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热稳定性 碳酸酐酶及其用途

阅读：250发布：2023-02-12

专利汇可以提供热稳定性碳酸酐酶及其用途专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明涉及Caminibacter 碳酸酐酶在CO2提取，例如从烟道气、生物气、天然气或环境空气提取中的用途。所述Caminibacter碳酸酐酶由于其热稳定性特别适用于这些用途。，下面是热稳定性碳酸酐酶及其用途专利的具体信息内容。

权利要求

1.可从属于Caminibacter属的菌株获得的或可由属于Caminibacter属的菌株产生的碳酸酐酶用于从含二氧化碳的介质中提取二氧化碳的用途。
2.权利要求1的用途，其中所述碳酸酐酶可从选自下组的菌种之一的菌株获得或可由选自下组的菌种之一的菌株产生：Caminibacter hydrogeniphilus、Caminibacter mediatlanticus和Caminibacter profundus。
3.权利要求1或2的用途，其中所述碳酸酐酶可从如下菌株之一获得或或可由如下菌株之一产生：Caminibacterhydrogeniphilus DSM 14510、Caminibactermediatlanticus DSM 16658或Caminibacterprofundus DSM 15016。
4.权利要求1至3任一项的用途，其中所述碳酸酐酶是
a) 来源于或可由 Caminibacter mediatlanticus DSM 16658或 Caminibacter hydrogeniphilus DSM 14510产生；或
b)具有对应于SEQ ID NO：2的氨基酸残基28至259或36至259或SEQ ID NO：13的氨基酸残基23至243的氨基酸序列的多肽；或
c)与SEQ ID NO：2的氨基酸残基28至259或36至259或与SEQ ID NO：13的氨基酸残基23至243至少60％相同的多肽；或
d)(a)、(b)或(c)具有碳酸酐酶活性的片段；或
e)由核酸序列编码的多肽，所述核酸序列在中等严格条件下与下述杂交：
i)编码SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：13的成熟多肽的多核苷酸序列；或
ii)SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：16的多核苷酸序列；或iii)(i)或(ii)的至少100个连续核苷酸的亚序列，或
iv)(i)或(ii)的互补链；或
f)由核酸序列编码的多肽，所述核酸序列由于遗传密码的简并性，并不与SEQ ID NO：
1、SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：16的多核苷酸序列杂交，但编码具有依照b)或c)的氨基酸序列的多肽。
5.前述任一项权利要求的用途，其中所述碳酸酐酶在55℃或更高的温度15分钟之后保持至少30％的残余活性。
6.前述任一项权利要求的用途，其中所述含二氧化碳的介质是气体或多相混合物。
7.权利要求6的用途，其中所述含二氧化碳的气体或多相混合物是从燃烧排出的。
8.权利要求7的用途，其中所述气体是烟道气。
9.权利要求6的用途，其中所述含二氧化碳的气体或多相混合物是原天然气或合成气。
10.权利要求6的用途，其中所述含二氧化碳的气体或多相混合物是生物气。
11.权利要求1至5任一项的用途，其中所述含二氧化碳的介质是含碳酸氢根的液体，且所述二氧化碳提取是从碳酸氢根转化为二氧化碳。
12.前述任一项权利要求的用途，其中所述二氧化碳的提取是在55℃-120℃的温度进行的。
13.一种用于提取二氧化碳的方法，包括用可从属于Caminibacter属的菌株获得的或可由属于Caminibacter属的菌株产生的碳酸酐酶处理含二氧化碳的介质。
14.一种具有碳酸酐酶活性的分离的多肽，其选自下组：
a)来源于或可由Caminibacter hydrogeniphilus DSM 14510产生的多肽；或b)具有对应于SEQ ID NO：13的氨基酸残基23至243的氨基酸序列的多肽；或c)与SEQ ID NO：13的氨基酸残基23至243至少60％相同的多肽；或
d)(a)、(b)或(c)具有碳酸酐酶活性的片段；或
e)由核酸序列编码的多肽，所述核酸序列在中等严格条件下与下述杂交：
i)编码SEQ ID NO：13的成熟多肽的多核苷酸序列；或
ii)SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：16的多核苷酸序列；或
iii)(i)或(ii)的至少100个连续核苷酸的亚序列，或
iv)(i)或(ii)的互补链；或
f)由核酸序列编码的多肽，所述核酸序列由于遗传密码的简并性，并不与SEQ ID NO：
12或SEQ ID NO：16的多核苷酸序列杂交，但编码具有依照b)或c)的氨基酸序列的多肽。
15.一种分离的多核苷酸，其具有编码权利要求14的多肽的核苷酸序列。
16.一种分离的多核苷酸，可由如下获得：
a)将DNA群体在中等严格条件下与以下杂交：
i)SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：16的多核苷酸序列，
ii)包含于SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：16的多核苷酸序列中的cDNA序列，或iii)(i)或(ii)的互补链；和
b)分离所述杂交的多核苷酸，其编码具有碳酸酐酶活性的多肽。
17.一种核酸构建体，包含权利要求15或16的多核苷酸，所述多核苷酸可操作地连接于在表达宿主中指导所述多肽产生的一个或多个调控序列。
18.一种重组表达载体，包含权利要求17的核酸构建体。
19.一种重组宿主细胞，包含权利要求17的核酸构建体或权利要求18的重组表达载体。
20.一种产生权利要求14的多肽的方法，包括：
a)培养菌株以产生所述多肽，所述菌株以其野生型形式能够产生所述多肽；和b)回收所述多肽。
21.一种产生权利要求14的多肽的方法，包括：
a)在有助于产生所述多肽的条件下培养权利要求19中限定的重组宿主细胞；和b)回收所述多肽。
22.一种组合物，包含赋形剂和选自下组的碳酸酐酶：
a)来源于或可由Caminibacter mediatlanticus DSM 16658或 Caminibacter hydrogeniphilus DSM 14510产生的多肽；或
b)具有对应于SEQ ID NO：2的氨基酸残基28至259或36至259或者SEQ ID NO：13的氨基酸残基23至243的氨基酸序列的多肽；或
c)与SEQ ID NO：2的氨基酸残基28至259或36至259或与SEQ ID NO：13的氨基酸残基23至243至少60％相同的多肽；或
d)(a)、(b)或(c)具有碳酸酐酶活性的片段；或
e)由核酸序列编码的多肽，所述核酸序列在中等严格条件下与下述杂交：
i)编码SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：13的成熟多肽的多核苷酸序列；或
ii)SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：16的多核苷酸序列；或iii)(i)或(ii)的至少100个连续核苷酸的亚序列，或
iv)(i)或(ii)的互补链；或
f)由核酸序列编码的多肽，所述核酸序列由于遗传密码的简并性，并不与SEQ ID NO：
1、SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：16的多核苷酸序列杂交，但编码具有依照b)或c)的氨基酸序列的多肽。
23.权利要求22的组合物，其中所述组合物包含适于固定化的基质。
24.权利要求23的组合物，其中所述基质选自下组：珠、织物、纤维、中空纤维、膜、颗粒、多孔表面、杆和管。
25.一种用于提取二氧化碳的生物反应器，其中所述反应器包含可从菌株获得的或可由菌株产生的碳酸酐酶，所述菌株属于Caminibacter属，优选选自下组菌种：
Caminibacter hydrogeniphilus、Caminibacter mediatlanticus 和 Caminibacter profundus；甚至更优选作为DSM 14510、DSM 16658或DSM15016保藏的菌株。
26.权利要求25的生物反应器，其中所述碳酸酐酶是：
a)来源于或可由Caminibacter mediatlanticus DSM 16658或 Caminibacter hydrogeniphilus DSM 14510产生的；或
b)具有对应于SEQ ID NO：2的氨基酸残基28至259或36至259或者SEQID NO：13的氨基酸残基23至243的氨基酸序列的多肽；或
c)与SEQ ID NO：2的氨基酸残基28至259或36至259或与SEQ ID NO：13的氨基酸残基23至243至少60％相同的多肽；或
d)(a)、(b)或(c)具有碳酸酐酶活性的片段；或
e)由核酸序列编码的多肽，所述核酸序列在中等严格条件下与下述杂交：
i)编码SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：13的成熟多肽的多核苷酸序列；或
ii)SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：16的多核苷酸序列；
或
iii)(i)或(ii)的至少100个连续核苷酸的亚序列，或
iv)(i)或(ii)的互补链；或
f)由核酸序列编码的多肽，所述核酸序列由于遗传密码的简并性，并不与SEQ ID NO：
1、SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：16的多核苷酸序列杂交，但编码具有依照b)或c)的氨基酸序列的多肽。
27.权利要求25或26的反应器，其中所述反应器包含下述元件：
a)至少一个吸收模块；
b)至少一个沉淀阶段；
c)载液；和
d)用于将吸收模块连接至沉淀阶段从而使得载液可从吸收模块传至沉淀阶段的装置。
28.权利要求25或26的反应器，其中所述反应器包含下述元件：
a)至少一个吸收模块；
b)至少一个解吸模块；
c)载液；和
d)用于连接吸收模块和解吸模块从而使得载液可从吸收模块传至解吸模块的装置。
29.权利要求25、26或28任一项的生物反应器，其中所述碳酸酐酶截留于吸收模块和/或解吸模块，或截留于沉淀阶段。
30.权利要求25至29任一项的生物反应器，其中所述反应器进一步包含基于碳酸氢根的载液。
31.权利要求25至30任一项的生物反应器，其中所述反应器进一步包含基于胺的载液。

说明书全文

热稳定性 碳酸酐酶及其用途

技术领域

[0001] 本发明涉及可从Caminibacter获得的碳酸酐酶在CO2提取，例如从烟道气、生物气、天然气或环境空气提取中的用途。本发明还涉及用于提取二氧化碳的生物反应器和可用于此种提取工艺的组合物。本发明进一步涉及碳酸酐酶。

背景技术

[0002] 二氧化碳(CO2)排放是全球变暖现象的重要原因。CO2是燃烧的副产物，且其造成操作、经济和环境问题。CO2排放可通过在CO2气体排放至大气之前将其捕捉来控制。有几种控制CO2排放的化学方法(A.Kohl和R.Nielsen，Gas Purification，第5版，Gulf Professional Publishing，Houston，TX，1997)。然而，许多这些方法具有缺点，如高能耗、缓慢的工艺和使用生态学上可疑或有毒的化合物。

[0003] 使用碳酸酐酶以非常高的速率(周转数为高至每秒105个CO2分子)催化CO2转化为碳酸氢根的能力的基于酶的方法克服了CO2捕捉中涉及的反应速率和环境问题。从气体如燃烧气体或呼吸气体使用碳酸酐酶提取CO2的技术方案，已描述于WO 2006/089423、US 6,524,842、WO 2004/007058、WO2004/028667、US 2004/0029257、US 7,132,090、WO2005/114417、US6,143,556、WO 2004/104160、US 2005/0214936和WO 2008/095057。一般而言，这些技术通过将可溶性或固定化的碳酸酐酶与可处于气相或液相的CO2相接触来运行。在水存在下，碳酸酐酶催化CO2转化为碳酸氢根离子，其取决于介质的pH可进一步质子化或去质子化为碳酸和/或碳酸根离子。这些离子可用来促进藻类或利用碳酸氢根/碳酸根作为碳源的微生物的生长，在环境介质诱导pH变化或提供缓冲能力，对于后续化学工艺提供碳酸氢根/碳酸根作为活性剂，或作为碳酸盐沉淀，或转化回纯CO2，然后可对其加以利用(例如在增强的油回收，用于生产尿素，用于食品和饮料加工，或向温室或养殖塘提供CO2)，释放(例如从封闭式生命支持环境如潜水艇、太空船或人造肺)，压缩(例如用于通过管道运输)或储藏(如在地质学或深海地层或盐水含水层(saline aquifer)中)。

[0004] 哺乳动物、植物和原核生物碳酸酐酶(α-和β-型CA)一般在生理温度(37℃)或更低温度起作用。然而，燃烧气体或溶解其的液体的温度可容易地超过用于捕捉CO2的碳酸酐酶的最适温度。使用基于酶的方案的一个缺点是在CO2提取工艺中在将含CO2的气/液与碳酸酐酶接触之前可需要彻底的冷却，而冷却是耗能过程。因此，当在与产业相关的条件下使用酶时，有对于更加热稳定性碳酸酐酶的需要。

发明内容

[0005] 本发明的一个方面是来源于或可由Caminibacter属的细菌产生的碳酸酐酶在从含二氧化碳的介质中提取二氧化碳中的用途。用于本发明的碳酸酐酶在15分钟之后，优选2小时之后在0.1M Britton-Robinson缓冲液pH 8.0，在55℃或以上的温度，优选在60℃或以上，优选在65℃或以上，更优选在70℃、75℃、80℃或85℃或以上，甚至更优选在90℃或以上，且最优选在100℃以上，维持至少30％，优选至少40％残余活性。热稳定性碳酸酐酶特别用于当提取工艺中的条件需要酶暴露于高温时，能够提取从燃烧，或从原天然气(raw natural gas)或合成气或生物气或环境空气排放的CO2的生物反应器。然而，所述酶亦可用于并不在高温发生的工艺中，因为它们在较低温度例如0℃，室温(20至25℃)和37℃亦维持活性。当在制造、使用或空闲期(例如储藏于热的仓库时)过程中，碳酸酐酶暴露于高温环境(即，温度超过45℃、50℃或甚至55℃处)时，热稳定性亦为有用的。使用过程中的热稳定性可包括碳酸酐酶在一个温度(例如45℃、50℃、55℃、60℃或65℃)进行催化，接着由于工艺中的不同阶段，暴露于较高温度(例如70℃、75℃、80℃、85℃、90℃、95℃或
100℃)，此时其亦进行催化或维持空闲直至暴露于工艺的下一阶段(如较低温度)，此时碳酸酐酶重新进行催化的情况。在这些情况下，碳酸酐酶可能必须承受在使用过程中反复暴露于较低和较高温度，因此需要热稳定性碳酸酐酶。

