技术领域
[0001] 本
发明涉及二芳基庚烷化合物分离领域，尤其涉及一种核桃青皮中二芳基庚烷化合物分离与制备方法。
背景技术
[0002]
现有技术中二芳基庚烷化合物的提取，一般包括干燥，浸膏提取和分离纯化过程，将所得组分分别采用不同
试剂进行反应后，最终混合得到含有二芳基庚烷化合物的物质。该种方法提取制备的二芳基庚烷化合物的提取率相对较低。
[0003] 鉴于上述
缺陷，本发明创作者经过研究和实践终于获得了本创作。
发明内容
[0004] 本发明的目的在于提供一种核桃青皮中二芳基庚烷化合物分离与制备方法，用以克服上述技术缺陷。
[0005] 为实现上述目的，本发明提供一种核桃青皮中二芳基庚烷化合物分离与制备方法，该具体过程为：
[0006] 步骤a，核桃青皮脂类物质粗提取，以胡桃青皮为原料，经
超声波微波萃取仪辅助处理后，采用多级萃取提取，以甲醇∶
水为4∶1的比例的
混合液为提取剂，
超声波微波萃取仪辅助处理后采用MSE获得乙酸乙酯提取液；
[0007] 步骤b，薄层层析分离，对步骤a中的提取物质进行提取分离和比对分析；
[0008] 步骤c，利用高速逆流色谱仪对各
单体进行采集和制备。
[0009] 将TLC(展开剂∶苯∶乙酸乙酯＝11∶1)获得6种单体物质与8种纯品进行逐一比对，结合UV法检测与相关文献资料查询表明乙酸乙酯提取液为二芳基庚烷类化合物。
[0010] 进一步地，上述步骤a的具体过程为：
[0011] 步骤a1，核桃青皮的处理；取核桃青皮于通
风处阴干至材料发脆，放入恒温箱内，在40～45℃下烘干，
磨碎后，过80目筛，装入玻璃容器中备用；
[0012] 步骤a2，甲醇水浸提；等量称取3份20克核桃青皮粉于3个250mL的锥形瓶中，按水∶甲醇1∶4的比例依次加入甲醇水溶液200mL，用恒温磁
力搅拌器搅拌均匀至形成悬浮液；
[0013] 步骤a3，超声波微波萃取仪处理：超声波微波辅助萃取仪分三阶段对3组悬浮液分别进行处理，每阶段5min，共15min；
[0014] 在超声波恒定的条件下，设置
温度为45℃、50℃、55℃，超声波功率为800、900、1000W，微波功率为100、200、300W，超声波
频率为50KHz，模式15∶10，
电机转速900r/min；
[0015] 步骤a4，离心：将提取液于3000r/min下离心10min，3次，获取残渣，将残渣置于
真空干燥箱蒸干，在
电子天平上准确称量得平均数为13.5克；合并上清液；
[0016] 步骤a5，乙酸乙酯浸提：将残渣分别置于3个250mL的锥形瓶，以物料比1∶15加入乙酸乙酯，在恒温磁力搅拌器下搅拌15min后置于离心机于3000r/min下离心10min，3次，合并并过滤上清液。将滤液于
旋转蒸发仪浓缩，设置水浴温度为70℃(乙酸乙酯沸点
77℃)，回收乙酸乙酯，滤液定容至40mL；残渣在真空干燥箱干燥，在电子天平上称量三组得平均数12.5克；
[0017] 按照下述公式计算出乙酸乙酯溶液对核桃青皮的提取率。
[0018] 步骤a6，紫外扫描：将所得乙酸乙酯提取液稀释5倍后在紫外光分光光度计下进行190nm-900nm的扫描，确定扫描波峰。
[0019] 进一步地，上述步骤b的具体过程为：
[0020] 步骤b1，
硅胶板制作：配制0.5％羧甲基
纤维素钠溶液：用量筒准确量取5000mL蒸馏水于大试剂瓶，用电子天平称取25g羧甲基
纤维素钠，并将其均匀地撒在蒸馏水面上，使其充分浸泡至完全浸湿下沉，并用磁力搅拌器加热搅拌促进溶解，约半个小时，之后用300目筛将溶液进行过滤，除去絮状沉淀，静置两个星期备用；
[0021] 步骤b2，配制硅胶液：根据所制作板的数量按
