生物人工肝
阅读：141发布：2020-05-11
专利汇可以提供生物人工肝专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供 生物 人工肝 (BAL)装置。还提供制造和使用BAL装置的方法。，下面是生物人工肝专利的具体信息内容。
1.一种生物人工肝装置，所述装置包括设计用于放置肝细胞球体的储存室，其中所述储存室包括混合室和沉降容积室，其中所述混合室通过漏斗从所述沉降容积室分离，且其中所述混合室通过限定在所述漏斗中的至少一个开孔与所述沉降容积室流体连通。
2.如权利要求1所述的生物人工肝装置，其特征在于，所述漏斗是有孔漏斗。
3.如权利要求1所述的生物人工肝装置，其特征在于，所述有孔漏斗包含直径100μm到5mm之间的开孔。
4.如权利要求1所述的生物人工肝装置，其特征在于，所述储存室在所述混合室内包含有磁性搅拌棒。
5.如权利要求1所述的生物人工肝装置，其特征在于，所述混合室包含入口。
6.如权利要求1所述的生物人工肝装置，其特征在于，所述沉降容积室包含出口。
7.如权利要求1所述的生物人工肝装置，其特征在于，所述漏斗包含多于25个开孔。
8.如权利要求1所述的生物人工肝装置，其特征在于，所述开孔直径在100μm到5mm之间。
9.如权利要求1所述的生物人工肝装置，其特征在于，所述储存室包含样品口。
10.如权利要求1所述的生物人工肝装置，其特征在于，所述储存室包含温度探测器。
11.一种生物人工肝装置，所述装置包括：
用于形成肝细胞球体的多个细胞容器；
设计用于摇晃所述多个细胞容器的多架培养摇床；和
设计用于在所述多个细胞容器中形成所述肝细胞球体后放置其的储存室。
12.如权利要求11所述的生物人工肝装置，其特征在于，所述装置还包括白蛋白透析系统。
13.如权利要求12所述的生物人工肝装置，其特征在于，所述白蛋白透析系统包括血液分离导管、炭柱、树脂柱、和透析膜。
14.如权利要求12所述的生物人工肝装置，其特征在于，所述白蛋白透析系统包括预稀释回路。
15.如权利要求11所述的生物人工肝装置，其特征在于，所述多架培养摇床设计以约
5-20圈/分钟摇晃。
16.如权利要求11所述的生物人工肝装置，其特征在于，所述多架培养摇床包括具有气体流入/流出膜的一个或多个摇晃盒。
17.如权利要求11所述的生物人工肝装置，其特征在于，所述储存室包括设计用于维持肝细胞球体悬浮的混合装置。
18.如权利要求11所述的生物人工肝装置，其特征在于，所述储存室包括设计用于允许双向液流的筛子或网。
19.一种生物人工肝装置，所述装置包括设计用于放置肝细胞球体的储存室，其中所述储存室包括设计用于允许双向液流的筛子或网。
20.如权利要求19所述的生物人工肝装置，其特征在于，所述装置其还包括白蛋白透析系统。
21.如权利要求20所述的生物人工肝装置，其特征在于，所述白蛋白透析系统包括血液分离导管、炭柱、树脂柱、和透析膜。
22.如权利要求20所述的生物人工肝装置，其特征在于，所述白蛋白透析系统包括预稀释回路。
23.如权利要求19所述的生物人工肝装置，其特征在于，所述筛子或网具有约20-40微米或更小的孔径。
24.如权利要求19所述的生物人工肝装置，其特征在于，所述装置还包括设计用于摇晃多个细胞容器以形成肝细胞球体的多架培养摇床。
25.如权利要求19所述的生物人工肝装置，其特征在于，所述储存室还包括设计用于维持肝细胞球体悬浮的混合装置。
26.如权利要求19所述的生物人工肝装置，其特征在于，所述储存室还包括透气膜以促进气体交换。
27.一种生物人工肝装置，所述装置包括：
白蛋白透析系统；和
与所述白蛋白透析系统流体连通的储存室，所述储存室设计用于放置肝细胞球体。
28.如权利要求27所述的生物人工肝装置，其特征在于，所述白蛋白透析系统包括血液分离导管、炭柱、树脂柱、和透析膜。
29.如权利要求27所述的生物人工肝装置，其特征在于，所述白蛋白透析系统包括预稀释回路。
30.如权利要求27所述的生物人工肝装置，其特征在于，所述装置还包括设计用于摇晃多个细胞容器以形成肝细胞球体的多架培养摇床。
31.如权利要求27所述的生物人工肝装置，其特征在于，所述储存室包括设计用于维持肝细胞球体悬浮的混合装置。
32.如权利要求27所述的生物人工肝装置，其特征在于，所述储存室设计成允许双向液流。
33.如权利要求27所述的生物人工肝装置，其特征在于，所述储存室包括透气膜以促进气体交换。
34.如权利要求27所述的生物人工肝装置，其特征在于，所述装置还包括用于稳定所述储存室内液体体积的控制器。
生物人工肝
[0001] 相关申请的交叉参考
[0002] 本申请是2009年3月13日提交的美国临时申请序列号61/160,150的{继续申请或部分继续申请或分案申请}，并要求所述申请的优先权。
[0004] 本发明是在国立卫生研究院(National Institutes of Health)授予的DK56733下由政府资助完成。政府对本发明拥有某些权利。
技术领域
[0005] 本发明涉及生物肝。
背景技术
[0006] 根据美国肝脏基金会2000年年报，肝炎和其他肝脏疾病影响2500万美国人。肝脏衰竭是美国第八大最常见死因，每年造成约43000人死亡。肝移植是目前医学上难控制的肝衰竭的唯一有效的治疗方法。然而，肝移植有一些缺陷，包括捐赠器官短缺、对潜在接受者的限制、和用于预防移植后排斥反应的药物的副作用。2003年有近2000个列在等侯名单上的肝脏移植候选人在等待时死亡这一事实证明了器官短缺问题。这些患者中有超过500人被诊断为急性肝衰竭(FHF)。器官短缺的一个可能的解决办法是体外肝脏支持系统，或生物人工肝(BAL)，该系统可作为移植的桥梁或在一些情况下，直到天然肝脏自发恢复为止。
[0007] BAL治疗的一个目的是提供解毒活性和预防急性肝损伤的全身表现(如图一所示)。目前的知识是ALF的肝外表现，如大脑水肿、肺功能障碍和肾功能障碍是由双路过程引起的：1)全身炎症反应综合征(SIRS)；2)发生在肝合成和解毒活性不足的情况中。ALF的炎症反应由可由急性损伤的肝释放的细胞因子如TNFα介导，而毒素如氨对靶器官和其支持细胞产生直接的细胞毒性影响。在至少60％ALF病例中观察到SIRS支持了这一理论。
[0008] 通常由肝清除的氨是图1所述的双路假说的最主要毒素。已证明氨的动脉浓度与有尿素循环缺陷的儿科患者和许多但不是全部ALF患者的脑疝相关联。TNFα也是SIRS和所述ALF双路假说的重要标记物。此外，认为细胞因子如TNFα介导所述局部炎症反应和头部损伤后的脑水肿。因此，在炎症和氨引起的ALF肝外表现(如脑水肿)之间很可能存在协同作用。
[0009] 发明概述
[0010] 本发明提供球形储器生物人工肝(SRBAL)，制造SRBAL的方法和使用SRBAL的方法。在一些情况下，本文所述SRBAL可包括设计用于摇动多个细胞容器的多架培养摇床以形成肝细胞球体。在一些情况下，本文所述SRBAL可包括用于放置肝细胞球体的储存室，该室具有可双向液流的筛选组件。在一些情况中，设计所述筛选组件以防止肝细胞球体从储存室中损失。所述筛选组件可以是具有微米级开孔的膜，滤器，或网。在一些情况中，所述储存室可包括有孔的漏斗型沉降柱或圆柱型沉降柱用以防止球形肝细胞随着流出物离开该储器而损失。在一些情况下，本文所述SRBAL可以是将肝细胞治疗和白蛋白透析相结合的肝支持装置，从而产生解决两种体外人工肝治疗形式过去的局限性的混合系统。在所述SRBAL中，白蛋白透析和原代肝细胞可协同治疗ALF。
[0011] 通常，本发明的一个方面以生物人工肝装置为特征，该装置包括设计用于放置肝细胞球体的储存室，其中所述储存室包括混合室和沉降柱室，其中所述混合室通过漏斗从所述沉降柱室中分离，且其中所述混合室通过限定在所述漏斗中的至少一个孔与所述沉降柱室流体连通。所述漏斗可以使有孔的漏斗所述有孔漏斗可包含直径为100μm到5mm之间的孔。所述储存室可在所述混合室里包含磁力搅拌棒。所述混合室可包含入口。所述沉降柱室可包含出口。所述漏斗可包含多于25个孔。所述孔的直径可为100μm到5mm之间。所述储存室可包含样品孔。所述储存室可包含温度探测器。
[0012] 在另一方面，本发明以包括用于形成肝细胞球体的多个细胞容器的生物人工肝装置为特征。所述装置还可包含设计用于摇动所述多个细胞容器的多架培养摇床。所述装置还可包含储存室，其设计用于在所述多个细胞容器中形成所述肝细胞球体后放置之。
[0013] 在一些实施方式中，所述生物人工肝装置还可包括白蛋白透析系统。在一些实施方式中，所述白蛋白透析系统可包括血液分离筒，炭柱，树脂柱和透析膜。在一些实施方式中，所述白蛋白透析系统可包括预稀释回路。
[0014] 在一些实施方式中，所述多架培养摇床可设计成以约5-20转/分钟的速度摇动。在一些实施方式中，所述多架培养摇床可包括具有气体流入/流出膜的一个或多个摇晃盒。
[0016] 在另一方面，本发明特征为包括设计用于放置肝细胞球体的储存室和可双向液流的膜的生物人工肝装置。在一些实施方式中，所述膜可具有微米级孔径(如约20-40微米或更小)。
[0017] 在一些实施方式中，所述生物人工肝装置还可包括白蛋白透析系统。在一些实施方式中，所述白蛋白透析系统可包括血液分离筒，炭柱，树脂柱和透析膜。在一些实施方式中，所述白蛋白透析系统可包括预稀释回路。
