本发明涉及启动转录的调控核苷酸序列及其在重组法生 产多肽中的应用。

本发明研究中所提出的技术问题是识别一种强力的并且 最终是可热诱导的启动子，它可以用于多种微生物，特别是 可用于放线菌类。

鉴于放线菌中包括了链霉菌和分枝杆菌，使得放线菌成 为一类具有重要经济意义和医学价值的微生物。

目前在抗生素的商品生产中，大约有70％使用了链霉 菌，此外，如果说结核分枝杆菌和麻风分枝杆菌的危害性不 再被强调；但是为了获得活的多价疫苗菌株，在牛分枝杆菌 (M.bovls)BCG菌株中提取异种抗原仍有很大的价值。

在分子水平上对这些菌种的基因遗传学研究还很少，它 们的基因表达调控与研究较多的一些菌如埃希氏大肠菌或枯草 杆菌等表达调控是不同的。

尤其是DNA富含G+C(鸟嘌呤十胞嘧啶)的放线菌对埃 希氏大肠杆菌或枯草杆菌中特征“启动子”序列的识别能力较 小和较差。

Baird等人(J.Gen.Microbiol.1989，135，931- 939)研究了分枝杆菌中热冲击蛋白质中的编码基因，并且假 设，两种序列TTGAG和TCTCATGT，(它们出现在结核 分枝杆菌中的10kDa，热冲击蛋白质的编码序列的前部)组 成了启动子的-35和-10区域。

事实上，这两个序列呈现出与埃希氏大肠杆菌中的相应 启动子的序列高度的同源性。此外，那些出现在各种分枝杆 菌中的其它热冲击蛋白质(例如，麻风分枝杆菌的65kDa蛋 白质或牛分枝杆菌的64kDa蛋白质)的编码基因前部的序列同 样也包含了一对同样类型的序列，即TTGCCG和 TTTCAT，或者TTGCCG和CTTCAT，因此它们与埃希 氏大肠杆菌的启动子以及10kDa结核分枝杆菌的“-35及- 10”序列有高度的同源性。

按照该论文以及Thole等人的论文(Infection and immunity，55 1987，1466-1475)，对分枝杆菌中热 冲击蛋白质基因的转录起作用的启动子中包含了这种类型的序 列(作为序列-35和-10)。以下把这种序列称为“埃希氏 大肠杆菌型-35和-10序列”。这样，这些，作者还没有 从结构带上证实这个假设，从而对启动子的辨认也还没有确 定。

令人惊奇地是本发明的发明者已经证明，埃希氏大肠杆 菌型-10和-35序列同样出现在链霉菌之中，但是它们在这 些菌中并不起热冲击蛋白质转录的启动作用。

应该提及在上面所引述的论文中，Baird和Thole还证 明了：在分枝杆菌中热冲击蛋白质的编码基因前部的序列 中，存在着一种含有序列GCACTC 9N GAGTGC的回 文顺序结构。然而，这个结构的确切作用尚未确定。 Thole假设，这个结构或者涉及到出现在热冲击蛋白质编码 基因前部的操纵子(operon)转录的末端，或者涉及到多顺 反子信使的译码规律。

为了克隆出一种可用于大量放线菌的强力的启动子， (并且最终是可热诱导的)，本发明者研究了链霉菌中热冲击 的应答，并且克隆了一种强力表达的蛋白质，以便确定其启 动子的特性。事实上，对通过重新合成蛋白质得到的热冲击 的应答现象是一种普遍现象；所以人们可次预言，其规律对 各种放线菌应该是相似的，特别是具有相同序列的启动子可 以用于大量的菌株。

本发明者还在链霉菌中鉴定了两种功能性的启动子，并 确定了它们的特性，由于观察到了这两个启动子都含有 GCACTC 9N GAGTGC结构，从而确定了该结构的功 能。

本发明涉及一个重组的核苷酸序列，其特征为：

一个启动转录调控序列，这个调控序列含有一个与结构 GCACTC 9N GAGTGC联接的启动子，其中的“N”代 表下述四个碱其中的任一个：T-胸腺嘧啶，G-鸟嘌呤， A-腺嘌呤，C-胞嘧啶；

