用于治疗恶性肿瘤的免疫活性血液灌注过滤器
阅读：449发布：2021-06-09
专利汇可以提供用于治疗恶性肿瘤的免疫活性血液灌注过滤器专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供了通过使人在大约1小时内经历使用了 生物 不相容的 生物材料 的单采过程来在人中产生天然免疫活性状态的方式。为了安全地控制由所述过程诱导的免疫休克，使人处于全身麻醉下达大约6小时，包括单采时间内以及其后的至少额外的5小时。这种免疫活化可用于 治疗 恶性 肿瘤 以及与免疫抑制相关的 疾病 ，例如AIDS。此外，本发明提供了包含血液灌注 过滤器 的单采柱用于治疗恶性肿瘤和传染病的用途，其中所述的过滤器具有生物不相容的材料。，下面是用于治疗恶性肿瘤的免疫活性血液灌注过滤器专利的具体信息内容。
1.一种治疗患者疾病的方法，包括：
(a)提供包含血液灌注过滤器的单采系统，其中所述的血液灌注过滤器包含至少一种生物不相容的材料；
(b)将所述的患者的血液循环与所述的单采系统连接，使得所述的患者的血液在再次进入到所述的患者的肌体中之前通过所述的血液灌注过滤器；
(c)使所述的患者处于全身麻醉下，并向所述的患者提供生理学支持；
(d)在大约1小时内，使所述的患者的血液通过所述的单采系统；以及
(e)在使所述的患者的血液循环通过所述的单采系统之后，使所述的患者在全身麻醉下保持至少5小时，
其中使所述的患者的血液循环通过所述的血液灌注过滤器会活化所述的患者的免疫系统，从而治疗所述的疾病。
2.权利要求1所述的方法，其中所述的疾病为恶性肿瘤。
3.权利要求1所述的方法，其中所述的疾病为传染病。
4.权利要求3所述的方法，其中所述的传染病为获得性免疫缺陷综合症(AIDS)或肝炎。
5.权利要求1所述的方法，其中所述的单采系统进一步包含空气室和/或保温袋。
6.权利要求1所述的方法，其中所述的生物不相容的材料为棉花或丝。
7.权利要求6所述的方法，其中所述的棉花选自埃及棉花、澳大利亚棉花和巴基斯坦棉花。
8.权利要求6所述的方法，其中所述的丝选自日本丝和广州丝。
9.权利要求1所述的方法，其中所述的生物不相容的材料是生物化的。
10.权利要求9所述的方法，其中所述的生物不相容的材料是使用甲醛或戊二醛生物化的。
11.权利要求1所述的方法，其中所述的患者为人类患者。
12.权利要求1所述的方法，其中所述的患者为非人类的动物。
13.权利要求1所述的方法，其中所述的全身麻醉为克他命。
14.权利要求1所述的方法，其中所述的生理学支持选自维持血压和维持血气水平中的至少一者。
15.权利要求1所述的方法，进一步包括在使所述的患者的血液循环通过所述的单采系统之前向所述的患者给予抗凝血剂的步骤。
16.权利要求15所述的方法，其中所述的抗凝血剂为肝素。
17.权利要求1所述的方法，其中所述的患者的血液以大约100至200ml/分钟的速度循环通过所述的单采系统。
18.一种包含血液灌注过滤器的单采系统以及全身麻醉的用途，在所述的单采系统中，所述的血液灌注过滤器包含至少一种生物不相容的材料，
(a)其中所述的单采系统与患者的血液循环连接，使得所述的患者的血液能够在再次进入到所述的患者的肌体之前通过所述的血液灌注过滤器；以及
(b)其中所述的全身麻醉用于在使用所述的单采系统以及在使用所述的单采系统之后的至少5小时过程中麻醉所述的患者，以用于治疗患者的疾病，其中使用所述的单采系统会活化所述的患者的免疫系统，由此治疗所述的疾病。
用于治疗恶性肿瘤的免疫活性血液灌注过滤器
[0001] 相关申请的交叉引用
背景技术
[0003] 在免疫抑制的患者中可以发展为恶性肿瘤。每天在肌体内都产生大量的恶性肿瘤细胞。幸运的是，免疫系统将它们识别为“非正常的”或“非自身的”细胞，并随后每天都杀死它们。因此，如果免疫系统适当地发挥作用，则发展成癌症的机会将被降低。
[0004] 免疫系统可以通过疫苗来活化。但是，当使用疫苗时，通过患者自身的免疫系统对癌细胞所产生的攻击是不足够强的。需要更有效且更强的免疫挑战能够杀死恶性肿瘤细胞，其中所述的恶性肿瘤细胞是患者免疫系统不能作为待杀死的细胞识别的。结果，治疗恶性肿瘤不仅涉及手术除去肿瘤的原发性病灶，而且还涉及用于杀死整个肌体的可能的转移性肿瘤细胞的药剂和放射治疗。不幸的是，抗癌药剂疗法会引入多种类型的不合意的副作用，这些副作用通常在取得有效的治疗结果之前必然会干扰药剂疗法。
[0005] 过去，已经使用用于抑制患者免疫系统的单采疗法来治疗自身免疫疾病。对于这些类型的患者而言，除去会导致自身免疫疾病的血液中的病理学分子证明了治疗效果。对于这些类型的患者而言，通过单采以及细胞因子(例如白细胞)来除去体液因子，例如自身抗体、免疫络合物、细胞因子和活化的补体。这种类型的疗法在患者中创建了免疫抑制的状态，这种状态对需要治疗癌症患者的免疫系统确实具有相反的作用。
[0006] 发明概述
[0007] 本发明提供了通过使用在单采柱中存在的体外血液灌注过滤器来强烈地活化人的免疫系统的方式。所得到的免疫活化使得通过细胞凋亡来破坏恶性肿瘤细胞。但是，本发明的方法导致对人产生大量的生理学影响，包括短暂的低血压以及组织缺氧。为了控制这些影响，在全身麻醉的条件下对人进行体外单采。全身麻醉以及仔细地监测血压和氧饱和度消除了与上述过程有关的任何不适。全身麻醉不仅在单采的过程中实施，而且在6小时的体内免疫活化调控中实施。
[0008] 可以使用具有生物不相容的材料的灌注过滤器来引入免疫刺激。使患者的血液以大约100ml/分钟的速度在1小时内灌注通过包含所述过滤器的单采柱可以产生所述的状态。本发明的方法可以在体外循环的最初30分钟过程中产生免疫活化。这种通过免疫活化治疗恶性肿瘤的分子手术过程会在最开始的30分钟内产生直接且可控的作用，并在几个小时内恢复至正常。这些作用包括血压过低(血压减少大约50％)、白细胞减少(白细胞减少大约70％)、以及呼吸困难，其中所述的呼吸困难会导致组织缺氧，并在所述过程开始后的30分钟形成最低的血氧水平。
[0009] 这些作用可以通过减少通过单采柱的血流量以及通过向人提供生理学支持而可逆。所述的支持包括使用了气管内插管的全身麻醉、血压控制(连续地监测血压)以及供氧控制(连续地监测血氧饱和度)。
[0010] 由于免疫活化单采系统诱导的短暂性休克综合征，所以过去未提供或使用特定的免疫活化柱。美国食品药品监督管理局(United States Food and Drug Administration)由于这种单采系统相关的休克症状，而将它们归类为临床不安全的。本发明的方法通过提供有效地活化免疫系统，同时控制与使用根据本发明的血液灌注过滤器相伴的休克症状而克服了所述的问题。
[0011] 由在本发明的血液灌注过滤器中存在的生物不相容的材料诱导的可控的免疫休克在试验动物中产生了免疫活化状况。为了提供安全、无痛、有效以及可重复的治疗结果，不仅在一小时的单采过程中提供使用了气管内插管的全身麻醉，而且在另外的5个小时中也使用所述的全身麻醉。在动物试验中没有使用了这种过程治疗的动物发生死亡，也没有任何与所述过程相关的身体或感觉上的异常被证明。