[0006] 在另一个方面，本发明提供了组合物，其包含适用于固定化的基质和来源于或由Caminibacter属细菌产生的碳酸酐酶。

[0007] 在另一个方面本发明提供了适用于提取二氧化碳的生物反应器。附图说明

[0008] 图1是中空纤维膜生物反应器的示意表示。数字代表下述特征：1.二氧化碳(CO2)罐；2.氮气(N2)罐；3.质流控制器(MFC)；4.载液储器；5.液体泵；6.压力计；7.中空纤维膜模块；8.废物；9.进料气(feed gas)；10.洗涤气(scrubbed gas)；11.质流计(Mass flow meter，MFM)；12.气体取样阀；13.气相色谱仪；14.进入的进料气；15.排出的洗涤气；16.进入的液体；17.排出的液体。

[0009] 图2是用于从混合气体提取CO2的一般性再循环吸收/解吸工艺的示意图示。在该一般性工艺中，富CO2的进料气(1)进入吸收模块(2)，优选气体从一端(例如底部)进入，在该处与进入吸收模块的贫CO2载液(3)相接触，所述载液优选从进料气相反一端进入(例如顶部)。去除了CO2的洗涤气(4)排出吸收模块。富CO2的载液(5)排出吸收模块，并(任选地)经过温度调节器(例如热交换器)(6)，然后进入(优选在一端(例如顶部))解吸模块(7)。施于所述解吸模块的热(8)，如由再沸器或直接蒸汽提供的，或真空(9)，或这些的组合，导致提取的CO2从载液释放，并排出(10)解吸模块，(任选地)在压缩和/或使用纯化的CO2气(12)之前经过冷凝器(11)以去除载液蒸汽。贫CO2的载液排出解吸模块，并(任选地)经过温度调节器(例如热交换器)，然后回到吸收模块。耗尽的和/或辅助的载液组分可在该工艺中的多个点添加，如在指示的位置(13a和13b)。不可溶的污染物可在工艺中的多个点从循环液体去除，如在指示的位置(14)。

[0010] 发明详述

[0011] 本发明的一个方面涉及可从Caminibacter属细菌菌株获得的或可由Caminibacter属细菌菌株产生的碳酸酐酶用于从含CO2介质如气体、液体或多相混合物提取CO2的用途。当所述含CO2的介质的温度高于商业上可获得的碳酸酐酶如从人或牛红细胞分离的CA-I或CA-II的最适温度时，本发明是特别有用的。

[0012] 定义

[0013] 术语“碳酸酐酶活性”或“CA活性”在本发明中定义为EC 4.2.1.1活性，其催化二氧化碳和碳酸氢根之间的相互转化就本发明而言，CA活性是根据实施例4中所述的方法确定的。一个单位的CA活性如Wilbur所定义：[1U＝(1/tc)-(1/tu)x 1000]，其中U是单位数，而tc和tu分别代表用秒表示的催化和未催化反应的时间(Wilbur， 1948，J. Biol.Chem.176：147-154)。当本发明的多肽具有由对应于SEQ ID NO：2的氨基酸残基28至259或36至259的氨基酸序列组成的多肽的CA活性的至少20％，优选至少40％，更优选至少50％，更优选至少60％，更优选至少70％，更优选至少80％，甚至更优选至少90％，最优选至少95％，且甚至最优选至少100％时，其视为具有CA活性。

[0014] 术语“贫CO2”和“富CO2”载液为在本发明中用于描述当循环经过整个工艺时载液中存在的碳(例如，以溶解CO2、经化学反应的CO2、碳酸氢根、碳酸和/或碳酸盐的形式)的相对量的术语。如用于本文，术语“贫CO2的载液”一般指进入吸收模块的载液。术语“富CO2的载液”一般指进入解吸模块的载液。应理解的是，术语“贫CO2的载液”亦可适用于排出解吸模块的载液，而术语“富CO2的载液”亦可适用于排出吸收模块的载液。在系统内在给定时间点，富CO2的载液与贫CO2的载液相比，包含更多碳。

[0015] 术语“含CO2的介质”用于描述包含至少0.001％CO2，优选至少0.01％，更优选至少0.1％，更优选至少1％，更优选至少5％，最优选10％，甚至更优选至少20％，且甚至最优选至少50％CO2的任何材料。优选地，在任何压力下，含CO2的介质具有5℃-110℃，更优选10℃-100℃，更优选20℃-95℃，更优选30℃-90℃，更优选40℃-85℃，更优选50℃-80℃，更优选55℃-75℃，且最优选60℃-70℃的温度。含CO2的介质特别而言是气相(包括气体混合物)、液体或多相混合物，但亦可为固体。包含CO2的气相例如为可从油井、气井和冷凝井获得的原天然气，通过含碳燃料(例如甲烷)气化为包含CO和H2气体产物生成的合成气，或来自燃烧过程例如来自基于碳的产生电的发电厂的排放流，或来自此类厂、工业熔炉、火炉、烤箱或壁炉的烟道气排气管或来自飞机或汽车排气管(exhaust)。包含CO2的气相还可为环境空气(包括热(高于40℃)空气，例如沙漠空气)，或来自哺乳动物(如人工肺中的包含CO2的气相)、活植物和其他排放CO2的物种中的呼吸过程，特别是来自温室。包含CO2的气相亦可为来自有氧或厌氧发酵，如酿造，产生有用产物如乙醇的发酵或生物气生产的废气。此类发酵过程若受嗜热微生物的促进，可在高温发生，例如生物气产生中面临的情况。包含CO2的气相还可为为了使用或储藏富含CO2的气相。上述气相亦可作为多相混合物出现，其中所述气体与一定程度的流体(例如水或其他溶剂)和/或固体材料(例如灰或其他颗粒)一同存在。包含CO2的液体为包含可测量的量(优选在任何压力以任何上文提及的水平)的CO2任何溶液或流体，特别是水性液体。包含CO2的液体可通过将包含CO2的气体或固体(例如干冰或包含可溶性碳酸盐的盐)传入液体来获得。包含CO2的流体亦可为经压缩的CO2液体(其包含污染物，如干洗流体)、超临界CO2，或CO2溶剂液体，如离子液体(ionic liquid)。

[0016] 术语“CO2提取”应理解为自含CO2的介质减少碳。这样的提取可以从一种介质到另一种介质地进行，例如气体到液体、液体到气体、气体到液体到气体、液体到液体或液体到固体，但是提取也可以是同一介质中CO2向碳酸氢根、碳酸根或碳酸的转化，或在同一介质中碳酸氢根向CO2的转化。术语CO2捕捉还用于指CO2从一种介质到另一种介质的提取或CO2向碳酸氢根/碳酸根的转化或碳酸氢根/碳酸根向CO2的转化。

[0017] 术语“编码序列”意指直接指定多肽氨基酸序列的多核苷酸。编码序列的边界一般由开读框决定，其通常以ATG起始密码子或诸如GTG和TTG的替代起始密码子开始，并以终止密码子如TAA、TAG和TGA结束。编码序列可以是DNA、cDNA、合成或重组多核苷酸。

[0018] 术语“多肽的功能性片段”或“具有碳酸酐酶活性的多肽片段”用于描述自更长的多肽(亲本多肽)衍生的多肽，例如成熟多肽，而且它已经在N-端区和/或C-端区中截短以生成亲本多肽的片段。为了成为功能性多肽，片段必须维持亲本多肽的CA活性的至少20％、优选至少40％、更优选至少50％、更优选至少60％、更优选至少70％、更优选至少80％、甚至更优选至少90％、最优选至少95％和甚至最优选至少100％。

[0019] 术语“同一性”用于描述两种氨基酸序列或两种核酸序列之间的相关性。就本发明而言，两种氨基酸序列的比对是使用来自EMBOSS包(emboss.org)2.8.0版的Needle程序测定的。Needle程序执行Needleman和Wunsch，1970，J.Mol.Biol.48：443-453中描述的全局比对算法。所使用的替代矩阵是BLOSUM62，缺口打开罚分是10，而缺口延伸罚分是0.5。两种氨基酸序列之间的同一性程度是以两种序列的比对中精确匹配数目除以最短序列的长度来计算的。结果以百分比同一性来表述。在“第一序列”与“第二序列”在重叠的同一位置具有相同氨基酸残基时(在下文的比对实例中，这以“|”表示)，发生精确匹配。
在下文纯粹假设的比对实例中，重叠为序列1的氨基酸序列“HTWGERNL”；或序列2的氨基酸序列“HGWGEDANL”。在该实例中，缺口以“-”表示。

[0020] 序列1：ACMSHTWGER-NL (SEQ ID NO：10)

[0021] | || |

[0022] 序列2：HGWGEDANLAMNPS(SEQ ID NO：11)

[0023] 两种核苷酸序列之间的同一性程度是使用与上文所述相同的算法、软件包和设置确定的。

[0024] 术语“加热稳定的”或“热稳定的”用于指酶(诸如碳酸酐酶)时，指明了该酶在高温，即，45℃以上、优选50℃以上、更优选55℃以上、更优选60℃以上、甚至更优选65℃以上、最优选70℃以上、最优选75℃以上、最优选80℃以上、最优选85℃以上、最优选90℃以上和甚至最优选100℃以上，是功能性的或有活性的(即能进行催化)。在一个优选的实施方案中碳酸酐酶在上示温度之一显示最适活性，即该酶的最适温度在上示温度之一。碳酸酐酶的温度稳定性能通过配制(例如通过与稳定化化学品组合或通过酶的固定化)或通过化学修饰(例如交联)而提高一定程度，以保持酶处于有活性的三维形状。要使酶认为是热稳定的，它在高温在至少15分钟之后维持活性，优选维持至少2小时、更优选至少24小时、更优选至少7天、更优选至少10天、甚至更优选至少14天、最优选至少30天、甚至最优选至少50天。一般而言，活性水平是使用实施例5中所述的测定法在给定高温在pH 8在0.1MBritton-Robinson缓冲液中温育给定时间后测量的。可以将该活性与温度升高前的酶活性进行比较，由此获得热处理之后酶的残余活性。优选地，所述残余活性在高温在给定时间之后为至少30％，更优选至少40％，更优选至少50％，更优选至少60％，甚至更优选至少70％，最优选至少80％，甚至最优选残余活性为至少90％，且绝对最优选残余活性的水平在高温在给定时间之后为至少相等或未变化。

[0025] 术语“宿主细胞”在意指任何对使用包含本发明多核苷酸的核酸构建体或表达载体的转化、转染、转导等易感的细胞类型。术语“宿主细胞”涵盖任何由于在复制过程中发生的突变而不同于亲本细胞的亲本细胞的任何后代。

[0026] 术语“分离的多核苷酸”意指相对于如自然界所见的该多核苷酸经人为修饰的多核苷酸。在一个方面，所述分离的多核苷酸如通过琼脂糖电泳确定的为至少1％纯，例如至少5％纯，更加至少10％纯，至少20％纯，至少40％纯，至少60％纯，至少80％纯，至少90％纯和至少95％纯。所述多核苷酸可为基因组、cDNA、RNA、半合成、合成来源的或其任意组合。

[0027] 术语“分离的多肽”意指如通过SDS-PAGE确定的，至少20％纯、优选至少40％纯、更优选至少60％纯、甚至更优选至少80％纯、最优选至少90％纯和甚至最优选至少95％纯的多肽。

[0028] 术语“成熟多肽”意指为翻译和任何翻译后修饰如N端加工、C端截短、糖基化、磷酸化等之后的最终形式的多肽。在一个方面，所述成熟多肽是SEQID NO：2的36至259或SEQ ID NO：13的氨基酸残基23至243。本领域已知宿主细胞可产生由相同多核苷酸表达的两种或更多种不同成熟多肽的混合物(即，具有不同的C端和/或N端氨基酸)。

[0029] 术语“成熟多肽编码序列”意指编码具有碳酸酐酶活性的成熟多肽的多核苷酸。

[0030] 术语“可操作连接”意指如下的构造，其中调控序列位于相对于多核苷酸编码序列适当的位置，使得调控序列指导编码序列的表达。

[0031] 术语“分泌的多肽”在用于本文时应理解为在细胞中表达后被转运至和释放至周围的胞外培养基或结合/包埋在细胞膜中使得多肽的至少一部分暴露于周围的胞外培养基的多肽。

[0032] 术语“亚序列”意指从成熟多肽编码序列的5’和/或3’端缺失一个或多个(几个)核苷酸的多核苷酸；其中所述亚序列编码具有碳酸酐酶活性的片段。

[0033] 术语“基本上纯的多肽”在本文中指含有(按重量计)至多10％、优选至少8％、更优选至多6％、更优选至多5％、更优选至多4％、至多3％、甚至更优选至多2％、最优选至多1％、和甚至最优选至多0.5％与其天然相关的其它多肽物质的多肽制备物。因此，优选的是基本上纯的多肽是至少92％纯的、优选至少94％纯的、更优选至少95％纯的、更优选至少96％纯的、更优选至少96％纯的、更优选至少97％纯的、更优选至少98％纯的、甚至更优选至少99％纯的、最优选至少99.5％纯的、和甚至最优选100％纯的(以制备物中存在的总多肽物质的重量计)。本发明的多肽优选是处于基本上纯的形式。特别地，优选的是多肽是处于“基本上纯的形式”，即，多肽制备物基本上不含与其天然相关的其它多肽物质。这可以通过例如通过公知的重组方法或经典的纯化方法制备多肽来实现。

[0034] 在本文中，术语“基本上纯的多肽”与术语“分离的多肽”和“处于分离的形式的多肽”同义。

[0035] 术语“合成气”或“合成气体”用于描述通过含碳燃料(例如甲烷或天然气)气化成具有热值的气体产物而生成的、含有不同量的一氧化碳和氢气的气体混合物。CO2在合成气反应中产生，而且必须去除以提高热值。

[0036] 与生物体有关的术语“嗜热的”描述在相对较高的温度(即45℃以上)旺盛生长的生物体。超嗜热生物体在极热环境中(也就是比60℃左右更热)旺盛生长，最适温度为80℃以上。

[0037] 可从Caminibacter获得的碳酸酐酶及其用途

[0038] 目前已知几种热稳定的碳酸酐酶，包括来自热自养甲烷杆菌(Methanobacterium thermoautotrophicum)ΔH的β类CA(Cab)(其据报道在高达75℃是热稳定的)(Smith和Ferry，1999，J.Bacteriol.181：6247-6253)和来自嗜热甲烷八叠球菌(Methanosarcina thermophila)TM-1的γ类碳酸酐酶(Cam)。Cam是在1994年得到首次分离的(Alber和Ferry，1994，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：6909-1913)，而且在1996年显示出在55℃加热时稳定15分钟(Alber和Ferry，1996，J.Bacteriol.178：3270-3274)。Cam是唯一得到分离的γ类酶，而且自其发现之后已经进行了许多表征研究。US 2006/0257990描述了人碳酸酐酶II的变体，其中大多数稳定变体在高至65℃显示活性。US2004/0259231公开了Cab以及非热稳定性人CA同工型IV在CO2溶解和浓缩工艺中的用途。WO 2008/095057描述了来自克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)和Bacillus halodurans的热稳定性α-碳酸酐酶及其用于提取CO2中的用途。

