一种长期体外培养和扩增肝细胞的方法及其应用
阅读：998发布：2020-07-07
专利汇可以提供一种长期体外培养和扩增肝细胞的方法及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及 生物 技术领域，本发明提供了一种长期体外培养和扩增 肝细胞 的方法，该方法在体外将成熟肝实质细胞诱导成为具有无限增殖能 力 的肝细胞，本发明制备得到的肝细胞可用于化合物和药物的毒理学和药理学评价、 肝炎 病毒的研究和诊疗、肝细胞移植 治疗 、 生物人工肝 的制备等应用。，下面是一种长期体外培养和扩增肝细胞的方法及其应用专利的具体信息内容。
1.一种体外培养和扩增肝细胞的方法，其特征在于，该方法在体外将肝实质细胞诱导成为具有无限增殖能力的肝细胞，包括以下步骤：
A、采用胶原蛋白I或Matrigel基质胶对培养支持物的预包被；
B、将肝实质细胞传入步骤A提供的经预包被的培养支持物上，在肝细胞增殖培养基中进行培养和扩增；
所述的肝细胞增殖培养基是由基础培养基和添加的营养成份组成，所述的基础培养基为WilliamsE或DMEM/F12培养基；所述的添加的营养成分为20-50ng/mL的人成纤维细胞生长因子-2、1-3μM的Wnt信号通路的小分子激动剂CHIR98014、0.5-1μM的Rho相关蛋白激酶抑制剂thiazovivin、体积百分含量为1％的胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠混合补充液、0.1mM的β-巯基乙醇、体积百分含量为1％的非必须氨基酸以及体积百分含量为1％的GlutaMAX；
C、步骤B获得的增殖状态的肝细胞，转入肝细胞分化培养基中培养获得肝实质细胞；
所述的肝细胞分化培养基由基础培养基和添加物组成，所述的基础培养基为WilliamsE或DMEM/F12培养基；所述的添加物为体积百分含量为1％的胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠混合补充液、体积百分含量为1％的GlutaMAX、0.1μM的地塞米松、10ng/mL的人抑瘤素-M以及非必须氨基酸和β-巯基乙醇；
D、步骤C获得的肝细胞的标志物鉴定。
2.根据权利要求1所述的一种体外培养和扩增肝细胞的方法，其特征在于，所述的肝实质细胞为哺乳动物细胞。
3.根据权利要求1所述的一种体外培养和扩增肝细胞的方法，其特征在于，所述的肝实质细胞为小鼠细胞、大鼠细胞或人细胞。
4.根据权利要求1所述的一种体外培养和扩增肝细胞的方法，其特征在于，所述的步骤A，用Matrigel基质胶预包被；所述的培养支持物是指培养皿或培养板。
5.根据权利要求1所述的一种体外培养和扩增肝细胞的方法，其特征在于，所述的步骤B，7-10天细胞可传代并持续增殖；所述的肝细胞传代采用Accutase消化5-10分钟待细胞完全从培养板上成团脱落，加入含血清培养基重悬并离心，细胞传代比例为1:2-1:4。
一种长期体外培养和扩增肝细胞的方法及其应用
技术领域
[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种长期体外培养和扩增肝细胞的方法，该方法在体外将成熟肝实质细胞诱导成为具有无限增殖能力的肝细胞，所述的肝细胞可用于化合物和药物的毒理学和药理学评价、肝炎病毒的研究和诊疗、肝细胞移植治疗、生物人工肝的制备等应用。
背景技术
[0002] 一、肝脏与肝细胞
[0003] 肝脏是动物体内以代谢功能为主的重要生命器官，调控着多种生理功能，主要包括解毒，储存肝糖原，合成分泌性蛋白质以及生成胆汁等。肝脏本身具有强大的再生能力，正常肝脏经三分之二部分肝切除后，残留的成熟肝细胞可快速增殖，并完全取代和恢复缺失肝脏的体积和功能。但是在罹患各种肝脏疾病，包括肝炎，肝硬化，肝癌，肝脏代谢疾病和肝功能衰竭时，肝脏逐渐失去再生能力，从而导致其生理功能不断下降，最终危害人们的健康和生命。
[0004] 全世界受肝病影响的患者超过5亿，一旦发展为终末期肝病或急性肝衰竭，目前唯一有效的治疗手段是进行肝脏移植。但是由于肝脏供体持续紧缺以及术后免疫系统对异体器官的排斥，移植手术的发展受到了严重的制约。最近基于肝细胞治疗的技术受到了广泛的关注，其中包括肝细胞移植，肝脏组织的体外重建和生物人工肝等，被认为是全器官移植较理想的替代方式。然而，由于成熟肝细胞无法长期体外培养和扩增，该方法仍旧依赖于捐献的供体肝脏，并且不能改变移植后的免疫排斥。此外，体外培养的肝细胞还是非常好的药物肝脏代谢模型以及肝炎病毒研究模型，被广大制药公司和研究机构大量使用。因此如何获得稳定而大量的肝细胞来源，成为目前最迫切的需要。
[0005] 在过去的数十年中，研究者进行了各种各样的尝试，期望在体外重现肝细胞特有的强大增殖潜能。然而迄今为止，尚无报道可在体外长期培养和扩增各种动物的正常肝实质细胞。为了克服原代肝细胞在体外的生长限制，研 究者通过导入SV40病毒蛋白(大T抗原或小T抗原)实现了正常肝细胞的永生化(如Fa2N-4细胞系)。此外一些来自于肿瘤的细胞系被建立起来，并表现出一些成熟肝细胞的形态和功能(如HepaRG细胞系)。虽然这些细胞可在体外无限培养和扩增，但出于安全性的考虑以及肝细胞功能上的异常(包括p450活性的异质性)，它们的实际应用受到极大限制，通常仅作为药物代谢和毒性筛查模型，在一些制药公司被少量使用(Vallier L.，Heps with Pep:Direct Reprogramming into Human Hepatocytes，Cell Stem Cell,14,March 6,2014，267-269)。
