本申请要求1997年8月7日提交的未决临时申请流水号 60/055,314(其全文列入本文作为参考)的权益，本申请还要求1998年 3月23日提交的，题为“通用的叶绿体整合和表达载体、其转化植物 及产物”的未决临时申请流水号60/079,042(其全文列入本文作为参考) 的权益，另外，本申请是Henry Daniell于1996年1月25日提交的未 决专利申请流水号08/591,407的部分后续申请，08/591,407是1994年 3月18日提交，现已放弃的流水号08/215,020的后续申请，而08/215,020 又是1988年9月26日提交，现已放弃的流水号07/249,616的后续申 请。 发明领域

本申请涉及植物基因组的基因工程领域，具体涉及植物质体如叶 绿体的基因组的基因工程，并涉及任何植物叶绿体基因组的稳定转 化。 相关申请

本申请具体涉及通用的叶绿体表达和整合载体，该载体能用一个 或多个所需基因转化任何植物。较早的专利申请流水号08/591,407教 导了以表达盒转化的植物细胞，该表达盒含有稳定整合(共价连接)至 靶植物细胞叶绿体基因组的外源DNA序列。“稳定”整合的DNA序 列是通过子代细胞或生物体的基因组复制而遗传的序列。通过建立由 含有外源DNA的群体组成的永久细胞系、克隆或转基因植物而展现 出此稳定性。

类似地，授予Daniell和McFadden的美国专利5,693,507(1997)公 开了利用含有编码所需性状的外源DNA序列的表达盒进行的稳定整 合及其转化植物。 发明背景 叶绿体转化与核转化相比的优点

叶绿体基因组转化与核基因组转化相比的优点可归因于由后者所 导致的严重危险。人们普遍关心的一个问题是外源基因通过花粉传播 由转基因的作物转移至其杂草亲属。已阐明转基因的花粉可将外源(转 基因的)基因传递至其它性-亲和的植物(由在周围地区生长的非转基因 植物的子代中大量存在的标记基因检测)。例如，在不同方向的不同距 离处都观察到含有转基因棉花植物的中心试验田中的花粉分散至周围 的非转基因植物(Lewellyn和Fitt，1996)；(Umbeck，P.F等，1991)。另 外，野生向日葵中标记基因的频率平均约为28至38％；距草莓地50 米内生长的野生草莓中，50％以上的野生植物含有栽培草莓的标记基 因(King，J，1996)。

由于基因很快由作物流向其野生亲属植物，对除草剂抗性基因而 言，外源基因通过花粉转移是一个非常严重的环境问题。该问题是基 因由转基因作物转移至其杂草亲属会产生过多的杂草。在水稻(Oryza sativa)中，已注意到基因由栽培品种流向其野生亲属O.perennis(Barrett， 1983)和红稻(O.sativa；Langevin等，1990)。在美国南部，红稻已成为 主要的杂草，因为杀死它的除草剂也能杀死栽培的水稻。被红稻污染 的栽培水稻价格下降。一些研究人员将赋予glufosinate抗性的bar基 因(Liberty)导入栽培水稻以抵抗此杂草(Oard等，1996；Sankula等， 1996)。然而，亲和性使得核-表达基因的导入也使抗性性状经花粉传 递至红稻中。

类似地，在野生条件下，具有经基因工程改造的除草剂抗性基因 的转基因油菜与杂草亲属Brassica campestris(野生芥子)进行异型杂 交，甚至在第一代回交植株中即赋予了除草剂抗性(Mikkelson，T.R等， 1996)。

被导入基因的母体遗传会防止基因经花粉转移。通过叶绿体基因 组(对大多数作物而言为母体遗传)将外源基因遗传工程化是此问题的 一个解决办法。另外，大多数除草剂的靶酶或蛋白质(如氨基酸/脂肪 酸生物合成途径或光合成)被局限在叶绿体内。叶绿体转化的另一个重 要优点是较高水平的外源基因表达，这是因为植物细胞中叶绿体基因 组的拷贝数很高(5000-10,000)的缘故。由于叶绿体的转录和翻译机制 实际上是原核性质的，因此，细菌来源的除草剂抗性基因可在叶绿体 中以超乎寻常的高水平被表达。 叶绿体基因组的转化

对叶绿体转化的早期研究集中于使用能有效和延长转录或翻译的 完整叶绿体来研制细胞器系统(Daniell和Rebeiz，1982；Daniell等，1983) 并在分离的叶绿体中表达外源基因(Daniell和McFadden，1987)。进行 这些实验的前提是能将分离的完整叶绿体导入原生质体并再生成转基 因植物(Carlson，1973)。转化装置基因枪的出现使植物的直接质体转化 成为可能(Daniell，1993)。使用基因枪完成了：外源基因在双子叶 (Daniell，1990；Ye等，1990)，单子叶(Daniell等，1991)质体中的瞬时表 达，使用自我复制的叶绿体表达载体进行的外源基因延长表达(Daniell 等，1990)，和选择性标记稳定整合至烟草叶绿体基因组中(Svab和 Maliga，1993)。通过将cryIAc基因整合至烟草叶绿体基因组得到对某 些昆虫具有抗性的烟草植株(McBride等，1995；美国专利5,451,513，列 入本文作为参考)。迄今为止，仅在烟草中完成了高等植物的稳定质体 转化。 有关叶绿体基因组的现有技术

迄今为止，仅报道了在烟草中将外源基因稳定整合至高等植物的 叶绿体基因组。这是通过特异于烟草的载体实现的，所述载体衍生自 烟草叶绿体基因组，即该载体含有仅与烟草叶绿体基因组同源的序 列，该序列在其它植物的叶绿体基因组中不是高度保守的。该载体不 适于稳定转化除烟草外的植物。有关在除烟草外的植物中的外源基因 表达的唯一报道是关于小麦叶和胚的报道(Daniell等，1991)，但未完成 稳定的整合。外源基因稳定整合至单子叶植物的叶绿体基因组中尚未 见报道。至少在谷类(单子叶植物)中，以前开发的转化/再生方法因系 统内部固有的低效性而不适于质体转化。使用所用的那些再生系统无 法实现据认为对达到同型异源性至关重要的连续/系列选择(重复选 择)(Daniell，1997)。独特的玉米(Rudraswamy，1997)和水稻(未发表)转 化/再生方法的最新进展具有使效率大大增加的潜力，并可在再生过程 中允许一轮以上的选择。

Maliga等，美国专利5,451,513和Svab等，1990建议通过非致死 的选择技术转化烟草质体基因组，所述技术利用编码非致死选择性表 型的质体DNA。根据Maliga等的说法，非致死选择对于得到转质体 (transplastgenic)品系而言是绝对必要的。

与Maliga等的技术不同的是，本发明的方法提供了对所有除烟 草外的非转化植物为致死的选择，仅经转化的植物能存活并继续生 长。在含有浓度为500-1,000μg/ml的抗生素的培养基中，实际上所有 的抗生素，包括壮观霉素和链霉素都能实现这种致死选择。Maliga等 指出类似的条件对烟草是非致死的。另外，与Maliga等的技术不同的 是，根据本发明，甚至在第一轮选择中即可实现同型异源性转化。

在欧洲专利申请0251654中，Cannon等描述了烟草经转座子介 导的叶绿体转化，例如，使用细菌转座子Tn5。含有转座子的载体被 靶向已知为“转录沉默”区的染色体区域以保留天然基因的转录完整 性。经鉴定，这种转录沉默区位于叶绿体基因的两个已知的背离式启 动子之间，例如，位于叶绿体核酮糖二磷酸羧化酶的大亚单位(RbcL， “LS RuBisCo”)基因和β-ATP酶(atpB)基因的启动子之间。这些启动 子在远离染色体沉默区的相反方向转录基因。在Cannon等的表达载 体中未提供转录终止子，已知该终止子区域对质体中的基因表达是绝 对必要的。最终，Cannon等人未完成稳定的叶绿体转化。

本文描述的发明与Cannon等人的相比有几个区别特征，本发明 教导了可转移至子代的稳定转化。在叶绿体染色体的无转录活性区域 未导入整合基因。本发明将盒(含有下文将进一步描述的转录终止子) 整合至叶绿体基因组的有转录活性的区域。启动子控制一个或多个基 因的表达。与Cannon等的技术不同的是，本发明的叶绿体转化中无 转座子参与。

在NATO Asi Series中，Daniell等(1994)报道了经由植物叶绿体 基因组改造的昆虫抗性以控制昆虫，该抗性表现为CryIIA蛋白的表 达。McBride等，1995和美国专利5,545,818(1996)证实了Daniell等人 的报道，并在植物质体中表达了苏云金芽孢杆菌CRYIAc蛋白。McBride 报道的载体被设计为仅将构建体导入烟草叶绿体基因组。 需要载体转化多种植物

由现有技术可明显看出：非常需要叶绿体整合和表达载体以转化 (优选稳定转化)很多不同种植物的叶绿体基因组。这种“通用载体” 允许用异源(外源)DNA编码序列转化选定靶植物的叶绿体基因组，而 不再需要构建多个载体，其中每一个载体特别地适于转化预被转化的 具体选定植物种的叶绿体基因组。

据本发明人所知，构建这种能转化不同植物的通用载体的问题尚 未被解决。 有关基因间隔区的现有技术概念

尽管种与种之间的基因组，包括叶绿体基因组的编码区的核苷酸 序列经常是保守的，但相反的是，功能基因的侧翼序列，即编码区之 间的间隔区一般是非保守的。有关间隔区之间缺乏保守性因而同源性 程度低的可接受的理论是间隔区一般不行使必不可少的功能。因此， 如果有的话，也仅有很少的选择压力来保守种之间间隔区的序列。可 以改变间隔区的序列而不会有不良影响。

Stummann等，1988揭示：包括烟草、玉米和欧龙牙草Marchantia 的不同种植物之间，叶绿体基因组的核糖体RNA操纵子的基因顺序 是相同的，此操纵子的编码序列是高度同源的。Stummann也证实了 操纵子的种间同源性比基因编码区的种间同源性低。这与间隔区缺乏 保守性是一致的；暗示着核糖体RNA操纵子间隔区的种间同源性相 对较低。

与间隔区缺乏保守性的理论相反的是，本发明使用了在不同植物 之间高度保守的间隔区以构建能转化多种植物的载体。 发明总述

本发明提供了通用的叶绿体整合和表达载体，该载体能将所需基 因稳定转化和整合至多种植物的叶绿体基因组中。本发明还提供了转 化植物及其子代。转化了迄今为止从未被转化过的单子叶和双子叶植 物。被合成基因转化的植物表达有用的生物可降解的蛋白质基聚合物 (PBP)。转化植物能产生很重要的分子。本发明可使农作物具有针对 主要种类的化学除草剂的抗性。除草剂抗性被用作叶绿体转化的致死 选择性标记。除了靶性状外，转化植物还能表达合乎需要的第二种非 靶性状。本发明为转化植物提供了抗昆虫的抗性，该抗性既可针对对 Bt毒素敏感的昆虫，也可针对对Bt毒素具有抗性的昆虫。 发明概述 有关基因间隔区的本发明概念

已发现与常规的看法相反，植物的叶绿体(ct)基因组含有具有高 度保守的核苷酸序列的间隔区。已经发现，叶绿体基因组中这些间隔 区核苷酸序列高度保守的特征使得该间隔区非常适于构建转化多种不 同植物的叶绿体所用的载体，这样的话，就不必为不同植物或各个作 物构建独立的载体，后者需要首先测定各个叶绿体基因组的DNA序 列。这一发现具有多个有用的结果和重要的实践应用价值。 本发明的几个实施方案 通用载体

本发明具有几个有用的实施方案。本发明提供了通用的整合和表 达载体。下文称之为“UV”，该载体可用于在多种不同的植物中表达 至少一种表型。

本发明的整合表达通用载体含有表达盒(下文将详述)，该表达盒 含有必需的遗传元件，以便用编码所需分子的外源(异源)DNA瞬时或 优选稳定地转化质体，如靶植物细胞的叶绿体基因组，所述分子例如 是植物表达的表型或极有用的非植物分子，如生物活性肽(或多肽)。 使用叶绿体基因组的转录活性区域构建本发明的通用载体，所述区域 在大多数高等植物的叶绿体基因组中是高度保守的。优选该区域是间 隔区2；t-RNAIle和tRNAAla区域之间的基因间隔区。本文中常将此区 域称为“间隔”区，因为在叶绿体基因组中，它位于由一个启动子转 录的rRNA操纵子的几个基因之间。当被构建至通用载体中时，本文 中常将此区域称为“边缘”或优选称为“侧翼序列”。这是因为在通 用载体中，用于稳定转化靶植物质体的可操作连接的遗传元件的每侧 侧翼都具有序列，即间隔区的片断。载体中的侧翼序列和叶绿体基因 组中的间隔区序列互相之间具有足够的同源性，从而可进行同源重 组。将通用载体插入叶绿体基因组之转录活性区域的间隔区。间隔区 一般位于叶绿体基因组的反向重复区域。本文中常将构建体的其余部 分，即除侧翼序列和表达盒之外的部分称为“载体”，其中含有细菌 序列，如质粒克隆载体pUC，pBR322，pGEM或pBlueScript。 表达载体或表达盒

