肝脏特异性转录调控序列及其应用
阅读：964发布：2020-05-11
专利汇可以提供肝脏特异性转录调控序列及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种肝脏特异性转录 调控序列 。具体地，本发明提供了一种可以驱动增强下游基因在肝脏细胞中的特异性表达的调控序列，该调控序列包含 白蛋白 和转甲状腺素蛋白的调控序列，可以用于在肝脏细胞中特异性的表达 治疗 性基因，如凝血因子IX基因，对于经 肝细胞 表达的 基因治疗 策略都具有非常重要的意义。，下面是肝脏特异性转录调控序列及其应用专利的具体信息内容。
1.一种分离的肝脏特异性转录调控序列，其特征在于，所述的调控序列包含白蛋白调控序列和转甲状腺素蛋白调控序列，所述的白蛋白调控序列包括转录因子HNF-1和C/EBP的结合位点，所述的转甲状腺素蛋白调控序列包括转录因子HNF-1、HNF-3、HNF-4、和C/EBP的结合位点；
所述的肝脏特异性转录调控序列为如SEQ ID NO.:1所示的多核苷酸。
2.一种核酸构建物，其特征在于，所述的构建物含有外源基因或外源DNA片段，以及与所述的外源基因或DNA片段可操作连接的权利要求1所述的调控序列。
3.如权利要求2所述的构建物，其特征在于，所述的外源基因选自下组：治疗基因、筛选标记基因、抗性基因、抗原蛋白基因、RNAi基因、microRNA基因、或其组合。
4.如权利要求3所述的构建物，其特征在于，所述的治疗基因选自下组：人凝血因子IX基因、人凝血因子VIII、人α1-抗胰蛋白酶、人芳基硫酸酯酶B(ARSB)基因、人低密度脂蛋白受体(LDLR)基因、或其组合。
5.如权利要求4所述的构建物，其特征在于，所述的凝血因子IX基因包括野生型凝血因子IX基因和突变型凝血因子IX基因。
6.如权利要求5所述的构建物，其特征在于，所述的突变型凝血因子IX基因包括(i)密码子优化的凝血因子IX基因，和(ii)点突变凝血因子IX基因，其中所述的点突变凝血因子IX基因编码的多肽在对应于野生型凝血因子IX的第338位精氨酸突变为亮氨酸。
7.如权利要求6所述的构建物，其特征在于，所述密码子优化的凝血因子IX基因的序列如SEQ ID NO.:2所示。
8.如权利要求6所述的构建物，其特征在于，所述的点突变凝血因子IX基因的序列如SEQ ID NO.:3所示。
9.一种载体，其特征在于，所述的载体含有权利要求2所述的构建物。
10.如权利要求9所述的载体，其特征在于，所述的载体为慢病毒载体、腺相关病毒载体。
11.如权利要求10所述的载体，其特征在于，所述的载体为AAV8载体。
12.一种宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞中含有权利要求9所述的载体或染色体中整合有外源的权利要求1所述的调控序列或权利要求2所述的构建物。
13.如权利要求12所述的宿主细胞，其特征在于，所述细胞为人或非人哺乳动物细胞。
14.权利要求1所述的调控序列、权利要求2所述的构建物或权利要求10所述的载体的用途，其特征在于，用于制备一制剂或组合物，所述的制剂或组合物用于调控外源基因或外源DNA片段在肝脏细胞或肝脏组织中进行特异性表达。
15.权利要求1所述的调控序列的用途，其特征在于，用于构建一表达载体，所述的表达载体用于在肝脏细胞或肝脏组织中特异性表达外源基因。
16.一种药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物含有权利要求10所述的载体和药学上可接受的赋形剂。
肝脏特异性转录调控序列及其应用
技术领域
[0001] 本发明涉及基因工程领域，更具体地涉及一种肝脏特异性转录调控序列及其应用。
背景技术
[0002] 血友病B(Hemophilia B,HB)属于单基因遗传性疾病，是染色体Xq27.1上的人凝血因子IX编码基因(hF9)缺陷所致的性染色体连锁遗传性出血性疾病，在全球男性中发病率约1/25000。正常的人F9基因全长约34kb，其中编码序列cDNA长度为1383bp，位于X染色体长臂末端Xq27.1-q27.2区域，包含8个外显子和7个内含子。人F9基因缺陷导致血浆中FIX蛋白缺失或功能障碍是导致血友病B的根本病因。目前，血友病患者的主要治疗措施是进行替代治疗(protein replacement therapy,PRT)，包括预防性或治疗性反复输注重组凝血因子IX或血浆制品等。这些治疗措施虽然在一定程度上改善了患者的生存率和生活质量，然而不具备治愈性。与此同时，长期治疗的昂贵费用($100-300,000/年)以及输血或静脉注射引发的感染等并发症都给患者带来诸多弊端。
[0003] 基因治疗是当前最有潜力治愈血友病的策略之一。通过基因克隆和转移技术，可以有效的把治疗基因转移到基因缺陷细胞以长期稳定地表达功能正常的凝血因子，恢复患者的正常凝血功能，从而达到终身治愈的目的。结合目前血友病基因治疗的基础研究和临床试验进展，发展相对比较成熟的最具有治愈潜力的技术是以腺相关病毒载体(adeno-associated virus，AAV)进行体内基因治疗(In vivo gene therapy)。