羧甲基纤维素钠溶液∶硅胶G＝3∶1的比例称取两物质，并将硅胶G撒在羧甲基纤维素钠溶液上至完全浸透沉淀，用玻璃棒朝一个方向匀速搅拌至均匀，加入适量微晶纤维素，大约每20g硅胶G加2～3g，以增强粘着力，搅拌均匀，置于真空干燥箱进行减压脱气约15min；
[0022] 步骤b3，板的涂布：将配好的硅胶液适量倒在擦净的
载玻片上，用玻璃棒均匀涂布，并轻轻从底部敲打载玻片使硅胶液在载玻片上形成一个平整的液面，同时除去少量夹杂的气泡，将涂布好的硅胶板置于
通风干燥处阴干；
[0023] 步骤b4，板的活化：将完全阴干后的硅胶板置于通风干燥箱，在110℃高温下
烘烤半个小时进行活化处理，随后放入干燥器以备用；
[0024] 步骤b5，点样；
[0025] 步骤b6，展开剂展开：将展开剂，苯∶乙酸乙酯＝11∶1的比例置于层析缸并盖好，等待3min至缸内有均匀的展开剂蒸气，将点样完成的硅胶板轻轻放入层析缸，等待展开剂前沿到达距离硅胶板顶端1cm处将板取出晾干，并用铅笔做出标记，计算出展开的Rf值；
[0026] 步骤b7，薄层色谱系统成像：将晾干展开的硅胶板置于薄层色谱成像系统中在365nm外光下拍照成像；
[0027] 与标准品比对，初步确定乙酸乙酯溶液中可能含有的物质；
[0028] 用20cm×10cm硅胶板将乙酸乙酯溶液和通过紫外扫描所确定含有的物质样液进行点样展开，进一步观察是否展开后在同一水平线上有相同
颜色斑点，以验证是否确实含有该物质。
[0029] 进一步地，上述步骤c的具体过程为；
[0030] 步骤c1，刮板溶解检测；将硅胶板置于紫外分析仪下用254nm紫外光照射，用铅笔将展开的各个斑点依次标记，并用小刀刮取各个斑点硅胶置于5mL收集瓶中，加入适量乙酸乙酯溶解，将硅胶过滤，所得滤液用紫外分光光度计进行190-400nm波峰扫描，确定各个斑点的
波长及波峰吸收值；
[0031] 步骤c2，HSCCC提取纯化；用大分液漏斗配制合理的上下相溶液2000mL，正己烷∶乙酸乙酯∶甲醇∶纯水＝1∶0.6∶0.6∶1，用
溶剂瓶将上下相分别收集，置于超声波清洗器中脱气20min备用；
[0032] 将收集瓶中各斑点乙酸乙酯溶液在电热板上蒸干至粉末状，加入3mL下相溶液进行震荡溶解，将溶液在紫外分光光度计下进行波长波峰扫描，以确定分离提取的适当波长；
[0033] 在高速逆流色谱仪上设置参数，波长213nm，时间200min，进行分离纯化并收集，记录保留相关数据。
[0034] 进一步地，上述步骤b中点样的过程为：用
微量注射器吸取25mL乙酸乙酯提取液置于全自动点样机上，设置参数进行点样，斑点宽度2mm斑点间距离5mm，每次点样量5mL。
[0035] 进一步地，上述步骤b中点样的过程为：用玻璃毛细管吸取少量乙酸乙酯样液，在硅胶板距离底部1cm高处进行点样，点样直径控制在3mm以内，点与点之间距离为5mm～1cm，每点样一次，等待彻底吹干后再进行第二次点样，每一个斑点点样三次以上以达到浓缩积累的效果。
[0036] 与现有技术相比较本发明的有益效果在于：本发明中，HSCCC方法制备二芳基庚烷类化合物技术简单、易于操作，且原料低廉、产率较高，对核桃青皮粉的提取率相对较高。
附图说明
[0037] 图1为本发明的分离与制备方法的流程示意图；
[0038] 图2a为本发明的乙酸乙酯提取液紫外扫描图；
[0039] 图2b为本发明的蒽
酮乙酸乙酯溶液紫外扫描图；
[0040] 图2c为本发明的焦性
没食子酸乙酸乙酯溶液紫外扫描图；
[0041] 图2d为本发明的没食子酸乙酸乙酯溶液紫外扫描图；
[0042] 图2e为本发明的
单宁酸乙酸乙酯溶液紫外扫描图；
[0043] 图2f为本发明的
儿茶素乙酸乙酯溶液紫外扫描图；