[0006] 近来，利用干细胞或其他细胞来分化获得肝细胞被认为是未来肝细胞的重要来源。可诱导多能干细胞(iPS)和谱系重编程技术的诞生更是使得建立个体化肝细胞，并最终实现个性化医学变得可能。目前已有多个报道可成功地将哺乳动物的胚胎干细胞(ES)和iPS细胞定向分化成具有肝脏功能的细胞。此外，研究者还成功地将体细胞通过谱系重编程直接转分化为肝细胞，并证明这些细胞可在肝脏中增殖及重建肝脏功能。但是，无论由ES细胞，iPS细胞还是谱系重编程分化获得肝细胞，都不可能达到百分之百的效率，残存的干细胞注射入动物体内后可能形成畸胎瘤和腺瘤，因此严重影响了这些细胞的应用。此外，ES细胞取材困难且受到伦理学上的严格限制，而iPS细胞和谱系重编程均涉及多个外源基因导入，其安全性和肝细胞功能与上述永生化的肝细胞相似，因此它们的实际应用也有较大限制。
[0007] 因此，最理想的肝细胞来源还是原代肝细胞，如果能实现原代肝细胞的长期体外培养和扩增，并保持正常肝细胞遗传学和功能的稳定性，将极大推动人类对肝脏的认识和肝病的诊疗。
[0008] 二、肝细胞特征
[0010] 成熟肝细胞的形态特征为其具有原代肝细胞的形态特征。该特征包括任何或所有下列各项：多边形细胞形状，双核表型，用于合成分泌蛋白的粗面内质网，用于细胞内蛋白分选的高尔基体、内质网和溶酶体复合体，过氧化物酶体和糖原颗粒，相对丰富的线粒体，并且形成细胞间的微胆管空间。
[0011] 成熟肝细胞也可以根据其是否表达肝系特征性标志物来鉴定，包括白蛋白，唾液酸糖蛋白受体，α1-抗胰蛋白酶，α-胎蛋白，载脂蛋白E，精氨酸酶I， 载脂蛋白AI，apoAII，载脂蛋白B，apoCIII，apoCII，醛缩酶B，醇脱氢酶1，过氧化氢酶，CYP3A4，葡萄糖激酶，葡萄糖-6-磷酸酶，胰岛素生长因子1和2，IGF-1受体，胰岛素受体，瘦素，肝特异性有机阴离子转运体(LST-1)，L-型脂肪酸结合蛋白，苯丙氨酸羟化酶，转铁蛋白，视黄醇结合蛋白，促红细胞生成素(EPO)。成熟肝细胞标记物包括但不限于，白蛋白，α1-抗胰蛋白酶，唾液酸糖蛋白受体，细胞角蛋白8(CK8)，细胞角蛋白18(CK18)，CYP3A4，富马酰乙酰乙酸水解酶(FAH)，葡萄糖-6-磷酸酶，酪氨酸氨基转移酶，磷酸烯醇丙酮酸烯醇和色氨酸2,3-双加氧酶。
[0012] 可以使用任何合适的免疫学技术，如采用流式细胞术分析细胞表面标记，采用免疫组织化学检测细胞表面或细胞内的肝细胞标志物，采用Western印迹分析细胞裂解液中标志物的表达水平，采用酶联免疫分析，对细胞裂解液或分泌到培养基中产物进行检测。也可以通过Northern印迹分析，斑点印迹杂交分析，或实时定量聚合酶链反应(RT-PCR)等方法检测肝细胞特异性标志物mRNA水平的表达情况(美国专利号US5843780)。还可以根据细胞是否显示酶活性鉴定其肝细胞特性。例如，测定对葡萄糖-6-磷酸酶活性，测定碱性磷酸酶(ALP)和5'-核苷酸酶活性等(Maurel P.，Hepatocytes-Methods and Protocols，METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，ISSN 1064-3745)。
[0013] 成熟肝细胞还可通过检测解毒活性确定其功能。细胞色素P450是单加氧酶系统的关键催化组分。该家族负责外来物质(如服用的药物)和许多内源性化合物的氧化代谢。不同的细胞色素存在特性和重叠的底物特异性。大部分的生物转化能力是由CYP1A2，2A6，2B6，3A4，2C 9-11，2D6和2E1等细胞色素实现的。可通过检测细胞色素P450酶的活性反映细胞解毒功能。检测CYP3A4的解毒活性可使用P450-GloTMCYP3A4 DMSO耐受试验(荧光素-TM
PPXE)和P450-Glo CYP3A4 cell-based/biochemical法(荧光素-PFBE)(Promega公司LNC，#V8911和V8901#)，还可采用CYP3A4酶的荧光底物DBOMF进行流式细胞术检测。检测CYP1A1和/或CYP1B1的解毒活性可使用P450-GloTM检测(荧光素-CEE)(Promega公司#V8762)。检测CYP1A2和/或CYP4A解毒活性使用的是P450-GloTM检测(荧光素-ME)(Promega公司公司#V8772)。检测CYP2C9解毒活性可使用P450-GloTMCYP2C9法(荧光素-H)(Promega公司，#V8791)。
PPXE)和P450-Glo CYP3A4 cell-based/biochemical法(荧光素-PFBE)(Promega公司LNC，#V8911和V8901#)，还可采用CYP3A4酶的荧光底物DBOMF进行流式细胞术检测。检测CYP1A1和/或CYP1B1的解毒活性可使用P450-GloTM检测(荧光素-CEE)(Promega公司#V8762)。检测CYP1A2和/或CYP4A解毒活性使用的是P450-GloTM检测(荧光素-ME)(Promega公司公司#V8772)。检测CYP2C9解毒活性可使用P450-GloTMCYP2C9法(荧光素-H)(Promega公司，#V8791)。