[0004] 2011年和2014年相继发表的世界首例血友病B基因治疗临床试验报道了AAV载体介导基因治疗在10名重症HB患者中取得的显著疗效，部分患者临床症状明显缓解，中断或减少hFIX因子替代品的使用。尽管如此，大多数患者体内的hFIX水平只能达到正常人的1-6％，在高、中、低三个组别中，主要是高剂量组及部分中剂量组的患者取得了较好的临床效应，但相对于>30％的彻底治愈标准还有一定距离。在此临床试验中效果有限的主要原因为：
[0006] (2)临床试验制剂的生产工艺有待进一步提高，以提高实体病毒颗粒的比例，降低空壳病毒的污染；
[0008] 综合以上，进一步改进优化基因治疗血友病B的生物载体并进行临床转化，对于填补国内在此领域的空白有非常重要的意义。
发明内容
[0009] 本发明的目的在于提供一种肝脏特异性转录调控序列及其应用。
[0010] 本发明的另一目的在于提供一种包含肝脏特异性转录调控序列的腺相关病毒载体，该腺相关病毒载体可以用于血友病的基因治疗。
[0011] 在本发明的第一方面，提供了一种分离的肝脏特异性转录调控序列，其特征在于，所述的调控序列包含白蛋白调控序列和转甲状腺素蛋白调控序列。
[0012] 在另一优选例中，所述的白蛋白调控序列包括转录因子HNF-1和C/EBP的结合位点。
[0013] 在另一优选例中，所述的转甲状腺素蛋白调控序列包括转录因子HNF-1、HNF-3、HNF-4、和C/EBP的结合位点。
[0014] 在另一优选例中，所述的转录因子为肝脏特异性转录因子。
[0015] 在另一优选例中，所述的肝脏特异性转录调控序列为任选自下组的多核苷酸：
[0016] (a)核苷酸序列如SEQ ID NO.:1所示的多核苷酸；
[0017] (b)核苷酸序列与SEQ ID NO.:1所示序列的同源性≥90％(较佳地≥95％，更佳地≥98％，最佳地≥99％)，且具有肝脏特异性转录活性的多核苷酸；
[0018] (c)如SEQ ID NO.:1所示多核苷酸的5’端和/或3’端增加和/或减少1-50个(较佳地1-20，更佳地1-10个，更佳地1-5个)核苷酸，且具有肝脏特异性转录活性的多核苷酸。
[0019] 在另一优选例中，所述的肝脏特异性转录活性是指驱动下游DNA片段在肝脏细胞中特异性转录的活性。
[0020] 在另一优选例中，所述的“在肝脏细胞中特异性转录”指在所述肝细胞中的转录活性(或转录量)Z1与在非肝脏细胞(如成纤维细胞)中的转录活性(或转录量)Z2之比(Z1/Z2)≥2，较佳地≥5，更佳地≥10。
[0021] 在另一优选例中，选自(b)或(c)的多核苷酸保留了SEQ ID NO.:1所示的多核苷酸的肝脏特异性转录活性的至少≥50％，≥60％，≥70％，≥80％，≥90％、≥100％。
[0022] 在另一优选例中，所述的调控序列为人工重组调控序列。
[0024] 在本发明的第二方面，提供了一种核酸构建物，其特征在于，所述的构建物含有外源基因或外源DNA片段，以及与所述的外源基因或DNA片段可操作连接的本发明第一方面所述的调控序列。
[0025] 在另一优选例中，所述的外源基因选自下组：治疗基因、筛选标记基因、抗性基因、抗原蛋白基因、RNAi基因、microRNA基因、或其组合。
[0027] 在另一优选例中，所述的凝血因子IX基因包括野生型凝血因子IX基因和突变型凝血因子IX基因。
[0028] 在另一优选例中，所述的突变型凝血因子IX基因包括(i)密码子优化的凝血因子IX基因，和(ii)点突变凝血因子IX基因，其中所述的点突变凝血因子IX基因编码的多肽在对应于野生型凝血因子IX的第338位精氨酸突变为亮氨酸。
[0029] 在另一优选例中，所述密码子优化的凝血因子IX基因的序列如SEQ ID NO.:2所示。
[0030] 在另一优选例中，所述的点突变凝血因子IX基因的序列如SEQ ID NO.:3所示。
[0031] 在本发明的第三方面，提供了一种载体，其特征在于，所述的载体含有本发明第二方面所述的构建物。
[0032] 在另一优选例中，所述的载体为质粒、病毒载体。
[0033] 在另一优选例中，所述的载体为慢病毒载体、腺相关病毒载体。
[0034] 在另一优选例中，所述的载体为AAV载体，优选地为AAV8载体。
[0035] 在另一优选例中，所述的载体为AAV8载体，并且所述载体(的一侧)具有本发明第八方面所述的突变的ITR序列。
[0036] 在本发明的第四方面，提供了一种宿主细胞，所述的宿主细胞中含有本发明第三方面所述的载体或染色体中整合有外源的本发明第一方面所述的调控序列或本发明第二方面所述的核酸构建物。
[0037] 在另一优选例中，所述细胞为分离的细胞，和/或所述细胞为基因工程化的细胞。
[0038] 在另一优选例中，所述细胞为人或非人哺乳动物细胞。
[0039] 在另一优选例中，所述细胞为肝脏细胞。
[0040] 在本发明的第五方面，提供了本发明第一方面所述的调控序列、本发明第二方面所述的核酸构建物或本发明第三方面所述的载体的用途，其特征在于，用于制备一制剂或组合物，所述的制剂或组合物用于调控外源基因或外源DNA片段在肝脏细胞或肝脏组织中进行特异性表达。
[0041] 在本发明的第六方面，提供了本发明第一方面所述的调控序列的用途，其特征在于，用于构建一表达载体，所述的表达载体用于在肝脏细胞或肝脏组织中特异性表达外源基因。
[0042] 在另一优选例中，所述的外源基因包括结构基因、非结构基因(如编码反义RNA、miRNA或siRNA的非结构基因)。
