一种检测多种常见氨基酸的液相色谱方法
专利汇可以提供一种检测多种常见氨基酸的液相色谱方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 属分析化学领域，涉及一种检测常见 氨 基酸的液相色谱方法以及其在中药板蓝根中的应用。本发明是将待测样品经过样品预处理后，加入反应 溶剂 及衍生化 试剂 进行衍生化反应，然后采用高效液相色谱法测定20种常见氨基酸的浓度。本发明的方法采用通用型的液相色谱柱和紫外检测器对氨基酸进行高效液相色谱测定，并能排除其他物质对氨基酸的干扰。本发明可用于动 植物 天然提取物、药品、保健食品、 饲料 以及 血浆 、尿液、 脑脊液 、 生物 组织 等 生物材料 中氨基酸浓度的定量测定，且也可准确测定中药板蓝根中氨基酸的含量。，下面是一种检测多种常见氨基酸的液相色谱方法专利的具体信息内容。
1.一种检测多种常见氨基酸的液相色谱方法，其特征在于，其包括步骤：将待测样品经过样品预处理后，加入反应溶剂及衍生化试剂进行衍生化反应，然后采用高效液相色谱法测定20种常见氨基酸衍生物的浓度，确定氨基酸的含量。
2.按权利要求1所述的检测多种常见氨基酸的液相色谱方法，其特征在于，所述的反应试剂为不含有活泼胺基的有机溶剂，选自乙腈、甲醇、丙酮、四氢呋喃、甲苯、苯或乙醚。
3.按权利要求1所述的检测多种常见氨基酸的液相色谱方法，其特征在于，所述的样品预处理是，取适量待测中性水溶液样品，加入乙腈稀释或沉淀蛋白。
4.按权利要求1所述的检测多种常见氨基酸的液相色谱方法，其特征在于，所述的样品选自植物天然提取物、药品、保健食品或饲料；或血浆、尿液、脑脊液、生物组织材料。
5.按权利要求1所述的检测多种常见氨基酸的液相色谱方法，其特征在于，按下述步骤测定动植物天然提取物、药品、保健食品或饲料中20种常见氨基酸浓度：
定量分取动植物天然提取物样品，加入定量的反应试剂混匀，再加入硼酸盐缓冲液及过量的衍生化试剂进行反应，涡旋混匀，放置一段时间后，用液相色谱法测定氨基酸衍生物的浓度；
所述的衍生化试剂为9-氯甲酸芴甲酯，其分子式为FMOC-Cl，结构式如通式(Ⅰ)，
；
其按式(Ⅱ)与氨基酸进行衍生反应，
式(Ⅱ)中，R和R’均表示烷基、芳基、烷基取代芳基或者含杂原子基团；
所述的反应试剂为不含有活泼胺基的有机溶剂，选自乙腈、甲醇、丙酮、四氢呋喃、甲苯、苯或乙醚；
所述的高效液相色谱法，是采用紫外检测器测定20种常见氨基酸衍生物的峰面积，用标准曲线校正方程换算成氨基酸的浓度；其中，液相色谱柱采用通用型，填料选自十八烷基键合相硅胶或辛烷基键合相硅胶；流动相由乙腈和 50 mM pH值为4.15的乙酸钠缓冲液组成，梯度洗脱，检测波长为UV 263nm。
6.按权利要求1所述的检测多种常见氨基酸的液相色谱方法，其特征在于，按下述步骤测定血浆、尿液、脑脊液、生物组织材料中20种常见氨基酸浓度，
定量称取待测样品，加入定量的蛋白沉淀试剂，涡旋混匀，高速离心，取上清液，加入硼酸盐缓冲液及过量的衍生化试剂反应，涡旋混匀，放置一段时间后，用液相色谱法测定氨基酸衍生物的浓度；
所述的蛋白沉淀试剂选自乙腈或者甲醇；
所述的高效液相色谱法，是采用紫外检测器测定20种常见氨基酸衍生物的峰面积，用标准曲线校正方程换算成氨基酸的浓度；其中，液相色谱柱采用通用型，填料选自十八烷基键合相硅胶或辛烷基键合相硅胶；流动相由乙腈和 50 mM pH值为4.15的乙酸钠缓冲液组成，梯度洗脱，检测波长为UV 263nm。
7.按权利要求5或6的方法，其特征在于，所述的20种常见氨基酸的线性范围为
0.17～98.40 μg/mL。
8.按权利要求5或6的方法，其特征在于，所述的20种常见氨基酸的最低检测限为
0.05～0.13 μg/mL，其中，进样量为20 μL。
9.权利要求1的检测多种常见氨基酸的液相色谱方法在测定中药板蓝根中氨基酸浓度中的用途。
一种检测多种常见氨基酸的液相色谱方法
技术领域
背景技术
发明内容
所述的衍生化试剂为9-氯甲酸芴甲酯，其分子式为FMOC-Cl，结构式如通式(Ⅰ)，
；
其按式(Ⅱ)与氨基酸进行衍生的反应，
式(Ⅱ)中，R和R’均表示烷基、芳基、烷基取代芳基或者含杂原子基团。
定量称取待测样品，加入定量的蛋白沉淀试剂，涡旋混匀，高速离心，取上清液，加入硼酸盐缓冲液及过量的衍生化试剂反应，涡旋混匀，放置一段时间后，用液相色谱法测定氨基酸衍生物的浓度；
所述的蛋白沉淀试剂选自乙腈或者甲醇；
所述的高效液相色谱法，是采用紫外检测器测定所述生物材料中20种常见氨基酸衍生物的峰面积，用标准曲线校正方程换算成氨基酸的浓度；其中，液相色谱柱采用通用型，填料选自十八烷基键合相硅胶或辛烷基键合相硅胶；流动相由乙腈和 50 mM乙酸钠缓冲液 (pH 4.15) 组成，梯度洗脱，检测波长为UV 263nm。
保留时间(min) 氨基酸 线性方程 相关系数 浓度范围(μg/mL) 检测限(μg/mL)
10.0 Arg y=176950x+34.99 0.9995 0.31～62.40 0.078