本发明通用载体含有每侧侧翼都具有侧翼序列的表达盒。列入本 文作为参考的美国专利5,693,507(1997)中描述了本发明所用的适当的 表达盒。该表达盒含有可操作连接的在植物叶绿体中起作用的转录起 始区，至少一种编码所需靶分子的异源DNA序列，如编码生物活性 化合物的基因(或其功能部分)，和位于5’端上游和3’端下游的调控 序列和转录终止区，以在靶植物的叶绿体基因组中表达编码序列。优 选表达盒的侧翼为植物DNA序列，如叶绿体DNA序列，以便于表达 载体稳定整合至叶绿体基因组中。在构建表达盒时，所述DNA序列 含有一个或多个克隆位点以整合所需基因。

在高等植物质体中得到鉴定的间隔区序列在多种植物之间是普遍 保守的。发现这些序列非常适于构建本发明的通用载体，结果，该载 体能通过同源重组转化多种(多重)靶植物的叶绿体基因组。因此，由 特定植物的哪个间隔区构建通用载体并不重要。

已知将至少一个另外的编码选择性表型的异源核苷酸序列如提供 抗生素抗性的基因或其功能部分用作与表达盒或通用的整合表达载体 相关的标记一般是可取的。这便于鉴定已稳定整合了外源基因的植物 细胞。在文献中已披露了一些标记基因，例如β-内酰胺酶，除草剂抗 性基因，如突变的psbA基因或EPSPS-aroA，编码氯霉素乙酰转移酶 的cat基因，编码β-葡糖醛酸酶(gus)的uidA基因等等。

据认为只有烟草对链霉素和壮观霉素的致死影响不敏感。尽管在 含上述抗生素的培养基中暴露时烟草叶无法形成色素，但能观察到烟 草的继续生长。然而，烟草的这一特性易被阻断，可使用如潮霉素的 多种抗生素使烟草致死。另一方法是选择可表达可见标记，如颜色、 荧光等的基因，如编码绿色荧光蛋白的报道基因mGFP。 转化方法

本发明提供了转化方法，该方法在第一轮选择之后即可产生同型 异源性(外源基因整合至植物细胞的所有叶绿体基因组中)而无需进一 步的选择过程。该转化植物的方法使用了通用载体，该载体是用除被 转化的靶植物外的植物的侧翼序列构建的。或者，载体可含有与靶植 物属于同一种之植物的侧翼序列，包括烟草的侧翼序列。 构建通用载体的方法

本发明还提供了构建通用的叶绿体整合和表达载体的方法。为 此，确定了与一种以上的植物高度同源的任何植物叶绿体基因组的间 隔区部分。从被鉴定出的叶绿体基因组中得到对应于间隔区的核苷酸 序列(或合成该序列)，并通过例如亚克隆至质粒而将其掺入适当的载 体。间隔区为表达盒的侧翼序列，所述表达盒含有以转化质体和表达 外源基因所必需的遗传元件。

可使用任何转化叶绿体的方法。可用于转化植物叶绿体并编码所 需肽以赋予靶植物所需性状的任何基因(或其功能部分)都适于被通用 载体转化。 转化植物

本发明还提供了植物，包括其子代，所述植物的叶绿体基因组已 被本发明的通用载体稳定地，即永久地转化。

本发明包括如谷类的单子叶植物或植物细胞，如玉米、水稻、大 麦、燕麦、小麦和禾草，及其子代，其中叶绿体基因组已被得自相同 种或不同于转化植物之种的通用载体稳定转化。本发明提供了经一轮 选择之后，因用含有叶绿体复制起点(ori)的通用载体可获得的同型异 源性而被稳定转化的双子叶和单子叶植物。本发明还提供了被稳定转 化的不同种植物，包括相同植物种、属、科、目和纲的品种。

根据本发明，其叶绿体基因组已被一个或多个所需外源基因稳定 转化的植物包括成熟的植物及其子代，如种子和胚。本文中的术语“植 物”也包括如外植体的植物部分，例如插条、组织培养物、细胞悬浮 液和愈伤组织。

因此，本发明包括稳定转化的多细胞植物、其子代、种子和转化 的质体，如叶绿体等，以及再生该被转化植物的方法。

在说明书和权利要求书中，当提及不同的“种”时，术语“种” 不仅指的是“物种”，也指植物界的种、属、科、目和纲中的品种。 因此，应理解能用于转化不同种植物的通用载体能转化不同种、不同 属、不同科、不同目和不同纲内的不同品种的植物。本文所用术语“植 物”是总称。 非植物产物的表达 生物聚合物基因

本发明使用通用整合和表达载体的另一个实施方案提供了被合成 的生物聚合物基因转化的植物，所述聚合物基因编码生物可降解的蛋 白质基聚合物(PBP)。

这些聚合物具有下文将讨论的有实践价值的重要特性。 高价值的分子—生物活性分子的生产

用不需要具有植物或动物天然类似物的合成基因进行转化以生产 PBP是可行的，这一令人感兴趣的发现显示出载体在人们致力的另一领 域中的广泛用途：由合成的或天然的任何基因或其功能部分在植物中 生产生物活性分子，如药物。

因此，本发明的另一个实施方案是将转化植物用作生物药物的生 物反应器(工厂)。生产具有药用价值的蛋白质经常需要至少两种性能， 而这在原核系统中是不可能生产的。与细菌不同的是，植物能生产出 具有生物活性构象的外源蛋白。植物对其生物合成途径的改变经常更 加耐受。因此，可用植物非功能性(或外源)基因转化植物，所述基因 可以是合成的也可以不是合成的，而它在动物(哺乳动物)，卵生动物， 具足动物或其它种动物中一般是具有功能的(有能力的)。

本发明还提供了含有由表达盒，优选由通用载体提供之基因的转 化植物，所述基因编码多种所需产物，尤其是生物活性分子，如肽(多 肽)，蛋白质，胰岛素，人血清白蛋白(HSA)和下文将进一步描述的其 它分子。允许或导致植物生长，从转化作物，如烟草、玉米等中分离 表达产物，需要时，首先收获，必要时进行纯化。 除草剂的耐受性

本发明的另一个重要的实施方案提供了转基因的除草剂抗性植 物，其中利用通用载体将对一种或多种除草剂具有抗性的外源转基因 优选稳定整合至叶绿体基因组中。特别重要的是表现出草甘膦抗性因 而对“ROUNDUPTM”(一种购自Monsanto公司的除草剂)具有抗性的 转化植物，通用载体提供了一种有效的方法，该方法可转化任何植物 叶绿体基因组并赋予针对任何除草剂化合物的抗性(或耐受性)。

本发明的一个不同方面是提供了利用表达盒，优选利用通用载体 转化植物，导致植物产生非-靶向(第二或其它)性状(或表型)的方法(例 见Penazloza，V等(1995)，报道了潮霉素β-磷酸转移酶基因的表达可赋 予对除草剂草甘膦的抗性)。

本发明的另一方面，除草剂耐受性被用作叶绿体转化的标记基 因。 昆虫抗性

本发明的另一实施方案提供了昆虫抗性，随着使用化学杀虫剂所 带来的问题的增多，现已广泛提倡使用苏云金芽孢杆菌(Bt)制剂。苏 云金芽孢杆菌产生很多种类型的对昆虫有毒的晶体状内含体。根据杀 昆虫的宿主范围和蛋白质的同源性对含有这些内含体的蛋白质进行了 分类。CRYI和CRYII毒素分别具有抗鳞翅目，或抗鳞翅目和双翅目 的杀昆虫活性。CRYI前毒素大小为130-135KDa，经酶促裂解为具 有杀昆虫活性的65KDa蛋白质。CRYII前毒素大小为65KDa，其含 有的分子量为60-62KDa的蛋白质具有杀昆虫活性。很多在商业上重 要的有害昆虫(尤其是螟蛾科)对CryIIA毒素敏感，所述害虫包括欧洲 玉米钻蛀虫、Ostrinia nubilalis，较小的玉米茎钻蛀虫Elasmopalpus lignosellus、豇豆荚钻蛀虫、Maruca testulalis、烟草芽虫烟草夜蛾、 Heliothis virescens、烟草角虫、Manduca sexta、和舞毒蛾(Lymantria dispar)，Daniell等，1994。

然而，Bt制剂已不如刚使用时那样有效，因为它们对UV照射敏 感，不能充分覆盖，价格昂贵和宿主范围有限。因此，经由Bt-转基 因植物传递Bt毒素是吸引人的。

用核-转Bt基因棉花可以产生对烟草芽虫、烟草夜蛾较好的控制， 但这些植物不能表达足够的Bt毒素以控制棉铃虫谷实夜蛾 (Helicoverpa zea)。另外，这些Bt基因可经由花粉与相关植物进行异 型杂交。为了防止这些问题的发生，因下列原因根据本发明，叶绿体 转化和表达已经得到了评价。1)每个含有叶绿体的植物细胞可含有高 达10,000个基因拷贝，2)叶绿体可读出完整的细菌DNA，包括操纵 子，和3)叶绿体基因组是由母系遗传的，还有，由于叶绿体DNA一 般在花粉中降解，所以能显著消除外源基因经由花粉转移这一现象。

选定CRY2A是因为CRY2A与CRY1A相对不同源，因此对一 些CRY1A-抗性的烟草夜蛾群体仅显示出微弱的交叉抗性。由于 CRY2A是“天然截短的”，因此不必损失3’端区域即可获得高表达 水平。

根据本发明，用本发明的通用载体转化烟草叶绿体基因组已经表 现出了抗性，所述抗性可以针对的是一般对Bt毒素敏感的昆虫和对Bt 毒素已有抗性或较不敏感的昆虫。从未被任何CRY毒素杀死的昆虫 在转化的烟草上显示出100％的死亡率。

因此，在植物中表达cry2A是控制多种害虫的有力工具，同时可 以防止Bt抗性的发展。在叶绿体中也高水平表达了通过不同机制杀 死棉铃象鼻虫的其它杀昆虫蛋白质，如胆固醇氧化酶。

本发明的其它实施方案在下文中将是显而易见的。 图的描述

图1显示出烟草叶绿体基因组的图谱。基因组图谱中的粗线表示 叶绿体基因组的反向重复区域。标以“UV”的箭头表示通用整合和表 达载体(UV)之优选实施方案的插入序列；标以“TV”的箭头表示烟草 载体(TV)的插入序列。

图2A显示出用于表达除草剂抗性的烟草叶绿体载体(TV)pZS- RDEPSPS。

图2B显示出用于表达除草剂抗性的通用叶绿体表达和整合载体 (UV)pSBL-RD-EPSPS。

图3A显示出用于表达生物聚合物的通用叶绿体整合和表达载体 pSBL-CG-EG121。

图3B显示出用于表达生物聚合物的烟草整合和表达载体pZS- CG-EG121。

图4A-4E显示出烟草和其它植物种类之间间隔区序列的同源性。 箭头表示外源基因插入的位点，外源基因插入位点的上游是复制起点 (ori)。

图4F-4G显示出几种作物间隔区(64bp)16S-23S rDNA的序列排 布，对烟草叶绿体序列而言，(+)表示正链，(-)表示负链。

图5A-C显示出载体pSBL-Ct边缘的构建。

图6A-C显示出载体pSBL-CtV1选择性标记基因盒的构建，该基 因盒含有叶绿体16S rRNA启动子(Prrn)，aadA基因和叶绿体psbA基 因的3’端非翻译区域。

图7A-7D分别显示出载体pSBL-CtV2、pSBL-CtV3、pSBL- CtVH、pSBL-CtVHF。

图8A-B分别显示出载体pSBL-CtVHBt和pSBL-CtVHBtR。

图9显示出在含有非致死选择的壮观霉素(500μg/ml)的培养基上 生长的已被转化和未被转化的烟草植株。标出转化叶(泛白)和未转化 叶(绿色)的生长。

图10A-10G显示出玉米质体转化和再生。

图11显示出玉米质体转化，在致死的培养基上，转化的玉米植 株正常生长(中间的嫩枝)，而未转化的植株死亡，这证明了抗生素 (1000μg/ml壮观霉素)的致死选择。

