实施例1 获得zfvtg1-1.7的DNA序列
1.斑马鱼的养殖
野生型斑马鱼(Danio rerio)购自国际斑马鱼资源中心,斑马鱼养殖系 统从美国Aquatic Habitats公司引进,喂养方案按照Zebrafish Book描述进行。
2.提取斑马鱼基因组DNA
采用美国promega公司的基因组DNA提取
试剂盒提取斑马鱼基因组DNA。
3.引物设计
根据Trust Sanger Institude斑马鱼数据库预测的vtg1基因(ID: ENSDARG00000016825)设计了序列2、序列3的引物,并引入HindIII和 BamHI酶切位点:
P1:5′-GCTGCAAGCTTACTAATAGGAAGCCAACGAAGGACC-3′(序列2)
P2:5’-CTCGGATCCGCTACAGTCAAGGCAAGCACAACAGC-3’ (序列3)
所述引物由上海赛百盛生物技术公司合成。
4.克隆zfvtg1-1.7序列
Zfvtg1-1.7序列的克隆按照《分子克隆实验指南》的方法进行。
(1)从基因组中扩增zfvtg1-1.7序列
取上述提取的斑马鱼基因组DNA,用引物P1,P2进行PCR扩增,反应体 系如下:
灭菌去离子水: 32μL
10×PCR缓冲液: 5μL
dNTP(2.5mM each): 8μL
P1: 1μL
P2: 1μL
基因组DNA: 2μL
Takara LA Taq DNA聚合酶(5U/μL) 1μL
总体积: 50μL
反应条件:
94℃5分钟,(94℃1分钟,62℃1分钟,72℃2分钟)×30循环,72℃ 7分钟。
取PCR产物进行1%的琼脂糖凝胶
电泳,分析产物片断的大小。并用美国 promega公司的核酸纯化试剂盒纯化上述PCR产物。
(2)构建zfvtg1-1.7-EGFP重组质粒
纯化后的PCR产物用HindIII和BamHI双酶切,与同样双酶切的的pEGFP-1载 体连接,反应体系如下:
pEGFP-1: 1μL
PCR产物: 4μL
SolI(含连接酶): 5μL
16℃连接3小时,转化大肠杆菌感受态DH5α,抽提质粒酶切鉴定,送上海基 康生物技术公司测序。该重组质粒命名为zfvtg1-1.7-EGFP。
所述pEGFP-1载体购自Clontech公司;限制性内切酶购自NEB公司;快速连 接试剂盒购自TaKaRa公司;DH5α菌株由本室保存。
实施例2 zfvtg1-1.7-EGFP启动子活性的鉴定(EGFP和vtg1的
时空表达一致)
1.构建zfvtg1-1.7-EGFP转基因斑马鱼
2.斑马鱼的养殖,转基因技术和荧光观察方法参照《Zebrafish Book》。
(1)斑马鱼养殖
野生型斑马鱼(Danio rerio)购自国际斑马鱼资源中心,斑马鱼养殖系统从 美国Aquatic Habitats公司引进,喂养方案按照《Zebrafish Book》描述进行。
(2)转基因
用限制性内切酶bgl II线性化重组质粒,纯化后溶于含酚红的
磷酸盐缓冲 液,浓度为50ng/μL。当受精卵发育到一至二个细胞阶段,在解剖镜下进行转 基因操作,每受精卵转入外源基因量为100pg(2nL)。
(3)荧光观察
转基因操作后的受精卵分三组:空白组,溶剂组,EE2处理组(100ng/L), 每组800个卵。28℃恒温培养,定期在荧光显微镜下观察荧光表达情况。
(4)RT-PCR和PCR鉴定EGFP的表达和在基因组中的整合
分别取转基因后观察到荧光的鱼和未观察到荧光的鱼(5dpf,每组15条), 按
说明书用Trizol(Invitrogen)一步法提取总RNA。逆转录以1ug总RNA为模 板,10mmol/L的oligodT 1ul,70℃,5min;
冰上加10×缓冲液2ul,25mmol/L 的dNTP4ul,M-MLV(Invitrogen)1ul(200U),42℃,60min,95℃,5min,逆 转录为cDNA。按Krovel AV和Islinger M等的文献[Aquat Toxicol.2003 Jan 24;62(2):85-103;Biol Reprod.2002 Jun;66(6):1881-92]设计引物:
EGFP P1(5’-ACCACATGAAGCAGCACGACT-3’),
EGFP P2(5’-CTTCTCGTTGGGGTCTTTGC-3’);
vtg1 P1(5’-GCT GCT GCA TCTGTC AAT GT-3’),
vtg1 P2(5’-CTG CTG CTG CTTTCA GAA GA-3’)。
以1u逆转录产物为模板,PCR扩增检测EGFP基因和vtg1基因;同时以 pEGFP-1质粒为模板作阳性对照。反应条件如下:94℃预变性5min,每循环包 括94℃变性40sec,55℃复性30sec,72℃延伸40sec,共28个循环,最后1个循 环结束后再72℃延伸7min。扩增
片段进行琼脂糖凝胶电泳分析。
待观察到荧光的鱼长至成熟后,提取基因组DNA(promega DNA提取试剂 盒),PCR鉴定EGFP的基因组整合,引物为上述EGFP P1和EGFP P2,同时以 质粒pEGFP-1为模板作为阳性对照,以野生型鱼基因组DNA为模板作为阴性对 照。反应条件为:94℃预变性5min,每循环包括94℃变性40sec,55℃复性 40sec,72℃延伸1min,共28个循环,最后1个循环结束后再72℃延伸7min。 扩增片段进行琼脂糖凝胶电泳分析。
2.原位杂交检测转基因鱼EGFP和vtg1的表达
(1)重组质粒pGEMTzfvtg1的制备
取上述实验所扩增出来的vtg1cDNA片段(801bp),与promega公司的pGEM-T 载体重组,反应体系如下:
2×连接酶缓冲液:5μL
pGEM-T(50ng): 1μL
PCR产物: 3μL
T4 DNA连接酶: 1μL
4℃连接过夜,转化大肠杆菌感受态DH5α,抽提质粒测序,该重组质粒命名 为pGEMTzfvtg1。
(2)探针标记
用限制性内切酶NcoI使pGEMTzfvtg1充分线性化,反应步骤如下:
反应体系:
pGEMTzfvtg1(1μg/μL):30μL
10×反应缓冲液: 10μL
NcoI(10U/μL): 8μL
水: 52μL
总体积: 100μL
37℃反应过夜。
线性化的pGEMTzfvtg1采用promega公司的核酸纯化试剂盒纯化,具体步骤 按说明书进行。
采用线性化的pGEMTzfvtg1为模板,用地高辛标记的NTP进行RNA探针标 记。反应体系如下:
10×SP6 RNA聚合酶缓冲液: 2μL
DTT(50mM): 2μL
地高辛标记NTP混合物(每种2.5mM):4μL
RNA酶
抑制剂(40U/μL): 0.5μL
pGEMTzfvtg1(0.5μg/μL): 1μL
SP6 RNA聚合酶(50U/μL): 1μL
无RNA酶水: 9.5μL
37℃反应2小时。
加入2μL(2U/μL)的DNA酶,37℃孵育30分钟。
加入2ul
乙二胺四乙酸二钠(pH8.0,0.2mol/L),2.5ul氯化锂(4mol/L),75ul 无水乙醇零下20摄氏度过夜。4℃12000转/分钟离心30分钟,去上清,用50ul 的无RNA酶的水溶解。变性琼脂糖凝胶电泳观察探针的
质量。最后加入450ul 的杂交缓冲液,备用。
(3)幼鱼的处理和固定
幼鱼从胚胎发育第一天开始分组处理:溶剂(0.001%乙醇),100ng/L EE2, 每24小时换液。生长到第五天时,分组收集幼鱼。用0.5毫升PBST洗涤两次。 加入4%的多聚甲
醛0.5毫升,室温静置5分钟,去多聚甲醛。再加入0.5毫升 4%多聚甲醛室温静置5分钟,再置于4℃ 12-15小时。去多聚甲醛,用PBST 0.5 毫升洗涤一次。再用甲醇洗涤三次,最后加入0.5毫升甲醇冻存于零下20摄氏 度。
(4)杂交
(1)用表1所示的溶液和时间使固定的胚胎重新水化:
表1 溶液编号 1 2 3 4 PBST(毫升) 甲醇(毫升) 洗涤时间 1.5 4.5 5分钟 3.0 3.0 5分钟 4.5 1.5 5分钟 6.0 0 5分钟三次
(2)在PBST中用细针头去掉绒毛膜;
(3)在室温用25μg/ml的蛋白酶K消化胚胎30分钟;
