本发明的一个目的是提供一种系统以用于测试潜在的药物候选物及 其代谢物的毒性。
本发明提供一种系统用于测试潜在的药物候选物的毒性。该系统具有 一种肝切片培养装置，其由下列各项组成：具有培养基入口和气阀的腔室， 被牢固定位于该腔室中从而使暴露于该培养基的肝切片的表面积最大化 的多个动物肝切片，用于选择性提供和去除腔室中的培养基从而使在腔室 中的培养基与肝切片接触和从与肝切片的接触中被移去的工具，和当该培 养基进入和退出该腔室时用于包含培养基的贮器。在定期供应培养基下， 将动物肝切片培养在充氧气体的环境中从而使所述切片交替暴露于培养 基和气体。当肝切片暴露于潜在的药物候选物时，潜在药物候选物的毒性 可以通过观察肝切片在存在潜在的药物候选物时代谢化合物的效率来确 定。
在另一个实施方案中，该系统具有一种网眼，该网眼至少部分围绕动 物肝切片从而形成间隔并且在该间隔中保持该切片。在该实施方案中，所 述网眼在腔室中是近似垂直的。另外的实施方案具有两个至少部分围绕肝 切片的网眼。
本发明还提供用于评估药物毒性的方法。所述方法包括提供培养基， 使培养基与动物肝切片接触，其中所述动物肝切片被牢固定位在腔室中从 而使肝切片暴露于培养基的表面积最大。该腔室具有血浆入口和气阀，用 于选择性提供和去除腔室中的血浆从而使在腔室中的血浆与肝切片接触 和从与肝切片的接触中被移去的工具，将气体供应给该腔室的工具，和当 血浆进入和退出该腔室时用于包含血浆的贮器。该方法还包括使肝切片与 氧和二氧化碳的气体混和物接触，将肝切片交替暴露于血浆和氧及二氧化 碳气体的混合物，并且将肝切片暴露于待测试的药物。当该肝切片暴露于 药物时，该药物的毒性可以通过观察肝切片在存在药物时代谢化合物的效 率来确定。
在本文公开的实施方案中，可以从由氨和利多卡因组成的组中选择将 要被代谢的化合物。
附图简述
本发明的另外的特性和优势将参考附图，从随后的优选实施方案的描 述中变得显而易见，在所述附图中：
图1是本发明系统的示意图；
图2A是本发明的肝切片排列的侧截面图；
图2B是图2A的肝切片排列的透视图；
图3A是使用本发明的生物人工肝系统以持续和间歇灌注进行的体外利多 卡因清除率的图示；
图3B是使用本发明的生物人工肝系统运行6小时和24小时的体外利多卡 因清除率的图示；
图4是使用本发明的生物人工肝系统运行6小时和24小时的体外DMX浓 度的图示；和
图5是使用本发明的生物人工肝系统运行6小时和24小时的体外氨清除 率的图示；
实施发明的最佳方式
对于药物公司而言，在临床前药物开发阶段中的目标是显示该化合物 用在作为小范围的临床研究的下一阶段中相当安全。通过体内和体外动物 测试来认识化合物的毒性和药理学作用。最少，FDA将要求药物公司：(1) 开发药物的药理学模式；(2)在动物的至少两个物种中确定该药物的急性毒 性；和(3)取决于在计划的临床研究中计划的延续时间和物质的使用，在2 周到3个月的范围内进行短期毒性研究。该过程是复杂的且昂贵的，其中 要测试数百和有时数千的化合物。
这种测试经常由独立的第三方进行以避免任何偏见的出现。进行每一 方面的努力来确保使用尽可能少的动物，并且使它们被人道地对待。通常 使用两个物种的动物，一种是啮齿类，一种是非啮齿类动物，因为药物对 一个物种的影响方式可能不同于另一种。由于大多数药物在肝中进行代 谢，毒性研究自然集中于对肝的影响上。
本发明，通过使用肝切片，理想地适合于临床前开发过程。所需要的 动物的数量被最少化，因为经常需要使动物经历充满压力和疼痛的测试过 程。
按照本发明，提供了一种生物人工肝系统用于评估，检测和测试药物 候选物，药物和药物代谢物。该系统具有肝切片培养装置。