[0039] 本发明的一个方面是从Caminibacter属的细菌菌株分离的热稳定性碳酸酐酶，或落入本发明的Caminibacter碳酸酐酶的给定序列同一性的碳酸酐酶，在从含CO2的介质如气体、液体或多相混合物中提取CO2的技术应用。优选地，所述Caminibacter碳酸酐酶是α类碳酸酐酶。优选地，CO2是从一种介质如气体，提取至第二种介质如液体，涉及在第二种介质中将CO2转化为碳酸氢根，这亦称作CO2的吸收。反提取过程，其中含CO2的介质中的碳酸氢根转化为CO2，然后将其从第一介质释放至第二介质如气体，亦为可适用本发明的碳酸酐酶的合意的工艺。此工艺也称为CO2的解吸。当含CO2的介质的温度和/或提取过程中碳酸酐酶存在的某些阶段的温度高于商业上可获得的碳酸酐酶(如从人或牛红细胞分离的CA-I或CA-II(其具有大约37℃的最适温度)时，或当温度高于少数已知的热稳定性碳酸根酶的最适温度时，本发明是特别有用的。可发生温度升高的工艺阶段的一个实例是当使热的烟道气与用于从所述烟道气吸收CO2的包含碳酸根酶的液体相接触时。另一个实例是目前的CO2洗涤技术，如用碳酸盐(例如热碳酸钾工艺)、烷醇胺(例如单乙醇胺、甲基二乙醇胺等)或其他胺类(例如氨)的化学吸收，其在解吸工艺中使用高温(高至约120至130℃)。

[0040] 已从深海热泉(hydrothermal vent)分离了属于Caminibacter属的几种细菌菌株。目前，鉴定了三个菌种，即C.hydrogeniphilus、C.mediatlanticus和C.profundus(Alain等，2002，International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 52：1317-23；Miroshnichenko 等，2004，International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 54：41-45 以及 Voordeckers 等，2005，International Journal of Systematic and Evolutionary_Microbiology 55：773-79)。
据报道这些菌株在45℃-70℃的温度生长。已对Caminibacter mediatlanticusTB-2进行基因组测序(EMBL-EBI ID ABCJ01000003)。在本申请中识别为SEQ ID NO：1的开读框是从该研究获得的，并预期以UniProt登录号A6DCH2公开的翻译的多肽序列可得到具有碳酸酐酶活性的蛋白质。看来从未表达或表征该蛋白质以确证该预测。本发明的实施例首次描述了来自C.mediatlanticusDSM 16658的成熟碳酸酐酶的克隆、表达和分离，并确证其氨基酸序列给出具有碳酸酐酶活性的酶。该酶的表征亦揭示其热稳定性达到无法基于该细菌的生长温度预期的水平。显示该酶在pH 8在1M NaHCO3中或在0.1MBritton-Robinson缓冲液pH 8在80℃温育15分钟之后保持其所有碳酸酐酶活性，并2小时之后残余活性分别为83％或82％。

[0041] 与具有UniProt登录号：A6DCH2的Caminibacter碳酸酐酶最紧密相关的碳酸酐酶为52.9％相同的Mtratiruptor sp.碳酸脱水酶(EC＝4.2.1.1，UNIPROT登录号A6Q1X3)。此外，本发明还公开了从Caminibacter hydrogeniphilus DSM14510分离的新颖碳酸酐酶。该碳酸酐酶与具有UniProt登录号：A6DCH2的Caminibacter碳酸酐酶的成熟序列58.2％相同，并与Mtratiruptor sp.碳酸脱水酶(EC＝4.2.1.1，UNIPROT登录号A6Q1X3)52.8％相同。C.hydrogeniphilus CA的开读框鉴定为SEQ ID NO：12，经优化用于在枯草芽孢杆菌(Bacillus subtitlis)中表达的合成基因鉴定为SEQ ID NO：16。可能可通过进一步优化SEQ ID NO：16来获得更佳的表达。由这些序列编码的碳酸酐酶表示为SEQ ID NO：13和15。已显示该酶在80℃稳定至少15分钟。

[0042] 本发明的一个实施方案是具有碳酸酐酶活性的分离的多肽，选自下组：a)来源于或可由Caminibacter hydrogeniphilus DSM 14510产生的多肽；或b)具有对应于SEQ ID NO：13的氨基酸残基23至243的氨基酸序列的多肽；或c)与SEQ ID NO：13的氨基酸残基23至243至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、
97％、98％或99％相同的多肽；或d)(a)、(b)或(c)具有碳酸酐酶活性的片段；或e)由核酸序列编码的多肽，所述核酸序列在中等严格条件下与下述杂交：i)编码SEQ ID NO：13的成熟多肽的多核苷酸序列；或ii)SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：16的多核苷酸序列；或iii)(i)或(ii)的至少100个连续核苷酸的亚序列，或iv)(i)或(ii)的互补链；或f)由核酸序列编码的多肽，所述核酸序列由于遗传密码的简并性，并不与SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：16的多核苷酸序列杂交，但编码具有依照b)或c)的氨基酸序列的多肽，或g)由核酸序列编码的多肽，所述核酸序列与SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：16至少60％、65％、70％、
75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。

[0043] 在本发明的一个实施方案中，待应用于CO2提取的碳酸酐酶来源于、可获得自或可产生自选自下述菌种之一的细菌菌株：Caminibacter hydrogeniphilus、Caminibacter mediatlanticus或Caminibacter profundus，优选待应用于CO2提取的碳酸酐酶来源于或可产生自作为Caminibacter hydrogeniphilus DSM 14510、Caminibacter mediatlanticus DSM 16658或Caminibacter profundus DSM 15016保藏的菌株之一。

[0044] 在另一个实施方案中，待应用于CO2提取的碳酸酐酶为a)来源于、可获得自或可产生自Caminibacter mediatlanticus DSM 16658或Caminibacter hydrogeniphilus DSM14510；或b)具有对应于SEQ ID NO：2的氨基酸残基28至259或36至259的氨基酸残基或SEQ ID NO：13的氨基酸残基23至243的氨基酸序列的多肽；或c)与SEQ ID NO：2的氨基酸残基28至259或36至259或SEQ ID NO：13的氨基酸残基23至243至少60％、
65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的多肽；或d)(a)或(b)或(c)具有碳酸酐酶活性的片段；或e)由核酸序列编码的多肽，所述核酸序列在中等严格条件下与下述杂交：i)编码SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：13的成熟多肽的多核苷酸序列；或ii)SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：12或SEQ ID NO：16的多核苷酸序列；或iii)(i)或(ii)的至少100个连续核苷酸的亚序列，或iv)(i)或(ii)的互补链(Sambrook，Fritsch和Maniatis，1989，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor，NewYork)；或f)由核酸序列编码的多肽，所述核酸序列由于遗传密码的简并性，并不与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：16的多核苷酸序列杂交，但编码具有依照b)或c)的氨基酸序列的多肽，或g)由核酸序列编码的多肽，所述核酸序列与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：16至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、
90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。c)、e)或g)中的多肽可为合成的，或来源于除了Caminibacter以外的其他菌种，只要该多肽落入要求保护的同一性，并保持碳酸酐酶活性。当使用术语Caminibacter碳酸酐酶时，其亦包括c)、e)和g)的碳酸酐酶。

[0045] 依照本发明，杂交条件定义如下。对于长度至少100个核苷酸的长探针，将非常低至非常高的严格条件定义为在42℃，在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml已剪切并且变性的鲑精DNA中，并且对于非常低和低严格性为25％的甲酰胺、对于中和中-高严格性为35％的甲酰胺、或对于高和非常高严格性为50％的甲酰胺，根据标准的Southern印迹法进行预杂交和杂交最佳12至24小时。使用2X SSC、0.2％SDS优选至少在45℃(非常低严格性)，至少在50℃(低严格性)，至少在55℃(中严格性)，至少在60℃(中-高严格性)，至少在65℃(高严格性)，至少在70℃(非常高严格性)将载体材料最终洗涤三次，每次
15分钟。在一个具体实施方案中，洗涤是使用2X SSC、0.2％SDS优选至少在45℃(非常低严格性)，更优选至少在50℃(低严格性)，更优选至少在55℃(中严格性)，更优选至少在
60℃(中-高严格性)，甚至更优选至少在65℃(高严格性)，且最优选至少在70℃(非常高严格性)进行的。在另一个具体实施方案中，洗涤是使用0.1X SSC，0.2％SDS优选至少在在45℃(非常低严格性)，更优选至少在50℃(低严格性)，更优选至少在55℃(中严格性)，更优选至少在60℃(中-高严格性)，甚至更优选至少在65℃(高严格性)，且最优选至少在70℃(非常高严格性)进行的。对于长度大约15个核苷酸至大约70个核苷酸的短探针，将严格条件定义为在比根据Bolton和McCarthy计算法(1962，Proc.Natl.Acad. Sci.USA 48：1390)得出的Tm低大约5℃至大约10℃，在0.9MNaCl，0.09M Tris-HCl pH 7.6，6mM EDTA，0.5％NP-40，1×Denhardt溶液，1mM焦磷酸钠(sodium pyrophosphate)，1mM磷酸二氢钠(sodium monobasic phosphate)，0.1mMATP和0.2mg每ml的酵母RNA中，根据标准的Southern印迹步骤进行预杂交、杂交和杂交后洗涤。将所述载体材料在6×SSC加0.1％SDS中最终洗涤一次15分钟，并用6×SSC在比计算的Tm低5℃至10℃的温度洗涤两次，每次15分钟。

[0046] 与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：13具有给定％同一性的多肽序列或与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：16具有给定％同一性的多核苷酸序列可从天然存在的来源如其他细菌菌株获得。或者，所述多肽或多核苷酸序列可通过在亲本序列(对于多核苷酸为SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：16，而对于多肽为SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：13)取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸或核酸来获得。优选地，在亲本序列或由亲本多核苷酸编码的多肽中变化的氨基酸的数目为1-5、1-10、1-20、1-30或1-40个氨基酸。
优选地，氨基酸改变对性质是较不重要的(of a minor nature)，即保守的氨基酸取代或插入，其不显著影响蛋白质的折叠和/或活性；通常为1至大约30个氨基酸的小缺失；小的氨基或羧基末端延伸，如氨基末端甲硫氨酸残基；多至大约20-25个残基的小接头肽；或通过改变净电荷或其它功能来促进纯化的小延伸，如多组氨酸序列(poly histidine tract)、抗原表位(antigenic epitope)或结合域(binding domain)。保守取代的实例是在以下组之内：碱性氨基酸组(精氨酸、赖氨酸和组氨酸)、酸性氨基酸组(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸组(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸组(亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)、芳族氨基酸组(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)和小氨基酸组(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸)。通常不改变比活性(specific activity)的氨基酸取代是本领域已知的，并且由例如H.Neurath和R.L.Hill，1979，于The Proteins，Academic Press，New York中描述。最普遍发生的交换是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu和Asp/Gly。除了20种标准氨基酸之外，非标准氨基酸(如4-羟脯氨酸，6-N-甲基赖氨酸，
2-氨基异丁酸，异缬氨酸和α-甲基丝氨酸)可取代野生型多肽的氨基酸残基。有限数量的非保守氨基酸、未由遗传密码编码的氨基酸和非天然氨基酸可取代氨基酸残基。“非天然氨基酸”在蛋白质合成之后经修饰，和/或在其侧链具有与标准氨基酸不同的化学结构。非天然氨基酸可为化学合成的，且优选为商业上可获得的，并包括哌可酸(pipecolic acid)、噻唑烷酸、脱氢脯氨酸、3-和4-甲基脯氨酸和3，3-二甲基脯氨酸。

[0047] 能够根据本领域已知的方法，例如定位诱变或丙氨酸分区诱变法(Cunningham和Wells，1989，Science 244：1081-1085)来鉴定亲本多肽中的必需氨基酸。在后一技术中，将单一丙氨酸突变引入到分子中的每个残基，并且测试所得突变分子的生物活性(即碳酸酐酶活性)以鉴定对于所述分子的活性关键的氨基酸残基。亦参见Hilton等，1996，J. Biol.Chem.271：4699-4708。酶的活性部位或其它的生物相互作用也能够通过结构的物理分析而测定，如通过以下这些技术：如核磁共振、晶体学、电子衍射或光亲和标记，连同推定的接触位点氨基酸的突变来测定。参见例如de Vos等，1992，Science 255：306-312；Smith等，1992，J. Mol.Biol.224：899-904；Wlodaver等，1992，FEBSLett.309：59-64。已对碳酸酐酶进行了大量的这些分析，最重要的例如在Tripp等，2001，J. Biol.Chem.276：
48615-48618和Lindskog，1997，Pharmacol.Ther.74：1-20中所综述的。必需氨基酸的身份(identity)也能够从与多肽的同一性分析来推断，所述多肽与本发明的多肽相关。

[0048] α-碳酸酐酶通过其共有序列基序来鉴定：S-E-[HN]-x-[LIVM]-x(4)-[FYH]-x(2)-E-[LIVMGA]-H-[LIVMFA](2)。相应的共有残基对应于SEQ ID NO：13的位置113至129位SEQ ID NO：2的位置130至146。在一个优选实施方案中，所有共有位置存在于碳酸酐酶中。

[0049] 预期下述氨基酸残基H108、H110和H127(编号依照SEQ ID NO：13)形成对于催化重要的组氨酸三联体。在本发明的一个优选实施方案中，碳酸酐酶包含在位置108、110和127的组氨酸(使用SEQ ID NO：13的编号)。