[0012] 提供大约6小时的全身麻醉不仅包括初始30分钟的休克的血压过低和含氧量低的阶段，而且还包括恢复阶段，其中动物在血流动力学上变正常。6小时之后，在肺部累积的白细胞被释放回系统性的循环中。在单采的初始阶段，粒细胞几乎减少100％而淋巴细胞仅减少40-50％，这在人免疫系统中创立了短暂的淋巴细胞占优势的状态。在全身麻醉的6小时过程中，免疫刺激细胞因子TNF-α和IL-6可以升高至1000倍。在6小时后，血液中的白细胞计数几乎恢复至过程前的水平，并且后来进一步升高。在4天后，与过程前的水平相比，白细胞计数超过2倍。细胞和体液的活化则在2星期后正常化。
[0015] 图1提供了作为本发明的单采方法的结果在所述的患者中形成的免疫活性作用的示意图。不仅体液因子被活化，细胞因子也被活化。
[0017] 图3提供了通过使用本发明的免疫活性过滤器的单采而诱导的生理学影响的示意图，包括白细胞被短暂地诱捕在肺毛细血管中。
[0019] 图5A提供了根据本发明的单采柱的一个实例的示意图。图5B为所述柱的实施方案的照片。
[0020] 图6示出了使用以下生物不相容的材料在一定的时间内，单采对补体活化的作用：聚乙烯(PE)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚乙烯醇(PVA)和醋酸纤维素(CA)，其中所述的补体活化的作用是通过在入口血液和出口血液的因子C3a测量得到的。
[0021] 图7提供了小型血液过滤器柱的示意图，包括注射器和生物不相容的材料。
[0022] 图8示出了使用酸和碱、或者盐处理的埃及棉花对在过滤通过经处理的棉花后血液中某种类型的细胞的计数的作用：(A)红细胞(RBC)、(B)白细胞(WBC)、(C)血小板(Plt)、以及(D)嗜中性粒细胞和淋巴细胞。“前”样品是指在过滤之前由血液样品中取得的4
细胞计数。对于RBC而言，Y轴测量了每微升过滤的血液的细胞数x10。对于WBC而言，Y轴测量了每微升过滤的血液的细胞数。对于Plt而言，Y轴测量了每微升过滤的血液的细
4
胞数x10。对于嗜中性粒细胞和淋巴细胞而言，Y轴测量了每微升过滤的血液的细胞数。
细胞计数。对于RBC而言，Y轴测量了每微升过滤的血液的细胞数x10。对于WBC而言，Y轴测量了每微升过滤的血液的细胞数。对于Plt而言，Y轴测量了每微升过滤的血液的细
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胞数x10。对于嗜中性粒细胞和淋巴细胞而言，Y轴测量了每微升过滤的血液的细胞数。
[0023] 图9示出了不同类型的棉花过滤器和PVA过滤器的能力之间的比较，其中所述的过滤器用于除去全血中的某些类型的细胞：A)RBC、(B)WBC、(C)Plt、以及(D)嗜中性粒细胞和淋巴细胞。“前”样品是指在过滤之前由血液样品中取得的细胞计数。对于RBC而言，Y4
轴测量了每微升过滤的血液的细胞数x10。对于WBC而言，Y轴测量了每微升过滤的血液
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的细胞数。对于Plt而言，Y轴测量了每微升过滤的血液的细胞数x10。对于嗜中性粒细胞和淋巴细胞而言，Y轴测量了每微升过滤的血液的细胞数。
轴测量了每微升过滤的血液的细胞数x10。对于WBC而言，Y轴测量了每微升过滤的血液
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的细胞数。对于Plt而言，Y轴测量了每微升过滤的血液的细胞数x10。对于嗜中性粒细胞和淋巴细胞而言，Y轴测量了每微升过滤的血液的细胞数。
[0024] 图10示出了不同类型的棉花过滤器的能力之间的比较，其中所述的过滤器用于除去全血中的嗜中性粒细胞和淋巴细胞。
[0025] 图11示出了当埃及棉花过滤器的密度为0.125g/ml时，其由不同体积的全血中除去某些类型的细胞的能力：A)RBC、(B)WBC、(C)Plt、以及(D)嗜中性粒细胞和淋巴细胞。“前”样品是指在过滤之前由血液样品中取得的细胞计数。各图中的Y轴测量了每微升过滤
4
的血液的细胞数。RBC和Plt测量为细胞数x10/μl。WBC和嗜中性粒细胞/淋巴细胞测量为细胞数/μl。
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的血液的细胞数。RBC和Plt测量为细胞数x10/μl。WBC和嗜中性粒细胞/淋巴细胞测量为细胞数/μl。
[0026] 图12示出了当埃及棉花过滤器的密度为0.05g/ml时，其由不同体积的全血中除去某些类型的细胞的能力：A)RBC、(B)WBC、(C)Plt、以及(D)嗜中性粒细胞和淋巴细胞。“前”样品是指在过滤之前由血液样品中取得的细胞计数。各图中的Y轴测量了每微升过滤
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的血液的细胞数。RBC和Plt测量为细胞数x10/μl。WBC和嗜中性粒细胞/淋巴细胞测量为细胞数/μl。
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的血液的细胞数。RBC和Plt测量为细胞数x10/μl。WBC和嗜中性粒细胞/淋巴细胞测量为细胞数/μl。
[0027] 图13示出了埃及棉花过滤器的密度对它们由不同体积的全血中除去某些类型的细胞的能力的作用：A)RBC、(B)WBC、(C)Plt、以及(D)嗜中性粒细胞和淋巴细胞。“前”样品是指在过滤之前由血液样品中取得的细胞计数。
[0028] 图14示出了生物化对埃及棉花过滤器由全血中除去(A)RBC和(B)WBC的能力的作用。使用浓度为1％、0.1％和0％的凝胶进行生物化。对于0％样品而言，仅使用戊二醛。使用水处理非生物化的样品。“前”样品是指在过滤之前由血液样品中取得的细胞计数。
[0029] 图15示出了生物化对埃及棉花过滤器由全血中除去(A)Plt、以及(B)嗜中性粒细胞和淋巴细胞的能力的作用。使用浓度为1％、0.1％和0％的凝胶进行生物化。对于0％样品而言，仅使用戊二醛。使用水处理非生物化的样品。“前”样品是指在过滤之前由血液样品中取得的细胞计数。
[0030] 图16示出了生物化对丝质过滤器由全血中除去(A)RBC和(B)WBC的能力的作用。使用浓度为1％、0.1％和0％的凝胶进行生物化。对于0％样品而言，仅使用戊二醛。使用水处理非生物化的样品。“前”样品是指在过滤之前由血液样品中取得的细胞计数。
[0031] 图17示出了生物化对丝质过滤器由全血中除去(A)Plt、以及(B)嗜中性粒细胞和淋巴细胞的能力的作用。使用浓度为1％、0.1％和0％的凝胶进行生物化。对于0％样品而言，仅使用戊二醛。使用水处理非生物化的样品。“前”样品是指在过滤之前由血液样品中取得的细胞计数。
