枸杞多糖通过调节血脑屏障抑制胶质瘤生长的实验方法
专利汇可以提供枸杞多糖通过调节血脑屏障抑制胶质瘤生长的实验方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且枸杞多糖通过调节血脑屏障抑制胶质瘤生长的实验方法，属于中医药领域。取雄性SD大鼠，给予枸杞多糖溶液饲养3-4周；然后构建大鼠胶质瘤模型；造模后继续给予枸杞多糖溶液并检测：①每组大鼠的生存时间，生存率及中位生存期；②取各组大鼠脑组织观察并测量 肿瘤 大小；③对各组大鼠通过股静脉注射伊文思蓝溶液，取等量脑组织检测伊文思蓝含量，判断血脑屏障通透性变化；④电镜观察血脑屏障超微结构变化；⑤对各组大鼠用多聚甲 醛 溶液进行心尖灌注，取脑 组织切片 后做免疫组化试验；⑥取各组大鼠分别直接断头取脑，提取RNA及蛋白，进行RT-PCR及Western blotting实验。本 发明 对 治疗 多种血脑屏障 疾病 提供了新的治疗途径。，下面是枸杞多糖通过调节血脑屏障抑制胶质瘤生长的实验方法专利的具体信息内容。
1.枸杞多糖通过调节血脑屏障抑制胶质瘤生长的实验方法，其特征在于：取雄性SD大鼠，先分别给予自来水与不同梯度枸杞多糖溶液（25mg/kg.d、50mg/kg.d、100mg/kg.d、
200mg/kg.d、400/kg.d）饲养3-4周；然后立体定位仪固定，构建大鼠胶质瘤模型，大鼠尾状核接种C6胶质瘤细胞（1×105个）；造模后继续给予不同浓度的枸杞多糖并检测以下指标：
①观察并记录每组大鼠的生存时间，计算生存率及中位生存期；以空白对照组大鼠中位生存期为准，再继续作如下检测：②取各组大鼠脑组织观察并测量肿瘤大小；③对各组大鼠通过股静脉注射伊文思蓝溶液，取等量脑组织检测伊文思蓝含量，判断血脑屏障通透性变化；
④电镜观察血脑屏障超微结构变化；⑤对各组大鼠应用4%多聚甲醛溶液进行心尖灌注，取脑组织切片后做免疫组化试验；⑥取各组大鼠分别直接断头取脑，提取RNA及蛋白，进行RT-PCR及Western blotting实验（③、④、⑤和⑥均选自上述肿瘤最小组脑组织，来检测颅内免疫指标及血脑屏障相关分子变化），该实验方法的技术路线为：实验动物分组及饲养——胶质瘤模型制备——生存期观察——肿瘤大小比较——血脑屏障通透性检测——扫描电镜观察血脑屏障超微结构变化——免疫组化实验——RT-PCR实验——Westernblotting实验——结果分析。
2.如权利要求1所述的实验方法，其特征在于：所述的实验动物分组及饲养的具体实验方法为：①取标准体重（180-200g）雄性SD大鼠200只，随机分为6组，每组25只（其中7只观察生存期，5只注射伊文思蓝检测血脑屏障变化，7只4%多聚甲醛灌注取脑测量肿瘤大小并做免疫组化实验，6只断头取脑用于RT-PCR 及Westernblotting实验），各组大鼠再随机分配：
4-5只/笼；各组均备有多余大鼠，以防造模失败或其他意外因素对实验造成影响；②空白对照组大鼠饮用水全程为自来水，实验组大鼠饮用水为不同浓度枸杞多糖溶液（实验开始前3天为大鼠适应期，给予自来水喂养，记录每笼大鼠的每天平均饮水量，并计算每只大鼠每天平均饮水量，以此来配置不同浓度枸杞多糖溶液，每5天测量一次大鼠体重，对枸杞多糖溶液浓度进行调整，保证每组大鼠所食用枸杞多糖分别为：25mg/kg.d、50mg/kg.d、100mg/kg.d、200mg/kg.d、400mg/kg.d）。
3.如权利要求1所述的实验方法，其特征在于：所述的胶质瘤模型制备具体操作方法为：①将培养瓶中C6细胞，用胰蛋白酶消化成单细胞悬液，调整细胞密度为4×106个/mL，备用；②麻醉：大鼠称重后，用10%水合氯醛麻醉（4ml/kg,ip）；③大鼠俯卧位固定于脑立体定位仪上，调整使前囟和后囟保持水平，备皮，碘伏消毒后头皮正中矢状切口，分离骨膜，暴露前囟；④定位左侧尾状核：前囟后0.5mm，左旁开3mm；标记后牙科钻钻孔；⑤用微量注射器吸取25ul单细胞悬液，进针5.8mm,6min内均匀注射完毕，停留5min，分2次缓慢退针（每次2-3分钟，中间停留5min）；⑥退针结束后骨蜡封孔，碘伏消毒后缝合皮肤；手术结束后大鼠喂养同前，注意保暖。