图12A-12F显示出水稻质体转化和再生。

图13A和13B显示出分离自水稻转化体叶的DNA的PCR分析。

图14显示出花生质体转化，在致死的培养基(500μg/ml壮观霉素) 上，转化的花生植株正常生长(平板中间和左侧)，而未转化的植株死 亡。

图15显示出大豆质体转化，在致死的培养基上，两个转化的植 株显示出嫩枝，而其它植株死亡，这证明了抗生素(500μg/ml壮观霉 素)的致死选择。

图16显示出在致死选择培养基(500μg/ml壮观霉素)上的甘薯胚 转化。

图17显示出葡萄细胞的转化，在致死的培养基(500μg/ml壮观霉 素)上，转化的培养物细胞变成绿色，而未转化的细胞死亡。

图18显示出在大肠杆菌中通过叶绿体整合和表达载体表达基于 蛋白质的生物聚合物(PBP)。

图19显示出对使用烟草载体(TV)的PBP转基因植物的转化体所 进行的Southern印迹分析。探针来自叶绿体边缘序列(A)或来自聚合 物(EG121)基因序列(B)。

图20显示出对使用通用载体(UV)的PBP转基因植物的转化体所 进行的Southern印迹分析。探针来自叶绿体边缘序列(A)或来自aadA 基因(B)。

图21A显示出使用分离自对照，叶绿体转化体和高水平表达合成 的生物聚合物基因(EG121)的核烟草转基因植物的总RNA，经Northern 印迹分析得到的外源基因的转录水平。

图21B显示出图21A泳道4-7的放大图。

图22显示出来自转基因植物经纯化的聚合物蛋白质的Western 印迹分析。

图23A显示出含有烟草载体的大肠杆菌的高生长速率，所述载体 含有EPSPS基因。

图23B显示出含有通用载体的大肠杆菌的高生长速率，所述载体 含有EPSPS基因。

图24A-24B通过使用rbcL和aadA引物(A)或16SRNA和aadA 引物(B)的PCR显示出外源基因整合至质体基因组中。

图25A-25C通过使用EPSPS探针(A)或rcbL-orf512探针的 Southern分析和同型异源性的大量产生显示出aroA基因整合至叶绿体 中，整合位点显示于(C)中。

图26A和26B显示出在选择性标记的存在下，分别收集自对照 和转化的烟草植株的种子的繁殖。

图27A和27B显示出喷洒有草甘膦的转基因和对照烟草植株。

图28A和28B显示出烟草对昆虫的敏感性(对照)和抗性(转化植 物)。

图29显示出(Western印迹分析)分离自对照和转基因烟草植株的 总蛋白质。

下文将更详细地描述本发明的优选实施方案。 发明详述 通用整合和表达载体

本发明的通用整合和表达载体能稳定转化多种不同靶植物的叶绿 体。异源DNA编码序列可在盒中被提供以编码如除草剂抗性，昆虫 抗性或其它性状的表型。载体在其DNA编码序列的每侧还含有与叶 绿体基因组的间隔区序列同源的侧翼序列，所述间隔区序列在不同植 物的叶绿体基因组中是保守的。凭此方法，通过侧翼边缘序列与叶绿 体基因组中的互补间隔区序列之间的同源重组，可将异源基因稳定整 合至靶植物的叶绿体基因组中。通用载体能转化任何植物。

已发现在从蓝细菌到高等植物，如单子叶和双子叶植物的多种不 同植物中，trnI和trnA间隔区是高度保守的。trnI和trnA基因位于间 隔区两侧，可称之为间隔区2或“spa 2区”(图4F-4G)。类似地，从 蓝细菌到高等植物的多种不同植物之间，间隔区任一侧的区域与相应 区域几乎具有完全的同源性，不同的是高等植物的trnI和trnA基因中 含有两个内含子。较长的边缘序列似乎更利于有效整合外源DNA。因 此，除了间隔区的同源性外，trnI和trnA基因同源性尽管不是必需的， 对转化和整合的效力也有贡献(图4A-4E)。

如果将包括非同源部分的较长边缘序列掺入载体中，序列的非同 源部分在重组过程中将被“环出”和“剪除”，不会整合至靶叶绿体 基因组中。

用间隔区可构建不同的通用载体。例如，用与“spa 2”相邻的trnI 和trnA基因的部分或全部可组成较短或较长的侧翼序列。

优选的通用载体含有侧翼序列和表达盒，所述表达盒含有下列遗 传元件以提供DNA编码序列的转录和翻译(5’至3’末端)：侧翼序 列的5’部分，在叶绿体中起作用的启动子，具有适当的克隆位点以 插入一个或多个DNA编码序列，用以表达所需表型或所需分子，和 带选择性标记的编码序列，转录终止子和侧翼序列的3’部分。编码 所需表型的和带选择性标记的DNA序列的顺序可被转换，还可提供 其它的侧翼植物DNA序列以促进稳定的整合。优选侧翼序列含有复 制起点(ori)。

在特定的图解中，高度保守的间隔区位于叶绿体基因组的反向重 复区域。然而，间隔区在叶绿体基因组中的特定位置并不及它与不同 植物间隔区的高同源性那样重要。

另外，在图4F-4G中可以看出，64bp长的间隔区2(或spa 2)序列 太短了以致于不能包括位于间隔区上游的叶绿体基因组ori。如果需要 包括ori，可选择包含ori的较长的间隔区序列，该序列包括间隔区序 列和侧翼序列中的一段附加序列。这可以提供一个更长的模板以用于 同源重组至受体的叶绿体基因组中并促进同型异源性。

另一个优选载体的每个侧翼序列除了含有间隔区2以外，还含有 叶绿体基因组的tRNAIle和tRNAAla基因之间的基因间隔区的部分或全 部(图4A-4E)。另外，侧翼序列也可分别包括tRNAIle和tRNAAla基因 的部分或全部。可任选每个侧翼序列含有16S和/或23S rRNA基因序 列的部分或全部。 图示的通用载体

一个优选的通用载体含有位于叶绿体基因组的16S-23S rRNA基 因之间的高度保守的trnI和trnA基因之间的间隔区2序列。优选区域 含有trnI和trnA基因的部分或全部DNA序列(图4F-4G)。从选定的 植物(如烟草)上切下此区域并亚克隆至商购质粒pUC19等的PvuII位 点。在质粒中插入表达盒，所述表达盒含有选择性标记基因，叶绿体 16SrRNA启动子，编码赋予抗生素抗性之酶的基因，如编码赋予链霉 素/壮观霉素抗性的氨基糖苷3’adenyl转移酶的aadA基因和叶绿体 psbA基因的3’端非翻译区。

具体地，当用质粒pSBL-Ct-bor构建通用载体时(图5)，在质粒中 插入选择性标记基因盒，该盒含有叶绿体16S rRNA启动子，编码赋 予链霉素/壮观霉素抗性的氨基糖苷3’腺苷转移酶的aadA基因，或 除草剂抗性基因和叶绿体psbA基因的3’非翻译区(图6)。然后将 此选择性标记基因盒以两个不同的方向插入通用的边缘。在载体 pSBL-CtV1中，选择性标记基因盒被插入进trnI基因(图6A)。在载体 pSBL-CtV2(图7A)中，选择性标记基因盒以16S rDNA转录的方向插 入进间隔区中的trnI和trnA基因之间。在载体pSBL-CtV2 R(无图示) 中，选择性标记基因盒则以与16S rDNA转录相反的方向插入间隔区 中的trnI和trnA基因之间。

已将几个有用基因插入到一个优选实施方案的通用载体pSBL- CtV2。例如，载体pSBL-CtV3(图7B)含有分离自水母，编码绿色荧光 蛋白的报道基因mGFP。这一基因也可用于可见地选择转化植物，或 用于观赏园艺，例如用于如圣诞树或甚至草坪等观赏作物，它们在蓝 光的照射下会发出绿色的荧光。

载体pSBL-CtVH(图7C)含有一个不同的选择性标记，赋予潮霉 素抗性的潮霉素磷酸转移酶(由叶绿体atpB基因启动子驱动的hph基 因)。此载体可用于转化对其它抗生素具有抗性的植物，尤其可用于转 化通常对其它常用抗生素具有抗性的单子叶植物。此基因也可赋予其 它性状，如除草剂抗性，非靶向性状。

载体pSBL-CtVHF(图7)含有GFP和hph基因，可用于致死选择 或致死/可见选择的联合。 一个特异于烟草的叶绿体载体和一个通用的叶绿体载体

烟草叶绿体载体pZS-RD-EPSPS(图2A)(“TV”)和通用载体 pSBL-RD-EPSPS(图2B)(“UV”)都含有(16S rRNA的)Prrn启动子、 aadA基因(壮观霉素选择所用)、编码EPSPS合成酶的突变的aroA基 因(用于草甘膦选择)和psbA 3’端区域。pZS-RD-EPSPS中的侧翼序 列含有rbcL和orf512，pSBL-RD-EPSPS的侧翼序列含有分别便于整 合至烟草叶绿体基因组的大的单拷贝区域(图1的“TV”箭头处)或反 向重复区域(图1的UV箭头处)的trnI和trnA基因。

草甘膦是Monsanto除草剂ROUNDUPTM的活性成分，它可用作 转基因植物除草剂选择的一个选择性标记。 叶绿体载体的构建

使用标准的载体构建方法，包括Klenow补平去磷酸化。烟草叶 绿体表达载体pZS-RD-EPSPS示于图2A。通用的叶绿体载体pSBL- RD-EPSPS示于图2B。这些载体的构建进一步示于实施例。在大肠杆 菌的XL1 Blue菌株中扩增这两种质粒，记录在M-9极限必需培养基 中的生长曲线。使用这两种载体在草甘膦中选择以证实对除草剂 ROUNDUPTM的抗性。

叶绿体表达载体pZS-RD-EPSPS特异于烟草，如前所述，该载体 对于转化其它植物无用(Maier等，1995)。与之相反，通用的叶绿体表 达和整合载体pSBL-RD-EPSPS(图2B)因上文所述的载体通用性而能 转化多种其它植物的叶绿体基因组。通用载体将外源基因整合至叶绿 体基因组的16S-23S间隔区。通用载体将叶绿体基因组反向重复区域 中的trnA和trnI基因(叶绿体转移RNA，其编码丙氨酸和异亮氨酸)用 作侧翼序列以进行同源重组。本发明中使用的叶绿体边缘序列也含有 叶绿体复制起点(oriA)，这在包括豌豆(Nielsen等，1993)和烟草(Lu等， 1996)的几种作物中已得到证实，这就可以解释此区域中高度保守的序 列同源性。此复制起点提供了增加数目的质粒模板以有效整合至受体 叶绿体基因组并获得同型异源性。

如上所述，构建通用载体时，将表达盒插入含间隔区的DNA片 断中的一个方便的限制性位点，所述表达盒含有叶绿体启动子，赋予 抗生素抗性的选择性标记基因(或其它选择标记)，编码靶分子的基因， 和其它元件(如本文所述)。必要时，可先将表达盒插入含保守间隔区 的DNA片断，再将编码靶分子的外源基因插入表达盒，以使插入前， 表达盒即包含多个克隆位点，用以插入一个或多个DNA编码序列。

间隔区序列中限制性位点的位置可决定两个侧翼序列各自的长 度，它们可以是(不同或相同长度的)间隔区的一部分。因此，两个侧 翼序列的长度不必相同，只要它们各与靶叶绿体基因组具有足够的互 补性以致于能促进同源重组即可。

由于本发明的载体与多种植物的叶绿体基因组的间隔区具有高水 平的同源性，因此该载体不仅能转化从中得到载体边缘序列的植物种 类，也能转化其它任何植物种类。

如本说明书所述，术语“同源”指的是一种植物的DNA序列含 有与另一种植物的DNA序列部分具有同一性的区域。即，如果两个 DNA序列是高度同源的，DNA会具有100％的序列同一性或低于100％ 的同一性。例如，为了进行叶绿体基因组整合，一段400bp长总体看 来只有25％同源性的序列，但其中含有一段100bp长有85％至90％或 更高同源性的序列，这段序列则被认为是与叶绿体基因组高度同源。

已证明通用载体的侧翼序列内含有叶绿体ori是有利的，未受理 论的束缚，据信通用载体中ori的存在促使一轮选择之后即可达到同 型异源性，而无需第二轮选择步骤。这一点在转化单子叶植物，如玉 米或水稻时尤为重要，此时由于由叶插条长成植物较困难，最终需要 由胚长成植物，所以第二轮选择步骤不可行。如果需要ori，但是缺乏 ori，可将其导入侧翼序列或其它任何地方。如果需要增加导入的通用 载体的拷贝数，可将含有ori的叶绿体DNA片断插入侧翼序列的外部 以使其仅能扩增通用载体的拷贝数，而不能整合至叶绿体基因组中。

