[0003]本发明可以一般性地被认为是涉及检测癌细胞中表观遗传学 上(epigenetically)沉默的肿瘤抑制基因的方法，更具体地说，是针对 如食道癌或者头颈部癌症的诊断方法和治疗方法。

[0004]虽然癌症一般被认为是由于遗传变化如一个基因的突变而导 致的，但现在已经比较明确地认为不改变DNA序列的表观遗传学机制 也可以导致癌症。最常见的表观遗传学上的变化就是由于基因序列甲 基化而导致该基因的表达沉默，特别是在5′端上游的基因调控序列。 在CpG二核苷酸中，特别是在CpG富含区(CpG岛)中，与鸟嘌呤 相邻的胞嘧啶的甲基化常常参与高等真核生物的正常基因表达调控。 举个例子，CpG岛的过度甲基化与某些印记基因的转录失活相关，这 些基因就像女性X染色体上基因的一样失活。正常情况下不甲基化的 CpG岛的异常甲基化也在一些株化(immortalized)细胞和癌化细胞中 发现，而且这种甲基化还与人类癌症的某些特定的肿瘤抑制基因的转 录失活有关。

[0005]与癌症相关的基因变化，包括使基因表达丧失或者表达出缺陷 型基因产物的基因变化，以及表观遗传学机理，比如甲基化导致基因 转录的沉默，为确定一个细胞是否易于失去生长控制，也就是说是否 容易形成癌细胞提供了标记。比如，BRCA1基因的一个突变与乳腺癌 相关。这样就可以对一个有家族乳腺癌历史的女性身上的细胞作诊断 性测试，看看这位女性是否也有作为乳腺癌标记分子的BRCA1基因突 变。前列腺特异性抗原(PSA)是标记分子的另外一个例子，它是前列 腺癌的标记分子。虽然对于导致PSA表达的缺陷以及PSA在体内的正 常功能都一无所知，但是不可否认PSA提供了一个极有价值的癌症标 记分子，因为通过它就可以确定那些易于患前列腺癌或者是处在癌症 早期的男性，这样就有可能引进有效的治疗。最近，一个细胞因子信 号转导/受细胞因子诱导的SH2蛋白质家族成员的抑制子-SOCS-1 基因的甲基化转录沉默在各种各样的癌细胞中都有发现，包括肝癌、 多骨髓瘤和急性白血病。因此，用来检测SOCS-1基因甲基化状态的筛 选分析就能够提供一些与这些癌症相关的诊断信息。

[0006]因为癌症是潜伏性较强的疾病，在病情恶化之前没有明显的临 床特征和症状，标记分子的存在及其使用使得我们能够确定一个人是 否易于患某种癌症，甚至作出癌症早期的检测，这是具有相当大医学 价值的。可惜的是，对于大多数癌症，还没有这样的标记分子可以被 利用。这样，许多癌症患者都只有在病情恶化到需要做化疗或者已经 是无药可治的情况下才会寻求医学的帮助。因此，就有必要寻找到可 以用来检测癌症细胞的标记分子。本发明就满足了这样一个需要，并 且提供了额外的优点。发明概述

[0007]本发明是涉及用来确定至少一个与癌症相关的表观遗传学沉 默基因的方法。举一个例子来说明这样的方法是如何进行，在适合于 核酸分子与阵列上的互补核苷酸序列发生选择性杂交的条件下，将代 表一个基因组的核苷酸序列阵列和对应于在癌症细胞中表达的RNA 分子的核酸分子接触，这些癌症细胞与至少一种能够重新激活表观遗 传学沉默基因表达的试剂接触过；接着检测来自于与试剂接触过的癌 细胞的核酸分子与阵列上核苷酸序列的亚组之间杂交量的增加，这种 增加是相对于对应于这些癌细胞中表达的RNA的核酸分子与核苷酸 序列的该亚组的至少一个核苷酸序列的杂交而言，在所述的条件下， 可以认为选择性杂交量的增加确定了表观遗传学上沉默基因的重新激 活表达。

[0008]和阵列上的核苷酸序列接触的对应于RNA的核酸分子可以是 DNA或者RNA，也就是说包括例如cDNA、cRNA、mRNA或者任意 其他可以代表一个细胞中表达的RNA的核酸分子。能够重新激活表观 遗传学沉默基因的表达的试剂可以是脱甲基化试剂，如甲基转移酶抑 制剂(如5-氮杂-2′-脱氧胞苷；5Aza-dC)，组蛋白去酰基化酶抑制剂 (曲古抑菌素A；TSA)，或者是二者的组合。癌症细胞可以是肉瘤 或者癌，比如食道癌细胞。

[0009]本方法的一个具体实施方案的方法包括将阵列与对应于用5 Aza-dC，TSA，或者两者的组合接触过的癌细胞中表达的RNA的核酸 分子接触。举个例子，如果这里的癌细胞是食道鳞片状细胞癌(ESCC) 细胞，通过本方法确定的表观遗传学沉默的基因可以是表2中所列出 的基因中的一种，或者是这样的基因的组合。如果癌细胞是头颈部鳞 片状细胞癌(HNSCC)细胞，那么通过本方法确定的表观遗传学上沉 默的基因可以是表5或者表6中所列出的基因中的一种。作为本方案 的一个方面，如果癌细胞是ESCC细胞，表观遗传学沉默基因是载脂 蛋白D(ApoD)的基因，神经介肽U(NU)基因，swiprosin-2基因， Hep27基因，KIF5C基因，角蛋白14基因，转谷氨酰胺酶2基因，MUC1 基因，白介素-1受体-2(IL-1R2)基因，晶体蛋白α2基因，含LIM 的半胱氨酸富含蛋白(CRIP-1)基因，Rad基因，HEM45基因，KLF6 基因，卵泡抑素相关蛋白FLRG基因，XAP-5基因，Tbcld1基因，细 胞周期蛋白G1相互作用蛋白基因，或者是这些基因的组合。在本方案 的另外一个方面，表观遗传学沉默基因是ApoD基因，NU基因， swiprosin-2基因，细胞因子样因子-1(CLF-1)基因，CRIP-1基因，细 胞视黄醇结合蛋白(CRBP)基因，金属硫蛋白1G基因，角蛋白14 基因，IL-1R2基因，晶体蛋白α2基因，或者是这些基因的组合。

[0010]在另外一个实施方案中，至少一个通过本项发明提供的方法鉴 定出来的表观遗传学沉默基因是甲基化沉默基因。比如，在ESCC中 甲基化沉默基因可以是ApoD，NU，CLF-1，CRIP-1，claudin-3，非配 对蛋白2(uncoupling protein-2)，金属硫蛋白1G，转谷氨酰胺酶2， 或者是载脂蛋白C1基因，或者是这些基因的组合。在另外一个实施方 案中，表观遗传学沉默基因是一个肿瘤抑制基因。一方面，肿瘤抑制 基因是ApoD基因，NU基因，或者是CRIP-1基因，每一个在这里提 到的基因都表现出肿瘤抑制活性。另外一方面，肿瘤抑制基因可能是 神经介肽B基因，或者G蛋白信号通路受体2(RGS2)基因。

[0011]本发明也涉及一种鉴定细胞是否已经失去生长控制或者容易 失去生长控制的方法。举个例子，可以通过检测待测细胞中至少一个 基因的表观遗传学沉默，这些基因可以是表2所列的基因，如ApoD， NU，swiprosin-2，Hep27，KIF5C，角蛋白14，转谷氨酰胺酶2，MUC1， IL-1R2，晶体蛋白α2，CLF-1，CRIP-1，Rad，HEM45，KLF6，类卵 泡抑素蛋白FLRG，XAP-5，Tbcld1，细胞周期蛋白G1相互作用蛋白， CRBP，金属硫蛋白1G，claudin-3，非配对蛋白2，或者是载脂蛋白 C1基因，或者是这些基因的组合。

[0012]失去生长控制或者容易失去生长控制的待测细胞可以是瘤细 胞，比如前期恶性肿瘤细胞或者恶性肿瘤细胞(比如癌细胞)。这样， 该细胞可以是或者被怀疑是癌细胞，瘤细胞，或类似的细胞。在一种 具体实施方案中，失去生长控制或者将来易于失去生长控制的细胞， 或者是被怀疑具有类似状况的细胞是癌细胞。这个具体方案的一个方 面，癌细胞是ESCC细胞，或者是被怀疑为ESCC细胞的细胞。在这 个具体方案的另外一个方面，癌细胞是HNSCC细胞，或者是被怀疑为 HNSCC细胞的细胞。

[0013]在一种具体实施方案中，表观遗传学沉默包括甲基化沉默，其 中该方法可以通过检测待测细胞中一个或者更多基因的甲基化或者甲 基化沉默来实现。在这个方案的一个方面，甲基化沉默的检测是通过 将包含着含有基因的核酸分子的5′端调控区域的区域与甲基化敏感型 限制性内切酶接触来实现的，这种对甲基化敏感的内切酶在含有CpG 二核苷酸的甲基化胞嘧啶残基的5′调控区内的识别位点上剪切，这样， 核苷酸分子的切割就可以作为指示受测细胞中这个基因甲基化的标 志。针对这种方法可以应用的甲基化敏感型限制性内切酶例如Acc III， Ban I，BstN I，Msp I，或者Xma I。在这个实施方案的另一方面，甲 基化沉默的检测是通过将包含着含有基因的核酸分子的5′端调控区域 的区域与甲基化敏感型限制性内切酶接触来实现的，这种内切酶在含 有CpG二核苷酸的甲基化胞嘧啶残基的5′调控区内的识别位点处剪 切，假如所述CpG二核苷酸的胞嘧啶残基被去甲基化的话，这样没有 核酸分子的剪切发生提供了受测细胞中基因甲基化沉默的指示。针对 这种方法可以应用的甲基化敏感型限制性内切酶可以例如是Acc II， Ava I，BssH II，BstU I，Hpa II，或者Not I。

[0014]基因表达的甲基化沉默也可以这样来检测，将含有受测细胞中 基因的核酸分子的5′端调控区域与化学试剂接触，所述化学试剂会选 择性地修饰未甲基化的或者甲基化的胞嘧啶残基，并检测由于所述接 触而产生的产物，其中该产物是作为基因上CpG二核苷酸中胞嘧啶残 基甲基化的指示，由此检测待测细胞中基因的甲基化沉默。这样的产 物可以通过下列方法来检测，比如电泳方法，色谱方法，质谱方法， 或者是这些方法的组合。

[0015]在检测目标基因的5′端调控区域甲基化的方法的一个方面，化 学试剂是肼，由此就会生成肼处理的基因5′端调控区域，其中被肼处 理的5′端调控区域再进一步与能够剪切经肼修饰的胞嘧啶残基的试剂 接触，得到包含着含有基因的核酸分子的片断的产物；进一步按照分 子量大小分离这些片断，然后检测在这个基因的5′端调控区域中已知 含有胞嘧啶残基的位置处的缺口，其中该缺口就是基因中CpG二核苷 酸的胞嘧啶残基甲基化的指示，由此便可检测受测细胞中这个基因的 甲基化沉默。用来剪切经肼修饰的胞嘧啶残基的试剂可以是哌啶。

[0016]在检测目标基因的5′端调控区域甲基化的这样的方法的另外 一个方面，化学试剂可以包括亚硫酸氢根离子，经过它处理之后，这 个基因的5′端调控区域内未甲基化的胞嘧啶残基就变成亚硫酸氢盐修 饰的胞嘧啶残基，其中经过亚硫酸氢根离子处理过的基因进一步被暴 露在碱性条件下，这样亚硫酸氢盐修饰的胞嘧啶残基就变成了尿嘧啶 残基，然后再检测受测细胞中亚硫酸氢根离子处理过的基因的5′端调 控区域中尿嘧啶残基的数量或者分布，然后再与先经过亚硫酸氢根离 子处理再经过碱性条件处理的未甲基化的基因中尿嘧啶残基的数量或 者分布相比，如果受测细胞中基因的5′端调控区域中的尿嘧啶残基的 数量或者分布减少，那就说明这个基因的5′端调控区域中CpG二核苷 酸的胞嘧啶残基甲基化了。

[0017]在一个方面，尿嘧啶残基的数量或者分布可以被检测，例如， 通过测定经过亚硫酸氢盐修饰的基因5′端调控区域在暴露于碱性条件 后的核苷酸序列来检测。另一方面，尿嘧啶残基的数量或者分布也可 以这样来检测，在经过亚硫酸氢根离子处理的基因序列暴露于碱性条 件之后，将其与可以选择性地与含有尿嘧啶残基的基因5′端调控区域 杂交的寡聚核苷酸杂交，然后再检测寡聚核苷酸的选择性杂交。用来 杂交的寡聚核苷酸可以进一步包括可以检测的标记，比如放射性同位 素，顺磁性同位素，发光化合物，化学发光化合物，荧光化合物，金 属鳌合剂，酶，酶底物，受体，或者受体的配体，其中可以通过检测 这些标记来检测寡聚核苷酸的选择性杂交。另外还有一种检测的方法， 这些寡聚核苷酸可以作为引物延伸反应的底物，其中可以通过检测引 物延伸反应的产物来检测选择性杂交。

[0018]另外一个方面，尿嘧啶残基的数量或者分布还可以这样来检 测，通过在适合扩增的条件下将基因的5′端调控区域与一对扩增引物 (包括一个正向引物和反向引物)接触，其中该引物对的至少一个引 物包含可以选择性地与5′端调控区域中含有尿嘧啶残基的核苷酸序列 杂交的寡聚核苷酸，这样有扩增产物出现就可以作为基因5′端调控区 域中CpG二核苷酸中胞嘧啶残基甲基化的指示，由此待测细胞中基因 的甲基化沉默就可以得到检测。这样一对可以使得目标基因的序列发 生甲基化特异性扩增的甲基化特异性扩增引物对正如SEQ ID NOS：1 和2所例示(也可以参见表4；SEQ ID NOS：65至127，包括至少一个 正向引物(F1或者F2)和一个反向引物(R))。

[0019]在另外一个方面，尿嘧啶残基的数量或者分布可以通过将基因 的5′端调控区域在适合扩增的条件下与一对包括正向引物和反向引物 的扩增引物接触来检测，其中该引物对的两个引物都会选择性地与5′ 端调控区域中含有胞嘧啶残基的核苷酸序列杂交，而不与5′端调控区 域中含有尿嘧啶残基的对应的核苷酸序列杂交，因此扩增产物的出现 就代表基因5′端调控区域中CpG二核苷酸的胞嘧啶残基没有甲基化， 由此待测细胞中基因的甲基化沉默就可以得到检测。这样一对可以使 得含有非甲基化的5′端调控区域的目标基因序列发生特异性扩增的非 甲基化特异性扩增引物正如SEQ ID NOS：3和4所例示。

[0020]另外一个方面，尿嘧啶残基的数量或者分布可以这样来检测， 将基因的5′端调控区域在适合扩增的条件下与第一对扩增引物和第二 对扩增引物接触，其中第一对扩增引物包括正向引物和反向引物，而 且第一对引物中至少有一个引物包含可以选择性地与基因5′端调控区 域中含有尿嘧啶残基的核苷酸序列杂交的寡聚核苷酸，而第二对扩增 引物包括正向引物和反向引物，第二对引物的两个引物都与基因5′端 调控区域中含有胞嘧啶残基的核苷酸序列选择性杂交，而不与基因5′ 端调控区域中含有尿嘧啶残基的对应核苷酸序列杂交，这样通过第一 对引物产生的扩增产物，如果有的话，便具有一个第一长度，而通过 第二对引物产生的扩增产物，如果有的话，便具有一个第二长度，而 且它与第一长度不同，那么扩增产物的长度就可以用来指示尿嘧啶残 基的存在，这样也就可以指示这个基因5′端调控区域中CpG二核苷酸 的胞嘧啶残基的甲基化。

[0021]在另外一个实施方案中，甲基化沉默的检测可以通过用一种脱 甲基化试剂与待测细胞接触，然后检测被重新激活的由基因编码的 RNA的表达，再与没有用脱甲基化试剂接触过的细胞中RNA的表达 水平比较，检测出甲基化沉默来实现。这种脱甲基化试剂可以例如是 一种甲基转移酶抑制剂，比如5Aza-dC，由表观遗传学沉默基因编码 的RNA的重新激活的表达可以被检测，例如通过检测表达出来的 RNA，或者是其产物，比如RNA的反转录聚合酶链式反应(RT-PCR) 产物。

[0022]用于检测表观遗传学沉默基因的本方法能够方便地被适用于 高通量的形式，其中待测细胞或者待测细胞的抽提物是多份待测细胞、 待测细胞抽提物或者两者的组合中之一。这些多份待测细胞或者待测 细胞抽提物可以是一样的或者不同的，或者是其组合，比如某个特定 待测细胞的双倍，三倍或者更多倍数的重复，大量的不同的待测细胞 样品能够但并不是一定要排在一个阵列上，比如一种可寻址阵列 (addressable array)上(例如，在一个固体支持物比如微芯片，玻璃 板，或者珠子上)。更进一步，两个或者更多的基因可以在一种待测 细胞(或者抽提物)的单个样本上检测表观遗传学沉默，比如使用不 同标记的寡聚核苷酸，由此可以提供多元的形式。在一种实施方案中， 通过高通量和/或者多元化分析来检测的待测细胞可以进一步包含检测 对应的表现出受控生长的细胞或者其抽提物中基因5′端调控区域CpG 岛中CpG二核苷酸的胞嘧啶残基的甲基化，如果有的话。

[0023]通过本发明中提供的一种方法来检测的待测细胞(或者抽提 物)可以包括从一个个体比如人类个体中获得的样本的细胞。如此， 样本可以是器官样本，组织样本，或者是细胞样本，比如食道样本， 肝脏样本，皮肤样本，淋巴结样本，肾脏样本，肺样本，肌肉样本， 骨样本，肠胃样本，或者脑样本；或者是生物液体样本，比如，骨髓， 血液，血清，淋巴，脑脊液，唾液，痰，粪便，尿液，或者精液，它 们都含有包含着需要被检测表观遗传学沉默的一个或多个基因的核酸 分子。

[0024]本发明还涉及一种降低或者抑制不受控制的细胞生长的方法， 这些细胞表现出已有至少一个与癌症相关的基因在表观遗传学上的转 录沉默。这样的方法可以通过例如恢复在细胞中表观遗传学沉默基因 编码的多肽的表达来实现，这样就可以降低或者抑制不受控制的细胞 生长。在一种具体实施方案中，这些由表观遗传学沉默基因编码的多 肽的表达可以通过将细胞与去甲基化试剂，组蛋白去酰基酶抑制剂， 或者二者的组合接触来实现。这个方案的一个方面，至少有一个表观 遗传学沉默的基因是甲基化沉默基因，并且是将细胞与去甲基化试剂 比如5Aza-dC接触。一般来说，用去甲基化试剂来处理细胞都是通过 向个体中施用去甲基化试剂来实现，也就是说这些试剂在体内接触细 胞。

[0025]在另外一个具体实施方案中，细胞中由表观遗传学沉默基因编 码的多肽的表达是通过向细胞内引入编码该多肽的多聚核苷酸，然后 该多肽就可以从这种多聚核苷酸开始表达。这种多聚核苷酸可以但并 不一定需要被包含在一个载体中，比如，病毒载体，也可以被制成配 方，比如在像脂质体，微气泡，或者类似物的基质中。一般来说，向 细胞中引入多聚核苷酸都是通过向生物体中注入这些多聚核苷酸使得 这些包含在载体和/或者被制成配方的多聚核苷酸可以在体内接触细 胞。

[0026]可以在这样的方法中应用的多聚核苷酸可以是任何的对应于 表观遗传学沉默基因的多聚核苷酸。比如，在细胞是ESCC细胞的情 况下，表观遗传学沉默的基因可以是列在表2中的基因的一种，而多 聚核苷酸可以是编码由这个基因编码的多肽的核酸分子，这样的多聚 核苷酸的GeneBank登记序列号如表2所示。举个例子，表观遗传学沉 默的基因可以是ApoD，NU，swiprosin-2，Hep27，KIF5C，角蛋白14， 转谷氨酰胺酶2，MUC1，IL-I R2，晶体蛋白α2，CLF-1，CRIP-1， Rad，HEM45，KLF6，类卵泡抑素蛋白FLRG，XAP-5，Tbcld1，细 胞周期蛋白G1相互作用蛋白，CRBP，金属硫蛋白1G，claudin-3，非 配对蛋白2，或者是载脂蛋白C1基因，或者是这些基因的组合。而如 果细胞是一个HNSCC细胞，那么表观遗传学沉默的基因可以是表5 或表6中所列基因的一种，而多聚核苷酸可以是编码由这个基因编码 的多肽的核酸分子，这样的多聚核苷酸的GeneBank登记序列号如表5 和表6所示。