[0043] 在本发明的第七方面，提供了一种药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物含有本发明第三方面所述的载体和药学上可接受的赋形剂。
[0044] 在另一优选例中，所述的药物组合物的剂型为口服剂型、或注射剂。
[0045] 在本发明的第八方面，提供了一种突变的ITR序列(末端反向重复序列)，所述突变的ITR序列含有106个碱基，与3’端野生型ITR序列(SEQ ID NO.:5)的第25位至第130位之间的碱基序列相同或者互补。
[0046] 在另一优选例中，所述突变的ITR序列删除了野生型ITR序列的对应于SEQ ID NO.:5的第1-24位(5’端)和第131-145位(3’端)。
[0047] 在另一优选例中，所述突变的ITR序列如SEQ ID NO.:4所示。
[0048] 在另一优选例中，所述突变的ITR序列为与SEQ ID NO.:4互补的碱基序列。
[0049] 在本发明的第九方面，提供了一种载体，其特征在于，所述的载体含有本发明第八方面所述的ITR序列。
[0050] 在另一优选例中，所述的载体为质粒、病毒载体。
[0051] 在另一优选例中，所述的载体为慢病毒载体、腺相关病毒载体。
[0052] 在另一优选例中，所述的载体为AAV载体，优选地为AAV8载体。
[0053] 在另一优选例中，所述的AAV载体的5’ITR序列为本发明第八方面所述的突变的ITR序列。
[0054] 在另一优选例中，所述的AAV载体的3’ITR序列为本发明第八方面所述的突变的ITR序列。
[0056] 图1显示了经群体分析在血友病B患者中鉴别诊断的1113种基因突变类型，以及这些突变在人凝血因子9(hF9)基因外显子、内含子和UTR区域的分布。其中，各代码含如下：E，外显子；Int，内含子；UTR，上游调控区域。
[0057] 图2显示了野生型AAV病毒和AAV载体示意图。
[0058] 图2A显示了野生型AAV载体是直径为20-25nm的无包膜DNA病毒，内含长约4.7kb的单链DNA基因组。AAV基因组有两组编码基因，rep基因编码病毒复制和组装所需蛋白，cap基因编码3种蛋白以形成60-mer的病毒包壳。AAV载体的外壳蛋白与野生型AAV病毒的一致或非常类似，内含具有转录驱动元件的治疗相关表达基因。AAV载体的分子重量中有74％由蛋白组成，最大DNA的携带量为5kb。
[0059] 图2B显示了野生型AAV病毒经改造为重组AAV载体，其中病毒自身编码基因被治疗性基因取代。
[0060] 图3显示了AAV载体介导特异性靶向肝细胞生成凝血因子基因治疗血友病B示意图。
[0061] 图4显示了AAV载体结构图及hFIX编码序列优化前后比较。
[0062] 图4A显示了AAV载体结构示意图。
[0063] 图4B显示了人FIX编码序列优化前后比较，包括优化参数(左)、GC含量(中)、以及cDNA二级结构(右)。
[0064] 图5显示了序列优化人FIX cDNA有助于提高hFIX在HB小鼠体内的活性和蛋白水平。
[0065] 图5A显示了ELISA方法测定hFIX抗原水平的结果。携带野生型hFIX，优化型hFIX(cohFIX)，或优化型hFIX阳性对照(+ve ctrl)表达框架的DNA质粒经高压注射方式进入血友病B小鼠(HB)体内。小鼠血浆于48小时后采集并通过ELISA方法测定hFIX抗原水平。结果以均数±标准差表示。
[0066] 图5B和图5C分别显示了ELISA方法测定hFIX活性和抗原水平的结果。携带GFP，优化型hFIX(cohFIX)，或优化型hFIX阳性对照(+ve ctrl)表达框架的AAV8载体通过尾静脉注射方式进入HB小鼠。从第一周开始，小鼠血浆每隔四周采集一次，其中hFIX活性和抗原水平分别通过发色底物法和ELISA法进行测定，结果表示为均数±标准差。
[0067] 图6显示了携带高凝血活性突变hFIX cDNA有助于有效降低AAV载体的生物剂量。表达hFIXR338L突变体的AAV8载体通过尾静脉注射方式进入HB小鼠。从第一周开始，小鼠血浆每隔四周采集一次，其中hFIX活性和抗原水平分别通过发色底物法和ELISA法进行测定，结果表示为均数±标准差。
[0068] 图7显示了凝胶电泳分析双链AAV载体和单链AAV载体结果。其中ITRm1是含Nathwani等发表的载体中ITR结构，ITRm2内含本项目中改造的ITR突变结构，两者均介导形成含有双链DNA核心的载体(scAAV)。ITR对照内含对照型ITR结构，经包装形成含单链DNA核心的载体(ssAAV)。AAV载体在碱性胶电泳下可保留其单/双链结构，表现为单链或双链的分子量；而在非变形胶中scAAV的双链结构被破坏，从而全部表现为单链DNA的分子量。
[0069] 图8显示了肝脏特异性调控元件活性在HB小鼠体内比较。携带不同肝脏特异性调控序列的cohFIX表达框架的AAV载体经尾静脉注射进入血友病B小鼠(HB)体内。从注射后一周开始，小鼠血浆每隔四周采集一次，其中hFIX活性和抗原水平分别通过发色底物法和ELISA法进行测定，结果表示为均数±标准差。