[0018] 在一些实施方式中，所述生物人工肝装置还可包括设计用于摇晃多个细胞容器的多架培养摇床以形成肝细胞球体。在一些实施方式中，所述储存室还可包括设计用于维持肝细胞球体悬浮的混合装置。在一些实施方式中，所述储存室还可包括透气膜以促进气体交换。
[0019] 在其他方面，本发明特征为包括白蛋白透析系统的生物人工肝装置。所述装置可包括与所述白蛋白透析系统流体连通且设计用于放置肝细胞球体的储存室。
[0020] 在一些实施方式中，所述白蛋白透析系统可包括血液分离筒，炭柱，树脂柱和透析膜。在一些实施方式中，所述白蛋白透析系统可包括预稀释回路。
[0021] 在一些实施方式中，生物人工肝还可包括设计用于摇晃多个细胞容器的多架培养摇床以形成肝细胞球体。
[0022] 在一些实施方式中，所述储存室可包括用于维持肝细胞球体悬浮的混合装置。在一些实施方式中，所述储存室可包括设计用于允许双向液流或设计用于防止球型肝细胞从所述储存室损失的筛子(如具有微米级孔的膜，滤器或网)。在一些情况下，所述储存室可设计具有沉降柱的作用以防止肝细胞球体的损失。在一些实施方式中，所述储存室可包括透气膜以促进气体交换。在一些情况中，筛子或隔板可位于所述透气膜和所述储器的内壁之间以使均匀气体流过所述装置。
[0023] 在一些实施方式中，所述生物人工肝装置还可在所述储存室内包含稳定液体体积的控制器。
[0024] 除非另外定义，本文使用的所有技术和科学术语的意义与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同。虽然与本文所述类似或相同的方法和材料可被用来实施本发明，但在下文描述合适的方法和材料。本文中述及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献都通过引用全文纳入本文。在抵触的情况下，以本说明书(包括定义在内)为准。此外，材料、方法和实施例都仅是说明性，并不构成限制。
[0026] 附图简要说明
[0027] 图1：双路假说提出急性肝损伤的全身表现(可能包括脑水肿、发热、低血压、肺功能障碍、肾衰竭、和死亡)是由于肝细胞功能缺失后的毒素积累(即尿素生成缺失造成的氨积累)和病因不明但最初可能不具有传染性的全身炎症反应的协同作用。数据表明所述SRBAL通过校正所述过程的这两个方面来防止急性肝损伤的全身表现。
[0028] 图2：猪肝细胞球体为所述SRBAL装置提供代谢和解毒活性。所示例子是在摇晃培养系统内一周后的猪肝细胞球体，其用在示范SRBAL装置中。
[0029] 图3：用于例如临床前实验的示范SRBAL装置的示意图(a)、照片(b)、图解(c)。所述SRBAL是“混合的”体外肝脏支持装置，其包括白蛋白透析系统和活的生物组分。所述肝细胞储器可含有原代猪肝细胞球体。所述5-泵SRBAL装置将所述肝细胞储器置于标准TM
白蛋白透析体外构型的白蛋白灌注液中。所述白蛋白灌注液回路包含普遍设置在MARS 回路(加博罗(Gambro)，瑞典德兰)中的炭柱和树脂柱。
白蛋白透析体外构型的白蛋白灌注液中。所述白蛋白灌注液回路包含普遍设置在MARS 回路(加博罗(Gambro)，瑞典德兰)中的炭柱和树脂柱。
[0030] 图4：球体储器构型：(a)用于形成球体的摇晃储器；(b)用于形成大规模球体的多架摇晃器；(c)用于体外使用的旋转储器，和(d)旋转储器示意图。
[0031] 图5：D-Gal诱导的ALF的全身炎症反应综合症(SIRS)与肝外器官功能障碍相关联—包括如(a)所示的呼吸衰竭。采用血清TNFα作为SIRS的标记，ALF的SIRS反应通过用肝细胞SRBAL治疗而被归一化(b)。来自门静脉和肝静脉血液样品的LPS水平之间的梯度表明库普弗细胞对肝脏LPS的清除(c)。内脏LPS短暂瞬时释放不能完全解释狗摄入D-Gal后TNFα活性的增加，这表明在非传染性急性肝衰竭中存在其他SIRS引发剂。
[0033] 图7：(a)在许多细胞类型中发现TLR4信号传导复合体。它还可稳定转染到报告细胞中以测量TLR4激动剂的体外活性；(b)是已转染TLR4复合体和荧光素酶报告基因以测量TLR4激动剂体外活性的HEK293细胞示意图。(c)中用于检测小鼠血清中TLR4激动剂活性的HEK293/Luc(+)/TLR4(+)细胞用于筛选狗血清的TLR4激动剂活性，(c)APAP毒素接触(500比0mg/kg)后小鼠血液中TLR4激动剂活性的评估。这个体外实验基于在HEK293细胞中连结NFκβ的荧光素酶报告基因，其对应于TLR4活化。在缺乏所述TLR4复合体的HEK293细胞(标记为TLR4(-))中仅检测到痕量背景活性，证明对TLR4的荧光素酶活性的特异性。
[0034] 图8：摇晃和旋转条件(上图)以及通过相位显微镜观察的球体形成期肝细胞球6
体(下图)的比较。以0.25Hz摇晃或60rpm旋转肝细胞(1x10 细胞/mL)从而诱导球体形成。提供摇动方法在4小时、12小时和24小时和旋转方法在4小时、12小时和24小时形成的球体的典型图像。比例尺等于50μm。
体(下图)的比较。以0.25Hz摇晃或60rpm旋转肝细胞(1x10 细胞/mL)从而诱导球体形成。提供摇动方法在4小时、12小时和24小时和旋转方法在4小时、12小时和24小时形成的球体的典型图像。比例尺等于50μm。
[0035] 图9：摇晃培养5天后经FluoroquenchTM染色的代表性肝细胞球体。活细胞染为绿色而死亡细胞染为红色。(a)低倍镜下的球体；(b)FITC滤片下的单个球体表明大量活细胞；(c)若丹明(红色)滤片下同样的球体具有2-3个死亡细胞的小聚集。
[0036] 图10：摇晃球体培养14天的242个肝脏特异性基因的微阵列表达。随着时间，这些基因中超过80％的平均表达是稳定的(绿色)。与基线(新鲜分离的大鼠肝细胞)相比的基因表达降低用粉色或红色表示，而表达的增加用蓝色标记。
[0037] 图11：用于测试最优化研究下流动条件、培养基条件和空心纤维膜的台式仪器示意图。在扩散条件下设置泵使F＝0mL/分钟(P1＝P2＝P3＝100mL/分钟)。设置泵使F在低对流，中对流和高对流条件下分别为5mL/分钟，25mL/分钟，或50mL/分钟。
[0038] 图12：旋转储器的旋转速度的效果。(a)叶轮速度对球体数量和大小分布的影响；(b)22小时混合后的球体显微图；和(c)适于球体体积而归一化的胱冬酶活性。这些图表明与98PRM相比，196RPM的快速旋转对形成较小的球体有良好的效果而没有细胞死亡的负TM
作用，因为肝细胞的胱冬酶3/7活性和Fluoroquench 活体染色在两个转速下是相当的。
作用，因为肝细胞的胱冬酶3/7活性和Fluoroquench 活体染色在两个转速下是相当的。
[0039] 图13：含血清和无血清培养基内的球体形成。球体在无血清培养基和补充有10％FBS的培养基里形成。L-肉碱可对球体形成有良好的效果。
[0040] 图14(a-b)：具有4个泵的示范SRBAL装置的示意图(a)和照片(b)。所述SRBAL是“混合的”体外肝脏支持装置，其包括白蛋白透析系统和活的生物组分。肝细胞储器可含有肝细胞球体。
[0041] 图15(a-b)：球体储器的示例性有孔漏斗设计的示意图(a)和照片(b)。
[0042] 图16：球体储器的示例性平坦漏斗设计示意图。
[0043] 图17：球体储器的示例性直型沉降柱设计示意图。
[0045] 图19：数据表证明在低pO2条件下球体形成期间细胞体积稳定。
[0046] 图20：数据表证明在低pO2条件下猪肝细胞的球体产量高。
[0047] 图21：描绘所述SRBAL生物反应器的储器内以及旋转瓶和有孔漏斗构型下的流出物内的微珠颗粒的大小分布。所述有孔漏斗构型能更有效地保留大颗粒。
[0048] 发明详述
[0049] 本文提供的SRBAL是体外人工肝装置。在一些情况中，本文提供的SRBAL可包括多架培养摇床用于形成肝细胞球体。在一些情况下，本文提供的SRBAL可包括具有微米级孔的允许双向液流的筛或网。在一些情况下，所述球体储存室可包括有孔漏斗沉降柱以防止肝细胞球体从该室流失。在一些情况中，本文提供的SRBAL可包括白蛋白透析系统。所述装置的白蛋白透析系统可类似加博罗公司(瑞典德兰)生产的MARS 白蛋白透析系统，其改进有较大孔径膜(150kD-400kD)或更小且加有透析中空纤维滤器用于超滤、预稀释和对流物跨血液中空纤维膜滤器的转移。在一些情况下，本文提供的SRBAL可包括活的生物组分(如获自哺乳动物的肝细胞，包括人、马、犬、猪、牛、绵羊、和鼠源)。例如，如图2所示，所述活的生物组分可在三维组织构造(即球体)中含有猪肝细胞。所述球体聚集设计可如美国专利号7,160,719(Nyberg)所述。所述猪肝细胞球体可在与白蛋白透析系统的白蛋白灌注液相连的储存室内分离。SRBAL装置例子的示意图、照片和图解分别如图3a、3b和3c所示。本文所述的另一个SRBAL装置例子的图解和照片分别如图14a和14b所示。
[0050] 所述SRBAL装置可设计用于肝衰竭患者的连续体外治疗。所述患者的血液循环可通过双腔静脉导管与所述设备相连，所述导管可实现速率在100-200mL/分钟级别的血液灌输。所述装置的操作与连续静静脉血液透析类似。如图3(c)所示，在所述示例性实施方式中，所述设备含5个泵(泵用PM1-5标记)。泵1和3用于灌输所述白蛋白回路。泵2将来自患者的血液灌输到所述中空纤维血液分离筒里。泵4用于弃去超滤液，其为维持所述患者的流体状态所需—类似连续静静脉血液透析。泵5控制预稀释线路，用于实现以高超滤速率穿过位于患者血液回路和白蛋白回路交叉点的中空纤维膜。