[0050] 预期下述氨基酸残基H83、E114、Q105和T145(使用SEQ ID NO：13编号)参与质子穿梭(proton shuttle)机制，其亦涉及该酶的催化活性(类似于人CAII，如Smith和Ferry，2000，FEMS Microbiol Rev.24：335-366所述)。在另一个实施方案中，所述碳酸酐酶包含在位置83(使用SEQ ID NO：13编号)的组氨酸和/或在位置106(使用SEQ ID NO：13编号)的谷氨酰胺和/或在位置114(使用SEQ ID NO：13编号)的谷氨酸和/或在位置195(使用SEQ ID NO：13编号)的苏氨酸。优选地，在所述碳酸酐酶中存在至少一个质子穿梭位置，更优选存在至少两个质子穿梭位置，更优选存在至少三个质子穿梭位置，且最优选存在所有的质子穿梭位置。

[0051] 预期下述半胱氨酸残基C45和C199参与半胱氨酸桥联，并因此对于碳酸酐酶的稳定性可为重要的。之前在淋病奈瑟氏球菌(Neisseria gonorrhoeae)CA(Huang等，1998，J Mol Biol，283：301-310.)中鉴定出了相应的半胱氨酸。在本发明的一个优选实施方案中，碳酸酐酶包含在位置45和199的半胱氨酸(使用SEQ ID NO：13编号)。

[0052] 能够使用已知的诱变、重组和/或改组(shuffling)方法，接着进行有关的筛选方法，例如那些由Reidhaar-Olson和Sauer，1988，Science 241：53-57；Bowie和Sauer，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：2152-2156；WO 95/17413；或WO95/22625公开的那些方法来进行并测试单个或多个氨基酸取代。能够使用的其它方法包括易错PCR、噬菌体展示(例如，Lowman等，1991，Biochemistry 30：10832-10837；美国专利5,223,409号；WO
92/06204)和区域定向的诱变(Derbyshire等，1986，Gene 46：145；Ner等，1988，DNA 7：
127)。

[0053] 诱变/改组方法能够与高通量、自动化的筛选方法组合以检测由宿主细胞表达的克隆的、诱变的多肽的活性。能够从宿主细胞回收编码活性多肽的诱变的DNA分子，并且使用本领域内标准方法快速测序。这些方法允许快速确定多肽中单个氨基酸残基的重要性，并可适用于未知结构的多肽。

[0054] 上文所述的Caminibacter碳酸酐酶可用于一系列下文中更加详细描述的应用。当在下文中提及Caminibacter碳酸酐酶或碳酸酐酶时，旨在包括所有在本发明中描述的碳酸酐酶，特别是如果其落入要求保护的同一性。

[0055] 具体而言，Caminibacter碳酸酐酶可用于从CO2排放流提取二氧化碳，例如从产生电的发电厂中基于碳或基于烃类的燃烧，或从此类工厂、工业熔炉、火炉、烤箱或壁炉的烟道气排气管，或从飞机或汽车的排气装置提取二氧化碳。Caminibacter碳酸酐酶亦可用于在工业气体的制备中去除CO2，所述气体如乙炔(C2H2)、一氧化碳(CO)、氯气(Cl2)、氢气(H2)、甲烷(CH4)、一氧化二氮(N2O)、丙烷(C3H8)、二氧化硫(SO2)、氩气(Ar)、氮气(N2)和氧气(O2)。Caminibacter碳酸酐酶亦可用于在天然气的加工过程中从原天然气去除CO2。从原天然气去除CO2会帮助富集天然气中的甲烷(CH4)成分(content)，由此增加热单位
3
/m。原天然气一般是从油井、气井和冷凝井获得的。当从地质的天然气藏(natural gas reservoir)通过常规方法获得时，天然气包含1％-10％的CO2，但是取决于天然来源或使用的回收方法，其可包含高至50％的CO2，或甚至更高。碳酸酐酶亦可用于纯化天然气，使其基本上不含CO2，例如，使得CO2含量为1％以下，优选0.5％以下、0.2％以下、0.1％以下、0.05％以下，且最优选0.02％以下。类似天然气的甲烷富集，碳酸酐酶亦可用于富集生物气中的甲烷成分。生物气总是会包含相当程度的CO2，因为用于发酵过程的细菌产生甲烷(60-70％)和CO2(30-40％)。生物气产生可使用嗜温(mesophilic)或嗜热微生物进行。嗜热菌株允许发酵在高温进行，例如，40℃至80℃，且优选50℃至70℃，且甚至更优选
55℃至60℃。在此类工艺中，热稳定性碳酸酐酶对于从甲烷去除CO2是特别有用的。本发明提供了Caminibacter碳酸酐酶减少生物气中的二氧化碳含量的用途，优选地，CO2含量减少至使得其占少于25％，更优选少于20％、15％、10％、5％、2％、1％、0.5％和最优选少于0.1％。在一个优选实施方案中，碳酸酐酶是热稳定的。此外，碳酸酐酶可施用于合成气的产生，即去除由含碳燃料(例如甲烷或天然气)的气化生成的CO2，由此富集合成气的CO和H2成分。当合成气产生发生在高温时，热稳定性碳酸酐酶的使用是优势。本发明提供了碳酸酐酶在合成气产生中减少二氧化碳含量的用途。优选地，CO2成分减少至使得其占少于25％，更优选少于20％、15％、10％、5％、2％、1％、0.5％和最优选少于0.1％。在一个优选实施方案中，碳酸酐酶是热稳定的。优选地，如上所述用于CO2提取的碳酸酐酶，在0.1M Britton-Robinson缓冲液pH 8中在45℃以上，优选50℃以上，55℃以上，60℃以上，65℃以上，更优选70℃以上，最优选80℃以上，最优选90℃以上，最优选100℃以上，最优选105℃以上且甚至最优选110℃以上的温度进行至少15分钟，优选至少2小时，更优选至少24小时，更优选至少7日，更优选至少10日，甚至更优选至少14日，最优选至少30日，甚至最优选至少50日在高温温育之后保持至少30％以上、优选40％以上，更优选50％以上，更优选
60％以上，甚至更优选70％以上，最优选80％以上，最优选85％以上，最优选90％以上，最优选95％以上的残余活性，且甚至最优选残余活性未变化。碳酸酐酶的温度稳定性可通过酶的配制，例如通过酶的固定化而得到一定程度的增加。

[0056] 在本发明的一个方面，从含CO2的介质提取CO2是在基于酶的生物反应器中进行的。在生物反应器中加工包含二氧化碳的介质之前，可对其进行纯化使其不含可扰乱酶反应，或以其他方式，例如通过堵塞出口或膜而干扰生物反应器功能的污染物。从燃烧过程排放的气体/多相混合物，例如烟道气或废气，优选在气体/多相混合物传入生物反应器之前清除了灰、颗粒、NOx和/或SO2。来自不同区的原天然气可具有不同的组成和分离要求。优选地，在基于酶的生物反应器中提取CO2之前，去除油、冷凝物、水和天然气液体(若存在于原天然气中)。从燃烧过程排放的或存在于原天然气中的CO2可在与硫去除相同的工艺中提取，或可在完全不同的工艺中提取。若在此时点气体超过了本发明的碳酸酐酶的最适温度，则可需要一定程度的冷却。在CO2提取过程中碳酸酐酶暴露于的温度(无论其为生物反应器中的工艺温度或进料气体温度)可为0℃至120℃。优选地，工艺温度为45℃-110℃，更优选50℃-90℃，更优选55℃-80℃，甚至更优选60℃-75℃，且最优选65℃-70℃。

[0057] 用于气体分离，包括CO2提取的反应器和工艺，在本领域是公知的，并在商业上用于多种目的(A.Kohl和R.Nielsen，Gas Purification，第5版，GulfProfessional Publishing，Houston，TX，1997)。存在几种类型的反应器可与本发明的碳酸酐酶组合以生成用于从气体如燃烧气体或呼吸气体提取CO2的生物反应器(包含生物材料如酶的反应器)。因为碳酸酐酶改善了CO2提取的速率，将碳酸酐酶与CO2提取反应器组合使得反应器和工艺能够得到改善，如与常规方法相比，较小的尺寸和较廉价的吸收模块(例如较短的吸收柱)，和使用低能耗和低挥发性载液，以及总体较低的操作温度。

[0058] 一种类型的反应器使用液膜。这可例如为包含中空纤维膜的反应器，其包含如描述于Majumdar等，1988，AIChE 1135-1145；US 4,750,918；US 6,156,096；WO 04/104160的液膜。此类基于中空纤维膜的设计有时亦称作中空纤维液膜(hollow fiber liquid membrane，HFLM)而基于这些的CO2分离装置命名为中空纤维封闭液膜(HFCLM)透过器。HFCLM透过器的常见特征是围绕进样和吹扫(sweep)气流的中空纤维彼此靠近(即，“紧密填充(tightly packed)”或“紧邻着(immediately adjacent)”)，且其被封装于单一的刚性处理室而形成一个完整的透过器。在此种设计中，液体围绕紧密填充的进样和吹扫中空纤维的外壳侧。由于一个中空纤维外壁之间的距离非常接近邻接的中空纤维，其间液体层的厚度非常薄，类似膜，且液体的组成仅使得某些组分能够穿过，因此使用了术语“液膜”以描述围绕所述中空纤维的液体。其中液膜夹心在两个结构支持膜之间的封闭液膜透过器在本领域也有描述(Cowan等，2003，Ann.NY Acad.Sci.984：453-469)；该设计基本上以与HFCLM相同的方式发挥作用。封闭液膜的反应器亦与碳酸酐酶组合使用，如描述于US 6,143,556，WO 2004/104160，Cowan等，2003，Ann.NY Acad.Sci.984：453-469；
和 Trachtenberg 等，2003，SAEinternational Conference on Environmental Systems Docket number2003-01-2499。在这些情况下，CO2解吸步骤与吸附步骤发生于相同的封装的处理室中。另一个实例描述了基于胺的CO2捕捉反应器，其基于吸收/解吸中空纤维膜模块(Kosaraju等，2005，Ind. Eng.Chem.Res.44：1250-1258)。

[0059] 另一种类型的反应器使用直接的气液接触。这可例如为常规的基于溶剂的CO2捕捉反应器，其基于吸收/解吸柱反应器(US 2008/0056972，Reddy等，Second National Conference on Carbon Sequestration，NETL/DOE，Alexandria，VA，May 5-8，2003)。使用烷醇胺(如单乙醇胺，二乙醇胺和甲基二乙醇胺)以供CO2提取的商业性直接气液接触反应器的实例流程图(flow scheme)示于A.Kohl和R.Nielsen，Gas Purification，第5版，Gulf Professional Publishing，Houston，TX，1997：57-62。使用碱性盐溶液(如碳酸钾)以供CO2提取的商业性直接气液接触反应器的实例流程图A.Kohl和R.Nielsen，Gas Purification，第 5 版，Gulf Professional Publishing，Houston，TX，1997：334-340。使用碳酸酐酶的直接气液接触反应器描述于US 6,524,843；WO 2004/007058，WO
2004/056455，US7,176,017和US 2004/0059231。在该类型的反应器中，将气相或多相混合物在气相中的CO2由液相吸收，并在液相中由碳酸酐酶转化为碳酸氢根的条件下与液相相接触。通过连续流从反应器去除富含碳酸氢根的液体，以确保CO2和碳酸氢根之间的平衡移向CO2的连续转化。气相溶解于液相依赖于气体和液体之间的表面接触区域。较大的接触区域可例如通过将液体和含CO2的气体穿过高表面区域填充的、塔盘(tray)或板式柱(plate column)或塔，通过将液体小滴喷洒经过含CO2的气体(即，喷雾接触器)，或通过将含CO2气体鼓泡经过液体(即，鼓泡槽(bubble tank)或鼓泡塘(bubble pond))，或通过这些技术的组合来实施。填充柱可包含填充物如拉西环(raschig ring)、贝尔鞍(berl saddles)、勒辛环(lessing ring)、矩鞍金属(intalox metal)、矩鞍(intalox saddle)、鲍尔环(pall ring)或工程的填充物如Q-PAC(Lantec Products，Inc.，Agoura Hills，CA 91301)。填充材料可包含聚合物如尼龙、聚酯、聚乙烯、聚醚醚酮(polyetheretherketone)、聚丙烯、聚苯乙烯或氟聚合物(例如聚四氟乙烯)，陶瓷如二氧化硅或金属如铝、碳素钢或不锈钢，或基于纤维素的材料如木或棉纤维。在液体是连续交换的或当需要将碳酸酐酶限制在反应器中一个或多个位置的反应器类型中，可通过多种方式将碳酸酐酶保留于反应器中。在填充柱中，碳酸酐酶可固定于填充材料上(对于固定化CA的方法，参见例如WO 2005/114417)。在“鼓泡”反应器中，可将碳酸酐酶包埋于多孔基质，例如，不溶性凝胶颗粒，如二氧化硅、海藻酸(盐)、海藻酸/壳聚糖、海藻酸、羧甲基纤维素，或可将碳酸酐酶固定(通过共价键、离子电荷、包埋或包囊)于悬于液体的固体填充物上(如填充柱中)，或碳酸酐酶可化学连接在白蛋白或PEG网络中。还可通过包埋于聚合物固定材料而将碳酸酐酶限制于反应器中的特定位置，所述材料可包含胶束或反胶束材料，如描述与WO 2010/037109中的。喷雾接触器可包括垂直或水平的喷洒室、逆流喷洒塔、文丘里洗涤器、喷射器(ejector)或喷气洗涤器(jet scrubber)、旋风洗涤器和喷雾干燥器(A.Kohl和R.Nielsen，Gas Purification，第5版，Gulf Professional Publishing，Houston，TX，1997：418-427和604-616)。当避免压力降和容忍气体如具有大气压力的燃烧后排出气中的固体颗粒物是重要的时，喷雾接触器的使用是需要的。然而，为了最为有效，在喷雾接触器中CO2吸收的速率必须快，且碳酸酐酶可提供需要的催化以实现这些快速的速率。