[0027]在一种具体实施方案中，细胞为ESCC细胞，表观遗传学沉默 基因是一个甲基化沉默的基因，比如ApoD，NU，CLF-1，CRIP-1， claudin-3，非配对蛋白2，金属硫蛋白1G，转谷氨酰胺酶2，或者是载 脂蛋白C1基因，或者是这些基因的组合。在另一种具体实施方案中， 细胞是ESCC细胞，表观遗传学沉默的基因是一个肿瘤抑制基因，比 如ApoD，NU，或者CRIP-1基因；或者肿瘤抑制基因包括神经介肽B， 或者G蛋白信号通路受体2(RGS2)基因；或者ESCC细胞含有这些 肿瘤抑制基因的组合。

[0028]本发明进一步涉及一种治疗癌症病人的方法，其中病人的癌细 胞表现出至少一个基因的遗传学沉默表达。这样的方法可以这样被实 施，例如通过恢复个体内癌细胞中至少一个表观遗传学沉默基因的表 达，由此治疗癌症病人。至少有一个表观遗传学沉默基因可以是甲基 化沉默基因，而且可以但并不一定是肿瘤抑制基因或者影响肿瘤抑制 基因表达或者活性的基因。

[0029]在一种具体实施方案中，癌症患者的癌细胞中含有至少一种甲 基化沉默基因，而且本方法包括注入个体内足够量的去甲基化试剂以 恢复个体内癌细胞中甲基化沉默基因的表达。在另外一个具体实施方 案中，癌症患者的癌细胞中含有至少一种表观遗传学沉默的基因，而 且本方法包括将至少一种编码由表观遗传学沉默基因编码的多肽的多 聚核苷酸注入个体内，并保证其量足以让病人体内癌细胞中至少一种 多肽表达。这样的多聚核苷酸可以包含在一个载体比如病毒载体中； 和/或者可以被配制在比如脂质体或者微气泡这样的基质中。

[0030]通过本发明提供的方法来处理的癌症可以是任何一种癌症，只 要这些癌症含有至少一个与癌症相关的表观遗传学沉默基因，这些癌 症包括例如癌(carcinoma)和肉瘤(sarcoma)。在一种具体实施方案 中，该癌症是食道鳞片状细胞癌，而表观遗传学沉默基因包括列在表2 中的一个或者更多的基因。比如表观遗传学沉默基因可以是ApoD， NU，swiprosin-2，Hep27，KIF5C，角蛋白14，转谷氨酰胺酶2，MUC1， IL-1R2，晶体蛋白α2，CLF-1，CRIP-1，Rad，HEM45，KLF6，类卵 泡抑素蛋白FLRG，XAP-5，Tbcld1，细胞周期蛋白G1相互作用蛋白， CRBP，金属硫蛋白1G，claudin-3，非配对蛋白2，或者是载脂蛋白 C1基因，或者是这些基因的组合。一个方面，表观遗传学沉默的基因 包含至少一个甲基化沉默的基因，比如ApoD，NU，CLF-1，CRIP-1， claudin-3，非配对蛋白2，金属硫蛋白1G，转谷氨酰胺酶2，或者是载 脂蛋白C1基因，或者是这些基因的组合。另外一个方面，表观遗传学 沉默的基因包括至少一个肿瘤抑制基因，比如ApoD，NU，和/或者 CRIP-1基因；或者是神经介肽B和/或RGS2基因；或者是它们的组合。 在另外一个具体实施方案中，该癌症是头颈部癌，表观遗传学沉默的 基因包括表5和6所列出的基因中的一种或者更多。

[0031]本发明还涉及一种为治疗癌症患者选择治疗策略的方法。这样 的方法可以这样来实施，例如通过本发明在这里公开的基因组筛选方 法，确定至少一个与癌症相关的表观遗传学沉默基因；然后再选择一 种可以有效地恢复所述的至少一种表观遗传学沉默基因在病人癌细胞 中的表达的试剂。这些试剂可以是，例如，编码本来由表观遗传学沉 默基因编码的多肽的多聚核苷酸，或者是编码由表2中所列基因来编 码的多肽的多聚核苷酸，这些基因可以是ApoD，NU，swiprosin-2， Hep27，KIF5C，角蛋白14，转谷氨酰胺酶2，MUC1，IL-1R2，晶体 蛋白α2，CLF-1，CRIP-1，Rad，HEM45，KLF6，类卵泡抑素蛋白FLRG， XAP-5，Tbcld1，细胞周期蛋白G1相互作用蛋白，CRBP，金属硫蛋 白1G，claudin-3，非配对蛋白2，或者是载脂蛋白C1基因，或者是这 些基因的组合。

[0032]在一种具体实施方案中，被鉴定出来的表观遗传学沉默基因包 括至少一个甲基化沉默基因，而选择的试剂是对癌细胞中所述的至少 一种甲基化沉默基因的恢复表达有用的试剂。在这个方法的一个方面， 被挑选出来的试剂包括编码本来由表观遗传学沉默基因编码的多肽的 多聚核苷酸，这些基因可以是ApoD，NU，CLF-1，CRIP-1，claudin-3， 非配对蛋白2，金属硫蛋白1G，转谷氨酰胺酶2，或者是载脂蛋白C1 基因。这个方法的另外一个方面，被挑选出来的试剂包括一种去甲基 化试剂，比如5Aza-dC。

[0033]在另外一种具体实施方案中，被鉴定出来的表观遗传学沉默基 因包括至少一个肿瘤抑制基因，而选择出来的试剂是对癌细胞中由所 述的表观遗传学沉默的肿瘤抑制基因编码的多肽的恢复表达有用的试 剂。例如，这种肿瘤抑制基因可以是ApoD，NU，或者CRIP-1基因， 或者神经介肽B和/或RGS2基因，或者是这些基因的组合，被选择出 来的试剂可以是编码ApoD，NU，CRIP-1基因，神经介肽B，和/或者 RGS2基因产物的多聚核苷酸。

[0034]本发明也涉及一种治疗患有食道鳞片状细胞癌(ESCC)的病 人的方法，其中与食道鳞片状细胞癌相关的细胞含有至少一个表观遗 传学沉默的基因。这样的方法可以这样被实施，例如通过向病人体内 注入一定量的使至少一种表观遗传学沉默基因的表达得以恢复的试 剂，这种试剂的用量要达到足够使得与食道鳞片状细胞癌相关的细胞 中表观遗传学基因恢复表达，然后就可以达到治疗病人的目的。在一 种具体实施方案中，该试剂包括编码至少一种表观遗传学沉默基因的 多聚核苷酸，特别是包含表2中所列基因的编码序列的多聚核苷酸， 比如包含下列基因的编码序列的多聚核苷酸：ApoD，NU，swiprosin-2， Hep27，KIF5C，角蛋白14，转谷氨酰胺酶2，MUC1，IL-1 R2，晶体 蛋白α2，CLF-1，CRIP-1，Rad，HEM45，KLF6，类卵泡抑素蛋白FLRG， XAP-5，Tbcld1，细胞周期蛋白G1相互作用蛋白，CRBP，金属硫蛋 白1G，claudin-3，非配对蛋白2，或者是载脂蛋白C1基因，或者是这 些基因的组合。

[0035]在另外一个具体实施方案中，至少一个表观遗传学沉默基因是 甲基化沉默基因，而治疗病人的试剂则包含编码由甲基化沉默基因编 码的多肽的多聚核苷酸。对于这些多聚核苷酸，可以包含下列基因的 编码序列：ApoD，NU，CLF-1，CRIP-1，claudin-3，非配对蛋白2， 金属硫蛋白1G，转谷氨酰胺酶2，或者是载脂蛋白C1基因，或者是 这些基因的组合。

[0036]在另外一个具体实施方案中，至少有一个表观遗传学沉默基因 包括肿瘤抑制基因，而治疗病人的方法包括恢复病人体内的ESCC细 胞中肿瘤抑制基因的表达。比如，肿瘤抑制基因可以是ApoD，NU， 或者CRIP-1；或者可以是神经介肽B，或者RGS2基因；或者可以是 包含这些基因的至少一种的组合；而所述试剂可以是编码一个或者多 个表观遗传学沉默的肿瘤抑制基因的多聚核苷酸。在本发明的方法中 有效的试剂可以被直接施于体内这些细胞的位置，或者被局部地施用， 或者被系统地施用，只要是药物能够和体内的ESCC细胞接触。

[0037]本发明进一步涉及分离的寡聚核苷酸，其具有正如SEQ ID NOS：1至127中的任何一个所阐述的核苷酸序列，本发明还涉及一组 分离的寡聚核苷酸，其包括至少两种列在SEQ ID NOS：1至127中的寡 聚核苷酸。另外，本发明也涉及扩增引物对，其包括一个正向引物和 一个反向引物，其序列如SEQ ID NOS：1和2所例示，和SEQ ID NOS：3 和4所例示(请参见表3，SEQ ID NOS：7和8，SEQ ID NOS：9和10 等；表4，SEQ ID NOS：65和67或者SEQ ID NOS：66和67；SEQ ID NOS：68和69；SEQ ID NOS：70和72或者SEQ ID NOS：71和72等)， 这些引物可以扩增出表2中所列的基因的核苷酸序列。一方面，本发 明的扩增引物对可以用来特异性地扩增核酸分子的甲基化5′端调控区 域，其中一对这样的扩增引物如SEQ ID NOS：1和2所例示，它们可以 扩增具有甲基化5′端调控区域的ApoD基因，通过包括由表4所列的 SEQ ID NOS：65至124的正向引物(F1或者F2)和反向引物(R)的 引物对，可以扩增出具有甲基化5′端调控区域的基因。另外一个方面， 本发明的扩增引物对可以用来特异性地扩增核酸分子的非甲基化5′端 调控区域，其中一对这样的引物如SEQ ID NOS：3和4所例示，它们可 以扩增具有非甲基化5′端调控区域的ApoD基因。

[0038]本发明还涉及试剂盒，其含有至少一种本发明的分离的寡聚核 苷酸，其包括例如多种这样的分离的寡聚核苷酸。在一个具体实施方 案中，本发明的试剂盒的多种分离的寡聚核苷酸包括至少一对扩增引 物(即，一个正向引物和一个反向引物)，还可以包括多个扩增引物 对。这样，本发明的试剂盒可以包含，比如一对或者很多对甲基化特 异性扩增引物，非甲基化特异性扩增引物，或者是甲基化特异性扩增 引物和非甲基化特异性扩增引物的组合，这种组合包括用来扩增特定 基因的甲基化形式或者非甲基化形式的甲基化特异性引物对和非甲基 化特异性引物对，而这些特定基因在一种或者更多种类型的癌症细胞 中是处于甲基化沉默状态或者被怀疑是处于这样的状态。

[0039]本发明的试剂盒可以进一步包括一些额外的试剂，这些试剂 都是有用的，比如对于试剂盒中的寡聚核苷酸的有效应用来说是有用 的。例如，如果试剂盒包括一对或者多对甲基化特异性或者非甲基化 特异性扩增引物，该试剂盒还可以进一步包括比如用于对照的寡聚核 苷酸，它可以是甲基化的也可以是非甲基化的；一种或者更多种修饰 甲基化胞嘧啶残基的试剂，和/或者一种或者多种用于实现一个扩增反 应的试剂。如果试剂盒包含一种或者多种可以选择性地与甲基化或者 非甲基化基因序列杂交的寡聚核苷酸，那么这个试剂盒还可以进一步 包含比如一种甲基化敏感的限制性内切酶。附图说明

[0040]图1提供了挑选肿瘤抑制基因(TSGs)的流程图。三个食道 鳞片状细胞癌(ESCC)细胞系在用1至5μM 5-氮杂-2′-脱氧胞苷(5 Aza-dC)±300nM曲古抑菌素A(TSA)处理之后，与含有12599个 寡聚核苷酸的微阵列进行cRNA杂交，由此筛选可能的TSG。有超过 500个独特的基因被鉴定出来，它们在经过处理之后都表现出大于或等 于3倍的表达增加(表1)。如果只挑选在这些受测的ESCC细胞系中 普遍表达上调的基因，那么候选基因的数目就会减少(120个基因)， 根据表达谱并去掉未知的基因，基因数目就更少了。从挑选之后剩下 的58个基因中选出22个基因进行启动子超甲基化的检测，这种检测 是通过在ESCC细胞系中作直接的测序或者作甲基化特异的PCR反应 (MSP)来完成的，结果有13个基因得到确认。这13个基因中有10 个在ESCC组织中是甲基化的，而这10个基因中又有3个基因在集落 聚集检验(colony focus assay)中发现具有生长抑制活性。上标字母标 记如下：a)在多于两个ESCC细胞系中重新表达；b)如果没有证据表明 在正常食道中表达就将其去除；c)挑选22个具有富含CpG的启动子的 基因用于检测其在细胞系中的甲基化；d)13个基因中的10个基因被确 认在原发性肿瘤组织中具有启动子被甲基化的特征；和e)挑选10个基 因中的3个基因而且确认这3个基因具有肿瘤抑制活性。

[0041]图2说明的是在原发性肿瘤中基因的甲基化和基因表达。对于 在ESCC细胞系表现出甲基化的13个待测基因，在原发性肿瘤中检测 了它们的甲基化状态。黑色的方格表示启动子区域被甲基化；带斑点 的方格表示通过直接测序发现其部分(低水平)甲基化。T，表示肿瘤 组织；N，表示正常食道粘膜。

[0042]图3说明的是KYSE30ESCC细胞的集落形成实验结果。实验 结果是三次独立实验的平均值。转染了Stat3C(2)，Apo D(3)，CRIP1(4) 或者p53(5)的细胞的集落形成效率与对照(1；空的pcDNA3TM载体) 相比。对照克隆的数目被看成是100％的集落形成效率；Apo D＝61％； CRIP 1＝18％。在另外一个实验中，在存在PBS或者神经介肽U(终 浓度为100μM)的情况下，pcDNA3(对照)转染的细胞用G418进行 两周的筛选后，集落形成的结果表明在神经介肽U处理的细胞中集落 形成效率降低到了43％。发明详述

[0043]本发明基于发展一种鉴定基因组中表观遗传学沉默基因的方 法，特别是对于肿瘤抑制基因，而且是在表现出失去生长控制或者容 易失去生长控制的细胞的基因组中鉴定，比如癌症细胞的基因组。本 发明通过鉴定ESCC细胞中565个表达上调的基因来说明其具体细节， 这些细胞分别用去甲基化试剂，组蛋白脱乙酰酶抑制剂，或者是二者 的组合来处理，这些基因中包括甲基化沉默基因和肿瘤抑制基因(见 表1)。更进一步，有58个普遍地表达上调的基因被确认，其中有53 个含有CpG岛，而且其中有44个基因含有高密度的CpG岛。这53 个基因中有25个基因被随机挑选出来，发现这些被挑选出来的基因具 有在脱甲基化试剂处理之后重新表达的特性，而且其中还有3个基因 被确认具有肿瘤抑制活性(见实施例1)。再者，这种基因组筛选的方 法还通过鉴定在头颈部鳞片状细胞癌(HNSCC)细胞中表观遗传学沉 默的基因来进一步例示(见表5，表6，和实施例2)。因此，本方法 提供了一种鉴定与癌症相关的表观遗传学沉默基因的方法，还进一步 提供了检测与基因表达的表观遗传学沉默相关的癌症的方法，以及治 疗患有这样的癌症的病人的方法和对于实施本方法有用的组合物。

[0044]启动子的高度甲基化是肿瘤抑制基因失活的常见途径。正如在 这里公开的一样，一种用来确定甲基化的基因的方法被提供，其基于 食道癌细胞系中表观遗传学沉默的药物学揭露。这种方法和选择算法 非常强大，可以鉴定原发性食道肿瘤组织中的大量新的甲基化基因。 这些被鉴定出来的甲基化基因提供了诊断和治疗的靶点，而且还进一 步提供了对肿瘤生物学的启示。三个被鉴定出来的基因，神经介肽U (NU)，半胱氨酸富含型肠道蛋白1(CRIP1)，和载脂蛋白D(ApoD)， 在癌细胞中被过量表达时表现出强有效的肿瘤抑制活性。

[0045]利用含有12599个基因的微阵列，基于5-氮杂-2′-脱氧胞苷(5 Aza-dC)和曲古抑菌素A(TSA)对表观遗传学沉默的肿瘤抑制基因 的功能性重新激活，对ESCC细胞中通常是失活的肿瘤抑制基因进行 全面的筛选。在通过本方法鉴定出来的58基因中，有44个(76％)基 因的启动子区都含有高密度的CpG岛。在细胞系中22个被测基因中 有13基因的启动子都被甲基化了，有10个基因还是在原代ESCC细 胞中被甲基化的，而且伴随着在mRNA水平上的沉默。在ESCC细胞 系中有强有效的生长抑制活性的基因包括CRIP1，ApoD和NU基因， 它们的生长抑制活性是通过克隆集落实验(colony focus assays)来证 明的。在这里公开的结果表明表观遗传学沉默的药物学逆转是一种有 效的全面鉴定人类癌症中肿瘤抑制基因的方法。

[0046]食道的癌症是第八大最常见的恶性肿瘤，而且被认为是世界上 第六大最常见的死亡原因(Pissani等，Int.J.Cancer 80：870-873，1999)。 不同组织类型的食道癌的发生频率都不一样，但是就世界范围内来说， 鳞片状细胞癌是最主要的类型。相当多的流行病学证据表明，酒精， 烟草，缺乏维他命/保护性抗氧化剂的食物，致癌物质(比如，频繁摄 入腌制的蔬菜)和热伤害是ESCC重要的致病源(参见，比如，Chen 等，Int.J.Cancer 820-822，1995；Garidou等，Int.J.Cancer 68：295-299， 1996)。分子生物学方面最近的进展也揭示了在人类ESCC细胞的p53 和p16/Rb肿瘤抑制通路中常见的遗传学或者表观遗传学方面的改变 (Xu等，Cancer Res.62，3493-3497，2002；Montesano等，Int.J.Cancer 69：225-235，1996；Mandard等，Mutat.Res.462：335-342，2000)。分子靶 点的进一步确认可以使得在分子水平上预防，诊断和治疗鳞片状食道 癌。尽管如此，和在其他癌症中一样，在ESCC中普遍地失活的肿瘤 抑制基因(TSG)在基因组范围内的全面检测依然是令人困惑的。

[0047]除了遗传学上的改变，在DNA甲基化方面的改变，在哺乳动 物细胞中出现的表观遗传学过程，也是人类癌症的一个标记(Baylin 等，Hum.Mol.Genet.10：687-692，2001)。许多基因的启动子区域，特 别是那些“持家”基因的启动子，都含有许多的CpG二核苷酸，而这 在基因组的其他部分是比较少见的。这些区域已经被命名为“CpG岛”， 除了在失活的X染色体和印记基因上的基因，在正常细胞中CpG岛是 没有甲基化的(参见Baylin等，supra，2001)。这种保护是非常重要的， 因为CpG岛的甲基化会导致与其相关的基因的表达失活。在致癌过程 中，全面的过度甲基化常常伴随着特定启动子的高密度甲基化 (Yoshikawa等，Nature Genet.28：29-35，2001，这篇文献在此引入作为 参考；也请参见，Merlo等，Nature Med.1：686，1995；Dammann等，Nat. Genet.25：315-319，2000；Li等，Cell 109：113-124，2002)。许多研究都表 明与启动子的过度甲基化相联系的肿瘤抑制基因的沉默是人类癌症中 常见的特征，而且是另外一种肿瘤抑制基因功能丧失的机制。比如， p16的过度甲基化伴随着基因的表达失活，而且还是许多固体恶性肿瘤 的常见特征(Merlo等，supra，1995)。过度甲基化也与肿瘤抑制基因 VHL的失活相关，而且在没有致失活性的点突变的情况下在一部分肾 透明细胞癌中都有这种现象发生(Herman等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：9700-9704，1994；Meyer等，Int.J.Cancer 5：650-653，2000)，而与p15 的表达丧失相关的过度甲基化是许多急性白血病的一个特征(Herman 等，Cancer Res.56：722-727，1996)。其他肿瘤抑制基因比如错配修复基 因的转录沉默也确定过度甲基化是人类癌症中肿瘤抑制功能丧失的常 见机制之一。因此，人类肿瘤中越来越多的肿瘤抑制基因都发现同时 具有遗传学和表观遗传学上的失活。