一个多肽的编码序列，称为“异源多肽”它不同于自然 状态下与上述启动子联接的序列，其编码序列位于所述启动 转录调控序列的后部，在适当条件下，该位置使得多肽的表 达可以在上述启动子控制下进行。

本发明的重组核苷酸序列使得能够在含有异源基因的细 胞中表达异源基因。

启动转录调控序列(它是重组核苷酸序列的一部分)是由 一个与结构GCACTC 9N GAGTGC相联的启动子所组成 的。这里，″相联″是指，结构GCACTC 9N GAGTGC 可以不同于启动子，或者该结构可能被包含在(至少部分地 被包含在)启动子中。这后一可能性同时包括了两种情况， 一种情况是该结构重叠在启动子序列上，另一种情况是该结 构组成了启动子整体的一部分。

本发明特别推荐的与结构GCACTC 9N GAGTGC相 联的那些出现在放线菌中的启动子，在细菌基因组中，它们 通常与热冲击蛋白质相联。作为这类启动子的例子，可以举 出白色链霉菌中的18kDa(P1)和56kDa(P2)热冲击蛋白质 启动子，在本发明者的发明范围中将它们识别为： P1对应于下两序列之一： CATTGGCACTCCGCTTGACCGAGTGCTAATCGCGGTCATAGTCTCAGCTCTG 5′                                               3′ 或 GCATTGGCACTCCGCTTGACCGAGTGCTAATCGCGGTCATAGTCTCAGCTCTG 5′                                                3′ P2对应于下两序列之一： GGAGGCCCCTAGCGCCTGCACTCTCCTACCCCGAGTGCTATTATTGGCGTTA 5′                                               3′ 或 GGAGGCCCCTAGCGCCTGCACTCTCCTACCCCGAGTGCTAATTATTGGCGTTA 5′                                                3′ 这些启动子中的任一个都可以在5′端缩短最多4或5个碱基，而 不会损害其活性。

另外类型的启动子是那些在10kDa和65kDa结核分枝杆菌 在64kD2牛分枝杆菌中的和65kDa麻风分枝杆菌中的热冲击 蛋白质启动子。

结构GCACTC 9N GAGTGC与启动子的联连给启动 子以热诱导的特性。这个结构有可能是一个操纵子 (operateur)，并组成一个阻遏蛋白(represseur)的固定位 置，从而阻止RNA多聚酶结合在启动子的-10和-35序列 上。

在该结构和启动子分离的情况下，它倾向选择在启动子 的前部，例如大概150至200个碱基处。

本发明的重组序列包括(除了启动转录调控序列外)一个 多肽的编码序列，称″异源多肽″，它不同于自然状态下与上 述启动子联接的序列。这样，启动子直接处在基因环境之 中、与包围在产生启动转录活性的基因组之中的情形不同。 作为异源多肽类型的例子，可以举出用于生产重组活疫苗的 中和抗原，或者对抗生素以抵抗力的多肽，酶，等等。

在本发明的核苷酸序列中，编码序列位于所述调控序列 的后部。当然，它们的相对位置是这样的：即编码序列的 表达在启动子的控制之下发生。

本发明此外还涉及一个表达载体，例如质粒，它包含 本发明的核苷酸序列。

本发明同样还包括一个由该表达载体所转化的细胞，所 述细胞能够识别启动转录调控序列的启动子，表达多肽。转 化细胞是原核生物细胞，特别是属于放线菌类(例如链霉菌 或分枝杆菌)的原核生物细胞。

本发明还涉及一个生产多肽的方法，其特征是它包含了 以下步骤：

--根据本发明，利用表达载体，在允许所述多肽表 达的条件下，进行细胞转化，由表达载体所转化的细胞能够 识别上述启动子；

--回收所表达的多肽。

允许多肽表达的条件在现有技术中是已知的，在目前情 形中它包括最好是热冲击的使用，它具有诱导表达的作用。 热冲击可以是提高温度，达到大约37-45℃，尤其是40℃ 至45℃，例如对链霉菌是37℃或41℃，对于分枝杆菌是42 ℃至45℃。

