mV，至少30mV，至少35mV，至少40mV，至少45mV，至少50mV，至少55mV，至少60mV，至少65mV，至少70mV，至少75mV，至少80mV，至少85mV，至少90mV，至少95mV，至少100mV，至少105mV，至少110mV，至少115mV，至少120mV，至少125mV，至少130mV，至少135mV，至少140mV，至少145mV，至少150mV，至少155mV，至少160mV，至少165mV，至少170mV，至少180mV，至少190mV，至少200mV或更多。在另外的具体实施方式中，膜电位相比于参考条件下的类似细胞的膜电位，降低至少3mV，至少5mV，至少10mV，至少15mV，至少20mV，至少25mV，至少30mV，至少35mV，至少40mV，至少45mV，至少50mV，至少55mV，至少60mV，至少65mV，至少70mV，至少75mV，至少80mV，至少85mV，至少90mV，至少95mV，至少100mV，至少105mV，至少110mV，至少115mV，至少120mV，至少125mV，至少130mV，至少
135mV，至少140mV，至少145mV，至少150mV或更多。
135mV，至少140mV，至少145mV，至少150mV或更多。
[0399] 如在此所用，表达"集定位于细胞的膜"指修饰细菌视紫红质蛋白优先定位于细胞膜，且可通过例如修饰细菌视紫红质使其包括使视紫红质蛋白对准细胞的膜(例如，质膜，线粒体外膜，线粒体内膜等)的信号序列来实现。。在一些具体实施方式中，至少细胞中40%的修饰细菌视紫红质蛋白定位到预期的细胞膜区室（例如，质膜，线粒体膜等）。在其他的具体实施方式中，至少50%，至少60%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，至少99%的修饰的细菌视紫红质蛋白定位到预期细胞的膜区室。类似的，术语"定位于亚细胞区室"指细菌视紫红质蛋白优先定位于特定的亚细胞区室(例如，线粒体，内质网，过氧化物酶体等)。在一些具体实施方式中，细胞中至少40%的修饰的细菌视紫红质蛋白定位于预期的亚细胞区室；在另外的具体实施方式中，至少50%，至少60%，至少70%，至少
75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，或至少99%的修饰细菌视紫红质蛋白定位预期的亚细胞区室。
75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，或至少99%的修饰细菌视紫红质蛋白定位预期的亚细胞区室。
[0400] 在一些具体实施方式中，约100%定位于预期细胞膜或区室。
[0401] 如在此所用，术语“引入到细胞内”指将编码光学传感器的表达载体或在此描述的重组光学传感器引入到宿主细胞的任何方法。将表达载体引入细胞的一些非限制例子包括，例如，磷酸钙转染，电穿孔，脂质转染法，或采用基因枪的方法或类似的方法。在一种具体实施方式中，重组光学传感器蛋白通过膜融合被引入到细胞，膜融合采用类脂介导的递送系统，例如微粒，脂质体等。
[0402] 如在此所用，术语“产生光学信号的部分”是指可产生可测量的信号，例如荧光，化学发光，比色信号等，的分子(例如，视黄醛)或分子的部分。在一种具体实施方式中，修饰细菌视紫红质包括具有可产生光学信号的部分的融合分子。
[0403] 如在此所用，术语“荧光水平的变化”或“光学信号水平的变化”指修饰细菌视紫红质蛋白荧光水平的增加或减小或光学信号的增加或减小，其是电压或膜电位变化诱导的。在一些具体实施方式中，相比于对照状态下的相同细胞或类似细胞，细胞中荧光水平或光学信号水平增加至少2%，至少5%，至少10%，至少20%，至少30%，至少40%，至少50%，至少60%，至少70%，至少80%，至少90%，至少95%，至少99%，至少1倍，至少2倍，至少5倍，至少
10倍，至少50倍，至少100倍，至少500倍，至少600倍，至少700倍，至少800倍，至少900倍，至少1000倍，至少2000倍，至少5000倍，至少10000倍或更多。可选地，相比于对照状态下的相同细胞或类似细胞，细胞中荧光水平或光学信号水平下降至少20%，至少30%，至少
40%，至少50%，至少60%，至少70%，至少80%，至少90%，至少95%，至少99%，或甚至100%(例如，没有检测到信号)。
10倍，至少50倍，至少100倍，至少500倍，至少600倍，至少700倍，至少800倍，至少900倍，至少1000倍，至少2000倍，至少5000倍，至少10000倍或更多。可选地，相比于对照状态下的相同细胞或类似细胞，细胞中荧光水平或光学信号水平下降至少20%，至少30%，至少
40%，至少50%，至少60%，至少70%，至少80%，至少90%，至少95%，至少99%，或甚至100%(例如，没有检测到信号)。
[0404] 如在此所用，术语“调节离子通道活性”指增加或减小离子通道的一个或多个体现细胞膜电位变化的特征。这些特征包括例如导电性的开放或闭合状态，电压阈值，动力学和/或配体亲和力。在一些具体实施方式中，细胞离子通道的一个或多个有用的特征通过例如，细胞膜电位变化测定。在一些具体实施方式中，与没有试剂存在时的离子通道活性相比，存在试剂的离子通道活性增加至少20%，至少30%，至少40%，至少50%，至少60%，至少70%，至少80%，至少90%，至少95%，至少99%，至少1倍，至少2倍，至少5倍，至少10倍，至少20倍，至少50倍，至少100倍，至少1000倍或更多。在其他的具体实施方式中，与没有试剂存在时的离子通道活性相比，存在试剂的离子通道的有用的参数下降至少20%，至少30%，至少40%，至少50%，至少60%，至少70%，至少80%，至少90%，至少95%，或至少99%。在一些具体实施方式中，与没有试剂存在的离子通道活性相比，在有试剂存在的离子通道参数是缺乏的。
[0405] 如在此所用，术语“抗生素外流抑制剂”是指细胞中的抗生素外流水平降低至少20%的试剂，与没有试剂存在的抗生素外流水平相比。在一些具体实施方式中，与没有试剂存在的抗生素外流水平相比，存在试剂时抗生素外流降低至少30%，至少40%，至少50%，至少60%，至少70%，至少80%，至少90%，至少95%，至少99%，或甚至100%(例如，不存在)。
[0406] 如在此所用，术语“靶向序列”指对准于或优先缔合或结合到特定组织，细胞型，受体，细胞器，或其他有用区域的部分或序列。将靶向序列附加到光学传感器组合物上将增强该组合物到预期的细胞型或亚细胞位置的递送。细胞中具有光学传感器的靶向序列的附加，或表达，增强了光学传感器在动物或受试者预期位置的定位。
[0407] 如在此所用，短语“相当于菌视紫质中的氨基酸突变的在另外的细菌视紫红质中的同源突变”指在预期细菌视紫红质中残基的突变，其希望具有与菌视紫质大体相似突变的类似效果。本领域技术人员通过对期望的的细菌视紫红质的保守区域与菌视紫质序列进行对比，可以同采用电脑程序例如ClustalW进行对比，可容易地将同源残基放置在其期望的细菌视紫红质中。
[0408] 同源突变的例子包括本申请中陈述的实施例中制造的突变。
[0409] 在此使用的术语“包括”或“包含”的使用涉及组合物，方法及其各自成分，它们是发明所必需的，其对不特定的组分是开放的，无论这些组分是否是必需的。
[0410] 在此所用的术语“基本上含有”指给定具体实施方式所需要的成分。该术语能够使存在成分而大体上不影响发明具体实施方式的基本的和新颖的或功能的特征。
[0411] 术语"由……组成"指在此所述的组合物，方法及其各自成分，不计在具体实施方式的描述中未列举的任何成分。
[0412] 在此提供光学传感器，包括细菌视紫红质或修饰的细菌视紫红质蛋白，相比于源自于的天然细菌视紫红质蛋白，离子泵活性降低。在一种具体实施方式中，组合物包括编码载体或工程化细胞，工程化细胞包括细菌视紫红质蛋白或修饰细菌视紫红质蛋白，相比于源自于天然的细菌视紫红质蛋白，离子泵活性降低。在一些具体实施方式中，细菌视紫红质定向于膜，例如质膜或线粒体膜。
[0413] 因此，发明提供测定细胞内的膜电位的方法，该细胞表达编码细菌视紫红质蛋白的核酸，该方法包括如下步骤：(a)采用至少一个波长的光，体外，离体或体内激发至少一个细胞，该细胞包括编码细菌视紫红质蛋白的核酸；和(b)体外检测来自至少一个细胞的至少一个光学信号，其中至少一个细胞发射的荧光水平，与参考相比，可指示细胞膜电位。
[0414] 在发明的一些或任何具体实施方式或方面中，细菌视紫红质蛋白是修饰细菌视紫红质蛋白，与源自于天然的细菌视紫红质蛋白相比，其离子泵活性降低。
[0415] 在发明的一些或任何具体实施方式或方面中，修饰的细菌视紫红质蛋白包括邻近希夫碱基的突变质子受体。
[0416] 在发明的一些或任何具体实施方式或方面中，细菌视紫红质蛋白是变形菌视紫红质蛋白家族的成员。
[0417] 在发明的一些或任何具体实施方式或方面中，细菌视紫红质蛋白是古细菌视紫红质蛋白家族中的成员。
[0418] 在发明的一些或任何具体实施方式或方面中，至少一个波长在λ=594-645nm波长之间。
[0419] 在发明的一些或任何具体实施方式或方面中，细胞是原核细胞。
[0420] 在发明的一些或任何具体实施方式或方面中，细胞是真核细胞。
[0421] 在发明的一些或任何具体实施方式或方面中，真核细胞是哺乳动物细胞。
[0422] 在发明的一些或任何具体实施方式或方面中，真核细胞是干细胞或多能细胞或祖细胞。
[0423] 在发明的一些或任何具体实施方式或方面中，真核细胞是诱导多能细胞。
[0424] 在发明的一些或任何具体实施方式或方面中，真核细胞是神经元。
[0425] 在发明的一些或任何具体实施方式或方面中，真核细胞是心肌细胞。
[0426] 在发明的一些或任何具体实施方式或方面中，该方法还包括用含有编码细菌视紫红质蛋白核酸的载体，体外，离体或体内转染至少一个细胞的步骤。
[0427] 在发明的一些或任何具体实施方式或方面中，编码细菌视紫红质蛋白的核酸可操作地连接于细胞型特异的启动子。
[0428] 在发明的一些或任何具体实施方式或方面中，编码细菌视紫红质蛋白的核酸可操作地连接于膜靶向核酸序列。
[0429] 在发明的一些或任何具体实施方式或方面中，膜靶向核酸是质膜靶向的核酸序列。
[0430] 在发明的一些或任何具体实施方式或方面中，膜靶向核酸序列是亚细胞区室靶向的核酸序列。
[0431] 在发明的一些或任何具体实施方式或方面中，亚细胞区室选自线粒体膜，内质网，肌质网，突触小泡，内涵体或吞噬小体。
[0432] 在发明的一些或任何具体实施方式或方面中，编码细菌视紫红质蛋白的核酸可操作地连接于编码至少一个附加荧光蛋白或生色团的核酸。
[0433] 在发明的一些或任何具体实施方式或方面中，至少一个附加荧光蛋白能够指示细胞内的离子浓度的荧光蛋白。.