[0033] 图19示出了使用强离子束辐射的生物化对埃及棉花过滤器由全血中除去(A)RBC、(B)WBC、(C)Plt以及(D)嗜中性粒细胞和淋巴细胞的能力的作用。
[0034] 图20示出了血液在灌注前和灌注后的白细胞的分析。(A)嗜中性粒细胞和(B)淋巴细胞。
[0035] 图21示出了根据本发明的一个实施方案在经历6小时的灌注时，狗的血压和体温。
[0036] 图22示出了根据本发明的一个实施方案在灌注过程中和灌注后，狗中的WBC、RBC、Plt和纤维蛋白原的水平。
[0037] 图23示出了根据本发明的一个实施方案在灌注过程中和灌注后，狗中的淋巴细胞、嗜中性粒细胞和单核细胞恢复的动力学。Y轴测量了在各时间点时在全血中存在的各种类型的细胞的数量。
[0038] 图24示出了根据本发明的一个实施方案在灌注过程中和灌注后，狗中的淋巴细胞、嗜中性粒细胞和单核细胞恢复的动力学。Y轴是指在各时间点时，在狗的全血中，作为全细胞的百分率存在的各种类型的细胞。
[0039] 图25示出了根据本发明的一个实施方案在灌注过程中和灌注后，在狗的血液中肿瘤坏疽因子α(TNFα)和白细胞介素6(IL-6)的水平。Y轴测量了每微升中以皮克存在的细胞因子的量，而X轴表示在灌注开始后的分钟。
[0040] 图26示出了在通过本发明的方法处理后，在单采受体的血液中白细胞动力学的图。X轴示出了相对于从单采开始时经过的时间的量的各个阶段。Y轴示出了白细胞计数的相关单位，其中1.0构成了在单采开始时，在血液中的白细胞的水平。
[0041] 发明详述
[0042] 如上文所述，每天在人的肌体内产生大量的恶性肿瘤细胞。幸运的是，每天，免疫系统将所述的细胞识别为异常细胞并杀死它们。如果免疫系统适当地发挥作用，则发展成癌症的机会将被降低。不幸的是，如果人的免疫系统被抑制，则癌细胞被识别为待杀死的外来细胞。在这种情况下，癌细胞只有被留在未检查的宿主中正在生长的恶性肿瘤中。
[0043] 为了研发用于恶性肿瘤的治疗处理，本发明提供了产生患者的免疫活性状态的安全、有效和可重复的方法。在一个实施方案中，患者为人类患者。在另一个实施方案中，患者为非人类的动物，在这种情况下，可以在动物背景下使用本发明。非人类的动物包括但不限于猫、狗、牛和马。目前，可以通过血液纯化(单采)来抑制患者的免疫状态。使得人的免疫系统的状态保持为活性状态的血浆因子和/或细胞因子的除去可以通过单采进行。参见Nosé 1995。引入这种血液纯化方法以用于治疗自身免疫疾病的患者。过去，引入单采过程来治疗诸如类风湿性关节炎或溃疡性大肠炎之类的自身免疫疾病。相反地，尝试除去导致癌症患者的免疫抑制的许多分子和细胞因子，但是这种单采的治疗作用对于恶性肿瘤患者而言不会显示任何积极的结果。参见Tani 1998。
[0044] 事实上，如表1所示，用于治疗恶性肿瘤的有效的疗法涉及活化免疫系统，而不是抑制免疫系统。因此，免疫抑制单采技术在治疗恶性肿瘤中没有成功。当人是健康的并且具有正常的免疫系统时，癌细胞被杀死，并且肿瘤不能形成。当免疫系统被抑制时，癌细胞在肌体中会获得复制的机会，从而导致人的癌症。当人的免疫系统受到长期的过度刺激时，则可以导致自身免疫疾病。因此，在癌症的情况下，成功的疗法涉及刺激受到抑制的免疫系统。
[0045] 表1
[0046]
[0047] 根据上文的逻辑，治疗恶性肿瘤涉及增强人的免疫功能是其达到正常的水平。结果，经治疗的人的肌体再次获得了识别癌细胞为乙醇细胞的能力，并且恶性细胞被人的正常化的免疫系统杀死。这种免疫功能的增强可以用于治疗与免疫抑制有关的任何疾病，包括癌症和传染病，例如细菌、真菌或病毒感染。在一个实施方案中，癌症在肌体中表现为一种或多种实体肿瘤。在另一个实施方案中，癌症并非表现为实体肿瘤，例如在白血病的情况下。在一个实施方案中，病毒感染可以为人类免疫缺陷病毒感染(HIV)，或肝炎病毒感染，例如A型肝炎病毒(HAV)、B型肝炎病毒(HBV)或C型肝炎病毒(HCV)。
[0048] 本发明提供了通过使用单采技术来活化患者的受抑制的免疫状态的治疗方法。使用Bacille Calmette Guerin(BCG)疫苗来提供针对肺结核细菌的免疫活化(Grange
2009)。不幸的是，BCG的作用极小。本发明提供了更有效地刺激患者的免疫功能的方法，使得其更有效地用于治疗与免疫抑制或感染疾病有关的疾病。
2009)。不幸的是，BCG的作用极小。本发明提供了更有效地刺激患者的免疫功能的方法，使得其更有效地用于治疗与免疫抑制或感染疾病有关的疾病。
[0049] 本发明的单采技术使用了包含生物不相容的材料的血液灌注过滤器。如本文所用，“生物不相容的材料”是指引发肌体的反应的材料，而不管是免疫反应还是生理学反应，例如直接(例如引入到肌体中)或间接(例如通过体外循环)暴露于肌体而形成的抗体。针对自身免疫疾病的治疗，已经研发了基于膜的血液纯化系统。参见Nosé 2000。对于这些血液纯化单采系统而言，尽管该系统除去了与自身免疫疾病相关的细胞和分子因子，但是本领域的该系统使用了这样的过滤器，该过滤器由血液相容性材料制备，从而避免了患者的免疫系统被活化。
[0050] 在其中生物不相容的单采过滤器产生免疫活化的情况下，患者必须遭受许多副作用，包括血压过低、呼吸困难、恶心、呕吐、出汗过度、寒冷以及颤抖。如本文所用，“免疫活化”或“免疫系统的活化”是指免疫系统的细胞(例如淋巴细胞)的数量和/或功能的增加，和/或与B细胞和抗体生产以及细胞因子生成相关的免疫系统的体液功能的增加。在一个实施方案中，此类细胞因子的生成可以为TNF-α和/或IL-6的生产。根据这些副作用，政府机关，包括美国FDA和日本卫生和福利部，禁止临床应用此类单采过滤器。因此，用于引入用于治疗恶性肿瘤的有效的免疫活化的此类生物不相容单采过滤器未经临床批准。
[0051] 本发明提供了通过在单采技术中使用生物不相容的材料来活化患者受到抑制的免疫状态的方法。尽管诸如血压过低和组织缺氧之类的副作用在所述技术的过程中可能发生，但是本发明提供了以安全和受控的方式活化免疫系统的方式。如上文所述，除了单采，诸如BCG疫苗之类的技术已经用于提供针对肺结核细菌的免疫活化(Grange 2009)。不幸的是，BCG的作用极小。本发明提供了刺激患者的免疫功能从而使其更有效地用于治疗与免疫抑制或传染病有关的疾病的更有效的方法。
[0052] 其他团队使用醋酸纤维素来刺激癌症患者的免疫系统(Yonekawa 1997)。Dr.Yonekawa使用了柱式醋酸纤维素珠(Japanese Antibody Research Institute)来用于癌症的治疗(Yonekawa 1992)。在9名患者里的8名患者，诸如疼痛和疲劳之类的主管症状得到改善。但是，这种柱式醋酸纤维素珠的过滤器的效力需要进行大量的处理，甚至不能产生清楚的结果。更加生物不相容的过滤器需要更强的免疫活化以用于更有效地治疗癌症患者。