值得注意，利用本发明的启动子P1和P2将导致在高温 下(例如对于链霉菌在37℃和41℃之间)能维持异源蛋白质的 表达。

本发明的另一方面涉及到这样的可能性，即通过把一种 启动子与结构GCACTC 9N GAGTGC相结合，使之转 化成可热诱导的启动子。更特殊地，本发明的这个方面涉及 到一种方法，该方法能赋于启动子以热诱导特性，其特征是 两个：一个是含有结构GCACTC 9N GAGTGC的序 列，另一个是启动子含有结构GAGTC的序列位在启动子的 前部，或者把含有结构GACTC 9N GAGTGC的序列全 部或至少部分地插入到启动子中部，这后一位置的选择原则 是，所述结构的简单插入不含干扰启动子的活性。

本发明涉及的核苷酸序列，其结构GCACTC 9N GAGTGC与启动子的序列不同。

当然，为了能够赋于热诱导特性，结构GCACTC 9N GAGTGC相对于启动子所应该占有的精确位置是随所用的 启动子不同而有所变化的。在使用热冲击时，这可以在由待 测试的结构所造成的转化细胞中，对易检测的异源基因(例如 LacZ那样的标记基因)的表达进行检测而得到验证。位于启 动子前部大概150至200个碱基的位置处的结构GCACTC 9N GAGTGC能够给出热诱导特性。在某些情况下，结 构GCACTC 9N GAGTGC也可以全部或至少部分地插入 启动子中部。这里，插入位置的选择应该使得该结构的简单 插入既不干扰其热诱导效应，也不干扰启动子的活性。重要 的是，在插入时不能改动启动子的-10的-35序列。这样 产生的启动转录调控序列的热诱导特性可以用下述方法进行验 证。

在研究启动子时，本发明者探索了不同种链霉菌对热冲 击的应答。除分子量为90-100，70及56-58kDa的主要 热冲击蛋白质外，还在每个被测试品种中观察到了一种16至 18kDa的蛋白质。在30℃至37℃的传代培养过程中，这种 蛋白(质称作HSP18)在白色链霉菌中有非常高的产率，可 以多达全部蛋白质的10％。70和90-100kDa蛋白质的热冲 击诱导是短暂的，然而56-58kDa和18kDa蛋白质热冲击诱 导是稳定的，在高温下可以持续生产。

名为HSP18的蛋白质已被表达和确定特性。它的性质与 其它热冲击蛋白质的不同。例如，除了它的大小比较小和调 节的稳定外，它在高温下还具有一个超过9的等电点。然而 这个非常高的等电点不能由它的氨基酸构成(见表2)反映出 来。

此外，对它的氨基酸组成的确定显示了一种更基本的蛋 氨酸持有者，这和利用了[35S]蛋氨酸的实验结果不一致。 这些观察表明HSP18在译码之后发生了变更。

HSP18蛋白质既不对抗埃希氏大肠杆菌groEL蛋白质的 多克隆抗体反应，也不对属于麻风分枝杆菌的65kDa热冲击 蛋白质的单克隆抗体反应。

对HSP18蛋白质的编码基因“groEL-1”转录的研究表 明，HSP18实际上是一种被截去一段的蛋白质。基因 groEL-1实际上编码了一种56kDa蛋白质，该蛋白质在码 后发生了变更，从而产生了18kDa蛋白质。

图6示出了基因groEL-1的部分序列以及它的氨基酸译 码。这个序列证实了由HSP18的Edman蜕变确定的序列。 在图6的序列中缺少结束56kDa蛋白质的COOH。18kDa蛋 白质的序列被包含在这个序列之中，它们的两个NH2端同时 结束第一个(氨基酸)。HSP18最多能扩展到大约170个氨基 酸。