在本发明的一个实施方案中，该装置包括具有气阀的腔室，和多个动 物肝切片，所述动物肝切片被牢固定位在腔室中从而使肝切片暴露于培养 基的表面积最大化。存在一种工具，所述工具用于选择性提供和移动培养 基到腔室从而使在腔室中的培养基上升得以与肝切片接触。培养基在腔室 中上升，从而使肝切片彻底被浸没。该工具也能从与肝切片的接触中移去 培养基。在另外的实施方案中，还存在提供气体到腔室上部的工具从而使 肝切片交替暴露于气体和培养基。此外，提供贮器用于当培养基进入和退 出腔室时包含该培养基。该腔室优选地是温度调节的。对于人肝切片，该 温度优选地保持在约36.5摄氏度。对于啮齿类动物肝切片而言，其保持在 约36到38摄氏度之间。然而，猪的肝切片对于温度变动非常敏感并且其 必须维持在38摄氏度，猪的正常体温。
图1是按照本发明的药物测试系统10的示意图。从贮器12，将培养 基13引入肝切片培养装置14。肝切片15被排列在两个金属丝网眼16之 间，并且被垂直平行放置在生物反应器中。当培养基被引入生物反应器中 时，流体水平开始上升直到其得以与肝切片接触，并且最终肝切片彻底被 浸没。
通过在腔室上部中的气阀17引入氧化的气体。尽管该气阀显示在腔 室的上部中，本文还意欲该气阀可以在该腔室的侧面或底部，并配有适合 的密封从而防止液体培养基的渗漏。该气体优选地是95体积％的O2和5 体积％的CO2的混合物，并且以1-10ATM的范围的压力通过气阀供应到 腔室并从其中排放，同时通过压力控制器(未显示)来控制压力。螺线管阀 门(也未显示)可以与压力控制器偶联以维持预设定的气压。气体灭菌装置 18，例如，一种具有约0.22μm的孔径的注射器滤器优选地被安装在气阀 17中从而过滤微生物，由此将供应到腔室中的气体进行灭菌。将具有气体 灭菌阀门18的闭气阀11定位在培养基贮器上并用于平衡贮器和气压之间 的压力。
肝切片的稳定化是本发明的重要特点。肝切片在液体培养基和氧化的 气体的供应下进行培养。通过贮器，将液体培养基，或血浆供应到腔室中 并且将充氧气体通过该腔室的上部进行供应。每一个都定期进行供应从而 使肝切片的每一个都交替暴露于培养基和气体，其暴露-时间比率在约1∶2 到约1∶4，优选地约1∶2.5到约1∶3.5的范围内，最优选地约1∶3。泵19 控制培养基的流动。
尽管血浆是维持细胞生存能力的相对较好的培养基，但是存在太多的 未知因子并且因此结果随不同动物有所不同。在本发明中，优选优于血浆 的Waymouth MB 752/1培养基。为了预防中央坏死，优选使用上述的95％ O2和5％CO2的气体混合物。由于该混合物可以产生对于肝细胞毒性很强 的氧自由基，将高浓度的谷胱甘肽和维生素E作为氧自由基清除剂和抗氧 化剂加入。对于该培养基的使用，配方应当补充以10％补充的失活小牛血 清的Fetal Vovine和L-谷氨酰胺。
现在参考附图，并且更具体地参考图2A和2B，显示本发明的肝切片 装置，如编号20所显示的。提供了两个不锈钢网眼21和22，其大小可以 基于该腔室的尺寸而进行选择。这两个网眼优选平行排列。在优先的实施 方案中，该网眼具有约0.26mm的孔径。此外，在优选的实施方案中，挤 压该网眼从而确保一致的平面。在网眼21和22之间，以顺序方式来排列 多个肝切片23。这两个网眼以足够的空间被定位在肝切片的每一侧上从而 不会将肝切片压碎，但是将它们充分地固定从而使它们不会被血浆冲走。 尽管图2A和2B显示相对较少数量的肝切片被定位在网眼之间，要理解 的是装置的功效取决于所用的肝切片的数量。此外，尽管显示了两个网眼， 本文意欲可以使用单一网眼。形成的网眼围绕，至少部分围绕肝切片，由 此形成间隔，并将它们保持在该间隔中。例如，该网眼可以以适合大小的 U-型形成。
根据该装置所意欲的用途，用在本发明中的肝切片可以获自适合的动 物，例如，兔，猪，狗，啮齿类动物，或人。此外它们可以是适合于维持 其生存能力和关键功能的任何大小或形状。在本发明中，肝切片优选具有 范围在约10μm到约2000μm的厚度，更优选在约100μm到约500μm 范围的厚度。
本发明理想地适合于测试药物的毒性和功效。这种测试通过将肝切片 暴露于药物或药物候选物并且观察肝切片代谢化合物的能力来实现，所述 化合物或其代谢物可以进行检测。例如，氨和利多卡因是常用的可以通过 健康的肝组织进行代谢的化合物。随后的实施例显示了这种测试。
实施例1
体外性能