[0048]因为启动子的过度甲基化与基因表达的沉默相关，因此关于整 个基因组的甲基化模式方面的知识，有时侯也称之为“甲基化组 (methylsome)”(Feinberg，Nat.Genet.27：9-10，2001)，能够提供一 种有效地鉴定在肿瘤形成过程中失活的肿瘤抑制基因的手段。5Aza-dC 能够整合到基因组DNA中并与甲基化转移酶的活性中心形成共价复 合物，因此可被用来解除基因的表观遗传学失活。这种自杀性的抑制 去除了甲基转移酶的活性，结果达到了一般性去甲基化的目的。然而， 染色质是由DNA和组蛋白构成的复合物，组蛋白的乙酰化作用也涉及 基因的转录(Pennisi，Science 275：155-157，1997；Marks等，Nat.Rev. Cancer 3：194-2022001)。另外，DNA的甲基化有助于建模组蛋白的 乙酰化作用(Gray和Teh，Curr.Mol.Med.1：401-429，2001)。甲基CpG 结合蛋白MeCP2出现在一个具备组蛋白脱乙酰酶活性的复合体中，而 DNA甲基转移酶与组蛋白脱乙酰酶2(HDAC2)以及辅阻遏物DMAP1 结合(Rountree等，Nat.Genet.25：269-277，2000)。因此，高密度甲基 化的DNA与转录上抑制的染色质相关，其特征为存在较低水平的乙酰 基化的组蛋白。TSA是一种组蛋白脱乙酰酶抑制剂，能够使依赖于甲 基化的启动子模板的转录抑制染色质的形成过程失败(Yoshida和 Horinouchi，Ann.NY Acad.Sci.886：23-26，1999)。表观遗传学改变因此 是动态联系的，利用TSA在去甲基化和组蛋白脱乙酰酶抑制之间建立 了协同作用，这比单独的5Aza-dC使癌细胞中沉默的基因重新激活的 效果要更加好(Cameron等，Nature Genet.21：103-107，1999；Suzuki等， Nature Genet.31：141-149，2002)。正如在这里公开的，用5Aza-dC和 TSA对ESCC细胞进行药物学上的处理，接着进行的cRNA微阵列分 析，全面地鉴定癌症中表观遗传学上失活的基因。这种方法鉴定出了 大量含有高密度甲基化启动子的基因，而且进一步的研究表明其中一 部分被鉴定出来的基因在原发性肿瘤中常常是处于失活状态的，而且 在失活之前具有肿瘤抑制活性。

[0049]相应地，鉴定表观遗传学沉默基因的方法在这里被提出来，比 如，鉴定甲基化沉默基因，包括与癌症相关的肿瘤抑制基因。在一种 具体实施方案中，本发明提供了一种鉴定至少一种与至少一种癌症相 关的表观遗传学沉默基因的方法。而在这里提到的“至少一个”是指 1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，或者更多。比如，这里公开的微阵列方法鉴定 出了565个表观遗传学沉默的基因，主要是根据它们在ESCC细胞中 经过去甲基化试剂和/或组蛋白脱乙酰酶抑制剂处理之后表达量上升的 能力来判断的。进一步，在被鉴定为在ESCC细胞中表观遗传学上沉 默的基因中有数个被确定为具有肿瘤抑制基因的特征(也请参见，表2， 5和6)。

[0050]术语“表观遗传学沉默”，常常用在一个基因上，意思是这个 基因已经不能够被转录了，或者与相应的对照细胞(比如正常细胞) 中对应的基因的表达水平相比转录水平降低了，其机制是不同于普通 的遗传改变的。基因沉默的表观遗传学机制已经被研究的很清楚了， 它包括，例如，基因5’端调控区域中CpG岛中的CpG二核苷酸过度 甲基化，和由例如组蛋白乙酰化引起的染色质的结构变化，这样基因 的转录就被减弱或者抑制了。在这里公开了检测基因的表观遗传学沉 默的方法，它包括，例如，检测细胞在与减除表观遗传学沉默的试剂 接触之后基因的重新表达(重新激活)，举个例子，如果沉默是由于 过度甲基化导致的，那么就检测细胞在与去甲基化试剂接触之后基因 的重新激活。

[0051]这里提到的“甲基化”或者“过度甲基化”这些名词，也常常 用来形容一个基因，意指与基因相关的CpG岛中的CpG二核苷酸中的 胞嘧啶残基在5’的位置被甲基化，即5’-甲基化胞嘧啶。此处提到的 “甲基化状态(methylation status)”这个名词表示的是一种相对丰度， 包括在一个CpG岛上CpG二核苷酸中的甲基化胞嘧啶残基的有或无。 一般地，具备转录活性的基因的CpG岛上的胞嘧啶残基是没有甲基化 的，因此检测到CpG岛上甲基化的胞嘧啶残基说明这个基因的表达水 平降低了或者是被抑制了。相应地，这里提到的“甲基化沉默 (methylation silenced)”基因是指由于基因5’调控区域的CpG岛中 的CpG二核苷酸的过度甲基化，这个基因不再被转录了，或者是与相 应的对照细胞(一般是正常细胞)中相应基因的转录水平相比转录水 平降低了。甲基化基因表达沉默的一个结果就是含有这个基因的细胞 具有降低水平的或者是完全缺乏由这个基因编码的多肽(即，基因产 物)，使得细胞中通常由该基因产物负责的所有功能下降或者缺乏。

[0052]本发明涉及鉴定至少一种与癌症相关的表观遗传学沉默基因 的方法。这样的方法可以通过下面的途径来实现，比如，在适合于核 酸分子与阵列上的互补核苷酸序列选择性杂交的条件下，将代表基因 组的核苷酸序列阵列与对应于癌细胞中表达的RNA的核酸分子接触， 而这些癌细胞是用至少一种能够重新激活表观遗传学沉默基因的表达 的试剂接触过的；然后检测用试剂接触过的癌细胞的核酸分子与阵列 上某个部分的核苷酸序列的增高的杂交水平，这种增高是相对于在所 述条件下对应于癌细胞中表达的RNA的核酸分子与该部分的核苷酸 序列中的至少一个序列的杂交水平而言，如果有的话，因而选择性杂 交量的增加就可以鉴定表观遗传学沉默基因的重新激活的表达。

[0053]这里提到的“代表基因组的核苷酸序列阵列”是指一组有组织 的核苷酸序列连接到一块固体支持物上，比如一块微芯片或者玻璃板， 其中这些序列就可以特异地和选择性地与细胞中表达的核酸分子杂 交。这种阵列是基于要研究的细胞所来源的生物而选择的，一般是代 表一个真核生物细胞的基因组，特别是哺乳动物细胞，而且优选人类 细胞。一般地，能够“代表”基因组的一个阵列的探针至少能够鉴定 细胞中表达的核酸分子的10％，一般都是至少是20％或者40％，常常 是50％到70％，有些情况下是至少80％或者90％，优选是能够鉴定所 有表达的核酸分子。应该意识到，阵列能够代表越多的基因，就表示 有越多的可能会鉴定到癌症细胞中所有的表观遗传学沉默的基因。含 有能够代表某些特定基因组的核苷酸序列的阵列可以通过已知的方法 来制备，或者是通过商业资源(比如Affymetrix；Invitrogen公司)购买， 比如在本研究中使用的GeneChipTM人类基因组U95AV2阵列 (Affymetrix)(见实施例1)。

[0054]这里提到的细胞的“对应于RNA的核酸分子”是指比如mRNA 或者polyA+RNA的RNA分子，用细胞中的RNA作为模板获得的 cDNA，或者是用RNA或者cDNA作为模板获得的的cRNA。为了实 践本发明的方法，这些对应于细胞中的RNA的核酸分子一般都有可以 检测的标记，比如，带有放射性同位素，顺磁性同位素，发光化合物， 化学发光化合物，荧光化合物，金属螯合剂，酶，酶底物，受体，或 者受体的配体；或者是能够比如用一个可以检测的标记探针来检测， 这样核酸分子与阵列上的核苷酸序列的杂交就可以被检测。因此，与 阵列上的核苷酸序列接触的对应于RNA的核酸分子可以是DNA或者 RNA，包括，例如，cDNA，cRNA，mRNA，或者任何可以代表细胞 中表达的RNA的核酸分子。那些能够重新激活表观遗传学沉默基因的 试剂可以是一种去甲基化试剂比如甲基转移酶抑制剂(比如 5Aza-dC)，一种组蛋白脱乙酰酶抑制剂(比如TSA)，或者是它们的 组合。

[0055]根据本发明中的方法，至少有一种(比如1，2，3，4，5，或 者更多种)表观遗传学沉默基因与至少一种(比如1，2，3，或者更多 种)癌症(cancer)相关。这些癌症可以是，比如癌(carcinoma)或者 肉瘤(sarcoma)，包括一种或者更多种特定类型的癌症，比如消化道 或者肠道癌，肝癌，皮肤癌，乳腺癌，卵巢癌，前列腺癌，淋巴癌， 白血病，肾癌，肺癌，肌肉癌症，骨癌，或者脑癌。与癌症相关的表 观遗传学沉默的基因用在表2中列出来的基因(而且还提供这些基因 的GenBank注册号)来例示，它们都与ESCC相关。参见表2，ESCC 细胞中表观遗传学沉默的基因可以在细胞与去甲基化试剂，组蛋白脱 乙酰酶抑制剂，或者它们的组合接触之后被重新激活，这些基因包括 载脂蛋白D(ApoD)基因，神经介肽U(NU)基因，swiprosin-2基因， Hep27基因，KIF5C基因，角蛋白14基因，转谷氨酰胺酶2基因，MUC1 基因，白介素-1受体-2(IL-1R2)基因，晶体蛋白α2基因，含LIM 结构域的半胱氨酸富含蛋白(CRIP-1)基因，Rad基因，HEM45基因， KLF6基因，类卵泡抑素蛋白FLRG基因，XAP-5基因，Tbcld1基因， 细胞周期蛋白G1相互作用蛋白基因，或者是这些基因的组合。

[0056]在一种具体实施方案中，表观遗传学沉默基因包括下列基因中 的一种或者多种：ApoD基因，NU基因，swissprosin-2基因，细胞因 子样因子-1(CLF-1)基因，CRIP-1基因，细胞视黄醇结合蛋白(CRBP) 基因，金属硫蛋白1G基因，角蛋白14基因，IL-1R2基因，或者晶 体蛋白α2基因。在另外-种具体实施方案中，至少有一个表观遗传学 沉默基因是甲基化沉默基因，比如，ApoD，NU，CLF-1，CRIP-1， claudin-3，非配对蛋白-2，金属硫蛋白1G，转谷氨酰胺酶2，或者载 脂蛋白C1基因，或者是这些基因的组合。在又另外一个具体实施方案 中，表观遗传学沉默的基因是肿瘤抑制基因，比如，ApoD基因，NU 基因，或者是CRIP-1基因，这里所列的三个基因都有肿瘤抑制活性； 和/或神经介肽B基因和/或G蛋白信号通路受体2(RSG2)基因。

[0057]正常非甲基化基因的启动子区域CpG二核苷酸的DNA异常甲 基化导致的基因转录沉默是肿瘤发生中被最广泛研究的一种表观遗传 学异常。由甲基化-CpG-结合结构域，转录辅阻遏物，染色质重排蛋白 (chromatin remodeling proteins)和组蛋白脱乙酰酶组成的蛋白复合物 与过度甲基化的DNA区域的结合使得染色质处于转录抑制(沉默)的 状态。在真核细胞中，位于鸟嘌呤残基的5’端的胞嘧啶残基的甲基化 主要在CpG缺乏区发生。相反，正常细胞中CpG岛常常保持非甲基化 的状态，除了失活的X染色体和亲本的特异性印记基因，这些区域的 5’端调控区域的甲基化常常与它们的转录抑制相关。眼癌(Rb)基因 一开始就被甲基化的情况被证明在眼癌中占有一小部分的比例(Sakai 等，Am.J.Hum.Genet.48：880，1991)，VHL基因的异常甲基化也在一 部分散发性肾细胞癌中被发现(Herman等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：9700-9704，1994)。正常非甲基化的5’CpG岛的重新甲基化也发 现能够使肿瘤抑制基因的表达功能丧失(参见，比如，Issa等，Nature Genet.7：536，1994；Merlo等，Nature Med.1：686，1995；Herman等， Cancer Res.56：722，1996)。

[0058]启动子区域的CpG岛的异常甲基化还与癌症的进一步发展有 关。比如在造血细胞肿瘤中，E-钙依粘连蛋白(Graff等，Cancer Res. 55：5195-5199，1995)，DAP激酶(Katzenellenbogen等，Blood 93：4347-4353，1999)，和细胞周期调控子p15INK4B和p16INK4A的过度甲 基化都与基因的失活相关(Herman等，Cancer Res.57：837-841 1997； Melki等，Blood 95：3208-3213，2000；Ng等，Clin.Canc.Res.7：1724-1729， 2001)。由于过度甲基化导致的转录沉默还在CDKN2A基因(Herman 等，Cancer Res.55：4525-4530，1995)，MGMT(Esteller等，Cancer Res. 59：793-797，1999)，和MLH1基因(Herman等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：6870-6875，1998)中发现。

[0059]染色体17p13.3位置的CpG岛的过度甲基化在多种常见类型的 人类癌症中发现(Makos等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：1929，1992； Makos等，Cancer Res.53：2715，1993；Makos等，Cancer Res.53：2719， 1993)，而且在脑癌，结肠癌和眼癌中还与17p丢失和p53突变的时 间和频率一致。与正常非甲基化启动子区域CpG岛的过度甲基化相关 的基因转录沉默向我们展示了不同于编码区突变机制的另外一种使肿 瘤抑制基因失活的机制(Baylin等，Cancer Cells 3：383，1991；Jones和 Buckley，Adv.Cancer Res.54：1-23，1990)。这种变化还与VHL，染色 体3p上一种肾癌肿瘤抑制基因(Herman等，supra，1994)，染色体6q 上的雌激素受体基因(Ottaviano等，Cancer Res.54：2552，1994)和染色 体11p上的H19基因(Steenman等，Nature Genetics，7：433，1994)的 表达丢失相关。

[0060]本发明还涉及一种鉴定细胞是否表现出或者易于失去生长控 制的方法。比如，这个方法可以这样实现，检测待测细胞中基因的表 观遗传学沉默，这些基因至少是列在表2中的一种基因或者是这些基 因的组合。在一种具体实施方案中，本发明的方法一部分需要比较待 测细胞中基因的甲基化状态与正常生长的细胞中对应的基因的甲基化 状态。此处所使用的名词“对应的”是指参考材料，通过它就可以比 较待测材料。一般地，参考材料提供一个对照或者标准让待测材料具 有可比性。比如，对于一个待测其甲基化状态的ApoD基因，参照一 个对应的非甲基化的ApoD基因，就是指待测甲基化状态的ApoD基 因的类型与非甲基化ApoD基因的类型相同，比如，待测基因和对应 的非甲基化基因都是人类ApoD基因。对于待测细胞来说，参考一个 对应的正常生长的细胞一般是指参考正常的细胞，即其细胞周期和生 长方式具有健康个体中该类细胞所具有的特征的细胞，这样，如果待 测细胞被认为是一种ESCC细胞，那么对应的细胞可以是例如正常的 食道上皮细胞。

[0061]本发明中的方法在实践的时候需要的样本包括待测细胞，或者 是待测细胞的抽提物，其含有所述细胞的核酸分子，特别是基因组 DNA，它们包括所有或者部分用来检测甲基化状态的基因的5’端调 控区域的CpG岛。一般地，待测细胞是那些被怀疑已经失去生长控制 的细胞，比如被怀疑具有损伤的活组织检查样本，或者是与恶化前或 者恶化以后的细胞接近的细胞或者是曾经与之接近的细胞，如从一个 被怀疑是损伤部位的周围一块地方或者几块地方取下来的细胞样本， 这样的待测细胞可以提供例如外科手术需要进行到什么程度的信息， 或者是一些从外科手术边缘收集的细胞样本，这样的待测细胞可以用 于检测癌症是否已经完全摘除，或者是检测癌症是否已经重生。

[0062]根据本发明的方法研究的待测细胞也可以是来自于生物体并 进行了培养的原代细胞，其目的可以是例如为了建立具有实质上和建 立培养物的细胞来源一样的特性的原代细胞培养物，或者是出于为了 能够重新施用于生物体而治疗和/或扩增细胞的目的。举个例子，食道 上皮细胞可以从一个患有ESCC的病人的身上获得，其中所述细胞的 一个或者更多个基因的表达表现出与癌症相关的甲基化沉默。这些培 养中的细胞可以用一种或者更多种试剂处理，以检测这些试剂使沉默 的基因恢复表达的能力，进而提供一种鉴定可以用于治疗该癌症病人 或者另外一个患有以一种或者更多种同样的基因的甲基化沉默为特征 的ESCC的病人的药物的方法。

[0063]待测细胞可以用临床上通常用来获得含有细胞的样本的任何 方式从生物体上获得。比如，待测细胞(或者含有这些待测细胞的样 本)可以通过活组织检查程序获得，例如对含有待测细胞的器官或者 组织进行活体穿刺取样。这样，待测细胞就可以从各种样本中获取， 如消化道样本，胃肠道样本，肝脏样本，骨髓样本，皮肤样本，淋巴 结样本，肾脏样本，肺样本，肌肉样本，骨样本，脑样本，或者类似 的样本。待测细胞也可以是一种生物液体的组分，比如，血液，淋巴， 脑脊液，唾液，痰，粪便，尿，或者精液。如果合适的话，待测细胞 也可以通过灌洗来得到，比如要从结肠，子宫，腹腔，或者类似的地 方获取样品，或者可以通过抽吸来获得，比如要获得骨髓样本。

[0064]本发明中的方法在实践时也可以使用待测细胞的抽提物，其中 所述抽提物包括待测细胞的核酸分子，特别是基因组DNA，其中的待 测基因中包含全部或者部分CpG岛。所述抽提物可以是粗抽提物，包 括例如含有待测细胞的组织的冻溶样本；也可以包括部分提纯的基因 组DNA，其可能含有例如核基质的成分；或者可以包括基本纯化的基 因组DNA，其可以是例如用蛋白酶处理和乙醇沉淀后得到的。在某些 具体实施方案中，待测细胞还可以是封存在石蜡中的组织切片样本的 成分。

[0065]由于表观遗传学沉默包括甲基化沉默，因此用来鉴定细胞是否 表现出或者易于表现出生长失控的方法可以通过检测细胞中一个或者 多个目标基因的甲基化来实施。基因的CpG岛中的CpG二核苷酸的甲 基化可以通过各种各样已知的检测核酸分子甲基化的方法来检测。这 样的方法包括让基因与一种或者一系列可以选择性的修饰非甲基化的 胞嘧啶残基或者是甲基化的胞嘧啶残基但不会对两者均起作用的化学 试剂接触，这样甲基化修饰的存在与否就可以被检测；将基因序列与 一种甲基化敏感的限制性内切酶接触，这种限制性内切酶的识别位点 中含有CpG二核苷酸，然后就可以用这种内切酶来剪切含有或者缺乏 甲基化胞嘧啶残基的CpG位点，但不能够在两种情况下都能够剪切， 这样这些序列的剪切是否发生就可以被检测到；或者将包含基因的核 酸分子与能够与该基因序列选择性杂交的寡聚核苷酸探针，引物或者 扩增引物对接触，这样也可以用来确定是否有CpG甲基化的存在。这 里提供了运用这些方法的一些例子，并且这些方法的一些修改和变动 也本技术领域是已知的。

[0066]目标基因的甲基化可以这样来检测，例如，将含有包含该基因 的核酸分子的5′端调控区域的区域与甲基化敏感型限制性内切酶接触， 这种对甲基化敏感的内切酶在含有其胞嘧啶残基被甲基化的CpG二核 苷酸的5′调控区内的识别位点上剪切，这样，该核酸分子的剪切就可 以作为指示甲基化，也就是待测细胞中这个基因甲基化沉默的标志。 甲基化敏感型限制性内切酶是众所周知的，例如有Acc III，Ban I，BstN I，Msp I和Xma I。作为选择或者作为补充，甲基化沉默也可以这样来 检测，将包含着含有基因的核酸分子的5′端调控区域的区域与甲基化 敏感型限制性内切酶接触，这种内切酶在含有其胞嘧啶残基被甲基化 的CpG二核苷酸的5′调控区内的识别位点处剪切，倘若CpG二核苷酸 的胞嘧啶残基被去甲基化的话，这样核酸分子没有发生剪切便是待测 细胞中该基因甲基化沉默的指示。这样的甲基化敏感型限制性内切酶 的例子是Acc II，Ava I，BssH II，BstU I，Hpa II，或者Not I。

[0067]检测包含目标基因序列的核酸分子被甲基化敏感型限制性内 切酶剪切的发生与否可以通过任何一种有效的检测多聚核苷酸序列长 度或者连贯性的方法来实现。比如，目标基因序列的断裂可以通过 Southern印迹分析来确定，这种方法允许对剪切位点进行作图，或者 用其他电泳方法或者色谱方法，这些方法可以基于相对大小，电荷， 或者是二者的组合来分离核酸分子。目标基因的剪切还可以通过寡聚 核苷酸连接分析来检测，其中，在核酸分子与限制性内切酶接触之后， 设计有两个寡聚核苷酸，第一个寡聚核苷酸与限制性内切酶剪切位点 上游且相邻的位置选择性杂交，第二个寡聚核苷酸与限制性内切酶剪 切位点的下游且相邻的位置选择性杂交，然后将这两个寡聚核苷酸与 目标基因接触，并进一步与连接酶接触，如果没有剪切发生，那么两 个相邻的寡聚核苷酸分子就可以被连接到一起，而在剪切发生的情况 下，连接不发生。通过测定连接反应之后的寡聚核苷酸分子的大小或 者是其他参数，被连接的寡聚核苷酸分子就会与没有连接的寡聚核苷 酸分子区别开来，因此也就提供了一种指示限制性内切酶活性的方法。