图8给出由基图groEL-1编码的蛋白质的全部序列，如 同图6所表示的，它包含了HSP18蛋白质。

本发明包括了热冲击多肽，它或者含有(1)显示在图6 中的氨基酸序列或对应于图8中的氨基酸链的序列，或者含 有(2)呈现与该序列至少有85％-90％同源性的序列，或者 含有(3)具有NH2末端和扩展到大约170个氨基酸的序列(1) 或(2)的一部分，多肽(3)的大小约为18kDa，并具有约 为9的非常碱性的等电点。

通过与groEL型的其它蛋白质的功能的类比，HSP18对 细胞的存活可能是至关重要的，并且起着“分子罩”的作 用，也就是说，它暂时附着在刚产生的多肽上，阻止不可 溶蛋白质的聚集，并且允许脱开，就如同穿过细胞膜进行传 递一样，同样可能的是，HSP18涉及到菌株对抗生素的抵 抗力，或是涉及到耐热性质。

从一个特殊方面来说，本发明还包括一个含有如图8所 示的GroEL1蛋白质的COOH-端区域的多肽。对应于这个 定义的特定多肽，含有或对应于下列氨基酸序列，Gly His Gly His Gyl His Ser His。

本发明还涉及一种肽，其氨基酸序列为Gly His Gly His Gly His Ser His。

通过与热冲击蛋白质中已知的多肽COOH-端序列相比 较，上述氨基酸序列对应于一个原始的氨基酸链。这个 COOH-端序列涉及到18kDa截断蛋白质的形成。

本发明的各个方面在附图中说明：

图1(A，B)示意地表示出基因groEL-1，groES和 groEL2的克隆。在构成质粒pPM1005和pPM997+Neo时 起作用的位置在括号内标明。

图2表示groEL2的启动子P2和groES，groEL-1的启 动子P1。

图3表示pPM1005载体，它在白色链霉菌的440pb片段 SmaI的控制下含有In5的neo基因。这个片段含有启动子P1 和groES基因的前160个碱基对。

图4表示pPM997+Neo载体，它在白色链霉菌的 800Pb片段BglII/SstI的控制制下含有Tn5的neo基因。这 个片段含有启动子P2和groEL2基因的前183个碱基对。

图5表示groES结构基因和GroES蛋白质的核苷酸序列及 所导出的氨基酸序列。

图6画出HSP18前端蛋白质的核苷酸序列以及导出的氨基 酸序列。

图7表示gro es el操纵子的核苷酸序列及其启动子序 列。

图8表示完整的，由与之对应的groEL1基因所编码的氨 基酸序列。

图9表示完整groEL1基因的核苷酸序列。

              实例

温度对链霉菌中蛋白质合成的作用：

在使用热冲击(温度从30度过渡到41℃)的前后，对链 霉菌的所有15个不同品种的蛋白质进行了制备。90-100， 70以及56-58kDa的几种主要热冲击蛋白质已往在染成柯氏 蓝的SDS-PAGE凝胶中检测到。此外，对应于18kDa蛋 质的分子带也已在某些品种中观察到。这种蛋白质在白色 霉菌中被十分强烈地诱导出来。

蛋白质的免疫学特性：

实现了对凝胶中蛋白质的“Western印迹”，其中使用 了对麻风分枝杆菌的65kDa热冲击蛋白质的单克隆抗体和对 埃希氏大肠杆菌的groEL蛋白质的多克隆抗体。所有蛋白质 都不对单克隆抗体作出反应，只有HSP56-58对多克隆抗体 有反应。

蛋白链霉菌中热冲击蛋白质的研究：

通过对所有的蛋白质在30℃和41℃的电泳，分析了白色 链霉菌对热冲击的应答。蛋白质进行了40分钟的标记，所 用的氨基酸是[35S]蛋氨酸和[14C]丙氨酸，已经能够观 察到四种主要的热冲击蛋白质。HSP90在30度时尚不能检测 到，但在热冲击后它出现了，约占全部蛋白质的3％， HSP70的产率至少高一倍。HSP56-58还要多出30％， HPS18在热冲击之前也检测不到，但冲击后约占全部蛋白质 的4％至7％(见表1)。