[0053] 另一团队使用了Immugard R(Terumo Co.，Japan)和ASAHI Kasei Medical Co.，Ltd的Cellsorba柱，来治疗溃疡性大肠炎。与ASAHI过滤器相比，Terumo过滤器显示出用于治疗溃疡性大肠炎的更好的临床结果。Cellsorba柱使用了聚酯过滤器。
[0054] 有2种其他的单采柱用于尝试治疗肺和G1道的恶性肿瘤。第一种柱被称为Imugard，其由日本的Terumo Co.生产，其经过试验包含得自海岛棉(Gossypium barbadense)植物的棉花过滤器(Amano 1996)。当该柱用于单采时，患者经历了短暂的血压过低，短暂的白细胞减少以及补体活化。在体外循环开始时，短暂的血压过低与短暂的白细胞减少一起发生。此外，也几乎大体上发生补体活化。由于并发症，FDA未批准使用所述的柱用于临床用途。接着，Terumo尝试通过将过滤器由棉花过滤器转变为合成过滤器来降低过滤器的生物不相容性。但是，在这种情况下，所述的柱丧失了其用于治疗感染和恶性肿瘤的效力，但是仍保持用于类风湿性关节炎的效力(Amano 1996)。在本质上，当过滤器的生物不相容性被降低时，Terumo柱由免疫活化柱改变为免疫抑制柱。近来，Terumo使用了聚亚安酯过滤器，并且它们的Immugard主要用于除去用于血液输注的白细胞。
[0055] 第二种柱包含纯化的金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)蛋白A，其对于免疫络合的IgG抗体具有高亲和性。当这种柱用于单采时，患者经历了短暂的血压过低和寒冷。蛋白A柱获得了相似的经历。此外，该柱也被尝试用于癌症的治疗(Messerschmidt1998和Ainsworth 1988)。但是，与使用Terumo柱相同，发生了并发症，例如在体外循环开始时的血压过低和寒冷。因此，FDA再次减持蛋白A柱应该被制得更具有生物相容性。在蛋白A柱的制造商成功地改善了其生物相容性之后，蛋白A柱停止了发挥其用于治疗恶性肿瘤的功能，但是保持了治疗类风湿性关节炎(Levy 2003)。
[0056] 在免疫系统被这些生物不相容的单采过滤器活化的情况下，患者必须遭受许多副作用，包括血压过低、呼吸困难、恶心、呕吐、出汗过度、寒冷以及颤抖。政府机关，包括美国FDA和日本卫生和福利部，禁止临床应用此类单采过滤器是正常的。结果，用于引入有效的免疫活化以治疗恶性肿瘤的此类生物不相容单采过滤器并未经过临床批准。但是，在这种情况下，当生物相容性被改善时，对恶性肿瘤的作用消失。因此，在降低这些副作用的过程中，Imugard柱丧失了其对肿瘤细胞的效力，而是保留了用于治疗类风湿性关节炎或溃疡性大肠炎的效力。相似地，当蛋白A柱被改性以便降低副作用时，其也丧失了对抗肿瘤细胞的效力，而对于治疗类风湿性关节炎是有效的。类风湿性关节炎和溃疡性大肠炎菌为与过度活性的免疫应答有关的状况，表明经改性的柱起到了抑制患者的免疫系统的作用。
[0057] 总而言之，当单采柱被改性以降低其生物相容性时，所得的柱通过除去自身抗体(特别是IgG3亚型)、除去免疫络合物、和/或除去免疫刺激细胞因子而起到抑制患者的免疫系统的作用。相比之下，包含生物不相容的材料的单采柱通过增加抗体的生产、增加细胞因子的生产、以及在患者的血液中对淋巴细胞占优势的状态下偏向白细胞群体而起到刺激免疫系统的作用。
[0058] 为了提供用于治疗恶性肿瘤和传染病的临床有效的治疗方法，本发明诱导了患者中受控的休克状态。换言之，本发明提供了在单采柱中使用生物不相容的材料来诱导暂时但有效的刺激免疫系统、同时控制可能与这些刺激相伴的副作用的方式。在不能提供这种强的免疫刺激的情况下，通过细胞凋亡杀死肿瘤细胞的免疫系统的能力被降低。当前，所提供的不具有任何心血管包含的单采不被临床用途所接受。与诱导免疫休克有关的副作用可以通过使用全身麻醉来控制。在这种方式中，本发明提供了一种分子手术的类型，其中患者的免疫系统在分子水平上被改变，从而寻找并杀死导致疾病的细胞。
[0059] 在20世纪实施的传统手术与在21世纪提出的分子手术之间的差异总结与表2中。
[0060] 表2
[0061]20世纪的传统手术 分子手术(21世纪)
除去的工具 刀和剪 膜过滤器和颗粒
除去的目标 恶性和/或损坏的组织 血液细胞和体液分子
过程 切割和缝合 体外血液疗法
结果 新组织的再生 免疫活化或免疫抑制
麻醉 全身或局部 全身
除去的工具 刀和剪 膜过滤器和颗粒
除去的目标 恶性和/或损坏的组织 血液细胞和体液分子
过程 切割和缝合 体外血液疗法
结果 新组织的再生 免疫活化或免疫抑制
麻醉 全身或局部 全身
[0062] 在20世纪的手术过程涉及在全身麻醉下通过剪和刀除去组织。在21世纪的血液纯化过程在全身麻醉下通过血液纯化过滤器(单采)来除去分子和细胞的成分。对于癌症疗法的这种分子方法而言，不具有与目前用于癌症疗法的放疗或化疗通常有关的并发症或副作用。不需要破坏患者的正常细胞，而仅是杀死异常的恶性肿瘤细胞。同时，极难检测小的转移性区域，从而施加有效的放疗。简言之，此时，不存在治疗恶性肿瘤的任何有效的治疗规则。因此，在21世纪，癌症的治疗过程应该为在全身麻醉下的分子手术。
[0063] 过去，在未全身麻醉下，在人类上实施临川单采过程。但是，对狗的试验单采过程是在全身麻醉下实施的，这并非用于控制免疫休克的副作用，而是用于在所述的过程中保持动物安静。结果，在单采过程本身的过程中，在短时间内采用全身麻醉。相比之下，本发明在生理学的2个阶段使用了全身麻醉使得患者：(1)在第一个小时过程中通过使用生物不相容的血液提取过滤器进行单采而诱导免疫活化；以及(2)在随后的5个小时的过程中安全地保持短暂的淋巴细胞占优势的免疫活性临床阶段，以用于通过细胞和体液试剂来杀死肿瘤。一些试验过滤器是生物不相容的并且被引入，使得血液动力学和呼吸改变，但是不存在致命的事件。但是，这些过滤器并非要增强免疫活性状态，而是要抑制免疫的活性。
[0064] 在使用本发明的单采柱，在大约1小时的单采之后，本发明的方法得到了图1所示的免疫调控。所有这些现象都是由于不仅体液因子被免疫活化，而且细胞因子也被免疫活化。换言之，患者的血液与生物不相容的生物材料的直接接触、以及随后在6小时的时间过程中患者体内的自身免疫的细胞和体液的调节的阶段1调控(下文所述)，其结果为诱导的免疫休克。在一个实施方案中，在2个星期内完成免疫活化过程。
[0065] 当生物不相容的单采过滤器用于单采时，会在体外循环的初始30分钟的框架内出现突然的血压降低以及突然的循环白细胞的减少(图2)。当注射100单位/kg的未纯化的肝素时也发生相同的情况。药剂诱导的血压过低以及生物不相容的单采柱诱导的血压过低之间的差异在于前者在注射之后不能逆转所述的副作用，而后者可以通过减少体外循环的血流量而停止所述的这些副作用。