4.如权利要求1所述的实验方法，其特征在于：所述的生存期观察是从造模后开始记录，直到大鼠自然死亡，计算大鼠平均生存天数。
5.如权利要求1所述的实验方法，其特征在于：所述的肿瘤大小比较是用4%多聚甲醛溶液灌注后开颅取全脑，将全脑放于大鼠脑切片模具中，做全脑冠状位切片，层厚1mm，测量肿瘤最大长径a、最大宽径b(冠状面，单位mm)及层数c，计算肿瘤体积，肿瘤体积V=a×b×c×π/6。
6.如权利要求1所述的实验方法，其特征在于：所述的血脑屏障通透性检测是将10%水合氯醛溶液对大鼠麻醉，大鼠仰卧固定于手术台上，备皮，暴露股静脉，穿刺注射2%（2g伊文思蓝加入100mlPBS缓冲液）伊文思蓝溶液（2ml/kg）,40min后断头取脑组织100 mg左右（大鼠脑切片模具切取同一层面，右侧用来检测血脑屏障，左侧检测血肿瘤屏障）,称重后放入存有3 ml二甲基甲酰胺的试管中, 60℃水浴中( 避光) 抽提 24 h ，1500g离心10 min ,取上清,应用 RF540荧光分光光度计(λ=632 nm) 测定伊文思蓝荧光光度
(opticaldensity,OD),蒸馏水作为空白对照，根据光密度数值,从标准曲线上算出脑组织中伊文思蓝含量,以伊文思蓝含量 (μg /g湿脑组织) 代表血脑屏障通透性的改变。
7.如权利要求1所述的实验方法，其特征在于：所述的扫描电镜观察血脑屏障超微结构变化：用4%多聚甲醛溶液灌注后开颅取全脑，4℃生理盐水冲洗3次；切取右侧同一部位大鼠脑组织（大小约3mm×3mm×3mm）置于固定液后标记，4℃固定30min；将组织块在载玻片上修小，置于固定液4℃固定2-2.5h；更换缓冲液2h×3次；4℃ 1% 锇酸浸泡2h；0.1M二甲砷酸钠缓冲液冲洗15min×2次；脱水：①4℃ 30%酒精脱水 10min；②4℃ 50%酒精脱水 10min；③4℃ 70%酒精脱水 10min；④室温80%酒精脱水10min；⑤室温90%酒精脱水10min；⑥室温100%酒精脱水15min×2次；⑦室温环氧丙烷渗透15min×2次；⑧室温1:1（不完全包埋液:环氧丙烷）渗透1h；室温2:1（不完全包埋液:环氧丙烷）渗透1h；室温完全包埋液渗透过夜；⑨完全包埋液浸泡，置于35℃温箱6h，然后转移至包埋板（完全包埋液），42℃温箱过夜；⑩扫描电镜观察血脑屏障超微结构变化。
8.如权利要求1所述的实验方法，其特征在于：所述的免疫组化试验是用4%多聚甲醛溶液灌注后开颅取全脑，将脑组织置于4%多聚甲醛溶液中浸泡24h，更换20%及30%的蔗糖溶液分别脱水24h(均在4℃冰箱中完成),PBS缓冲液冲洗后，包埋剂包埋固定后置于莱卡冰冻切片机上切片（层厚25μm），直接贴在黏附载玻片上；置于37℃烘干箱中进行抗原修复1-2h；取出后PBS将脑片湿润；3%H2O2去离子水孵育10min，以阻断内源性过氧化物酶；PBS冲洗2min×
3次；山羊血清封闭40min；滴加一抗（兔抗大鼠CD3单克隆抗体，兔抗大鼠CD8单克隆抗体），
37℃孵育2h，PBS冲洗2min×3次；加二抗，37℃孵育20min，PBS冲洗2min×3次；滴加试剂1，
37℃孵育20min，PBS冲洗2min×3次；滴加试剂2，37℃孵育20min，PBS冲洗2min×3次；滴加苏木素复染15min；风化液（75%酒精99ml+浓盐酸1ml）浸泡2-5s，pbs冲洗2min×3次，晾干；
梯度酒精（75%、80%、90%、100%）脱水（各2-3min）；二甲苯脱水透明2-3min；中性树胶封片；显微镜下观察拍照。
9.如权利要求1所述的实验方法，其特征在于：所述的RT-PCR检测是将大鼠直接断头取脑后，取脑组织100mg置于组织匀浆器中研碎，加入1-1.5ml Trizol试剂,转移至2ml EP管中，室温下使脑组织充分裂解；加入氯仿（为Trizol体积的1/5）,震荡均匀，室温放置15min；