[0068]基因的甲基化沉默也可以通过将包含待测细胞基因的核酸分 子的5’端调控区域与可以选择性的修饰非甲基化或者甲基化的胞嘧啶 残基的化学试剂接触，然后检测这样接触之后的产物，其中这种产物 就是指示该基因的CpG二核苷酸中的胞嘧啶残基是否甲基化的标记， 这样也就达到了检测待测细胞中基因的甲基化沉默的目的。举个例子， 这种产物可以通过电泳方法，色谱方法，质谱方法，或者是这些方法 的组合来检测。

[0069]在这种实施方案的一个方面，用可以修饰胞嘧啶残基但却不能 够修饰甲基化的胞嘧啶残基的肼与基因接触，然后再将经过肼处理的 基因序列与一种可以在被肼处理的胞嘧啶残基处剪切核酸分子的试剂 接触，比如哌啶，这样就会产生包括片断的产物。根据分子量来分离 这些片断，例如可以利用电泳方法，色谱方法，或者质谱方法来分离， 然后再与经过相同处理的对应的非甲基化的基因序列的分离模式比 对，待测基因上在某些位置出现的缺口就说明这个基因含有甲基化的 胞嘧啶残基。这样，缺口的存在就是待测细胞中目标基因的CpG二核 苷酸中的胞嘧啶残基甲基化的一个指示。

[0070]在另外一个方面，含有目标基因的核酸分子与含有亚硫酸氢根 离子的化学试剂接触，比如亚硫酸氢钠，它可以将没有甲基化的胞嘧 啶残基转变成亚硫酸氢盐修饰的胞嘧啶残基，然后再将经过亚硫酸氢 根离子处理过的基因序列暴露在碱性环境中，这样亚硫酸氢盐修饰的 胞嘧啶残基又被转变成尿嘧啶残基。亚硫酸氢钠可以快速地与胞嘧啶 的5，6-双键反应(但与甲基化的胞嘧啶反应很慢)，形成磺化胞嘧啶反 应中间产物，这种中间产物非常易于进行脱氨反应，而形成磺化尿嘧 啶。这样，如果将磺化尿嘧啶暴露于碱性环境中就可以去除磺基，结 果形成尿嘧啶。然后这些DNA分子又可以被扩增，例如通过PCR反 应进行扩增，接着再测序以确定所有CpG位点的甲基化状态。在PCR 反应中，Taq聚合酶将尿嘧啶识别作胸腺嘧啶，结果PCR的产物只有 在起始模板DNA含有5-甲基化胞嘧啶的位置才有胞嘧啶。通过比较待 测细胞中被亚硫酸氢根离子处理过的基因序列与经过相同处理的对应 的没有甲基化的基因序列之间的尿嘧啶残基的数量或者分布，检测到 待测细胞中基因的尿嘧啶残基数量或者分布的减少就说明待测细胞中 目标基因的CpG二核苷酸中的胞嘧啶残基上发生了甲基化。尿嘧啶的 数量或者分布也可以通过将经过亚硫酸氢根离子处理，再暴露在碱性 环境中的目标基因序列与可以选择性的与含有或者缺少尿嘧啶残基的 目标基因的核苷酸序列杂交的寡聚核苷酸接触，然后检测与寡聚核苷 酸分子的选择性杂交(或者是没有杂交发生)。

[0071]在这里提到的“选择性的杂交”或者“选择性地进行杂交”或 者“特异性杂交”是指两个核酸分子在一般严紧或者高度严紧的条件 下发生稳定的相互作用。这样，选择性杂交比较偏向于在寡聚核苷酸 和目标核酸分子杂交，而基本上不在寡聚核苷酸和非目标核酸分子的 核酸分子之间发生，这不包括那些编码一个基因家族中相关却不同的 成员的核酸分子。一般地，可以用作与目标核酸分子选择性杂交的探 针或者引物的寡聚核苷酸在长度上至少有大约12到15个核苷酸，一 般是大约18到20核苷酸长度，常用的是至少21到25个核苷酸长度， 特殊情况下会是26到35个核苷酸长度或者更长。在实践本发明的方 法时所用到的寡聚核苷酸包括那些在SEQ ID NOS：1-127中所列的寡聚 核苷酸，它们可被用来检测表2中所列的基因。用于实践本发明的方 法的其它寡聚核苷酸可以基于本公开内容和通过表2所列的GenBank 注册号来获取的核苷酸序列来设计。

[0072]适合于选择性杂交的条件可以通过经验来确定，或者可以估 计，比如，基于要杂交的寡聚核苷酸和目标核酸分子的相对GC：AT(或 者GC：AU)含量，杂交寡聚核苷酸的长度，杂交的寡聚核苷酸分子和 目标序列之间的错配数目(如果有的话)(参见，比如Sambrook等， ″Molecular Cloning：A laboratory manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989))。这样，被用来获得特定的严紧水平的杂交条件会随着杂 交的核酸分子的性质而改变。需要额外考虑的是核酸分子是否被固定 化了，比如固定在滤膜上。逐步增高的严紧条件的例子如下：2X SSC/0.1％SDS在大约室温条件下(杂交条件)；0.2X SSC/0.1％SDS 在大约室温条件下(低严紧条件)；0.2X SSC/0.1％SDS在大约42摄 氏度条件下(一般严紧条件)；0.1X SSC在大约62摄氏度条件下(高 严紧条件)。杂交和/或洗涤可以在其中一种条件下进行，比如高严 紧条件，或者其中的每一个条件都被使用，例如，每个条件进行10到 15分钟，按上面列出的顺序，重复列出的这些步骤的任何一个或者所 有的步骤。

[0073]寡聚核苷酸与目标基因(比如表2中所列基因)的选择性杂交 可以通过让寡聚核苷酸带上可检测的标记这样的方法来检测。这些可 检测的标记可以是任何一种能够方便地与寡聚核苷酸连接的分子，而 且还可以用容易获得的仪器来检测。比如，这种可检测的标记可以是 一种荧光化合物比如Cy3，Cy5，Fam，荧光黄，罗丹明，或者绿色荧 光蛋白，或者是其增强型或者改进型；放射性原子核如硫-35， technicium-99，磷-32，氘或者碘-125；顺磁旋转标记如碳-13，Gd-17， Mn-55，Dy-162，Cr-52，或者Fe-52；发光物质如发光蛋白；化学发光 物质；金属螯合剂；一种酶如荧光素酶或者β-半乳糖苷酶，或者是酶 底物；或者是一种受体或受体的配体，比如生物素。检测可检测标记 的方法是根据标记的性质来选择的，同样将标记连接到寡聚核苷酸上 的方法也是如此(参见，比如，Hermanson，″Bioconjugate Techniques″ (Academic Press 1996)，其在此被整入以供参考)。

[0074]举个例子，选择性杂交的检测也可以利用寡聚核苷酸作为引物 延伸反应的底物，进一步让样本在足够使引物延伸反应进行的条件下 与脱氧核糖核苷酸(dNTPs)接触，如果需要的话，这些脱氧核糖核苷 酸可以包括可检测的dNTP(比如一种荧光标记的dNTP，一种地高辛 配体标记的dNTP，或者是一种生物素标记的dNTP)，另外还要有DNA 依赖型的DNA聚合酶，接着就可以检测引物延伸反应的产物。进行引 物延伸反应的条件在本领域是已知的(参见，比如，Sambrook等，如 上，1989)。

[0075]包含目标基因序列的核酸分子经过亚硫酸氢根离子处理，接着 暴露在碱性环境中之后，检测其中尿嘧啶的数量或者分布也可以通过 扩增反应比如PCR来实现。扩增反应是在适合于扩增引物对的正向引 物和反向引物与目标核酸分子选择性杂交的条件下进行的。一般地， 反应是在含水缓冲溶液中进行的，pH在7～9之间，常常pH是大约8。 另外，反应一般在引物的摩尔量远远超过目标核酸分子的情况下进行 的，比如引物：基因组DNA的摩尔比例约为100∶1。当样本中目标核酸 分子的量不知道的时候，比如在一个诊断程序中用到的生物样本，这 时就可以用一定范围的引物量加到样本中做平行实验，虽然一般即使 很少量的引物加到样本中也可以形成足够的摩尔逾量而使得这样的扩 增反应可以继续。

[0076]足量的三磷酸脱氧核糖核苷酸dATP，dCTP，dGTP和dTTP 可以单独也可以混合在一起加到合成反应混合物中，如果混在一起加 入的话，还可以进一步包括引物，最后溶液需要加热到90～100摄氏度， 维持大约1到10分钟，优选是1到4分钟。经过这段加热期之后，溶 液需要冷却到室温，这样更有利于引物的杂交。往冷却下来的混合物 中加入影响引物延伸反应的合适的试剂，一般是一种聚合酶，接着反 应就可以在这里公开的条件下(参见实施例1)进行或者是按照本领域 已知的条件进行。如果聚合酶是热稳定的，那么它还可以与其它试剂 一起被加入。聚合酶可以是任何一种用来指导引物延伸产物的合成的 酶，比如包括E.coli DNA聚合酶I，E.coli DNA聚合酶I的Klenow 片断，T4 DNA聚合酶，其它可获得的DNA聚合酶，聚合酶的突变蛋 白，反转录酶，或者其他酶，包括热稳定酶，它们在本领域都是熟知 的而且可以通过商业渠道获得。扩增反应产物是否甲基化可以通过测 序方法，寡聚物限制性分析(Saiki等，BioTechnology 3：1008-1012， 1985)，等位基因特异性寡聚核苷酸探针分析(Conner等，Proc.Natl. Acad.Sci.USA 80：278，1983)，寡聚核苷酸连接反应分析(Landegren 等，Science 241：1077，1988)，以及类似的方法(也请参见，Landegren 等，Science 242：229-237，1988)来检测。

[0077]在一种实施方案中，扩增反应是通过将目标基因序列(比如列 在表2，5或者6中的基因)在适合于扩增的条件下与包括正向引物和 反向引物的扩增引物对接触来进行的，其中该引物对中至少有一个引 物包含可以与含有尿嘧啶残基的目标基因序列选择性杂交的寡聚核苷 酸，因而扩增产物的生成就是待测细胞中目标基因的CpG二核苷酸的 胞嘧啶残基甲基化的标记。在另外一种实施方案中，扩增反应是通过 将目标基因序列在适合于扩增的条件下与包括正向引物和反向引物的 扩增引物对接触来进行的，但其中该引物对的两个引物都能够与含有 胞嘧啶残基的目标基因序列选择性杂交，而不与含有尿嘧啶残基的目 标基因序列杂交，因而扩增反应产物的生成就是待测细胞中目标基因 的CpG二核苷酸的胞嘧啶残基非甲基化的标记。

[0078]在又另外一个实施方案中，甲基化特异性的扩增反应比如甲基 化特异性PCR(MSP)可以单独使用或者与亚硫酸氢盐处理组合使用， 从而检测核酸分子的甲基化状态(参见美国专利号6,265,171； 6,200,756；和6,017,704，其中每一篇都在此整入以供参考；也可参见 实施例1)。MSP是一种特别灵敏的方法，可以用来检测数目很少的 甲基化等位基因，而且只需要使用很少量的核酸样本，包括一些腊封 的材料，该方法还可以方便地在多重分析中采用，比如包括，在单个 样本中同时检测甲基化和非甲基化产物，这样就可以提供一个内标。

[0079]在MSP反应中使用的扩增引物对经设计之后可以特异性地区 分未经亚硫酸氢盐处理的或未经修饰的DNA，甲基化的和非甲基化的 DNA。针对非甲基化DNA的MSP引物对(非甲基化特异性引物对) 一般在3’-CpG对中具有胸腺嘧啶残基以区别于甲基化DNA中保留 的胞嘧啶，对于反义引物则采用互补序列来设计。MSP引物对的序列 中常常含有相对少量的胞嘧啶或者鸟嘌呤残基，这是由于在正义(正 向)引物中缺乏胞嘧啶，而在反义(反向)引物中缺乏鸟嘌呤所致； 胞嘧啶被修饰之后成为尿嘧啶，而尿嘧啶在扩增产物中是作为胸腺嘧 啶来扩增的。MSP非甲基化特异性引物对和MSP甲基化特异性引物对 都可以基于基因的核苷酸序列来设计，这些基因如表2中所列的注有 GenBank注册号的各种基因，这些引物对包括用来扩增表2中所列的 甲基化或非甲基化基因的甲基化特异性或者非甲基化特异性引物对， 比如，如SEQ ID NOS：1和2所述的ApoD甲基化特异性引物对，如 SEQ ID NOS：3和4所述的ApoD非甲基化特异性引物对(也请参见， 表4；SEQ ID NOS：65至127，公开了针对指定基因的甲基化特异性引 物对，包括用于亚硫酸氢盐处理之后测序的引物)。

[0080]因此，一方面，MSP被用来检测经亚硫酸氢根离子处理并接 着进行碱处理的目标基因中的尿嘧啶残基的数量和分布。这样的方法 可以这样来实施，将基因序列与第一引物对和第二引物对在适合于扩 增的条件下接触，其中第一扩增引物对含有一个正向引物和一个反向 引物，该第一引物对中的至少一个引物包含可以与含有尿嘧啶残基的 目标基因的核苷酸序列选择性杂交的寡聚核苷酸，而第二扩增引物对 含有一个正向引物和一个反向引物，该第二引物对的两个引物都能够 与含有胞嘧啶残基的目标基因选择性杂交，而不与含有尿嘧啶残基的 目标基因序列杂交，这样由第一引物对生成的扩增产物(如果有的话) 会有一个第一长度，而由第二引物对生成的扩增产物(如果有的话) 会有一个第二长度，其不同于第一长度，因此扩增产物的长度就是一 种指示尿嘧啶残基的数量或者分布的标记，这样，待测细胞中目标基 因的CpG二核苷酸的胞嘧啶残基的甲基化也就可以通过这个方法来检 测。

[0081]尿嘧啶残基的数量或者分布也可以这样来检测，将基因的5’ 端调控区域与第一引物对和第二引物对在适合于扩增的条件下接触， 其中第一扩增引物对含有一个正向引物和一个反向引物，该第一引物 对中的至少一个引物包含可以与含有尿嘧啶残基的基因5’端调控区域 的核苷酸序列选择性杂交的寡聚核苷酸，而第二扩增引物对含有一个 正向引物和一个反向引物，该第二引物对的两个引物都能够与含有胞 嘧啶残基的基因5’端调控区域的核苷酸序列选择性杂交，而不与含有 尿嘧啶残基的基因5’端调控区域的核苷酸序列杂交，这样由第一引物 对生成的扩增产物(如果有的话)会有一个第一长度，而由第二引物 对生成的扩增产物(如果有的话)会有一个第二长度，其不同于第一 长度，因此扩增产物的长度就是一种指示尿嘧啶残基并因而指示基因 5’端调控区域的CpG二核苷酸的胞嘧啶残基的甲基化的标记，由此 可以检测待测细胞中基因的甲基化沉默。

[0082]在表现出或者被怀疑表现出失去控制的生长的细胞中的基因 的甲基化沉默(比如，一种癌症相关的基因)的检测也可以这样进行， 将待测细胞与一种脱甲基化试剂接触，然后再与没有用脱甲基化试剂 接触过的待测细胞中RNA的表达水平比较，检测由这个基因编码的 RNA的表达量增加。这样的方法可以进一步包括检测表现出正常生长 的对应细胞或者对应细胞的抽提物中基因的5’端调控区域的CpG岛 中的CpG二核苷酸的胞嘧啶残基的甲基化(如果有的话)。脱甲基化 试剂可以是甲基化转移酶抑制剂如5Aza-dC。RNA表达量的增加可以 用任何一种检测RNA的方法来检测，例如包括RNA点杂交分析，反 转录聚合酶链式反应分析，或者与核苷酸序列阵列的选择性杂交，如 在此所公开的。相应地，本发明的这些方法也可以以高通量的形式进 行，其中待测细胞或者待测细胞的抽提物包括多份待测细胞的一份或 者待测细胞的抽提物，或者是其组合；所述的多份待测细胞中的每一 份，或者所述的多份待测细胞的抽提物可以是相同的或者不同的，或 者是其组合。

[0083]在将本发明的方法应用于高通量的形式时，待测细胞或者待测 细胞的抽提物可以被安排在一个阵列上，这种阵列可以是一种可追踪 的(addressable)阵列，可以在一个固体支持物如微芯片，玻璃板，或 者玻璃珠上，细胞(或者抽提物)可以顺序地或者是平行地与寡聚核 苷酸探针或者引物(或者引物对)接触，如在此所公开的。安排在阵 列中的样本或者是安排成其它可再现形式的样本可以被指定地址(即， 阵列上的位置)，这样就利于确定样本的来源。将样本排列成阵列特 别是可寻址阵列的另外一个好处是可以用自动化系统对一个或者多个 样本在不同时间增加或者去除试剂，或者是为特定的样本加入不同的 试剂。除了可以同时检测多个样本的好处之外，这样的高通量分析还 能够提供了检测单个样本的两份等份，三份等份，或者更多等份的手 段，这样可以增加获得的结果的合理性，而且还可以在和待测样本同 样的条件下检测对照样本，从而为比较不同分析的结果提供了内标。 方便的是，阵列上某个位置的细胞或者抽提物可以与两种或者更多种 寡聚核苷酸探针或者引物(或者引物对)接触，其中所述寡聚核苷酸 是被不同地标记的或者是包括产生可区别的产物的反应，从而提供了 一种进行多重分析的手段。这样的分析可以允许检测一个或者多个， 尤其是2，3，4，5，10，15，20或者更多个基因，以鉴定待测细胞中 的表观遗传学沉默基因。

[0084]本发明也提供用作鉴定表观遗传学沉默基因(或者鉴定这些基 因的缺乏)的探针或者引物的寡聚核苷酸。在这里被使用的术语“寡 聚核苷酸”，“多聚核苷酸”或者“核酸分子”是指一段由两个或者 更多脱氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸组成，由磷脂键连接起来的序列。 这里提到的“基因”是指包含在基因组中的一段多聚核苷酸序列。然 而，应该认识到，包含基因的一部分的核酸分子可以从细胞中分离出 来或者作为基因组DNA被研究，比如通过杂交反应或者PCR反应。 因此，在整个基因组中，也许并不清楚某个基因在哪一个特定的核苷 酸位置起始或者结束，对于本发明的目的来说，对于在此被鉴定和/或 研究的基因，基因可以被认为是不连续的(discrete)核酸分子，它至 少包括那些GenBank注册号列在表2，5和6中的核苷酸序列。

[0085]为了讨论的方便，这里用到的术语“寡聚核苷酸”是指用作探 针或者引物的多聚核苷酸，而使用更加广泛的术语“多聚核苷酸”或 者“核酸分子”则是包含了具有两个或者多个核苷酸的任何序列，包 括寡聚核苷酸。另外，术语“核苷酸序列”是指存在于阵列上的分子。 因此，应该认识到，这里使用的各种术语可以方便地区分不同的核酸 分子。因此，这些术语包括了RNA和DNA，其可以是一个基因或者 是基因的一部分，cDNA，合成的多聚脱氧核糖核酸序列，或者类似的 分子。一般地，寡聚核苷酸或者多聚核苷酸可以是单链也可以是双链， 还可以是DNA/RNA杂交分子，然而应该注意的是，用来作为探针或 者引物的双链寡聚核苷酸的两条链在使用的时候需要分开，比如通过 加热含有寡聚核苷酸的溶液到高于特定寡聚核苷酸的熔点。

[0086]这里使用的术语“寡聚核苷酸”，“多聚核苷酸”和类似物包 括自然发生的核酸分子，这些核酸分子可以从细胞中分离，也可以是 比如通过限制性内切酶消化之后得到的片断，还可以是合成的分子， 比如这些分子可以通过化学合成的方法或者酶学方法如PCR来制备。 在各种各样的实施方案中，本发明的寡聚核苷酸或者多聚核苷酸可以 包含核苷或者核苷酸类似物，或者其骨架键不是磷酯键，比如是硫酯 键，硫代磷酸键，类似肽键的键或者本领域技术人员已知的能够连接 核苷生成合成的多聚核苷酸的其它任何化学键(参见，比如，Tam等， Nucl.Acids Res.22：977-986，1994；Ecker和Crooke，BioTechnology 13：351-360，1995，每个文献在此整入以供参考)。非自然发生的核苷类 似物或者连接核苷或类似物的非自然发生的连接键的整入在该多聚核 苷酸要暴露于可能含有核酸水解活性的环境中时特别有用，这些环境 包括例如组织培养液，细胞或者存活个体，因为这种被修饰的多聚核 苷酸可以被设计成对于降解较不敏感(假如需要的话，也可以设计成 对于降解更加敏感)。