[0060] 在直接气液接触反应器中的CO2提取可涉及第一吸收阶段，继以任选地后续解吸、沉淀、利用、收集、再生或释放阶段。吸收阶段的一般描述如下所述。当操作吸收反应器时，含水液体在一端，优选顶部进入反应器，而流至另一端，优选底部，而含CO2的气体流(进料气)在一端，优选液体的相反端(底部)(“逆流”)进入反应器，且气体穿过液体并排出，而失去(minus)提取入液体的CO2，穿过在另一端的出气口(优选地，反应器顶部)。排出吸收反应器的液体富含碳酸氢根/碳酸根(富CO2)液体，而排出气与进料气相比CO2含量减少。富CO2液体可在后续反应中加工，例如通过经过解吸反应器生成纯CO2，或产生碳酸盐沉淀如CaCO3。来自吸收反应器的富CO2液体亦可加以利用，例如增强藻类生长，加以收集，例如通过将富CO2液体泵入封闭的地质构造进行，加以释放，例如通过将富CO2液体泵入环境，如从水下生命支持系统将碳酸氢盐液体释放入海水，加以蒸发或脱盐。含有碳酸氢根阴离子的富CO2液体可用于工业工艺，如用作化肥的碳酸铵和碳酸氢铵的制造工艺，或用于供去除和中和酸性气体如二氧化硫的工艺。

[0061] 上文所述的反应器可仅涉及吸收阶段，仅涉及解吸阶段或涉及吸收继以解吸阶段，其中碳酸酐酶可催化CO2水合为碳酸氢根或碳酸氢根脱水为CO2或两者皆是。反应器可彼此组合，其中每个反应器构成模块。例如，液膜反应器可作为吸收模块起作用而直接气液接触反应器可作为解吸模块起作用，或反之亦然。

[0062] 不限制本发明的范围，提供了图2以说明包含吸收和解吸模块的CO2提取反应器的一般概略，通过该反应器，CO2吸收载液循环，即其从吸收器中含CO2的气相(进料气)去除CO2，在解吸器中释放纯化的CO2气体，然后重新循环至吸收器。术语“进料气”通常用于涉及CO2提取反应器，其中其暗示CO2是通过与反应器中的贫CO2载液相接触而从含CO2的气相去除。进料气可为大气压，或大气压的压力以上或以下。CO2在载液中的选择溶解性(selective solubility)导致CO2在吸收器中从进料气提取入载液。在解吸器中，通过引入降低CO2在载液中的溶解性的压力差(例如，在解吸器气相中与进料气中的相比较低的CO2分压，如可通过在解吸器中施加真空来实现)和/或施加热量(例如通过再沸器)、蒸汽或吹扫气将CO2驱入解吸器中的气相来将CO2从载液释放。热能本身可用于驱动解吸，如常用于基于单乙醇胺的CO2提取工艺。例如，通常的基于乙醇胺的CO2提取的解吸器中的温度为高于100℃(例如120℃)。或者，热能可与压力减少组合以驱动解吸，在此情况下，可降低解吸器中的温度。例如，与相对于吸收器中的压力(例如大气压)减少的压力(例如真空)组合，解吸器可在70℃操作。pH的差异可用于促进吸收和解吸，其中在更加碱性的pH有利于将CO2吸收入水性介质，而在碱性较低(更加酸性)的pH有利于CO2从水性介质解吸。吸收和解吸之间相关pH差异的范围(“振幅(swing)”)取决于具体的工艺。例如，为了方便说明，CO2吸收入基于碳酸氢根的载液可发生于pH 9以上，导致载液pH下降至pH 9以下。然后CO2从载液的解吸可发生于pH 9以下的pH。

[0063] 当经过吸收器的进料气的压力高于解吸器中气相压力时，可确立/发生吸收器和解吸器之间的压力差。在一些情况下，如对于天然气升级(natural gas upgrading)，吸收器中的气压高于解吸器中的气压，且吸收器和解吸器中的气压均高于大气压。在其他情况下，吸收器中的气压高于大气压，而解吸器中的气压为大气压或低于大气压(即等于或小于100kPa)。或者，当经过吸收器的进料气(如烧煤燃烧之后的烟道气)的压力大约为大气压而解吸器中气相的压力低于大气压时，可确立/发生吸收器和解吸器之间的压力差。在本发明的一个实施方案中，吸收器和解吸器之间的总压力差为至少约35kPa。

[0064] 在图2中概略显示的吸收器和解吸器可为基本上相同温度(“等温的”)或不同温度。Caminibacter碳酸酐酶可仅存在于吸收器或解吸器或两者皆是。使用真空(低压)在低温例如70℃在存在高温碳酸酐酶如Caminibacter碳酸酐酶的吸收器中再生CO2是本发明的另一个实施方案。在此种工艺中的碳酸酐酶催化CO2吸收至吸收溶剂和CO2从吸收溶剂解吸。当吸收器和解吸器处于不同温度时，可使用温度调节器(例如热交换器)以保存该过程中的能量。

[0065] 在进一步的阐述中，对于CO2提取(US 2007/0256559)描述了用于H2S吸收的真空碳酸盐工艺(vacuum carbonate process)的修饰(A.Kohl和R.Nielsen，
GasPurification，第5版，GulfProfessional Publishing，Houston，TX，1997，383-388)，并将其与碳酸酐酶一同公开(Lu等，DOE Project No.DE-FC26-08NT0005498，NETLCO2 Capture Technology for Existing Plants R&D Meeting，March 24-26，2009，Pittsburgh，PA)。在该阐述中，大气压电厂烟道气在吸收柱中以40至60℃的温度与碳酸钾水溶液和碳酸酐酶相接触，认为在此处碳酸酐酶改善载液中CO2水合为碳酸氢根的速率。将富CO2的载液泵送至解吸柱(“洗提塔(stripper)”)，在此处CO2通过低压(例如14-55KPa)和施加热(例如，
50-70℃)的组合从载液释出，所述热是通过直接注入来自电厂低压蒸汽轮机的低压、低品质废汽流(exhaust steam)获得的。本发明来自Caminibacter的碳酸酐酶特别适用于所述的经修饰的真空碳酸盐工艺，因为Caminibacter碳酸酐酶可耐受吸收器和解吸器两者中的温度，意味着不像其他已知的碳酸酐酶会被解吸器中的温度所失活，Caminibacter碳酸酐酶可耐受解吸器中的温度，允许其随着载液通过工艺的吸收和解吸阶段循环。物理搅拌，包括超声波搅拌，可与真空组合以增强解吸器中CO2从载液的释出。

[0066] 另一种类型的反应器使用膜与由碳酸酐酶催化的CO2水合的组合，继以沉淀。在一种情况下，通过将气态流经过气体扩散膜将CO2从气态流移除至溶液，在此处，转化通过将CO2溶液经过包含碳酸酐酶的基质并添加矿物质离子以导致碳酸盐的沉淀得到加速(US7,132,090)。已进一步显示碳酸酐酶不仅可催化CO2水合/脱水反应，还可促进碳酸钙的沉淀(Mirjafari等，2007，Ind.Eng.Che.Res.46：921-926)。

[0067] 另一种类型的反应器从环境空气去除CO2。已经报道了经设计以从环境空气去除CO2的反应器(Stolaroff等，2008，Environ.Sci.Technol.42：2728-2735)，然而该反应器并未利用碳酸酐酶。不拘于报道的环境空气反应器的设计，如本发明中公开的与合适载液组合的碳酸酐酶，可用于本文中所述的此种反应器或其他反应器设计。热稳定碳酸酐酶是特别有用的，因为反应器暴露于环境条件，如阳光，可增加液体温度超过已知碳酸酐酶的耐受程度，并避免冷却反应器的需要。这说明了下述情况，其中从含CO2的介质提取CO2的工艺可需要碳酸酐酶在高于含CO2的介质的起始温度的温度下起作用，或耐受该温度，所述介质如环境空气，其可在夜间冷(低于10℃)而在日间热(高于45℃)。

[0068] 如上所述的不同的膜反应器和直接气液接触反应器以及其他备选方案可施用于二氧化碳提取工艺，其中吸收过程和解吸过程发生于至少两步。此类反应器一般包括下述元件：a)至少一个吸收模块，其可包含气体入口区和/或气体出口区；b)至少一个解吸模块，其包含气体出口区；c)载液；和d)连接吸收模块和解吸模块的装置(means)，从而使得载液可从吸收模块传至解吸模块。任选地，用于连接吸收和解吸模块的装置是回路(circuit)，允许载液一旦经过解吸模块，能够回到吸收模块中。所述模块的一个或两者可包含至少一个CO2可透过的膜，其将气相和水相分开，如WO2010/014773和WO2010/014774中所述。该模块类型也称作气液膜(GLM)模块。该GLM模块可例如为中空纤维膜、平层膜(flat sheet membrane)或螺旋卷绕的膜的形式。所述GLM模块可作为吸收器模块和/或解吸器模块起作用。或者，模块之一可为GLM模块而另一个模块的组成可使得气相和液相直接接触，或换言之，气液界面未由膜分开。该模块类型亦称作直接气液接触(DGLC)模块或就称作直接接触(DC)模块。所述DGLC模块可例如为允许气液接触的填充有填充材料的柱，和/或配置将气体暴露于液体的入口的含有液体的容器(如鼓泡塔)，和/或液体喷淋(如喷淋塔)和/或充气器模块和/或降膜蒸发器的形式。所述DGLC模块可作为吸收器模块或解吸器模块起作用。泡罩系统、筛板系统、Disk-and-doughnut柱和填充柱是直接气液接触模块(DGLC)的实例。

[0069] 如上所述的反应器类型可在任何所需温度操作。在一个实施方案中，操作反应器所用的与碳酸酐酶相接触和/或包含碳酸酐酶的液体的温度为0℃-120℃或5℃-110℃，更优选10℃-100℃，更优选20℃-95℃，更优选30℃-90℃，更优选40℃-85℃，更优选50℃-80℃，更优选55℃-75℃，且最优选60℃-70℃。

[0070] CO2的吸收和解吸速率取决于载液的pH。在与本发明相关的所述反应器类型中，贫CO2的载液的pH是pH 4-12，优选pH 7以上(如在室温测量，即20-25℃)，更优选pH 8以上，更优选8-12，更优选8-10.5，更优选8.5-10，甚至更优选9-9.5。由于在吸收过程中CO2水合为碳酸(其立即在水中解离为碳酸氢根)，载液的pH随着富CO2载液的碳含量的增加而降低。pH 降低的程度取决于载液的缓冲能力和吸收的CO2的量。在本发明一个优选实施方案中，载液为碳酸氢盐缓冲液，如碳酸氢钠，碳酸氢钾，碳酸氢铯或另一种合适的碳酸氢盐，在此处取决于pH，或多或少量的碳酸盐和/或碳酸会与碳酸氢盐一同存在。

[0071] 在本发明的一个实施方案中，富CO2的载液经过解吸阶段，在此处富CO2的载液的pH会随着CO2释放而增加。为了再循环载液通过此种吸收-解吸系统，优选在载液重新经过吸收阶段之前其pH回到贫CO2载液的pH。

[0072] 在本发明的一个优选实施方案中，反应器配置有调节载液中pH的装置。这可以几种方式进行。一种方式是将碱性物质添加至载液，例如在图2中指示的辅助组分添加点(13a)之一添加，使用自动pH调整装置如自动滴定器。所述碱性物质优选与在系统中循环的载液具有相同的组成(例如，溶剂浓度、离子强度、碳酸酐酶的量等)，且可在吸收之前的任何时间添加以供调整pH。类似地，可在解吸之前的任何时间将中性至酸性物质添加至载液，例如在图2中指示的辅助组分添加点(13b)之一添加。若需要，多余的载液可从系统移除，例如在图2中指示的移除点(14)之一移除。

[0073] 在如上所述的CO2捕获工艺中，本发明的Caminibacter碳酸酐酶可与一种或多种其他碳酸酐酶组合。在整个CO2捕获工艺中的不同工艺步骤可需要不同的操作条件，例如温度、pH、载液组成、压力等。本发明的碳酸酐酶可与CO2捕获工艺中所需的在不同最优条件下操作的其他碳酸酐酶组合。例如，一种碳酸酐酶可在载液中循环，而不同的碳酸酐酶可固定于反应器中的一个或多个位置。

[0074] 本发明的碳酸酐酶或包含本发明的碳酸酐酶的如上所述的基于酶的生物反应器亦具有更非常规的应用，如飞行员座舱、潜水艇(submarine vessel)、水中用具(aquatic gear)、安全或救火用具(safety and firefighting gear)以及宇航员的太空服和人工肺装置以维持呼吸空气不含毒性水平的CO2。其它的应用为从狭窄空间去除CO2，如在实施发酵的酿酒厂和封闭建筑内降低危险的CO2水平以及从对CO2敏感的环境如博物馆或图书馆中降低危险的CO2水平以防止过量CO2对书籍和艺术品的酸性损伤。另外的用途为从热环境空气如沙漠中的热环境空气去除CO2。在此情况下，所述碳酸酐酶可例如包含于适于从环境空气提取CO2的反应器中，如Stolaroff等，2008 Environ.Sci.Technol.，42，2728-2735所述，上述反应器可例如采取“人工树(artificial tree)”的形式。

[0075] Caminibacter碳酸酐酶可用作独立的CO2提取催化剂或其可与常规的CO2提取技TM术如通过基于胺的溶剂或氨水或如Selexol (Union Carbide)或聚乙二醇醚的物理溶剂的化学吸收相组合。在本发明的另一个实施方案中，将Caminbacter碳酸酐酶与二氧化碳吸收化合物如基于胺的化合物组合，所述化合物例如水性烷醇胺包括单乙醇胺(MEA)，二乙醇胺(DEA)，甲基二乙醇胺(MDEA)，2-氨基-2-甲基-1-丙醇(AMP)，2-氨基-2-羟甲基-1，
3-丙二醇(AHPD)，二异丙醇胺(DIPA)，N-甲基氨基丙酸或其他天然或修饰的氨基酸的水溶性盐，2-(2-氨基乙基氨基)乙醇(AEE)，三乙醇胺(TEA)或其它基于伯、仲、叔胺或空间位阻的胺的溶剂包括描述于US 4,112,052(通过提述并入本文)的7至9页的那些，或者甘氨酸或牛磺酸的水性盐，或者其它液体吸收剂如水性NaOH、KOH、LiOH，具有不同离子强度的碳酸盐或碳酸氢盐溶液，或电解质水溶液和促进剂(promoter)如哌嗪或聚乙二醇醚，或它们的混合物或其类似物或混合物。所述组合可施用于如上所述的生物反应器，或其可施用于已经存在的基于常规技术的CO2洗涤设备。在常规生物反应器中，烷醇胺的浓度通常为
15-30重量百分比。在本发明的一个实施方案中，烷醇胺的浓度可为常规范围或优选在较低浓度，如优选15％(V/V)以下，更优选12％以下、10％、8％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、
0.5％、0.2％以下且最优选0.1％(V/V)以下。