[0066] 通过本发明的免疫活化的血液灌注过滤器诱导的这些生理学影响示于图3中。这些生理学影响的主要原因是由于白细胞被诱捕在肺毛细血管中。大部分的粒细胞瞬间被诱捕在肺毛细血管的内部，随后诱导患者中短暂的淋巴细胞占优势的状态。这是患者免疫活化的最重要的迹象之一。因此，短暂地减少循环白细胞以及血压降低会有助于本发明的有益的治疗作用。白细胞在体外循环的初始30分钟过程中被诱捕在肺毛细血管中。不论在30分钟后体外循环是持续的还是中断的，这些被诱捕在肺毛细血管中的白细胞开始释放。
生物不相容的血液纯化的所谓不安全的“副作用”实际上是导致对恶性肿瘤产生治疗作用的生理学应答。
生物不相容的血液纯化的所谓不安全的“副作用”实际上是导致对恶性肿瘤产生治疗作用的生理学应答。
[0067] 在所述的30分钟之间后白细胞的短暂增加可以如图4所示发生。根据过滤器的不同的相容性，在这些30分钟后，返回循环的白细胞的动力学不同。使用不同材料的不同过滤器，在最初的30分钟过程中在体外循环之后白细胞的诱捕是相同的，但是白细胞返回至血液循环的速度由于材料的不同生物相容性而不同。
[0068] 此外，当使用针对恶性肿瘤的传统的药剂疗法和放疗时，监测和预防副作用是极困难的。在这些疗法的过程中，患者遭受了大量的并发症，不仅失去了他们的头发，而且还具有许多消极的生理学。然而，它们的治疗作用是不确定的，并且是昂贵的。与恶性肿瘤的传统疗法相反，通过免疫活化的直接血液疗法证明了其以可控的及可监测的方式简单地发挥作用(表3)。换言之，在气管导管下使用全身麻醉的6小时本发明的免疫活化灌注过程过程中及过程后，可以更安全且更容易地使患者处于医生的合适的控制下。实际上，在实施例2所述的研究中，经历这种免疫活性单采疗法的所有狗在治疗后都存健康地存活至少6-12个月。这种给予患者以受控的免疫休克的体外疗法可以在全身麻醉下使用合适的血液压力监测来实施，使得患者在所述过程的过程中或者之后都不会具有任何消极的感觉或疼痛。
[0069] 表3
[0070]通过药物 通过血液疗法
作用 间接的 直接的
作用的控制 困难的 容易的
副作用的控制 困难的 容易的
作用或副作用的监测 困难的 容易的
作用的逆转或抑制 困难的 容易的
作用 间接的 直接的
作用的控制 困难的 容易的
副作用的控制 困难的 容易的
作用或副作用的监测 困难的 容易的
作用的逆转或抑制 困难的 容易的
[0071] 方法
[0072] 向人直接注入生物不相容的材料是危险的，这是因为其在免疫活化发生后难以除去。反而，患者的免疫系统的安全的免疫活化可以通过体外单采来完成。如上文所述，不存在不会将所谓的免疫休克综合征引入给患者的免疫活性单采过滤器。不幸的是，此时，不存在适当且安全地控制所述的免疫休克综合征的方法。但是，为了向癌症患者提供合适且临床有效的免疫活化，重要的是对患者诱导受控的免疫休克。
[0073] 为了提供安全的单采过程，本发明的方法涉及在全身麻醉下实施单采过程。在另一个实施方案中，使用气管内插管实施单采。在另一个实施方案中，在整个所述的过程中保持合适的血压和合适的血气水平。例如，可以通过鼻、口或气管给予氧气的供应来保持合适的血气水平。在一些实施方案中，通过覆盖在患者鼻和口上的面具给予氧气。在另一个实施方案中，通过气管内插管给予氧气。
[0074] 例如，当使用根据本发明的生物不相容的血液灌注过滤器使受试对象经历单采过程时，在体外循环的初始15至30分钟过程中可能发生突然的血压过低和白细胞减少症。血压可能降低50％以上。这种作用可以在30分钟后通过降低血流量的速度而逆转，并且通常在1小时的框架内返回至所述过程前的水平。在本发明中，如下文所述，由于在单采过程中以及之后发生的免疫活化的本性，使受试对象保持全身麻醉达大约6小时。
[0075] 在本发明的一个实施方案中，在全身麻醉下在1小时内通过根据本发明的单采柱的体外循环以及将麻醉再保持5小时可以为患者提供安全的免疫活化。血流量通过单采柱的初始速度可以为大约100至200ml/分钟，使得1体积的血液处理大约60分钟。通过静脉-静脉针通道可以取得大约100ml/分钟的体外循环速度。在另一个实施方案中，可以在单采过程中保持大约100ml/分钟的血流量；但是，在体外循环开始时，血压降低至不安全的水平，例如低于50mmHg，接着血压的这种降低应该被修正。在一个实施方案中，血流量的速度可以降低25％。如果血压过低持续，则血流量的速度可以进一步降低至初始血流量速度的50％。此外，在所述的过程中，动脉血液的氧气含量可以与白细胞计数一起降低，例如总细胞计数的不到20％。血流量的速度由25％立即减少至50％还可以纠正组织缺氧和白细胞减少症。在一个实施方案中，血流量的速度可以由大约100ml/分钟减少至大约75ml/分钟或大约50ml/分钟。
[0076] 在另一个实施方案中，血液中的细胞和分子因子的免疫活化在6小时内完成(急性阶段)。在该过程中，患者的心肺功能可以在全身麻醉的条件下得到保持。因此，患者不会感觉到诱导的免疫休克的任何不适的副作用，包括头昏眼花、呼吸困难、恶性、呕吐、出汗过度、发烧、寒冷和颤抖。
[0077] 在一个实施方案中，本发明提供了治疗患者疾病的方法，包括：
[0078] (a)提供包含血液灌注过滤器的单采柱，其中所述的过滤器包含至少一种生物不相容的材料；
[0079] (b)将患者的血液循环与单采系统连接，使得患者的血液在再次进入患者肌体之前通过血液灌注过滤器；
[0080] (c)使患者处于全身麻醉下，并向患者提供生理学支持；
[0081] (d)使患者的血液通过单采系统存环大约1小时；以及
[0082] (e)在患者的血液循环通过单采系统之后，将患者保持全身麻醉达至少5小时，[0083] 其中患者的血液循环通过血液灌注过滤器会活化患者的免疫系统，从而治疗疾病。
[0084] 在一个实施方案中，本发明提供了治疗患者疾病的方法，包括：
[0085] (a)提供包含血液灌注过滤器的单采柱，其中所述的过滤器包含至少一种生物不相容的材料；
[0086] (b)在连续监测动脉压力以及监测动脉血液的氧气下通过气管内插管提供全身麻醉；
[0087] (c)向患者提供抗凝血剂；
[0088] (d)通过静脉-静脉灌注使患者的血液循环通过单采柱达大约1小时；其中血流量通过单采柱的速度为大约100至200mL/分钟；
[0089] (e)监测患者的血压和血氧水平；
[0090] (f)在使患者的血液循环通过单采系统之后，使患者在全身麻醉下保持至少5小时，同时监测患者的免疫活化的迹象和心肺稳定性；以及
[0091] (g)在确认肺功能恢复至单采前水平之后，除去患者的全身麻醉。
[0092] 在另一个实施方案中，本发明提供以下过程用于治疗患者疾病的用途：
[0093] (a)包含血液灌注过滤器的单采柱，其中所述的过滤器包含至少一种生物不相容的材料，其中所述的单采系统与患者的血液循环连接，使得患者的血液在再次进入患者肌体之前可以通过血液灌注过滤器；以及
[0094] (b)在使用单采系统的过程中以及在使用后的至少5小时，用于麻醉患者的全身麻醉，
[0095] 其中使用单采系统可活化患者的免疫系统，由此治疗疾病。