[0087]一般地，组成多聚核苷酸的核苷酸是自然发生的脱氧核糖核苷 酸，比如腺嘌呤，胞嘧啶，鸟嘌呤或者胸腺嘧啶连接到2’-脱氧核糖 上，或者是核糖核苷酸，比如腺嘌呤，胞嘧啶，鸟嘌呤或者尿嘧啶连 接到核糖上。尽管如此，多聚核苷酸(或者寡聚核苷酸)也可以包含 核苷酸类似物，包括非自然发生的合成的核苷酸或者被修饰过的自然 发生的核苷酸。这些核苷酸类似物在本领域是已知的，而且可以通过 商业渠道获得，含有这些核苷酸类似物的多聚核苷酸也是如此(Lin等， Nucl.Acids Res.22：5220-5234，1994；Jellinek等，Biochemistry 34：11363-11372，1995；Pagratis等，Nature Biotechnol.15：68-73，1997，每 篇文献都在此整入以供参考)。

[0088]包含自然发生的核苷酸和磷酯键的多聚核苷酸可以通过化学 合成来制备或者用合适的多聚核苷酸作为模板通过DNA重组方法来 制备。与此相比，包含核苷酸类似物或者非磷酯键的共价键的多聚核 苷酸一般都通过化学合成的方法来制备，尽管某些酶如T7聚合酶可以 将某些类型的核苷酸类似物整合到多聚核苷酸中，并因而被用来由一 个合适的模板来重组合成这样一段多聚核苷酸(Jellinek等，如上， 1995)。这样，多聚核苷酸可以通过例如传统的磷酸三酯方法和磷酸二 酯方法的方法来制备，比如，包括例如使用二乙基磷酸脒的自动化方 法(参见，Beaucage等，Tetrahedron Lett.，22：1859-1862，1981)，或者 一种在被修饰的固体支持物上进行的寡聚核苷酸合成方法(参见美国 专利号4,458,066)。

[0089]本发明的可以选择性地与目标核酸分子杂交且可以作为检测 一个基因的表达和/或甲基化(或者甲基化缺乏；“非甲基化”)的试 剂的寡聚核苷酸被设计成与目标基因上游(5’)或者下游(3’)大 约2000个核苷酸之内的核苷酸序列选择性杂交，一般是在大约1000 个核苷酸的区域内，这些区域含有需要检测胞嘧啶甲基化的CpG岛， 更常见的是在大约500个核苷酸内的位点进行检测。另外，本发明的 寡聚核苷酸，或者对于本发明的方法有用的寡聚核苷酸，在长度上至 少要有大约12个核苷酸，一般至少是大约14或15个核苷酸长度，通 常是大约18到20个核苷酸长度，也可以是大约25，30，35或者更多 的核苷酸，这样它可以选择性地与目标核酸分子杂交。需要注意的是， 寡聚核苷酸的长度会部分地依赖于目标基因。比如，当目标基因是由 含有相似性非常高的区域的紧密相关的基因组成的家族的一员时，使 用更长的寡聚核苷酸可以保证其与目标基因的选择性杂交，而最小化 与相关基因序列的交互杂交，如果有的话。

[0090]本发明中的寡聚核苷酸被设计成与对应于基因组的基因座的 双链核酸分子的至少一条链基本互补(当间插序列要被扩增时，则是 与双链的每条链互补)，这些寡聚核苷酸被用于区分甲基化或者非甲 基化的胞嘧啶残基时，会包含一定量的鸟嘌呤和胞嘧啶，正如上述讨 论的一样。本发明的寡聚核苷酸的实例如用于目标基因的核苷酸序列 的RT-PCR的扩增引物对(参见表3；SEQ ID NOS：7至64)；还有用 于目标基因的核苷酸序列的甲基化特异性或者非甲基化特异性扩增的 引物；或者用于亚硫酸氢盐PCR的引物(参见表4；SEQ ID NOS：65 至127，甲基化特异性引物；SEQ ID NO.)。

[0091]因此，本发明提供选自SEQ ID NOS：1至127中的任意一个的 寡聚核苷酸，而且进一步提供多个这样的寡聚核苷酸，其包括至少两 种(比如2，3，4或者更多种)列在SEQ ID NOS：1至127中的寡聚核 苷酸，其包括，例如，包含用作扩增引物对的至少两种寡聚核苷酸的 组合，其可以扩增列在表2中的ApoD基因的一部分，在某些情况下 要依赖于例如目标序列是否甲基化。本发明还提供包括正向引物和反 向引物的扩增引物对，特别是这样的引物对，其含有的一个，特别是 两个寡聚核苷酸可以是一个引物对的正向引物，反向引物或者两者， 所述引物对特别是用来扩增表2中所列基因的一部分的引物对。在一 个方面，本发明的扩增引物对可以用来特异性地扩增核酸分子的甲基 化的5’端调控区域。另一方面，本发明的扩增引物对可以用来特异性 地扩增核酸分子的非甲基化的5’端调控区域。

[0092]本发明还涉及试剂盒，其中包括至少一种分离的本发明的寡聚 核苷酸，包括例如多种这样的分离的寡聚核苷酸。在一种实施方案中， 本发明的试剂盒的多种分离的寡聚核苷酸包括至少一个扩增引物对 (即，一个正向引物和一个反向引物)，也可以包括多个扩增引物对， 其包括例如在这里公开的扩增引物对。这样，本发明的试剂盒可以包 括，例如，一个或者多个甲基化特异性扩增引物对，非甲基化特异性 扩增引物对，或者甲基化特异性引物对和非甲基化特异性引物对的组 合，这种组合包含用来扩增特定基因的甲基化形式或者非甲基化形式 的甲基化特异性引物对和非甲基化特异性引物对，所述特定基因已知 或者被怀疑在一种或者多种类型的癌症细胞中被甲基化沉默。

[0093]本发明的试剂盒可以进一步包含额外的试剂，它们是很有用 的，例如，确保所述试剂盒中的寡聚核苷酸能够有效使用。例如，当 试剂盒含有一种或者多种甲基化特异性和/或非甲基化特异性扩增引物 时，该试剂盒可以进一步包括例如可以被甲基化的或者非甲基化的对 照寡聚核苷酸；一种或者更多种可以修饰甲基化胞嘧啶残基的试剂， 和/或一种或更多种用于进行扩增反应的试剂。如果试剂盒包含一种或 者多种能够与甲基化或者非甲基化基因序列选择性杂交的寡聚核苷 酸，那么试剂盒还可以进一步包括，例如，甲基化敏感型限制性内切 酶。本发明的试剂盒还可以包括至少第二引物对，它可以是但不一定 是上述所列引物对中的一种，它可以用来进行例如巢式扩增反应。这 些额外的引物对可以基于目标基因的扩增部位的期望序列，利用依据 目标基因的相关GenBank注册号所获得的序列信息(参见表2)来设 计。

[0094]在一种具体实施方案中，本发明的试剂盒含有一对甲基化特异 性引物和一对非甲基化特异性引物，它们的特异性都是针对同一个目 标基因，因而使用该试剂盒的用户可以确定某个特定目标基因是否甲 基化。在另外一种实施方案中，试剂盒含有多对这样的甲基化特异性 和非甲基化特异性引物，因而用户就可以确定一个或者更多个目标基 因的甲基化。例如，这样的试剂盒中可以含有针对一个或者多个挑选 出来的目标基因的甲基化特异性引物对和非甲基化特异性引物对，比 如所述目标基因是ApoD基因，NU基因，CRIP1基因，或者其他列在 表2中的基因，由此该试剂盒提供了用于确定一个或者多个被挑选出 来的基因的5’调控区域是否甲基化的扩增引物对。这样的试剂盒可以 进一步含有引物对，该引物对包括能够选择性地与利用甲基化特异性 或者非甲基化特异性的引物对产生的期望的扩增产物杂交的寡聚核苷 酸，从而提供了用于进行巢式扩增反应的试剂。

[0095]本发明的试剂盒还可以包括一种能够连接或者整合到试剂盒 中的寡聚核苷酸上的可检测的标记，或者多种不同的可检测的标记， 这样用户就可以根据需要为特定的应用选择合适的标记，而且如有需 要的话，还可以包括将可检测标记连接或者整合到寡聚核苷酸上所需 的试剂。作为选择或者作为补充，试剂盒可以包含一种或者多种用于 进行杂交反应的试剂，这样选择性杂交的条件就可以很快的获得；和/ 或者可以包括一种或者多种标准核酸分子，例如含有甲基化胞嘧啶残 基的标准目标ApoD基因核苷酸序列，其对应于ApoD基因上寡聚核 苷酸选择性杂交的区域，或者所述的标准核酸分子是对应于目标序列 的含有非甲基化胞嘧啶残基的标准目标ApoD基因核苷酸序列，或者 是二者的组合。这样的标准具有数个优点，包括，例如，可以确认用 待测细胞或其抽提物进行的反应是否正确有效，或者可以用来比较不 同时间检测的样本或者收集于不同来源的样本。

[0096]当试剂盒含有一种或者多种用来进行引物延伸(或者扩增)反 应的寡聚核苷酸，那么试剂盒可以进一步包括用于进行选择性杂交反 应的试剂，以使所述寡聚核苷酸可以作为延伸反应的底物；和/或一种 或多种用于进行引物延伸(或扩增)反应的试剂，比如，dNTPs，其中 的一种或者多种可以被可检测的标记标记或者为了方便地连接上可检 测的标记而被修饰；一种或者一系列的多聚酶；和/或一种或多种标准 目标核酸分子。如果本发明的试剂盒含有两种或者更多种寡聚核苷酸 (或者引物对)，例如在此例示的或者其它可以用于实践本发明的方法 的寡聚核苷酸，那么试剂盒可以提供一系列方便来源的试剂，有了这 些，技术人员就可以根据自己的需要选择一种或者多种寡聚核苷酸(或 者引物对)。

[0097]本发明也涉及一种降低或者抑制表现出至少一种与癌症相关 的基因的转录在表观遗传学上沉默的细胞的失控生长的方法。例如， 这种方法可以通过恢复由表观遗传学沉默基因编码的多肽在细胞中的 表达来实施，这样就可以降低或者抑制细胞的失控生长。在一种实施 方案中，由表观遗传学沉默基因编码的多肽的表达可以通过将细胞与 脱甲基化试剂，组蛋白脱乙酰酶抑制剂，或者二者的组合接触来恢复。 在这种实施方案的一方面，至少一个表观遗传学沉默基因包括甲基化 沉默基因，而所述细胞与一种脱甲基化试剂比如5Aza-dC接触，接触 的方法比如是向个体局部地或者系统地注射脱甲基化试剂，使得这些 试剂能够在体内与细胞接触。

[0098]恢复细胞中由表观遗传学沉默基因编码的多肽的表达的方法 可以通过向细胞中引入编码该多肽的多聚核苷酸来实现，然后这种多 肽就可以通过引入的多聚核苷酸来表达。所述多聚核苷酸可以但并不 一定包含在一个载体中，比如一个病毒载体中，它也可以被包装起来， 比如包装在一种基质中，如在脂质体，微气泡，或者类似物中。多聚 核苷酸可以通过将其施用到体内的方法来向细胞中引入这种多聚核苷 酸，这样它就可以接触细胞，接着就可以被细胞摄入，编码的多肽从 而被表达。

[0099]在这样的方法中应用的多聚核苷酸可以是种对应于表观遗传 学沉默基因的任何多聚核苷酸。例如，细胞是ESCC细胞，表观遗传 学沉默的基因可以是列在表2中的一种基因，那么多聚核苷酸就可以 是一种编码由该基因编码的多肽的核酸分子，这样的多聚核苷酸序列 的GenBank注册号在表2中指出。例如，表观遗传学沉默基因可以是 ApoD，NU，swiprosin-2，Hep27，KIF5C，角蛋白14，转谷氨酰胺酶 2，MUC1，IL-1R2，晶体蛋白α2，CLF-1，CRIP-1，Rad，HEM45， KLF6，类卵泡抑素蛋白FLRG，XAP-5，Tbcld1，细胞周期蛋白G1 相互作用蛋白，CRBP，金属硫蛋白1G，claudin-3，非配对蛋白2，或 者是载脂蛋白C1基因，或者是这些基因的组合。

[0100]在一种具体实施方案中，细胞是ESCC细胞，表观遗传学沉默 基因是甲基化沉默基因，比如，甲基化沉默基因是ApoD，NU，CLF-1， CRIP-1，claudin-3，非配对蛋白2，金属硫蛋白1G，转谷氨酰胺酶2， 或者是载脂蛋白C1基因，或者是这些基因的组合。在另外一种实施方 案中，细胞是ESCC细胞，表观遗传学沉默基因是肿瘤抑制基因，比 如是ApoD，NU，或者CRIP-1基因；或者所述肿瘤抑制基因包括神经 介肽B，或者G蛋白信号通路受体2(RGS2)基因；或者所述ESCC 细胞含有这些肿瘤抑制基因的组合。

[0101]本发明进一步涉及一种治疗癌症病人的方法，其中癌症病人体 内的癌细胞含有至少一种表观遗传学沉默的基因。这样的方法可以通 过例如恢复病人体内癌细胞中所述的至少一种表观遗传学沉默基因的 表达来实现，进而达到治疗癌症病人的目的。至少一个表观遗传学沉 默基因可以是甲基化沉默基因，而且还可以但并不一定是肿瘤抑制基 因或者影响肿瘤抑制基因活性或者表达的基因。

[0102]在一种具体实施方案中，癌症病人的癌细胞含有至少一种甲基 化沉默的基因，而治疗的方法包括将脱甲基化试剂以一定的量施于体 内以期恢复体内癌细胞中所述甲基化沉默基因的表达。在另外一种具 体实施方案中，癌症病人的癌细胞含有至少一种表观遗传学沉默的基 因，而治疗的方法包括将至少一种编码由表观遗传学沉默基因编码的 多肽的多聚核苷酸在足够使所述的至少一种多肽在病人的癌细胞中表 达的条件下施于病人体内。所述的多聚核苷酸可以包含在一个载体比 如病毒载体中；和/或也可以被包装在基质比如脂质体或者微气泡中。

[0103]根据本发明的方法来治疗的癌症可以是任何一种涉及含有至 少一种与癌症相关的表观遗传学沉默基因的癌细胞的癌症，包括，例 如，癌(carcinoma)或者肉瘤(sarcoma)。在一种具体实施方案中， 癌症是食道鳞片状细胞癌，而表观遗传学沉默基因包括在表2中列出 的一种或多种基因。例如，所述表观遗传学沉默基因可以是ApoD， NU，swiprosin-2，Hep27，KIF5C，角蛋白14，转谷氨酰胺酶2，MUC1， IL-1R2，晶体蛋白α2，CLF-1，CRIP-1，Rad，HEM45，KLF6，类卵 泡抑素蛋白FLRG，XAP-5，Tbcl d1，细胞周期蛋白G1相互作用蛋白， CRBP，金属硫蛋白1G，claudin-3，非配对蛋白2，或者是载脂蛋白 C1基因，或者是这些基因的组合。一方面，表观遗传学沉默基因包括 至少一种甲基化沉默基因，比如ApoD，NU，CLF-1，CRIP-1，claudin-3， 非配对蛋白2，金属硫蛋白1G，转谷氨酰胺酶2，或者是载脂蛋白C1 基因，或者是这些基因的组合。在另一方面，表观遗传学沉默基因包 括至少-种肿瘤抑制基因，比如ApoD，NU和/或者CRIP-1基因；或 者神经介肽B和/或RGS2基因；或者其组合。

[0104]本发明也涉及一种为治疗癌症病人选择治疗策略的方法。这样 的方法可以这样来实施，例如，根据本发明在这里公开的基因组筛选 方法确定至少一种与癌症相关的表观遗传学沉默基因；然后选择出用 于恢复所述的至少一种表观遗传学沉默基因在病人的癌细胞中的表达 的试剂。例如，这种试剂可以是一种编码本来由表观遗传学沉默基因 编码的多肽的多聚核苷酸，如编码由在表2中所列的一种基因编码的 多肽的多聚核苷酸，所述的基因例如ApoD，NU，swiprosin-2，Hep27， KIF5C，角蛋白14，转谷氨酰胺酶2，MUC1，IL-1R2，晶体蛋白α2， CLF-1，CRIP-1，Rad，HEM45，KLF6，类卵泡抑素蛋白FLRG，XAP-5， Tbcld1，细胞周期蛋白G1相互作用蛋白，CRBP，金属硫蛋白1G， claudin-3，非配对蛋白2，或者是载脂蛋白C1基因，或者是这些基因 的组合。

[0105]在一种具体实施方案中，被鉴定出来的表观遗传学沉默基因包 括至少一种甲基化沉默基因，而选择出来的试剂是用来恢复所述的至 少一种甲基化沉默基因在癌细胞中的表达的试剂。在这个方法的一个 方面，选择出来的试剂包括编码本来由所述甲基化沉默基因编码的多 肽的多聚核苷酸，所述的甲基化沉默基因例如ApoD，NU，CLF-1， CRIP-1，claudin-3，非配对蛋白2，金属硫蛋白1G，转谷氨酰胺酶2， 或者载脂蛋白C1基因。在这个方法的另外一个方面，被选择出来的试 剂包括一种脱甲基化试剂，比如5Aza-dC。

[0106]在另外一种实施方案中，鉴定出来的表观遗传学沉默基因包括 至少一种肿瘤抑制基因，而选择出来的试剂是用来恢复由所述的表观 遗传学沉默的肿瘤抑制基因编码的多肽在癌细胞中的表达的试剂。例 如，所述肿瘤抑制基因可以是ApoD，NU或者CRIP-1基因；或者是 神经介肽B或RGS2基因；或者这些基因的组合，而选择出来的药物 可以是编码ApoD，NU，CRIP-1，神经介肽B和/或RGS2基因产物的 多聚核苷酸。

[0107]本发明也涉及一种治疗患有食道鳞片状细胞癌的病人的方法， 其中与食道鳞片状细胞癌相关的细胞中含有至少一种表观遗传学沉默 的基因。这种方法可以这样来实施，例如对病人施用能够恢复所述的 至少一种表观遗传学沉默基因的表达的试剂，试剂的用量要足够使得 所述的表观遗传学沉默基因在与食道鳞片状细胞癌相关的细胞中的表 达恢复，这样就可以达到治疗病人的目的。在一种具体实施方案中， 所述试剂包括编码由所述的至少一种表观遗传学沉默基因编码的多肽 的多聚核苷酸，特别地，所述多聚核苷酸包括在表2中所列基因的编 码序列，例如，所述多聚核苷酸包括下列基因的编码序列：ApoD，NU， swiprosin-2，Hep27，KIF5C，角蛋白14，转谷氨酰胺酶2，MUC1，IL-1 R2，晶体蛋白α2，CLF-1，CRIP-1，Rad，HEM45，KLF6，类卵泡抑 素蛋白FLRG，XAP-5，Tbcld1，细胞周期蛋白G1相互作用蛋白，CRBP， 金属硫蛋白1G，claudin-3，非配对蛋白2，或者载脂蛋白C1基因，或 者这些基因的组合。

[0108]在另外一种具体实施方案中，至少一种表观遗传学沉默基因是 甲基化沉默基因，而治疗病人的药物包括编码由所述甲基化沉默基因 编码的多肽的多聚核苷酸。对于所述多聚核苷酸来说，可以包括下列 基因的编码序列，这些基因是ApoD，NU，CLF-1，CRIP-1，claudin-3， 非配对蛋白2，金属硫蛋白1G，转谷氨酰胺酶2，或者是载脂蛋白C1 基因，或者是这些基因的组合。在又另外一种实施方案中，至少一种 表观遗传学沉默基因包括至少一种肿瘤抑制基因，而治疗病人的方法 包括恢复所述肿瘤抑制基因在病人的ESCC细胞中的表达。例如，所 述的肿瘤抑制基因可以是ApoD，NU或者CRIP-1；或者可以是神经介 肽B或者RGS2基因；也可以是含有这些基因中的至少一种的组合； 而所述试剂可以是编码所述的表观遗传学沉默的肿瘤抑制基因的一种 或者多种的多聚核苷酸。在本发明的方法中使用的试剂可以通过局部 地或者系统地施于患者，这样试剂就可以在体内与ESCC细胞接触。