[0076] 在常规工艺中，添加腐蚀和氧化抑制剂，如包含于Fluor Daniel的专有的EconAmine FG溶剂中的，以供增加胺浓度同时减少腐蚀的风险。无机腐蚀抑制剂包括钒(例如偏钒酸钠)、锑、铜、钴、锡和硫化合物。有机腐蚀抑制剂包括硫脲和水杨酸。

[0077] 其他辅助的载液组分可包括润湿剂、螯合剂和降粘剂，和其他能够增加CO2流入或流出载液的通量的化合物。

[0078] 在常规工艺中，常采用供减少和/或避免泡沫形成的技术。这些包括在CO2提取之前去除导致泡沫的杂质，和使用消泡剂和抑泡剂如硅氧烷化合物或高沸点醇类如油醇或辛基苯氧基乙醇(A.Kohl和R.Nielsen，Gas Purification，第5版，Gulf Professional Publishing，Houston，TX，1997：224-230)。

[0079] 本发明的另一个方面涉及生物气产生，其中CO2提取在生物气发酵液中直接进行，作为如上所述将生物气经过生物反应器的备选方式。通过将Caminibacter碳酸酐酶添加至厌氧发酵液，可将更多的来自气相的CO2转化为碳酸氢根，其为由产甲烷的古细菌进行的甲烷产生的底物。具体而言，甲烷八叠球菌属(Methanosarcina)经常存在于嗜热性生物气消化者中(Mladenovska和Ahring，2000，FEMS Microbiol.Ecol.3：225-229)。对于嗜热甲烷八叠球菌(Methanosarcina thermophila)TM-1已显示碳酸氢根可为甲烷产生的限制因子，例如生长于低碳酸氢根溶液(0.6mM)的嗜热甲烷八叠球菌TM-1的培养物与包含高至10倍的碳酸氢根剂量(6mM)的培养物相比显示可观的延滞期(即甲烷产生开始更晚)。此外，在较低碳酸氢根剂量，甲烷的总产量低至25分之一以下(Murray和Zinder，1985，Appl.Environ.Microbiol.50：49-55)。因此，若使用一种或多种嗜热性微生物例如产甲烷菌(如可使用CO2/碳酸氢根作为碳源以供生长和甲烷产生的甲烷八叠球菌属种)在高温进行生物气生产，热稳定性碳酸酐酶会是特别有用的。

[0080] 本发明的另一个实施方案是本发明的Caminibacter碳酸酐酶在生物气发酵液中作为添加剂的用途。

[0081] 本发明的另一个实施方案是Caminibacter碳酸酐酶增强藻类和其他通过在水生植物环境中或为了将碳酸氢根递送至水生植物环境，催化CO2至碳酸氢根的转化而利用碳酸氢根作为碳源的水生动物植物的生长的用途。该方法可，例如用于同时从燃烧废气如烟道气中去除CO2并提供CO2以供通过将废气与来自培养塘(cultivation pond)的液体相接触来转化至碳酸氢根。某些培养藻类和水生植物的方法涉及使用其中来自日光的热量提高水温度的封闭管或浅槽或塘。因此热稳定性碳酸酐酶在升高的培养温度下特别有用。

[0082] 多核苷酸

[0083] 本发明还涉及分离的多核苷酸，其编码本发明的多肽。

[0084] 用于分离或克隆编码多肽的多核苷酸的技术是本领域内已知的，包括从基因组DNA分离，从cDNA制备，或其组合。可通过例如使用熟知的聚合酶链式反应(PCR)或表达文库的抗体筛选来检测具有共有结构特性的克隆DNA片段，从而实现从这种基因组DNA克隆多核苷酸。参见，例如，Innis等，1990，PCR：A Guide to Methods and Application，Academic Press，New York。可以使用其它核酸扩增方法，如连接酶链式反应(LCR)、连接活化转录(LAT)和基于核苷酸序列的扩增(NASBA)。可以从Caminibacter菌株，或其它或相关生物体克隆多核苷酸，并且因此可为例如所述核苷酸序列的多肽编码区的等位基因变体或种变体(species variant)。

[0085] 本发明还涉及包含核苷酸序列或由核苷酸序列组成的分离的多核苷酸，所述核苷酸序列与SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：16的成熟多肽编码序列具有至少60％，例如，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少
97％，至少98％，至少99％或100％的序列同一性程度，其编码具有碳酸酐酶活性的多肽。

[0086] 本发明还涉及编码本发明多肽的分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸在低严格条件，中等严格条件，中-高严格条件，高严格条件，非常高的严格条件下，与以下杂交：(i)编码SEQ ID NO：13的成熟多肽的多核苷酸序列，(ii)SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：16的成熟多肽编码序列，或(iii)(i)或(ii)的至少100个连续核苷酸的亚序列，或(iv)(i)或(ii)的互补链、(i)或(ii)的全长互补链；或它们的等位变体和亚序列(Sambrook等，1989，见上文)，如本文所定义的。本发明还涉及包含核酸序列或由核酸序列组成的分离的多核苷酸，所述核酸序列由于遗传密码的简并性，并不与SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：16的多核苷酸序列杂交，但编码具有根据b)或c)的氨基酸序列的多肽。

[0087] 在一个方面，所述多核苷酸包含SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：16，SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：16的成熟多肽编码序列或SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：16编码SEQ ID NO：13的具有碳酸酐酶活性的片段的亚序列，或由SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：16，SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：16的成熟多肽编码序列或SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：16编码SEQ ID NO：13具有碳酸酐酶活性的片段的亚序列组成。

[0088] 核酸构建体

[0089] 本发明还涉及包含本发明的多核苷酸的核酸构建体，所述多核苷酸与一个或多个(几个)调控序列可操作地连接，所述调控序列在合适的宿主细胞中在与该调控序列相容的条件下指导编码序列的表达。

[0090] 可以用许多方式操作多核苷酸以提供多肽的表达。依赖于表达载体，在将多核苷酸插入载体之前对其进行操作可能是理想的或必需的。使用重组DNA方法修饰多核苷酸的技术是本领域熟知的。

[0091] 调控序列可以是启动子序列，其是由用于表达编码本发明多肽的多核苷酸的宿主细胞识别的多核苷酸。启动子序列含有介导多肽的表达的转录调控序列。启动子可以是在所选的宿主细胞中显示转录活性的任何多核苷酸，包括突变的、截短的和杂合的启动子，并且可以从编码与宿主细胞同源或异源的胞外或胞内多肽的基因获得。

[0092] 用于指导本发明的核酸构建体在细菌宿主细胞中转录的合适启动子的实例是从下述获得的启动子：解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、嗜热脂肪芽孢杆菌产麦芽淀粉酶基因(amyM)、枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因、大肠杆菌lac操纵子、天蓝链霉菌琼脂糖酶基因(dagA)和原核β-内酰胺酶基因(Villa-Kamaroff 等，1978，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 75：3727-3731)，以及tac 启动子(DeBoer等，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80：21-25)。另外的启动子在″Useful proteins from recombinant bacteria″于Scientific American，1980，242：74-94中；和在Sambrook等，1989，见上文中描述。

[0093] 用于指导本发明的核酸构建体在丝状真菌宿主细胞中转录的合适启动子的实例是从下列酶的基因获得的启动子：构巢曲霉乙酰胺酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA)、米曲霉TAKA淀粉酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶、尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶(WO 96/00787)、镶片镰孢淀粉葡糖苷酶(WO 00/56900)、镶片镰孢Daria(WO 00/56900)、镶片镰孢Quinn(WO 00/56900)、曼赫根毛霉(Rhizomucor miehei)脂肪酶、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶IV、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉β-木糖苷酶，以及NA2-tpi启动子(一种修饰的启动子，其包含在曲霉属中编码中性α-淀粉酶的基因，其中未翻译的前导序列由在曲霉属中编码丙糖磷酸异构酶的基因的未翻译的前导序列所替代；非限制性实例包括修饰的启动子，其包含在黑曲霉中编码中性α-淀粉酶的基因，其中未翻译的前导序列由在构巢曲霉和米曲霉中编码丙糖磷酸异构酶的基因的未翻译的前导序列所替代)；和它们的突变的、截短的和杂合的启动子。

[0094] 在酵母宿主中，有用的启动子从如下酶的基因获得：酿酒酵母烯醇化酶(ENO-1)、酿酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH1，ADH2/GAP)、酿酒酵母丙糖磷酸异构酶(TPI)、酿酒酵母金属硫蛋白(CUP1)和酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶。对于酵母宿主细胞其它有用的启动子由Romanos等，1992，Yeast 8：423-488描述。

[0095] 调控序列也可以是合适的转录终止子序列，其由宿主细胞识别以终止转录。所述终止子序列与编码所述多肽的多核苷酸的3’末端可操作地连接。可以将在所选宿主细胞中有功能的任何终止子用在本发明中。

[0096] 对于丝状真菌宿主细胞优选的终止子从如下酶的基因获得：构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶和尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶。

[0097] 对于酵母宿主细胞优选的终止子从如下酶的基因获得：酿酒酵母烯醇化酶、酿酒酵母细胞色素C(CYC1)和酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶。对于酵母宿主细胞其它有用的终止子由Romanos等，1992，见上文描述。

[0098] 调控序列还可以是合适的前导序列，当被转录时其为对于宿主细胞的翻译重要的mRNA非翻译区。前导序列可操作地连接于编码多肽的多核苷酸的5’-末端。可以使用在所选宿主细胞中有功能的任何前导序列。

[0099] 对于丝状真菌宿主细胞优选的前导序列从如下酶的基因获得：米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉丙糖磷酸异构酶。

[0100] 对于酵母宿主细胞合适的前导序列从如下酶的基因获得：酿酒酵母烯醇化酶(ENO-1)、酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、酿酒酵母α因子和酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)。

[0101] 调控序列也可以是聚腺苷酸化序列，其是与多核苷酸的3’末端可操作地连接的序列，并且在转录时，宿主细胞将其识别为将聚腺苷残基添加至转录的mRNA的信号。可以使用在所选宿主细胞中有功能的任何聚腺苷酸化序列。

[0102] 对于丝状真菌宿主细胞优选的聚腺苷酸化序列从如下酶的基因获得：米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶和黑曲霉α-葡糖苷酶。

[0103] 对于酵母宿主细胞有用的聚腺苷酸化序列由Guo和Sherman，1995，Mol.Cellular Biol.15：5983-5990描述。

[0104] 调控序列还可以是信号肽编码区，其编码与多肽的N-末端相连的信号肽，并且指导多肽进入细胞分泌途径。多核苷酸的编码序列5’端可固有地包含信号肽编码序列，其与编码多肽的编码区片段一起天然地连接在翻译阅读框中。可供选择的是，编码序列5’端可含有对于所述编码序列为外源的信号肽编码序列。外源信号肽编码序列在编码序列不天然地含有信号肽编码序列时可为必需的。或者，外源信号肽编码序列可以简单地取代天然信号肽编码序列以增强多肽的分泌。然而，可使用指导表达的多肽进入所选宿主细胞的分泌途径的任何信号肽编码序列。

[0105] 对于细菌宿主细胞有效的信号肽编码序列是从如下酶的基因获得的信号肽编码序列：芽孢杆菌属NCIB 11837产麦芽糖淀粉酶、地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶(subtilisin)、地衣芽孢杆菌β-内酰胺酶、嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶、嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT，nprS，nprM)和枯草芽孢杆菌prsA。另外的信号肽由Simonen和Palva，1993，Microbiological Reviews 57：109-137描述。

[0106] 对于丝状真菌宿主细胞有效的信号肽编码序列是从如下酶的基因获得的信号肽编码序列：黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米曲霉TAKA淀粉酶、特异腐质霉纤维素酶、特异腐质霉内切葡聚糖酶V、疏棉状腐质霉脂肪酶和曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶。

[0107] 对于酵母宿主细胞有用的信号肽从酿酒酵母α因子和酿酒酵母转化酶的基因获得。其它有用的信号肽编码序列由Romanos等，1992，见上文描述。

[0108] 调控序列还可以是前肽编码序列，其编码位于多肽N-末端的前肽。所得多肽称为酶原(proenzyme)或前多肽(propolypeptide)(或在某些情况下称为酶原(zymogen))。前多肽通常是无活性的并且能够通过前肽的催化或自催化切割从前多肽转化为活性多肽。
可以从枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT)、嗜热毁丝霉漆酶(WO 95/33836)、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶和酿酒酵母α因子的基因获得前肽编码序列。

[0109] 当信号肽和前肽序列二者均出现在多肽的N-末端时，将前肽序列置于紧接着(next to)多肽N-末端，并且将信号肽区置于紧接着前肽序列的N-末端。

[0110] 同样理想的是添加调节序列，其允许相对于宿主细胞的生长来调节多肽的表达。调节系统的实例是引起基因表达响应化学或物理刺激物，包括调节化合物的存在而开启或关闭的那些系统。原核系统中的调节系统包括lac、tac和trp操纵基因系统。在酵母中，可以使用ADH2系统或GAL1系统。在丝状真菌中，可以使用黑曲霉葡糖淀粉酶启动子、米曲霉TAKA α-淀粉酶启动子和米曲霉葡糖淀粉酶启动子。调节序列的其它实例是那些允许基因扩增的序列。在真核系统中，这些序列包括在氨甲蝶呤(methotrexate)存在下扩增的二氢叶酸还原酶基因，和以重金属(with heavy metal)扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况下，编码多肽的多核苷酸将与调节序列可操作地连接。

[0111] 表达载体

[0112] 本发明还涉及重组表达载体，所述重组表达载体包含本发明的多核苷酸、启动子和转录和翻译终止信号。多种核苷酸和调控序列可以结合在一起以产生重组表达载体，所述表达载体可以包括一个或多个(几个)方便的限制位点以允许在这些位点插入或取代编码多肽的多核苷酸。可供选择的是，可以通过在适当的用于表达的载体中插入包含所述序列的多核苷酸或核酸构建体来表达所述多核苷酸。在制备表达载体的过程中，将编码序列置于载体中，从而将该编码序列与适当的表达调控序列可操作地连接。

[0113] 重组表达载体可以是任何载体(例如，质粒或病毒)，其能够方便地进行重组DNA步骤，并且能够产生多核苷酸的表达。载体的选择将通常依赖于载体与将引入该载体的宿主细胞的相容性。载体可以是线状或闭合环状质粒。