[0014] 成熟肝细胞还可通过生物功能分析如糖原储存、尿素产生、胆汁分泌以 及脂质合成来进行评估。糖原贮积通过碘酸雪夫(PAS)染色进行测定，阳性为特征性的红色糖原颗粒。尿素产量可通过试剂盒进行测定。胆汁的分泌可以通过荧光素二乙酸酯时间的推移试验来测定。简言之，将贴壁培养的肝细胞用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤三次，加入含有荧光素二乙酸酯(20微克/毫升)(Sigma-Aldrich公司)的无血清培养基，37℃孵育35分钟，随后用PBS洗涤3次和荧光成像。脂质合成(中性甘油三酯)可通过油红O或BODIY染色进行检测。
[0015] 成熟肝细胞还可通过其对环境病原微生物的易感性来评价。其中包括肝炎病毒A，B，C和delta型，Epstein-Barr病毒(EBV)，巨细胞病毒(CMV)，肺结核和疟疾。例如，乙型肝炎易感性可以用HBV携带者的血清感染肝细胞，随后通过免疫组织化学或RT-PCR检测病毒核心抗原(HBcAg)。
[0016] 三、肝细胞的应用
[0017] 肝细胞具有多种应用，包括筛选细胞毒性化合物和药物化合物等；在体外研究肝脏疾病和病毒感染的机制，如HBV和HCV的感染机制及抗病毒治疗；研究药物和/或生长因子的作用机制；生物人工肝；体内肝细胞移植治疗等，以下仅例举几例：
[0018] 1、化合物筛查
[0019] 培养和扩增的肝细胞可用于标准药物筛选和毒性测定，这些检测之前通常在只能短期培养的原代肝细胞中进行。候选药物化合物活性的评估通常包括候选化合物处理所述的细胞后，细胞的形态，表型或代谢活性发生的改变(与未处理的细胞或对照处理的细胞)，然后关联该化合物的作用与观察到的变化。化合物可具有对肝细胞的药理学作用，或对肝脏有副作用。两种或多种药物可以组合进行测试，以检测可能的药物-药物相互作用。此外，如果肝细胞可长期培养并维持成熟肝细胞状态，其还可用于在体外评估化合物的长期效应和毒性。
[0020] 肝毒性的检测可通过对细胞活力，存活，形态和酶泄漏进入培养基的量来测定。还可检测化合物是否影响肝细胞功能(例如，糖异生，尿素合成，以及血浆蛋白的合成等)。乳酸脱氢酶(LDH)是一个较好的标记，因为肝同工酶(V型)培养上清中较为稳定，可在培养12-24小时后进行检测。其它酶，如线粒体谷氨酸草酰乙酸转氨酶和谷氨酸丙酮酸转氨酶的泄漏也可用于检测。此外，肝毒性还可通过测定白蛋白，胆固醇和脂蛋白的合成和分泌； 结合胆汁酸和胆红素运输；尿素生成；细胞色素P450的水平和活动；谷胱甘肽水平；α-谷胱甘肽-S-转移酶的释放；ATP，ADP和AMP的代谢；细胞内K+和Ca2+浓度；核基质蛋白或寡聚核小体的释放；诱导细胞凋亡(由细胞变圆，染色质浓缩和核碎裂表示)等来进行评估。化合物对DNA合成或结构的影响可通过测量[3H]-胸苷或BrdU掺入以及DNA修复来评价。
[0021] 2、肝细胞移植治疗
[0022] 培养和扩增的肝细胞可用于急慢性及遗传性肝病的治疗，以部分恢复病人的肝功能。目前常用三种动物模型来验证体外培养的肝细胞是否具有体内功能。
[0023] FAH小鼠肝损伤模型：延胡索酰乙酰乙酸水解酶(Fah)基因剔除小鼠，简称Fah-/-小鼠，是Grompe等建立的遗传型酪氨酸血症I型小鼠模型。该模型小鼠由于Fah基因的缺失，酪氨酸分解代谢受阻，无法生成延胡索酸、乙酰乙酸和琥珀酸盐，导致酪氨酸在体内蓄积，从而造成肝损伤。Fah-/-小鼠存在广泛而持续的肝损伤，特别适合于移植细胞的再殖。
[0024] DPPIV-/-F344倒千里光碱结合三分之二肝切模型：该大鼠缺失DPPIV基因，经过倒千里光碱处理后，其正常肝再生能力被抑制，进行三分之二肝切除后，接种的野生型肝细胞，可在6个月左右重建90％以上的肝脏。由于野生型肝细胞表达DPPIV基因，因此可清晰的判断外源细胞的定植和生长情况。
[0025] Tet-uPA小鼠模型：该模型借助Tet-on基因表达调控系统，可以通过强力霉素(Dox)诱导，在小鼠肝脏特异表达尿激酶(Urokinase plasminogen activator，uPA)，引起小鼠肝脏损伤。是可调控的高效肝损伤模型。Tet-uPA小鼠与免疫缺陷小鼠Rag2null/γcnull或NOD/SCID/γcnul交配，获得免疫缺陷的诱导型肝损伤模型。这种小鼠通过移植人的肝脏细胞，可以获得真正意义上的人源化肝脏小鼠模型。
[0026] 3、生物人工肝等肝脏辅助设备
[0027] 生物人工肝的使用目的是在一定时间内部分替代肝功能，既可用于慢性肝病的长期治疗以维持患者肝功能，也可用于暴发性肝衰竭的治疗，以帮助患者度过急性期，或者作为延长肝移植患者等待供肝的姑息治疗手段。悬浮型生物人工肝的形式包括1、细胞悬浮在透析袋中；2、细胞封装在微胶囊中，并培养在合适的基质上；3、细胞培养在包被了细胞外基质蛋白或其混合物的微载体珠上；4、细胞培养在水溶胶载体上；5、细胞培养在填充床的固相填 充物上、多层平板上或中空纤维毛细管中。该装置具有患者血液的进口和出口以回流入患者体内，通常还有细胞培养液的入口和出口。该装置的功效可通过比较血液输入和输出成分中代谢物的去除以及新生蛋白质的合成来进行评估。