[0051] 如图14a所示，在一些情况下，所述设备设计为含4个泵(泵用PM1-4标记)。泵3用于灌输所述白蛋白回路。泵2将来自患者的血液灌输到所述中空纤维血液分离筒里。
泵4用于弃去超滤液，其为维持所述患者的流体状态所需—类似连续静静脉血液透析。泵1控制预稀释回路，用于实现以高超滤速率穿过位于患者血液回路和白蛋白回路交叉点的中空纤维膜。如图14a所示，在一些情况下，所述设备可包括位于所述球体储器上方的空气/泡沫阱。
泵4用于弃去超滤液，其为维持所述患者的流体状态所需—类似连续静静脉血液透析。泵1控制预稀释回路，用于实现以高超滤速率穿过位于患者血液回路和白蛋白回路交叉点的中空纤维膜。如图14a所示，在一些情况下，所述设备可包括位于所述球体储器上方的空气/泡沫阱。
[0052] 与所述球体储器一起，所述白蛋白线路包括炭柱、树脂柱、流体加热器、和用于超滤的第二中空纤维膜模块。所述装置可以是受控用于稳定所述球体储器液体体积和实现超滤(如果需要除去液体)的微处理器。所述设备可包括调节温度、pH和/或O2的各种控制器。所述SRBAL装置可提供多方面的体外肝脏支持，包括解毒来自患者的废料和将水代谢物和生长因子及原代肝细胞的其他尚未鉴定的产物回传给该患者。这些过程可涉及通过扩散和对流穿过所述中空纤维膜的物质转运。扩散可主要通过中空纤维膜的表面积和跨所述膜的浓度梯度测定，而对流可通过由泵的条件设定的穿过所述膜的液流所测定。
[0053] 在一些实施方式中，200-400g肝细胞剂量(如猪肝细胞)用于所述SRBAL。制备6
所述剂量是通过从置于多架培养摇床中的6-12L培养基中的5-10x10 细胞/mL开始，浓缩
7
到置于3L球体储器中的1-2x10 细胞/mL(如约200-400g)。在一些实施方式中，所述白蛋白浓度范围可为0.5到5.0g/dL。在一些实施方式中，所述白蛋白回路可包含预稀释特性，如从透析中空纤维膜滤器出并进入所述入口空气/泡沫阱的回路且涉及如图3c所示的泵
5。预稀释可使对流穿过血液中空纤维膜滤器的膜而患者血通路中没有过度的血浓缩和淤血。将增加的物质从患者转移到所述白蛋白回路和肝细胞储器可具有提高所述SRBAL解毒的优点。在一些实施方式中，如图3c所示的泵1和3(PM1和PM3)在相同的速率下运转—所述速率使液流循环出入所述肝细胞球体储器以增加扩散性物质的转移。在一些实施方式中，如图3c所示的泵4(PM4)可基于临床需要设定为去除液流(如肾替代流出物)。在一些实施方式中，如图3c所示的泵5(PM5；循环线路)可设定为提供预稀释和通过对流跨所述中空纤维膜的更佳物质转移。如图3c所示的泵5的流速可决定所述白蛋白回路有多少超滤液体被循环到血液中空纤维膜滤器的入口处用于预稀释，而如图3c所示的泵4决定有多少液体从患者体内移除。在标准操作条件下，所述球体储器体积可保持不变。泵4和泵
5的速率一起决定穿过所述中空纤维膜的对流速率(F)。如果泵4和泵5设为0mL/分钟，则没有对流穿过所述中空纤维膜(F＝0)且通过纯化扩散产生物质传输。如果泵4和/或泵5运转中，则产生跨所述中空纤维膜的对流。在标准条件下，所述血液分离中空纤维滤器TM
可具有150kD-400kD的孔。该孔径大于MARS (70kD；加博罗，瑞典德兰)。
所述剂量是通过从置于多架培养摇床中的6-12L培养基中的5-10x10 细胞/mL开始，浓缩
7
到置于3L球体储器中的1-2x10 细胞/mL(如约200-400g)。在一些实施方式中，所述白蛋白浓度范围可为0.5到5.0g/dL。在一些实施方式中，所述白蛋白回路可包含预稀释特性，如从透析中空纤维膜滤器出并进入所述入口空气/泡沫阱的回路且涉及如图3c所示的泵
5。预稀释可使对流穿过血液中空纤维膜滤器的膜而患者血通路中没有过度的血浓缩和淤血。将增加的物质从患者转移到所述白蛋白回路和肝细胞储器可具有提高所述SRBAL解毒的优点。在一些实施方式中，如图3c所示的泵1和3(PM1和PM3)在相同的速率下运转—所述速率使液流循环出入所述肝细胞球体储器以增加扩散性物质的转移。在一些实施方式中，如图3c所示的泵4(PM4)可基于临床需要设定为去除液流(如肾替代流出物)。在一些实施方式中，如图3c所示的泵5(PM5；循环线路)可设定为提供预稀释和通过对流跨所述中空纤维膜的更佳物质转移。如图3c所示的泵5的流速可决定所述白蛋白回路有多少超滤液体被循环到血液中空纤维膜滤器的入口处用于预稀释，而如图3c所示的泵4决定有多少液体从患者体内移除。在标准操作条件下，所述球体储器体积可保持不变。泵4和泵
5的速率一起决定穿过所述中空纤维膜的对流速率(F)。如果泵4和泵5设为0mL/分钟，则没有对流穿过所述中空纤维膜(F＝0)且通过纯化扩散产生物质传输。如果泵4和/或泵5运转中，则产生跨所述中空纤维膜的对流。在标准条件下，所述血液分离中空纤维滤器TM
可具有150kD-400kD的孔。该孔径大于MARS (70kD；加博罗，瑞典德兰)。
[0054] 在一些情况下，所述装置可具有如图14所示的4个泵。
[0055] 图4a显示用于球体形成的摇晃储器。图4b显示用于大规模球体形成的多架摇晃器。所述多架摇晃器可以5-20转/分钟摇动。所述多架设计可使所有盒子适当摇晃(与单架摇晃器上的堆积盒子相反)。摇晃器盒子可具有硅橡胶膜，其下具有气体流入/流出回路(72-75％氮气+21％O2，4-7％CO2-CO2可用于维持pH在生理范围内)。球体形成期间介质的氧气和pH可由气体入口条件决定。所述多架摇晃器的一个目的是可从新鲜分离或冷藏的肝细胞中大规模生成球体。
[0056] 图4c显示体外使用的旋转储器(如2L体积的旋转储器)。图4d示意性显示图4c的旋转储器。在一些情况下，所述旋转储器包括旋转篮过滤器。所述滤器可以约30-200rpm旋转。在一些情况下，所述滤器在使用中可单向旋转。所述滤器可设计成允许双向液流以畅通该滤器。所述滤器网的孔径可为10-100μm之间。在一些情况下，所述网的孔径为20-40μm或更小。在一些情况下，所述旋转储器可包括透气性硅橡胶膜。所述膜可具有较大的表面积以用于更多的气体交换，其可在细胞密度增加时维持细胞的生存能力和生化活性。肝素和/或苄丙酮香豆素钠可以平衡抗凝集与球体大小的浓度用于所述旋转储器和所述摇晃储器中。在一些实施方式中，使用1IU/mL肝素和1μm/mL苄丙酮香豆素钠。所述旋转器设计可用于多种目的，包括维持所述球体悬浮和使所述球体储器连续灌注而从该储器中损失的球体最少。所述旋转储器内的细胞滤器可通过螺旋轴的连续流入和流出的设计不断地清洗细胞。此连续作用可使所述滤器上细胞的聚集最少，避免其堵塞，并使所述储器的细胞损失最小。通过调节流入和流出区的截面面积可实现高速流入和低速流出。
[0057] 在一些情况下，所述球体储器可以是具有多至两个隔室(如混合室和沉降容积室)的容器(如圆柱形容器)，所述隔室可通过例如图15a和15b所示有孔漏斗形式的分隔物彼此分离。一个或更多搅拌棒可位于所述混合室内。例如，搅拌棒可置于所述混合室的中心和底部。此旋转作用可造成漩涡效应向下推动流体与细胞一起穿过所述漏斗的管口，并因此可使流出所述混合室的球体的净损失最小。所述有孔漏斗可抑制径向流线向轴向流线的转换，并使所述储器的上部容积可作为沉降柱。这种抑制效果可通过旋涡得到加强，所述漩涡在流体穿过所述有孔漏斗且被例如处于所述混合室底部的定位于中央的搅拌棒所拉下穿过漏斗的管口时形成。连续的流体可在所述混合室底部进入储器且可通过所述容器的中上部的出口流出储器。在一些情况中，所述储器可具有用于温度探测器和取样口的开孔。
[0058] 有孔漏斗可由各种材料如聚丙烯、聚乙烯、或聚碳酸酯组成。所述材料可以是不易受细胞粘附影响的材料。所述有孔漏斗的一个目的是在所述储器的上部容积形成沉降柱而使所述储器的下部容积为混合室。进行研究以鉴定漏斗出口的最优位置。将所述管口置于接近所述混合室底部的位置，可提高所述漩涡效应且因此可与离开所述混合室并进入所述沉降柱和通过所述储器出口流出的颗粒数量的降低有关。距所述室底部小于5cm的距离可与存在较少颗粒有关，且距离底部的最优高度可以是所述混合室的底部上方约1-2cm。所述有孔漏斗储器设计的其他规格如下所示。所述生物反应器的高度可为至少24cm高(包括所述沉降容积)(如24-100cm，24-75cm，或24-50cm)，所述有孔漏斗本身可为10-20cm高(如约16.5cm高)，所述漏斗的角度可为约50°到70°之间(如约60°)，所述管口直径可为约0.5-2cm(如约1.25cm，在一些情况下至少约1cm)，所述窗孔可为约1-4mm宽(如至少1mm宽)，确定所述漏斗几何形状以使开窗孔的面积和沉降柱的截面积大约相同，并且所述有孔漏斗的开孔面积百分比可不低于约50％。
[0059] 如本文所述，用大鼠和猪肝细胞制成的微珠和球体进行各种研究。这些研究证明所述沉降柱效应可以1-2cm/分钟(0.018-0.034cm/秒)的沉降速率分离测得60微米或更大的球体。基于这些流动参数，如果所述球体储器的圆柱体内经为7英寸(约180mm)，则其可以400mL/分钟的流速运行。通常，所述系统的最优条件受所述储器内球体的数量和这些球体的直径影响，因为较大的球体有更快的沉降速度且可耐受所述沉降柱内更高的轴向速度。