随后的实施例举例说明使用肝切片的系统的体外性能，并形成本发明 的药物测试系统的模型。本文的实施例显示在存在药物候选物HL100时， 肝切片代谢氨和利多卡因的功效。
肝将氨转化成尿素，所述尿素通过肾被排泄到尿中。在严重的肝疾病 存在的情况下，因为血液清除率的减少和形成尿素的能力减少，氨聚集在 血液中。升高的氨水平可是毒性的，尤其是对于脑而言，并且在肝性脑病 的发展中起着重要作用。因此，测量氨清除率可以评估肝功能。更具体地， 测量氨清除率提供本发明代谢化合物的可操作性的指示，所述化合物可能 或可能不对肝有毒害。
此外，利多卡因是一种可以被肝从毒性形式转化成已知为二甲基二甲 代苯胺(DMX)的非毒性代谢物。利多卡因清除率的测量值是本发明的性能 的指示。通过测量在药物候选物存在时的氨或利多卡因的清除率，可以产 生药物候选物的毒性曲线。如果药物候选物对于肝细胞是毒性的，在这些 实施例中，将存在氨和利多卡因的增加。因此，在药物候选物的毒性和利 多卡因或氨水平之间存在可观察到的直接关系。
对3-3.5kg的兔进行安乐死并且获得肝切片。该切片的直径约为1cm， 平均重量为50mg。在该实施例中共使用约2克。接着通过将该切片浸没 于约200ml的具有10％FCS的Williams E培养基中进行预培养，并在暴 露于充氧的气体后排干表面的水。每一个肝切片交替地暴露于培养基和气 体，其中暴露时间比率为约1∶3。
在整个研究中，将1ATM的约95％的氧，5％CO2的气体混合物维持 在腔室中。每12分钟交换气体混合物。注射利多卡因(2mg)或氨(20mg) 的推注剂量。在培养6小时和25小时后，通过在0，5，15，30，60，90和120 分钟收集样品来测量氨和DMX。将结果总结于图3A，3B，4和5中。
图3A是2mg剂量的利多卡因的体外清除率的图示。进行持续灌注(如 菱形所示)，还进行间歇灌注(时间-暴露比率为1∶3)(如圆圈所示)。对于每 种，进行三个单独的试验。在利多卡因加载后约30分钟，利多卡因的水 平从3.2和5.8μg之间降到约0.9μg。在120分钟，将该水平减少到约 0.5μg。该结果显示本发明的装置，甚至在药物候选物HL100存在时，在 30分钟内将利多卡因的水平减少到无毒水平。与持续的培养基灌注比较， 间歇灌注(约1∶3)需要更少体积的培养基而获得基本相同的结果。该结果 显示药物候选物基本上没有削弱肝切片代谢利多卡因的能力。
图3B是2mg剂量的利多卡因预先运行6小时和24小时的时间的体 外清除率的图示。在这些运行中，在利多卡因加载之前，肝切片以1∶3的 比率持续或间歇暴露于气体达6小时和24小时。利多卡因的起初读数介 于2μg和7.8μg之间。然而，对于6小时的试验和对于持续灌注24小时 的试验，在30分钟内，利多卡因的水平减少到约0.80μg。在60分钟内， 所有的试验显示利多卡因的水平在0.75μg和1μg之间。此外，结果显示 当暴露于HL 100时，在间歇灌注下该装置减少利多卡因的水平到非毒性 水平的功效。
图4是由于2mg的利多卡因剂量，体外DMX浓度累积的图示。起 始的DMX浓度保持在约为0，直到约18分钟。在18分钟后，观察到DMX 代谢物的浓度增加，并在60分钟处达到近似最大值。然而，对于24小时 1∶3的暴露试验而言，DMX浓度持续增加，直到120分钟。这些结果显 示，在HL100存在时，本发明代谢利多卡因的能力(如通过DMX代谢物 浓度随时间的增加所指示)。在持续灌注试验和间歇灌注试验之间没有明显 的不同，除了上述的24小时暴露试验。
图5是20mg加载剂量的体外氨清除率的图示。在约30分钟时，在 所有的试验中，观察到最大的氨清除率。这些结果证明在存在药物候选物 HL100时，本发明相对快速将氨去除到非毒性水平的能力。此外，在以持 续灌注的试验和以间歇灌注的试验之间没有存在明显的不同，由此指示可 以使用更少的培养基，同时仍旧维持该装置的活性和功效。
尽管本发明已经通过具体实施方案的方式进行举例说明和描述，应当 理解可以在不背离本发明的实质和范围下对其进行许多改变和改进。