[0109]细胞中一种或者多种基因的甲基化转录沉默导致细胞中缺乏 这些基因的产物，因此，便出现了与编码基因的产物缺乏相关的功能 丢失。例如，本来与细胞生长控制顺式相关的ApoD基因的表观遗传 学沉默导致该基因的功能丧失，结果细胞生长失控。因此，本发明的 方法是基于向由于基因表达发生表观遗传学沉默特别是甲基化沉默而 导致生长失控的细胞提供由所述表观遗传学沉默基因编码的多肽，由 此恢复细胞的受控生长。正如在这里公开的，可以直接向细胞提供所 述多肽，可以向细胞中引入编码所述多肽的外源多聚核苷酸并让其表 达，或者恢复细胞中内源的甲基化沉默基因的表达。通过对表现出生 长失控的细胞进行所述多肽的恢复，一些与生长失控相关的特征，比 如包括在软琼脂中生长的能力，缺乏接触生长抑制，或者对细胞程序 性死亡的抗性都被减轻了。

[0110]一种或者多种甲基化沉默基因例如表2所列基因的一种或者 多种的表达恢复，可以通过将细胞与一种脱甲基化试剂比如5Aza-dC 接触来完成，5Aza-dC可以在细胞复制的过程中整合到基因中，结果 子代细胞就含有非甲基化的基因，这样就可以被转录了。如果需要的 话，在将试剂施用于对象之前，可以将来自对象的目标细胞样本(或 者对应于目标细胞的细胞)在培养基中与所述的脱甲基化试剂接触， 以确定或者验证提供的脱甲基化试剂的量可以足够保证目标基因的去 甲基化，而对细胞又没有毒性。这些在培养基中被接触的细胞一般是 所述对象的细胞，其在向所述对象施用脱甲基化试剂之前被检测，但 这些细胞也可以是比如和所述对象体内将要与脱甲基化试剂接触的细 胞同样类型的已建立的细胞系的细胞，如ESCC细胞。根据本发明治 疗病人的方法可以进一步包括用本领域已知的用于治疗患有该特定类 型癌症的病人的试剂来治疗病人，或者是一些和本方法联合使用时有 新的作用的试剂。

[0111]具有甲基化基因表达沉默的细胞一般是通过将试剂施用到体 内的方法使之可以在体内与去甲基化试剂接触。如果方便的话，脱甲 基化试剂可以通过下列方法引入体内，比如在体内表现出生长失控的 细胞的位置或者附近运用导管插入法，或者在其血液流向所述细胞所 在位置的血管运用导管插入法。类似地，如果将要被治疗的器官或者 器官的一部分可以通过分路方法被分离，那么试剂可以通过分路器被 施用，结果本质上也可以将试剂施于含有所述细胞的位置。试剂也可 以被系统地施用或者是通过其他路径施用，如在这里所公开的，或者 如本领域所知的。

[0112]表观遗传学沉默基因导致其量降低或者缺乏的多肽也可以通 过向细胞中引入编码这种多肽的多聚核苷酸来向细胞提供，这样这种 多肽就可以在细胞中由该多聚核苷酸表达。因此，本发明提供了一种 基因治疗的方法。例如，如果细胞具有其ApoD基因的转录被甲基化 沉默的特征，那么具有GenBank注册号J0261(参见表2)所列的核苷 酸序列的多聚核苷酸就可以引入目标细胞中。

[0113]除了编码多肽的序列，所述多聚核苷酸还可以包括有效连接的 (operatively linked)转录调控元件，翻译调控元件和类似的元件，所 有这些可以形成一个裸露的DNA分子，可以包含在一个载体中，或者 可以包装在一种基质比如脂质体或者微气泡中，它们可以帮助多聚核 苷酸进入特定的细胞。在这里提到的术语“有效连接的”是指两种或 者更多种分子邻近相连以至它们可以作为一个单位来看待，而且表现 出的功能可以是其中一种或者所有分子的功能，或者这些功能的组合。 例如，编码ApoD多肽的多聚核苷酸可以与另外一个(或者更多)编 码序列有效连接，这样由所述的有效连接的编码多肽可以表达出嵌合 多肽。所述的嵌合多肽可以是融合蛋白，其中两种(或者更多种)被 编码的多肽被翻译成一条多肽，即，通过肽键共价连接；或者可以被 翻译成两个独立的多肽，这些多肽被翻译出来之后，可以彼此联系形 成一个稳定的复合物。类似地，编码需要的多肽的多聚核苷酸序列可 以与调控元件有效连接，在这种情况中该调控元件可以将它的调控作 用赋予该多聚核苷酸，其方式与这种调控元件调控细胞中与其正常相 关的多聚核苷酸序列一样。

[0114]融合蛋白常常表现出其中每个多肽组分的部分或者全部特性， 因此可以用来在细胞中恢复基因的表达，还可以进一步提供其他的优 点。比如，融合蛋白可以包含由于其编码基因的表观遗传学沉默而导 致其量降低或者缺乏的多肽，这种多肽可以与一种细胞区室定位结构 域有效连接，这样该融合蛋白在细胞中的表达或者向细胞中引入这种 融合蛋白可以将编码的多肽定位到特定的细胞内区室中以发挥其活 性，比如定位到细胞核。细胞区室定位结构域已经研究的很清楚了， 比如包括质膜定位结构域，核定位信号，线粒体膜定位信号，内质网 定位信号和类似的结构域，也包括可以指导多肽从细胞中分泌出来的 信号肽(参见，比如，Hancock等，EMBO J.10：4033-4039，1991；Buss 等，Mol.Cell.Biol.8：3960-3963，1988；美国专利号5,776,689，每篇文献 都在此整入以供参考文献)。融合蛋白也可以包括所需要的多肽与起 其它作用的肽有效连接，包括作为受体的配体的肽，用作确定多肽在 细胞中的表达的标记的肽，或者是用于分离融合蛋白的肽，或者是任 何其他感兴趣的多肽或者肽，只要该融合蛋白具有所要的多肽的蛋白 活性。肽标记比如多聚组氨酸标记肽，比如His-6，可以用一种二价阳 离子比如镍离子，钴离子或者类似的离子来检测；FLAG表位，可以 用抗FLAG抗体来检测(参见，比如，Hopp等，BioTechnology 6：1204 (1988)；美国专利号5,011,912，每篇文献都在此整入以供参考)；c-myc 表位，可以用针对这种表位的特异性抗体来检测；生物素，可以用链 霉亲和素或者亲和素来检测；谷胱甘肽S-转移酶，可以用谷胱甘肽来 检测，这些标记在本技术领域是已熟知的，它们为检测与其有效连接 的多肽存在与否提供了一种方法。这些标记还提供了额外的好处，比 如它们可以帮助分离与之有效连接的多肽，如果需要获得基本纯化的 形式的多肽的话，这样的多肽可以用于实践本发明的方法。

[0115]编码本来由表观遗传学沉默基因编码的多肽的多聚核苷酸可 以单独使用，也可以包含在一个载体中，这可以辅助多聚核苷酸的操 作，包括将所述多聚核苷酸引入到目标细胞中。载体可以是一个用来 保存多聚核苷酸的克隆载体，也可以是一个表达载体，它除了包括多 聚核苷酸，还含有对多聚核苷酸和被编码的多肽在特定细胞中的表达 有用的调控元件。一个表达载体可以含有，例如，维持编码多聚核苷 酸的转录所必需的表达元件，或者能够在多聚核苷酸被克隆到载体之 前就可以与该多聚核苷酸有效连接的调控元件。

[0116]一个表达载体(或者编码所需多肽的多聚核苷酸)一般含有或 者编码一段启动子序列，它可以为所述的编码多聚核苷酸提供组成性 的，或者如果需要的话，可以是可诱导的或者组织特异性的或者发育 阶段特异性的表达，还可以含有多聚腺嘌呤识别序列，核糖体识别位 点或者内部核糖体进入位点，或者其他调控元件，比如组织特异性的 增强子。载体还可以包含在原核或者真核宿主系统中复制所需要的元 件，或者是在两种系统中都需要的元件，如果需要的话。这样的载体 包括质粒载体和病毒载体比如噬菌体，杆状病毒，反转录病毒，慢病 毒(lentivirus)，腺病毒，疫苗病毒，塞姆利基森林(semliki forest) 病毒和腺相关病毒，这些病毒是已熟知的，而且也都可以通过商业渠 道(Promega，Madison WI；Stratagene，La Jolla CA；GIBCO/BRL， Gaithersburg MD)来获得，或者可以由本领域技术人员构建(参见， 比如，Meth.Enzymol.，第185卷，Goeddel，ed.(Academic Press，Inc.， 1990)；Jolly，Canc.Gene Ther.1：51-64，1994；Flotte，J.Bioenerg. Biomemb.25：37-42，1993；Kirshenbaum等，J.Clin.Invest.92：381-387， 1993；每篇文献都在此整入以供参考)。

[0117]四环素(tet)诱导的启动子对于控制编码所需多肽的多聚核苷 酸的表达特别有用。在四环素或者其类似物被施于含有与四环素诱导 型启动子有效连接的多聚核苷酸的个体之后，编码的多肽就被诱导表 达。多聚核苷酸也可以与组织特异性的调控元件有效连接，比如一种 肝脏细胞特异性调控元件，如α-胎蛋白启动子(Kanai等，Cancer Res. 57：461-465，1997；He等，J.Exp.Clin.Cancer Res.19：183-187，2000)或 者白蛋白启动子(Power等，Biochem.Biophys.Res.Comm. 203：1447-1456，1994；Kuriyama等，Int.J.Cancer 71：470-475，1997)；一 种肌肉细胞特异性调控元件，比如肌球蛋白启动子(Delvin等，J.Biol. Chem.264：13896-13901，1989；Yan等，J.Biol.Chem.276：17361-17366， 2001)；一种前列腺细胞特异性调控元件，比如PSA启动子(Schuur 等，J.Biol.Chem.271：7043-7051，1996；Latham等，Caner Res. 60：334-341，2000)；一种胰腺细胞特异性调控元件，比如弹性蛋白酶 启动子(Omitz等，Nature 313：600-602，1985；Swift等，Genes Devel. 3：687-696，1989)；一种白细胞特异性调控元件，比如白细胞唾液酸蛋 白(CD43)启动子(Shelley等，Biochem.J.270：569-576，1990；Kudo 和Fukuda，J.Biol.Chem.270：13298-13302，1995)；或者类似的启动子， 这样多肽的表达就可以限制在个体内特定的细胞中，或者限制在培养 基如器官培养基中一个混合群体的细胞中的特定细胞中。调控元件， 包括组织特异性元件，许多都是可以通过商业渠道获得的，它们在本 领域是已熟知的(参见，比如，InvivoGen；San Diego CA)。

[0118]病毒表达载体在将多聚核苷酸引入到细胞特别是个体内的细 胞特别有效。病毒载体所具有的优势是它们可以以相对高的效率来侵 染寄主细胞，而且可以侵染特定的细胞类型。例如，编码所需多肽的 多聚核苷酸可以被克隆到杆状病毒载体中，它然后可以用于侵染昆虫 宿主细胞，由此提供一种产生大量该被编码的多肽的方法。病毒载体 也可以来源于侵染感兴趣的生物的细胞的病毒，这些生物细胞比如是 脊椎动物宿主细胞如哺乳动物宿主细胞，鸟类宿主细胞或者鱼类宿主 细胞。在本发明的方法中，病毒载体在向目标细胞中引入多聚核苷酸 方面特别有用。病毒载体还可以被发展以用于特定的宿主系统，特别 是哺乳动物系统，这样的病毒载体包括反转录病毒，其他慢病毒载体， 如那些基于人类免疫缺乏综合症(HIV)的病毒，腺病毒载体，腺相关 病毒载体，疱疹病毒载体，肝病毒载体，疫苗病毒载体，或者类似的 病毒载体(参见Miller和Rosman，BioTechniques 7：980-990，1992； Anderson等，Nature 392：25-30 Suppl.，1998；Verma和Somia，Nature 389：239-242，1997；Wilson，New Engl.J.Med.334：1185-1187(1996)，每 篇文献都在此整入以供参考)。

[0119]包含在载体之中的多聚核苷酸可以通过本领域已知的任何方 法被引入到细胞中(Sambrook等，如上，1989；Ausubel等，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley和Sons，Baltimore，MD (1987，和1995年的增补材料)，每篇文献都在此整入以供参考)。 这样的方法包括如转染，脂转染(lipofection)，微注射，电转和用病 毒载体侵染；还可以包括运用脂质体，微乳剂或者类似物来引入，这 些方法可以帮助多聚核苷酸导入细胞，还可以使多聚核苷酸在被导入 细胞之前避免降解。一个特别有用的方法包括将多聚核苷酸整合到微 气泡中，然后可以注射到循环通路中。可以放置一个超声源使得超声 可以传递到肿瘤处，正在肿瘤的位置循环的含有多聚核苷酸的微气泡 被超声波打破，这样就可以在癌症部位提供这种多聚核苷酸。一种特 定方法的选择需要依据比如多聚核苷酸所要导入的细胞，还有细胞是 否分离于培养基中，或者是在培养的组织或器官中，或者是在原位。

[0120]利用病毒载体的侵染来将多聚核苷酸导入细胞中的方法是非 常有益的，它可以将核酸分子高效地导入到细胞中。而且，病毒一般 都是非常特化的，可以根据其对一种或者几种特定类型的细胞的侵染 能力以及繁殖能力来挑选需要的载体。因此，它们的天然特异性可以 将包含在载体中的核酸分子定向导入到特定类型的细胞中。这样，基 于HIV的载体可以用于侵染T细胞，基于腺病毒的载体可以用于侵染 例如呼吸道上皮细胞，基于疱疹病毒的载体可以用来侵染神经元细胞， 等等。其他载体如腺相关病毒可以有更加宽泛的宿主细胞范围，因此 可以用来侵染很多类型的细胞，尽管病毒或者非病毒载体也可以用特 定的受体或者配体进行修饰，以通过受体介导的事件来改变其目标特 异性。本发明的多聚核苷酸，或者含有多聚核苷酸的载体可以包含在 细胞中，比如在宿主细胞中，这样含有多聚核苷酸的载体便可以增殖， 或者在辅助细胞中，这样含有多聚核苷酸的病毒载体便可以组装。所 述多聚核苷酸可以暂时地存在于细胞中，也可以稳定地存在，例如通 过整合到细胞基因组中这样的方法。

[0121]本发明的方法还可以通过直接将所需要的多肽导入到病人体 内表现出生长失控的细胞所在位置处来实施。所述多肽可以在产生后 被分离，然后按照需要采用这里公开的方法制成配方，接着可以与细 胞接触使得所述多肽可以穿过目标细胞的细胞膜。如果所需的多肽与 生物体的细胞接触，那么这种多肽可以是融合蛋白，其中含有促进其 穿过细胞膜的肽或者多肽组分，比如人类免疫系统缺乏综合症病毒 (HIV)TAT蛋白转导结构域，而且还可以进一步包含与之有效连接 的核定位结构域。作为选择，或者作为补充，所述多肽可以被包装在 基质中以促进多肽进入细胞。

[0122]对于活体施用，用于实践本发明的治疗方法的试剂例如脱甲基 化试剂，多聚核苷酸或者多肽一般被配制成适合于施用的组合物。因 此，本发明提供含有用于恢复由于一种或者多种基因的甲基化转录沉 默而导致生长失控的细胞的受控生长的试剂的组合物。这样，这种试 剂就可以用作治疗患有与这种生长失控相关的病理症状的病人的药 物。

[0123]这样的组合物一般包含对于形成配方和将试剂施用于个体可 接受的载剂。可被接受的载剂在本领域是已知的，包括比如含水溶液 如水或者生理缓冲盐溶液，或者其他溶剂或媒介物如乙二醇，甘油， 油类物质如橄榄油或者可注射的有机酯。可被接受的载剂可以含有一 些生理上能够接受的化合物，其作用是例如稳定或者增加结合物的吸 收。这样的生理上可以接受的化合物包括例如碳水化合物如葡萄糖， 蔗糖或者葡聚糖，抗氧化剂如抗坏血酸或者谷胱甘肽，螯合试剂，低 分子量蛋白或者其他稳定剂或赋形剂。本领域技术人员应该知道，包 括生理上可接受的化合物在内的可接受载剂的选择是依赖于比如治疗 试剂本身的物理化学性质和施用该组合物的途径，所述途径可以是例 如口服或者不经肠胃的途径，如静脉内施用并且是通过注射，插管， 或者本领域已知的其他这样的方法。所述药物组合物还可以含有第二 种试剂，比如诊断试剂，营养物质，毒素，或者治疗试剂，比如癌症 化疗试剂。

[0124]所述试剂可以整合到一种胶囊材料中，比如在油水混合乳剂， 微乳剂，微胶束，混合微胶束，脂质体，微球体，微气泡，或者其他 聚合物基质当中(参见，例如Gregoriadis，Liposome Technology，第1 卷(CRC Press，Boca Raton，FL 1984)；Fraley等，Trends Biochem.Sci.， 6：77(1981)，每篇文献都在此整入以供参考)。脂质体，例如由磷脂或 者其他脂类组成的脂质体，是没有毒性的，生理上可接受的而且可代 谢的载体，它们比较容易制作和施用。“隐形(Stealth)”脂质体(参 见，例如美国专利号5,882,679；5,395,619和5,225,212，每篇文献都在 此整入以供参考)就是这样的胶囊材料的一个例子，其对于制备用于 本发明的方法的组合物非常有用，而其他的“隐蔽(masked)”脂质 体也可以类似地被应用，这样的脂质体延长了治疗试剂在循环中的保 留时间。阳离子型脂质体比如也可以用特异性的受体或者配体修饰 (Morishita等，J.Clin.Invest.，91：2580-2585(1993)，这篇文献在此整入 以供参考)。另外，多聚核苷酸试剂可以利用比如腺病毒-多赖氨酸DNA 复合物来导入到细胞中(参见，比如，Micheal等，J.Biol.Chem. 268：6866-6869(1993)，这篇文献在此整入以供参考)。

[0125]含有治疗试剂的组合物的施用途径部分地依赖于分子的化学 结构。比如多肽和多聚核苷酸，如果是通过口服进入体内的话就不是 特别有效，因为它们会在消化道中被降解。然而，比如用来使多肽对 于内源的蛋白酶降解更加不敏感或者使其更容易通过消化道吸收的化 学修饰多肽的方法，都在这里公开了或者它们是本领域所知的(参见， 比如，Blondelle等，如上，1995；Ecker和Crook，如上，1995)。另外， 多肽试剂可以用D型氨基酸来制备，或者可以包含一个或者多个基于 肽模拟物的结构域，它们是模拟结构域的结构的有机分子；或者是基 于一种类肽比如维尼纶类肽(vinylogous peptoid)构成。

[0126]在这里公开的组合物可以通过各种途径被施于个体，比如包括 口服或者不经肠道的途径，如静脉内，肌肉内，皮下，眼睑内，囊内， 腹腔内，直肠内，脑池内施用，或者通过皮肤被动或者易化吸收，比 如分别应用皮肤帖或者透皮离子电渗透法。而且，所述组合物可以通 过注射，插管，口服或者局部施用，后者可以是被动式的，比如直接 贴上一块膏药，或者是主动式的，比如利用鼻腔喷雾或者吸入剂，在 这种情况中，所述混合物的一种成分是一种合适的推进剂。药物组合 物也可以被施于具有病理症状的位点，比如通过静脉或者动脉注射到 给肿瘤供血的血管。

[0127]在实践本发明的方法时施用的试剂的总用量可以以单次剂量 的形式施于个体，也就是以一粒药丸的形式或者是通过在一段相对较 短的时间内输注，或者可以采用分次治疗方案来施用，其中在一段延 长的时间内分多次剂量施用。本领域技术人员知道，治疗患者的病理 状况所需要的组合物用量依赖于许多因素，包括患者的年龄，一般健 康状况，还有给药的途径和要进行治疗的次数。纵观这些因素，熟练 的技术人员会根据需要来调整特定的剂量。一般地，所述组合物的配 方以及给药的途径和频率都在一开始就已经通过I期和II期临床试验 确定了。

[0128]所述组合物可以配制成口服配方，比如药片，或者溶液或悬浮 液的形式；或者可以包含带有有机或无机载剂的附加剂，或适合于肠 道或者非肠道应用的赋形剂，还可以与例如通常无毒的药学上可接受 的载剂构成复合物，形成药片，药丸，胶囊，栓剂，溶液，乳剂，悬 浮液或者其他适于使用的形式。除了前面公开的那些，载剂还可以包 括葡萄糖，乳糖，甘露糖，阿拉伯树胶，明胶，甘露醇，淀粉糊，三 硅酸镁，云母，谷物淀粉，角蛋白，胶体硅石，马铃薯淀粉，尿素， 中等链长的甘油三酸酯，葡聚糖和其他适于工业制备的载剂，它们可 以是固体，半固体或者液体的形式。另外，助剂，稳定剂，增稠剂或 者着色剂和香料也可以被应用，例如一种干性稳定剂如酮丙糖(参见， 例如，美国专利号5,314,695)。