[0060] 当使用所述有孔漏斗生物反应器的设计时，可用30到200RPM范围的搅拌速度。内容物可很好的混合而不过度搅拌所述沉降容积。所述搅拌棒长度可为2-15cm(如8cm)。
全部生物反应器可以是圆柱形。所述搅拌棒和漏斗可与所述圆柱形生物反应器的中轴轴向对准。所述流速可为100-400mL/分钟且基于人体肝脏功能，400mL/分钟最优。所述装置可具有单个入口和单个出口。测试或取样口可在所述混合室内提供。在一些情况下，可提供温度探测器口。1μm滤器(或更小)可包含在所述生物反应器出口上的生物-人工肝回路内。可通过将所述滤器置于所述沉降柱和所述出口之间将其纳入所述生物反应器。所述生物反应器必须用生物相容性材料制成(美国药典USP第6类)。1μm滤器(或更小)包含在所述生物反应器出口上的生物-人工肝回路内。可通过将所述滤器置于所述沉降柱和所述出口之间将其纳入所述生物反应器。1μm滤器(或更小)包含在所述生物反应器出口上的所述SRBAL线路内。可通过将所述滤器置于所述沉降柱和所述出口之间将其纳入所述生物反应器。
全部生物反应器可以是圆柱形。所述搅拌棒和漏斗可与所述圆柱形生物反应器的中轴轴向对准。所述流速可为100-400mL/分钟且基于人体肝脏功能，400mL/分钟最优。所述装置可具有单个入口和单个出口。测试或取样口可在所述混合室内提供。在一些情况下，可提供温度探测器口。1μm滤器(或更小)可包含在所述生物反应器出口上的生物-人工肝回路内。可通过将所述滤器置于所述沉降柱和所述出口之间将其纳入所述生物反应器。所述生物反应器必须用生物相容性材料制成(美国药典USP第6类)。1μm滤器(或更小)包含在所述生物反应器出口上的生物-人工肝回路内。可通过将所述滤器置于所述沉降柱和所述出口之间将其纳入所述生物反应器。1μm滤器(或更小)包含在所述生物反应器出口上的所述SRBAL线路内。可通过将所述滤器置于所述沉降柱和所述出口之间将其纳入所述生物反应器。
[0061] 在一些情况中，所述球体储器(如具有有孔漏斗的球体储器)可主要由丙烯酸用标准加工操作制成。所述漏斗可由ABS用流体沉积模型快速成型方法制成。整个装置可用塑料成型方法制成(如注塑和/或吹塑)。
[0062] 在一些情况下，球体储器可以是本文所述的SRBAL装置，其具有如图16或17所示的设计。
[0063] 本文所述的SRBAL装置可为肝衰竭患者提供肝脏解毒。解毒作用可由所述球体储器内有代谢活性的肝细胞(如原代猪肝细胞)以及所述白蛋白灌输液内的炭柱和树脂柱提供。所述球体储器内肝细胞的代谢活性可由通过所述储器内样品口的所述原代肝细胞的细胞生存能力、氧气消耗、白蛋白生成、和P450活性来评估。所述装置可设计成体外运行(如在急性肝衰竭(ALF)患者的床边)。所述装置可用作能自发恢复的肝衰竭中肝移植的替代物，或如果肝衰竭是不可逆的，则其可用作肝移植的桥梁。
[0064] 本文提供的SRBAL可通过将白蛋白透析和基于肝细胞的治疗相结合以提供协同效果。改良例如用新鲜的而不是冷藏的肝细胞、将肝细胞剂量从70克提高到200克或400克、延长治疗持续时间以连续灌注、以及白蛋白透析带来的优点，也可使BAL治疗在ALF中有效。所述SRBAL还可解毒氨。增加氨的解毒的一个方法是通过增加调节尿素生成基因表达的转录因子，如HNF6。在一些情况中，所述SRBAL治疗可通过提供关键的肝细胞功能，如氨解毒为尿素，且同时还降低急性肝损伤的SIRS响应而具有双倍效果。
[0065] 以下实施例进一步描述了本发明，这些实施例不限制权利要求书所述的本发明范围。实施例
[0066] 实施例1：所述SRBAL在D-半乳糖胺诱导FHF的犬模型中改善生存率并降低肝外表现
[0067] 所述SRBAL测试用6只狗(15-20公斤重)在3种处理条件下进行。新鲜的肝细10
胞SRBAL(2x10 新鲜猪肝细胞)，无细胞BAL(对照)，和无BAL(对照)。异氟烷麻醉诱导后，将四个探测器置于狗脑中测量ICP、微量透析流、温度和组织血氧。狗在t＝0小时接受D-半乳糖胺(2.0g/kg)；在t＝24小时开始BAL治疗。第一天(t＝6小时)狗接受一个
5毫摩尔NH4Cl大药丸，在t＝28小时、t＝32小时、t＝36小时接受3次5毫摩尔NH4Cl大药丸以在肝衰竭发作之前和之后测定NH3的解毒。NH3的动脉样本在NH4Cl药丸前和60分钟后立即获得。观察到用肝细胞SRBAL处理组的狗保持正常的颅内压且在所述试验期间存活，而所有对照动物出现颅内高压且死于脑疝(表1)。
胞SRBAL(2x10 新鲜猪肝细胞)，无细胞BAL(对照)，和无BAL(对照)。异氟烷麻醉诱导后，将四个探测器置于狗脑中测量ICP、微量透析流、温度和组织血氧。狗在t＝0小时接受D-半乳糖胺(2.0g/kg)；在t＝24小时开始BAL治疗。第一天(t＝6小时)狗接受一个
5毫摩尔NH4Cl大药丸，在t＝28小时、t＝32小时、t＝36小时接受3次5毫摩尔NH4Cl大药丸以在肝衰竭发作之前和之后测定NH3的解毒。NH3的动脉样本在NH4Cl药丸前和60分钟后立即获得。观察到用肝细胞SRBAL处理组的狗保持正常的颅内压且在所述试验期间存活，而所有对照动物出现颅内高压且死于脑疝(表1)。
[0068]* **
[0069] 治疗结束 未放置颅内探测器
[0070] 基于峰值血清ALT水平，在所有三组中相似的肝损伤情况下所述肝细胞处理组的结果有所改善。疝与脑组织氧化突然降低(小于10mmHg)和脑血流下降有关。对照动物中的脑葡萄糖下降和脑乳酸盐增加反映出伴随疝的脑缺血。对照动物形成疝时观察到的脑甘油显著增加为急性神经元损伤提供了进一步证据且能诊断出脑死亡。相反，用所述SRBAL中新鲜肝细胞处理的狗的葡萄糖、乳酸、和甘油的最终脑水平均正常。
[0071] 用所述SRBAL处理的一个附加的优点是改善NH3解毒。事实上，ALF狗在SRBAL处理期间对5毫摩尔NH4Cl药丸的反应与它们第一天ALF发作前的反应相似(0.47±0.81相对0.34±0.63umol/L/mmol，p＝NS)。相反，所述无细胞BAL组的ALF狗对相同5毫摩尔NH4Cl大药丸的反应与基线相比显著升高(3.47±1.77相对0.63±0.34μmol/L/mmol，p＝0.025)。所述SRBAL改善氨解毒与BAL治疗结束时猪肝细胞球体的高生存力有关(生存力大于90％)。所述SRBAL中肝细胞球体的氧气消耗也保持稳定，从体外治疗开始到结束其为0.94到0.88毫摩尔O2/小时。
[0072] 实施例2：用所述肝细胞SRBAL处理ALF狗有助于所述全身炎症反应综合症(SIRS)的持续正常化
[0073] 用所述肝细胞SRBAL处理ALF狗与所述全身炎症反应综合症(SIRS)的持续正常化有关。给予D-半乳糖胺12小时后在对照狗中观察到SIRS的特征，如低血压、少尿、和呼吸功能障碍(图5a)。D-半乳糖胺24小时后在对照狗中观察到血液TNFα水平增加。在所述无BAL组中血液TNFα水平稳定增加直到终止。在无细胞BAL治疗初始观察到TNFα急速增加且持续升高到无BAL组的范围内直至脑死亡。相反，在两只用所述肝细胞SRBAL处理的狗中测量到正常水平的TNFα(Figure 5b)。这些结果表明肝细胞提高所述SRBAL的生物相容性且降低D-gal诱导的ALF的SIRS响应。所述ALF的SIRS响应与门静脉而非肝静脉的LPS水平短暂上升有关(图5c)，表明肝脏中细胞对LPS的清除，如库普弗细胞。然而，所述LPS的短暂突增不能完全解释给予肝毒素后观察到的持续SIRS响应。这些研究说明除LPS外存在其他ALF的SIRS介质。进行机制研究以鉴定ALF的SIRS内源性介质，其可能在SRBAL治疗期间被清除，例如胞外基质的分解产物。
[0074] 实施例3：功能性TLR4信号有助于在乙酰氨基酚或D-gal/LPS毒素接触后肝病症和SIRS的发展
[0075] 研究TLR4在ALF和SIRS中的作用。图6a显示TLR4缺陷(突变)小鼠免受Dgal/LPS诱导的肝损伤，而野生型小鼠在接触Dgal/LPS后发生具有大量TUNEL(+)凋亡的肝脏严重坏死。当用500mg/kg乙酰氨基酚(APAP)处理野生型和TLR4突变小鼠时也观察到TLR4缺陷的类似保护效应，该高毒性剂量使野生型小鼠100％致死(表2)。APAP和Dgal/LPS后野生型小鼠在尸检时肺部血液TNFα和嗜中性粒细胞浸润水平提高证实其发生全身性炎症。相反，TLR4缺陷型小鼠的肺组织学和全身TNFα水平维持正常。图6b说明肝细胞死亡和毒素诱导肝损伤的SIRS响应是由库普弗细胞表达的TLR4所介导。TLR4缺陷型库普弗细胞也可解释毒素接触后在TLR4缺陷型小鼠中观察到的保护效应(图6c)。与此观察一致，在用氯化钆预处理的野生型小鼠中观察到Dgal/LPS毒性显著降低(表2)。氯化钆预处理使肝脏中的库普弗细胞数量降低48％(31±6到16±4细胞/HPF，p＜0.001)，并将ALT峰值水平从2458±2347U/mL降低至278±196U/mL。
[0076]
[0077] *p value＜0.05(相对野生型，同样条件) **p value＜0.001(相对野生型，同样条件)