[0070] 图9显示了携带pSyn.cohFIX表达框架的AAV8载体在HB小鼠体内进行剂量增高试验。AAV载体分别按照高(2×1012/kg/只)、中(4×1011/kg/只)、和低(1×1011/kg/只)三种不同的剂量经尾静脉输入HB小鼠体内(n＝3～6)。AAV.GFP载体(2×1012/kg/只)被用于作为阴性对照。小鼠于注射后第一周及每隔四周采集血浆一次，hFIX的血浆活性和抗原水平分别通过发色底物法和ELISA法进行测定，结果表示为均数±标准差。
[0071] 图10显示了AAV载体剂量增高试验中，各组HB小鼠肝脏、脾和胸腺组织中的RNA表达水平比较。在注射了不同剂量AAV载体后第12周，各组小鼠有2-3只采集肝、脾、及胸腺组织提取RNA，并逆转录生成cDNA。通过real-time PCR半定量测定hFIX及内参GAPDH的cDNA水平，比较各组织中RNA的水平差异。人凝血因子IX的RNA水平表示为相对RNA拷贝数(2-Δ(hFIX-GAPDH))。结果显示为个体小鼠数据及均数±标准差。
[0072] 图11显示了AAV载体在剂量增高试验中各组小鼠组织脏器中的生物性分布。剂量增高试验中各组小鼠2-3只在注射AAV载体后12周采集肝、脾、及胸腺组织提取RNA肝、脾，及胸腺组织中的DNA，通过real-time PCR半定量测定AAV载体DNA在各组织细胞中的浓度。结果显示为均数±标准差。
[0073] 图12显示了剂量增高试验中各组小鼠肝功能指标测定。各组小鼠2-3只在注射AAV载体前，及注射后第4和12周采集的血浆经过发色底物法测定AST和ALT的浓度，结果显示为均数±标准差。
[0074] 图13显示了剂量增高试验中各组小鼠高凝血活性指标测定。各组小鼠2-3只在注射AAV载体前，及注射后第4和12周采集的血浆经过ELISA方法检测D二聚体的浓度，结果显示为均数±标准差。
具体实施方式
[0075] 本发明人经过广泛而深入地研究，首次意外地发现一种肝脏特异性转录调控序列，其可以驱动增强下游基因在肝脏细胞中的特异性表达。实验表明，本发明的调控序列可以增强外源基因(如人凝血因子IX等)在肝脏细胞中的特异性表达，其转录调控效率高(已经在血友病B小鼠模型进行了验证)。本发明的调控序列还可用于在肝脏细胞中特异性地表达其他治疗性基因，对于经肝细胞表达的基因治疗策略都具有非常重要的意义。
[0076] pSyn调控序列
[0077] 如本文所用，术语“调控序列”、“转录调控序列”、“pSyn调控序列”可互换使用，是指一种准确有效起始基因转录功能的核酸序列。本发明的所述的调控序列包括来源于白蛋白、转甲状腺素蛋白的转录调控序列。优选地，所述的调控序列为任选自下组的多核苷酸：
[0078] (a)核苷酸序列如SEQ ID NO.:1所示的多核苷酸；
[0079] (b)核苷酸序列与SEQ ID NO.:1所示序列的同源性≥90％(较佳地≥95％，更佳地≥98％，最佳地≥99％)，且具有肝脏特异性转录活性的多核苷酸；
[0080] (c)如SEQ ID NO.:1所示多核苷酸的5’端和/或3’端增加和/或减少1-50个(较佳地1-20，更佳地1-10个，更佳地1-5个)核苷酸，且具有肝脏特异性转录活性的多核苷酸。
[0081] pSyn调控核苷酸序列可以驱动增强下游基因在肝脏细胞中的特异性表达。在本发明中，主要用于增强人凝血因子IX在肝脏细胞中的特异性表达，其转录调控效率和其他肝脏转录调控序列已经在血友病B小鼠模型中进行了比较。除了应用于血友病B的基因治疗外，pSyn调控序列还可用于在肝脏细胞中特异性的表达其他治疗性基因。因此，此段序列对于经肝细胞表达的基因治疗策略都具有非常重要的意义。
[0082] 在本文中，所述的调控序列包括SEQ ID NO.:1所示调控序列的变体，所述变体可以通过插入或删除调控区域，进行随机或定点突变等来获得。
[0083] 本发明还包括与本发明的调控序列具有50％或以上(优选60％以上，70％以上，80％以上，更优选90％以上，更优选95％以上，最优选98％以上，如99％)同源性的核酸，所述核酸也具有特异性调控启动植物地上组织表达的功能。“同源性”是指按照位置相同的百分比，两条或多条核酸之间的相似水平(即序列相似性或同一性)。
[0084] 如本文所用，术语“特异性表达”是指目的基因在特定的时间和/或特定的组织的表达。
[0085] 如本文所用，“外源的”或“异源的”是指不同来源的两条或多条核酸或蛋白质序列之间的关系。例如，如果启动子与目的基因序列的组合通常不是天然存在的，则启动子对于该目的基因来说是外源的。特定序列对于其所插入的细胞或生物体来说是“外源的”。
[0086] 本发明的启动子可以被可操作地与外源基因连接，该外源基因相对于启动子而言可以是外源(异源)的。本发明所述的外源基因(也称为目的基因)没有特别的限制，优选的外源基因为经肝细胞表达的用于基因治疗的外源基因，如人凝血因子IX基因。
[0087] 本发明还提供了包含所述调控序列的核酸构建物和载体。用于制备重组载体的方法是本领域普通技术人员所熟知的。表达载体可以是细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。一种特别优选的载体为AAV8病毒。
[0088] 本领域普通技术人员可以使用熟知的方法构建含有本发明所述的启动子和/或目的基因序列的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。