[0129]下面的实施例用来说明本发明但是并不限制本发明。                          实施例1
鉴定食道癌细胞中的表观遗传学上沉默的肿瘤抑制基因

[0130]本实施例提供了一种用于鉴定与食道鳞片状细胞癌细胞相关 的表观遗传学沉默基因的基因组筛选方法，所述的表观遗传学沉默基 因包括表观遗传学上沉默的肿瘤抑制基因(也请参见，Yamashita等， Cancer Cell 2：485-495，2002，这篇文献在此整入以供参考)。方法
细胞系和组织样本

[0131]食道鳞片状细胞癌(ESCC)细胞系TE1，TE2，TE3，TE4， TE5，TE7，TE13，KYSE30，KYSE70，KYSE110，KYSE140，KYSE150， KYSE200，KYSE410和KYSE520是从Tohoku大学衰老和癌症系生物 医学研究所细胞反应中心获得(TE系列)，KYSE系列是由Kyoto大 学外科系Shimada博士热心提供。细胞在补充有10％胎牛血清的RPMI 1640培养基中培养以用于分离DNA和RNA。原发性ESCC肿瘤和对 应的附近的正常组织从马里兰大学医学院医药系肠胃病学分部获得。 对细胞用5-氮杂-2′-脱氧胞苷(5Aza-dC)和曲古抑菌素A(TSA)处 理

[0132]细胞在处理之前12至24小时被分成低密度培养(每个T-25 摇瓶有5×105细胞)，然后用1μM或者5μM的5Aza-dC(Sigma) 处理3，4或者5天，所述的5Aza-dC来自于100mM溶在50％乙酸中 的储液，或者细胞用含有同样乙酸的同样体积磷酸盐缓冲液(PBS)处 理作为对照。在先用5Aza-dC温育(48小时)后，终浓度为300nM的 TSA(Sigma)被加到培养基中，所述TSA来自于5mM用乙醇溶解的 储液，或者细胞用同样体积的乙醇处理作为对照。微阵列和RT-PCR分析

[0133]寡聚核苷酸微阵列分析是应用GeneChipTM人类基因组 U95Av2阵列(Affymetrix)，依据制造商的说明书来进行的，该阵列 含有12599个基因。根据制造商提供的算法，鉴定出经过药物处理后 被向上调节的基因。RNA是利用TRIZOL试剂(Invitrogen公司)提取 的，总RNA的反转录用是用M-MLV(Invitrogen公司)来实现的；cDNA 产物的百分之一被用作PCR的模板。RT-PCR运行24到30个循环： 每个循环是95摄氏度1分钟，54或56摄氏度1分钟，然后72摄氏度 1分钟。用于RT-PCR的示范性的扩增引物对如表3所示(SEQ ID NOS：7至64)。在对照反应中，没有反转录(RT-)的反应也没有PCR 产物的扩增出现。

[0134]初步的分析是用2倍的增加作为临界值，结果鉴定出很多额外 的基因。然而，这些基因中只有少数的基因是在多于一种细胞系中被 向上调节，而例如BIN1，BRCA相关蛋白1(BAP1)和MAP激酶8 相互作用蛋白3(JNK蛋白支架蛋白)的数种基因在启动子区域并没有 甲基化。这些基因可能处于受被测细胞系中更加上游的在表观遗传学 上被调节的基因调控的通路中。相比而言，用3倍的增加作为临界值 可以按照惯例地鉴定出启动子过度甲基化的表观遗传学沉默基因。因 此，3倍的增加在于此公开的研究中被使用。序列分析

[0135]基因组DNA是通过TRIZOL试剂来提取的，而基因组DNA 的亚硫酸氢盐修饰如所述地进行(Merlo等，Nature Med.1：686-692， 1995，这篇文献在此整入以供参考)。亚硫酸氢盐处理过的DNA作为 模板，扩增出含有ATG起始位点或者推定的转录起始位点的5’端区域 (大约200到500个碱基对)，所用的引物是针对25个基因(22个在 表中列出的基因，以及MAPK8IP3，BIN1和BAP-1)设计的。所有的 PCR产物都经过胶回收(Qiagen)，然后将其上样到Applied Biosystems 3700DNA分析仪，利用BD终止染料(应用生物系统公司)以及巢式 引物或者正向引物(参见表4；F2引物)进行分析。甲基化特异性PCR

[0136]经过亚硫酸氢盐处理的DNA用针对载脂蛋白D设计的甲基化 特异性或者非甲基化特异性的引物扩增33个循环：96摄氏度30秒， 59(甲基化)或55(非甲基化)摄氏度30秒，然后72摄氏度30秒。 针对载脂蛋白D设计的甲基化特异性引物序列用5’ -CACACGCGCGAAAACAATAT-3’(SEQ ID NO：1)作为正向引物， 用5’-TATGTATGTTACGTTCGTCG-3’(SEQ ID NO：2)作为反向 引物。非甲基化特异性的引物序列是5’ -CACACAAAAACAATATCTCATTTCT-3’(SEQ ID NO：3)和5’ -TTTTTTATGTATGTTATGTTTGTTG-3’(SEQ ID NO：4)。在其它 实验中，如SEQ ID NOS：82和84(参见表4)所列的甲基化特异性的 引物被运用。额外的甲基化特异性引物如表4所示(SEQ ID NOS：65 至127)，其中正向引物用F1或者F2指示，反向引物用R指示；其 中“PCR扩增”一栏指示的是用来获得在这里公开的结果的甲基化特 异性引物对，而“序列”一栏指示的是用于亚硫酸氢盐测序的引物。人类表达载体构建

[0137]CRIP1的全长cDNA从TE2细胞中用PCR分离出来，所用的 引物是5’-CAGAAGCTTCCACCATGCCCAAGTGTCCCAAGTGC-3’ (SEQ ID NO：5)和5’-CTCTCGGTGTGAAAGTTCATTAGATCTGAC-3’(SEQ ID NO：6)， 其中包含有Hind III和Xba I识别位点。接着PCR产物从胶上剪下来， 再用Hind III和Xba I酶切，然后连接到用Hind III-Xba I酶切过的 pcDNA3TM载体(Invitrogen)上，这个载体具有CMV启动子。一个克 隆，pcDNA3-CRIP1，含有具有正义方向和正确序列的插入片断。以 pRCC-p53(Osada等，Nature Med.4：839-843，1998，这篇文献在此整入 以供参考)作为模板扩增p53，然后亚克隆到pcDNA3TM载体的Hind III 和Xba I酶切位点之间，然后再测序。被插入到pcDNA3TM载体中的 Apo D cDNA和被插入到pcDNA3TM载体中STAT3C cDNA也被利用 (参见，例如，Bromberg等，Cell 98：295-303，1999)。
转染和集落形成试验

[0138]集落形成试验是在单层培养物上进行的(Yoshikawa等，如上， 2001)。使用6孔板来铺放细胞，每个孔中有2×104个细胞，然后参 照制造商提供的实验方案，用Lipofectamine PlusTM转染试剂 (Invitrogen)来转染1μg的pcDNA3-p53，pcDNA3-STAT3C， pcDNA3-CRIP1，pcDNA3-ApoD或者pcDNA3对照(没有插入片断)。 然后将细胞去附着，置于100毫米的组织培养皿中进行转染后培养24 或者48个小时，在转染后的48小时同时收集细胞，在mRNA水平 (RT-PCR)确认它们表达ApoD基因的情况。用CRIP1转染的细胞在 转染后48小时会迅速死亡；因此在转染后的24小时检测mRNA水平。 与非甲基化细胞系的基底表达相比，ApoD和CRIP-1的RNA水平在 细胞中有1.5～2.0倍的增长。用G418(1mg/ml)来选择细胞，于转染 后的2周进行集落计数。对于使用了神经介肽U(NU；-Phoenix Pharmaceutical)的处理，集落形成试验在对照PBS或者培养基中含有 100μM的NU。结果
转录上被抑制的基因的药理学暴露

[0139]在有或者没有组蛋白脱乙酰酶抑制剂TSA(300nM；最后的 24小时)的情况下，用脱甲基化试剂5Aza-dC(1μM或者5μM)。处 理细胞3至5天，以重新激活三个ESCC细胞系中表观遗传学沉默的 基因。处理之后，基因表达的变化用含有12599个转录子的微阵列芯 片(Affymetrix)来检测；通过RT-PCR验证随机挑选出来的基因。正 如所期望的一样，经过这些试剂处理，有超过500个独特的基因(表1) 的表达上调(即，至少是3.0倍的增加)。这些基因的几乎全部(＞80％) 都包含在5μM 5Aza-dC处理的这一组中，但有一些基因是在低浓度的 5Aza-dC或者加入TSA的情况下被鉴定出来的(见下面)。可以合理 地认为，这些在2个或者3个ESCC细胞系中失活而又被重新激活的 基因很有可能就是常常失活的肿瘤抑制基因(TSGs；120个基因)。 通过比较在正常的食道和癌组织样本中的基因表达模式(参见网上资 源，URL为“cgap.nci.nih.gov”)(去除在正常组织中不表达的那些 基因)，并去除未知的基因，由此将候选基因的数目进一步减少。对 于经过脱甲基化处理之后表达普遍上调的58个基因，还作了更加详细 的分析(图1；表2)。

[0140]58个基因中有53个基因(91％)在启动子区域含有CpG位点， 有44个基因(76％)在启动子区域含有高密度CpG岛(GC含量＞60％ 或者CpG含量＞15％)(表2；CpG一栏)。25个随机选择的基因在 经过处理之后在3个主要细胞系中的表达上调通过RT-PCR来验证。 所有25个基因都被证明在经过5μM的脱甲基化处理之后有强劲的重 新表达(表2；ESCC细胞系/暴露)。与5Aza-dC或者TSA的单独处 理相比，例如细胞因子类因子1(CLF-1)和Hep27的基因在用1μM 5Aza-dC和300nM TSA处理的时候表现出协同性的激活。ESCC细胞系中的表达和启动子过度甲基化

[0141]所述的58个基因的一部分被用来检验其在另外12个ESCC细 胞系中的沉默或者表达下调。TE4和TE5保持了载脂蛋白D的表达， 而在余下的细胞系中其mRNA水平与正常的食道样本相比都是下调 的。神经介肽U在6个细胞系中完全是沉默的，而在其他细胞系中其 表达与正常的食道相比也具有明显的降低。半胱氨酸富含肠蛋白1 (CRIP1)在15个ESCC细胞系的8个细胞系(53％)中完全沉默， 而正常的食道组织则表现出CRIP1基因的充分表达。其他几种被挑选 出来的候选基因，包括细胞因子类因子1(CLF-1)，swiprosin-2，CRBP， 金属硫蛋白1G，角蛋白14，晶体蛋白α2和IL-1受体-2都被证明在 ESCC细胞系中有明显的表达下调。

[0142]为了确认被重新激活的基因的启动子过度甲基化，22个基因 (21个具有高密度CpG岛的基因和载脂蛋白D)的启动子区域通过亚 硫酸氢盐测序来验证(表2)。通过RT-PCR发现，在处理之前就具有 一定的基底表达的候选基因(Tbcl d1，溶酶体唾液酸苷酶前体，载脂 蛋白J，KLF6，推定的细胞周期蛋白G1相互作用蛋白和XAP-5)的大 多数总是非甲基化的(溶酶体唾液酸苷酶前体，推定的细胞周期蛋白 G1相互作用蛋白)。另外一方面，有13个基因(α微管蛋白，swiprosin， 胰岛素样生长因子结合蛋白(IGFBP2)，细胞视黄醇结合蛋白(CRBP)， 载脂蛋白D(ApoD)，神经介肽U(NU)，claudin-3，非配对蛋白(UCP-2)， 半胱氨酸富含肠蛋白1(CRIP1)，金属硫蛋白1G(MT 1G)，载脂 蛋白CI(Apo CI)，细胞因子类因子1(CLF-1)，转谷氨酰胺酶2) 在经过亚硫酸氢盐处理之后，它们的被认为是对于转录甚为关键的 CpG位点或者CpG岛中胞嘧啶的含量仍然相当高，这表明这些基因具 有很高程度的胞嘧啶甲基化(参见表2；“CpGd一栏”-“CpG状态” -标记了“M”)。除了swiprosin-2之外，所有基因的甲基化状态都与 它们的表达状态紧密关联。比如，KYSE30中NU的表达沉默，其启动 子也具有高密度的甲基化，而KYSE410和KYSE520都表达NU基因， 其启动子就没有甲基化。对于ApoD，除了TE5之外的所有ESCC细 胞系都被证明有启动子的甲基化，而大量表达ApoD基因的TE5细胞 却不具有任何的甲基化。TE2，TE4和TE13细胞都表现出Apo D mRNA 的弱表达，通过亚硫酸氢盐处理的DNA的直接测序表明，这些细胞的 大约50％具有非甲基化的等位基因。原发性ESCC肿瘤中的表达和启动子过度甲基化

[0143]通过MSP或者直接的测序分析来检测上述13个甲基化基因 (表2；“CpGd”一栏，标记了“M”的基因)在ESCC组织中的启 动子甲基化。这13个基因中有10个基因具有肿瘤特异性的启动子甲 基化(图2)。肿瘤甲基化的频率从10％(UCP-2)到80％(载脂蛋白 C1)。ApoD几乎在所有的原发性ESCC组织中(80％)被甲基化，而 且通过MSP可知在一些正常组织中它的甲基化水平很低。Swiprosin-2 和α微管蛋白在正常的食道粘膜样本中表现出甲基化，这表明是一种 组织特异性但非肿瘤特异性的过度甲基化。10种受测的原发性肿瘤都 不具有IGFBP-2甲基化。

[0144]然后检测这13种基因在5种原发性ESCC组织中的表达；与 对应的正常组织相比，在这些原发性癌症中的表达水平降低被检测到 (表2)。在数种原发性肿瘤中NU和ApoD的mRNA水平与对应的 正常组织相比要下降许多。除了swiprosin-2，每一个在原发性肿瘤中 被甲基化的基因都在RNA水平上有明显的表达量降低。对于 swiprosin-2，其甲基化并不与其在原发性肿瘤或者细胞系中的表达量降 低非常相关(表2)。还有一些肿瘤并不产生甲基化，但是却依然表现 出特定基因的偶尔下调(表2)，这很有可能是通过其他机制导致的。肿瘤抑制活性

[0145]甲基化基因中的三个(CRIP，ApoD和NU)被用来验证其抑 制KYSE30的肿瘤生长的能力，KYSE30中这三个基因都被沉默掉。 对这三种基因的检验是通过将由各种基因或者对照载体(pcDNA3TM 载体)转染的细胞用G418进行选择，应用集落形成实验来完成的。 STAT3是一种癌基因蛋白，STAT3C是其组成型的活性形式(Bromberg 等，如上，1999)。由于STAT3的表达在经过5Aza-dC处理之后不改 变，因此它可以用来作为肿瘤抑制活性的阴性对照。在NU的情况中， 实际用到的蛋白浓度是100μM。所有三种基因都被证明具有强劲的肿 瘤抑制活性，在三次独立的实验中，它们的集落形成能力在转染(ApoD， 61.3±15.0％；CRIP，18.3±15.7％)或者加入蛋白(NU，33.6±12.3％) 之后都有明显的降低(参见，例如，图3)。为了进一步验证CRIP1 表达的作用，IRES-CRIP1被暂时转染到KYSE30细胞中。表达出高水 平GFP蛋白(同时也是表达CRIP1)的细胞表现出细胞凋亡的经典的 形态变化，包括细胞变圆，凋亡小体的出现和细胞核收缩。TUNEL分 析证实了表达CRIP1的细胞的DNA断裂。

[0146]表观遗传学沉默的药理学逆转揭示了许多种在ESCC中转录 被抑制的基因。数种未知的可能的TSG通过微阵列分析和直观的算法 用3倍的增加作为临界值鉴定出来。这些基因的大多数是通过高剂量 的5Aza-dC处理鉴定出的，有一部分基因是通过低剂量5Aza-dC和TSA 的协同处理被重新激活，正如在结肠癌细胞系中被证明的一样 (Cameron等，如上，1999；Suzuki等，如上，2002)。这一鉴定可以提 供了最小数目的上调基因，因为表观遗传学沉默的逆转在一系列细胞 中出现时，其重新表达的表达量很可能不同(Cameron等，如上，1999)。 一种涉及选择性克隆的更加复杂的方法鉴定出结肠直肠癌中的许多甲 基化目标，还可以应用这种方法鉴定更加精细的目标(Suzuki等，如上， 2002)。高剂量5Aza-dC的应用很可能导致更多数目的细胞的重新表 达，因而有利于本研究中所用到的直接杂交方法。运用多种逆转表观 遗传学沉默的方法很可能会得到最全面的基因鉴定。另外，其他算法 和更好的去甲基化或者HDAC抑制可以改进鉴定甲基化目标的结果。

[0147]神经介肽U(NU)被认为涉及正常食道粘膜的整合性，并且 NU连同最近鉴定出的同源受体(Hedrick等，Mol.Pharmacol. 58：870-875，2000)在正常的食道粘膜中被大量表达(Hedrick等，如上， 2000；Lynch等，Nature 406：70-74，2000)。NU受体(FM3)是一种G 蛋白偶联受体，能够通过PI3激酶γ进行信号转导，最近被确认可以阻 断人类结肠癌细胞的生长(Sasaki等，Nature 406：897-902，2000)。而 且，在本研究中，候选TSG的列表包括神经介肽B和RSG2，这些基 因涉及同样的通路。

[0148]CRIP具有一个LIM结构域，其涉及肿瘤形成过程(比如Lmo2 和Lmo4)。Lmo2是一种转录因子，被认为在T细胞白血病发生过程 中起致癌作用(Grutz等，EMBO J.17：4594-4605，1998)，这也许是通 过促进血管发生来实现的(Yamada等，Oncogene 21：1309-1315，2002)。 Lmo4在乳腺癌细胞中过量表达，并与BRCA1结合，结果使得BRCA1 转录活性受到抑制(Visvander等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98：14452-14457，2001；Sum等，J.Biol.Chem.277：7849-7856，2002)。桩 蛋白(paxillin)是一种含有多个LIM结构域的与聚焦黏附相关的接头 蛋白，其参与细胞伸展和运动(Schaller，Oncogene 20：6459-6472，2001)。 桩蛋白的LIM结构域与α微管蛋白结合(Herreros等，2000)，而α微 管蛋白是包括APC和Fhit在内的其他关键性的肿瘤抑制子的伴侣。这 里鉴定到的LIM基因(CRIP)是一种非常小的分子(开放阅读框架只 有273个碱基对)，它能够以显性抑制的方式调节其他LIM蛋白，而 且潜在地调节或者影响涉及癌症发生的许多通路。此外，酵母双杂交 筛选鉴定到Ubc13是作为一种结合伴侣，其牵连到对于细胞凋亡是关 键的NF-κB和JNK通路中的CRIP(Wang等，Nature 412：346-351， 2001)。

[0149]载脂蛋白D与细胞生长控制相关(Do Carmo等，J.Biol.Chem. 277：5514-5523，2002)，但其具体的机制还不清楚。其他载脂蛋白如载 脂蛋白CI和载脂蛋白J也包括在这里鉴定出的58种基因中。载脂蛋 白J具有很强的诱导细胞死亡的能力(Han等，Nature Med.7：338-343， 2001)。载脂蛋白D与细胞因子类型的受体结合，介导MAP激酶信 号转导通路(Liu等，FASEB J.15：1329-1331，2001)。这种细胞因子信 号转导通路也可以被识别的肿瘤抑制因子样SOCS-1使用(Yoshikawa 等，如上，2001)，而且，如被本研究结果所指出的，IL-1受体拮抗剂 (IL-1R2)(Colotta等，Science 261：472-475，1993)和CLF-1(Elson 等，J.Immunol.161：1371-1379，1998)也可以参与这个通路。

[0150]58个候选基因的染色体定位被列在表2中。许多候选TSG都 集中在特定的染色体区域(表2)，这说明了在肿瘤中具有高度甲基化 和降低的基因表达的甲基化染色体区域的存在，而它们又可以通过药 物学去甲基化处理来揭示。载脂蛋白D，NU和CRIP1分别定位在3q26， 4q12和14q24。所有这些基因座在各种癌症中都有染色体缺失或者 LOH，而3q26也是一个易碎的位点。本研究揭示了10个基因以肿瘤 特异性的模式被甲基化，但是不管是否被甲基化，所有这些基因都还 是TSG通路的参与者。比如，MUC2是在本研究中被鉴定出来的基因 中的一个；MUC2敲除的小鼠易于形成肿瘤(Velcich等，Science 295：1726-1729，2002)。因此，在本研究中被鉴定出来的许多基因都可 以是TSG基因。