侧翼序列如不来自特定植物，则可得自按下述方法合成的间隔 区。

为了转录和翻译编码所需多肽的DNA序列，可使用一般能在叶 绿体中表达某一个基因的整个启动子区域。这个启动子区域也可以包 括得自叶绿体基因的启动子，如菠菜或豌豆的psbA基因的启动子， 玉米的rbcL和atpB启动子区域和rRNA启动子。美国专利5,693,507 提及了可用的启动子和其它的文献来源。

美国专利5,693,507和其它文献中所述的可促进稳定整合的侧翼 序列不是本文所述的通用表达和整合载体的侧翼序列，本文所述的侧 翼序列在植物种与种之间是高度保守的，而上述专利和其它文献中所 述的侧翼序列却不是这样。 基因间的间隔区序列的鉴定

本发明提供了鉴定植物中适当的未转录的基因间间隔区序列的方 法，所述间隔区序列适于构建通用载体。所述方法包括分离质体基因 组DNA，与一个已知的放射性标记的间隔区序列探针进行杂交，检测 和分离出与探针具有所需程度同源性的质体序列。举一例证，为了测 定未知结构和序列的质体基因组是否具有间隔区，利用烟草间隔区作 为探针进行Southern印迹。利用一些已有的方法分离质体基因组 DNA，并用适当的限制性酶裂解之。在严紧(如68℃用50％甲酰胺，68 ℃用0.1×SSC洗涤)和非严紧条件下(如68℃用6×SSC，50℃用2×SSC 洗涤)(1×SSC是0.15M NaCl，0.015M柠檬酸钠)与间隔区序列探针进 行杂交，分别检测出与烟草间隔区序列具有约90-100％同源性或60- 100％同源性的该质体序列，然后分离经鉴定的质体序列。如果人们对 同源重组的需求更加随意，与探针杂交的程度要求更低，如约60％的 杂交就可以了。

因此，具有足够重组同源性的任何已知或未知的间隔区都适于构 建UV。类似地，可使用任何基因间高度保守的间隔区序列的已知序 列来鉴定和分离与已知间隔区序列同源的质体序列。

或者，可使用上文所述的BLAST程序来鉴定已知序列的质体基 因组中的高度保守区域。 可被转化的植物

可被本发明的通用载体转化的植物包括任何低等植物，如蓝细 菌，任何高等植物，如单子叶和双子叶植物。被转化的植物可以是 solonacious植物或生长于地下的植物。可被通用载体转化的高等植物 的非限制性例子包括谷类植物，如大麦、玉米、燕麦、水稻和小麦； 瓜类，如黄瓜，甜瓜和西瓜；豆科植物，如蚕豆、豇豆、豌豆、花生； 油料作物，如canola和大豆；茄科植物，如烟草；块茎类植物，如土 豆和甘薯；和蔬菜，如番茄、胡椒和辣椒；水果，如梨、葡萄、桃、 李子、香蕉、苹果和草莓；纤维作物，如棉属的棉花、亚麻和大麻； 和其它植物，如甜菜，棉花，咖啡，辣椒，商业上的开花植物，如康 乃馨和玫瑰；禾本科植物，如甘蔗或草皮草；常绿树，如冷杉、云杉 和松树；和落叶树，如槭树和栎树。本发明最感兴趣的是主要的经济 作物，如玉米、水稻、大豆、小麦和棉花。据发明人了解，除了烟草 外，上述植物都未经叶绿体基因组稳定转化过，包括烟草在内，无一 植物被本文所述的通用载体稳定转化过。人们经常从中得到DNA序 列的植物是烟草，这是因为烟草是被研究得最彻底的植物，但任何其 它植物叶绿体基因组也是适合的。

需重新提及的是，如上文所述，用于稳定转化烟草的载体不能转 化其它植物的叶绿体基因组。 转化方法

可通过多种已知方法中的任一种将表达盒转化至所需植物细胞 中。这些方法包括例如下列方法：通过钨颗粒轰击转化，聚乙二醇-介 导的转化，使用激光束，电穿孔，微注射或任何其它能将DNA导入 叶绿体的方法。例见Sanford，1988；Daniell，1993；Daniell，1997；美国 专利5,693,507；Kin Ying等，1996。使用这些技术可以将本文所述的发 明应用于多种不同的单子叶和双子叶植物。 由转化植物表达非植物分子

本发明的通用表达和整合载体能够使转化植物表达非植物和有价 值的分子，这正清楚地表现出该载体具有前所未有的用途。 生物可降解的蛋白质基聚合物

根据本发明的另一个实施方案，使用通用载体已经把表达蛋白质 基聚合物(PBP)的合成基因转化进烟草。该聚合物和表达它们的基 因在文献中是已知的(Daniell等，1997)。特别令人感兴趣的是PBP具 有重复的五聚体序列，如同GVGVP一样(Yeh等，1987)。这些PBP 聚合物显示出有用的反相温度过渡特性。当温度升高至过渡态以上 时，蛋白质变得不可溶。类似于基于石油的聚合物，PBP提供了广泛 的材料，如水凝胶，弹性体和塑料。它们也显示出显著的生物相容性， 从而可全面地应用于医学领域，包括防止外科手术后的粘附；组织重 构和程序化的药物传递(Urry等，1993)。在非医学方面，潜在的应用包 括用于转导器；分子机器；超级吸附剂和生物可降解的塑料(Daniell 等，1997)。这种聚合物包括聚合物(Val1-Pro2-Gly3-Val4- Gly5)n(VPGVP)n，其中“n”可为1至几百，如250等。Daniell等1995 年讨论了其重要的商业可能性和一些相关方面。PBP可制备有用的生 物可降解塑料。表达这些PBP的基因也可用于本发明，因为它们可用 作载体，即一个所需分子的基因可与叶绿体整合和表达载体上的PBP 基因融合。

在先前的一个研究中，在大肠杆菌中过量表达了编码(GVGVP)121 的合成聚合物基因，表达的程度之高使聚合物内含体几乎占了细胞体 积的80-90％(Guda等，1995；Daniell等，1997)。相同的基因也在培养的 烟草细胞的核区(Zhang等，1995)和转基因烟草植物的叶(Zhang等，1996) 中得到了表达。

在模型系统中，使用烟草基因组16S-23S rRNA间隔区中的trnI 和trnA基因之间的区域(图1)构建通用载体以整合选择性标记基因 aadA基因和合成的聚合物基因(EG121)。载体被插入叶绿体基因组的 反向重复区域。转化的烟草植物表达了高水平的聚合物蛋白质。使用 通用载体，也可用该合成的基因转化其它植物的叶绿体基因组以表达 蛋白质基聚合物。 高价值分子的生产

对生物聚合物的研究表明：合成基因可表达非植物产物，因此可 利用本发明的载体使具有多种DNA编码序列的转化植物表达具有生 物价值的分子。DNA编码序列可包含在通用载体中，或必要时，如上 文所述包含在表达盒中。

已知转基因植物可通过核转化而不是叶绿体转化产生了有价值的 生物活性分子。例见下列文献(皆列入本文作为参考)：Daniell，1995； Miele，1997；Lyons，1996；Daniell和Guda，1997；Arntzen，1997。 生物活性分子的表达

根据本发明可用通用载体或表达盒在转化植物的叶绿体中表达有 价值的生物活性分子。可通过已知方法收获植物，可以口服含有这些 产物的转化植物，Arntzen，1997。由转基因植物生产药物体现于具有 很多药物用途的肽(蛋白质)，它们包括疫苗、免疫调节剂、生长因子、 激素、血液蛋白质、抑制剂和酶。已报道的得自转基因植物的典型生 物制品包括抗病毒疾病的疫苗；病毒肽表位，如人免疫缺损病毒，非 病毒肽表位，细菌抗原蛋白质；生物活性肽，重组毒素(重组抗体)， 血清蛋白质和植物次级代谢物。根据本发明，转基因植物的叶绿体中 可表达所有这些产物。

转基因植物产生的典型的药物肽或蛋白质包括乙肝病毒表面抗 原，诺沃克病毒衣壳蛋白，口蹄疫病毒，人鼻病毒14，人免疫缺损病 毒，S.mutans表面蛋白，大肠杆菌肠毒素B亚单位，疟原虫环子孢子 表位，小鼠ZP3蛋白质表位(疫苗)；小鼠催化抗体6D4，小鼠mAB Guy’s 13，mAB B1-8，抗-光敏素Fv蛋白，抗-P物质(抗体)；人血 清白蛋白(HSA)，人C蛋白(血清蛋白)；α-天花粉蛋白，蓖麻毒蛋白(细 胞毒素)；人表皮生长因子(生长因子)；Leu-脑啡肽(神经肽)和人酸性β- 葡糖苷酶(hGC)(酶)。很多这些分子已在烟草、土豆块茎等中得到了表 达。

根据本发明，特别感兴趣的是用通用的整合和表达载体或用表达 载体产生胰岛素和人血清白蛋白(HSA)。已在转基因(核)的土豆和烟草 植物中产生了HSA，Sijmons等，1990。根据本发明，经由叶绿体转化 可产生上述产物。 胰岛素

本发明提供了由转基因植物表达胰岛素(作为聚合物-融合蛋白)的 方法。用含有合成的生物聚合物基因，如(GVGVP)40的表达盒或通用 的整合和表达载体转化植物。适当的植物是烟草，因为该植物的基因 工程较容易，而且需要寻找这一有争议的作物的其它用途。

为了在细菌中表达，该方法包括：构建在大肠杆菌中表达聚合物 (GVGVP)40基因与前胰岛素基因之融合物的载体，在大肠杆菌中表达 聚合物-胰岛素融合蛋白(以已知方法培养)，利用蛋白质基聚合物的温 度-过渡特性纯化重组蛋白，使用已知方法从聚合物上裂解胰岛素。

为了转化植物，将含有聚合物-前胰岛素之融合物的基因的表达 盒或通用的整合和表达载体导入靶植物，如烟草。由植物表达聚合物- 胰岛素融合蛋白，从植物细胞的叶绿体和胞质溶胶区室中提取聚合物 融合蛋白，用二硫苏糖醇(DTT)或其它已知方法从聚合物蛋白中裂解 胰岛素，收集胰岛素。或者，可在可食作物或作物的可食部分中表达 胰岛素聚合物融合产物。

将编码生物活性分子的DNA序列与表达蛋白质基聚合物的合成 基因融合以在适当的细菌或酵母宿主或转化植物中表达的技术是应用 广泛的很有前途的方法。 植物中的重组人血清白蛋白

在核转基因烟草和土豆植物中，产生了与真正的人蛋白质没什么 区别的重组人血清白蛋白(rHSA)(Sijmons等，1990)。这显示出有价值 的蛋白质在转基因植物中的表达，而且，通过使HSA与能导致正确 的蛋白质裂解和分泌的植物前序列融合，从而也可以进行适当的加 工。用本文所述的通用载体可轻易地转化一种选定的植物，如烟草的 叶绿体基因组并能使其表达HSA。 一般用途

如本文所述，根据本发明，通用载体可以转化植物，使植物表达 可赋予植物一种所需表型的生物分子和/或产生一种可以具有(不是必 需具有)生物活性的所需产物(或终产物的前体)。这种编码核苷酸序列 可以是合成的或天然的。产生的分子对植物而言可以是外源的，非功 能性的或功能性的。通用载体可广泛应用于植物转化领域。

希望用本发明的通用载体(特定情况下也许需经适当改动)转化的 转基因植物可产生任何生物活性分子(其前体或衍生物)。 叶绿体转化植物的除草剂耐受性

本发明的另一个实施方案涉及使用通用载体赋予植物对除草剂的 抗性或耐受性。基因转移技术的发展已使得将除草剂抗性基因导入植 物成为可能，从而使除草剂只选择特定的作物。 靶酶的修饰

此方法的第一个步骤是对赋予耐受性的除草剂靶酶(基因)进行鉴 定和必需的修饰，这已经被研究得很深入了。嘧黄隆是磺酰脲除草剂， 它可通过抑制支链氨基酸途径的第一个酶，乙酰乳酸合成酶(ALS)来 阻断细菌，酵母和高等植物的生长。人们可以从对嘧黄隆抗性的大肠 杆菌和酵母中分离出突变的ALS基因，Yadav等(1986)。通过对ALS 基因进行基因工程改造，在烟草和几种其它作物中获得了除草剂抗 性，Gabard等(1989)；Miki等(1990)。为植物提供除草剂抗性的另一种 方法是表达膦丝菌素乙酰转移酶(PAT)，该酶可使除草剂膦丝菌素去 毒，DeBlock等(1987)。 草甘膦