[0078] 进一步支持TLR4在ALF的SIRS响应中作为信号分子的证据如图7所示。图7a-b显示本研究中所用的试验，以及TLR4受体复合体。图7c证明500mg/kg APAP6小时后，获自重病小鼠的血清与0mg/kg假处理对照相比含有高水平的TLR4激动剂活性(p＜0.001)。
[0079] 实施例4：基于影响球体形成因子的生物工程分析、生物化学性能、跨所述BAL膜的物质传输和膜的生物相容性确定所述SRBAL的最优操作条件
[0080] 1.调节球体形成以改善所述SRBAL的生化性能
[0081] 为了确定是否能调节球体形成以改善所述SRBAL的生化性能，首先比较传统旋转技术和美国专利号25,160,719所述的摇晃技术的球体形成。观察到所述摇晃技术相对所述旋转技术有诸多优点。这些优点包括更快的球体形成速度，更好的球体大小控制，和更大比例的肝细胞纳入所述摇晃技术聚集的球体。24小时摇晃后，大多数(85％)接种的肝细胞已纳入直径大于40μm的成型良好的球体中(图8)。
[0082] 在48小时，用库尔特计数测量法仅检测到13％的细胞颗粒直径小于40μm。大多数摇晃成型的聚集体(84％)直径为75-200μm。相反，在旋转条件下24小时，仅有58％的肝细胞纳入球体。大多数未粘附的肝细胞呈现死亡。球体形成提供保护优势，因为直到14天的每个时间点上球体内存在的肝细胞中大于95％存活(图9)。摇晃技术改善球体形成动力学和稳定的球体完整性可能与球体肝细胞相较单层对照更多的生化性能有关。
[0083] 摇晃球体培养14天的大鼠肝细胞的基因表达分布。本任务进行242个肝相关基因的定制微阵列。可观察到14天培养中这些基因的85％表达维持稳定—低于2倍的表达增加或50％的表达降低(图10)。5％的基因表达增加2倍或更多；且10％的基因表达降低50％。摇晃球体肝细胞的生化活性也优于旋转技术形成的球体和单层培养的肝细胞。这些结果表明可调控球体形成以改善所述SRBAL的生化特性。更好的球体形成条件包括补充有
6
胰岛素/转铁蛋白/硒的无血清培养基以15圈/分钟的频率摇晃，和5x10 活肝细胞/mL的接种密度。24小时摇晃后，如果将新形成的球体放入所述SRBAL且连续提供氧气并补充
7
新鲜培养基，则其可浓缩到1-2x10 细胞/mL的浓度。
6
胰岛素/转铁蛋白/硒的无血清培养基以15圈/分钟的频率摇晃，和5x10 活肝细胞/mL的接种密度。24小时摇晃后，如果将新形成的球体放入所述SRBAL且连续提供氧气并补充
7
新鲜培养基，则其可浓缩到1-2x10 细胞/mL的浓度。
[0084] 2.毛细管外空间的流动条件对所述SRBAL的生化性能的影响
[0085] 采用如图11所示的4泵台式设备研究流动条件对所述SRBAL性能的影响。所述最优研究中考虑的变量包括中空纤维膜孔径(70kD，150kD，400kD)、泵设置(F＝0、5、25、50mL/分钟)、和R2中白蛋白浓度(0.5g％，5.0g％)。这三个变量构成总共24种条件，其用三种废料分子(氨、结合和非结合胆红素)，猪白蛋白，和作为渗透率标记物的三种免疫分子(TNFα，IgG，和IgM)进行测试。在所有研究中，储器#1最初装有添加各上述化合物的猪血浆。储器#2最初装有添加0.5g％或5.0g％牛白蛋白的PBS。管道和筒装有与其中空纤维膜侧面对应的溶剂。此外，所有膜的筛选系数由在渗透测试前后使用右旋糖酐聚合物的标准化膜技术测定。进行所有24种条件和8种渗透测量的秩和分析以确定在临床前功效研究中操作所述SRBAL的最优条件。所述秩和分析确定了使用150kD或400kD膜在高通量下白蛋白(p＜0.001)、TNFα(p＜0.001)和非结合胆红素(p＜0.01)的物质转移最好。当也考虑IgG和IgM的渗透率时，由于所述150kD膜对这些潜在的有害抗体的渗透率较低，所以认为其更优。
[0086] 3.所述BAL培养基中白蛋白浓度对从患者隔室中消除极性和非极性毒素的影响[0087] 用图11所示的台式设备测量所述BAL培养基(R2)中白蛋白浓度对从患者隔室(R1)中消除极性(氨、结合胆红素)和非极性(非结合胆红素)毒素的影响。在高(5.0g％)和低(0.5g％)白蛋白条件下观察到所有3种分子的物质转移速度略高。所述研究在SRBAL治疗中偏好使用标准白蛋白透析条件。
[0088] 4.所述BAL膜的渗透率对所述SRBAL的生物相容性、免疫保护、和生化性能的影响[0089] 上述研究证明使用150kD或400kD膜的白蛋白和废料分子的物质转移最大。所述150kD膜可用于限制较大的和潜在有害的IgG和IgM分子转移入R2。
[0090] 实施例5：通过证明生存改善和肝性脑病的逆转以建立所述SRBAL在ALF临床前模型中的功效
[0091] 1.储器培养基中新鲜分离的猪肝细胞的剂量对所述SRBAL功效的影响[0092] 如上表1所示，使用200克新鲜猪肝细胞的所述SRBAL研究证明在处理患有D-gal诱导的ALF的两只狗中存在有益的响应。使用剂量为200克或400克新形成的球体或猪肝细胞的验证研究如实施例8所述。
[0093] 实施例6：球体储器的较快或较慢旋转速度的优点
[0094] 在两个1.5L摇晃盒内接种1L肝细胞悬浮液(5x106细胞/mL)并培养24小时(红线)。分离球体并重悬于2L新鲜培养基且接种入两个SRBAL旋转储器之一。一个储器以98rpm搅拌(绿线)而另一个以196rpm搅拌(蓝线)22小时。22小时结束时，从每个储器中移出20mL球体悬浮物，制成球状，悬浮于新鲜培养基并接种到玻璃摇板上。用于白蛋白产生和BUN的样本在4小时和24小时取样。该研究的结果如图12所示。
[0095] 这些结果证明更快的旋转速度可导致更小的球体，其在一些情况下具有优势。这些结果还证明较低的旋转速度可导致较大的球体，其在沉降柱中沉降更快且不易流出沉降柱。
[0096] 实施例7：含血清和无血清培养基内的球体形成
[0097] 如图13所示，球体可在含血清的培养基和无血清的培养基中形成。在球体形成期间加入10％小牛血清和10mM L-肉碱到培养基中似乎是有益的。例如，当在RPMI球体形成培养基中补充10％FBS和10mM L-肉碱并且新分离的猪肝细胞悬浮物以0.25Hz摇晃24小时，81％的肝细胞纳入球体中。
[0098] 实施例8：通过证明生存改善和肝性脑病的逆转以建立所述SRBAL在ALF临床前模型中的效果
[0099] 1.用异种(猪)肝细胞的所述SRBAL的剂量响应研究
[0100] ALF中的所述SRBAL功效在两组实验设置(异种剂量研究，同种异体研究)中评估。受体模型、BAL条件和这两组实验的各个终点汇总于表3中。所述剂量研究旨在确定所述SRBAL中肝细胞的最优数量和白蛋白透析与所述灌注回路中的肝细胞是否有协同作用。所述同种异体研究用于确定使用与患者相同种类的肝细胞是否有额外的优点。两个研TM究中的灌注回路包括生理水平的白蛋白(5g％)以及MARS 白蛋白透析中商业使用的炭和树脂柱。所述SRBAL可使用所述150kD或400kD MWCO改性聚砜中空纤维膜在高通量条件(50mL/分钟)下操作。剂量研究使用0-400克范围的新鲜猪肝细胞。所述0克组相当于标准白蛋白透析。包含非BAL对照组以评估没有体外装置下ALF狗的基线炎症反应，其可能引发如图5所述的炎症反应。所述同种异体研究使用的肝细胞剂量与在剂量研究(除了同种异体)中发现最有效的剂量相同。存活时间是所述剂量研究和同种异体研究的一级终点。表3所列的其他二级终点经过仔细监测和报告。
[0101]
[0102]
[0103] a.一级终点 b用尿素生成、白蛋白生成(前和后)、氧气消耗(期间)进行评估
[0104] ？同种异体肝细胞球体的最优剂量取决于异种剂量研究的结果
[0105] 所述SRBAL功效测试在ALF的犬D-半乳糖胺模型中进行(参见例如Sielaff TD，Nyberg S，Amiot B，Hu M，Peshwa M，Wu F，Hu W-S等，生物人工肝(BAL)在急性爆发性肝炎中的应用(Application of a bioartificial liver(BAL)in a new model of acute fulminant hepatitis)，Surgical Forum 1993；44：61-63；Nyberg S，Cerra F，Gruetter R.，用磁共振波谱观察在狗爆发性肝衰竭期间的脑乳酸盐(Brain lactate by magnetic resonance spectroscopy during fulminant hepatic failure in the dog.)，Liver Transplantation and Surgery 1997；4：158-165)。选择该动物模型是因为它与临床ALF的相似性(肝性脑病逐渐发展为脑水肿和脑死亡，肺水肿，肝肾综合征)。狗装有测量仪器以监控肝衰竭(和被SRBAL逆转)发展期间的血液动力学变化(肺功能，肾功能和脑生理学)。用于监控所述SRBAL功效的终点包括：1)存活时间，2)颅内压和脑微量透析作为脑水肿测量，3)肺和肾功能作为ALF的其他肝外表现，4)动物血液动力学，5)THFα和IL6水平作为SIRS标记物，和6)ALT/氨/葡萄糖/乳酸盐作为肝损伤和功能的标记物。在处理之前、期间和之后评估猪肝细胞球体的肝细胞活力和生化性能作为免疫保护的间接测量。最后，对每个动物进行尸检以仔细检查研究动物的脑、肺和肾以及肝损伤的一致性。可看出肝衰竭、毒素积累和肝衰竭的肝外表现、以及改善(如果这一系列事件被SRBAL治疗所逆转)直接相关。在肝细胞和白蛋白透析之间可存在协同作用。