[0096] 本发明的方法使得患者血液中的白细胞群体显著改变，并且使一些细胞因子短暂升高。如图26所示，所述的方法在2个星期内产生了4种不同阶段的白细胞动力学。在阶段1中，该阶段为在体外循环开始后的不到30分钟内，血液中的白细胞的短暂减少主要是通过这些细胞被诱捕到肺毛细血管的内部而发生。在单采柱中使用生物不相容的材料的条件下，与淋巴细胞(大约40％)相比，粒细胞减少的更多(接近100％)，从而在血液中创建了淋巴细胞占优势的状态。在30分钟后，粒细胞逐渐由肺释放。通常，1小时的体外循环可以产生足够的免疫活化作用。
[0097] 在阶段2中，白细胞由肺毛细血管释放，并且在大约6小时内白细胞计数变得正常化。在这6小时的过程中，最多的粒细胞由肺释放。这也是淋巴细胞占优势的阶段，其中细胞因子短暂地大幅升高，这转而会导致患者肌体中的肿瘤细胞死亡。在这6小时的过程中，肺功能需要帮助。在通过气管内插管大量地提供氧气下的全身麻醉可以在所述的时间过程中治疗组织缺氧。
[0098] 在阶段3中，单采后的4天，尽管在初始6小时过程中粒细胞会显著减少，但是淋巴细胞计数大幅升得更高。此外，白细胞(包括粒细胞和淋巴细胞)还可以升高超过单采前水平的2倍以上。而且，在该阶段过程中，与粒细胞和淋巴细胞相比，单核细胞群体甚至大幅升高的更高。在该时间过程中，这些升高的单核细胞和粒细胞应该能够消除死亡的肿瘤细胞。同时，淋巴细胞仍在高水平下存在。
[0099] 在阶段4中，在2个星期后，所有这些异常升高的白细胞计数返回至单采前的水平。在一个实施方案中，如果在2个星期后发生了意外的更高水平的免疫活化、以及随后过度地破坏肿瘤细胞，则可以施加用于除去这些细胞碎片的单采过程和免疫活性试剂以保持患者的安全性。
[0100] 在一个实施方案中，可以根据本发明，向患者给予一次单采。在另一个实施方案中，可以向患者给予多于一次的单采。在这种情况下，每隔2个星期进行一个单采治疗。在另一个实施方案中，向患者提供至少3次治疗，每次治疗每隔2个星期进行一次。在该实施方案中，所有对患者的治疗都在6个星期内完成。在另一个实施方案中，可以通过传统的抗癌疗法来补充根据本发明的单采治疗，从而增强本发明的免疫刺激的作用。
[0101] 患者的血液通道不必直接由单采柱返回至患者的肌体中。在一个实施方案中，患者的血液可以流入本发明的单采柱中，然后被收集以用于稍后给予患者。因此，可以通过将得自患者的收获的血液暴露于具有生物不相容的材料的过滤器并再次注射到患者中来建立免疫活化。
[0102] 根据本发明的体外单采的主要技术特征包括：(1)在大约60分钟内，取得通过生物不相容的血液灌注过滤器的体外循环；(2)在6小时时，可以完成阶段2的免疫活化，在该时期内，发生了细胞和细胞因子的活化；以及(3)在大约30分钟内发生了针对治疗的生理学应答，并包括血压过低、白细胞减少症以及呼吸困难，例如组织缺氧。这些生理学应答是安全的，并且被处于全身麻醉下的患者无痛地接受。
[0103] 可用于本发明的方法的单采柱组件
[0104] 图5A提供了可以用于本发明的方法的丙烯酸树脂单采柱的一个实施方案。聚丙烯酸树脂小室(3)保持有大约1g、大约5μm或更低的经洗涤的纤维。这些纤维通过PVA的非织造网(2)而保持在小室中，其中所述的网为大约2mm厚。Kuraray Inc，Tokyo Japan提供非织造PVA网(VW 00)。包含制备的纤维的各小室以及PVA网构成了过滤器单元(4)。5至10个过滤器单元可以堆叠成单采柱(1)。在一个实施方案中，使用了10个过滤器单元，在这种情况下，柱的高度为大约120mm。
[0105] 在一个实施方案中，过滤器单元可以以使装填体积为大约400ml的方式被包装在所述的室中，其中所述的体积为在所述的室中，在引入血液前运行通过所述的柱的装填溶液的体积。过滤器的包装密度可以至多为大约10％(克/体积)。
[0106] 生物不相容的材料
[0107] 将白细胞诱捕到肺毛细血管内会有助于建立淋巴细胞占优势的状态，在该过程中发生了免疫活化。在癌症的情况下，正是在该时间过程中癌细胞可以被杀死。最佳的生物不相容的擦料会通过将粒细胞诱捕在单采柱内而由血液中除去，对于再次进入肌体的白细胞而言，暴露于生物不相容的材料可以导致这些白细胞被暂时地诱捕到肺中。使用具有小直径的纤维有助于这些作用。在一个实施方案中，纤维的直径为5μm或更低。在另一个实施方案中，纤维的直径为1-25μm。
[0108] 可以用于本发明的单采柱的天然纤维包括但不限于棉花和丝。
[0109] 得自埃及的较小直径的棉花纤维可以有助于白细胞被诱捕在肺中。与合成的聚合物相反，天然棉花纤维由多种分子络合物构成，并且是更加生物不相容的。在所有的棉花纤维中，埃及棉花纤维具有比巴基斯坦棉花和澳大利亚棉花纤维更小的直径。因此，由埃及棉花制成的生物不相容的过滤器预计会由一类植物纤维生产具有更有效的免疫活性的过滤器。在其来源的国家收获各种类型的棉花，并且这些棉花可得自Marubeni America Corporation，Houston，TX 。
[0110] 在天然的动物纤维中，丝质纤维的直径最小。在所有的丝中，“广州(Kanton )”丝和“日本”丝显示出最小的纤维尺寸。日本丝由日本制造商生产，而广州丝由中国制造。两种类型的丝都可以得自Marubeni America Corporation，Houston，TX。丝质纤维的最小直径几乎与埃及棉花的纤维直径相似。它们低于5μm，通常为1-2μm。但是，与植物纤维相比，动物纤维为具有多种不同生物不相容的成分(特别是蛋白类)的更复杂的结构。因此，它们比合成纤维或天然植物纤维更加的生物不相容。
[0111] 得自桑蚕的外来蛋白可以起到免疫刺激剂的作用，从而使得丝对患者的免疫系统产生更好的刺激。因此，可以使用丝来得到最佳的免疫活化过滤器。预计使用丝质纤维制成的免疫活化柱应该能够通过体外血液灌注来治疗恶性肿瘤。
[0112] 在一些实施方案中，本发明的天然纤维可以被生物化。如本文所用，术语“生物化”是指交联过程，该过程连接了在丝中存在的同源蛋白，从而在纤维上产生光滑一致的表面。纤维可以通过化学方式或通过辐射技术生物化。纤维可以通过使用化学试剂而已化学方式生物化，包括但不限于甲醛和戊二醛。在一个实施方案中，纤维在10％的甲醛中浸泡至少
48小时。在另一个实施方案中，纤维可以在戊二醛的0.45％溶液中储存超过2个星期，以及长达5年。如果在单采柱内的生物不相容的材料已经生物化，则可以使用生理盐水洗涤，从而在临床应用之前除去残余的醛。
实施例
48小时。在另一个实施方案中，纤维可以在戊二醛的0.45％溶液中储存超过2个星期，以及长达5年。如果在单采柱内的生物不相容的材料已经生物化，则可以使用生理盐水洗涤，从而在临床应用之前除去残余的醛。
实施例
[0113] 实施例1：在与生物不相容的材料接触时血液细胞计数的变化