草甘膦是一种强有力的广谱除草剂，它对一年生和多年生禾本科 植物和宽叶草十分有效。草甘膦对环境是安全的，因为它在土壤中可 快速降解，土壤迁移率极低，对非植物的生命形式没什么毒性。草甘 膦通过结合和抑制5-烯醇-丙酮莽草酸-3-磷酸(EPSP)合成酶来起作 用。EPSP合成酶(EPSPS)催化莽草酸-3-磷酸和无机磷酸形成EPSP， EPSP对芳香族氨基酸的生物合成途径至关重要。草甘膦之所以对动 物无毒性是因为这一反应仅在植物和微生物中发生。不幸的是，由于 所有植物中都可发生形成EPSP的反应，草甘膦在杂草和所需植物(如 作物和观赏植物)之间没有选择性。

两种方法已被尝试用来通过基因工程开发草甘膦抗性植物。一种 方法基于野生型EPSP合成酶的过量产生，以使EPSP合成酶被草甘 膦竞争性抑制之后，残留的EPSP合成酶赋予了植物对草甘膦具有耐 受性。第二种方法基于编码草甘膦抗性EPSP合成酶之突变基因(aroA) 的表达。

在上述所有例子中，无一例外地将除草剂抗性基因导入了核基因 组。 叶绿体转化的必要性

十分需要开发除草剂抗性植物，尤其是对最常使用的除草剂具有 抗性的植物，其中赋予除草剂抗性的蛋白质在叶绿体中产生，使得除 草剂抗性的基因不能通过花粉转移至环境中。

本发明的通用载体符合上述要求，它可转化任何靶植物以提供对 任何选定除草剂的耐受性，如草甘膦。利用通用载体可赋予重要的经 济作物，如小麦，水稻，玉米，大豆对选定除草剂的抗性。

本发明提供了转基因的除草剂抗性植物，其中利用通用载体可将 对一种或多种除草剂具有抗性的某一个外源转基因整合至叶绿体基因 组中。转基因植物可以是成熟的植物，不成熟的植物，如种子，胚， 愈伤组织，培养的组织或细胞悬浮物，或植物的一部分，如插条或愈 伤组织。适用于本发明，且根据本发明稳定整合至叶绿体基因组中的 基因所抗的除草剂包括所有已知的(研究成熟的)除草剂。 除草剂的类别

本发明可以控制的除草剂一般被分为几个化合物类别。

第一类包括PSII(光系统II)除草剂，它干扰PSII受体位点上的质 体醌还原，包括下列化合物：三嗪、三嗪酮、脲衍生物、biscarmate， 腈、硝基苯酚、取代的哒嗪酮、苯基氨甲酸酯、N-丁酰苯胺、氰基丙 烯酸酯、DCMU、碳酰苯胺、尿嘧啶，具体地举例，比如二氯苯基二 甲基脲、莠去净、草克净、环草定、苯敌草、ioxynil和地乐酚。这些 化合物与叶绿体类囊体膜中的32-KDa的结合蛋白(QB蛋白，D1，除草 剂-结合蛋白)结合，从而阻断光合成的电子转运。编码QB蛋白前体的 质体基因被称为psbA，其序列在不同植物中具有很高程度的同源性。 最重要的PSII除草剂是Ciba-Gergy研制的莠去净。

另一类是PSI(光系统I)除草剂，它是一种膜结合蛋白质复合物， 其作用是催化光-驱动的质体蓝素(PC)氧化和铁氧还蛋白(Fd)还原。这 些化合物的典型代表是二吡啶基除草剂百草枯和杀草快。

另一类除草剂是芳基氧基苯氧基丙酸酯(APP)或乙酰辅酶A羧化 酶型除草剂，它可抑制质体中的乙酰辅酶A羧化酶，以及随后的脂肪 酸的生物合成。典型的APP是环己烷二酮(CHD)、sethoxydin、氟吡 禾灵、quizalofop、phenoxaprop(及其低级烷基-取代的分子)，dicolofop、 稀禾定、袭草酮和tralkoxydim。

另一类除草剂包括植物生长素类似物，如macropop、草灭平、 二氯甲氧苯酸、除草灵、1-萘基乙酸、3，6-二氯吡啶甲酸、毒莠定、 fluoroxypyr、quinclorac、MCPA和2，4-D。

另一类是有丝分裂除草剂，可称之为二硝基苯胺除草剂，如氟乐 灵、黄草消和除草通。

本发明使用的另一类除草剂是作用于氨基酸生物合成的除草剂， 如叔氨基甲基磷酸氯磺隆、glufosine和草甘膦。

另一类除草剂是抑制乙酰乳酸合成酶的除草剂(ALS)，如磺酰脲、 咪唑啉酮、三吡咯并嘧啶和嘧啶基硫代苯甲酸酯，如氯磺隆、灭草烟、 flumetsulam(和下文提及的植物中的除草剂抗性，1994，第4章，表I 中所列的其它除草剂)。

磺酰脲除草剂的例子是嘧黄隆(OustTM中的活性成分)和氯磺隆 (GleanTM中的活性成分)。咪唑啉酮中的一种灭草烟是美国Cyanamid＇s 除草剂ArsenalTM中的活性成分，imazamethabenz是两种咪唑啉酮的 混合物(Merk Index，第11版，4825)。可利用通用载体，使用位于ALS、 ilvG和ILV2结构基因中的ALS突变形式赋予植物以除草剂抗性。

尽管咪唑啉酮和磺酰脲之间存在化学上的差异，但这些物质可抑 制相同的酶ALS。看上去醌和咪唑啉酮除草剂与磺酰脲除草剂竞争 ALS上的共同位点，因此，根据本发明转化的植物能显示出对这两组 除草剂的抗性。

使用本发明的通用载体可以控制的另一组具有除草剂活性的化合 物的典型代表是L-phosphinothricin，它是三肽“bialaphos”的成分。 市场上出售的此三肽有日本，Meiji Seika的“HerbiaceTM”(商品名)和 德国Hoechst AG的“BastaTM”。L-phosphinothricin是谷氨酰胺合成 酶强有力的抑制剂，会导致植物中的氨浓度快速增加并导致植物细胞 死亡。尽管进行了深入的研究，但通过叶绿体转化未开发出赋予植物 除草剂耐受性的令人满意的产物。至于草甘膦型除草剂，据报道再生 的核转化的转基因植物对草甘膦显示出了耐受性，但也显示出受损的 生长，不会导致转基因植物对草甘膦具有高水平的耐受性，Schultz等， 1990。 叶绿体转化体

根据本发明，用携有必需编码序列的本发明载体转化对除草剂敏 感的靶植物的叶绿体，从而赋予植物除草剂抗性。转化的叶绿体中含 有携有外源转基因的基因组，该转基因可赋予除草剂耐受性。叶绿体 可以是成熟的叶绿体，也可以是不成熟的叶绿体，如黄化质体。优选 地，赋予除草剂抗性的基因编码EPSP合成酶，与野生型EPSP合成 酶相比，该酶与草甘膦的结合较难(亲和性降低)。如果有的话，第二 个转基因一般是赋予植物抗生素抗性的基因。因此，通过暴露于含致 死浓度的选定除草剂的培养基中选择转化体(其中转化体会存活)，利 用致死选择将除草剂抗性用作叶绿体转化的标记。第二个基因的来源 可以是原核生物(如细菌)或真核生物(如植物)。

本发明还涉及生产对几种除草剂具有抗性的植物(不论是相同类 型的除草剂还是不同类型的除草剂)和对多种除草剂具有抗性的转化 植物。

已知一些植物对某些类型的除草剂产生了天然的和非-永久性的 耐受性。本发明的教导易于应用于此。

本发明包括生产除草剂抗性植物的方法，所述方法包括通过将一 个或多个外源转基因导入植物叶绿体基因组来转化植物叶绿体，所述 转基因编码赋予除草剂抗性的蛋白质。优选转基因编码酶的突变形 式，与天然酶相比，该突变酶对给定除草剂的亲和性降低。

下表列出了多种类型的抑制或赋予抗性的抗性决定簇(化合物或 “分子”)和与其相关的典型除草剂。

                           表I

   抗性决定簇            除草剂

谷胱甘肽S-转移酶         s-三嗪

                         西玛三嗪

                         氯乙酰胺

                         Metalachlor

  生长素类似物           2，4-D

                         MCPA

                         2甲4氯丙酸

                         草灭平

  EPSP合成酶             草甘膦    Qb(psbA)-PS II型         莠去净

                         去草净

                         二氯苯基二甲基脲

                         草克净

                         环草定

                         苯敌草

                         Loxynil

                         地乐酚

乙酰乳酸合成酶           磺酰脲

    (ALS)

                         氯磺隆

                          灭草烟

                          嘧黄隆

                          咪唑啉酮

谷氨酰胺合成酶            Phosphinothricin

   PS I型                 百草枯

                          杀草快   乙酰辅酶A碳酸酵素           芳基氧基苯氧基丙酸酯(APR)，

抑制酶(APP型)             环己烷二酮    有丝分裂的破坏物           氟乐灵

                          黄草消

                          除草通

                          二硝基苯胺

有关植物抗除草剂的综述可见Stephen O.Duke(1996)编著的《抗 除草剂作物的农业、环境、经济、规章和技术的概况》(CRC出版) 以及Stephen B.Powles和Joseph A.M.Holtum(1994)编著的《植 物抗除草剂的生物学和生物化学》(CRC出版)。在第一本参考书中， 第三章《培育抗性作物技术》(在此章中有大量的参考文献被引用) 是这个发明特别重要的背景。两本书在这里被整体综合参考。

根据这个发明也发现，转基因植物在表达靶性状的过程中，能表 达比原始靶性状可能更有应用价值的其它性状。在此种情况中，植物 允许表达另一性状和在其性状表达的基础上被选择。

下列的非限制性实施例例证了该发明。 实施例1

通用的叶绿体整合和表达载体(烟草)通过首先切下烟草叶绿 体DNA中包含16S和23S rRNA基因的BamHI片段(130656-140992) 然后再亚克隆到已被普遍利用的pUC19细菌质粒上，完成示例叶绿体 载体的构建。烟草叶绿体基因图谱见图1。在这一片段中有一个包含 由trnI和trnA基因和基因间的间隔区(图5A)组成的通用边缘序 列的2.1kbp HindIII-EcoRI片段，在PvuII位点被亚克隆到pUC19质 粒上(图5B)。所得质粒被命名为pSBL-Ct Bor(图5C)。

载体pSBL-RD-EPSPS包含一个编码EPSP合成酶的突变EPSP 合成酶基因(图2B)。Mosanto′s ROUND UPTM的活性成分草甘磷结 合在EPSP合成酶蛋白上，并阻碍必需氨基酸的合成，导致植物死亡。 被突变基因编码的EPSP合成酶不能与草甘磷结合，为此使作物抗除 草剂。

其它赋予植物抗不利环境因素的如耐盐/干旱(耐渗透基因如甜 菜碱乙醛脱氢酶BADH，用于糖胶甜菜碱的过剩生产)或耐热(编码 热击蛋白的基因)或防冻蛋白，以及抗病如抗微生物(溶解酶肽、几 丁质酶)和抗病毒(衣壳蛋白)的基因也能被单独或以非-矛盾的联合 方式插入此通用叶绿体载体，或分别插入同一个通用叶绿体载体的不 同基因盒，以将靶植物转化成具有理想性状的植物。 包含合成间隔区2的通用叶绿体整合载体的构建

通过首先将包含间隔区2的合成寡核苷酸亚克隆到pUC19细菌 质粒上，完成仅包含烟草叶绿体基因组间隔区2的通用叶绿体载体的 构建。64个碱基对的间隔区序列的正负链被合成，正链的序列如下： 5＇-GCTGCGCCAGGGAAAAGAATAGAAGAAGCATCTGACTACTTCATGCATGCTCCACTTGGCTCGG-3＇

将合成片段混合和退火后在PvuII位点将之连接到pUC19上。(图 5B)一个适当可选择的标记基因和一个异质基因的插入如以上对 pSBL-CtBor的描述。

为了得到包括tRNAIle和tRNAAla基因的较长序列，可采用同样 的方法。

不同植物的遗传转化 实施例2

烟草的叶绿体转化  以下举例描述的是任何载体皆能用的烟草 叶绿体遗传转化的经典程序。两个这类的载体在下面被确定。将所有 新的叶绿体载体如Daniell(1997)描述皆首先在烟草中检验。通过使烟 草(Nicotiana tabacum var.Petit Havana)种子在pH为5.8的MSO培养 基(含有MS 4.3g/l，VB5混合液(肌醇100mg/l，盐酸硫胺素10mg/l，烟 酸1mg/l，盐酸吡哆素1mg/l)，蔗糖30g/l和植物琼脂6g/l)上萌发 而无菌培养。选择约两月龄植株的充分展开的绿叶而用于轰击。

