可靶向转染背根神经节卫星胶质细胞腺病毒载体构建方法
专利汇可以提供可靶向转染背根神经节卫星胶质细胞腺病毒载体构建方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及 生物 工程 技术领域，尤其是可靶向 转染 背根神经节卫星胶质细胞腺病毒载体构建方法，其特征在于，取得适量pAAV-GFAP-EGFP表达质粒、pRep2/Cap6(pRC6)、pRC8和pHelper进行AAV病毒的生产，取得适量的AAV病毒进行梯度离心纯化，转染得到AAV载体，转染后三天，将细胞沉淀重悬于裂解缓冲液中，并通过3个循环的冻融裂解得到细胞裂解物A，进行纯化病毒载体完整性验证，分析EGFP表达的细胞特异性，评估载体注射后SGC转导的比率，得到结果。本发明成功构建含有GFAP启动子的AAV载体，AAV载体因安全性较高已经被美国FDA批准可供人体内使用，该载体能特异性在DRG内转染SGCs，为后续 基因 治疗 创造了条件，提高了安全性，促进神经性 疼痛 的治疗手段的进步，减轻了患者的负担。，下面是可靶向转染背根神经节卫星胶质细胞腺病毒载体构建方法专利的具体信息内容。
1.可靶向转染背根神经节卫星胶质细胞腺病毒载体构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一：取得适量pAAV-GFAP-EGFP表达质粒、pRep2/Cap6(pRC6)、pRC8和pHelper进行AAV病毒的生产，准备足量的裂解缓冲液(50mM Tris-HCl，150mM NaCl，2mM MgCl 2，pH8.0)、100U/ml的benzonase(Sigma-Aldrich)、含有2.5N NaCl的40％PEG8000(Sigma-Aldrich)的储存溶液、含有1mM CaCl 2和2mM KCl的磷酸盐缓冲盐水(PBS)、40ml Quick-Seal离心管、18号针头、Centricon Plus-20(Regenerated Cellulose 100，000MWCO，Millipore，Bill-erica，MA)、含有5％山梨糖醇(Sigma-Aldrich)的PBS、氨苄青霉素抗性基因、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)、Pierce银染色试剂盒(Fisher Scientific，Rockford，IL)、小鼠抗Vp1，-2，-3抗体(1：1000稀释；Research Diagnostic Inc.)、1％Alcian blue(Electron Microscopy Sciences)预处理铜网(400孔涂有聚醋酸甲基乙烯脂和薄碳膜；Electron Microscopy Sciences，Hatfield，PA)、1％乙酸双氧铀(Electron Microscopy Sciences)、JEOL 2100和Hitachi 600透射电子显微镜；
步骤二：取得适量的AAV病毒，采用Optirep(Sigma-Aldrich，St Louis，MO，USA)梯度离心纯化；
步骤三：通过用pRC6或pRC8和pHelper质粒将CaPO4共转染pAAV-GFAP-EGFP到293T细胞中来产生AAV载体；
步骤四：转染后三天，将细胞沉淀重悬于裂解缓冲液(50mM Tris-HCl，150mM NaCl，2mM MgCl 2，pH8.0)中，并通过3个循环的冻融裂解得到细胞裂解物A，将细胞裂解物A通过2500g离心30分钟澄清得到细胞裂解物B，将细胞裂解物B与100U/ml的benzonase(Sigma-Aldrich)在37℃温育1小时得到细胞裂解物C，将含有2.5N NaCl的40％PEG8000(Sigma-Aldrich)的储存溶液加入到细胞裂解物中至终浓度为8％，然后将溶液在冰上温育2小时，以2500g离心30分钟，并将沉淀在含有1mM CaCl 2和2mM KCl的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中分离；
步骤五：进行纯化病毒载体完整性验证；
步骤六：取2μl构建的腺相关病毒载体，通过微量注射器缓慢注射至SD大鼠DRG，注射完毕5min后缓慢撤出针头，病毒转染后5周将动物安乐死，DRG包埋切片，使用GFP抗体通过免疫荧光分析EGFP表达的细胞特异性；