    表1：进行14C丙氨酸和35S蛋氨酸标记后，几种主要热冲 击蛋白质合成的定量产率。

             30℃和41℃时的合成产率a 蛋白质  35S/30℃ 35S/41℃ 14C/30℃ 14C/41℃ 分子量b 90      c         3         -          2.9 70      2.7       6.4       2.3        5.8 56-58   6.8       8.4       6.2        9.0 18      ＞0.7？   6.9       ＞0.7？    3.8

a.由放射自显影照片上测得的光密度(O.D)百分比形式 表示。

b.分子量单位是kDa。

c.没有检测。

白色链霉菌HSP18的研究

白色链霉菌的18kDa蛋白质(HSP18)是非常碱性的， 它已被纯化，并且其氨基酸的部分组成已被确定(见表2)：

    表2：HSP18的氨基酸组成： Asx    12.2 Thr    9.4 Ser    3.2 Glx    10.8 Ala    12.1 Cys    0.0 Met    0.0 Val    9.2 Ile    5.7 Leu    6.8 Tyr    1.3 Phe    1.9 His    0.3 Lys    6.9 Arg    4.5 Gly    11.0 Pro    4.4

蛋白质的NH2端和两个内部片段的序列已借助Edman蜕 变确定。

寡核苷酸的合成：

基于上述内部片段的肽序列，已经合成了两种30个碱基 的寡聚核苷酸探针。该片段的序列为：

…D-D-P-Y-E-N-L-G-A-Q…

所合成的脱氧寡聚核苷酸探针如下： 5′GAC-GAC-CCC-TAC-GAG-AAC-CTG-GGC-GCC-CA    3′OL1

             G               C       T 3′CTC-CTG-GGG-ATG-CTC-TTG-GAC-CCG-CGG-GTC   5′OL2

             C               G       A

热诱导蛋白质HSP18基因的克隆：

在60℃下与SSC5x杂交之后，这些寡聚核苷酸探针能 够描述和克隆白色链霉菌的1.9kb的Xhol限制性片段(见图1 中的克隆A)。

这个片段的序列已被确定；它含有开放式结构的形态， 对于超过50kDa的蛋白质，它从位于430位置处的一个 ATG开始，扩展到编码克隆区，但是它的NH2末端对应于 从HSP18的肽序列中导出的核苷酸序列。此外，该基因在 其整个长度上都与埃希氏大肠杆菌的热冲击蛋白质groEL和麻 风分枝杆菌的65kDa蛋白质氨基酸序列有高度的同源性(75％ 的同源性)。最初，这个基因被称做“groEL1”。

白色链霉菌中第二种“类grlEL”确定和克隆：

利用麻风分枝杆菌HSP65基因的5′端部分作为探针，实 现了白色链霉菌基因组的杂交，在和白色链霉菌的基因组杂 交之后，这个探针给出两个信号，一个强信号和一个弱信 号，不论使用了什么样的酶来消化DNA都是如此。弱信号 对应于从HSP18导出的寡聚核苷酸得到的信号，也就是从 groEL1基因得到的信号。强信号对应于另一种具有典型大 小(65kDa)的“类groEL”蛋白质的编码基因。于是在白 色链霉菌中有两种groEL基因。

白色链霉菌菌HSP65热冲击蛋白质基因的克隆：

由麻风分枝杆菌的HSP65探针强烈反应1.2kbxhoI限制性 片段已被克隆(克隆C见图1)。

该片段的核苷酸序列已被确定。1.2kb的xhoI片段碥码 了一个麻风分枝杆菌65kDa蛋白质有90％的同源性的蛋白质 内部片段，此外，白色链霉菌中的两种：“类groE1”基因 1和2有80％的同源性。