[0044] 图2g为本发明的
绿原酸乙酸乙酯溶液紫外扫描图；
[0045] 图2h为本发明的胡桃醌乙酸乙酯溶液紫外扫描图；
[0046] 图2i为本发明的类胡萝卜素乙酸乙酯溶液紫外扫描图；
[0047] 图3a-3e为本发明的为硅胶板从上到下A、B、C、D、E各物质刮板物质紫外扫描吸收图；
[0048] 图4a为本发明的HSCCC收集图谱一；
[0049] 图4b为本发明的HSCCC收集图谱二。
具体实施方式
[0050] 以下结合附图，对本发明上述的和另外的技术特征和优点作更详细的说明。
[0051] 请参阅图1所示，本发明的核桃青皮中二芳基庚烷化合物分离与制备方法的过程为：
[0052] 步骤a，核桃青皮脂类物质粗提取；
[0053] 步骤a1，核桃青皮的处理；取核桃青皮于通风处阴干至材料发脆，放入恒温箱内(40～45℃)烘干，磨碎后，过80目筛，装入玻璃容器中备用。
[0054] 步骤a2，甲醇水浸提；等量称取3份20克核桃青皮粉于3个250mL的锥形瓶中，按水∶甲醇1∶4的比例依次加入甲醇水溶液200mL，用恒温磁力搅拌器搅拌均匀至形成悬浮液。
[0055] 步骤a3，超声波微波萃取仪处理：超声波微波辅助萃取仪分三阶段对3组悬浮液分别进行处理，每阶段5min，共15min。在超声波恒定的条件下，设置温度为45℃、50℃、55℃，超声波功率为800、900、1000W，微波功率为100、200、300W，超声波频率为50KHz，模式
15∶10，电机转速900r/min。
[0056] 步骤a4，离心：将提取液于3000r/min下离心10min，3次，获取残渣，将残渣置于真空干燥箱蒸干，在电子天平上准确称量得平均数为13.5克；合并上清液(它用)。
[0057] 步骤a5，乙酸乙酯浸提：将残渣分别置于3个250mL的锥形瓶，以物料比1∶15加入乙酸乙酯，在恒温磁力搅拌器下搅拌15min后置于离心机于3000r/min下离心10min，3次，合并并过滤上清液。将滤液于
旋转蒸发仪浓缩，设置水浴温度为70℃(乙酸乙酯沸点
77℃)，回收乙酸乙酯，滤液定容至40mL；残渣在真空干燥箱干燥，在电子天平上称量三组得平均数12.5克。
[0058] 按照下述公式计算出乙酸乙酯溶液对核桃青皮的提取率。
[0059] 提取率＝【(实验前称取核桃青皮粉
质量-甲醇浸提量-最后蒸干所得残渣质量)/核桃青皮粉质量】×100％(甲醇浸提量＝青皮粉量-甲醇浸提后蒸干的残渣质量)[0060] 步骤a6，紫外扫描：将所得乙酸乙酯提取液稀释5倍后在紫外光分光光度计下进行190nm-900nm的扫描，确定扫描波峰。
[0061] 步骤b，薄层层析分离；
[0062] 步骤b1，硅胶板制作：配制0.5％羧甲基纤维素钠溶液：用量筒准确量取5000mL蒸馏水于大试剂瓶，用电子天平称取25g羧甲基纤维素钠，并将其均匀地撒在蒸馏水面上，使其充分浸泡至完全浸湿下沉，并用磁力搅拌器加热搅拌促进溶解，约半个小时，之后用300目筛将溶液进行过滤，除去絮状沉淀，静置两个星期备用；
[0063] 步骤b2，配制硅胶液：根据所制作板的数量按羧甲基纤维素钠溶液∶硅胶G＝3∶1的比例称取两物质，并将硅胶G撒在羧甲基纤维素钠溶液上至完全浸透沉淀，用玻璃棒朝一个方向匀速搅拌至均匀，加入适量微晶纤维素(大约每20g硅胶G加2～3g)以增强粘着力，搅拌均匀，置于真空干燥箱进行减压脱气约15min，以免薄层表面出现气泡，影响分离效果；
[0064] 步骤b3，板的涂布：将配好的硅胶液适量倒在擦净的载玻片上，用玻璃棒均匀涂布，并轻轻从底部敲打载玻片使硅胶液在载玻片上形成一个平整的液面，同时除去少量夹杂的气泡，将涂布好的硅胶板置于通风干燥处阴干；