(4)室温用4%的多聚甲醛重新固定胚胎20分钟;
(5)用0.5ml的PBST洗5次,每次5分钟;
(6)在300μL杂交液中65℃预杂交2小时,杂交完毕前30分钟用杂交液1/20 稀释探针置于65℃预热30分钟;
(7)去除预杂交液换成含有探针的杂交液,在65℃杂交过夜;
(8)去除杂交液,用表2溶液在65℃洗涤。溶液要在65℃预热30分钟,每 种溶液洗涤时间为10分钟。
表2 溶液编号 1 2 3 4 2×SSC(毫升) 杂交液(毫升) 时间 1.5(25%) 4.5(75%) 10分钟 3.0(50%) 3.0(50%) 10分钟 4.5(75%) 1.5(25%) 10分钟 6.0(100%) 0(0%) 10分钟
(9)用0.5毫升0.2×SSC在65℃洗两次,每次30分钟;
(10)用表3溶液洗涤:
表3 溶液编号 1 2 3 4 PBST(毫升) 0.2×SSC(毫升) 时间 1.5(25%) 4.5(75%) 5分钟 3.0(50%) 3.0(50%) 5分钟 4.5(75%) 1.5(25%) 5分钟 6.0(100%) 0(0%) 5分钟
(11)在PBST中加入2mg/ml的BSA和5%的
绵羊血清作为封闭液,4℃封闭胚 胎1-3小时;
(12)用封闭液1/2000稀释
碱性磷酸酶标记的抗地高辛抗体,使胚胎在此抗 体溶液中4℃过夜;
(13)用含有2mg/ml的PBST洗八次,每次15分钟;
(14)用含有100mM Tris pH=9.5、100mM的
氯化钠、50mM的氯化镁和0.1 %土温-20溶液平衡胚胎;
(15)加入碱性磷酸酶显色液室温显色30分钟至1小时,观察结果。
本发明所采用的杂交相关试剂购自Roche诊断试剂公司。
实验结果表明,在含有100ng/L的17α-炔雌醇的系统水中,生长到第五天 的转基因斑马鱼肝脏出现明显的绿色荧光,肝脏同时表达vtg1;而系统水中如 果不含有17α-炔雌醇,转基因斑马鱼的肝脏不出现荧光,也没有vtg1的表达。 因此zfvtg1-1.7启动的EGFP表达和vtg1的表达在时空上是一致的,而且均受 到雌激素(17α-炔雌醇)的调控。
无需进一步详细阐述,相信采用前面所公开的内容,本领域技术人员可最 大限度地应用本发明。因此,前面的优选具体实施方案应被理解为仅是举例说明, 而非以任何方式限制本发明的范围。
从以上描述,本领域技术人员可很容易地明了本发明的本质特征,而且在不 偏离其主旨和范围的情况下,可对本发明进行各种变更和改进。
SEQUENCE LISTING
<110>复旦大学
<120>斑马鱼卵黄蛋白原-1基因调控序列
<130>Fudan-20050619
<160>3
<170>PatentIn version 3.2
<210>1
<211>1720
<212>DNA
<213>斑马鱼(Danio rerio)
<220>
<221>promoter
<222>(1)..(1720)
<400>1
actaatagga agccaacgaa ggactttaag caatgtgcaa ccaactggtt aaaagccttg 60
cagctgcatt cagcacaact tgcaatcaat ctacagatga ctatttagac aagtgtacag 120
aacattaaat agtccaaccg tgaagagata aaggaatgac aagcatctcc atcttttctt 180
atgaaaccat atttctagtt tttgcaatat tcctaagatg gaaaacactt gcaaacacag 240
attaaaacat agaactttat caaagatgac atccatattt ctgtttccac tgcaatttaa 300
gggtgacaga tacaaaaata ctcaatctct gggatgacat tataaaaatg caaaaatcta 360
catctcagtt ttgtcaggat taagttgaaa attgtcagcc atccatttgt taatggtgac 420