将叶子以远轴侧向上的方式放在置于标准培养皿(100×15mm) 内RMOP*培养液中的Whatman No.1滤纸上轰击。钨(1μm)或金(0.6μm) 微粒用目的质粒DNA(即pSBL-RD-EPSPS or pZS-RD-EPSPS)包衣， 按Daniell(1997)描述的用PDS1000/He(Bio-Rad)仪进行轰击。轰击后， 培养盘用膜(parafilm)密封并在12小时光照周期和24℃条件下培养， 两天后把经轰击的叶片切碎为约5mm2的小片，放在深培养盘 (100×25mm，约每盘放10片)中的致死选择培养基上(RMOP，包 含一种可选择的标记如约500μg/ml壮观霉素二盐酸盐)，并使远轴 边接触培养基。从已死亡的芽上挑选抗壮观霉素的再生芽，再切碎成 小片(约2mm2)，再次转接在新的含同样致死培养基的深培养盘中 (约每盘5片)。将来自第二培养周期的抗性芽转接于生根培养基(补 充了IBA 1μg/L和适量的抗生素如500μg/ml壮观霉素二盐酸盐的MSO 培养基)。将生根的植株移栽于土壤，在26℃和连续光照的条件下生 长，待进一步分析。

转移到致死选择培养基后，外植体颜色逐渐变苍白，大约3-8 周时从叶子的被轰击侧开始出现绿色愈伤组织和芽的发育。来自每块 愈伤的抗性芽被认为是一个无性繁殖系。

在第一个培养周期后，对叶绿体转化子的PCR筛选表明，20个 抗性无性繁殖系中12个在叶绿体基因组中插入了连接在EG121基因 上的aadA外源基因。使这12个无性繁殖系进一步进行再生。从轰击 到转移至土壤的整个再生过程大约需3-5个月。

图9表示生长在壮观霉素(500μg/ml)存在的培养基上，转化和 未转化的烟草质体的生长，表明没有致死选择。 实施例3

玉米叶绿体转化  玉米种子的表面消毒和萌发：把玉米种子浸 在含20％(v/v)商品漂白粉和0.5％SDS的溶液中不断摇动15分钟，然 后用无菌重蒸水连续冲洗4-5次，而将种子的表面消毒。将液体MS 基萌发培养基(称为改进的CSG，含MS 4.3g/l，蔗糖30g/l，DM维生 素(盐酸硫胺素1.0mg/L，烟酸0.5mg/l，盐酸吡哆素0.5mg/l，肌醇 100mg/l)和BA 2.0mg/l，pH5.8)分放在每个铺有8层粗棉布的 MagentaTM盒内后高压灭菌。将种子放入灭菌后的改进的CSG培养基 (每盒25粒，任意基因型)中，在25℃、16小时或连续光照下培养 三天待其萌发。从三天龄的幼苗上无菌切下子叶结部分。此子叶结部 分在刚萌发的幼苗上似乎可清晰划分，表现在第七结上(图10A)。切 割时子叶结的横切面直径约为1.2-1.5mm(图10B)。

图10A-G表示玉米质体转化、再生进程。A)三天龄的玉米苗； 箭头和线用于指示外植体切割的第七结；B)在轰击前的子叶结横断 面，箭头所示是某个切面的边缘。C)GUS+的子叶结部分(核转化)； 轰击后三天进行组织化学分析。D)培养8周后发自一个子叶结部分(对 照)的多重芽。E)在生长培养基上3周的对照芽。F)生根组培苗对 照。G)转化的玉米质体在含壮观霉素和链霉素的液体培养基上选择 8周。

多重芽诱导：将子叶结段外植体以顶端朝上的方式放在玉米芽 诱导培养基(CSI：MS盐，蔗糖和DM维生素如上所述，BA 2.0mg/l，CPA 0.25mg/l和植物琼胶8g/l，pH5.8)，培养条件同上述。对于所用培养 基，除改进的CSG和RG1(水稻)外，对PGRs和抗生素进行过滤灭 菌，在培养基高压灭菌后加入。为了多重芽的形成，使植物组织在新 CSI培养基上每两周转接一次(图10D)。培养8周后从丛生芽中分 离出不定芽，并转接在半固体MS基培养基(含蔗糖、DM维生素、 甘氨酸10mg/l、天门酰胺150mg/l，pH5.8)中，使之生长三周(图10E)。 将生成的幼苗再转接于含IBA 0.5mg/l的同样培养基上生根(图10F)。 生根的小苗能在包含粗棉布的试管(150×25mm)中生长在无PGR的 液体MS培养基中，用粗棉布作固定根的材料可达到快速生长。将再 生的小苗转移至培养钵，适应环境后使之在温室生长至成熟。

图11示玉米质体转化。在致死培养基中转化的玉米植株能正常 生长(中间芽)，未转化的植株死亡，证实了壮观霉素(1000μg/l) 的致死选择。 实施例4

水稻叶绿体的转化  水稻种子的表面消毒和预培养：来自任 何基因型(indica或japonica型)的脱壳种子先浸在70％酒精中不断 摇动10分钟后，用无菌重蒸水冲洗5次。然后再浸于0.2％Benlate(w/v) 溶液20分钟，无菌重蒸水冲洗5次。再浸于50％的漂白剂20分钟， 无菌重蒸水反复冲洗，而将种子表面消毒。消毒后的种子预培养在RGI 培养基中(MS盐，蔗糖和DM维生素如上述，BA 2.0mg/l，pH5.8)。 如同玉米培养，在液体RGI培养基灭菌前被分放在有粗棉布的 MagentaTM盒中。轰击前的一天将种子在RGI(每盒放100粒任意基 因型的种子)中过夜预培养(23℃、16小时或连续光照)。

完整水稻种子胚的轰击  预培养的种子被垂直压紧，胚竖立在 一个含RG1.1培养基(PGI培养基加8.0g/l植物琼胶)的培养皿(每 皿放25个胚)中央2.5cm区，用DNA包衣的微粒轰击。

DNA沉淀  此过程如玉米DNA沉淀所描述的一样，作了下面 的改进：10μl DNA(1.0μg/l)和20μl异丙醇(2倍体积DNA)、60μl 2.5M CaCl2和15μl 0.1M亚精胺。每次发射出2.0μg DNA和720μg钨。

图12A-F示水稻质体转化和再生图解。A)轰击前水稻种子、 胚竖立；箭头指示胚的边缘；B)培养七天后从一个对照胚上诱导多 重芽；C)在选择培养基上生长8周后，选择自含壮观霉素和链霉素 培养基上生长的原始水稻胚而成的质体转化的水稻芽；箭头指示两个 推定的转化子；D)对照水稻再生体；E)转基因的Priscilla 2.3；F)转 基因的Priscilla 2.4。

多重芽的诱导和轰击后转化原生质体的选择  水稻种子被分别 撒播在RG1.1培养基上(保持极性)，轰击后在黑暗中放两天。然后 从弃去胚乳的剩余物中切掉种子胚末端(胚加上少量胚乳)。为了多 重芽的诱导(图12B)，胚被放在50ml液体RG2培养基上(在250ml 摇瓶中)以诱导多重芽，RG2含如上述的MS盐、蔗糖和DM维生素 以及BA 6.0mg/l pH5.8。RG2选择培养基含壮观霉素(1000μg/l)和硫酸 链霉素(100μg/l)。把培养物放在25℃、16小时光周期生长箱内培 养，并且每两周转入新选择培养基中继代培养。从每个胚萌发的芽簇 中选择绿芽放回选择培养基(图12C)。在加有抗生素的RG3培养基 (如上述的MS盐、蔗糖和DM维生素，IBA 0.5mg/l，pH5.8)中完成 生根(芽既能单独也可簇生生根)。小苗转移至培养钵，适应环境后 移植于沙土(1∶1)中在温室生长至成熟。(图12D，E，F)。

玉米和水稻质体转化与再生的发展程序  如上所述，独特的玉 米核转化和再生程序被发展(Rudraswamy，1997)并且被应用于质体 的转化。(在这个工作以前，子叶结外植体不曾被用来转化或再生)。 可从三天龄幼苗切下的子叶结上诱导多重芽，该幼苗具有21个基因 型(没有和A188或B73相关的)，包括杂合基因型(16个谷类，一 个甜型)和近交基因型(4个)。培养8周后，每个外植体生长16- 32个芽(平均24)。在温室分析中芽的生根和再生体不表现异常表 型(每个基因型限研究两株)。DNA也能被传递到所有基因型的子叶 结外植体中(图10C；β-葡糖苷酸酶的瞬间表达)。为了质体转化， 子叶结外植体被带有pSBL-ctV2的微粒轰击，然后放在含壮观霉素和 链霉素的多重芽诱导培养基上。发生的芽能被切割并再放回芽诱导 培养基待随后的多轮选择。

如上所述的独特的水稻靶体、脱壳的完整的成熟种子、胚的竖立， 以及伴随着成熟胚(轰击后两天切割)多重芽的诱导程序(图12)， 在之前未见报道。在8个被试验的基因型中多重芽皆被诱导(Litton， Priscilla-两个新发布的Mississippi栽培种，加上6个培育系)。因为 最初的外植体是一个成熟胚，所以大多其它品种上的主要反应是类似 的。为了收集F1代种子，再生体(非转化)一直被保养着。质体转 化后，在壮观霉素/链霉素存在下，芽得到了繁殖。象玉米转化株，由 于芽增生(原始是否掖生或不定生)是在切割芽的基底上，因此其能 经受多轮选择。生根也在选择培养基上完成。

图13A-B示分离自水稻转化体第一代叶片DNA的PCR分析。 用第一代叶片分离的DNA作PCR分析。PCR产物没有在烟草叶绿 体转基因植物中所观察到的那么丰富(图13A的11泳道，13B的12 泳道)。这可能是因为两个原因：用来分离DNA的程序不适合粗糙 的水稻叶的DNA的分离，或为烟草设计的引物与水稻的ct DNA退火 不够完全。然而，为了初步分析的需要，烟草引物被用来检测aadA 基因对来自通用载体植物基因组的整合。产物的缺乏将表明是自发突 变种，即无aadA基因也能在壮观霉素上生长(图13A的7-10泳道)。 一个1.57kb的PCR产物在通用载体转化的4个品系中被检测到(图13A 的2-3泳道)。在抗性选择条件下，通用载体转化的10个品系转化 子中检测到4个突变株。引物也被设计用来特别鉴定质体基因组的整 合。对于通用载体，叶绿体自身基因组上的引物位于16s rRNA基因 上，而在叶绿体载体的侧翼序列之外(1.60kb PCR产物)。在用通用 载体转化的转基因品系中观察到了预期的产物(图13B的5，6泳道)。 未轰击的植株(对照)不产生任何PCR产物，同预想的一致(图13B 的2泳道；图13A的1泳道)。PCR结果鉴定出两个＇Priscilla＇水稻植 株(2.3和2.4)含转化质体(图12和13)。 实施例5 花生叶绿体转化(Arachis hypogaea)

用通用载体pSBL-CG-CtV2(图7A)转化叶绿体基因组的转基 因花生已被获得。花生组织培养根据Kanyand(1994)等描述的程序 培养。花生转化轰击条件除烟草用可变压力切碎的叶圆片而花生用上 胚轴外，与上面描述的烟草叶绿体转化条件相同。花生叶绿体的转化 在此前未见报道。

图14示花生质体转化。转化的花生植物生长正常(盘的左边和 中间)，而未转化的植株在致死培养基上死亡(500μg/ml)。 实施例6

大豆叶绿体转化  用通用载体pSBL-CG-CtV2(图7A)转化 叶绿体基因组的转基因大豆已被获得。轰击条件与烟草叶绿体转化相 同。大豆叶绿体转化先前尚未见报道。

图15示大豆质体转化。(500μg/ml)，在致死选择培养基上两 个被转化的植株显示出芽的生长，而另外的植株死亡，这证实了壮观 霉素(500μg/ml)的致死选择。 实施例7

甘薯叶绿体转化  用通用载体pSBL-CG-CtV2(图7A)转化 叶绿体基因组的转基因甘薯已被获得。甘薯组织培养根据Zhang (1996)等描述的程序培养。轰击条件除用甘薯愈伤组织与原生胚来 轰击，轰击后转移至含100mg/l壮观霉素盘内外，其它条件同烟草叶 绿体的转化。甘薯叶绿体转化先前未见报道。