这种65kDa蛋白质的编码基因称做groEL2。

“类groEL”基因转录及启动子的研究。

在热冲击实验的过程中提取了白色链霉菌菌株的全部的 RNA，并以“Northern印迹”技术进行了处理，然后与各 种寡聚核苷酸进行杂交，或者用groEL1序列进行合成，或 者用groEL2序列进行合成，并且分别确定了这两个序列中 所选择的区域。在与两个克隆片段进行新的杂交时，使用了 同一硝纤素滤膜观察到了三个有非常强的热诱导性的转 录产物；它们的大小分别约为2500，2100和650个碱基。 2100个碱基的对应于groEL2的转录产物；650个碱基的对 应于位于groEL1前部的基因的转录产物；2500个碱基的对 应于groEL1和位于groEL1前部的基因的共同转录产物。这 些结果表明，一方面，groEL1和groEL2两种基因有强力 的和可诱导的，尤其是热冲击性的启动子，另一方面， groEL1的启动子在1.9Kb片段中没有被克隆。特别是，这 些结果证明了，在分枝杆菌中，在图1标有“P？”的环上 没有任何RNA来行使一个假定能够作为启动子的序列。

事实上，这个环含有两个TTTGCCGGG和TTTCAT 序列，虽然还缺乏对启动子结构描述的工作，它们已被认为 分别是分枝杆菌中65kDa蛋白质的启动子的-35和-10区域 (例如见：J.Gen.Microbiol，(1989)，135，931- 939)。这些结果表明，这两个序列不构成白色链霉菌中 groEL1基因的启动子的一部分。

所研究的启动子应该位于形成携带groEL1操纵子基因的 前部。位于groEL1前部的基因已被鉴别；这涉及到一种与 埃希氏大肠杆菌的groES基因相高度同源的基因，在那里它 同样形成了groEL1的操纵子(见图5)。

两种基因groEL1和groEL的启动子区的克隆：

借助于从用上述方法克隆的片段序列而合成的寡聚核苷 酸，已经克隆了两种新的白色链霉菌DNA片段，它们已被 BclI/SacI(1700bp)和BglII/SacI/(900bp)消化。于 是它们分别部分地复盖了带有groEL1和groEL2的片段，并 且各自都延伸到约800bp的前部(图1的克隆B和D)。

这些片段的序列已经确定，然后利用核酸酶S1的结构描 述和反转录中的诱发扩展，研究了启动子的特性。这样确定 了特性的两种基因groEL1和groEL2的启动子不具有相同的 序列(图2)，但它们具有重要的结构同源性，特别是它们都 呈现下述图文顺序结构：

GCACTC  9N  GAGTGC

两种启动子的序列如下：

P1对应于下两序列之一：

CATTGGCACTCCGCTTGACCGAGTGCTAATCGCGGTCATAGTCTCAGCTCTG

5′                                               3′

或

GCATTGGCACTCCGCTTGACCGAGTGCTAATCGCGGTCATAGTCTCAGCTCTG

5′                                                3′

P2对应于下两序列之一； GGAGGCCCCTAGCGCCTGCACTCTCCTACCCCGAGTGCTATTATTGGCGTTA 5′                                               3′ 或 GGAGGCCCCTAGCGCCTGCACTCTCCTACCCCGAGTGCTAATTATTGGCGTTA 5′                                                3′ 利用groEL1和groEL2启动子表达异源基因：

这两个启动子已用来表达克雷伯氏菌的Tn5转座子的异源 基heo，这个基因编码了氨基磷酸转移酶(APH)从而赋与了 对新霉素/卡那霉素抵抗力。该基因已克隆在两个启动子的 后部(图3和图4)，然后导入白色链霉菌和变铝青链霉菌 中，于是这个新基因被有力地表达，证明它对所给予的抗生 素有高水平的抵抗力。此外，我们已经能观察到在聚丙烯酰 胺凝胶中电泳后的原始提取物中的APH合成和对抗APH抗体 的免疫斑点。应该强调，这些结果是用整体的载体在链霉菌 中得到的。因此在这些实验中只有基因neo的和用基因组研 究的启动子一个考贝。事实上，为了判断启动子的能力， 重要的是不要使用大量拷贝的载体来增加neo的拷贝数目， 从而人为地增加neo的表达。

同样，pPM1005的HihdIII-BanHI片段和pPM997的 SmaI-SmaI片段也已被插入到分枝杆菌中去。pPM997的 SmaI-SmaI片段含有neo基因，启动子P2和终止子。