[0089] pSyn调控序列的构建
[0090] 为了提高AAV载体介导基因治疗的疗效，对转录调控元件进行了筛选优化。在肝细胞定向基因治疗中，尽管AAV8等病毒载体对肝脏组织具有亲和性并且可以成功感染组织细胞，但也有一定可能感染其他一些非肝脏细胞，结构将产生脱靶表达及相应的不良反应。因此设计筛选的调控元件首要要求是具备肝细胞特异性调控作用。此外，基于双链互补型AAV载体的包装容量只有野生型的一半，为了成功地组装成病毒实体颗粒，调控元件也需要包含尽可能少的碱基数，否则将超过病毒颗粒的包装容量而生成无效产品。转录调控序列主要包含启动子和增强子。启动子负责RNA聚合酶的识别及结合，而增强子包含促进调控转录因子的结合位点，可以增加下游基因的转录效应。
[0091] 在Nathwani等进行的临床试验中，hFIX序列的调控元件是由人载脂蛋白E肝脏特异性控制区(Human apolipoprotein E-Hepatocyte Control Region,ApoE-HCR)组为增强子，与人α抗胰蛋白酶的启动子组合形成的复合结构序列，并且为了适应AAV的包装容量调整了大小。携带此调控元件的载体属于在肝脏组织中表达效率最强的载体之一，并且成功地在临床试验中体现了一定疗效。然而，这种表达水平只是使患者的表型得到了一定程度缓解，并未完全达到治愈的标准。
[0092] 为了能够获得更高临床疗效水平的肝脏特异性基因表达，在肝脏特异性基因启动子数据库(The Liver Specific Gene Promoter Database)中进行了检索(http://rulai.cshl.org/LSPD/index.html)。在肝细胞高效特异表达的蛋白中，白蛋白(Albumin)是其中最主要成员之一。由此可见，白蛋白的增强子和启动子具备较多的肝脏特异性调控元素，从而与肝脏细胞中的转录调控系统联系密切。白蛋白的启动子包括转录起始位点至上游217bp之间区域，其序列中包含有不同转录因子的结合位点(表5)，例如肝脏特异性转录因子HNF-1(Hepatocyte nuclear factor 1)(LF-B1,PAF,AFP1)、C/EBP、CTF/NF1、C/EBP和DBP等。而在人白蛋白基因5’端的上游区域至少存在三个增强子，包括启动子上游约-265bp，-1.7kb，以及-6kb区域。这些富含AT和GC区域均属于转录因子，如HNF-1等的主要结合位点，这种蛋白-DNA相互作用对于下游基因的转录具有明显促进的作用。
[0093] 表5.白蛋白和甲胎蛋白基因的启动子和增强子中富含AT和GT序列的区域[0094]
[0095] 转甲状腺素蛋白(transthyretin，TTR)，又称前白蛋白(prealbumin)，也是主要在肝细胞内合成生产的蛋白之一。小鼠TTR基因的启动子长度包含从转录起始位点至5’上游202个碱基对的区域，其中从-108至-202区域属于TTR在肝脏细胞中特异性转录表达必需区域。此外，在5’上游介于-1.86kb至-1.96kb之间有约100bp的DNA片段具有很强的增强子作用，在肝癌细胞株中可以促进近端启动子驱动下的表达效率增强5～10倍。经鉴定，在TTR的启动子和增强子区域包含至少有4种不同转录因子的结合位点，如HNF-1、HNF-3、HNF-4、以及C/EBP等。这些因子大部分属于肝脏特异性转录因子，对于促进下游基因在肝细胞内的表达具有较强的促进作用。
[0096] 人凝血因子IX(hFIX)的主要合成部位也位于肝脏细胞，其编码基因hF9的启动子定位于-219至+29碱基对之间，属于TATA序列缺乏、转录效率较弱的启动子。然而，经鉴定发现在hF9启动序列中包含有5个顺式调控元件。这些元件中可以与肝脏内含量丰富的转录因子，如C/EBPα、NF1、AR、DBP或HNF-4等，结合从而促进hF9转录。在所有元件中，以5号位点的调控序列(-219至-199)的转录促进作用最强。只携带hF9近端启动子的报告基因质粒虽然表达水平不高，但在加入了数个拷贝的5号位点序列以后，其转录效率可以与包含了HCR调控序列的质粒大致相当32。这些数据目前只是在体外细胞系试验中得出了结论，尚未进行体内试验验证。因此，为了获得生理性表达水平的凝血因子IX，值得尝试应用这些生理性调控序列构建表达框架，以用于在肝细胞内特异性表达hFIX的基因治疗载体中。
[0097] 以上这些经肝脏细胞特异性合成蛋白的编码基因均有可以借鉴的增强子序列以进行筛选或合成转录效率高的调控元件以用于基因治疗中的表达框架，介导肝细胞特异性的转录表达。
[0098] 突变的ITR序列
[0099] 本发明提供了一种突变的ITR序列(末端反向重复序列)，所述突变的ITR序列含有106个碱基，与3’端野生型ITR序列SEQ ID NO.:5的第25位至第130位之间的碱基序列互补或者相同。
[0100] 具体地，野生型ITR结构含有145个碱基对，在病毒复制中发挥作用并介导形成单链DNA核心的AAV病毒。本发明对野生型ITR结构进行了调整，在3’端野生型ITR序列的两端各去除部分碱基序列后，删除了其中的末端终止位点(terminal resolution site，TRS)，并将此ITR结构的互补序列构建于表达载体的5’端，从而促进在AAV复制过程中形成互补双链结构，促进转录表达。此结构比Nathwani等改造的ITR结构进一步缩减了数个碱基对，使其仍然可以形成互补双链病毒DNA。综合以上结构，调整而构建的AAV载体的生物活性和安全性在HB小鼠体内进行了系统评估。