[0028] 生物人工肝装置主要用于血液的解毒，主要指通常由肝脏处理的代谢物和化合物，包括但不限于胆红素，胆汁酸，尿素，血红素，脂蛋白，碳水化合物，转铁蛋白，血红素结合蛋白，去唾液酸糖蛋白，如胰岛素和胰高血糖素激素，以及多种小分子药物。该装置还可提供通常由肝脏合成的蛋白质包括但不限于白蛋白，急性期反应物，和卸载的载体蛋白等。该装置可进一步优化以提高肝功能重建的能力。
[0029] 因此，肝细胞在各种肝病的移植治疗中，在用于辅助肝功能设备的制备中、在药物毒性筛选和新药研发中以及在肝病和肝炎研究等领域的需求巨大。由于原代肝细胞无法在体外长期培养并很快失去功能，且原代肝细胞的药物代谢能力表现出显著的个体间差异，因此无限量供应有功能的个性化肝细胞将极大促进药物开发以及生物人工肝和肝细胞移植的最终临床应用。
[0030] 而目前国内外尚无一种长期体外培养和扩增肝细胞的方法，尤其是一种能在体外将成熟肝实质细胞诱导成为具有无限增殖能力的肝细胞的方法。
发明内容
[0031] 本发明的目的在于提供一种长期体外培养和扩增肝细胞的方法，该方法也是一种原代肝实质细胞的培养、扩增、鉴定与应用方法，即在体外将成熟肝实质细胞诱导成为具有无限增殖能力的肝细胞。
[0032] 本发明的另一目的在于提供根据上述方法制备得到的肝细胞在化合物和药物的毒理学和药理学评价、肝炎病毒的研究和诊疗、肝细胞移植治疗、或制备生物人工肝等方面的应用。
[0033] 本发明的第一方面，是提供了一种长期体外培养和扩增肝细胞的方法，该方法在体外将肝实质细胞诱导成为具有无限增殖能力的肝细胞，包括以下步骤：
[0034] A、采用胶原蛋白I或Matrigel基质胶对培养支持物的预包被；
[0035] 胶原蛋白I(Collagen I)，较优的为，购自美国Invitrogen，货号A1048301；Matrigel基质胶，较优的为，购自Becton Dickinson Compary(BD)，货 号356234；
[0037] 所述的培养支持物是指培养皿或培养板等。
[0038] B、将肝实质细胞传入步骤A提供的经预包被的培养支持物上，在肝细胞增殖培养基中进行培养和扩增；
[0039] 所述的肝细胞增殖培养基是由基础培养基和添加的营养成份组成，所述的基础培养基包括Williams E、DMEM/F12等培养基；所述的添加的营养成分包括5％-10％(体积百分比)的血清(如人AB血清和胎牛血清，)、5％-10％的血清替代物(如KnockOut血清替代物)等。
[0040] 较优的，肝细胞增殖培养基中添加的营养成份还包括小分子物质，如成纤维细胞生长因子、Wnt信号通路的小分子激动剂和Rho相关蛋白激酶抑制剂；优选地，5-100 ng/ml的人成纤维细胞生长因子-2(FGF-2)，0.1-10μM的Wnt信号通路的小分子激动剂CHIR98014，0.1-5μM的Rho相关蛋白激酶抑制剂thiazovivin，0.1％-10％(体积百分比)的胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠混合补充液等。
[0041] 肝实质细胞贴壁后，细胞形态在3-5天发生改变，细胞拉长并可出现多个向外伸展的凸起，细胞核体积变大；5-7天细胞出现典型的上皮细胞形态并开始快速增殖；7-10天细胞可传代并持续增殖。
[0042] 所述的肝细胞传代采用Accutase(Invitrogen)，吸去培养基后按50μl/cm2加入Accutase，消化5-10分钟待细胞完全从培养板上成团脱落，加入含血清培养基重悬并离心(150G，5分钟)，细胞传代比例为1:2-1:4。
[0043] 所述的肝细胞可反复冻存和复苏，冻存和复苏方法同与普通细胞相同。
[0044] 所述原代肝实质细胞购自Invitrogen公司，也可通过文献方法自行制备(Maurel P.，Hepatocytes-Methods and Protocols，METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，ISSN 1064-3745)。
[0045] C、步骤B获得的增殖状态的肝细胞，转入肝细胞分化培养基中培养获得肝实质细胞。
[0046] 所述的肝细胞分化培养基由基础培养基和添加物组成，所述的基础培养基包括Williams E、DMEM/F12等培养基；所述的添加物包括5％-10％的血清(如人AB血清和胎牛血清)、5％-10％的血清替代物(如KnockOut血清替代物)、0.1％-10％(体积百分比)的胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠混合补充液等。
[0047] 所述的添加物还包括小分子物质，如1-100 ng/ml的人肝细胞生长因子(HGF)，0.1-100μM的地塞米松和1-100μM的人抑瘤素-M。
[0048] D、步骤C获得的肝细胞的标志物鉴定。
[0049] 基因表达：成熟肝细胞特征性转录因子如HNF4α，HNF6，Prox1；功能性基因如白蛋白(ALB)，α抗胰蛋白酶(AAT)，葡萄糖-6-磷酸酶(G6P)；药物代谢I相酶如CYP1A2，CYP2C9，CYP3A4；药物代谢II相酶如MGST1和UGT1A1；药物代谢III相转运子如NTCP，MRP2和OATP1B3。