图16示在致死抗生素壮观霉素选择培养基上(500μg/ml)甘薯 胚的转化。注意变白的愈伤组织(右)和绿色的胚(左)。 实施例8

葡萄叶绿体转化  用同样的通用载体pSBL-CG-CtV2转化叶绿 体基因组的转基因葡萄被获得。葡萄组织培养根据Hebert(1993)等 描述的程序培养。叶绿体转化程序除用在指数生长期的细胞(大约继 代培养4天后)来轰击外，其它条件同烟草。葡萄叶绿体转化先前尚 未见报道。

图17示葡萄细胞转化。在致死抗生素壮观霉素选择培养基 (500μg/ml)中转化培养物细胞变绿而未转化的细胞死亡。 实施例9

其它植物的转化  借助微粒轰击的植物转化，是把携带有编码 有益分子所要求的核甘序列的通用载体导入靶植物的一种有用的技 术。通过微粒轰击获得的例证性转基因植物列举在表II中。

                          表II

通过微粒轰击获得的转基因植物

植物品种                         转化利用的外植体

苜蓿                             来自叶柄，茎部的愈伤组织

阿布属                           根段

大麦                             胚发生的愈伤组织，未成熟胚

香蕉                             胚发生悬浮细胞

豆                               分裂组织

柑橘                             胚发生细胞

棉花                             胚发生悬浮系，分生组织

酸果蔓果                         茎段

黄瓜                             子叶

木兰                             原胚体

胺树                             合子胚

葡萄                             胚发生悬浮细胞

玉米                             胚发生悬浮系；未成熟胚

燕麦                             胚发生的

番木瓜                           合子/体细胞胚；胚轴

牧草                             胚发生愈伤组织

桃                               胚起源的愈伤组织

花生                             分生组织

白杨树                           胚发生的

水稻                             合子胚

借助基因枪的植物转化被Daniell(1997)描述。在其表中被报道 的通过微粒轰击进行的核转化的作物，都能用本文所述的通用载体进 行叶绿体基因组的转化。 实施例10 非植物产物的表达

随后的例子，阐明了基于生物多聚物的生物可降解蛋白质(PEPs) 的表达和转化子的分析。

载体pSBL-CG-EG121.载体pSBL-CG-EG121(图3A)含基 因(GVGVP)121met(命名为EG121)，此基因编码有许多医药和非医 药应用的基于生物多聚物的生物可降解蛋白质(PBP)。

叶绿体表达载体的构建  对载体构建的标准程序如 Sambrook(1989)等所概括。叶绿体的整合和表达载体pSBL-CtV2(图7A) 和pZS197被分别用xbaI(在aadA基因和psbA3＇区间的唯一位点)和 SpeI(在psbA3′调控区的aadA基因下游120bp处的唯一位点)酶解，用 克列诺填补和脱磷酸。多聚物基因EG121和来自pET 11d载体的 Shine-Dalgarno序列(GAAGGAG)从质粒pET11d-EG121中被切割 成一个XbaI-BamHI片段。插入片段的粘端用克列诺填补并且和载体 pSBL-CtV2或pZS197连接产生叶绿体表达载体pSBL-CG-EG121(图 3A)和pZS-CG-EG121(图3B)，其整合的aadA和EG121基因在反向重 复序列(IR)或进入烟草叶绿体基因组的rbc1和orf512基因间的间 隔区。见图1，分别用“UV”和“TV”表示其整合位点。

在大肠杆菌和烟草中的生物多聚物的表达。质粒载体pSBL- CG-EG121(图3A)被转入大肠杆菌菌株XL-1 Blue中，转化子在37 ℃下，在含氨苄青霉素(100μg/ml)的极好的液体培养基中生长24小 时。根据Laemmli(1970)的方法用12％的分离胶和5％的浓缩胶，在 30mAmps稳定电流下进行SDS-PAGE电泳5小时。照Guda(1995) 等描述的方法来制备大肠杆菌细胞的蛋白粗提物并且电泳。电泳后， 多肽用CuCl2负染显色。

图18表示在大肠杆菌菌株HMS174(DE3)中叶绿体整合表达 载体的表达。1泳道，表示纯化的多聚物蛋白；2泳道，表示未转化 的大肠杆菌对照物；3泳道，表示用普通载体pSBL-CG-EG121(图 3A)转化的大肠杆菌XL-1Blue菌株；4泳道表示用烟草载体转化的 大肠杆菌和5泳道，表示用含T7启动子转录多聚物基因的pET11d- EG121载体转化的大肠杆菌菌株HMS174(DE3)。在大肠杆菌中Prrn 启动子的表达水平几乎相当于驱动多聚物基因的高效T7启动子。

Southern印迹分析。用Rogers和Bendich(1988)的CTAB 步骤提取被转化植物和野生型植物叶的总DNA。

图19和20分别表示用烟草载体(图19)和通用载体(图20) 转化获得的转化子的Southern印迹分析。通用载体(UV)转化子总 DNA用EcoRI和HindIII酶解，烟草载体(TV)转化子用EcoRI和 EcoRV酶解。多聚物基因3’末端一个EcoRI位点的存在允许仅在叶 绿体转化子内切所期望大小的片段。为了确定外源基因的整合和同型 异源性，每个印迹用相应的边缘序列探测。对于TV转化子，第二和 第三次选择后，边缘序列与4.6和1.6kbp片段杂交(图19A的泳道 2、3和4)，并且与野生型中的3.1kbp天然片段杂交(图19A的泳 道1)。另一方面，对于UV转化子，一次选择后，边缘序列与4.0 和1.2kbp片段杂交(图20A的泳道1和2)，并且与对照中的2.1kbp 天然片段杂交(图20A的泳道3)。此外，TV转化子也显示类似野 生型植物3.1kbp的天然片段(图19A的泳道2和3)，说明被转化叶 绿体基因组的异质性，即使他们已经历了几次的选择。然而，甚至第 一次选择后，两个UV转化子均显示出同型性(图20A的泳道1，2)。

甚至第二次选择后异质性的存在早期已有报道并且建议选择应进 行到达到同型异源性为止(Svab和Maliga，1993)。这和TV转化子中 第二次选择后存在高度异质性的观察一致(图19A的泳道2和3)。 而若UV转化子无异质性状态观察到，可能是由于两个IR区间的复制 校正机制和/或边缘序列中叶绿体复制起点(ori)的存在，在整合前 增加了被导入质粒的拷贝数。

DNA凝胶印迹或用aadA基因(UV整合植物)或用EG121基因 (TV整合植物)探测，进一步证实外源基因整合进叶绿体基因组。 在TV整合植物中，多聚物探针仅与在质体转化系中的4.6kbp片段杂 交(图19B的泳道2、3和4)。而在UV整合植物中，aadA序列也 与一个期望的4.0kbp片段杂交(图20B)，此片段也与质体转化系中 边缘序列杂交(图20A的泳道1和2)。

转基因烟草的转录物水平分析和Northern印迹。用分离自 对照、叶绿体转化子和借助核基因组介导的高水平表达多聚物基因 (EG121)的烟草转基因植株的总RNA(Zhang et al，1996)，通过 Northern印迹分析外源基因的转录物水平(图21)。多聚物基因 (EG121)序列与叶绿体转化子中的1.8kbp片段杂交(泳道1-4，5 -6)，也与某一个叶绿体转化子中一个较大的片段杂交(泳道6)。 对于核转化体，一个约2.1kbp的转录物被观测到(泳道7)。这是由 于由nos终止子提供的多聚物转录物的3＇末端的多聚A尾部的存在。 在6泳道观察到的较大片段可能是2聚，3聚或在叶绿体中正被加工的 多顺反子转录物。这在叶绿体基因表达中是一个普遍现象，因为许多 质体基因被组构成多顺反子转录单位，将引起几套复杂的重叠 mRNAs。转录水平的量揭示了叶绿体转化子正在产生11倍(泳道5) 或比50倍多的多聚物转录物(泳道6)，高于一个高水平表达的核转 化子的转录水平(泳道7，在35个被检测的用TV进行的核转基因植 物中表达水平最高的植株)。这直接归于叶绿体转基因植物高基因拷 贝数的存在。烟草载体(TV)整合的质体转化子与通用载体整合的转 化子相比，其显示较低水平的多聚物转录(泳道1-4)，因为多聚物 基因在通用载体转化子中每个转化的质体基因组存在两个拷贝而同样 在TV转化子中则只存在单拷贝，并且在TV转化子中被观察到了异 质性情况。

Western印迹分析。依照近来被Zhang(1995)等描述的方法， 纯化来自野生烟草、叶绿体转化子和核转基因植物叶中的多聚物蛋 白。根据Laemmli(1970)的方法用12％的分离胶和5％的浓缩胶，在 30mAmps稳定电流下，通过SDS-PAGE电泳5小时分析纯化的多聚 物。用0.3M CuCl2负染，约60kDa的多聚物多肽被显示。凝胶在pH9.0 的0.25MEDTA钠和0.25Mtris-盐酸缓冲液中退色，以10分钟为间隔， 更换缓冲液三次。Western免疫印迹和染色(图22)如Zhang(1996) 等所述的方法来完成，该方法是用抗多聚物GVGAP的单克隆抗血清， 该血清能与多聚物GVGVP发生很好的交叉反应，以及免疫印迹分析 试剂盒(Bio-Rad)来进行Western印迹分析。在IR整合植物的质体 转化子中可见多聚物多肽跑在约60kDa处。在泳道5可见来自高表达 核转基因植物F2代(35个被检测的转基因植物的表达水平最高的植 株)的多聚物表达(图22)，同时泳道4显示在未转化的对照中无多 聚物表达(图22)。11-50倍的高水平多聚物转录物显示在叶绿体 转化子中(图21〕。因为叶绿体天然发生的蛋白象缬氨酸和脯氨酸， 其生物合成途径在叶绿体中被区室化，所以蛋白定能被期望得到高水 平的生产。 实施例11

通过细胞核和叶绿体基因组介导，获得耐草甘磷性能的遗传工程

烟草中含EPSPS的叶绿体整合和表达载体。EPSPS编码序列最 近已经被整合进烟草叶绿体基因组(图1)。叶绿体载体pZS-RD- EPSPS(图2A)含16s rRNA启动子(prrn)，该启动子驱动aadA基因和 EPSPS基因，并带有烟草叶绿体基因组psbA3＇端区域。这种构建是 将EPSPS和aadA基因整合到烟草叶绿体基因组的rbcL基因和orf512 基因之间的间隔区。见图1“TV”箭头所指。

草甘磷抗性实验  大肠杆菌中的基因表达  由于大肠杆菌和叶绿 体转录和翻译系统具有高度相似性(Brixey等，1997)，在进行转化 更高级植物之前，叶绿体表达载体被首先在大肠杆菌中进行对草甘磷抗 性的试验。在含10mM和40mM草甘磷的条件下，含烟草载体的大肠 杆菌比含载体pZS197载体(与载体pZS-RD-EPSPS相似但缺失EPSPS 基因)的大肠杆菌生长较快。表明耐草甘磷的大肠杆菌表达了EPSPS 基因(图23A)。另一个生长曲线(图23B)，证实EPSPS通过通用载体 在大肠杆菌中得到了表达。这样，大肠杆菌对草甘磷的耐性可归因于 在烟草和通用载体中EPSPS基因的表达。 烟草转基因植物的特征

基因整合  用烟草和通用叶绿体载体轰击充分展开的烟草叶片 (Nicotiana tabaccum var.Petit Havana.).轰击两天后，叶片外植体被 转移到含500ug/ml的壮观霉素选择性致死培养基上。在轰 击3-5个月内获得转基因植物。非常典型地，从16个轰击过的叶片中， 有10个芽被证实是单独转化形成的。

从第一代或第二代的芽及成熟的转基因植株中分离DNA作PCR 分析。引物被用于证实烟草和通用载体上的aadA基因对植物基因组 的整合。缺乏一种产物将意味着自发突变体，它们能够在没有aadA 基因的情况下在壮观霉素选择性培养基上生长。烟草载体转化的植株 中有6个转基因株系得到预期的PCR产物(887bp)(见图24A-B，泳道1- 6)。通用载体转化的植株中有4个株系检测到1.57kb的PCR产物(图 24A-B，泳道1-4)。在选择性条件下，从烟草载体转化的10个植株中检 测到4个突变体，而另一方面，所有的通用载体的转基因株系均显示整 合了aadA基因。