[0065] 步骤b4，板的活化：将完全阴干后的硅胶板置于通风干燥箱，在110℃高温下烘烤半个小时进行活化处理，随后放入干燥器(内置变色硅胶)以备用；
[0066] 步骤b5，点样：
[0067] 方法一：用
微量注射器吸取25mL乙酸乙酯提取液置于全自动点样机上，设置参数进行点样(斑点宽度2mm斑点间距离5mm，每次点样量5mL)；
[0068] 方法二：用玻璃毛细管吸取少量乙酸乙酯样液，在硅胶板距离底部1cm高处进行点样，点样直径控制在3mm以内，点与点之间距离为5mm～1cm，每点样一次，等待彻底吹干后再进行第二次点样(以防凝集展不开)，每一个斑点点样三次以上以达到浓缩积累的效果。
[0069] 步骤b6，展开剂展开：将展开剂(苯∶乙酸乙酯＝11∶1)置于层析缸并盖好，等待3min至缸内有均匀的展开剂蒸气，将点样完成的硅胶板轻轻放入层析缸，等待展开剂前沿到达距离硅胶板顶端1cm处将板取出晾干，并用铅笔做出标记，计算出展开的Rf值(在0.3～0.5为最佳)；
[0070] 步骤b7，薄层色谱系统成像：将晾干展开的硅胶板置于薄层色谱成像系统中在365nm外光下拍照成像；
[0071] 与标准品比对：根据文献资料猜测乙酸乙酯溶液中可能含有的物质成分，并取适量纯品用乙酸乙酯溶解，配制一定浓度的样液；将样液分别用紫外分光光度计进行波长波峰值的扫描，确定各个物质的吸收波长，保存波样图；将乙酸乙酯溶液扫描图与各个纯品样液扫描图进行比对，初步确定乙酸乙酯溶液中可能含有的物质；
[0072] 用20cm×10cm硅胶板将乙酸乙酯溶液和通过紫外扫描所确定含有的物质样液进行点样展开，进一步观察是否展开后在同一水平线上有相同颜色斑点，以验证是否确实含有该物质。
[0073] 步骤c，利用高速逆流色谱仪(HSCCC)纯化收集；
[0074] 步骤c1，刮板溶解检测：将硅胶板置于紫外分析仪下用254nm紫外光照射，用铅笔将展开的各个斑点依次标记，并用小刀刮取各个斑点硅胶置于5mL收集瓶中，加入适量乙酸乙酯溶解，将硅胶过滤，所得滤液用紫外分光光度计进行190-400nm波峰扫描，确定各个斑点的波长及波峰吸收值；
[0075] 步骤c2，HSCCC提取纯化：用大分液漏斗配制合理的上下相溶液2000mL(正己烷∶乙酸乙酯∶甲醇∶纯水＝1∶0.6∶0.6∶1)，用溶剂瓶将上下相分别收集，置于超声波清洗器中脱气20min备用；
[0076] 将收集瓶中各斑点乙酸乙酯溶液在电热板上蒸干至粉末状，加入3mL下相溶液(甲醇-水)进行震荡溶解，将溶液在紫外分光光度计下进行波长波峰扫描，以确定分离提取的适当波长；
[0077] 在高速逆流色谱仪上设置参数(波长213nm，时间200min)进行分离纯化并收集，记录保留相关数据。
[0079] 在本实施例中，主要试剂与仪器：
[0080] 主要试剂：甲醇、乙酸乙酯、羧甲基纤维素钠、硅胶G、微晶纤维素、正己烷、苯、乙酸乙酯、
乙醇、浓
盐酸、白凡士林，纯水(自制)。
[0081] 主要仪器：TU-1901双光束紫外可见分光光度计(北京普析)、XH-300B微波超声波组合合成/萃取仪(北京祥鹄)、TBE300B高速逆流色谱仪(上海同田)、KH-3000Plus型全能型薄层色谱
扫描仪(上海科哲)。
[0082] 主要材料：核桃青皮取于吕梁本地。
[0083] 1、乙酸乙酯提取率
[0084] 将甲醇水溶液和乙酸乙酯浸提前后青皮粉质量进行
整理列表计算即可得出乙酸乙酯溶液的提取率，数据见下表：
[0085] 表1各组浸提质量及提取率
[0086]
[0087] 由表1数据可知，乙酸乙酯溶剂对核桃青皮粉的提取率相对较高，平均值在20％左右，初步可以说明乙酸乙酯溶液中所提物质丰富。