[0114] 载体可以是自主复制载体，即，作为染色体外实体(entity)存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如，质粒、染色体外元件、微型染色体(minichromosome)或人工染色体。载体可以含有任何用于确保自复制的手段(means)。或者，载体可以是一种当被引入宿主细胞中时，整合到基因组中并且与整合了该载体的染色体一起复制的载体。此外，可以使用单独的载体或质粒或两个或更多个载体或质粒，其共同含有待引入宿主细胞基因组的完整DNA(total DNA)，或可以使用转座子(transposon)。

[0115] 载体优选地含有一个或多个(几个)选择性标记，其允许简单选择经转化、转染、转导等的细胞。选择性标记是基因，其产物提供杀生物剂或病毒抗性、对重金属的抗性、对营养缺陷型的原养性(prototrophy to auxotrophs)等。

[0116] 细菌选择性标记的实例是来自枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌的dal基因，或赋予抗生素抗性的标记，所述抗生素抗性例如氨苄青霉素、氯霉素、卡那霉素或四环素抗性。对于酵母宿主细胞合适的标记是ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1和URA3。用于丝状真菌宿主细胞的选择性标记包括但不限于amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(草铵膦(phosphinothricin)乙酰转移酶)、hph(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)(nitrate reductase)、pyrG(乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶)(orotidine-5’-phosphate decarboxylase)、sC(硫酸腺苷酰转移酶)和trpC(邻氨基苯甲酸合酶(anthranilate synthase))以及它们的等同物。优选用在曲霉属细胞中的是构巢曲霉或米曲霉的amdS和pyrG基因和吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)的bar基因。

[0117] 载体优选含有元件，其允许载体整合入宿主细胞基因组或载体在细胞中独立于基因组的自主复制。

[0118] 为了整合入宿主细胞基因组，载体可依赖编码多肽的多核苷酸的序列或用于通过同源或非同源重组整合入基因组的任何其它载体元件。或者，载体可以含有额外的多核苷酸，用于指导通过同源重组整合入宿主细胞基因组染色体中的精确位置。为了增加在精确位置整合的可能性，整合元件应含有足够数量的核酸，如100至10,000碱基对，400至10,000碱基对，和800至10,000碱基对，其与相应的目标序列具有高度序列同一性以增强同源重组的概率。整合元件可以是任何序列，其与宿主细胞基因组中的目标序列同源。此外，整合元件可以是非编码或编码的多核苷酸。另一方面，可以将载体通过非同源重组整合到宿主细胞的基因组中。

[0119] 为了自主复制，载体可以进一步包含复制起点，其使载体能够在所述的宿主细胞中自主地复制。复制起点可以是介导自主复制的任何质粒复制子(replicator)，其在细胞中发挥功能。术语“复制起点”或“质粒复制子”意味着能够使质粒或载体体内复制的多核苷酸。

[0120] 细菌复制起点的实例是允许在大肠杆菌中复制的质粒pBR322、pUC19、pACYC177和pACYC184的复制起点，和允许在芽孢杆菌属中复制的质粒pUB110、pE194、pTA1060和pAMβ1的复制起点。

[0121] 用于酵母宿主细胞中的复制起点的实例是2微米复制起点，ARS1，ARS4，ARS1和CEN3的组合，和ARS4和CEN6的组合。

[0122] 在丝状真菌细胞中有用的复制起点的实例是AMA1和ANS1(Gems等，1991，Gene98：61-67；Cullen等，1987，Nucleic AcidsRes.15：9163-9175；WO00/24883)。分离AMA1基因和构建包含该基因的质粒或载体能够根据公开于WO 00/24883中的方法完成。

[0123] 可以将多于一个拷贝的本发明的多核苷酸插入宿主细胞以增加多肽的产生。多核苷酸拷贝数的增加可通过如下方法获得：将至少一个额外拷贝的序列整合入宿主细胞基因组，或将可扩增的选择性标记基因包括于多核苷酸，其中可通过在合适的选择剂(selectable agent)存在下培养细胞来选择含有选择性标记基因的扩增拷贝，且由此含有多核苷酸的额外拷贝的细胞。

[0124] 用于连接上述元件以构建本发明的重组表达载体的方法是本领域技术人员熟知的(参见，例如，Sambrook等，1989，见上文)。

[0125] 宿主细胞

[0126] 本发明还涉及重组宿主细胞，其包含本发明的多核苷酸，所述多核苷酸可操作地连接于一个或多个(几个)指导具有本发明的多肽的产生的调控序列。将包含多核苷酸的构建体或载体导入宿主细胞，使构建体或载体如前所述作为染色体整合体或者作为自复制的染色体外载体维持。术语“宿主细胞”包括亲本细胞的任何后代，其由于复制过程中发生的突变而不同于亲本细胞。宿主细胞的选择将在很大程度上依赖于编码多肽的基因及其来源。

[0127] 宿主细胞可以是在本发明的多肽的重组产生中有用的任何细胞，例如，原核或真核细胞。

[0128] 原核宿主细胞可以是任何革兰氏阳性细菌或革兰氏阴性细菌。革兰氏阳性细菌包括但不限于，芽孢杆菌属、梭菌属、肠球菌属、地芽孢杆菌属、乳杆菌属、乳球菌属、海洋芽孢杆菌属、葡萄球菌属、链球菌属和链霉菌属。革兰氏阴性细菌包括但不限于，弯曲杆菌属、大肠杆菌、黄杆菌属、梭杆菌属、螺杆菌属、泥杆菌属、奈瑟氏菌属、假单胞菌属、沙门氏菌属和脲原体属。

[0129] 细菌宿主细胞可以是任何芽孢杆菌属细胞，包括但不限于，嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌细胞。

[0130] 细菌宿主细胞还可以是任何链球菌属细胞，包括但不限于，似马链球菌、酿脓链球菌、乳房链球菌和马链球菌兽瘟亚种细胞。

[0131] 细菌宿主细胞还可以是任何链霉菌属细胞，包括但不限于，不产色链霉菌、除虫链霉菌、天蓝链霉菌、灰色链霉菌和浅青紫链霉菌细胞。

[0132] 可通过如下方法实现将DNA引入到芽孢杆菌属细胞：例如原生质体转化(参见，例如，Chang和Cohen，1979，Mol.Gen.Genet.168：111-115)，使用感受态细胞( 参见，例如，Young 和 Spizizen，1961，J. Bacteriol.81：823-829 或 Dubnau 和Davidoff-Abelson，1971，J. Mol.Biol.56：209-221)，电穿孔(参见，例如，Shigekawa和Dower，1988，Biotechniques 6：742-751)或接合(参见，例如，Koehler和Thorne，
1987，J. Bacteriol.169：5771-5278)。可通过如下方法实现将DNA引入到大肠杆菌细胞：例如原生质体转化(参见，例如，Hanahan，1983，J.Mol.Biol.166：557-580)或电穿孔(参见，例如，Dower等，1988，Nucleic Acids Res.16：6127-6145)。可通过如下方法实现将DNA引入到链霉菌属细胞：例如原生质体转化和电穿孔(参见，例如，Gong等，
2004，Folia Microbiol.(Praha)49：399-405)，接合(参见，例如，Mazodier等，1989，J. Bacteriol.171：3583-3585)，或转导(参见，例如，Burke等，2001，Proc.Natl.Acad.Sci.USA98：6289-6294)。可通过如下方法实现将DNA引入到假单胞菌属细胞：例如电穿孔(参见，例如，Choi等，2006，J. Microbiol.Methods 64：391-397)或接合(参见，例如，Pinedo和Smets，2005，Appl.Environ.Microbiol.71：51-57)。可通过如下方法实现将DNA引入到链球菌属细胞：例如天然感受态(natural competence)(参见，例如，Perry和Kuramitsu，1981，Infect.Immun.32：1295-1297)，原生质体转化(参见，例如，Catt和Jollick，1991，Microbios.68：189-207)，电穿孔(参见，例如，Buckley等，1999，Appl.Environ.Microbiol.65：3800-3804)或接合(参见，例如，Clewell，1981，Microbiol.Rev.45：409-436)。然而，可以使用本领域已知的将DNA引入宿主细胞的任何方法。

[0133] 产生方法

[0134] 本发明还涉及用于产生本发明多肽的方法，其包括：(a)在有助于产生多肽的条件下培养细胞，所述细胞以其野生型形式产生所述多肽；和(b)回收所述多肽。在一个优选的方面，所述细胞是Caminibacter的细胞。在更优选的方面，所述细胞是Caminibacter hydrogeniphilus、Caminibacter mediatlanticus或 Caminibacter profundus。在最优选的方面，所述细胞是Caminibacter hydrogeniphilus DSM l4510、Caminibacter mediatlanticus DSM 16658 或Caminibacter profundus DSM 15016。

[0135] 本发明还涉及用于产生本发明的多肽的方法，其包括：(a)在有助于产生多肽的条件下培养本发明的重组宿主细胞；和(b)回收所述多肽。

[0136] 使用本领域熟知的方法在适合于产生所述多肽的营养培养基中培养细胞。例如，可以通过在合适培养基中和允许表达和/或分离所述多肽的条件下进行的摇瓶培养，和实验室或工业发酵罐中的小规模或大规模发酵(包括连续、分批、补料分批或固态发酵)来培养细胞。使用本领域已知的方法在合适的营养培养基中进行培养，所述营养培养基包含碳源和氮源和无机盐。合适的培养基能够从商业供应商获得或可以根据公开的组成制备(例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中)。如果多肽分泌到营养培养基中，该多肽能够从所述培养基中直接回收。如果多肽不分泌，其能够从细胞裂解物(lysate)回收。

[0137] 可以使用本领域已知的对于所述多肽是特异性的方法来检测多肽。这些检测方法可包括特异性抗体的使用、酶产物的形成或酶底物的消失。例如，酶测定法(enzyme assay)可用于测定如多肽的活性。

[0138] 多肽可以使用本领域已知的方法回收。例如，多肽可以通过常规方法从营养培养基中回收，所述常规方法包括但不限于离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀。

[0139] 多肽可以通过多种本领域已知的方法纯化以获得基本上纯的多肽，所述方法包括但不限于层析(例如，离子交换、亲和、疏水、层析聚焦和大小排阻)、电泳方法(例如，制备型(preparative)等电聚焦)、差示溶解度(例如，硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE或提取(参见，例如，Protein Purification，J.-C.Janson和Lars Ryden，editors，VCH Publishers，New York，1989)。

[0140] 在另一个方面，不回收多肽，但将本发明表达多肽的宿主作为多肽的来源。

[0141] 包含多肽的组合物和其制备方法

[0142] 本发明提供了包含本发明的Caminibacter碳酸酐酶和优选包含赋形剂的组合物，和制备此种组合物的方法，包括将本发明的多肽与赋形剂混合。

[0143] 在一个具体实施方案中，本发明的Caminibacter碳酸酐酶是组合物的主要(多肽)组分，即为单组分组合物。在该上下文中的赋形剂应理解为任何用于配制所述组合物的辅助剂或化合物，并包括溶剂(例如水、无机盐、填充剂、色素、蜡)、载体、稳定剂、交联剂、粘合剂、防腐剂、缓冲液等。

[0144] 所述组合物还可包含一种或多种其他酶，如一种或多种其他碳酸酐酶，脱羧酶，漆酶或氧化酶。

[0145] 所述组合物可根据本领域已知方法制备，并可为液体或固体组合物的形式。例如，所述酶组合物可使用配制技术酶和/或医药产物的本领域已知的方法进行配制，例如配制为涂覆的或非涂覆的颗粒或微颗粒。本发明的多肽可因此以颗粒，优选无尘颗粒，液体，特别是稳定化的液体，浆料，或保护的多肽的形式提供。

[0146] 对于某些应用，可优选固定化所述多肽。固定化的酶包括两种基本功能，即设计用于协助分离(例如，从应用环境分离催化剂，重新使用催化剂和控制工艺)的非催化功能和设计用于在所需时间和空间内转化靶化合物(或底物)的催化功能(Cao，Carrier-bound Immobilized Enzymes：Principles，Applications and Design，Wiley-VCH Verlag GmbH & Co.KGaA，Weinheim，Germany，2005)。当酶固定化时，其变得对于其协助转化的靶化合物(底物)和使用的溶剂是不溶的。固定化的酶产物可从应用环境分离以促进其重新使用，或减少所需的酶量，或在其中连续递送底物并从酶附近连续移出产物的过程中使用酶，其例如减少酶成本。此外，酶常常通过固定化来稳定化。涉及固定化的酶的工艺常常是连续的，其促进简单的工艺控制。固定化的酶可通过机械手段或通过容纳于限定的空间作为异源催化剂而得到保留。后者可通过微包埋于例如半透过性膜或通过使用例如中空纤维模块等容纳于UF系统来进行。亦常常使用在多孔载体上的固定化。这包括例如通过吸附、络合/离子/共价结合或仅简单将可溶性酶吸收于载体上来将酶结合于载体，和后续的溶剂去除。酶的交联亦可用作固定化的手段。产业上亦应用了通过容纳于载体将酶固定化(Buchholz等，Biocatalysts and Enzyme Technology，Wiley-VCH Verlag GmbH & Co.KGaA，Weinheim，Germany，2005)。固定化酶如碳酸酐酶的具体方法包括但不限于，如WO 2007/036235(通过提述并入本文)中所述的将酶与包含多官能性胺的液体介质和包含交联剂的液体介质喷淋于颗粒状多孔载体上，如WO 2005/114417(通过提述并入本文)中所述的将碳酸酐酶与交联剂(例如戊二醛)连接于卵清蛋白层，该层又附着于聚合物支持物的粘合剂层，或如美国专利5,776,741号中所述的将碳酸酐酶偶联于二氧化硅载体，或偶联于硅烷，或CNBr活化的载体表面如玻璃，或如Bhattacharya等，2003，Biotechnol.Appl.Biochem.38：111-117(通过提述并入本文)中所述将碳酸酐酶与甲基丙烯酸酯共聚于聚合物珠上，使用US 2010/068784中所述的球状蛋白和粘合剂。所述碳酸酐酶亦可使用标记如组氨酸样标记(例如6x His标记或HQ标记)或纤维素结合模块(CBM)(Liu等，2008，Biotechnol.Prog.25：68-74)固定化。