taaacaatcc tgcaagaact gtaagaaaag tacaatagca tatcatcagc atagcaatga 480
taagacacaa atttaaagct gctagtattg ttgcttagag aaagtgtata caaatgaaac 540
agaagagagc ctagcacaga aacttgaggc acgcacagga cagaggaaca gagtctgaca 600
tgtgagttcc tatggacaca gaaaaactcc tgtcaccaag ataggaggat aaccagagct 660
gtcccactat tcccaccaga gaatgcaatg tctttattaa agtgcagtga tcaacattgt 720
caaaatctac actaatatcc agcaaaacca gcacatacta attacctgca tgccattaaa 780
agatcatact taagacaact tggaacaaac aacaagggtc agtcacaaaa taccaggtct 840
accaaaccat ttacacccct tttttatttt ttccaaatac acaaacagtt gtcaaaatgt 900
acattatgtg gacaataaat acagttaaat atgacttggt gtaaataaaa gttaaaaagg 960
catgctgccc agctgtgttc tttcaccttt gcttataaca ggttattgta gntgtcttgt 1020
tgttacttat attaggccta ttttgtgtat atgccaaaaa ccttggccaa ttattaagta 1080
aaaaaaaata ttaggctaac attgacatca cttataaaaa ataatttctt aaaactcata 1140
catatttgcc ttagccccgg tagaaaaata attgcacagt gcctggttcc atacccatac 1200
catcaatggg atttatgcat tggttgctat gtaaatgaga tgttacatct acagtatgtt 1260
ctttaatttg tgttatcaga aaatcatgca ccaaaactta aaaacaaaaa atgcaccaaa 1320
aattatgtaa atctgcctgt ttagttaaat ctggccttaa atgtatacat aaaaataaat 1380
ttttaattaa ttacatctat ttataagtat ctatgtataa aacatctact gcatcagtat 1440
tattttatta ctgaaaaata ataacctttt tatatataaa agattggcga tcattttact 1500
gtgtacattg gcaaaaataa tgacatcatg acaggccagg ttaacctaac ctctggagat 1560
atttttgttc aaataaccaa gtcttaacct gtgtgcagtt ttttttttta cttgtttaaa 1620
gacttatgtt aataattaat ttaagaacta atacttggtc agcaagaaaa tcactataaa 1680
agacccgata ctctcaagag ttcttcacaa accaccagcc 1720
<210>2
<211>36
<212>DNA
<213>斑马鱼(Danio rerio)
<400>2
gctgcaagct tactaatagg aagccaacga aggacc 36
<210>3
<211>35
<212>DNA
<213>斑马鱼(Danio rerio)
<400>3
ctcggatccg ctacagtcaa ggcaagcaca acagc 35