[0088] 2、乙酸乙酯溶液及各物质纯液紫外扫描结果
[0089] 用紫外分光光度计对乙酸乙酯溶液进行扫描，根据文献资料判断可能含有的化学物质，并配制成一定浓度样液。
[0090] 图2a为乙酸乙酯青皮提取液；图2b-2i分别为蒽酮、焦性没食子酸、没食子酸、
单宁酸、儿茶素、绿原酸、胡桃醌和类胡萝卜素乙酸乙酯溶液。
[0091] 通过观察乙酸乙酯溶液和各个物质样液在紫外分光光度计下扫描图，初步判断乙酸乙酯提取液中可能含有蒽酮、焦性没食子酸、没食子酸、单宁酸、儿茶素、绿原酸、胡桃醌、类胡萝卜素。
[0092] 3、薄层展开比对验证
[0093] 乙酸乙酯青皮提取液与各标样薄层比对：
[0094] 可以看出，在同一条件下，各纯品样液经展开后，在硅胶板顶端
位置处，蒽酮与乙酸乙酯样液有相同的蓝色
荧光斑，其余没有与乙酸乙酯溶液展开图像相一致的斑点(颜色、位置均不同)，由此，薄层比对成像看出，乙酸乙酯分离出的物质中可能含有蒽酮，其它不一定是上述所猜测的这些化合物，而可能为其它物质。
[0095] 并且，通过乙酸乙酯与蒽酮点样对比，展开所得结果显示：蒽酮没有与样液相似的点，与之前所得结果图有矛盾，可能展开距离以及蒽酮药品纯度均有影响。
[0096] 4、刮板溶解扫描
[0097] 将硅胶板分离开的各个物质分别进行刮板，用乙酸乙酯溶解并在紫外分光光度计下进行扫描。
[0098] 图3a-3e为本发明的为硅胶板从上到下A、B、C、D、E各物质刮板物质紫外扫描吸收图，从上到下各物质主要吸收波长分别在260nm，250nm-210nm处，在后三个在270～280nm处有特征吸收，初步判断分离到的为二芳基庚烷类化合物。
[0099] 5、HSCCC纯化收集
[0100] 将乙酸乙酯提取液蒸干后用下相溶液溶解，在紫外分光光度计下扫描，各物质均在235nm波长处有明显吸收。因此可设置高速逆流色谱仪上最相近波长254nm进行纯化收集。
[0101] 本发明中，将胡桃青皮阴干、80目过筛后经超声波微波萃取仪辅助处理，可降低青皮中
氧化物质的的分解，最大限度释放细胞内的功能物质；采用MSE法可有效地将青皮中功能成分逐一释放采集，有利于核桃青皮中
生物分子的产业化利用。
[0102] 利用TLC法(展开剂∶苯∶乙酸乙酯＝11∶1)分离、纯化获得的6种单体物质，经过TLC比对分析，结合UV法检测与相关文献资料查询表明乙酸乙酯提取液为二芳基庚烷类化合物。既建立了TLC法实验体系，又可准确对功能物质进行分离、纯化。并且为HSCCC法从核桃青皮中获得二芳基庚烷类化合物提供了科学依据。
[0103] 利用HSCCC法采集和制备了6种单体物质，首次建立了从核桃青皮中获取二芳基庚烷类化合物的HSCCC上下相溶液体系(正己烷∶乙酸乙酯∶甲醇∶纯水＝1∶0.6∶0.6∶1)，为核桃青皮中生物分子的产业化生产提供了技术支持。
[0104] 上述二芳基庚烷类化合物分离与制备的原理为：
[0105] 二芳基庚烷类化合物分子中有两个苯环，某些化合物庚烷链上存在共轭烯酮结构，整个分子中存在共轭结构，形成离域的P分子轨道，电子容易激发。同时，苯环上多连有供电子甲氧基或羟基，P→P*跃迁在较长波长处发生，其中联苯型二芳基庚烷类化合物在300nm、250～260nm、205～215mm波长附近通常有强吸收。在二苯醚型二芳基庚烷类化合物中，由于醚键的存在，一般在270～280nm附近有较强吸收，这也是二苯醚型二芳基庚烷类化合物和联苯型化合物之间的一个显著区别。
[0106] 以上所述仅为本发明的较佳实施例，对发明而言仅仅是说明性的，而非限制性的。本专业技术人员理解，在发明
权利要求所限定的精神和范围内可对其进行许多改变，
修改，甚至等效，但都将落入本发明的保护范围内。