[0434] 在发明的一些或任何具体实施方式或方面中，能够指示细胞内的离子浓度的荧光蛋白是钙指示器。
[0435] 在发明的一些或任何具体实施方式或方面中，能够指示细胞内的离子浓度的荧光蛋白是pH指示器。
[0436] 在发明的一些或任何具体实施方式或方面中，至少一个附加荧光蛋白能够进行非放射性荧光共振，使能量转移到细菌视紫红质，其能量转移速率取决于膜电位。
[0437] 在发明的一些或任何具体实施方式或方面中，至少一个附加荧光蛋白是绿色荧光蛋白或其同系物。
[0438] 在发明的一些或任何具体实施方式或方面中，荧光蛋白的亮度对膜电位或局部化学环境不敏感。
[0439] 在发明的一些或任何具体实施方式或方面中，该方法进一步包括如下步骤：采用至少第一和第二波长的光体外，离体或体内激发至少一个细胞；和体外，离体或体内检测至少第一和第二光学信号，该信号是由来自至少一个细胞的至少第一和第二波长的激发引起。
[0440] 在发明的一些或任何具体实施方式或方面中，至少第二波长在λ=447-594nm之间。
[0441] 在发明的一些或任何具体实施方式或方面中，该方法还包括下述步骤：计算细菌视紫红质的荧光发射与至少一个附加荧光蛋白的荧光发射的比率，以获取不依赖于表达水平差异的膜电位测定。
[0442] 在发明的一些或任何具体实施方式或方面中，该方法还包括下述步骤：将至少一个细胞体外，离体或体内暴露于能够或预期能够改变膜电位的刺激。
[0443] 在发明的一些或任何具体实施方式或方面中，刺激是候选试剂。
[0444] 在发明的一些或任何具体实施方式或方面中，刺激是细胞培养基组分的变化。
[0445] 在发明的一些或任何具体实施方式或方面中，刺激是电流。
[0446] 在发明的一些或任何具体实施方式或方面中，还包括在第一和至少第二时间点体外，离体或体内测定至少一个光学信号的步骤。
[0447] 在发明的一些或任何具体实施方式或方面中，第一时间点是在将至少一个细胞暴露于刺激之前，至少第二时间点是将至少一个细胞暴露于刺激之后。
[0448] 在发明的一些或任何具体实施方式或方面中，其中该方法包括多个细胞，例如在高通量测定中。
[0449] 在另外的具体实施方式中，发明提供分离和纯化的编码古细菌视紫红质蛋白家族修饰成员的核酸，与源自于天然的古细菌视紫红质蛋白家族成员相比，离子泵活性降低。
[0450] 在发明的一些或任何具体实施方式或方面中，古细菌视紫红质蛋白家族的修饰成员包括邻近希夫碱基的突变质子受体。
[0451] 在发明的一些或任何具体实施方式或方面中，与源自于天然的古细菌视紫红质蛋白家族的成员相比，古细菌视紫红质蛋白家族的修饰成员的离子泵活性降低，该古细菌视紫红质蛋白家族的修饰成员可操作地连接于膜靶向的核酸序列。
[0452] 在发明的一些或任何具体实施方式或方面中，膜靶向的核酸序列是质膜靶向的核酸序列。
[0453] 在发明的一些或任何具体实施方式或方面中，膜靶向的核酸序列是亚细胞膜靶向的核酸序列。
[0454] 在发明的一些或任何具体实施方式或方面中，亚细胞膜是线粒体膜，内质网，肌质网，突触小泡，内涵体或吞噬小体。
[0455] 在发明的一些或任何具体实施方式或方面中，古细菌视紫红质家族的修饰的细菌视紫红质可操作地连接于细胞型特异的启动子。
[0456] 在发明的一些或任何具体实施方式或方面中，古细菌视紫红质家族的修饰的细菌视紫红质可操作地连接于编码至少一个附加荧光蛋白或生色团的核酸。
[0457] 在发明的一些或任何具体实施方式或方面中，其中至少一个附加荧光蛋白是绿色荧光蛋白或其同系物。
[0458] 在发明的一些或任何具体实施方式或方面中，至少一个附加荧光蛋白能够指示细胞内的离子浓度。
[0459] 在发明的一些或任何具体实施方式或方面中，能够指示细胞内离子浓度的荧光蛋白是钙指示器。
[0460] 在发明的一些或任何具体实施方式或方面中，能够指示细胞内离子浓度的荧光蛋白是pH指示器。
[0461] 在发明的一些或任何具体实施方式或方面中，至少一个附加荧光蛋白能够进行非放射性荧光共振，使能量转移到细菌视紫红质，其能量转移速率取决于膜电位。
[0462] 在发明的一些或任何具体实施方式或方面中，分离和纯化的核酸还包括载体。
[0463] 在发明的一些或任何具体实施方式或方面中，载体是病毒载体，例如慢病毒载体或腺伴随病毒载体。
[0464] 在另外的具体实施方式中，发明提供试剂盒，包括合适容器中分离和纯化的核酸，该核酸编码在此公开的古细菌视紫红质家族的修饰的细菌蛋白。核酸可以以干燥形式或适宜缓冲液的形式提供。
[0465] 发明另外的具体实施方式提供分离的细胞，其包括编码细菌视紫红质蛋白的核酸，其中细菌视紫红质蛋白是修饰的细菌视紫红质蛋白，与源自于天然的细菌视紫红质蛋白相比，离子泵活性降低。
[0466] 在发明的一些或任何具体实施方式或方面中，修饰的细菌视紫红质蛋白包括邻近希夫碱基的突变质子受体。
[0467] 在发明的一些或任何具体实施方式或方面中，细菌视紫红质是变形菌视紫红质家族的成员。
[0468] 在发明的一些或任何具体实施方式或方面中，细菌视紫红质是古细菌视紫红质家族的成员。
[0469] 在发明的一些或任何具体实施方式或方面中，细胞是真核细胞。
[0470] 在发明的一些或任何具体实施方式或方面中，细胞是原核细胞。
[0471] 在发明的一些或任何具体实施方式或方面中，修饰的细菌视紫红质基因可操作地连接于启动子。
[0472] 在发明的一些或任何具体实施方式或方面中，启动子是细胞型特异的启动子。
[0473] 在发明的一些或任何具体实施方式或方面中，编码细菌视紫红质蛋白的核酸可操作地连接于膜靶向的核酸序列。
[0474] 在发明的一些或任何具体实施方式或方面中，膜靶向核酸是质膜靶向的核酸序列。
[0475] 在发明的一些或任何具体实施方式或方面中，膜靶向核酸是亚细胞区室靶向核酸序列。
[0476] 在发明的一些或任何具体实施方式或方面中，亚细胞区室是选自于线粒体膜，内质网，肌质网，突触小泡，内涵体或吞噬小体。
[0477] 在发明的一些或任何具体实施方式或方面中，编码修饰的细菌视紫红质蛋白的核酸可操作地连接于编码至少一个附加荧光蛋白或生色团的核酸。
[0478] 在发明的一些或任何具体实施方式或方面中，至少一个附加荧光蛋白是绿色荧光蛋白或其同系物。
[0479] 在发明的一些或任何具体实施方式或方面中，至少一个附加荧光蛋白能够进行非放射性荧光共振，使能量转移到细菌视紫红质，其能量转移速率取决于膜电位。
[0480] 在发明的一些或任何具体实施方式或方面中，至少一个附加荧光蛋白对膜电位或局部化学环境不敏感
[0481] 在发明的一些或任何具体实施方式或方面中，至少一个附加荧光蛋白能够指示细胞内的离子浓度。
[0482] 在发明的一些或任何具体实施方式或方面中，能够指示细胞内离子浓度的荧光蛋白是钙指示器。
[0483] 在发明的一些或任何具体实施方式或方面中，能够指示细胞内离子浓度荧光蛋白是pH指示器。
[0484] 在发明的一些或任何具体实施方式或方面中，细胞是干细胞，多能细胞，或诱导多能细胞，或其分化或未分化子代细胞。
[0485] 在发明的一些或任何具体实施方式或方面中，细胞是分化细胞。
[0486] 在发明的一些或任何具体实施方式或方面中，分化细胞是神经元。
[0487] 在发明的一些或任何具体实施方式或方面中，分化细胞是心肌细胞。
[0488] 在一种具体实施方式中，发明还包括分离细胞，含有任何分离和纯化的核酸或核酸构建体的分离和纯化的核酸，该分离和纯化的核酸或核酸构建体含有上面描述的古细菌视紫红质家族的修饰的细菌视紫红质。
[0489] 在一种具体实施方式中，发明提供试剂盒，如在此描述的，包括适宜细胞培养基上的多个细胞或容器。
[0490] 在另外的具体实施方式中，发明提供用于光学测定膜电位的工程细胞的制造方法，包括用编码细菌视紫红质蛋白的核酸转导细胞步骤。
[0491] 在发明的一些或任何具体实施方式或方面中细菌视紫红质蛋白是修饰的细菌视紫红质蛋白，相比于天然细菌视紫红质蛋白，其离子泵活性降低。
[0492] 在发明的一些或任何具体实施方式或方面中，修饰的细菌视紫红质包括邻近希夫碱基的突变质子受体。
[0493] 在发明的一些或任何具体实施方式或方面中，编码细菌视紫红质蛋白的核酸可操作地连接于膜靶向核酸序列。
[0494] 在发明的一些或任何具体实施方式或方面中，膜靶向核酸序列是质膜靶向核酸序列。
[0495] 在发明的一些或任何具体实施方式或方面中，膜靶向性核酸序列是亚细胞膜靶向的核酸序列。
[0496] 在发明的一些或任何具体实施方式或方面中，亚细胞膜是线粒体膜，内质网，肌质网，突触小泡，内涵体或吞噬小体。
[0497] 在发明的一些或任何具体实施方式或方面中，编码细菌视紫红质蛋白的核酸可操作地连接于细胞型特异性启动子。