[0151]通过甲基化和脱乙酰化的功能逆转，并接着进行微阵列上的杂 交，鉴定出在ESCC中受表观遗传学调控的候选基因和通路。在这里 公开的结果证明了这种方法的快速和普遍有效，而且这种方法还很容 易在其他癌症细胞系中重复，以全面搜寻表观遗传学沉默的肿瘤抑制 基因。用来搜寻甲基化CpG岛的互补基因组阵列方法可以与功能重激 活分析相比较(Gitan等，Genome Res.12：158-164，2002；Adorjan等， Nucleic Acid Res.30：e21，2002；Shi等，Cancer Res.62：3214-3220，2002)。 启动子区域具有CpG岛和在肿瘤组织中发生甲基化的基因很有可能就 是一个真正的肿瘤抑制基因(表2)。本方法鉴定出3个新的肿瘤抑制 基因，还有更多的基因有待于进一步验证。

[0152]应用MSP可以快速地检测由于甲基化导致的原发性肿瘤中基 因失活的频率，而功能性分析又可以快速地评定基因的抑制活性。这 些被鉴定出来的基因可以提供一种鉴定和操作ESCC的生物学过程的 手段，由此提供了重要的治疗靶点。此外，继基因鉴定之后的MSP分 析的快速发展使得可以通过执行有前景的分子检测手段来有效地分析 原发性肿瘤和其他临床样品(参见，比如，Esteller等，如上，1996； Kavakami等，J.Natl.Cancer Inst.92：1805-1811，2000；Jeronimo等，J. Natl.Cancer Inst.93：1747-1752，2001)。                           实施例2
鉴定头颈部癌细胞中的表观遗传学上沉默的肿瘤抑制基因

[0153]本实施例将上述针对食道癌细胞公开的结果延伸到头颈部鳞 片状细胞癌(HNSCC)细胞。

[0154]HNSCC细胞用10μM 5Aza-dC或者0.1μM 5Aza-dC和300 nM TSA处理，筛选的方法如实施例1所述。表观遗传学沉默基因的重 新激活在两组被处理的细胞中都被发现。示范性的基因至少有2倍的 表达量增加，如表5和表6所示(增加的倍数在第二栏中示出)。

[0155]这些结果表明实施例1中公开的基因组筛选方法可以拓展到 其他癌症细胞类型。在HNSCC细胞中重新表达的基因的进一步分析按 照如实施例1公开的方法进行，可以确认具有肿瘤抑制活性的基因。

[0156]虽然本发明已经参照上面的实施例作了描述，但是需要理解的 是，修改和变动依然包括在本发明的精神和范围之内。因此，本发明 的内容只受权利要求的限制。  表1.处理之后通过微阵列分析表达上调的基因   KYSE30  KYSE410   KYSE520   1μM 5Aza-dC   1μM 5Aza-dC+300nM TSA   5μM 5Aza-dC   独特的基因数目   46   57   242   289   15   21   334   363   5   51   149   185        独特基因的总数＝565个基因   表2.鉴定食道癌中可能的肿瘤抑制基因   Genebank   序号   基因名称   染色体   位置   ESCC细胞系   ESCC组织   已知或推定的功能   CpGa   暴露b   表达c   CpGd   表达e   CpGf   M21302     AI813532   AI885852   J05581     L13463   小脯氨酸富含蛋白   (sprll)   TNF受体1B   组蛋白2A.2   MUC1     G蛋白信号通路调节   1     1p36   1q21   1q21     1q31   (-)     (++)   (++)   (++)     (++)   *     *     是     *   *     *   *   是     *   *     *   *   U     U   UV诱导基因     细胞因子受体   核小体蛋白   肿瘤抗原     G蛋白信号     AF010309   X06956   X59770   AB011103   X63368     W27472   S37730   M11433     J02611     AB029031   AF084481   X76029   X57522   AF040958       X70683   AB000714   M25915   子2(RSG2)   Pig3   α-微管蛋白(b α1)   IL-1R2   KIF5C   HSP40同源蛋白   (HSJ1)   Swiprosin-2   IGFBP2   细胞视黄醇结合蛋白   (CRBP)   载脂蛋白D     Tbcld1   跨膜蛋白(WFS1)   神经介肽U   TAP1   溶酶体唾液酸苷酶前     体   Sry   Claudin-3   载脂蛋白J     2p23   2p36   2q12   2q23   2q32     2q36   2q36   3q21     3q26     4p14   4p16   4q12   6p21   6p21       6p22   7q11   8p21     (+)   (++)   (-)   (？)   (+)     (++)   (++)   (++)     (+)     (++)   (++)   (++)   (++)   (++)       (++)   (++)   (++)     *   *   是   是   *     是   *   *     是     是   *   是   *   是       *     是     *   *   是   *   *     是   *   是     是     否   *   是   否   否       *   *   否     *   M   *   *   *     M   M   M     M     *   *   M   U   U       *   M   *       5/5(100％)           5/5(100％)   1/5(20％)   5/5(100％)     3/5(60％)         3/5(60％)             4/5(80％)       0/10(0％)           10/10(100％)   0/10(0％)   6/10(60％)     8/10(80％)         3/10(30％)             6/10(60％)     p53诱导基因   微管   细胞因子受体   细胞质转运   胁迫诱导基因     生长控制？   IGF信号   视黄醇结合蛋白     生长抑制？     胀亡   Wolfram综合症   G蛋白受体配体   肿瘤抗原加工   酶       性别决定基因   紧密连接   细胞凋亡   M22488     AF001461   M13755     U94592   W68521     AF001436   X15675   AL038340   AJ001684   AJ001685   M20681   U31875     X81637   X67325     AI017574     AI985272   骨形态形成蛋白   1(BMP-1)   KLF6(Zf9)   干扰素诱导的   17-kDa/15-kDa蛋白   非配对蛋白2   胱蛋白酶抑制剂   E/M(6)   Cdc42效应蛋白(CEP2)   pTR7   晶体蛋白αB   NKG2C   NKG2E   GLUT3   Hep27     笼形蛋白轻链b   干扰素刺激基因   12(p27)   含LIM的半胱氨酸富   含蛋白(CRIP1)   神经介肽B   8p21     10p15   11p36     11q13   11q13     11q13   11q13   11q22   12p13   12p13   12p13   14q11     14q21   14q32     14q32     15q22   (++)     (++)   (++)     (++)   (++)     (++)   (++)   (++)   (-)   (-)   (+)   (+)     (++)   (+)     (++)     (++)       是   *     是   *     *   *   是   *   是   *   是     *   是     是     *   *     否   *     是   *     *   *   是   *   *   *   *     *   *     是     *   U     *   *     M   *     *   *   *   *   *   *   *     *   *     M     *             1/5(20％)                             1/5(20％)             1/10(10％)                             2/10(20％)   TGF-β超家族     肿瘤抑制基因   干扰素诱导基因     细胞凋亡   蛋白酶抑制剂     抑制运动性   重复序列基因   胁迫诱导基因   NK细胞识别   NK细胞识别   葡萄糖转运   生长控制？     膜循环   干扰素诱导基因     LIM蛋白     G蛋白受体配体   NM_002201     J03910   NM_004165   AA976838   J00124   U20982   Z19574   AF059293       D12620   AF061812   U76702   AF044968   AA152406     M37457     U61837     M55153   HEM45(干扰素刺激基   因20)   金属硫蛋白-1G   Rad   载脂蛋白CI   角蛋白14   IGFBP4   细胞角蛋白17   细胞因子类因子     -1(CLF-1)   细胞色素P-450LTBV   角蛋白16   类卵泡抑素蛋白FLRG   柄蛋白2   细胞色素氧化酶c，   VIIa型   Na+/K+-ATP酶催化亚   基，α-III   推定的细胞周期蛋白   G1相互作用蛋白   转谷氨酰胺酶2(组织   15q26     16q   16q22   16q22   17q12   17q12   17q12   19p13       19p13   19q12   19q13   19q13   19q13     19q13     20p13     20q11   (++)     (++)   (++)   (++)   (+)   (++)   (++)   (++)       (+)   (++)   (++)   (++)   (++)     (++)     (++)     (++)   是     *   是   *   是   是   *   是       *   *   是   *   *     *     是     是   *     是   是   *   *   *   *   是       *   *   *   *   *     *     否     是   *     M   U   M   *   *   *   M       *   *   U   *   *     *     U     M       5/5(100％)     3/5(60％)         3/5(60％)                           3/5(60％)       4/10(40％)     8/10(80％)         5/10(50％)                           4/10(40％)   干扰素诱导基因     细胞凋亡相关基因   运动性抑制   生长促进？   中间丝   IGF信号   中间丝   细胞因子受体同源     基因   电子转送   中间丝   TGFβ相关基因   紧密连接   电子转送     离子转运     细胞周期(G2/M)     细胞凋亡     W72816   X75315     X91817   AD001530   谷氨酰胺酶)   剪切刺激因子   Seb4B(RPM类型的   RNA结合蛋白)   transketorase 2   XAP-5     20q13   20q13     Xq28   Xq28     (++)   (++)     (+)   (++)     *   *     *   是     *   *     *   否     U   *     *   *     BRCA1相关基因   RNA结合蛋白     代谢物辅助因子   重复序列基因  aCpG位点。在启动子区域，(++)高密度CpG岛，(+)CpG位点，(-)无CpG位点。  b处理之后实验的RT-PCR结果。*：没有进行，是：在三种关键细胞中被验证是沉默的，处理之后又重新被激活。  c在更多类型的ESCC细胞中通过RT-PCR分析基因的表达。*：没有进行，是：在数种细胞系中被验证是沉默的。否：在所有被   研究的细胞系中广泛表达。  dESCC细胞的CpG状态。M：甲基化，U：非甲基化，*没有进行。  e通过RT-PCR验证在ESCC组织中的基因表达。发生沉默的肿瘤/所有受测的肿瘤(％沉默的)。  f通过直接测序分析在ESCC组织中的启动子甲基化。甲基化的肿瘤/所有受测的肿瘤(％甲基化的)。
                                                     表3   RT-PCR引物   F   R   MUC1   IL-1R2   ILF5C   Swiprosin-2   CRBP   载脂蛋白D   Tbcld1   神经介肽U   TAP1   溶酶体唾液酸苷酶前体   载脂蛋白J   KLF6   非配对蛋白2   晶体蛋白αB   NKG2E   Hep27   ISG12(p27)   CRIP-1   HEM45   金属硫蛋白1G   Rad   角蛋白14   IGFBP4   GCTGGTGCTGGTCTGTGTTCT(7)*   TGAAGGCCAGCAATACAACAT   AGAAACTGCAACTGGAACAGG   TGTCATCGGCCAGTAAGTTTG   AGGCCCCTCCTGGATGTCACC   GCATTTCATCTTGGGAAGTGC   CGAGAAATGAGCAGCGAGAGA(19)   GCTCCAATATTACCTCAAGGA   CAGAATCTGTACCAGCCC   TGGCTCAGTCGTCATCAATGC   ACAACCCCTCCCAGGCTAAGC   ATGTGCAGCATCTTCCAGGAG(29)   CTAGCAGGCAGCACCACAGGT   GACCAGTTCTTCGGAGAGCAC   TCAGGAACCGAACAGGAAATA   AATACTCACCGCAAGGGTCTG   CAGTGTGGCCAAAGTGGTCAG(35)   CCAAGTGCAACAAGGAGGTGT   GCTCGTTGCAGCCTCGTGAAC   TAGGAGGGTGCTTGGTTTTCC   GTGCGCTCTCGTGAGGTCTCG   TAGTGGCTTTGGGGGAGGATA(49)   ACAAAAGACTGCCAAGGACAT   AACCTGAGTGGAGTGGAATGG(8)   TGCGTAGTGTCTGAAAACTCA   CAGCTGCTTGTGAACTTTGGT   AGAGGAGCAGAGGCAGGAGAC   GGAAGATGCTGAGCAACGAG   TGCAGGTACAGGAATACACGA   CTCCGAGTCACTGGACAGGTC(20)   TCGTCCACTCTGAATCTCTTC   CTGGCTGTTTGCATCCAGG   TCCGGCCTTTCTCATACAGGA   TCCGCCACGGTCTCCATAAAT   CCAATGGGGTCGGAGGTAAAC(30)   GTCTACAGGGGAGGCGATGAC   ACAGTGAGGACCCCATCAGAT   CATGAGGAAGGTAAAATGCTG   CTAGCACAGGGATGAAACCAG   CAATGGAGCCCAGGATGAACT(40)   GGGTGGTTGCAGTAGGGTTTG   TCAGCACCCGCAGGGAGACAC   TTAGCCACAGCCCCAGATTCC   CGTTCGTCTCCCACCATAGTG   GTCCACTGTGGCTGTGAGAAT(50)   TATTCTCGATAAAGCCTGTGC   CLF-1   FLRG   推定的细胞周期蛋白G1相互作用蛋白   转谷氨酰胺酶2   XAP-5   GAPDH   CCGATGTACTCACGCTGGATA   TTTCTCAGCCCCAAGCCTCTA   CGGATGTCACTGTGCTTGAGG   TACGATGCGCCCTTTGTCTTT(59)   GGAAGCCAAGCAGGAGAAGAT   GTCAACGGATTTG GTCGTATT(63)   CATAGATGCCAAAGGGGTTGC   GTCCCCACACGCACTCAGACT   ATCGTGCCGGAAGAACTCCTG   AGCGGTGTTGTTGGTGATGTG(60)   TGAGCAACCGCACATCGTCAT   AGTCTTCTGGGTGGCAGTGAT(64)
*SEQ ID NO：-从7到64编号，从左到右，从上至下；示例性的SEQ ID NO：被显示。
                                                                               表4   甲基化引物   F1   F2   R   PCR扩增 序列   MUC1   RSG2   α-微管蛋白   Swiprosin-2   IGFBP2   CRBP   载脂蛋白D   神经介肽U   TAP1   溶酶体唾液酸苷酶前体   claudin-3   BMP-1   非配对蛋白2   CRIP-1   金属硫蛋白1G   Rad   载脂蛋白CI   CLF-1   FLRG   推定的细胞周期蛋白G1相互作用蛋白   转谷氨酰胺酶2   AACTACCCCTCCCCCCTCCC(65)*     ATCTCCTATCATAACTTCTCTAAAC   TCCTCCCACCAAACTAACAAT   TATTCTCCTTCAAAAATCATAATCA   ATCTCCTCTTCCTTFATAAAAAAAA   AACCAACTTTAACTCATAACCCTC(82)   CCCAATCCAATCCTTCCAAAAATAA   CAACATCCCTACAAAACACCACTCT   AAACCCAATAAAAATAATACCAATC   CACAAAACCAAATCCTTCCTCCCAA   TTTCGTTAGGTTATAGGTGTAGT(98)   AAAAAATCATAAAAAAAACCCTAAA   CTTAAACCCTAAACCTAAATTCAAA   CCCAACTACGCTCAAAAAACCTTAC   AATACCCCCTAAAACCTAATTCTAA   AAAACTAAAATAATCTAAAAACCCC(113)   TAAATTAAAAAACTTTAAAC   CCCTAAATCCAACCACATCTCCCCA   ACAAAATTTACACCTCCACACTAAA   ATCCCCTAAATAAACCCCAC(125)   AAACCCTTATACCCTACCCA(66)   TACTCCCACACCTACCCCAAC(68)   AAATTAAAAATCTAAACCAA   CCAATCCATCCTCAAACCCTC   ATAATCAAACCAAAAAAATA   CCTAAACAAACCTAACCCTT   TTATCTTTCTCTCACACATACTCTC(83)   TCCATTCTCTTTATCCCAAA   TAAAACACTAATTTCCAACC   CCTTCTTCACCCCAACCAAT   TCACTATCCTTAAACCCTAC   CGACTAAAACCCAAAAACAA(99)   CCCAAATAAAAACTAACAAA   ATCCCCAAAATCCAAATCCT   TACACTTAACCCATCTCCTA   CTTCTCTCACACCTCAAACC   ACCCCACAAAATCAAAAAAA(114)   TTATCAATTCAACTACTCAAACTTA   CCAAATACATTCTCTAACTC   ATTTTACCCCTATAAAACAT   TAAATAACCTCCCAAATCAC(126)   GAGGGGGTAGAATAGATTTAG (67)   TGTTTGCGTTTTTGTTTATGGGTTT(69)   ATTTTATTTAACGGTTATAAAGAGT   GTACGTTAGTTTTTTATTGGTTATGG   GGTAGGTGGTACGGTTTTGTGAG   TGATTGGAGTTAGTTGGTTATAAGT   TAGGTTTTTGATGTTTATTTTTTAT(84)   TTTATTTGGTGTTTTGGTTGTGTTT   TGTTTAATTTTTTTTATTATGTATA   ATTTTGGTAGTTAGATTTTATAGAG   GGACGGATGGATGGATTGATTTAT   TTTCGTTAGGTTATAGGTGTAGT(100)   CGAGCGTGGATAGTTAATTTTAAGG   TATTTTTTTGTTGTATTTGGGATAT   TTAAGCGAGAAGGGAAGAGGTAGTG   GAGGGGGTTGGTATTTTTTAGGAGG   TATTTAGTATTAATTTGAATTTTG(115)   AGAGTAGTAGTAGTAGGGGTAGTAA   AGGGTAGAGGTTAGAGTGGTTTTGG   AGGATTGATTTGGGAAGGGGAAGGG   GCGGTGATTTTGATATTTATTTT (127)   F2-R   F2-R   F1-R   F2-R   F1-R   F1-R   F1-R   F1-R   F1-R   F1-R   F1-R   F1-R   F2-R   F2-R   F1-R   F2-R   F1-R   F2-R   F1-R   F1-R   F2-R F2 F2 F2 F2 F2 F2 F2 F2 F2 F2 F2 F2 F2 F2 F2 F2 F2 F2 F2 F2 F2
*SEQ ID NO：-从65到127编号，从左到右，从上至下；示例性的SEQ ID NO：被显示。
表5  用5aza-dC处理HNSCC#011细胞系   1776_at   10.9   L24564/特征＝/定义＝HUMRAD人类Rad mRNA，完全编码序列   1902_at   5.562   来源：人类切除修复蛋白(ERCC1)mRNA，完全编码序列，克隆pcD   36953_at   3.5132   黑腹果蝇母体抗dpp(Mad)基因(DPC4基因)，GenBank   34892_at   2.4292   DR4同源基因；包含一个与TNF受体类似的死亡结构域；TRAIL受体   1879_at   3.7   M14949人类R-ras基因，外显子2至6   1860_at   2.3   U58334人类Bc12，p53结合蛋白   2031_at   2.9   U03106人类野生型p53激活片断1(WAF1)mRNA   595_at   3.648   肿瘤坏死因子α诱导蛋白   35151_at   2.4474   DOC-1相关蛋白   1668_s_a   2.4375   来源：人类(克隆g7)希-林氏(von Hippel-Lindau)疾病肿瘤抑制子   1814_at   3.3   人类TGF βIIR α的mRNA   425_at   5.8   X67325人类p27 mRNA   38374_at   2.3   AF050110人类TGFb早期可诱导蛋白和早期生长响应   1736_at   2.2   M62402人类胰岛素样生长因子结合蛋白6(IGFBP6)基因   39781_at   3.7   U20982人类胰岛素样生长因子结合蛋白4(IGFBP4)基因   32034_at   3.1   AF041259人类乳腺癌的推定转录因子(ZABC1)基因
表6  用5aza-dC+TSA处理HNSCC#013细胞系   1879_at   4.8   M14949人类R-ras基因，外显子2至6   41848_f_at   6.4361   来源：人类MDA-7(mda-7)mRNA，完全编码序列   1454_at   2.3633   来源：人类mad蛋白同源蛋白(hMAD-3)mRNA，完全编码序列   31851_at   2.3171   来源：人类可能的肿瘤抑制子的mRNA   38886_i_at   2.2503   来源：人类的推定的肿瘤抑制子NOEY2的mRNA   1211_s_at   2.1   U84388含有人类死亡结构域的蛋白CRADD的mRNA   33642_s_at   11.7   U17986人类GABA/去甲肾上腺素转运子的mRNA   1348_s_at   2.7   S79219转移相关基因(人类，高度转移性的肺细胞亚系)   1788_s_at   2.1   U48807人类MAP激酶磷酸酶(MKP2)的mRNA   38477_at   2.1   S81752 DPH2L＝可能的肿瘤抑制基因(卵巢癌，删除发生的关键区域)   34308_at   2.9   U90551人类组蛋白2A样蛋白的mRNA   33352_at   3.3   X57985人类组蛋白H2B.1和H2A的基因   37196_at   2.4   人类VE-钙依粘连蛋白的mRNA   38994_at   2.6   AF037989人类STAT诱导的STAT抑制剂2的mRNA

[0001]根据U.S.C.第119条(e)(1)的规定，本申请要求美国序列号为 60/362,577，归档日期为2002年3月7日的优先权，其所有内容都在 此整入以供参考。

[0002]本发明的部分是受政府支持来完成，由国立卫生院提供 CA84986-04号基金资助。因此美国政府可以享有这项发明的某些权 利。