[0101] 人凝血因子IX基因
[0102] 血友病B(Hemophilia B,HB)属于单基因遗传性疾病，是染色体Xq27.1上的人凝血因子IX编码基因(hF9)缺陷所致的性染色体连锁遗传性出血性疾病，在全球男性中发病率约1/25000。正常的人F9基因全长约34kb，其中编码序列cDNA长度为1383bp，位于X染色体长臂末端Xq27.1-q27.2区域，包含8个外显子和7个内含子。人F9基因缺陷导致血浆中FIX蛋白缺失或功能障碍是导致血友病B的根本病因。经群体分析3721名HB患者及其家系成员，总共鉴定诊断出1113种特异性突变(图1)。在这些突变中，约73％为点突变，呈单个或多个广泛地分布于外显子内(700/812)。大约50％突变致使hFIX蛋白表达障碍或功能缺陷，从而诱发严重的临床表型(表1)。
[0103] 表1.血友病B患者突变类型和疾病严重程度的相关分析
[0104]
[0105] 目前中国血友病的发病率为5-10/10万，约15％属于血友病B患者，重症患者占其中一半左右。以目前的医疗经济状况，绝大部分重度HB患者无法承担预防性替代治疗所需的昂贵费用。
[0106] 基因治疗策略通过腺相关病毒载体AAV导入正常基因在肝细胞内表达凝血因子具有长期治愈的潜能，目前国外的临床试验中初步取得了一定的临床疗效及安全性结果。然而，基因治疗中使用的生物载体还存在一定的优化改进空间。最重要的是，目前国内尚无具有同类知识产权的基因治疗产品。因此，本发明结合国际前沿进展，开展了基因治疗血友病B的研究，开发优化了用于血友病B基因治疗的AAV载体，并且在临床前期的动物模型中证实了其生物学活性和安全性，从而为其临床转化提供了坚实的基础。这个载体的开发在一定程度上填补了我国目前在基因治疗血友病B领域的空白，其临床应用将为基因治疗包括血友病在内的遗传性疾病奠定坚实的理论和实践基础。
[0107] 此外，本发明中的用于介导在肝细胞中表达致病基因的AAV载体及其中的肝脏特异性调控序列具有通用性。对于其他类型的单基因缺陷性遗传性疾病，如果缺陷基因尺寸适用于AAV载体包装容量，均可通过此载体进行肝脏特异性表达。因此，本发明中涉及的AAV载体及调控元件理论上在基因治疗领域具有非常广泛的适用前景，为未来发展更多的基因治疗策略提供了有利的研究工具。
[0108] 腺相关病毒载体
[0109] AAV载体直径约20-25nm，野生型AAV病毒由蛋白包壳和核酸核心组成，可以包含大小约4.7kb的DNA片段(图2A)。经改造后病毒自身编码基因可以被治疗性基因所取代，从而构成重组AAV病毒载体(图2B)。迄今从人和动物组织中自然分离鉴定的AAV载体包壳蛋白(capsid protein)有120余种。组织亲和性检测结果显示不同的AAV载体可以对人体多种组织具有亲和性，与此同时同一种组织也可以被不同血清型的AAV载体感染(表2)。对于血友病基因治疗主要的靶向器官肝脏(图3)，AAV2、AAV7、AAV8、AAV9以及AAVrh10均有较高的亲和性，其中AAV8及AAVrh10的感染效率最高，因此已经被应用于血友病基因治疗的临床试验。
[0110] 表2.不同血清型AAV的组织嗜亲性
[0111]
[0112] 本发明的载体
[0113] 本发明也涉及包含本发明的pSyn调控序列的载体，以及利用本发明的载体或pSyn调控序列经基因工程产生的宿主细胞。
[0114] 术语“载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。对于载体而言，通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。优选的，本发明载体为AAV载体。
[0115] 可以利用本领域技术人员熟知的方法构建本发明的载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到本发明载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。本发明载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。
[0116] 此外，本发明载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。
[0117] 包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
[0118] 宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞(如农作物和林业植物的细胞)。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属、农杆菌；真菌细胞如酵母；植物细胞、动物细胞等。优选的，本发明的宿主细胞为人或非人哺乳动物细胞，较佳地为肝脏细胞
[0119] 本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。
[0120] 本发明的AAV载体