[0498] 在发明的一些或任何具体实施方式或方面中，编码细菌视紫红质蛋白的核酸可操作地连接于编码至少一个附加荧光蛋白或生色团的附加核酸。
[0499] 在发明的一些或任何具体实施方式或方面中，至少一个附加荧光蛋白是绿色荧光蛋白或其同系物。
[0500] 在发明的一些或任何具体实施方式或方面中，至少一个附加荧光蛋白能够指示细胞内的离子浓度。
[0501] 在发明的一些或任何具体实施方式或方面中，至少一个能够指示细胞内离子浓度的附加荧光蛋白是钙指示器。
[0502] 在发明的一些或任何具体实施方式或方面中，至少一个能够指示细胞内离子浓度的附加荧光蛋白是pH指示器。
[0503] 在发明的一些或任何具体实施方式或方面中，细胞是分化的细胞。
[0504] 在发明的一些或任何具体实施方式或方面中，分化细胞是神经元。
[0505] 在发明的一些或任何具体实施方式或方面中，分化细胞是心肌细胞。
[0506] 在发明的一些或任何具体实施方式或方面中，细胞是多能细胞，干细胞或诱导多能干细胞。
[0507] 在发明的一些或任何具体实施方式或方面中，该方法还包括分化多能细胞，干细胞或诱导多能干细胞为分化细胞的步骤。
[0508] 根据权利要求书80-97任一项所述的方法，其中转导采用瞬时转染来实施。
[0509] 在发明的一些或任何具体实施方式或方面中，转导采用稳定转染来实施。
[0510] 在发明的一些或任何具体实施方式或方面中，采用在此描述的分离和纯化的核酸转导细胞。
[0511] 在一些具体实施方式中，在非人类细胞实施方法。
[0512] 在一些具体实施方式和方面中，发明提供用于表达细菌视紫红质的遗传工程细胞，和使用这种细胞的方法，所述的细菌视紫红质在细胞中不是自然存在的。
[0513] 在此还提供制作光学传感器的方法，包括:(a)修饰细菌视紫红质蛋白，使其与源自于天然的细菌视紫红质蛋白相比离子泵活性降低，和(b)将修饰的细菌视紫红质蛋白引入到细胞内，从而产生遗传编码的光学传感器。在一种具体实施方式中，引入的步骤包括将修饰的细菌视紫红质蛋白的基因引入到细胞中。
[0514] 在另一个方面中，发明提供测定细胞的膜电位变化的方法，该方法包括：测定细胞中的光学信号，其中细胞包括天然的细菌视紫红质，和修饰的细菌视紫红质蛋白，其与源自于天然的细菌视紫红质蛋白相比，离子泵活性降低，其中细菌视紫红质或修饰细菌视紫红质蛋白定位于细胞膜，并且其中视紫红质或修饰的细菌视紫红质蛋白的荧光水平变化指示细胞的膜电位变化。
[0515] 在此描述的还有筛选直接或通过影响离子通道活性调节膜电位的候选试剂的方法，该方法包括:(a)用候选试剂接触细胞，其中细胞包括细菌视紫红质或修饰的细菌视紫红质蛋白，其与源自于天然的细菌视紫红质蛋白相比，离子泵活性降低，其中细菌视紫红质或修饰的细菌视紫红质蛋白定位于细胞的膜上，和(b)测定光学信号，其中在候选试剂存在下，视紫红质或修饰的细菌视紫红质蛋白的荧光水平变化指示细胞跨膜的膜电位的变化，从而指示候选试剂直接或通过影响离子通道活性调节膜电位。
[0516] 此外，在此提供筛选细菌细胞中抗生素外流调节剂的方法，该方法包括:(a)用候选试剂接触细胞，其中该细胞包括细菌视紫红质或修饰的细菌视紫红质蛋白，与源自于的天然的细菌视紫红质蛋白相比，其离子泵活性降低，其中细菌视紫红质或修饰的细菌视紫红质蛋白定位于细胞膜，和(b)测定细菌视紫红质或修饰的细菌视紫红质的荧光水平的时间依赖性波动，其中在候选试剂存在下波动的变化指示细胞跨膜的膜电位的变化，从而指示候选试剂是细菌细胞中抗生素外流调节剂。在一种具体实施方式中，候选试剂是抗生素外流的抑制剂。在可选择具体实施方式中，候选试剂增强了抗生素外流。
[0517] 还在此描述的表达细菌视紫红质和修饰的细菌视紫红质蛋白的核酸构建体，所述修饰的细菌视紫红质蛋白是与源自于的天然细菌视紫红质蛋白相比，离子泵活性降低的，该核酸构建体至少包括一个编码修饰的细菌视紫红质蛋白的核酸序列，所述修饰的细菌视紫红质蛋白是通过适于真核细胞的密码子选择的修饰。
[0518] 在另外的具体实施方式中，在此描述的载体包括至少一个编码电压指示器的核酸可操作地连接于启动子，例如，组织特异性的启动子，例如神经特异性的启动子或心脏组织，例如心肌细胞特异性的启动子。
[0519] 在一些具体实施方式中，载体还包括靶向于膜的膜靶向信号序列，例如质膜，线粒体，内质网，肌质网，突触小泡和吞噬小体。在一些具体实施方式中，载体至少包括编码不同电压指示器蛋白的两个核酸。在一些具体实施方式中，载体还包括编码例如，pH指示器(例如，pHluorin)或钙指示器(例如，GCaMP3)的核酸。使用这些组合能够同时监测电压和浓2+
度(分别为pH或Ca )。
度(分别为pH或Ca )。
[0520] 在另外的具体实施方式中，本发明提供细胞表达，稳定或瞬时，至少一个核酸构建体，或编码说明书中描述细菌视紫红质或修饰细菌视紫红质的载体。
[0521] 在另外的方面中，提供测定细胞回路中至少一个细胞的膜电位变化的方法，该方法包括：测定细胞回路中至少一个细胞中的细菌视紫红质或修饰细菌视紫红质的荧光水平，其中细胞回路中至少一个细胞包括细菌视紫红质或修饰的细菌视紫红质蛋白，其与源自于的天然细菌视紫红质蛋白相比，离子泵活性降低，其中细菌视紫红质或修饰的细菌视紫红质蛋白定位于细胞的膜上，且其中荧光水平变化指示在所述的细胞回路中至少一个细胞的跨膜的膜电位变化。在发明的一些和所有方面中，细菌视紫红质靶向于细胞的质膜。
[0522] 在此提供的另外方面是用于光学测定膜电位的高通量系统，该系统包括:(a)多个工程细胞，在其膜上包括至少一个修饰细菌视紫红质蛋白，与源自于的天然的细菌视紫红质蛋白相比，其离子泵活性降低，和(b)检测修饰的细菌视紫红质蛋白荧光的工具。
[0523] 在上述描述的方法或细胞的一个具体实施方式中，细胞是真核细胞或原核细胞。
[0524] 在一个具体实施方式中，真核细胞是哺乳动物细胞。
[0525] 在另外的具体实施方式中，细胞是干细胞或多能细胞，包括诱导多能细胞或干细胞。
[0526] 在一些具体实施方式中，细胞是祖细胞，例如神经祖细胞或心脏祖细胞。
[0527] 在一些具体实施方式中，细胞是分化细胞，例如神经细胞或心肌细胞。
[0528] 在上述方法或细胞的另外的具体实施方式中，原核细胞是细菌细胞。
[0529] 在一个具体实施方式中，引入步骤包括将细菌视紫红质或修饰的视紫红质蛋白的基因引入到细胞。
[0530] 在所述具体实施方式的一个或所有方面中，细胞是真核细胞。在所述的一个或所有具体实施方式中，细胞不天然表达细菌视紫红质。
[0531] 在上述方法或细胞的另外的具体实施方式中，通过病毒载体进行引入。
[0532] 在上述方法或细胞的另外的具体实施方式中，通过电穿孔进行引入。
[0533] 在上述方法或细胞的其他具体实施方式中，通过脂质转染法，CaPO4，类脂介导的递送(例如，脂质体，胶束等)，转染或转化进行引入。
[0534] 在上述方法或细胞的另外的具体实施方式中，在受试者体内的至少一个细胞中进行引入。
[0535] 在上述方法或细胞的另外的具体实施方式中，细胞是遗传工程细胞用于编码修饰细菌视紫红质蛋白。
[0536] 在上述方法或细胞的另外的具体实施方式中，细胞是干细胞。
[0537] 在上述方法或细胞的另外的具体实施方式中，干细胞选自如下组：包括多能细胞，胚胎干细胞，成体干细胞和神经干细胞。
[0538] 在上述方法或细胞的另外的具体实施方式中，修饰的细菌视紫红质蛋白还包括产生光学信号的部分。
[0539] 在上述方法或细胞的另外的具体实施方式中，相比于衍生源天然细菌视紫红质蛋白，修饰的细菌视紫红质蛋白包括氨基酸突变体。
[0540] 在一些具体实施方式中，细菌视紫红质是变形菌视紫红质。
[0541] 在一些具体实施方式中，细菌视紫红质是古细菌视紫红质。在一些具体实施方式中，古细菌视紫红质是古细菌视紫红质3(Arch3)或其任何同系物。
[0542] 在上述方法或细胞的另外的具体实施方式中，包括突变体的修饰的细菌视紫红质蛋白是绿色吸收变形菌视紫红质。
[0543] 在上述方法或细胞的另外的具体实施方式中，突变体选自下述组，组包括：D97N，E108Q，E142Q，和L217D。
[0544] 在上述方法或细胞的另外的具体实施方式中，包括突变体的修饰的细菌视紫红质蛋白是蓝色吸收变形菌视紫红质。
[0545] 在上述方法或细胞的另外的具体实施方式中，突变体是菌视紫质中的D85N或蓝色吸收变形菌视紫红质中的D99N。
[0546] 在上述方法或细胞的另外的具体实施方式中，氨基酸突变体是在菌视紫质中的残基V48，P49，Y57，L92，W86，I119，M145，W182，Y199，D212，V213上(例如，由核酸序列GenBank NC_010364.1，序列1082241-1083029编码的蛋白，其中核苷酸1082241在此认定为核酸残基1或GenBank登录序列M11720.1)或在其他的细菌视紫红质中的同源的突变体。