[0114] 在改变的条件下，针对多种类型的棉花和丝对得自人类全血的不同类型细胞的过滤能力进行测试。对于这些体外试验而言，将5ml注射器包装成在注射器内部具有4ml体积的生物不相容的材料，使得其密度为0.125g/ml。参见图7。全血得自正常的健康人类，并且每毫升血液加入1单位的肝素钠，以减少凝血。在试验中，在30分钟的收集中使用血液制备物。在22℃下的过滤过程中，将经处理的血液倒入注射器的顶部，过滤通过生物不相容的材料，然后由注射器的底部收集。接着，针对存在的不同类型的细胞，分析所得的过滤的血液。
[0115] 将使用0.5N酸溶液和0.5N碱溶液处理的埃及棉花的粒细胞除去速度与使用盐水处理的埃及棉花(Baxter Corp.目录编号no.281324)得到的除去速度相比。埃及棉花粗品得自，并通过使用0.5N NaOH(S320-500 Fisher Scientific)、水、0.5N HCI(SA48-500，Fisher Scientific)、水、和生理盐水的各种溶液分别连续地浸泡大约30分钟来制备。此外，埃及棉花也仅浸泡在生理盐水中。在棉花经过处理之后，将0.5g酸/碱处理的、或盐水处理的棉花置于4ml体积的注射器中，从而得到纤维密度为0.125g/ml。将8毫升的血液倒入注射器的微小体积中。最先的4ml过滤的血液丢弃，以防止被生理盐水稀释。收集剩余的4ml过滤的血液，并针对WBC和RBC技术与过滤前的血液比较。
[0116] 如图8所示，在酸/碱处理的埃及棉花与盐水处理的棉花的除去速度之间不存在差异。两种处理都得到相当的红细胞(RBC)、白细胞(WBC)和血小板的除去。更具体而言，在2类处理的棉花之间，嗜中性粒细胞与淋巴细胞也均是以相当的速度除去。与过滤前的血液中的淋巴细胞数量相比，淋巴细胞的数量稍微减少(图8D)。这些结果表明，在化学处理存在下，如通过嗜中性粒细胞计数的减少来测量的，埃及棉花保持了其除去粒细胞的能力，其中所述的化学处理可以用于制备棉花(即，除去油脂、灭菌和/或中和棉花)。
[0117] 针对最有效的粒细胞的除去速度，测试4种类型的棉花，其中使用PVA纤维作为阴性对照，并且粒细胞的除去速度是通过除去经过滤的血液中的嗜中性粒细胞而测量的。所测试的4种类型的棉花为巴基斯坦棉花(Marubeni America Corporation)、澳大利亚棉花(Marubeni America Corporation)、和埃及棉花。在生理盐水中漂洗棉花和PVA，然后将0.5g各种类型的棉花和PVA置于体积为4ml的5ml注射器中从而得到纤维密度为0.125g/ml。将8毫升的全血过滤通过注射器，并收集第二个4ml用于分析。
[0118] 如图9所示，通过将所测试的各种棉花与PVA阴性对照相比，表明几乎100％的粒细胞都被除去，其中埃及棉花提供了最好的结果。参见图9D。此外，参见图10。此外，RBC没有被任何类型的棉花过滤掉，而大部分的血小板被除去。参见图9A和9C。就淋巴细胞而言，各种类型的棉花表现为淋巴细胞除去的水平稍微不同，其中澳大利亚棉花除去了最多的淋巴细胞。
[0119] 此外，如上文所述，使用经盐水处理的埃及棉花评估纤维密度对粒细胞除去速度的作用。将埃及棉花包装到注射器中，其密度为0.125g/ml及0.05g/ml。对于0.05g/ml的密度而言，将2克埃及棉花包装到4ml注射器中。如上文所述制备密度为0.125g/ml的柱。对于0.125g/ml的密度而言，使用针对待测试的各种血液体积的新型迷你柱，过滤20ml至
80ml的不同体积的血液。对于0.05g/ml的密度而言，测试5至15ml的血液体积。对于各种密度而言，最先的4ml过滤的血液被丢弃以防止被生理盐水稀释，然后，以2ml的批次收集经过滤的血液。如图11D所示，即使甚至在80ml全血被过滤时，如通过嗜中性粒细胞的除去所测量，埃及棉花(当其密度为0.125g/ml时)能够除去一些粒细胞，但是当20ml全血被过滤时，除去是最高效的。粒细胞除去的效率会随着血液体积的增加而降低。在测试的血液体积中，在0.125g/ml密度下，血液的体积不会影响RBC或血小板的除去速度。在
0.125g/ml密度下，在至多80ml经加工的血液体积下，埃及棉花能够保持除去大约70％嗜中性粒细胞。图12D示出了对于0.05g/ml密度而言，WBC除去的效率随着血液体积的升高而降低。11至13ml过滤的血液体积下，粒细胞除去是最佳的，同时保持淋巴细胞存在于过滤的血液中。在少至最先的5至7ml中，如通过嗜中性粒细胞的除去所测量，迷你柱能够除去粒细胞。
80ml的不同体积的血液。对于0.05g/ml的密度而言，测试5至15ml的血液体积。对于各种密度而言，最先的4ml过滤的血液被丢弃以防止被生理盐水稀释，然后，以2ml的批次收集经过滤的血液。如图11D所示，即使甚至在80ml全血被过滤时，如通过嗜中性粒细胞的除去所测量，埃及棉花(当其密度为0.125g/ml时)能够除去一些粒细胞，但是当20ml全血被过滤时，除去是最高效的。粒细胞除去的效率会随着血液体积的增加而降低。在测试的血液体积中，在0.125g/ml密度下，血液的体积不会影响RBC或血小板的除去速度。在
0.125g/ml密度下，在至多80ml经加工的血液体积下，埃及棉花能够保持除去大约70％嗜中性粒细胞。图12D示出了对于0.05g/ml密度而言，WBC除去的效率随着血液体积的升高而降低。11至13ml过滤的血液体积下，粒细胞除去是最佳的，同时保持淋巴细胞存在于过滤的血液中。在少至最先的5至7ml中，如通过嗜中性粒细胞的除去所测量，迷你柱能够除去粒细胞。
[0120] 在图13中，在单一的血液体积下，针对粒细胞除去的效率测试3种纤维的密度。比较0.05g/ml、0.125g/ml和0.2g/ml的纤维密度。如上文所述制备0.05和0.125g/ml密度的迷你柱。对于0.2g/ml密度的柱而言，将0.2克埃及棉花在4ml注射器中包装成1ml体积。当测试0.05g/ml密度的柱时，7ml肝素处理的全血过滤通过所述的柱。最先的5ml被丢弃，并收集剩余的2ml用于分析。对于0.125g/ml密度而言，22ml肝素处理的全血过滤通过所述的柱。最先的20ml丢弃，并收集剩余的2ml用于分析。于0.2g/ml密度的柱而言，5ml肝素处理的全血过滤通过所述的柱。最先的3ml过滤的血液丢弃，并收集剩余的2ml用于分析。纤维密度的差异得到相当水平的RBC的除去。但是，一般对于WBC而言，0.05g/ml的密度不能如同0.125和0.2g/ml的密度一样除去WBC。同样地，如通过嗜中性粒细胞所测量，0.125g/ml和0.2g/ml的纤维密度最佳地除去了粒细胞，同时使得一些淋巴细胞通过迷你柱。因此，至少0.125g/ml的纤维密度较好地除去粒细胞。
[0121] 评估埃及棉花纤维的生物化对粒细胞除去的效力的作用。使用3种结合处理对棉花纤维进行生物化：0.4％戊二醛交联，然后使用1％、0.1％或0％凝胶涂敷纤维。在0％凝胶的情况下，仅使用戊二醛对纤维进行生物化。对于生物化而言，将纤维在戊二醛中浸泡超过24小时。然后，将该纤维在凝胶溶液中涂敷(Fisher Scientific；目录编号No.G7-500)。此外，将棉花纤维单独地浸泡在水中，并作为阳性对照。如图14所示，在样品中，所有3种处理都得到相当的RBC的除去。对于WBC而言，所有3种处理都得到WBC由过滤的血液中显著地除去。参见图14。图15示出所有3种处理都得到良好的血小板的除去，以及完全的粒细胞的除去，同时使得一些淋巴细胞通过迷你柱。使用丝质纤维，而不使用埃及棉花进行相似的研究，从而产生相似的结果。参见图16和17。