[0121] 在基因治疗血友病B的策略中，AAV载体具有关键性的传递运输作用。表达治病基因的序列需要经过AAV载体才能在机体血液循环中运输并且特异性定位于特定的靶器官。基因治疗血友病B的AAV载体主要包含由两部分组成：a.治病基因表达框架；b.具有突变ITR结构的AAV结构序列(图4)。本发明通过优化两个组成部分从而达到提高基因治疗中具有治疗性作用的正常凝血功能hFIX的表达水平。具体地，本发明的基因治疗血友病B的肝脏特异性表达腺相关病毒载体(AAV载体)包含：
[0122] 1.肝脏特异性转录调控序列，pSynthetic(简称pSyn)；
[0123] 2.序列优化的人凝血因子IX编码序列；
[0124] 3.优化改良的ITR结构(突变的ITR序列)。
[0125] 本发明的主要优点包括：
[0126] (a)在肝脏组织中特异性高效驱动下游基因的转录表达；
[0127] (b)具有长期稳定的在肝脏组织中驱动下游基因表达的活性；
[0128] (c)具有较好的安全性，在非肝脏组织中基本不表达，不干扰其他非治病基因的表达水平。
[0129] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
[0130] 实施例1
[0131] 序列优化人F9编码基因
[0132] 人FIX的表达框架包括hFIX cDNA编码序列，以及增强子/启动子等调控序列(图4A)。首先，对hFIX编码序列进行了密码子优化。密码子优化的原理是通过评估不同密码子使用频率的差异，将同一个氨基酸所对应的在真核细胞中表达频率较高的密码子替换相对使用频率较低的密码子，从而增强基因的转录表达效率。
[0133] 此外，对hFIX编码序列进行序列优化，以提高mRNA分子结构的稳定程度，降低其被内源性RNase降解的风险。序列优化主要利用OptimumGeneTM分析完成。其中优化的参数包括：(1)基因转录效率调控参数，包括增加偏好性氨基酸密码子，降低或删除利用率低下密码子的使用；(2)调整GC含量，适用区间为30％～70％；(3)修改hFIX的mRNA二级结构，包括减少或删除隐含的剪切位点、环状或分枝等不稳定结构、重复序列、以及适用终止密码子TGA等(图4B)。
[0134] 为了验证本发明的优化策略是否可以有效的提高hF9基因的表达效率，在同样的转录调控元件的驱动下构建了经优化的hFIX序列，通过尾静脉高压注射血友病B(HB)小鼠，利用物理压力将携带表达框架的质粒导入小鼠肝细胞中。
[0135] 结果如图5A所示，与野生型cDNA比较，本发明的密码子优化策略使血浆中的hFIX(cohFIX)抗原表达水平提高了约3倍，这种水平已经与临床试验中取得了明显临床疗效的hFIX优化序列(hFIX.ctrl)基本一致。
[0136] 随后，将携带cohFIX表达框架通过AAV8载体转运至HB小鼠的肝脏组织，血浆定期检测的结果发现，本发明的cohFIX优化序列(AAV.cohFIX)可以在小鼠肝细胞中稳定高效的进行表达抗原和凝血活性，其转录效率与阳性对照(AAV.hFIXctrl)基本一致，其结果有效的缓解了基因治疗小鼠的出血表型(图5B)。这些结果有利地证明了本发明的序列优化策略能够有效的提高hF9基因的转录效率，因此适用于基因治疗中的表达载体。
[0137] 除了有效的优化cDNA序列，本发明也在编码基因中引入了一个点突变，从而使hFIX蛋白中第338位的精氨酸替换为亮氨酸(hFIX.SIHR338L)。这个突变最初发现于一个意大利家系，当hFIX中第338位的精氨酸被亮氨酸取代，结果导致尽管患者血循环中FIX蛋白水平和正常人相当，但凝血活性达到正常人的5-8倍。经研究发现R338位点是凝血因子X与FIX结合的重要部位，被亮氨酸取代后可以增强两者之间的结合效率，从而明显增强FIX的凝血活性。此外，携带此突变的FIX蛋白的抗纤溶效应也增强。因此，将此突变位点引入cohFIX序列，经AAV载体在HB小鼠肝细胞中表达，结果显示hFIXR338L突变体的表达可以有效的降低AAV制剂的剂量，在低剂量1×1011vg/kg基础上即可在小鼠体内产生～100％正常人血浆水平的凝血因子活性和抗原，较野生型AAV载体降低了数倍(图6)。
[0138] 实施例2
[0139] 构建并筛选肝脏特异性调控序列
[0140] 为了提高AAV载体介导基因治疗的疗效，除了对hF9基因进行优化外，还对转录调控元件进行了筛选优化。为了获得最有效率的转录调控，将不同的调控序列进行组合，并与Nathwani等临床试验中AAV载体携带的pLP1调控序列进行了平行比较。
[0141] 1.人工合成的pSynthetic(pSyn)调控序列，结合了TTR和Alb的调控序列，包含HNF-1、HNF-3、HNF-4、以及C/EBP等多个肝细胞特异性转录因子的结合位点。
[0142] 2.人凝血因子IX调控序列(pF9)有长短两种不同的版本。其中pF9.v1包含了F9基因-219至+29碱基对之间的序列，而pF9.v2还引入了5个拷贝的增强子序列，该序列在体外细胞系试验中有效的提高了pF9近端启动子的转录效率。