[0547] 在具体实施方式中，细菌视紫红质是古细菌视紫红质，例如Arh-3(见，例如，Chow，B.Y.等，自然，第463卷，页码:98-102(2010)，以引用的方式在此全部并入)（Chow，B.Y.et al.，Nature463:98-102(2010))。在另外的具体实施方式中，古细菌视紫红质Arh-3包括D95N氨基酸突变体或在其他的古细菌视紫红质中相应位置上的突变体。其他的古细菌视紫红质包括，但不仅限于，在嗜盐古菌（Halorubrum sp.）中发现的古细菌视紫红质-1和古细菌视紫红质-2(见，例如，Enami等.分子生物杂志，2006年5月5日，第358卷3期，页码:675-85.电子版2006年3月3日)(Enami et al.J Mol Biol.2006May5；358(3):675-85.Epub2006Mar3)。
[0548] 在上述方法或细胞的其他的具体实施方式中，修饰细菌视紫红质蛋白定位于亚细胞区室。
[0549] 在上述方法或细胞的其他的具体实施方式中，修饰细菌视紫红质蛋白定位于质膜，线粒体内膜或线粒体外膜。
[0550] 在上述方法或细胞的其他的具体实施方式中，修饰的细菌视紫红质蛋白还包括靶向序列。
[0551] 在上述方法或细胞的其他的具体实施方式中，修饰的细菌视紫红质蛋白包括Golgi输出序列，膜定位序列，和/或内质网输出序列。
[0552] 在上述方法或细胞的其他的具体实施方式中，膜定位序列包括来自于β2烟碱乙酰胆碱受体的C-末端信号序列。
[0553] 在上述方法或细胞的其他的具体实施方式中，修饰的细菌视紫红质蛋白还包括荧光基序或生色团。
[0554] 在上述方法或细胞的其他的具体实施方式中，荧光或光学信号通过荧光，谱移荧光共振能量转移(FRET)，视紫红质光锁定成像(ROLI)，拉曼，或倍频效应(SHG)检测。
[0555] 在上述方法或细胞的其他的具体实施方式中，真核细胞是神经细胞。
[0556] 在上述方法或细胞的其他的具体实施方式中，修饰的细菌视紫红质蛋白在细胞中表达。
[0557] 在上述方法或细胞的其他的具体实施方式中，修饰的细菌视紫红质蛋白从编码修饰的细菌视紫红质蛋白的核酸序列表达，该视紫红质蛋白有修饰的密码子选择，这样密码子选择适于真核细胞，但氨基酸序列保持和修饰的细菌视紫红质蛋白大体相似。
[0558] 在上述方法或细胞的其他的具体实施方式中，细菌细胞是对抗生素不敏感的细菌菌种。
[0559] 在上述方法或细胞的其他的具体实施方式中，视紫红质蛋白还包括产生光学信号的部分。
[0560] 在上述方法或细胞的其他的具体实施方式中，产生光学信号的部分包括荧光部分或生色团。
[0561] 在上述方法或细胞的其他的具体实施方式中，构建体还包括真核启动子。
[0562] 在上述方法或细胞的其他的具体实施方式中，真核启动子是诱导型启动子或组织特异性启动子。
[0563] 在上述方法或细胞的其他的具体实施方式中，细胞回路包括至少两个神经细胞。
[0564] 在上述方法或细胞的其他的具体实施方式中，修饰的细菌视紫红质蛋白的离子泵活性被抑制。
[0565] 在上述方法或细胞的其他的具体实施方式中，修饰的细菌视紫红质测量不到离子泵活性。
[0566] 在上述方法或细胞的其他的具体实施方式中，候选试剂抑制，增加，或降低离子通道活性。
[0567] 实施例
[0568] 电压通过生物系统用于信息细胞或生物范围传递到。传统的电压探针依赖于电极与细胞接触，仅可用于有限数量的细胞。在此描述的是基于细菌视紫红质的新型荧光蛋白，其荧光对细胞的膜电位极其敏感。该探针，具有远红外荧光激发，近红外发射，毫秒响应应时间，且极其耐光。
[0569] 实施例1
[0570] 变形菌视紫红质作为质子荧光传感器
[0571] 变形菌视紫红质是最近在海洋菌中发现的光活性的跨膜蛋白大家族。绿色吸收变形菌视紫红质(GPR)是光驱动性质子泵，通过其宿主将太阳能转换为质子动力势，为细胞机器提供动力。质子通过GPR的定向移动伴随一系列蛋白的引人注目的颜色变化。该研究的方法是测定GPR是否反向运行：跨膜电位能否驱动质子穿过蛋白并进而改变其颜色？在此描述的是采用该方法的基于蛋白的膜电位比色指示器。
[0572] 共价键结合的亚视黄基是GPR的可见的生色团。视黄醛通过希夫碱基连接于赖氨酸231的ε-氨基上。在野生型光循环的早期，质子离开SB，导致吸收峰从λmax=535nm到λmax=421nm的移动。pH的增加还诱导颜色变化且指示SB的pKa>12。这是由于膜电位的变化将会改变SB上质子的电化学电位，进而影响pKa。能斯特方程式指示在SB上59mV的ΔV对应于ΔpKa的1pH单位。如果pKa低于周围pH，SB失去质子继而发生染色变化。当SB平衡离子Asp85发生点突变时，电化学响应显示在紧密相关的细菌视紫红质蛋白上大量发生。
[0573] GPR平衡离子的突变，Asp97Asn，已被构建。已报告该突变对光响应时，不泵质子，且有pKa=9.9的SB，与生理pH更接近。纯化蛋白在pH8.4和10.4之间进行可见颜色的变化。虽然pKa比周围依然高出>2pH单位，该蛋白作为电压传感器测定。该工程蛋白在此是指变形菌视紫红质光学质子传感器(PROPS)。
[0574] 光学吸收的灵敏不足以检测单个细胞中小量PROPS中的颜色变化。因此，需要寻找不同的分光镜读出装置。令人惊讶的是，在大肠杆菌中PROPS的表达显示清晰的定位于膜上的可见荧光(λexc=633nm，λem=700–750nm)。并且纯化的PROPS的荧光在高pH消失，这表明仅有质子化的SB在633nm激发下是具有荧光的。显示大肠杆菌–PROPS/+视黄醛，或+PROPS/-视黄醛的荧光比细胞+PROPS/+视黄醛(SOM)低100倍，这证实发射来自功能蛋白。
[0575] PROPS有很多有利于成像的光物理特性。红色激发和近红外发射落入了无背景自-3动荧光的谱带中。在pH7.4，纯化PROPS有荧光量子产率(QY)=1.0×10 ，但WT GPR具有-3 2
(QY)=1.3×10 。PROPS的低QY被其显著的耐光性部分抵消。在350mW/cm激光强度下，在>30分钟内PROPS的光漂白作用是其初始强度的50%，但在相同的测定条件下，有机荧光基团Alexa647在24s光漂白作用达到其的50%。PROPS包含一类新的远红荧光蛋白，其与GFP不同源。
(QY)=1.3×10 。PROPS的低QY被其显著的耐光性部分抵消。在350mW/cm激光强度下，在>30分钟内PROPS的光漂白作用是其初始强度的50%，但在相同的测定条件下，有机荧光基团Alexa647在24s光漂白作用达到其的50%。PROPS包含一类新的远红荧光蛋白，其与GFP不同源。
[0576] PROPS对质子的局部浓度敏感
[0577] 为检测PROPS对质子的灵敏度，通过pH敏感染料，BCECF，用CCCP处理以平衡内外pH的内侧完整的大肠杆菌，同时成像蛋白。两个荧光基团的荧光pH滴定显示PROPS随着pH增加荧光降低，确实对质子敏感。
[0578] 为了检测PROPS对电压的响应，采用EDTA和缬氨霉素处理大肠杆菌膜使其可渗透+K，并采用自制的流式小室使其受KCl电击。强度差异倍计算用于发挥作强加的膜电压功能。PROPS显示对KCl增强的电击显示显著的荧光降低，与模型一致，该模型中高的膜电压降低来自质子化状态的荧光。采用这些测定方法，计算每100mV的ΔF/F为500%。这些实验证实PROPS对细胞内pH和电压的线性组合是敏感的。
[0579] 表达PROPS的大肠杆菌有周期的荧光闪烁
[0580] 在大肠杆菌中表达PROPS，细胞固定化在玻璃盖玻片上，在倒置落射荧光显微镜上成像，在pH7下使细胞上的基本培养基缓缓流动。很多细胞显示细胞范围的荧光闪烁，其中荧光以高达8的因子增加。在细胞范围内这些闪烁是同时的(在10ms成像分辨率内)和同质的。闪烁与邻近细胞间是不相关的。
[0581] 在单个显微镜视野范围内标准的的同源种属细胞中，观察到各种瞬时动力学。最普遍的闪烁的上升时间是350ms，持续1s，并用1000ms回到基线。很多细胞是周期性闪烁，典型频率是0.2Hz。一些细胞偶尔有“缓慢闪烁”，持续20s到40s。快速闪烁和缓慢闪烁达到相同的最大强度。第3个部分是“铃声模式”，其中荧光振动振幅变小，频率升高，直到细胞在中等强度下沉淀。一些细胞在数分钟内休眠，后闪烁一次，然后回归黑暗；其他处于休眠周期的细胞被的突然发作的短暂闪烁打断。一些细胞永久明亮，一些细胞永久黑暗。具有两个不同的编码PROPS(阿拉伯糖或IPTG诱导的)的质粒的4株大肠杆菌显示闪烁。闪烁发生在通过聚左旋赖氨酸固定的细胞中，细胞放在裸的盖玻片，固定在琼脂糖垫上。在两个独立的显微镜成像系统中观察到闪烁。