[0050] 蛋白表达：流式细胞术检测白蛋白(ALB)，唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)。免疫荧光检测白蛋白(ALB)，α抗胰蛋白酶(AAT)，钙粘蛋白E(E-cadherin)，HNF4α等。
[0052] 生物功能：过碘酸雪夫(PAS)染色检测糖原贮积；BODIPY染色检测脂质合成；尿素生成采用试剂盒检测。
[0053] 解毒活性：P450-GloTM荧光素酶法检测CYP3A4，CYP1A2，CYP2C9的酶活性水平。
[0054] 所述的方法，其中所述肝实质细胞优选是哺乳动物细胞，更优选为小鼠、大鼠或人细胞，最优选人细胞。
[0055] 本发明的第二方面，是提供了根据上述方法制备得到的肝细胞，该肝细胞具有无限增殖能力。
[0056] 根据上述方法制备得到的肝细胞，通过体外连续传代30次以上鉴定证明其具有无限增殖能力。其优点为：①克服了以往无法在体外培养和扩增肝实质细胞的难题，为肝细胞的应用提供了无限的细胞来源；②所述的肝细胞可反复冻存和复苏，为细胞的存储、转运和使用提供了便利；③不同个体肝细胞具有较大的异质性，通过本发明的方法可建立由不同个体肝细胞组成的肝细胞库，为药物筛选和毒性检测提供更全面群体样本，也为肝细胞的个性化治疗建立了基础。
[0057] 所述的肝实质细胞，所述细胞分泌白蛋白，所分泌的白蛋白水平达到人原代成体肝实质细胞分泌白蛋白的水平，优选地，所述细胞还具有选自合成尿素、储存糖原、产生细胞色素P450酶，进行一相、二相代谢，三相转运中的一项或多项功能。
[0058] 本发明的第三方面，是提供所述的肝细胞在化合物和药物的毒理学和药理学评价、肝炎病毒的研究和诊疗、肝细胞移植治疗、制备生物人工肝等方面的应用。
[0059] 所述的肝细胞在制备生物人工肝脏中的应用(Struecker B,Raschzok N,Sauer IM.Liver support strategies:cutting-edge technologies.Nat Rev Gastroenterol Hepatol.2014 Mar；11(3):166-76.)。
[0060] 所述的肝细胞在药物代谢研究、药物的毒性测试或预防或治疗肝炎药物筛选中的应用，(Maurel P.，Hepatocytes-Methods and Protocols，METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，ISSN 1064-3745)
[0061] 在本发明的优选实施例中：
[0062] 步骤A中，所述的培养板预包被采用的胞外基质蛋白优选为Matrigel，将其按1:80稀释入4℃预冷的无血清培养基中，根据100μl/cm2计算所需包被液的体积，将其加入培养板中，37℃静置1小时，使用前吸去包被液，即可将细胞传入进行培养。
[0063] 步骤B中，所述的肝细胞增殖培养基为含有1-100ng/ml人成纤维细胞生长因子-2，0.1-10μM Wnt信号通路的小分子激动剂CHIR98014，0.1-5μM Rho相关蛋白激酶抑制剂thiazovivin和体积百分含量0.1-10％的胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠混合补充液的基础细胞培养基；其中，人成纤维细胞生长因子-2的含量优选为20ng/ml；Wnt信号通路的小分子激动剂CHIR98014的含量优选为1μM，Rho相关蛋白激酶抑制剂thiazovivin的含量优选为0.5μM，胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠混合补充液的含量优选为1％。
[0064] 步骤C中，所述的肝细胞分化培养基为含有1-100ng/ml人肝细胞生长因子，0.01-10μM地塞米松和1-100ng/ml人抑瘤素-M；其中人肝细胞生长因子的含量优选为10ng/ml，地塞米松的含量优选为0.1μM，人抑瘤素-M的含量优选为10ng/ml。
[0065] 上述肝细胞增殖培养基和肝细胞分化培养基的pH均可为培养哺乳动物细胞的常规pH，如pH7.2-7.6。
[0066] 所述基础细胞培养基可为MEM、DMEM、BME、DMEM/F12、RPMI1640、William E或Fischers培养基。
[0067] 所述方法中，人原代肝实质细胞在肝细胞增殖培养基中培养5-7天后可进入快速增殖状态，细胞倍增时间为16小时，细胞可在体外连续传代30次以上。
[0068] 所述方法中，还包括将增殖肝细胞传代的步骤，增殖肝细胞传代的方法为将细胞用Accutase消化液(美国Invitrogen公司)消化，然后采用肝细胞增殖培养基培养。
[0069] 由上述原代肝细胞增殖培养基和肝细胞分化培养基组成的用于原代肝实质细胞扩增和成熟的培养基也属于本发明的保护范围。
[0070] 术语
[0071] 如本文所用，除非另外说明，所述的“肝实质细胞”是指来自人肝组织新鲜分离或冻存的肝脏实质细胞。