[0106] 如本文实施例1和2所述，在给予D-半乳糖胺前T＝0小时，狗在异氟烷麻醉下被植入管子并装有测量仪器。所述体外回路的灌输在给予D-半乳糖胺后T＝12小时开始。所述SRBAL已在体外条件下至少24小时以确保处理开始时球体正确形成以及生化性能最大。在6小时、18小时给予且24小时后不断给予氯化铵大药丸以评估肝衰竭前、肝衰竭后、和SRBAL治疗期间的氨解毒活性。
[0107] 所述球体储器设计适于这些研究，因为所述设计可在处理前、中、后对肝细胞(用于活力)和培养基(用于测量氧气消耗)连续取样。SRBAL的生化性能在基线(处理前)和治疗结束后24小时测量。动物处理最高达48小时。
[0108] 用上表1的数据进行功效分析以建立本研究中功效测试的组大小。按照表1，对照ALF狗的存活时间为(35，36，40，41小时，平均38小时，标准偏差3小时)。因此，假设α为0.05且80％功率，治疗和对照组之间如下平均存活差异显著：若n＝5，6.3小时；若n＝8，4.5小时；若n＝10，3.0小时。由于表1仅限于4只对照狗，所以选择更加保守的3小时平均存活差异和n＝10只狗/组。这些假定基于实施例的研究而有效。
[0109] 处理40只狗。在低(200克)和高(400克)剂量的猪肝细胞下都存在白蛋白透析和球体肝细胞治疗的协同效应。最长的存活者是在所述400克猪肝细胞球体处理组。含所有3种处理(仅AD，AD+200克，AD+400克)的治疗可能与二级终点的改善例如较低颅内压、标准化的脑微量透析值、改进的肺和肾功能、和基于较低TNFα和IL6值的全身炎症减少有关。
[0110] 如果2.0gm/kg的D-半乳糖胺剂量太高并导致超出SRBAL治疗能稳定水平的致死性ALF，可替代使用较低剂量的1.0-1.5gm/kg D-半乳糖胺。所述SRBAL可使用所述150kD MWCO改性聚砜中空纤维膜在高通量条件(50mL/分钟)下操作。如果治疗结束时肝细胞活力很高但治疗优点低于预期(没有显著的存活优点)，则所述系统可改为400kD MWCO。若需要所述改变，则研究额外的动物以使n＝10/组。
[0111] 2.所述SRBAL中同种异体肝细胞的治疗优点
[0112] 进行与#1相同的研究，除了在SRBAL设备中使用狗肝细胞。分离狗和猪的肝细胞的技术相同。装载到所述SRBAL的肝细胞剂量与#1中发现的最有效剂量相同。研究了5只狗以测定在所述SRBAL中使用同种异体来源的肝细胞是否有增量效益。
[0113] 用相同剂量的同种异体和异种肝细胞可得到与#1中相似的结果。因为免疫介导的并发症是同种异体肝细胞源的可能性很小，所以处理后测量的肝细胞活力可能较高。所述400kD中空纤维膜用于所述同种异体研究，其可改善治疗效果—更长的存活时间。
[0114] 实施例9：确定基于细胞的生物人工肝在抑制急性肝衰竭的全身炎症反应综合症上的作用(alf的sirs)
[0115] 1.筛选BAL处理和未处理的ALF狗的门静脉、肝静脉和动脉血用于证明TLR4激动剂活性
[0116] 筛选实施例1的狗提供的血液样本用于测量D-gal诱导的ALF发作前和发作时每6小时的TLR4激动剂活性。这些血液样本获自SRBAL处理狗和未处理对照狗的门静脉、肝静脉、和股动脉。诱导ALF前两周，对狗进行外科手术过程以在所述肝静脉和门静脉中植入TM
两个BARD 孔型导管。该过程涉及普通麻醉下的剖腹手术以将所述导管的内端置于合适的静脉。所述导管的外部开到狗背部上的位点用于皮下植入所述孔。该手术过程比经皮放射学技术植入导管更加可靠。导管植入和诱导肝衰竭之间两周的间隔可使所述狗完全康复而没有开腹手术的炎症反应的干扰。股动脉导管在D-半乳糖胺灌注当天通过经皮技术植入。
孔也在当时通过休伯针连接。
两个BARD 孔型导管。该过程涉及普通麻醉下的剖腹手术以将所述导管的内端置于合适的静脉。所述导管的外部开到狗背部上的位点用于皮下植入所述孔。该手术过程比经皮放射学技术植入导管更加可靠。导管植入和诱导肝衰竭之间两周的间隔可使所述狗完全康复而没有开腹手术的炎症反应的干扰。股动脉导管在D-半乳糖胺灌注当天通过经皮技术植入。
孔也在当时通过休伯针连接。
[0117] TLR4激动剂活性通过体外实验测量，使用HEK293/Luc(+)/TLR4(+)细胞(参见例如Akira S，Takeda K.Toll-样受体信号(Toll-like receptor signaling)，Nat Rev Immunol 2004；4：499-511)。所述实验以及所述TLR4受体复合体如图7a-b所示。萤光素酶报告基因信号用TD-20/20光度计(加利福尼亚州萨尼维尔市，特纳设计公司(Turner Designs，Sunnyvale，CA))定量。NFκβ的活化用萤火虫萤光素酶活性与组成型表达的海肾荧光素酶内参三复孔平均值的比例报告(参见例如，Brunn G，Bngm M，Johnson G，Platt J.，Toll样受体的条件信号(Conditional signaling by Toll-like receptor)，FASEB J2005；19：872-4)。
[0118] 急性肝衰竭的发展可与SIRS响应和全身动脉血液样本的TLR4激动剂活性增加相关联。可在门静脉和肝静脉血液样本中观察到TLR4激动剂活性的增加。TLR4激动剂活性分布差异取决于TLR4激活剂的主要来源是内脏还是肝。随着肝损伤的确定，TLR4活性显示出在门静脉中早期增加之后在肝静脉血液中晚期持续增加。因为在SRBAL治疗期间观察到TNFα(全身活化的敏感标记物)的归一化，所以SRBAL治疗可与TLR4激动剂活性的归一化相关联。
[0119] 2.肝损伤期间释放的ECM组分是SIRS的介质且这些SIRS潜在介质在所述SRBAL治疗期间被清除
[0120] 使用我们的HEK293/Luc(+)/TLR4(+)细胞体外实验筛选获自实施例8的ALF狗的门静脉、肝静脉和股动脉血液样本(用或不用SRBAL治疗)中TLR4激动剂活性的存在，。对发现具有阳性TLR4激动剂活性的样本进一步分析以确定这种活性是否与LPS、硫酸乙酰肝素、和/或透明质酸的存在有关。这些研究依次进行。首先步骤是移除LPS并再检测移除和未移除LPS的样本。第二步骤是移除硫酸乙酰肝素并再检测移除和未移除硫酸乙酰肝素的样本。第三步骤是移除透明质酸并再检测移除和未移除透明质酸的样本。任意这三种操作后的TLR4激动剂活性降低证明狗血样本中存在该分子(LPS、硫酸乙酰肝素、或透明质酸)，更重要的是，提示这些分子作为ALF中SIRS响应的介质。通过在特异结合LPS的带正电去污剂多粘菌素B中培养样本进行LPS的移除(参见例如，Rifkind D.，内毒素和多粘菌素B之间相互作用的研究(Studies on the interaction between endotoxin and polymyxin B)，J Infectious Dis 1967；117：433-438)。通过在重组肝素酶中培养样本进行硫酸乙酰肝素移除(参见例如，Brunn G，Bngm M，Johnson G，Platt J.，Toll样受体的条件信号，FASEB J 2005；19：872-4)。通过在牛睾丸透明质酸酶(西格玛化学公司(Sigma Chemicals))中培养样本进行透明质酸的移除(参见例如，Termeer CC，Hennies J，Voith U，Ahrens T，Weiss JM，Prehm P，Simon JC.透明质酸寡糖是树突细胞的有效激活剂(Oligosaccharides of hyaluronan are potent activators of dendritic cells)，J Immunol 2000；165：1863-1870)。细胞培养使用的所有材料经鉴定无内毒素或用鲎变形细胞裂解物试验凝胶结块法测试以确保没有可检测到的内毒素(＜0.1ng/mL)。
[0121] 可证明ALF的SIRS被内源分子如硫酸乙酰肝素或透明质酸介导，至少部分介导。
[0122] ALF过程中获得的血清可包括基质金属蛋白酶，其通过内源或微生物配体例如LPS剪切胞外基质蛋白并加强TLR4活性。为了检测ALF血清是否包含这些酶，ALF血清存在时在胞外基质包被板上培养HEK/Luc(+)/TLR4(+)细胞。6小时后在所述培养细胞的不同孔中加入更多量的LPS。通过LPS-TLR4激活的剂量响应曲线的左移检测到TLR4信号被ALF血清增强，表明ALF血清包含TLR4信号的间接激活剂或增强剂。如果在ALF狗血清中没有发现LPS、硫酸乙酰肝素和透明质酸，则考虑其他潜在候选分子。其他候选物包括月桂酸、纤维蛋白原、纤连蛋白、热激蛋白、和β-防御素。硫酸乙酰肝素和透明质酸是主要候选物。
[0123] 3.肝脏的肝细胞、库普弗细胞、和星状细胞对ALF中ECM组分的循环水平的影响以及这些细胞在调控急性肝衰竭的SIRS中的作用