[0582] 探索测定闪烁是否由PROPS表达诱导和/或成像中采用的激光诱导。通过在将激2
光强度增加2个数量级下监测相同视野内的细胞。闪烁保持不变直到达到100W/cm的阈值强度，此时闪烁显著增加。增加的闪烁原因不明。闪烁的迅速增加使PROPS处于两个状
2 2
态(i)在低强度下监测内源性活性(<50W/cm)和(ii)在高强度下增强活性(>100W/cm)。
为了增加发生闪烁细胞的分数，在高强度状态下进行其余的研究。
光强度增加2个数量级下监测相同视野内的细胞。闪烁保持不变直到达到100W/cm的阈值强度，此时闪烁显著增加。增加的闪烁原因不明。闪烁的迅速增加使PROPS处于两个状
2 2
态(i)在低强度下监测内源性活性(<50W/cm)和(ii)在高强度下增强活性(>100W/cm)。
为了增加发生闪烁细胞的分数，在高强度状态下进行其余的研究。
[0583] 还观察到菌种JY29显示一些“亚-阈值”闪烁，其升降时间短暂到4ms。该现象具有重要意义，因为其确立在时间量程上PROPS对电压波动的应答与神经元的动作电位的持续时间(1ms)进行对比。目前仍不清楚观察到的4ms时间范围是否是由PROPS的响应速度引起的或是由大肠杆菌中的内在的电压动力学引起的。
[0584] 闪烁是由于电压摆动，而不是pH
[0585] PROPS对电压和pH都敏感，但荧光中的瞬时闪烁可以是细胞内pH(pHi)，细胞外pH(pHo)和膜电位(ΔV)发挥作用。该研究力求测定这种未知的响应功能，并进一步测定闪烁是否是通过pHi，ΔV的变化或两者的变化引起。这些数量的独立测定认为是必需的。
[0586] 为了测量pHi，细胞用EDTA和pH荧光指示器，BCECF-AM孵化。该染料被细胞占用，转换为荧光膜不可透过的形式。BCECF的荧光和PROPS的荧光同时测定。pHo在6.5–9范围变化时，BCECF荧光是大体不变的，与早期的发现一致，即在该pHo范围内大肠杆菌维持pHi～7.8的稳态。在该pHo范围内PROPS基线（非闪烁）荧光也是大体不变的，这表明PROPS中的SB没有暴露于细胞外媒介。然后加入离子载体羰基氰化物间氯苯腙(CCCP)，致使细胞膜对质子是可渗透的，以便于pHo的变化诱发pHi的相应变化。对变化的pHo的响应，BCECF和PROPS荧光变化更多，表明PROPS对pHi敏感。采用CCCP处理带有BCECF的的细胞对pHo的阶跃变化的响应是足够迅速的，以致于如果在闪烁中pHi变化，BCECF荧光的变化也会是可检测的。
[0587] 用EDTA和BCECF制备闪烁细胞的新鲜样品，双色的胶片记录显示BCECF和PROPS同时发生的荧光(数据未显示)。这些细胞继续在PROPS通道中闪烁，但在测量误差范围内BCECF荧光保持不变。这表明在闪烁中pHi不变化或变化很小。
[0588] 为将闪烁和ΔV关联起来，同时观察PROPS荧光和大肠杆菌菌株JY29的鞭毛转动。这些细胞有粘性的鞭毛，粘合于玻璃盖玻片，导致细胞体以与细胞PMF相称的角速度转动。菌株JY29缺少CheY，因此其鞭毛运动不能反转方向。闪烁与转动的缓慢或间歇相关，表明闪烁随细胞PMF的降低而发生。既然pHo和pHi保持不变，膜电位必须变小来解释PMF的变化。
[0589] 闪烁对pH，苯甲酸酯，以及[Na+]和[K+]敏感
[0590] 给予闪烁细胞化学干扰用以推导电压变化的原理。在密封室的未搅动培养基中，闪烁经过～15分钟停止；但一旦加入新鲜的含氧培养基又重新开始。采用去氧酶（Oxyrase）从培养基中去除氧气也可以可逆的去除闪烁。从这些实验可得出结论，闪烁需要有氧呼吸。在充氧的基本培养基持续的温和的流动下，细胞闪烁持续>1hr。当加热到室温时，在基本培养基下储存多日的细胞在4℃下开始闪烁。
[0591] 闪烁对pHo高度敏感，仅在pH7和9之间发生。闪烁频率增加且在低pH时准时降低。在低pH时闪烁更可能是周期性的。pH末端(<6or>9.5)不可逆的去除闪烁，引起细胞在突然的转变后进入明亮状态。加入CCCP(20μg/mL)迅速地和不可逆地去除闪烁，使所有细胞变明亮。
[0592] 检测离子冲击以测定在电压摆动中的传导的离子。pH7.5时在仅包括Na+，K+，Cl-，+ +and PO4缓冲液中细胞能够闪烁>30分钟。仅去除Na 或K 不会立即停止闪烁，但去除两种离子引起显著的荧光变化。同样地，2M KCl的冲击引起显著效果，但2M NaCl的冲击不会。
该迹象并不针对特定离子，而是能够传输多种类型离子的通道。通过基因敲除进一步测试关于闪烁和溢出的机制。
该迹象并不针对特定离子，而是能够传输多种类型离子的通道。通过基因敲除进一步测试关于闪烁和溢出的机制。
[0593] PROPS的发展代表在分子探针方面的重要步骤。光遗传工具用于控制基于通道视紫红质II和嗜盐菌紫质的神经活性，随着该光遗传工具来临，细菌视紫红质作为神经科学的工具，已获得关注。PROPS增加了神经科学中一个重要工具，通过其用光探测电活动性的能力，。PROPS的远红外移动的激发和发射光谱可与视紫红质的当前成就简单组合，以充分提供膜电位的光学控制和读出装置。
[0594] 利用PROPS的独特能力，在呼吸的大肠杆菌中发现了其自发的电活动性。在Ca++适应中，脉冲的分离特性表明Crz1蛋白定位于酵母的细胞核，虽然酵母的定位以更缓慢的时间量程发生(以分钟计而不是秒)。大肠杆菌中电脉冲的生物学意义目前尚不清楚。
[0595] PROPS也可以用于测定(i)分子成分和细菌闪烁后面的机制，(ii)三种闪烁中的每一种在生物学上扮演的角色，(iii)其他的细胞行为和(iv)其他细菌菌株的闪烁模式。在一种具体实施方式，GPR被工程化为具有更高的荧光量子产率。GPR，其突变体，和其他细菌视紫红质是膜电位的荧光指示器有希望的家族。在一种具体实施方式中，PROPS及其变异体可用于监测膜电位在其他类型的电活性细胞中的变化，例如神经元。
[0596] 实施例2:Arch3可以反向运行从而提供电压传感器
[0597] 来自苏打嗜盐菌（Halorubrum sodomense）的古细菌视紫红质3(Arch3)是光驱动的外向质子泵，为其宿主捕获太阳能(Ihara，K.等.古生菌视紫红质的进展:基因复制和机能分化的进展速率变化。分子生物学杂志，第285卷，页码：163-174(1999))(Ihara，K.et al.Evolution of the archaeal rhodopsins:evolution rate changes by gene duplication and functional differentiation.J.Mol.Biol.285，163-174(1999))。最近将Arch3在哺乳动物神经元中表达，其中它可使神经活性光学沉默，且显示对黑暗中的内源性功能有最低限度的扰乱性(Chow，B.Y.等.通过光驱动质子泵引起的高性能的基因的靶向神经沉默。自然，第463卷，页码：98-102(2010))(Chow，B.Y.et al.High-performance genetically targetable optical neural silencing by light-driven proton pumps.Nature463，98-102(2010))。我们现在已经证明Arch3可以反向运行：膜电位可以改变蛋白的光学特性，从而提供通过与PROPS相似的机制发挥作用的电压传感器。