[0072] 如本文所用，所述的“哺乳动物”是脊索动物门(Chordata)脊椎动物亚门(Vertebrata)哺乳纲(Mammalia)的动物。本发明所述的哺乳动物包括人，也包括非人哺乳动物。所述的非人哺乳动物例如是小鼠、大鼠、兔、狗、兔、猿猴、猪、牛、羊、马等等。不管是非人哺乳动物还是人，在基因组的组成、个体的发育、代谢方式、器官解剖、疾病发病机制等方面都非常接近。在进化过程中，一些关键的细胞功能或者调控通路在不同的物种之间是非常保守的。比如细胞增殖、凋亡的信号通路在哺乳动物中基本一致。细胞的衰老途径也是一个非常保守的调控机制。在本发明的一些实施方式中，以鼠作为模式生物，和人类相比，它无论在基因组的组成、个体的发育、代谢方式、器官解剖、疾病发病机制等都和人类非常接近；因此，本发明列举的一些适用于人的情况可以毫无疑义地适用于非人哺乳动物。
[0073] 如本文所用，所述的“细胞外基质蛋白”是指多细胞结构的胞外基底膜蛋白，主要发挥结构支持和功能调节的作用，包括但不仅限于Collagen，Fibronectin，Vitronectin，Vimentin，Gelatin，Matrigel(BD)，Geltrix(Invitrogen inc)，StemAdhere(Stemcell Technology)等。以Matrigel为例来说明，Matrigel是由BD公司从富含胞外基质蛋白混合物的EHS小鼠肿瘤中分离出BD Matrigel基底膜基质，其主要成分由层粘连蛋白，Ⅳ型胶原蛋白，巢蛋白，硫酸肝素糖蛋白等组成，还包含生长因子和基质金属蛋白酶等。BD Matrigel基底膜基质在室温条件下，聚合形成具有生物学活性的三维基质，模拟体内许多组织包括肝脏的细胞基底膜的结构、组成、物理特性和功能，有利于体外肝细胞的 培养和分化，以及对细胞形态和生化功能的维持。
[0074] 如本文所用，所述的“成熟肝细胞特性”包括但不仅限于一种或多种下列指标：1、表达一种或多种肝细胞标志物，包括葡萄糖6磷酸酶(G6PD)、白蛋白(Albumin)、α-抗胰蛋白酶(α-1-antitrypsin，AAT)、细胞角蛋白8(CK8)、细胞角蛋白18(CK18)、脱唾液酸糖蛋白受体(asialoglycoprotein receptor，ASGR)、乙醇脱氢酶1(alcohol dehydrogenase 1)、精氨酸酶I型(arginase Type I)、细胞色素氧化酶p4503A4(CYP3A4)、肝特异性有机阴离子转运蛋白(LST-1)或其中的组合；2、肝脏特异性酶活性，如G6PD和CYP3A4；胆汁或尿素的副产物；解毒功能等；3、肝细胞特征性的形态；4、细胞在免疫缺陷动物的肝脏中增殖，并重建肝脏功能。
[0075] 本发明的有益效果如下：
[0076] 本发明克服了以往无法在体外长期培养和扩增肝细胞的难题，实现了个体特异性肝细胞的无限量供应。本发明通过特定的培养条件，将贴壁的肝实质细胞诱导成为具有无限增殖能力的肝细胞。通过改变培养条件，所述细胞可在体外重新分化为有功能的成熟肝实质细胞，分泌较高含量的白蛋白，并具有合成尿素、储存糖原、产生细胞色素P450酶，进行一相、二相代谢，三相转运等功能。附图说明
[0077] 图1为原代肝细胞培养和扩增过程中的形态；其中A为培养24小时，B为培养6天，C为培养2周。
[0078] 图2为分化成熟过程中的肝细胞形态；其中A为原代肝细胞对照，B为肝细胞分化培养5天，箭头所示为双核肝细胞。
[0079] 图3为RT-PCR(逆转录PCR)检测经培养扩增并分化成熟的肝细胞和新鲜分离的原代肝实质细胞一相、二相代谢和三相转运基因的表达，RT表示逆转录。
[0080] 图4为免疫荧光检测经培养扩增并分化成熟的肝细胞白蛋白(A)和E-钙粘蛋白(B)的表达。
[0081] 图5为流式细胞检测经培养扩增并分化成熟的肝细胞白蛋白(A),CYP3A4(B)和α抗胰蛋白酶(C)的表达。
[0082] 图6为BODIPY染色检测经培养扩增并分化成熟的肝细胞和新鲜分离的原代肝实质细胞中的脂滴水平；其中A为原代肝细胞对照，B为肝细胞分化培养5天。
[0083] 图7为PAS糖原染色检测经培养扩增并分化成熟的肝细胞中的糖原储存水平。
[0084] 图8为LDL-DyLight-549摄入试验检测经培养扩增并分化成熟的肝细胞对低密度脂蛋白的摄取能力；其中A为明场下肝细胞形态，B为对应细胞摄入LDL-DyLight-549后的荧光照片。
[0085] 图9为典型药物对上述细胞细胞色素P450酶CYP3A4和CYP1A2基因表达水平的的诱导；其中A为地塞米松，B为奥美拉唑。
[0086] 图10为酮康唑对上述细胞细胞色素P450酶CYP3A4的抑制作用。
[0087] 图11为ELISA检测经培养扩增并分化成熟的肝细胞和新鲜分离的原代肝实质细胞白蛋白的分泌水平。
[0088] 图12为检测上述细胞移植两周后的小鼠血清中人白蛋白含量。
[0089] 图13为采用实施例2方法培养和分化的肝细胞形态；其中A为增殖形态的肝细胞，B为分化形态的肝细胞。
具体实施方式
[0090] 下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则所有的百分比和份数按重量计。
[0091] 下述实施例中如无特殊说明所用方法均为常规方法，所用试剂均可从商业途径获得。其中，肝细胞基础培养基DMEM/F12(美国Invitrogen公司，11320-033)，William's E(美国Invitrogen公司，A12176-01)，人成纤维细胞生长因子-2(FGF2，美国Humanzyme公司，HZ-1287)，人肝细胞生长因子(HGF，美国Humanzyme公司，HZ-1083)，人表皮细胞生长因子(HGF，美国Peprotech公司，AF-100-15)人抑瘤素-M(Oncostatin M，美国Peprotech公司，300-