[0122] 此外，对通过辐射而非化学处理进行生物化的埃及棉花进行测试。使用设定在5千瓦的氩等离子体基离子注入装置对棉花纤维辐射0.5小时(图18)或1小时(图19)，然后如上文所述使用盐水进行制备。对于过滤粒细胞而言，辐射1小时要比辐射0.5小时的效果好。根据这些数据，等离子体基的离子引入可以用于调节由血液中除去的嗜中性粒细胞的比例。比较图18D和19D中嗜中性粒细胞的计数。
[0123] 实施例2：在杂种狗中的免疫活化
[0124] 使用由Marubeni International Inc.Houston，Texas提供的包含天然非合成非植物纤维(ACS-A1天然得到的纤维，其直径为1-2μm)的生物不相容单采柱，使20-30kg的6只正常的雄性杂种狗经历单采试验。参见图5B。所述的柱包含5克生物化的ACS纤维。
这些纤维是有效的白细胞顾虑器，但是仍用作生物不相容的材料。将共5克的这种纤维引入到柱的内部。具体而言，将1克充分洗涤的纤维装在分开的室中，并且在室的顶部和底部，由Kuraray Inc，Houston，Texas提供非织造PVA(聚乙烯乙烯醇)支撑，从而制得过滤单元。参见图5A。将5个过滤单元引入到柱的内部。
这些纤维是有效的白细胞顾虑器，但是仍用作生物不相容的材料。将共5克的这种纤维引入到柱的内部。具体而言，将1克充分洗涤的纤维装在分开的室中，并且在室的顶部和底部，由Kuraray Inc，Houston，Texas提供非织造PVA(聚乙烯乙烯醇)支撑，从而制得过滤单元。参见图5A。将5个过滤单元引入到柱的内部。
[0125] 通过使用0.5N NaOH、0.5N HCl、70％异丙醇进行连续地处理来制备纤维。在各溶液中，纤维均消耗大约30分钟，并且在各溶液之间使用水进行漂洗步骤。洗涤盒，并通过在48小时内将10％甲醛溶液运行通过所述的柱来进行生物化。在试验前，将经加工的纤维包装到柱中，然后建立血液环路。
[0126] 所述的血液环路包含辊式泵、管组件、加热单元和单采柱。在开始试验之前，通过生理盐水漂洗血液环路，直到漂洗的溶液中残余的甲醛浓度低于5ppm。将通过柱的血流量速度设定为3ml/kg。通过压力表测量柱的入口和出口压力。
[0127] 通过PVC(聚氯乙烯)管以及保温袋和除气室将单采柱与狗连接，从而完成体外循环的完整的环路。通过4％甲醛对体外单采柱进行过夜消毒，同时将其余的环路元件在使用前事先灭菌。
[0128] 在体外单采之前，使用肌肉内Xylazin和肌肉内克他命的组合来诱导麻醉，然后使用2.5％异氟醚气体用于保持来麻醉狗。将3L氧气、5L空气以及2％异氟醚加入到呼吸气体中。备选的麻醉诱导，可以使用阿托品。在单采治疗开始的60分钟内给予全身麻醉。
[0129] 通过静脉内团注的方式初始给予200单位/kg来对狗的血液进行肝素化，然后在单采过程中，使狗连续地接受100单位/kg肝素，接着使狗的血液以3.3ml/kg的流动速度在1小时内循环通过单采柱，如上文所述。在1小时的单采后，使狗再保持5小时的全身麻醉，使得从体外单采开始的时间起共持续6小时的全身麻醉。
[0130] 如图20所示，这种处理使得体外除去白细胞。在该图中，最黑的柱表示在入口血液中存在的白细胞(在该图中表示嗜中性粒细胞和淋巴细胞)，其中所述的入口血液为移动进入到单采柱中的血液。中间颜色的柱表示在离开单采柱并移动返回至狗中的血液中存在的白细胞的数量。最浅颜色的柱表示在被诱捕到柱内部的残余血液中存在的白细胞的数量。几乎所有的粒细胞都被除去，而仅60％的淋巴细胞被除去，因此在狗中得到了淋巴细胞占优势的状态。
[0131] 如图21所示，在单开开始后的大约30分钟，血液往往会短暂降低。但是，在这些短暂降低之后，血液后来会升高。在麻醉过程中，保持血液的血气水平，同时在全身麻醉的6个小时过程中，体温往往升高。
[0132] 图22示出了在灌注过程中WBC计数和纤维蛋白原的水平在最初时会降低，但是后来在单采的数小时内会恢复。但是，在单采过程中血小板计数也会降低，并在大约4天中保持相对低的数量。在1小时的单采处理过程中和之后，RBC计数停留在相当恒定的水平。
[0133] 在6小时的构架中，粒细胞与单核细胞一起返回至循环中(图23)，而在这6个小时过程中，淋巴细胞保持减少(图23B)。但是，在短期内，在狗中建立了淋巴细胞占优势的短暂状态。具体而言，在15分钟的体外循环之后，狗的血液中，粒细胞的百分率和淋巴细胞的百分率改变。狗的血液中嗜中性粒细胞的百分率仅为20％，而淋巴细胞构成了血液中80％的WBC。在后来的时间点时，在6小时后，嗜中性粒细胞和单核细胞的百分率返回至手术前的水平，但是在治疗后的6小时至4天淋巴细胞的百分率保持较低(图24)。
[0134] 除了由于体外单采而使得狗的免疫系统中短暂的淋巴细胞占优势的状态以外，在单采开始后在30至90分钟的过程中，TNF-α也短暂地升高大约1000倍(图25)。而且，在单采开始后在60至200分钟的过程中，IL-6也短暂地升高大约1000倍(图25)。相反，在治疗后的2个星期过程中，干扰素γ(IFN-γ)和白细胞介素(IL-2)如同抗体水平保持不变。
[0135] 与使用生物不相容的材料的单采有关的免疫休克包括由于血压过低而造成的头昏眼花、呼吸困难、恶心和呕吐、出汗过度、发烧、寒冷和颤抖。为了安全地控制这些生理学作用，在全身麻醉下实施本发明的方法。通过如此操作，患者可以经历可重复且有效的用于治疗恶性肿瘤和传染病的免疫活化单采疗法。由免疫活化单采疗法诱导的不安全且危险的休克现在由于本发明而变得安全、有效且无痛的治疗分子手术过程。
[0136] 在一个实施方案中，本发明的有效且安全的免疫活化疗法可以描述为以下8个特征：(1)使用气管内插管的全身麻醉；(2)仔细地监测血压和动脉血氧含量；(3)足够地提供氧气；(4)无论何时血压过低和组织缺氧发生超过了预期的水平，在体外循环以及自身血流量减少的过程中都应该仔细地控制流量；(5)持续大约60分钟或更少的体外循环；(6)保持至少6个小时的气管内麻醉，在该过程中患者在全身麻醉的同时接受了生理学支持；(7)在4天的免疫活化之后，白细胞计数短暂升高；以及(8)在完成单采治疗后的2个星期，监测细胞和体液的免疫应答。
[0137] 可以使患者经历1个小时的使用了生物不相容的生物材料的单采过程来生产患者的免疫活性状态。随后，患者的诱导的免疫活化状态导致肿瘤细胞或感染细胞的细胞凋亡，而不会对患者的天然且健康的细胞造成任何损害。
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