[0598] 中性pH Arch3是粉色的，在高pH时，蛋白变黄色(图8A)，在其pKa10.1为临界。基于其他细菌视紫红质的同源性(Lanyi，J.K.菌视紫质。生理学年评，第66卷，页码：665-688(2004)；riedrich，T.等。变形菌视紫红质是具有各种载体性质的光驱动质子泵。分子生物学杂志。第321卷，页码：821-838(2002))(Lanyi，J.K.Bacteriorhodopsin.Annu.Rev.Physiol.66，665-688(2004)；Friedrich，T.et al.Proteorhodopsin is a light-driven proton pump with variable vectoriality.J.Mol.Biol.321，821-838(2002))，我们把pH诱导的颜色变化归于希夫碱基(SB)的去质子化，希夫碱基连接视黄醛生色团和蛋白核心(Dioumaev，A.K.等。变形菌视紫红质的光化学反应循环中的质子递送，生物化学，第41卷，页码：5348-5358(2002))(Dioumaev，A.K.et al.Proton transfers in the photochemical reaction cycle of Proteorhodopsin.Biochemistry41，5348-5358(2002))。我们推断膜电位的变化可能改变SB中质子的局部电化学电位，翻倒了酸碱平衡和诱导相似的颜色变化(图6A)。电压诱导的颜色变化在菌视紫质的干燥薄膜的机制先前已经报道(Kolodner，P.，Lukashev，E.P.，Ching，Y.和Rousseau，D.L.在D85N突变体菌视紫质中电子领域诱导的希夫碱基去质子化。美国国家科学院学报，第93卷，页码：11618-11621(1996))(Kolodner,P.,Lukashev,E.P.,Ching,Y.&Rousseau,D.L.Electric-field-induced Schiff-base deprotonation in D85N mutant bacteriorhodopsin.Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.93,11618-11621(1996))，且形成PROPS的电压灵敏度基础(Kralj，J.M.，Hochbaum，D.R.，Douglass，A.D.和Cohen，A.E.采用荧光电压指示蛋白探测大肠杆菌的电子脉冲，科学，第333卷，页码：
345-348(2011))(Kralj，J.M.，Hochbaum，D.R.，Douglass，A.D.&Cohen，A.E.Electrical spiking in Escherichia coli probed with a fluorescent voltage indicating protein.Science333，345-348(2011))。
345-348(2011))(Kralj，J.M.，Hochbaum，D.R.，Douglass，A.D.&Cohen，A.E.Electrical spiking in Escherichia coli probed with a fluorescent voltage indicating protein.Science333，345-348(2011))。
[0599] 由于可得蛋白数量小，光学吸收的变化对单个细胞的检测是有挑战性的。然而，大部分细菌视紫红质的荧光是微弱的(Lenz，M.O.等。在变形菌视紫红质中视黄醛光异构化的第一步，生物物理学杂志，第91卷，页码：255-262(2006))(Lenz，M.O.et al.First steps of retinal photoisomerization in proteorhodopsin.Biophys.J.91，255-262(2006))，我们将纯化的Arch3作为前瞻性的荧光指示器(表6)。在中性pH时，Arch发射远红外荧光(λem=687nm)，在高pH时Arch没有荧光(图6B，图17)。Arch的荧光量子产率较低-4(9×10 )，但耐光性与GFP家族成员相比是可以媲美的(Shaner，N.C.，Steinbach，P.A.和Tsien，R.Y，荧光蛋白选择指南，自然方法学，第2卷，页码：905(2005))(Shaner，N.C.，Steinbach，P.A.&Tsien，R.Y.A guide to choosing fluorescent proteins.Nat.Meth.2，
905(2005))，产生光漂白作用之前大约eGFP质子的25%。宽吸收峰能够在波长λ=640nm激发，其他细胞成分在该波长无吸收，且远红外发射在几乎无背景自身荧光的光谱区发生。
905(2005))，产生光漂白作用之前大约eGFP质子的25%。宽吸收峰能够在波长λ=640nm激发，其他细胞成分在该波长无吸收，且远红外发射在几乎无背景自身荧光的光谱区发生。
[0600] HEK293细胞中Arch3的荧光容易在倒置荧光显微镜中成像，所述倒置荧光显微镜2
具有红色照明(λ=640nm，I=540W/cm)，高数值孔径的物镜，Cy5滤光镜套件和EMCCD相机。
细胞显示荧光主要位于质膜(图6C)。不表达Arch的细胞不具有荧光性。细胞曝露持续
10分钟后显示17%光漂白作用，且在该期间保持正常的形态学。
具有红色照明(λ=640nm，I=540W/cm)，高数值孔径的物镜，Cy5滤光镜套件和EMCCD相机。
细胞显示荧光主要位于质膜(图6C)。不表达Arch的细胞不具有荧光性。细胞曝露持续
10分钟后显示17%光漂白作用，且在该期间保持正常的形态学。
[0601] 如通过整细胞电压箝所测，表达Arch的HEK细胞的荧光对膜电压极度敏感。我们开发了一套规则系统已在加权和中结合像素强度，其输出结果是对采用常规电生理学测定的膜电位的最佳估计。图6C显示电压像素-权重矩阵的例子，表明电压敏感的蛋白定位于细胞膜；细胞内Arch产生荧光，但没有电压依赖性信号。在-150mV和+150mV之间荧光通过因子2增加，在整个范围的响应接近线性(图6D)。在上升和下降边缘，膜电位每一步的荧光相应发生在我们成像系统的500μs时间分辨率以内(图6E)。应用正弦式变化的膜电位导致正弦式变化的荧光；在f=1kHz，荧光摆动保持低频率振幅的55%(图18)。Arch报告1/2
电压梯度小到10mV，在时间量程<12s准确度为625μV/(Hz) (图19)。经过更长的时间量程，激光能量波动和细胞运动降低了准确度。
电压梯度小到10mV，在时间量程<12s准确度为625μV/(Hz) (图19)。经过更长的时间量程，激光能量波动和细胞运动降低了准确度。
[0602] 采用病毒递送，我们测定了Arch3在培养的大鼠海马神经元中作为电压指示器。表达Arch的神经元显示定位于细胞膜的荧光的电压依赖性变化。在整个细胞电流箝下，给予细胞注射200pA的电流脉冲，细胞显示脉冲。个体脉冲伴随清晰的可辨认的荧光增加(图
7A)。在2kHz图像采集率下，荧光(脉冲振幅:基线噪音)的信噪比是10.5发现脉冲的规则系统正确的鉴定了99.6%的脉冲（基于与同时记录的膜电位相比）(图7B)，其中假阳性率为0.7%(n=269脉冲)。观察累计曝光4分钟的单个细胞，没有检测到在静息电位或脉冲频率的变化。
7A)。在2kHz图像采集率下，荧光(脉冲振幅:基线噪音)的信噪比是10.5发现脉冲的规则系统正确的鉴定了99.6%的脉冲（基于与同时记录的膜电位相比）(图7B)，其中假阳性率为0.7%(n=269脉冲)。观察累计曝光4分钟的单个细胞，没有检测到在静息电位或脉冲频率的变化。
[0603] 在亚细胞分辨率下通过平均单个脉冲的多个瞬时记录的胶片，我们将动作电位动力学成像(图7C)。在体细胞中和体细胞附近，光学测定的动作电位波形是一致的，且与电记录的波形相匹配。然而，在很窄的动作电位峰中，延迟达1ms(图7D)。这些观察结果和多个箝在单个神经元中的记录一致(Stuart，G.J.和Sakmann，B.体细胞动作电位到大脑神经锥体细胞细胞树突的有效繁殖，自然，第367卷，页码：69-72(1994))；(Stuart，G.J.&Sakmann，B.Active propagation of somatic action potentials into neocortical pyramidal cell dendrites.Nature367，69-72(1994))；但是该记录是需要技术的，且仅探测膜电位在少数点上的变化。本结果表明Arch可用于描绘动作电位的细胞内动力学。
[0604] 在没有添加的视黄醛时，表达Arch的神经元显示伴随单独脉冲的清晰的可辨认的荧光闪烁(图20)，表明神经元包括足够的内源性视黄醛以提供一些蛋白。Arch和其他细菌视紫红质的体内实验已表明内源性的视黄醛足以控制光遗传神经活性25。因此Arch无需外源性视黄醛可在体内作为电压指示器发挥作用。
[0605] 640nm的光照与Arch吸收光谱(λ=558nm)相差很远，但成像激光依然在表达Arch3的HEK细胞中诱发10–20pA的光电流(图8A)。我们努力开发一种不扰乱膜电位但能维持电压灵敏度的突变体。菌视紫质中去除质子泵26的突变体D85N，因此我们将其同源突变体D95N引入到Arch3。该突变体去除光电流(图8A)，并改变了几个对电压传感重要的光物理性质(表6，图8，图21)。制作对膜电位变化的荧光响应的胶片，并显示视觉的结果。与Arch3WT相比Arch D95N更加灵敏和明亮，但响应更慢(图8A-8C)。
[0606] 在用于成像神经活性的照明条件下(I=1800W/cm2全内反射(TIR)模式)，在表达Arch3WT的神经元中光诱导的光电流一般是10pA。在电流钳条件下，该光电流将神经元的静息电位转移到-20mV。对于激活阈值附近的神经元，光电流可抑制激发(图9A)，因此我们探索作为神经元中的电压指示器的非泵变异体D95N。照明Arch D95N不干扰神经元中的膜电位(图9B)。