10)，地塞米松(Dexamethasone，美国Sigma-Aldrich公司，D8893)，CHIR-98014(美国Selleck公司，S2745)，thiazovivin(美国Selleck公司，S1459)，Collagen I(美国Invitrogen公司，A1048301)，Matrigel基质胶(美国BD公司，356234)。
10)，地塞米松(Dexamethasone，美国Sigma-Aldrich公司，D8893)，CHIR-98014(美国Selleck公司，S2745)，thiazovivin(美国Selleck公司，S1459)，Collagen I(美国Invitrogen公司，A1048301)，Matrigel基质胶(美国BD公司，356234)。
[0092] 实施例1：
[0093] 一、原代肝细胞的长期培养和扩增
[0094] 1.细胞培养板的预包被。
[0095] Collagen I具体包被方法如下：整个包被过程均在冰上操作，以24孔板包被为例将胶原蛋白产品(5mg/ml)溶液置于冰上备用；取15ml的离心管置于冰上，加入预冷的基础培养基，如：DMEM 10ml；取100ul的胶原蛋白产品(5mg/ml)加入到上述10ml的DMEM中，混匀；此溶液配制浓度为0.05mg/ml；将上述制备好的胶原溶液加到对应的孔板中，24孔板每孔加
300μL；将培养板置于超净台上，轻柔晃动，使胶原溶液覆盖整个孔的底面静置。将孔板放于培养箱中，放置过夜；取出培养板，去除上清，每孔加500μL基础培养基清洗两次，开盖自然晾干(或过夜干燥)。封口膜包装好，4℃保存。使用时，取出已经包被好的培养板，每孔加500μL细胞完全培养基，置于CO2培养箱中平衡15 min；吸弃培养基，加入一定量细胞悬液，置于培养箱中贴壁培养，定时观察贴壁情况。
300μL；将培养板置于超净台上，轻柔晃动，使胶原溶液覆盖整个孔的底面静置。将孔板放于培养箱中，放置过夜；取出培养板，去除上清，每孔加500μL基础培养基清洗两次，开盖自然晾干(或过夜干燥)。封口膜包装好，4℃保存。使用时，取出已经包被好的培养板，每孔加500μL细胞完全培养基，置于CO2培养箱中平衡15 min；吸弃培养基，加入一定量细胞悬液，置于培养箱中贴壁培养，定时观察贴壁情况。
[0096] 2.人原代肝实质细胞的分离。
[0097] 采用胶原酶两步灌注法分离新鲜人原代肝实质细胞，(Maurel P.，Hepatocytes-Methods and Protocols，METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，ISSN 1064-3745)。
[0098] 具体方法如下：首先采用PBS在蠕动泵提供的压力下，利用肝脏表面暴露的官腔连续冲洗新鲜肝脏组织10分钟，随后将PBS更换为无钙镁离子的Hanks液灌注肝组织10分钟，然后采用加入质量体积比1％的BSA和质量体积比0.1％的四型胶原酶(美国Sigma公司)灌注30分钟。采用胶棒将肝细胞从肝组织中轻轻分离出来，500g离心1分钟并重复3次，沉淀细胞则为原代分离的肝实质细胞。
[0099] 3.原代肝实质细胞的培养和扩增。
[0100] 将分离的新鲜人肝实质细胞传入包被好的细胞培养板中，加入肝细胞增殖培养基。肝细胞培养基为在基础细胞培养基DMEM/F12中加入胰岛素‐转铁蛋白‐亚硒酸钠混合补充液，GlutaMAX，非必须氨基酸，β-巯基乙醇，人成纤维细胞生长因子-2，Wnt信号通路的小分子激动剂CHIR98014，Rho相关蛋白激酶抑制剂thiazovivin。肝细胞增殖培养基中，胰岛素‐转铁蛋白‐亚硒酸钠混合补充液终浓度为1％(体积百分含量)；人成纤维细胞生长因子-2的终浓度20ng/ml；Wnt信号通路的小分子激动剂CHIR98014的终浓度为1μM；Rho相关 蛋白激酶抑制剂thiazovivin的终浓度为0.5μM；β-巯基乙醇的终浓度为0.1mM；非必需氨基酸的终浓度为1％(体积百分含量)；GlutaMAX的终浓度为1％(体积百分含量)。细胞培养过程中每3天更换新鲜的肝细胞增殖培养基。细胞传代的方法为将细胞用Accutase消化液(美国Invitrogen公司)消化，按1:3传代，用肝细胞增殖培养基培养。
[0101] 二、肝细胞的分化成熟及细胞性质的鉴定
[0102] 1.肝细胞的分化和成熟。
[0103] 肝细胞生长至90％汇合率时，加入肝细胞分化培养基培养9-13天，每天更换新鲜肝细胞分化培养基。肝细胞分化培养基为在基础细胞培养基DMEM/F12中加入胰岛素‐转铁蛋白‐亚硒酸钠混合补充液，GlutaMAX，非必须氨基酸，β-巯基乙醇，地塞米松和人抑瘤素-M；肝细胞分化培养基中，胰岛素‐转铁蛋白‐亚硒酸钠混合补充液的终浓度为1％(体积百分含量)，GlutaMAX的终浓度为1％(体积百分含量)，地塞米松的终浓度为0.1μM，人抑瘤素-M的终浓度为10ng/ml，细胞在分化培养基中培养3-5天出现肝实质细胞形态(见图2)。