步骤七：AAV6-GFAP-EGFP成功转染后EGFP在Tubb3标记的初级感觉神经元胞体周围呈环状表达，其中EGFP信号位于Tubb3阳性的神经元细胞及NKAα1标记的神经元质膜之外，与GFAP染色高度共定位；
步骤八：评估载体注射后SGC转导的比率，对围绕神经元的环形SGC行免疫组织化学检测：于注射AAV6-GFAP-EGFP的DRG，有70％±8％的神经元周围观察到EGFP阳性的环形SGC，而只有少数神经元胞体EGFP呈阳性(～1％)，得到本项目构建的病毒载体可特异性的在SGCs中表达的结果。
2.根据权利要求1所述的可靶向转染背根神经节卫星胶质细胞腺病毒载体构建方法，其特征在于，所述步骤一中pAAV-GFAP-EGFP表达质粒含有自身互补(sc)AAV2反向末端重复序列(ITR)，并通过GFAP启动子驱动嵌合内含子增强下游的EGFP转录，所述Rep2/Cap6(pRC6)和pRC8(Viromics，Fremont，CA，USA)分别含有来自AAV6或AAV8的AAV2复制(rep)和衣壳(cap)蛋白基因；所述编码腺病毒辅助基因的pHelper(Viromics)。
3.根据权利要求1所述的可靶向转染背根神经节卫星胶质细胞腺病毒载体构建方法，其特征在于，所述步骤二中Optiprep纯化AAV的方法包括以下步骤：
S1：用40ml Quick-Seal离心管行Optiprep梯度离心(Beckman Instruments，Palo Alto，CA，USA)，梯度分别为10ml，15％；8ml，25％；6ml，40％，2ml，60％；
S2：将15毫升AAV病毒进行裂解梯度离心，在70℃下在70Ti转子(Beckman Instruments)中以18℃离心70分钟，用18号针头从40-60％的之间和40％的下层1/2部分提取病毒；
S3：用Centricon Plus-20(Regenerated Cellulose 100，000MWCO，Millipore，Bill-erica，MA)浓缩获得的病毒悬浮液，并将最终的病毒制剂保持在含有5％山梨糖醇(Sigma-Aldrich)的PBS中，并在-80℃下储存；
S4：用PicoGreen法(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)测定相对于标准质粒的载体基因组，并且还在AAV载体变性后行点状印迹，使用氨苄青霉素抗性基因为引物行PCR检测，未发现纯化的AAV载体基因组中的AAV质粒污染，计算病毒滴度，单位为每ml的基因组拷贝数(GC/ml)，AAV6-EGFP和AAV8-EGFP载体的滴度分别为2.161013GC/ml和2.561013GC/ml。
4.根据权利要求1所述的可靶向转染背根神经节卫星胶质细胞腺病毒载体构建方法，其特征在于，所述步骤五中进行纯化病毒载体完整性验证方法包括以下步骤：
B1：首先通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳评估载体的纯度，然后使用Pierce银染色试剂盒(Fisher Scientific，Rockford，IL)进行银染色；
B2：使用小鼠抗Vp1，-2，-3抗体(1：1000稀释；Research Diagnostic Inc.)通过标准免疫印迹程序确认病毒衣壳蛋白；
B3：用NIH ImageJ软件(http://rsbweb.nih.gov/ij/)定量Vp1：Vp2：Vp3蛋白的比例和相对于凝胶上可见的非载体蛋白的纯度，进行负染色和电子显微镜(EM)扫描以评估纯化的AAV载体的颗粒含量；
B4：用1％Alcian blue(Electron Microscopy Sciences)预处理铜网(400孔涂有聚醋酸甲基乙烯脂和薄碳膜；Electron Microscopy Sciences，Hatfield，PA)并加载5ml病毒载体，洗涤网格，用1％乙酸双氧铀(Electron Microscopy Sciences)染色，并用JEOL 2100和Hitachi 600透射电子显微镜观察；
B5：通过直接计数电子显微照片确定颗粒比率。
5.根据权利要求1所述的可靶向转染背根神经节卫星胶质细胞腺病毒载体构建方法，其特征在于，本实验中所述AAV病毒制剂批次均为同一批次。
可靶向转染背根神经节卫星胶质细胞腺病毒载体构建方法
技术领域
背景技术
发明内容
具体实施方式
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