[0143] 除此之外，还对载体的ITR结构进行了调整。对照型ITR结构(ITR对照)介导形成单链m1DNA核心的AAV载体(图7，样本F)，Nathwani等删除了AAV载体一侧的ITR(ITR )中近20余个碱基对，从而在AAV包装生产的过程中形成了互补双链DNA结构，促进转录效率(图7，样本A)。在此基础上进一步改造删减了几个碱基对(ITRm2)，但使其保留形成互补双链病毒DNA的能力(图7，样本B-E)。还在hFIX的表达框架中加入了一段人工合成的内含子序列，并且在两端加上splicing donor和splicing acceptor，从而不影响编码序列。综合以上结构调整而构建的AAV载体的生物活性和安全性在HB小鼠体内进行了系统评估。
[0144] 为了比较确定本发明设计构建的肝脏特异性调控元件是否具有高效稳定的转录驱动效率，构建了包含不同调控元件的hFIX表达框架并且包装成AAV8载体。这些载体经过尾静脉注射后进入HB小鼠体内，并且介导肝脏特异性表达hFIX蛋白。
[0145] 结果如图8所示，经过活性测定及ELISA分析，显示在近四个月的追踪观察中，注射了内含pSyn调控元件的AAV载体的HB小鼠组血浆中的hFIX抗原和活性水平最高。与LP1调控元件组相比较，pTTR和pF9组的HB小鼠血浆中hFIX的蛋白和活性水平相对较弱，提示其转录调控效率相对较低。
[0146] 实施例3
[0147] pSyn调控序列的体内剂量增高试验
[0148] 根据以上结果显示pSyn调控序列有相对较强的肝脏特异性转录活性，因此利用包含pSyn调控序列的AAV.pSyn.cohFIX载体进行了体内剂量增高试验，其中高、中、低浓度组注射的载体剂量分别与Nathwani等设计的临床试验中应用的剂量想对应。
[0149] 结果显示，血浆中的hFIX抗原和活性从注射载体后一周就开始升高，到第四周达到高峰，并且在4个月的观察周期中维持在相对稳定的水平。此外，血浆中的凝血因子活性和抗原水平随着剂量的增高成正比上升，中剂量组的小鼠血浆中hFIX的活性和浓度可以达到正常人水平的100％左右，而高剂量组已经在正常人水平的600～900％之间(图9)。这些结果证明了AAV.pSyn.cohFIX载体可以有效地在HB小鼠体内长期稳定的表达并发挥其凝血作用。
[0150] 实施例4
[0151] pSyn调控序列的组织特异性试验
[0152] 为了明确AAV载体介导表达hFIX的组织特异性，部分HB小鼠在注射病毒载体三个月后提取了组织器官进行分析，肝、脾、和胸腺组织中的RNA被提取出来并且分析了hFIX相对内参基因GAPDH的RNA表达水平。
[0153] 结果如图10所示，人凝血因子IX的RNA主要在肝脏组织中表达，并且表达水平随着载体剂量的升高而增加。与肝脏组织相比，脾脏和胸腺中hFIX RNA表达水平处于基线水平，与注射了AAV.GFP载体的HB小鼠各组织中的RNA水平一致。这些结果说明AAV.pSyn.hFIX载体介导的RNA表达具有肝脏组织特异性。
[0154] 实施例5
[0155] AAV.pSyn.cohFIX载体的生物性分布
[0156] 随后，分析了AAV载体在HB小鼠体内的生物性分布。根据以往报道的结果，AAV8载体应该主要对小鼠肝脏组织具有亲和性。
[0157] 结果如图11所示，经分析检测基因治疗小鼠的肝、脾、胸腺、及骨髓组织，病毒DNA主要分布在肝脏组织中，而且分布浓度和载体剂量成正比。此外在脾脏中也有极少量的病毒DNA分布，在高剂量组的平均浓度约0.23拷贝/细胞，在其他剂量组及其他组织中均与AAV.GFP组HB小鼠中的基线水平差不多一致。结合这些数据以及RNA表达水平的分析结果，说明AAV8结合肝脏特异性调控序列的基因传递策略可以有效的保证目的治病基因在肝脏组织中的特异性表达，本申请中的AAV.pSyn.cohFIX载体具有控制在肝脏内特异性表达hFIX以治疗血友病B的目的。
[0158] 实施例6
[0159] 肝功能指标测定
[0160] 在既往的临床试验中显示AAV载体介导的基因治疗可以诱发机体免疫反应及轻度的肝脏损害，伴随着肝功能指标的上升。比较了AAV载体注射前以及注射后第4、12周的血浆谷草转氨酶(AST)和谷丙转氨酶(ALT)的水平。
[0161] 结果如图12所示，和未接受基因治疗的HB小鼠血浆内的水平相比(Week 0)，在注射病毒载体后4周或12周的小鼠血浆内的AST或ALT水平都没有显著性升高。这也与血浆内稳定表达的hFIX水平相对应，说明在这些剂量下AAV载体及其表达产物没有诱发明显的肝功能损害。
[0162] 实施例7
[0163] 小鼠高凝血活性指标测定
[0164] 过量的外源性凝血因子可以诱发机体的高凝血状态。为了检测不同剂量AAV载体表达的hFIX是否会产生高凝血风险，检测了血浆中的D二聚体浓度。
[0165] 结果如图13所示，和基因治疗前水平以及AAV.GFP对照组水平相比，不同剂量下的AAV载体表达凝血因子没有引发过度的凝血反应，证明了在这些剂量下HB小鼠体内不存在高凝血风险。
[0166] 综合以上数据，本发明构建的AAV.pSyn载体充分具备在肝脏组织中特异性表达目的治病基因的功能。在血友病基因治疗中，在pSyn驱动下可以长期稳定地表达凝血因子IX，从而恢复小鼠的正常凝血功能，达到长期甚至永久治愈的目的。
[0167] 在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
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