[0607] Arch3D95N报告了单个试验基础上的神经动作电位(图9C)。对去极化电流脉冲的响应是受瞬态特性的缓慢成分支配；但该响应的快泳成分足以指示动作电位。
[0608] 蛋白纯化
[0609] 编码Arch3-EGFP的慢病毒骨架质粒是来自Dr.Edward Boyden(MIT)的慷慨赠送。采用EcoRI和NcoI限定性酶切位点将该视紫红质的基因克隆到pet28b载体。利用正向引物(5’-TTATGCCAGGTACGCCAACTGGCTGTTTACCAC)(SEQ ID NO:22)和反向引物(5’-GTGGTAAACAGCCAGTTGGCGTACCTGGCATAA)(SEQ ID NO:23)采用QuikChangeII试剂盒(安捷伦)制作D95N突变体。
[0610] 根据Bergo，V.等人公开的内容(在传感视紫红质II-传感器复合物检测的构象变化。生物化学杂志，第278卷，页码：36556-36562(2003))(Conformational changes detected in a sensory rhodopsin II-transducer complex.J.Biol.Chem.278，36556-36562(2003))，表达Arch及其D95N突变体并从大肠杆菌中纯化。。简单的说，在37℃温度下大肠杆菌(菌株BL21，pet28b质粒)在有100μg/mL卡那霉素的1L LB中培养到O.D600为0.4。加入全反视黄醛(5μM)和诱导剂(IPTG0.5mM)，细胞在黑暗中另外培养3.5小时。将其离心后，在pH7.3的50mM Tris，2mM MgCl2中进行混悬反复悬浮，用超声破碎器溶解5分钟，由此收集细胞。溶解物离心然后将沉淀悬浮在加有1.5%十二烷基麦芽苷(DM)的PBS中。该混合物用玻璃/聚四氟乙烯树脂的Potter Elvehjem匀浆器匀浆，然后再次离心。浓缩上清液，并用30k微量离心浓缩器（Centricon）MWCO清洗后过滤，最终得到3mL体积。
[0611] Arch WT和D95N的分光镜鉴定
[0612] 采用具有DT-MINI-2-GS光源的海洋光学USB4000（Ocean Optics USB4000）分光计测定纯化的Arch3WT和D95N的吸收光谱。对于Arch3WT和D95N，吸收光谱在pH6和11之间发挥pH功能进行测量。为了测定荧光发射光谱，用100mW，532nm激光(Dragon Lasers，532GLM100)或25mW，633nm HeNe激光(Spectra-Physics)的非准直的光束照射石英管中的蛋白。用532nm拉曼陷波滤波器(Omega Optical，XR03)或710/100发射过滤器(Chroma)阻止散射激光，用垂直于照明方向的1000微米纤维采集荧光，其将光传送到海洋光学QE65000分光计。光谱积分2秒。
[0613] 通过比较积分的发射强度与染料ALEXA 647结合物样品的发射强度，测定Arch3WT和D95N的荧光量子产率。简单的说，采用可见吸收光谱测定染料和蛋白微摩-1 -1
尔溶液的浓度。我们使用对于ALEXA 647使用的消光系数为270000M cm 和对
-1 -1
于Arch3WT和D95N使用的消光系数为63000M cm ，假定这些细菌视紫红质和菌视紫质具有相同的消光系数。稀释染料溶液1:1000，得到与Arch3可比的荧光发射的溶液。用633nm激发测定染料和蛋白样品的荧光发射光谱。然后通过下面公式确定量子产率
尔溶液的浓度。我们使用对于ALEXA 647使用的消光系数为270000M cm 和对
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于Arch3WT和D95N使用的消光系数为63000M cm ，假定这些细菌视紫红质和菌视紫质具有相同的消光系数。稀释染料溶液1:1000，得到与Arch3可比的荧光发射的溶液。用633nm激发测定染料和蛋白样品的荧光发射光谱。然后通过下面公式确定量子产率
[0614]
[0615] 其中Fl是660到760nm的积分荧光，ε是633nm的消光系数和c是浓度。
[0616] Arch3和eGFP的相对耐光性
[0617] 为了直接比较Arch3和eGFP的耐光性，我们研究了Arch3-eGFP融合体的光漂白作用。该策略保证两种荧光基团的1:1化学计量学，简化分析。实验在透化细胞中进行，在显微镜下，与光漂白细胞一起显像记录。我们首先记录了640nm照明下Arch3的光漂白作用胶片；然后在相同的视野区域内，我们记录了488nm照明下eGFP的光漂白作用，调整其照射强度以产生与Arch3大约相同的初始计数率。从每个胶片的无蛋白区附近获得荧光背景水平，且从含有蛋白区域的强度中剔除。计算在每个光漂白时间轨迹下面积，得到每个荧光基团的可检测的光子总数的估计。通过不同的发射滤光器采集eGFP发射(λmax=509nm)和Arch发射(λmax=687nm)，因此原始计数被校正，以用于滤光器的传导光谱和EMCCD相机的波长依赖性的量子产率。结果是比光漂白作用之前发射的光子相对数对于eGFP:Arch3WT是3.9：1，对于eGFP：Arch D95N这个比率是10：1。
[0618] HEK细胞培养
[0619] 在37℃温度，5%CO2，加入10%FBS和盘尼西林-链霉素的DMEM溶液中培养HEK-293TM细胞。根据生产说明书，采用LIPOFECTAMINE 和PLUS试剂(Invitrogen)转染质粒，在
2
48-72小时后进行分析。记录前一天，以～5000细胞/cm密度在玻璃底皿(MatTek)重新平板培养细胞。
2
48-72小时后进行分析。记录前一天，以～5000细胞/cm密度在玻璃底皿(MatTek)重新平板培养细胞。
[0620] HEK细胞中内源性视黄醛的浓度是未知的，因此细胞补加视黄醛，是通过在生长培养基中稀释视黄醛储备溶液(40mM，DMSO)，使最终浓度为5μM，然后将细胞放回到孵化器1–3小时。中实施全部成像和电生理学实验均在台氏液（Tyrode）(含有，以nM计:125NaCl，2KCl，3CaCl2，1MgCl2，10HEPES，30葡萄糖，pH7.3，和用蔗糖调整到305-310mOsm)中进行。分析中仅包括在-10and-40mV之间具有反转电位的HEK细胞。
[0621] 显微镜检查法
[0622] 室温下在自制的倒置落射荧光显微镜中获得同时发生的荧光和整个细胞膜片箝记录。在100mW，640nm(CrystaLaser，DL638-100-O)下操作的二极管激光提供宽视野的照2
明，其强度一般在500–2000W/cm之间。为了使不聚焦碎片的背景信号最小化，常进行穿透物镜的全内反射荧光模式(TIRF)的照明。使用60x，1.45NA油浸物镜(Olympus)采集荧光发射，采用660–760nm通带放射滤光器(Chroma)从散射激发光中分离。为了动态荧光响+
应和动作电位的快速成像，在操作上至2000桢/s的Andor iXon860相机上获取影像(采+
用小的有用区域和像素合并)。具有高空间分辨率的缓慢成像在Andor iXon897EMCCD上获取。在LabView(国家仪器)编写的定制软件可用于同步化照明，采集成像，记录膜电位和细胞电流，并将电刺激应用于细胞。
明，其强度一般在500–2000W/cm之间。为了使不聚焦碎片的背景信号最小化，常进行穿透物镜的全内反射荧光模式(TIRF)的照明。使用60x，1.45NA油浸物镜(Olympus)采集荧光发射，采用660–760nm通带放射滤光器(Chroma)从散射激发光中分离。为了动态荧光响+
应和动作电位的快速成像，在操作上至2000桢/s的Andor iXon860相机上获取影像(采+
用小的有用区域和像素合并)。具有高空间分辨率的缓慢成像在Andor iXon897EMCCD上获取。在LabView(国家仪器)编写的定制软件可用于同步化照明，采集成像，记录膜电位和细胞电流，并将电刺激应用于细胞。
[0623] 电生理学
[0624] 丝状玻璃微量加液器(WPI)被拉伸到耐受3-10MΩ的尖端，火抛光，并用内部溶液(包括，以mM计:125葡萄糖酸钾，8NaCl，0.6MgCl2，0.1CaCl2，1EGTA，10HEPES，4Mg-ATP，0.4Na-GTP，pH7.3；和用蔗糖调整到295mOsm)充满。将微量加液器放置在Burleigh PCS5000显微操作器。采用AxoPatch200B放大器(Molecular Devices)获取整个细胞电压箝记录，用内部Bessel滤光器以2kHz过滤，后用国家仪器PCIE-6323采集板在10kHz数字化。采用HumBug噪音清除器(AutoMate Scientific)去除周围的60Hz噪音。对于需要快速调节跨膜电位的实验，预测串联电阻和整个细胞电容到95%，并校正到～50%。采用TM