10.4 Asn y=149813x-4343.5 0.9989 0.34～68.80 0.086
10.8 Gln y=76850x-5029.4 0.9951 0.20～81.60 0.051
12.0 Ser y=357888x-21999 0.9991 0.36～72.00 0.090
12.4 Asp y=113563x+6411 0.9997 0.40～80.00 0.100
13.0 Glu y=101569x+2046.4 0.9999 0.38～76.80 0.096
14.6 Thr y=105150x+6411 0.9997 0.43～86.40 0.108
15.7 Gly y=318825x-2126.1 0.9992 0.37～73.60 0.092
18.8 Ala y=247938x-9302.3 0.9998 0.38～75.20 0.094
21.6 Pro y=202156x-1346.7 0.9997 0.34～68.80 0.086
24.4 Met y=157131x-4710.7 0.9999 0.45～89.60 0.112
27.8 Val y=320994x+232533 0.9976 0.17～68.80 0.043
29.5 Phe y=141300x-9037.3 0.9996 0.49～98.40 0.123
30.0 Trp y=141113x-7516.6 0.9994 0.37～73.60 0.092
31.9 Ile y=177088x+45650 0.9938 0.24～48.80 0.061
32.6 Leu y=192400x-13501 0.9994 0.35～70.40 0.088
41.2 His y=118356x-1488.1 0.9994 0.53～105.60 0.132
42.5 Cys y=154075x+165942 0.9939 0.19～78.40 0.049
43.0 Lys y=379331x-37123 0.9997 0.26～52.80 0.066
45.3 Tyr y=229119x+11021 1.0000 0.34～67.20 0.084
y: 峰面积; x: 氨基酸衍生物浓度 (μg/mL) 。
附图说明
照图，
图1和图2中， Arg：精氨酸，Asn：天冬酰胺，Gln：谷氨酰胺，Ser：丝氨酸，Asp：天冬氨酸，Glu：谷氨酸，Thr：苏氨酸，Gly：甘氨酸，Ala：丙氨酸，Pro：脯氨酸，Met：甲硫氨酸，Val：
缬氨酸，Phe：苯丙氨酸，Trp：色氨酸，Ile：异亮氨酸，Leu：亮氨酸，His：组氨酸，Cys：半胱氨酸，Lys：赖氨酸，Tyr：酪氨酸。
具体实施方式
YMC C18 色谱柱 (5 μm, 250mm×4.6 mm)；柱温：30℃；流动相：乙腈 (A)-50mM 乙酸钠缓冲液(pH 4.15) (B), 梯度洗脱: 0-30 min A:B从(28:72, v/v)到(50:50, v/v), 30-37 min A:B从(50:50, v/v)到(58:42, v/v), 37-38 min A:B从(58:42, v/v)到(68:32, v/v), 38-44 min A:B从(68:32, v/v)到(76:24, v/v), 44-45 min A:B从(76:24, v/v)到(85:15, v/v), 45-54 min A:B (85:15, v/v). 流速: 1.0 mL/min, 检测波长: 263 nm, 进样量: 20 μL.
样品制备：分别精密量取已过0.45 μm过滤头含氨基酸的动植物天然提取物、药品、保健食品或者饲料水提取液50 μL，加入100 μL乙腈涡旋1 min，混匀，接着加入0.04 M硼酸盐缓冲液(pH9.5) 50 μL，10mM 9-氯甲酸芴甲酯50 μL，涡旋1 min，混匀，放置15 min后，进样20 μL，用液相色谱法测定氨基酸衍生物的浓度。
色谱条件：日本HITACHI (L-2130泵，L-2400 紫外检测器)高效液相色谱仪；色谱柱：
YMC C18 色谱柱 (5 μm, 250mm×4.6 mm)；柱温：30℃；流动相：乙腈 (A)-50mM 乙酸钠缓冲液(pH 4.15) (B), 梯度洗脱: 0-30 min A:B从(28:72, v/v)到(50:50, v/v), 30-37 min A:B从(50:50, v/v)到(58:42, v/v), 37-38 min A:B从(58:42, v/v)到(68:32, v/v), 38-44 min A:B从(68:32, v/v)到(76:24, v/v), 44-45 min A:B从(76:24, v/v)到(85:15, v/v), 45-54 min A:B (85:15, v/v). 流速: 1.0 mL/min, 检测波长: 263 nm, 进样量: 20 μL。
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