[0124] 此试验包括一系列体外研究以确定肝细胞在调控ALF的SIRS响应中的作用。研究获自实施例8对照ALF狗(无BAL组)的具有TLR4激动剂活性的血浆样本。考虑门静脉、肝静脉和股动脉样本。用HEK293/Luc(+)/TLR4(+)细胞体外试验测定这些样本的TLR4激动剂活性(参见例如，Brunn G，Bngm M，Johnson G，Platt J.，Toll样受体的条件信号，FASEB J 2005；19：872-4)。所述研究中使用大鼠肝细胞(参见例如，Seglen P.，制备分离的大鼠肝细胞(Preparation of isolated rat liver cells)，Methods in Cell Biology 1976；13：29-83)，并用猪肝细胞检验其结果。粗制备的肝细胞(85-90％肝细胞、5-10％库普弗细胞、星状细胞等)用于初始研究，接着在随后的研究中富集制备肝细胞、库普弗细胞、或星状细胞。通过在购自西格玛化学公司的无精氨酸培养基中选择性培养粗制品来富集原代肝细胞(参见例如，Leffert HL，Paul D.分化的胎肝细胞的初级培养物研究(Studies on primary cultures of differentiated fetal liver cells)，J Cell Biol 1972；52：
559-568；Spiegelberg T，Bishop JO.在生长抑制培养基中培养的小鼠肝细胞的组织特异性基因表达(Tissue-specific gene expression in mouse hepatocytes cultured in growth-restricting medium)，Mol Cell Biol 1988；8：3338-3344)。通过使用酶处理、密度梯度离心、离心淘洗法、和选择性吸附的四步技术分离库普弗细胞(参见例如Valatas V，Xidakis C，Roumpai H，Kolios G，Kouroumalis E.大鼠库普弗细胞的分离：高纯化的初级培养物的组合方法(Isolation of rat Kupffer cells：a combined methodology for highly purified primary cultures)，Cell Biol International 2003；27：67-73)。使用阿拉伯半乳聚糖通过密度梯度离心分离星状细胞(参见例如，Ramm G.大鼠肝星状细胞
6
的分离和培养，J Gastroenterol Hepatol 1998；13：846-851)。富集的细胞群(1x10 细胞/mL)在补充有胰岛素/转铁蛋白/硒(ITS，西格玛化学公司)和0.5体积％狗血清样本的RPMI无血清培养基中37℃孵育24小时。狗血清样本(0.5体积％)也在无血清培养基的无细胞对照条件下37℃孵育24小时。在细胞和无细胞(对照)条件下测量TLR4激动剂活性以确定肝细胞接触对TLR4激动剂活性的影响。在所有库普弗细胞培养物和任何显示出TLR4激动剂活性反常增加的样本中检测TNFα水平。
559-568；Spiegelberg T，Bishop JO.在生长抑制培养基中培养的小鼠肝细胞的组织特异性基因表达(Tissue-specific gene expression in mouse hepatocytes cultured in growth-restricting medium)，Mol Cell Biol 1988；8：3338-3344)。通过使用酶处理、密度梯度离心、离心淘洗法、和选择性吸附的四步技术分离库普弗细胞(参见例如Valatas V，Xidakis C，Roumpai H，Kolios G，Kouroumalis E.大鼠库普弗细胞的分离：高纯化的初级培养物的组合方法(Isolation of rat Kupffer cells：a combined methodology for highly purified primary cultures)，Cell Biol International 2003；27：67-73)。使用阿拉伯半乳聚糖通过密度梯度离心分离星状细胞(参见例如，Ramm G.大鼠肝星状细胞
6
的分离和培养，J Gastroenterol Hepatol 1998；13：846-851)。富集的细胞群(1x10 细胞/mL)在补充有胰岛素/转铁蛋白/硒(ITS，西格玛化学公司)和0.5体积％狗血清样本的RPMI无血清培养基中37℃孵育24小时。狗血清样本(0.5体积％)也在无血清培养基的无细胞对照条件下37℃孵育24小时。在细胞和无细胞(对照)条件下测量TLR4激动剂活性以确定肝细胞接触对TLR4激动剂活性的影响。在所有库普弗细胞培养物和任何显示出TLR4激动剂活性反常增加的样本中检测TNFα水平。
[0125] 狗样本在原代肝细胞的粗培养物和纯培养物中孵育后可看到TLR4激动剂活性降低，这是由于所述SIRS响应的介质的代谢降解。在纯库普弗细胞或纯星状细胞培养物中孵育后也可看到TLR4激动剂活性降低。
[0126] 如果上述0.5体积％的“有毒”样本大到足以刺激HEK293/Luc(+)/TLR4(+)细胞的TLR4激动剂响应，则测试更高浓度的有毒狗血清(1-10体积％)。如果ALF狗血清包含基质金属蛋白酶，则使用LPS滴定技术以排除此试验中的污染(如果表明)。如果少量已知表达TLR4且存在于球体聚集体的树突细胞参与抑制ALF的SIRS，则考虑树突细胞在所述SRBAL中的作用(如果SRBAL治疗的有益结果不能完全通过移除肝细胞、库普弗细胞和星状细胞来解释)。
[0127] 实施例10：确定肝细胞核因子6(hnf6)对维持球体储器生物人工肝中尿素生成的作用
[0128] 1.重组腺病毒载体诱导大鼠肝细胞球体中HNF6的稳定表达
[0129] 基于用大鼠肝细胞cDNA通过聚合酶链式反应扩增生成的包含大鼠Hnf6完整蛋白编码序列的cDNA克隆来设计CMV-GFP-HNF6融合表达腺病毒质粒(AdCMV-GFP-HNF6)。为了对照腺病毒感染的不良影响，还制备了包含腺病毒质粒而没有Hnf6的GFP(AdCMV-GFP)。用浓度逐渐增加的AdCMV-GFP-HNF6感染大鼠直到发现能在大部分肝细胞中成功表达HNF6-GFP的最优腺病毒浓度。一旦这被确定下来，通过两步灌注法从未感染、对照感染(AdCMV-GFP)和AdCMV-GFP-HNF6自雄性SD(Sprague-Dawley)大鼠(印第安纳州，印第安纳波利斯)中分离肝细胞(参见例如，Seglen P.制备分离的大鼠肝细胞(Preparation of isolated rat liver cells)，Methods in Cell Biology 1976；13：29-83)。仅将产生至少90％活性肝细胞的收获物用于随后的肝细胞球体培养物，所述活性通过台盼蓝染色排除
6
确定。通过在摇晃条件下以1x10 细胞/mL的细胞密度在硅化的20mL玻璃培养板中孵育新分离的细胞来制备球体肝细胞培养物(参见例如Brophy C，Luebke-Wheeler J，Amiot B，Remmel R，Rinaldo P，Nyberg S.用摇晃技术形成的大鼠肝细胞球体维持分化的肝细胞的表达和功能(Rat hepatocyte spheroids formed by rocked technique maintain differentiated hepatocyte expression and function)，Hepatology，2009，49：578-86)。
在1、2、7和14天收获样本用于随后的实验。由于HNF和绿色荧光蛋白融合，所以用绿色荧光显微镜监控HNF6的表达变化。用流式细胞仪测定稳定表达GFP-HNF6的肝细胞百分比。简要地，来自腺病毒处理和未处理培养物的球体用胰蛋白酶消化并立即分析测定绿色荧光细胞相较总细胞数的比例。腺病毒HNF6感染造成的Hnf6的表达变化也用反转录聚合酶链式反应检验(qRT-PCR)(参见例如，Brophy C，Luebke-Wheeler J，Amiot B，Remmel R，Rinaldo P，Nyberg S.用摇晃技术形成的大鼠肝细胞球体维持分化的肝细胞的表达和功能，Hepatology，2009，49：578-86)。此外，使用HNF6抗体通过Western印迹分析监控感染了所述对照或HNF6表达腺病毒的多大鼠肝与来自分离的成年大鼠肝的未感染培养物相比的HNF6蛋白变化。
6
确定。通过在摇晃条件下以1x10 细胞/mL的细胞密度在硅化的20mL玻璃培养板中孵育新分离的细胞来制备球体肝细胞培养物(参见例如Brophy C，Luebke-Wheeler J，Amiot B，Remmel R，Rinaldo P，Nyberg S.用摇晃技术形成的大鼠肝细胞球体维持分化的肝细胞的表达和功能(Rat hepatocyte spheroids formed by rocked technique maintain differentiated hepatocyte expression and function)，Hepatology，2009，49：578-86)。
在1、2、7和14天收获样本用于随后的实验。由于HNF和绿色荧光蛋白融合，所以用绿色荧光显微镜监控HNF6的表达变化。用流式细胞仪测定稳定表达GFP-HNF6的肝细胞百分比。简要地，来自腺病毒处理和未处理培养物的球体用胰蛋白酶消化并立即分析测定绿色荧光细胞相较总细胞数的比例。腺病毒HNF6感染造成的Hnf6的表达变化也用反转录聚合酶链式反应检验(qRT-PCR)(参见例如，Brophy C，Luebke-Wheeler J，Amiot B，Remmel R，Rinaldo P，Nyberg S.用摇晃技术形成的大鼠肝细胞球体维持分化的肝细胞的表达和功能，Hepatology，2009，49：578-86)。此外，使用HNF6抗体通过Western印迹分析监控感染了所述对照或HNF6表达腺病毒的多大鼠肝与来自分离的成年大鼠肝的未感染培养物相比的HNF6蛋白变化。