PCIE-6323采集板生产电刺激，并将其传送到AXOPATCH ，然后将这些信号应用到恒定电流或恒定电压模式。
PCIE-6323采集板生产电刺激，并将其传送到AXOPATCH ，然后将这些信号应用到恒定电流或恒定电压模式。
[0625] 当暴露于强度为1800W/cm2的640nm照明的短暂(200ms)脉冲时，光电流测定在电压箝保持在0mV的HEK细胞上进行。
[0626] 所有的实验在室温下进行。
[0627] 从荧光成像估计膜电位
[0628] 特征化荧光电压指示器的一般做法是报告每100mV膜电位的ΔF/F值。我们感觉由于很多原因，该参数使用是有限的。首先，ΔF/F值对背景扣除的方法极度敏感，尤其对于指示器其在某些电压下F接近零。第二，ΔF/F没有包括关于信噪比的信息：一个指示器的F和ΔF值可能较小，其他的指示器可能有较大值，但是比例ΔF/F可能是相同的。第三，比例ΔF/F没有包括有关荧光瞬时稳定性的信息。由于细胞内运输，光漂白作用，或其他光物理学可能会导致出现浮动。
[0629] 因此我们力求找到电压指示器的性能的测定方法，其报告荧光信号的信息内容。我们找到从一系列荧光成像推测膜电位的规则系统。我们使用准确度作为指示器性能的测量方法，其中准确度是将估计的膜电位与真实膜电位（如膜片箝记录报告）匹配得到。
[0630] 用两个步骤从荧光确定估计膜电位 首先我们培养每个像素上膜电位和荧光关联的模型。我们使用高度简化的模型，给出在像素i和时间t的荧光信号Si(t)，由:
[0631] Si(t)=ai+biV(t)+εi(t)，[S1]
[0632] 其中ai和bi是位置依赖性的但是时间独立性的常数，膜电位V(t)是具有时间依赖性的但位置独立性的，和εi(t)是时间和空间不相关的高斯白噪音，该噪音具有像素依赖性的变量：
[0633]
[0634] 其中<>指时间上的平均。
[0635] 该模型忽略了荧光对电压响应的非线性，蛋白对电压变化，光漂白作用，细胞运动或梯度漂移的有限响应时间，和以下事实：如果εi(t)由散射噪音支配，那么该变量应该与Si(t)是成比例的，其分布应该是泊松分布（Poisson），不是高斯分布。尽管进行了这些简化，当这些相同数据组校准其应用的资料，Eq.S1模型提供了好的膜电位估计。
[0636] 在Eq.1中像素特异性的参数通过如下的最小二乘法测定。我们从平均荧光和平均电压规定偏差，通过
[0637] δSi(t)=Si(t)-
[0638] δV(t)=V(t)-.
[0639] 然后估计斜度 是:
[0640] 和补偿是：
[0641]
[0642] 电压的像素-像素估计形成于：
[0643]
[0644] 确定估计的准确度，由：
[0645]
[0646] 定义最大的可能权重矩阵，由:
[0647] [S2]
[0648] 该权重矩阵支持像素，其荧光是在训练集中对电压的准确估计。
[0649] 为了估计膜电位，与像素-像素估计组合，根据：
[0650] [S3]
[0651] 在Eq.S1的近似值中，Eq.S3是V(t)最大可能的估计值。
[0652] Arch3WT和D95N的斜坡和瞬时特性
[0653] 为了测定发挥膜电位功能的荧光，应用三角曲线，在-150mV到+150mV幅度内，周期是12s，视频记录是每桢100ms条件下进行。根据Eq.S2计算像素权重矩阵，将矩阵应用于胶片影像，以性每个桢上的荧光数量。这些荧光值被分为其最小值(V=-150mV)。该结果在图7和8作为V功能进行标绘的。该程序优选在细胞膜上从像素加权数据，但不需要任何背景去除。由手动选择的相当于质膜区域的像素获取类似的结果，无背景去除时作为V功能标绘其强度。来自原始荧光的背景扣除会产生相当大的ΔF/F值。
[0654] 以相似的方式测定瞬态特性，除了试验波形包括一系列电压脉冲，幅度是从-70mV到+30mV，持续时间300ms，周期是1s。细胞受试于20个波形重复，荧光响应是所有反复的平均。
[0655] Arch3WT和D95N的频率依赖性的响应功能
[0656] 测试包括连环系列正弦波的波形，每个持续时间2s，幅度100mV，零平均，频率在1Hz和1kHz之间在对数范围内均匀隔开(共31个频率)。波形在10kHz离散然后应用于细胞，荧光胶片以2kHz的桢频率获取。
[0657] 从低频率电压的荧光响应，计算提取 的模型参数。然后将这些参数用于计算所有频率的估计电压。
[0658] 将应用电压降采样到2kHz，以达到模拟瞬时响应的电压指示器的响应。对每个应用的频率，通过降采样的V(t)的傅里叶转换计算或分开傅里叶转换 该比例的幅度决定了响应灵敏度。适当补偿移液管电阻和细胞膜电容以获取准确的响应光谱是至关重要的。表达膜结合GFP的细胞对照实验不显示电压依赖性荧光。
[0659] 在常数V=0条件下，测定能谱 以能够计算任何应用的V(t)的信噪比。
[0660] 分子生物学和病毒生产
[0661] 编码Arch-EGFP(FCK:Arch-EGFP)的质粒直接用于HEK细胞实验，或根据已发表方法首先用于生产VSVg-类病毒((Chow，B.Y.等.由通过光驱动质子泵引起的高性能的基因的靶向神经沉默。自然，第463卷，页码：98-102(2010))(Chow，B.Y.et al.High-performance genetically targetable optical neural silencing by light-driven proton pumps.Nature463，98-102(2010))。对假型化，通过LIPOFECTAMINE和PLUS试剂(Invitrogen)用pDelta8.74，VSVg，和古细菌视紫红质的任何骨架质粒共同转染细胞。48小时候收集病毒上清液，然后用0.45μm的膜进行过滤。病毒培养基用于感染没有进一步浓缩的神经元。
[0662] 使用与大肠杆菌质粒相同的引物，根据生产说明，采用 试剂盒（Stratagene）引入D95N突变。
[0663] 神经细胞培养
[0664] 从BrainBits购买的E18大鼠海马，将其在1mg/mL木瓜蛋白酶(Worthington)中进行机械离解，然后将其在聚左旋赖氨酸和基质胶涂层的(BD Biosciences)玻璃底皿按照每皿5000–30000细胞进行平板培养。在N+培养基(100mL神经细胞培养基，2mL B27补充物，0.5mM谷氨酰胺，25μM谷氨酸，盘尼西林-链霉素)中孵化细胞3小时。在细胞中加入另外的300μL病毒培养基，过夜孵化，最终置于2mL体积的N+培养基中。两天后，将1.5mL体积的N+培养基加入到细胞中。在细胞中在4DIV加入1mL无谷氨酸的N+培养基，之后每隔3-4天附加1mL。使细胞生长直到10-14DIV，将该点时细胞用于实验。
[0665] 在与HEK细胞记录相同的条件下，从成熟的神经元获取整个细胞电流箝记录。校正串联电阻和吸管电容。仅用在-50和-70mV之间有静息电位的神经元用于分析。
[0666] 脉冲排序
[0667] 已经开发可用于电子记录V(t)或光学测定 的脉冲识别算法。用持续10ms的参考脉冲卷入输入痕迹。卷入的波形部分穿过使用者定义的阈值被认为是推定脉冲。在10ms(阈值附近的噪音诱导的低频干扰的结果)内下降的多重脉冲聚集，并被鉴定为一个。
[0668] 表6显示Arch3WT和Arch D95N的光学和电子响应。(1)在λ=532nm激发。(2)用假-1 -1 32 (3)定与菌视紫质相同的峰消光系数63000M cm (Ref. )，校正吸收光谱。 通过将λ=633nm(4) (5)
激发与Alexa647比较测定。 测定用eGFP的1:1融合. 在吸收光谱通过奇异值分解测(6) (7)
定。 从瞬态特性测定。Arch D95N有其快速(<0.5ms)响应(20%)的次要成分。 是
从荧光估计的膜电位。在HEK细胞中以f≥0.1Hz频率测定噪音。
激发与Alexa647比较测定。 测定用eGFP的1:1融合. 在吸收光谱通过奇异值分解测(6) (7)
定。 从瞬态特性测定。Arch D95N有其快速(<0.5ms)响应(20%)的次要成分。 是
从荧光估计的膜电位。在HEK细胞中以f≥0.1Hz频率测定噪音。
[0669]
[0670] 在此以引用的方式将引用的文献全部并入说明书和实施例。
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