[0104] 2.肝细胞标志物和功能鉴定。
[0105] 将本发明培养扩增的肝细胞和分化成熟的肝细胞分别进行基因表达和功能鉴定，具体方法和结果如下：
[0106] 1)RT-PCR：采用上海飞捷生物RNAfast200试剂盒(货号220010)抽提上述细胞RNA，TM采用SuperScript II RNase H-反转录酶(Invitorgen，18064014)将RNA反转录为cDNA，采用表一中的引物通过PCR技术扩增肝细胞相关基因，进行凝胶电泳，鉴定结果见图3，通过本专利方法培养和扩增的肝细胞，经体外分化后，可表达与肝实质细胞功能密切相关的基因，其表达水平与原代肝实质细胞接近。
[0107] 2)免疫荧光：上述细胞经4％多聚甲醛室温固定10分钟，用0.2％Triton100穿膜10分钟，用1％BSA室温封闭1小时，加入一抗4℃孵育过夜，PBS洗三次，加入二抗室温孵育1小时，PBS洗涤三次后倒置显微镜观察成像，鉴定结果见图4，反映肝实质细胞功能的白蛋白和上皮细胞特性的E-钙粘蛋白均可被检测到。
[0108] 3)流式细胞术：采用eBioscience流式细胞染色试剂盒，根据试剂盒说明书检测上述细胞中白蛋白，CYP3A4和α抗胰蛋白酶的表达水平，检测 结果见图5，上述三种反映肝实质细胞功能的蛋白在大多数经分化的肝细胞中表达，进一步证明本专利方法获得的肝细胞具有较高的纯度和功能。
[0109] 4)BODIPY染色：采用Invitrogen公司生产的BODIPY检测上述细胞内脂滴水平，检测结果见图6，和原代肝实质细胞相比，经体外培养和分化的肝细胞也具有合成脂滴的能力。
[0110] 5)糖原PAS染色：采用南京建成公司生产的糖原染色试剂盒，根据试剂盒说明书检测上述细胞糖原合成和存储水平，检测结果见图7，经体外培养和分化的肝细胞具有较强的糖原合成能力，反映其具有肝实质细胞的特有功能。
[0111] 6)LDL摄入试验：采用Abcam公司生产的低密度脂蛋白(LDL)摄取试剂盒(ab133127)，根据试剂盒说明书检测上述细胞对LDL的摄取能力，检测结果见图8，经体外培养和分化的肝细胞具有摄取LDL的能力，反映其具有肝实质细胞的特有功能。
[0112] 7)细胞色素氧化酶诱导：采用100μM地塞米松和10μM分别处理上述经培养扩增并分化成熟的肝细胞，采用上述采用上海飞捷生物RNAfast200试剂盒(货号220010)抽提上述细胞RNA，采用SuperScriptTMII RNase H-反转录酶(Invitorgen，18064014)将RNA反转录为cDNA，采用表一中的引物通过实时定量PCR技术检测细胞色素氧化酶CYP3A4和CYP1A2的表达水平变化。检测结果见图9，已知临床常用的一些药物如地塞米松和奥美拉唑均在肝脏经特定的细胞色素氧化酶(CYP)进行转化和代谢，图9A显示地塞米松可显著诱导细胞CYP3A4转录水平升高，而CYP1A2则可被奥美拉唑显著诱导表达。
[0113] 8)细胞色素氧化酶抑制实验采用Promega公司生产的CYP3A4P450-GLOTM(V9001)试剂盒，根据试剂盒说明书检测CYP3A4的特异抑制剂酮康唑对CYP3A4活性的抑制作用，检测结果见图10，CYP3A4活性可被酮康唑显著抑制，以上结果证实，本专利培养扩增的肝细胞，经体外分化后具有典型的肝实质细胞CYP活性。
[0114] 9)ELISA：采用Bethyl公司生产的人白蛋白ELISA试剂盒检测上述细胞培养上清中的白蛋白含量，检测结果见图11，和原代肝实质细胞相比，经体外培养和分化的肝细胞具有较强的白蛋白合成能力，反映其具有 肝实质细胞的特有功能。
[0115] 10)细胞移植和血清人白蛋白检测：将上述经培养扩增并分化成熟的肝细胞2×106细胞通过注射入uPA/il2R-/-/Rag2-/-小鼠脾脏中，两周后抽血，采用Bethyl公司生产的人白蛋白ELISA试剂盒，根据试剂盒提供的说明书检测小鼠血清中人白蛋白水平，检测结果见图12，在移植两周左右可在小鼠体内检测到人白蛋白，提示移植的肝细胞已成功定植入受体小鼠的肝脏中。
[0116] 实施例2：
[0117] 1.细胞培养板的预包被。
[0118] 采用Matrigel进行包被，将冷冻保存的Matrigel放置4℃过夜，使其成为液态，用预冷的无血清培养基(如DMEM)按1:80稀释，加入培养孔中，以覆盖底面为宜，放置37℃一小时后即可使用。
[0119] 2.人原代肝实质细胞的分离同实施例1。
[0120] 3.原代肝实质细胞的培养和扩增。
[0121] 在上述肝细胞增殖培养基中人成纤维细胞生长因子-2的终浓度50ng/ml；Wnt信号通路的小分子激动剂CHIR98014的终浓度为3μM；Rho相关蛋白激酶抑制剂thiazovivin的终浓度为1μM，其余同实施例1.
[0122] 4.肝细胞的分化成熟及细胞性质的鉴定同实施例1，鉴定结果与实施例1一致。
[0123] 5.肝细胞增殖和分化情况见图13，采用实施例2的方法获得了与实施例1方法相同的效果，细胞增殖和分化形态与实施例1方法所获得的细胞相同。
[0124] 以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。
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