离心15min（4℃，12000rpm）,管中液体分三层；吸取最上层（RNA）置于新的无RNA酶EP管中，加入等体积的异丙醇，充分混匀后室温静置10min；4℃，12000rpm离心10min，弃上清，底部沉淀即为RNA；加入1ml 75%酒精上下混匀对RNA进行清洗，4℃，12000rpm离心10min，弃上清；自然晾干后加入适量DEPC水溶解，测定RNA浓度；根据美国Thermo公司RNA逆转录试剂盒对RNA进行反转录，再根据德国DBI荧光定量试剂盒进行RT-PCR检测。
10.如权利要求1所述的实验方法，其特征在于：所述Westernblotting实验:大鼠直接断头取脑后，取脑组织100mg置于组织匀浆器中研碎，根据凯基蛋白提取试剂盒操作进行蛋白提取，根据BCA试剂盒操作方法进行蛋白浓度测定；然后加上样缓冲液，100 ℃ 5 min使蛋白变性；取50 μg蛋白（25 μL）上样，进行SDS-PAGE（90 V，90 mi n）以分离蛋白，然后电转膜（300 mA，70 min），PVDF 膜用脱脂牛奶封闭1 h；分别加入兔抗大鼠GAPDH和ANXA1单克隆抗体（体积稀释比例均为1∶1 000），4 ℃反应过夜；TBS缓冲液洗膜后，加入IRDye 800CW 标记的山羊抗兔荧光二抗（体积稀释比例为1∶4 000），常温杂交1 h；再次洗膜后，置于Odyssey Infrared Imaging仪进行曝光，应用ImageJ Setup软件进行蛋白条带的灰度值扫描，以目的蛋白与内参GAPDH蛋白条带的灰度值之比表示各蛋白的相对表达水平。
枸杞多糖通过调节血脑屏障抑制胶质瘤生长的实验方法
技术领域
背景技术
发明内容
100mg/kg.d、200mg/kg.d、400/kg.d）饲养3-4周；然后立体定位仪固定，构建大鼠胶质瘤模型，大鼠尾状核接种C6胶质瘤细胞（1×105个）；造模后继续给予不同浓度的枸杞多糖并检测以下指标：①观察并记录每组大鼠的生存时间，计算生存率及中位生存期；以空白对照组大鼠中位生存期为准，再继续作如下检测：②取各组大鼠脑组织观察并测量肿瘤大小；③对各组大鼠通过股静脉注射伊文思蓝溶液，取等量脑组织检测伊文思蓝含量，判断血脑屏障通透性变化；④电镜观察血脑屏障超微结构变化；⑤对各组大鼠应用4%多聚甲醛溶液进行心尖灌注，取脑组织切片后做免疫组化试验；⑥取各组大鼠分别直接断头取脑，提取RNA及蛋白，进行RT-PCR及Western blotting实验（③、④、⑤和⑥均选自上述肿瘤最小组脑组织，来检测颅内免疫指标及血脑屏障相关分子变化）。
2、本发明实验方法结果显示枸杞多糖具有调节血脑屏障开放的作用，可有效辅助化疗，特别是对术后患者的保守治疗，促使化疗药物进入颅内，增强药物疗效，从而达到治疗肿瘤的效果；
3、 本发明实验方法对枸杞多糖相关药物研发，联合多种制剂更加有效调节血脑屏障的开放，为阿尔茨海默病等多种血脑屏障相关疾病提供了新的治疗途径。
附图说明
图3为伊文思蓝在不同组大鼠脑组织中的含量示意图；
图4为不同组血脑屏障关键分子变化示意图；
图5为免疫组化实验示意图。
具体实施方式
15min×2次；⑧室温1:1（不完全包埋液:环氧丙烷）渗透1h；室温2:1（不完全包埋液:环氧丙烷）渗透1h；室温完全包埋液渗透过夜；⑨完全包埋液浸泡，置于35℃温箱6h，然后转移至包埋板（完全包埋液），42℃温箱过夜；⑩扫描电镜观察血脑屏障超微结构变化。
37℃孵育20min，PBS冲洗2min×3次；滴加试剂1，37℃孵育20min，PBS冲洗2min×3次；滴加试剂2，37℃孵育20min，PBS冲洗2min×3次；滴加苏木素复染15min；风化液（75%酒精99ml+浓盐酸1ml）浸泡2-5s，pbs冲洗2min×3次，晾干；梯度酒精（75%、80%、90%、100%）脱水（各2-
3min）；二甲苯脱水透明2-3min；中性树胶封片；显微镜下观察拍照。
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