[0130] 因为Hnf6的表达受CMV启动子的直接控制，所以可诱导Hnf6表达并在大鼠肝细胞球体中维持。通过定量qRT-PCR分析Ad-CMV-HNF6表达肝细胞能检测到Hnf6表达，而培养14天会失去Hnf6表达的Ad-CMV感染的肝细胞则不能。HNF6蛋白可能随着Hnf6基因表达的增加而增加，其通过Western印迹分析测定。
[0131] 如果很难通过HNF6表达腺病毒的尾静脉注射来获得HNF表达细胞，则在体外悬浮培养条件下直接感染肝细胞。或者，通过将CMV-HNF6表达质粒瞬时转染到原代大鼠肝细胞悬液中，直接在大鼠肝细胞球体培养物中再表达HNF6。
[0132] 2.过量表达HNF6对尿素循环基因表达的影响及其在摇晃球体培养中的作用[0133] 如上面#1所述完成来自未感染、Ad-CMV感染(作为对照)和Ad-CMV-HNF6感染大鼠肝的大鼠肝细胞球体培养物。最初，完成所有6个尿素生成基因的qRT-PCR分析以确定HNF6对尿素生成基因表达的影响。为了检测所述肝细胞球体的生化性能，培养基掺入了15
硫酸氨并测量解毒速率。重氨(N D3)转化为重尿素用于检测全部尿素循环活性。
硫酸氨并测量解毒速率。重氨(N D3)转化为重尿素用于检测全部尿素循环活性。
[0134] 与不表达HNF6的未处理或对照感染培养物相比，表达HNF6的细胞可具有改善的氨解毒能力。尿素生成功能的变化可能是由于尿素生成基因的表达水平上升。
[0135] 如果HNF6的强制表达足以诱导尿素生成基因表达和功能的变化，则研究其他肝脏转录因子以确定额外调控因子在肝细胞球体中是否损失。这通过qRT-PCR分析涉及尿素生成基因表达调控的其他肝细胞转录因子的表达来实现。
[0136] 3.HNF可调控Cps1表达
[0137] Hnf6和Cps1表达在肝细胞球体培养物中都下调。此研究涉及瞬时转染和染色质免疫沉淀(ChIP)分析的结合。对于瞬时转染分析，一系列启动子构建体包括驱动萤光素酶报告基因表达的所述Cps1上游调控序列部分。构建HNF6表达质粒，当其转染到组织培养细胞中时可使巨细胞病毒启动子(CMV)高水平表达。将这些表达质粒和驱动荧光素酶的所述Cps1启动子的不同片段一起导入NIH3T3细胞。NIH3T3细胞中通常不表达HNF6，因而这些细胞用于通过测量相关荧光素酶水平来确定HNF6是否经Cps1启动子反式活化表达。不同启动子片段对HNF6反式活化的响应比较可绘制出HNF6在所述Cps1启动子/增强子的何处起作用。所述信息可表明在何处对直接HNF6调控区域进行集中初步分析。可在HNF6和Cps1之间鉴定到直接的体内关系。为了实现上述目的，分离成年大鼠肝脏和心脏(作为阴性对照，因为其不表达HNF6)并用1％甲醛固定，用均质器解离细胞，并用超声处理将染色质剪切到约500bp。使用昂斯特ChIP实验试剂盒(昂斯特#17-295)按照厂商说明书用抗HNF6(圣克鲁兹公司(Santa Cruz)，H-100)或抗Pes1抗体进行染色质免疫共沉淀。设计引物以PCR扩增染色质区域，该区域侧接已知的Cyp7a1内HNF6结合位点、Cps1内任何预测的HNF6结合位点、和缺少HNF6结合位点作为阴性对照的RNA Pol2片段。
[0138] HNF6可通过调控肝细胞球体中尿素生成基因如Cps1的表达而具有调控尿素生成功能的能力，且HNF6可用瞬时转染实验通过上游Cps1调控区反式活化Cps1基因表达。HNF6可间接调控Cps1表达，且HNF6可能通过直接调控Cps1表达的其他转录因子的直接调控来做到这点。ChIP分析可能没有发现HNF6体内结合的证据。HNF6可能在Cps1表达上直接发挥其调控效应，且ChIP分析可鉴定潜在的新HNF6调控序列。
[0139] 如果HNF6不足以在NIH3T3细胞中调控Cps1表达，则这可能是由于缺少在体外反式活化所述Cps1启动子/增强子的其他肝脏转录因子。所述瞬时转染实验在肝细胞瘤细胞系如HepG2中进行，所述细胞系表达大多数肝细胞转录因子，虽然在内源肝组织中水平较低。
[0140] 实施例11-形成球体
[0141] 考虑到球体形成条件，使用在补充有10％胎牛血清的培养基中以三种细胞密度培6
养的肝细胞进行研究(2、5、10x10 细胞/mL)。不同的球体形成条件包括所述摇晃器速率(8相对10圈/分钟)和球体形成培养基中的氧压(50-60mm Hg低pO2和约300mm Hg高pO2)。
基于这些条件，在较慢摇晃速度和低pO2环境下在所述摇晃容器中形成大量球体。例如，在
8圈/分钟的摇晃速度和低pO2下95％的猪肝细胞初始接种物形成40微米或更大的球体。
相反，在高pO2环境中以10圈/分钟摇晃时仅有86％的猪肝细胞形成40微米或更大直径的球体。条件的其他两个组合与90％球体形成相关联。应注意，低pO2环境并不导致含氧量低的情况，其中氧气供给不能满足细胞对氧气的需求。一旦满足所述供给/需求条件，增加的氧气压力在球体形成期间和之后的摇晃球体培养期间似乎产生有毒效应。
养的肝细胞进行研究(2、5、10x10 细胞/mL)。不同的球体形成条件包括所述摇晃器速率(8相对10圈/分钟)和球体形成培养基中的氧压(50-60mm Hg低pO2和约300mm Hg高pO2)。
基于这些条件，在较慢摇晃速度和低pO2环境下在所述摇晃容器中形成大量球体。例如，在
8圈/分钟的摇晃速度和低pO2下95％的猪肝细胞初始接种物形成40微米或更大的球体。
相反，在高pO2环境中以10圈/分钟摇晃时仅有86％的猪肝细胞形成40微米或更大直径的球体。条件的其他两个组合与90％球体形成相关联。应注意，低pO2环境并不导致含氧量低的情况，其中氧气供给不能满足细胞对氧气的需求。一旦满足所述供给/需求条件，增加的氧气压力在球体形成期间和之后的摇晃球体培养期间似乎产生有毒效应。
[0142] 从猪肝中分离肝细胞，并在50-60mm Hg低pO2和8圈/分钟摇晃频率下用图4b所示的多盘摇晃器通过摇晃技术从这些细胞形成球体。图20以24小时后93.7±2.4％的肝细胞形成入球体和这些条件下48小时后93.2±1.9％形成入球体证明球体形成的高效率。如图19所示，在球体形成的这48小时间隔所述系统中细胞总体积也保持相对恒定。48小时后，形成的球体随之放入图15a示意图和图15b照片所示的有孔漏斗SRBAL生物反应器中。用培养基连续灌输这些球体24小时。图18汇总了这72小时时间框架中肝细胞氧气消耗的显著速率。应注意，开始48小时用注射技术测定氧气消耗，而最后72小时在所述SRBAL中时直接测量流入物和流出物氧压差异以测定氧气消耗。技术的差异说明了图18中第二天(92.6μmolO2/分钟)和SRBAL t＝0小时(42.3μmolO2/分钟)测定的氧气消耗值的差异。两种测量法测自小于2小时间隔的相同球体群。
[0143] 用与肝细胞球体制品大小和密度分布大致相同的合成微珠的混合物测试SRBAL设计的物理性质。在这些测试中，将微珠加入所述储器。使用库尔特计数器对所述储器和所述流出物内微珠组合物的各样本进行测定。所述有孔漏斗设计显示更有效保持储器内微珠且流出物中离开的颗粒数量最少。在图21所示的试验中，没有观察到直径大于100μm的颗粒离开所述储器。
[0144] 其他实施方式
| 标题 | 发布/更新时间 | 阅读量 |
|---|---|---|
| 组合型生物人工肝支持系统 | 2020-05-22 | 756 |
| 生物人工肝系统 | 2020-05-12 | 985 |
| 生物人工肝系统 | 2020-05-12 | 825 |
| 混合型生物人工肝体外支持装置 | 2020-05-23 | 774 |
| 生物人工肝细胞生长组件、人工肝反应器及其制备方法 | 2020-05-15 | 770 |
| 全血灌流生物人工肝系统 | 2020-05-18 | 221 |
| 人工肝生物反应器 | 2020-05-14 | 1013 |
| 离体式生物人工肝的肝支持装置 | 2020-05-21 | 334 |
| 毛绒线式生物反应器人工肝系统 | 2020-05-17 | 737 |
| 一种生物型人工肝用细胞3D打印系统 | 2020-05-25 | 869 |
高效检索全球专利专利汇是专利免费检索,专利查询,专利分析-国家发明专利查询检索分析平台，是提供专利分析，专利查询，专利检索等数据服务功能的知识产权数据服务商。
我们的产品包含105个国家的1.26亿组数据，免费查、免费专利分析。
分析报告
专利汇分析报告产品可以对行业情报数据进行梳理分析，涉及维度包括行业专利基本状况分析、地域分析、技术分析、发明人分析、申请人分析、专利权人分析、失效分析、核心专利分析、法律分析、研发重点分析、企业专利处境分析、技术处境分析、专利寿命分析、企业定位分析、引证分析等超过60个分析角度，系统通过AI智能系统对图表进行解读，只需1分钟，一键生成行业专利分析报告。
生物人工肝热门专利
QQ群二维码
意见反馈
意见反馈