PCR叶绿体整合引物也被设计为特异性地验证整合进质体基因 组。这个策略是将一个引物着落到本身的叶绿体基因组临近载体的整 合位点，另一个引物则着落在aadA基因上。一个引物被设计为立即着 落在烟草载体的rbcL基因外(2.08kb PCR产物)。对通用载体，着落在 本身叶绿体基因组中的引物是着落在16srRNA基因上。(1.60kb PCR 产物)。预期的产物能从所获得的用烟草载体(图24A-B泳道2-7)和通 用载体转化(图24A-B泳道1-4)的转基因株系中观察到。未经轰击的 植物(对照)，正如所预期的，没有产生任何PCR产物(图24A，泳道1和9； 24B，泳道5和11)。这样，所有检测过的转基因植物都是叶绿体而不 是细胞核转化子的结果。这可能是在极度选择条件下，氨基糖苷腺苷转 化酶AADA在转基因植物中需要表达的水平较高。在核转移植物中 AADA的含量很低应已排除掉可能存在核转化子。PCR分析的结果是 结论性质的，其明确证明应用烟草和通用载体，叶绿体整合了外源基 因。

Southern杂交分析Southern杂交也证实了aroA基因与叶绿体 的整合。另外，也能通过确定转基因植物中外源基因的拷贝数来证实观 察到的对草甘磷的高水平抗性(图20A)。确定外源基因整合进叶绿体 基因组的探针包含654bp EPSPS基因片段，P32标记的随机引物。用 EcoRI消化含有细胞器和基因组的总DNA。在叶绿体基因组整合位点 上游200bp处的EcoRI位点的存在，被用来证明在转基因植物中EPSPS 基因整合进叶绿体基因组。可在4.5kb片段处看到探针与核基因组中 原始EPSPS基因杂交。另外，探针杂交到经消化过的转基因烟草的叶 绿体基因组，生成3.5kb和4.35kb片段(见图25A的2、3、4泳道)。因 为烟草叶绿体基因组没有外源基因，探针不与经消化过的未转化植株叶 绿体基因组杂交。(见图25A的1泳道)。这清楚地确立了EPSPS基因 与叶绿体基因组的整合。

基因拷贝数量整合基因的拷贝数量可以通过建立转基因叶绿体 基因组的同型异源性来确定。烟草叶绿体在每个细胞中大约有5000- 10,000个拷贝数的叶绿体基因组(McBride et.al，1995)。如果仅仅有一 部分基因组能被转化，假使有错，拷贝数量一定少于10,000。如通过转 基因建立EPSPS转化过的基因组仅有一个，这一个转化子在一个细胞 中能得到5000-10,000个拷贝。通过用EcoRI内切总DNA，用侧翼序 列(能使外源基因同源重组到叶绿体基因组)作标记探针。该探针包 含有一段位于rbcL-orf512区域，长度为2.9kb的片段。用EPSPS基 因转化的叶绿体基因组，在叶绿体基因组的rbcL-orf 512区域整合了 一个EcoRI位点，因此当用EcoRI酶切时多出了一个外源片段(见图 25C)。Southern杂交分析揭示的图25B，第1泳道的一个4.43KB片 段是未转化的对照。在第2，3，4泳道，有4.35kb和3kb长的两个 片段。这两个片段的产生是由于把EPSPS基因盒整合进了rbcL和 orf512之间的区域(图25C一个用灰色点线代表外源DNA整合位点 的图解)。在转基因植物中没有对照植株中的4.43KB片段。这说明， 在细胞中只存在有转基因的叶绿体基因组，而不带有其本身的、未转 化的叶绿体基因组，不带有EPSPS基因由此建立了转化子同型异源 性，同时在每个细胞中有大约5000-10,000个外源DNA拷贝。这得以 解释转基因烟草植物对草甘磷耐性的高水平表达(见图20A)。

后代收集自花授粉的转基因植物的种子。种子在含有壮观霉素 (500μg/ml)的条件下萌发。所有种子均萌发并保持正常的绿色及生 长状态(图26B)。同一的壮观霉素抗性表明aadA基因被传给了所 有后代。后代花斑的缺少暗示同型异源性，因为一个异质条件可导致 在壮观霉素条件下出现花斑后代。(Svab et al。，1990；Svab and Maliga， 1993)。后代中缺乏叶绿素色素形成的变化也强调不存在位置效应， 这是一个核转化假象。所有对照株种苗均是脱色了的，壮观霉素存在 下都没有生长(图26A)。

草甘磷抗性用0.5-5mM不同浓度的等体积草甘磷喷洒生长了18 周的对照和转基因植株。对照烟草植株对草甘磷极度敏感，即使在 0.5mM草甘磷的情况下也于7天内死亡(图27B)。另一方，叶绿体 转基因烟草植株在高达5mM草甘磷时仍然能够存活(图27A)。考 虑到在叶绿体载体中使用的EPSPS基因来自矮牵牛，对草甘磷的耐性 水平较低，也含有转运多肽以利于靶向叶绿体，这些结果显然非常有 意义。

这是真核生物的核基因在原核细胞叶绿体区室表达的第一例报 告。众所周知，密码选择在原核细胞叶绿体区室和真核细胞细胞核区 室之间有显著差异。理论上讲，从原核细胞系统来的aroA突变基因 (不与草甘磷结合)应当在叶绿体区室表达。现在已经有这种基因， 而且这种基因对草甘磷抗性水平的表达程度比本研究中所用的来自矮 牵牛的基因大一千倍。按照这种意见，有可能将原核细胞的除草剂抗 性基因整合入本研究中的叶绿体基因组，有可能导致抗除草剂基因难 以置信的高水平的表达，同时仍然保持生物防范作用效力如避免花粉 传播。 实施例12

玉米对草甘磷的耐性下述是利用玉米叶绿体DNA构建通用的 叶绿体载体的方法：首先，按下述步骤构建pSBL-Ct-bor载体(图5C)： 用细菌质粒pUC19构建含一个反向重复区的玉米叶绿体DNA亚克 隆。第二步，从第一次亚克隆中构建只包含rRNA操纵子的一个更小 的亚克隆，把第二次亚克隆中含有trnA，trnI基因及代表通用边缘的 间隔区域的这段DNA片段再亚克隆到pUC19质粒PvuII位点。最终 质粒被命名为pSBL-Ct-bor。在质粒pSBL-Ct-bor中，含有一个带选择 性标记的基因盒，该盒包含叶绿体16sRNA启动子和aadA基因(编 码赋予四环素/壮观霉素抗性的氨基糖苷3’腺苷转移酶)，叶绿体psbA 基因3’末端的未翻译区被插入到构建的pSBL-CORN载体。选择性 标志基因盒被插入间隔区的trnI和trnA基因，其方向与16sDNA转录 方向一致。

pSBL-CORN-aroA载体含有一个来自Salmonella typhimurium (stalker等，1985；loma，等，1983)aroA突变基因aroA基因编码EPSPS 合成酶。该载体是通过把突变aroA基因插入pSBL-CORN载体而构建 成的。表达突变aroA基因的转基因玉米能够抵抗草甘磷(如除草剂 RoundupTM)，而未转化的对照则不能。 实施例13

耐咪脞酮类IMIDIZOLINONES、磺酰尿类Sulfonvlureas的叶绿 体转化。质粒pSBL-CORN经插入Saccharomyces erevisiae的乙酰乳 酸合成酶基因的突变型DNA片段(Falco and Dumas，1985；Yadav et al。1986)改造为质粒pSBL-CORN-ASL1。该基因编码的乙酰乳酸合 成酶不受咪唑啉酮类或磺酰脲类除草剂的抑制，从而赋予了对含嘧黄 隆(sulfometuron methyl)的除草剂和含灭草烟除草剂的耐受性。表达 突变乙酰乳酸合成酶基因的转基因烟草植株能抵抗咪唑啉酮类及磺酰 脲类除草剂的喷洒。

载体pSBL-CORN-ALS2派生于pSBL-CORN，该载体含有数个 拷贝的烟草suRA和suRB突变基因(Chaleff and Ray.1984)。这些 基因编码烟草乙酰乳酸合成酶多肽。载体pSBL-CORN-ALS2是通过连 接从烟草DNA分离的suRA和suRB基因到载体pSBL-CORN而构成 的。最后载体具有抗咪唑啉酮类和磺酰脲类除草剂的特性。 实施例14

耐光系统II阻遏物的叶绿体转化光系统II除草剂抗性出现自 psbA基因内的突变，QB蛋白被包围。在很多植物中都具有保守性。 抗性植物具有的突变改变了QB蛋白内特定位置的氨基酸，如219， 251，255，264，和275号残基(Hirschberg and McIntosh.1993；Glloway and Mets.1984；Gloden and Haselkorn.1985；Erickson et al.1984； Johanningmeier et al.1987)。基因具有的这些突变可以被利用来通过 阻止光合作用光系统II电子转移的完成以赋予对除草剂的抗性。

这些除草剂样品包括：二氯苯二甲基脲(DCMU)，莠去净，草 克净，环草定，苯敌草，loxynil及地乐酚。

用适当的限制性内切酶酶切衣藻基因组DNA，分离得到在264 残基端发生丝氨酸到甘氨酸突变的PsbA突变基因。突变基因片段连 接到通用的叶绿体表达载体pSBL-ctV2，转化大肠杆菌E。Coli XL1Blue。用从该大肠杆菌中纯化得到的质粒来转化植物Daniell (1997)。psbA突变基因掺入进叶绿体基因组，合适的转化子的筛 选按前述方法完成。转化植物产生突变的psbA蛋白包括丝氨酸被甘 氨酸替代，从而能抵抗除草剂莠去净AtrazineTM，对照植物却不能。

用适当的限制性内切酶酶切衣藻基因组DNA，分离得到在219 端发生缬氨酸到异亮氨酸突变的psbA突变基因。同上述方法构建一 个通用载体。转基因植物如玉米表达了在219残基端发生缬氨酸到异 亮氨酸的突变的psbA突变基因，因而可以期望产生对除草剂DCMU 的耐性。 实施例15

对2，4-D类植物激素的耐性用XbaI酶切通用表达载体psbL- ctV2，然后与含编码单加氧酶基因的DNA片段连接。构建的载体被 转化进叶绿体中得到含多个拷贝单加氧酶基因的转基因植物。转基因 植物高效表达单加氧酶，期望也能具有对2，4-D的耐性。 实施例16

抗虫的叶绿体转化用含cryIIA基因并能表达CryIIA蛋白的通用 载体pSBL-CtVHBt(图8)转化烟草，获得对螟蛾类昆虫的抗性，如 烟草天蛾。尽管一些昆虫已形成对Bt毒性蛋白的抗性或对Bt毒性蛋 白已不太敏感，但用本文所说的叶绿体载体基因所表达的Bt毒性蛋 白能杀死这些昆虫。

用SmaI酶切载体pSBL-CtVH，产物与编码CryIIA毒性蛋白的 基因连接，构建出载体pSBL-CtVHBt。产物中所含的cryIIA基因在正 确的转录方向(图8A)。

用PCR分析方法证实了CryIIA基因已被整合到烟草叶绿体基因 组。Southern印迹方法估计出每个细胞中的cryIIA基因的拷贝数达 10,000。用Western印迹方法估计CryIIA晶体蛋白约占细胞总蛋白的 5％-10％。在所有转Bt基因植物的报告中，这例晶体蛋白表达的效率 最高。用未转化的Petit Havana烟草和cryIIA基因转化的烟草作离体 叶片生物测定。每片叶上放置5-10只幼虫，3-5天后测定死亡率和叶 片的损失。用敏感的烟草夜蛾H.Virescens(YDK)昆虫作试验，在 转cryII-A基因的烟草上所有幼虫在3天内死亡，而在未转化的Petit Havana烟草上，没死一只幼虫，叶片基本上100％脱落。用抗CryIAc (YHD2，40-50,000倍抗性)，抗CryIIA(CXC，2000倍抗性)的 H.Virescens昆虫试验，得到了相似的结果。另外，用棉铃虫谷实夜 蛾，甜菜夜蛾Spodoptera exigua做试验，也观察到100％的致死率， 而没有一种以前见过被任何晶体毒蛋白杀死。

图28A和28B显示一种生物测定，A为对照未转化植物，B为 转基因植物。测试的昆虫显示100％死亡：烟草夜蛾对CryI敏感，棉 铃虫和甜菜夜蛾抗CryI和CryII。

图29显示从对照(C泳道)和转基因植物(B泳道)中用Western 印迹分析方法分离到的总蛋白。D-H泳道代表不同浓度的纯CryIIA蛋 白(1-20％)。A泳道显示标准蛋白。

其他对照昆虫的描述见本项发明较前部分的叙述。

按照前面的描述，许多修饰，改变，替代没有离开本发明的精神 或范围，在发明实践中都是可行的，就那些本领域的技术人员而言， 这将是显而易见的。因此，这些修饰、改变、替代意欲被要求列入本 申明保护的范围。

所引用的全部文献明确地列于此处。

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