[0147] 本发明的一个实施方案是组合物，包含适于固定化的基质，和选自下组的碳酸酐酶：

[0148] a)来源于或可由Caminibacter mediatlanticus DSM 16658或Caminibacter hydrogeniphilus DSM 14510产生的多肽；或

[0149] b)具有对应于SEQ ID NO：2的氨基酸残基28至259或36至259或者SEQ ID NO：13的氨基酸残基23至243的氨基酸序列的多肽；或

[0150] c)与SEQ ID NO：2的氨基酸残基28至259或36至259或者SEQ ID NO：13的氨基酸残基23至243至少60％相同的多肽；或

[0151] d)(a)、(b)或(c)具有碳酸酐酶活性的片段；或

[0152] e)由核酸序列编码的多肽，所述核酸序列在中等严格条件下与下述杂交：

[0153] i)编码SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：13的成熟多肽的多核苷酸序列；或

[0154] ii)SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：16的多核苷酸序列；或[0155] iii)(i)或(ii)的至少100个连续核苷酸的亚序列，或

[0156] iv)(i)或(ii)的互补链；或

[0157] f)由核酸序列编码的多肽，所述核酸序列由于遗传密码的简并性，并不与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：16的多核苷酸序列杂交，但编码具有依照b)或c)的氨基酸序列的多肽。

[0158] 在本发明的进一步的实施方案中，所述碳酸酐酶固定在基质上。所述基质例如可选自下组：珠、织物、纤维、中空纤维、膜、颗粒、多孔表面、杆、结构化填料和管。合适的基质的具体实例包括氧化铝、膨润土、生物聚合物、碳酸钙、磷酸钙凝胶、碳、纤维素、陶瓷支持物、粘土、胶原、玻璃、羟基磷灰石、离子交换树脂、高岭土、尼龙、酚聚合物、聚氨苯乙烯、聚丙烯酰胺、聚丙烯、聚合物水凝胶、Sephadex、Sepharose、二氧化硅胶、沉淀的二氧化硅和TEFLON牌PTFE。在本发明的一个实施方案中，碳酸酐酶根据Methods in Enzymology volume XLIV (section in the chapter：Immobilized Enzymes，118-134页，由 Klaus Mosbach编，Academic Press，New York，1976)(通过提述并入本文)中所述的技术固定化于尼龙基质上。待包括在组合物中的多肽可根据本领域已知方法稳定化，例如通过添加抗氧化剂或还原剂以限制多肽的氧化而稳定组合物中的多肽，其可通过添加聚合物如PVP、PVA、PEG、糖、寡聚物、多糖或其他合适的已知对多肽在固体或液体组合物中的稳定性有益的聚合物来稳定化，或其可通过添加存在于酶活性位点的稳定化离子如锌(例如氯化锌或硫酸锌)来稳定化。可添加防腐剂如Proxel、青霉素以在应用中延长保存期或性能。

[0159] 在本发明的实施方案中，所述碳酸酐酶通过吸附在基质、表面或底物上而固定化。基质、表面或底物的非限定性实例包括来自下组的那些：珠、织物、纤维、中空纤维、膜、颗粒、多孔表面、杆、结构化填料和管。合适的基质、表面或底物的具体实例包括氧化铝、膨润土、生物聚合物、碳酸钙、磷酸钙凝胶、碳、纤维素、陶瓷支持物、粘土、胶原、玻璃、羟基磷灰石、离子交换树脂、高岭土、尼龙、酚聚合物、聚氨苯乙烯、聚丙烯酰胺、聚丙烯、聚合物水凝胶、Sephadex、Sepharose、硅胶、沉淀的二氧化硅和TEFLON牌PTFE。在实施方案中，在吸附所述酶之后，可干燥所述基质、表面或底物。

[0160] 在又一实施方案中，本发明的组合物是可应用于二氧化碳捕获的组合物。实施例

[0161] 实施例1

[0162] 在枯草芽孢杆菌中克隆和表达Caminibacter mediatlanticus DSM 16658碳酸酐酶

[0163] 设计了基于Caminibacter mediatlanticus DSM 16658CA(Uniprot：A6DCH2)蛋白序列的合成基因，并将该基因针对枯草芽孢杆菌进行了密码子优化。

[0164] 将合成基因从携带合成基因的质粒进行PCR扩增。第一PCR反应(PCR(1))是在总体积50微升中进行的，添加了下述试剂：1微升合成DNA制备物(模板)，10pmol各引物(C1297synthf和C1297synthr)，dNTP和Phusion GC缓冲液中的聚合酶(Finnzymes，Finland)。PCR条件为94℃进行2分钟；9个循环，每循环94℃进行15秒；55℃进行45秒；68℃进行1分钟，然后68℃进行10分钟；4℃进行20分钟，和15℃直至PCR程序结束。

[0165] 使用的引物为：

[0166] C1297synthf tttagttcatcgatcgcatcggctgcgtcttcttacaactaccacgc(SEQ ID NO：4)

[0167] C1297synthr gccaaggccggttttttatgttttacttaaggattacgcgagcattg(SEQ ID NO：5)

[0168] PCR(1)产物具有大约700bp的长度，将PCR产物纯化。该PCR产物适于后续的SOE PCR(2)融合反应。将来自克劳氏芽孢杆菌(aprH)的碱性蛋白酶的信号肽通过如WO99/43835(通过提述并入本文)中所述的SOE融合符合读框地融合于PCR(1)中获得的编码碳酸酐酶的DNA。将从PCR(2)获得的包含碳酸酐酶编码序列的核苷酸片段通过同源重组整合入枯草芽孢杆菌宿主细胞基因组。在三重启动子系统(如WO 99/43835中所述)的调控下表达基因构建体。使用编码氯霉素乙酰转移酶的基因作为标志物(如(Diderichsen等，
1993，Plasmid 30：312-315)中所述)。

[0169] 通过DNA测序分析氯霉素抗性转化体以验证正确的构建体DNA序列。翻译的蛋白序列对应于SEQ ID NO：2，其中氨基酸1-17对应于克劳氏芽孢杆菌aprH信号肽，氨基酸28-35是来自C.mediatlanicus的CA的信号肽的一部分，而氨基酸36-259对应于预测的成熟CA。

[0170] 选择一个表达克隆并在500mL带挡板的锥形瓶中在旋转摇床上培养，每个瓶中包含100ml补充34mg/l氯霉素的基于酪蛋白的培养基。将克隆在37℃培养4日。根据Wilbur，1948，J. Biol.Chem.176：147-154(基本上如实施例5中所述)确定培养液中有碳酸酐酶活性。

[0171] 实施例2

[0172] 在枯草芽孢杆菌中克隆并表达具有N-末端HQ标记和凝血酶切割位点的Caminibacter mediatlanticus DSM 16658

[0173] 将实施例1中所述的包含合成基因的质粒用作模板以供PCR(3)。正向引物为编码HQ亲和标记的CamiHQ。

[0174] CamiHQ catcagcaccaacaccagcatcctaggacttggtcttactctggcaag(SEQ ID NO：6)[0175] 反向引物为用于PCR(1)中的C1297synthr。以与PCR(1)相同的条件进行PCR(3)。

[0176] PCR(3)产物具有大约700bp的长度，将PCR产物纯化。该PCR产物适于后续的SOE PCR(4)融合反应。将来自克劳氏芽孢杆菌的碱性蛋白酶(aprH)的信号肽通过如WO99/43835(通过提述并入本文)中所述的SOE融合符合读框地融合于PCR(3)中获得的编码碳酸酐酶的DNA。将从PCR(4)获得的包含碳酸酐酶编码序列的核苷酸片段通过同源重组整合入枯草芽孢杆菌宿主细胞基因组。在三重启动子系统(如WO 99/43835中所述)的调控下表达基因构建体。使用编码氯霉素乙酰转移酶的基因作为标志物(如Diderichsen等，
1993，Plasmid 30：312-315中所述)。

[0177] 通过DNA测序分析氯霉素抗性转化体以验证正确的构建体DNA序列。翻译的蛋白序列对应于SEQ ID NO：3，其中氨基酸1-27对应于克劳氏芽孢杆菌aprH信号肽，氨基酸28-34对应于HQ标记，氨基酸35-36对应于凝血酶切割位点，而氨基酸37-260对应于预测的成熟CA。

[0178] 选择一个表达克隆并对其根据实施例1中所述步骤进行培养。制备了来自培养的克隆的基因组DNA，并用其转化蛋白酶较弱的枯草芽孢杆菌宿主株。选择一个来自该蛋白酶较弱的株的表达克隆，并对其根据实施例1中所述步骤进行培养。根据Wilbur，1948，J. Biol.Chem.176：147-154(基本上如实施例5中所述)确定培养液中有碳酸酐酶活性。

[0179] 实施例3

[0180] 酶纯化

[0181] 将来自获得自实施例2中蛋白酶较弱的枯草芽孢杆菌宿主株的培养液离心(20000x g，30分钟)，并通过过滤澄清上清。将硫酸铵添加至3.2M终浓度，并通过离心收集沉淀出的蛋白。将沉淀出的蛋白溶解于5体积的去离子水，并通过NALGENE 0.2微米Filtration单元(目录号569-0020)过滤以得到澄清溶液。将0.2微米滤过物的pH调整至pH 7.5，并将该滤过物施于在50mMHEPES/NaOH，500mM NaCl，pH 7.5中平衡的Ni-Sepharose FF柱(GEHealthcare)。在用平衡缓冲液洗涤该Ni-Sepharose FF柱之后，用含10mM咪唑的平衡缓冲液彻底洗涤该柱以去除松散结合的蛋白。在这些洗涤之后，通过用50mM HEPES/NaOH，500mM咪唑，pH 7.5的逐步洗脱将碳酸酐酶洗脱。将洗脱峰转移至G25Sephadex柱(GE Healthcare)上的10mM MES/NaOH，pH6.0。将经缓冲液交换的溶液施于在10mM MES/NaOH，pH 6.0中平衡的SOURCE 30S柱(GE Healthcare)。在用平衡缓冲液彻底洗涤该SOURCE 30S柱之后，在相同缓冲液中以五个柱体积用线性NaCl梯度(0--＞0.5M)洗脱该酶。将来自该柱的级分通过SDS-PAGE分析，并汇集纯级分。汇集的碳酸酐酶溶液略微有色，因此将该溶液在去离子水中稀释5x，并施于在10mMMES/NaOH，pH 6.0中平衡的S-Sepharose HP柱(GE Healthcare)。在用平衡缓冲液彻底洗涤该S-Sepharose HP柱之后，通过用10mM MES/NaOH，1M NaCl，pH 6.0的逐步洗脱将酶洗脱。最后，将碳酸酐酶峰转移至G25Sephadex柱(GEHealthcare)上的50mM HEPES/NaOH，500mM NaCl，pH 7.0。基于SDS PAGE，CA的纯度估计为高于90％，酶以Mw＝29kDa的条带迁移。经缓冲液交换的溶液包含纯化的CA制备物，并用于进一步表征。

[0182] 实施例4

[0183] 嗜热甲烷八叠球菌TM-1碳酸酐酶的克隆、表达和纯化。

[0184] 设计了基于来自嗜热甲烷八叠球菌(UniProt：P40881)的γ-CA蛋白序列的合成基因，并针对枯草芽孢杆菌进行了优化。

[0185] 将合成基因从携带合成基因的质粒PCR扩增。第一PCR反应(PCR(1))是在总体积50微升中进行的，添加了下述试剂：1微升合成DNA制备物(模板)，10pmol各引物(sgCAtspf和sgCAr)，dNTP和Phusion GC缓冲液中的聚合酶(Finnzymes，Finland)。PCR条件为94℃进行2分钟；9个循环，每循环94℃进行15秒；55℃进行45秒；
68℃进行1分钟，然后68℃进行10分钟；4℃进行20分钟，和15℃直至PCR程序结束。

[0186] 使用的引物为：

[0187] sgCAtspf cttgctgcctcattctgcagccgcgCAAGAGATCACTGTTGA(SEQ ID NO：8)[0188] sgCAr tccgatccccttttccattctactTTATGAAGTCTCTTTGTAGC(SEQ ID NO：9)[0189] PCR(1)产物具有大约690bp的长度，将PCR产物纯化并通过PCR(2)框内融合于来自地衣芽孢杆菌的α-淀粉酶(AmyL)的信号肽。将从PCR(2)获得的包含α-淀粉酶信号肽符合读框地融合于所述γ-碳酸酐酶的核苷酸片段通过同源重组整合入枯草芽孢杆菌宿主细胞基因组。在由来自地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)、解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)的启动子和包含稳定化序列的苏云金芽孢杆菌cryIIIA启动子组成的三重启动子系统(如WO99/43835中所述)的调控下表达基因构建体。使用编码氯霉素乙酰转移酶的基因作为标志物(例如在Diderichsen等，1993，Plasmid30：312-315中所述)。

[0190] 通过DNA测序分析氯霉素抗性转化体以验证正确的构建体DNA序列。翻译的蛋白序列对应于SEQ ID NO：7，其中氨基酸1-28对应于AmyL信号肽，氨基酸29-241对应于预测的成熟γ-CA。

[0191] 选择一个表达克隆并将其在1升补料分批发酵中在38℃培养34日。在发酵过程中用氨水将pH维持在6.8。根据Wilbur，1948，J. Biol.Chem.176：147-154(基本上如实施例5中所述)确定培养液中有碳酸酐酶活性。

[0192] 将发酵液离心(26000x g，20分钟)，并通过过滤澄清上清。将滤过物转移至G25Sephadex柱(GE Healthcare)上的10mM HEPES/NaOH，pH 7.0。将经缓冲液交换的溶液施于在20mM HEPES/NaOH，pH 7.0中平衡的Q SepharoseFF柱(GE Healthcare)。在用平衡缓冲液彻底洗涤该Q Sepharose FF柱之后，在相同缓冲液中以五个柱体积用线性NaCl梯度(0--＞0.5M)洗脱该酶。将来自该柱的级分就CA活性进行分析，并将活性级分汇集并用去离子水稀释至4.2mS/cm的电导率。将稀释的CA汇集物施于在20mM HEPES/NaOH，pH7.0中平衡的SOURCE 30Q柱(GE Healthcare)。在用平衡缓冲液彻底洗涤该SOURCE 30Q柱之后，在相同缓冲液中以六个柱体积用线性NaCl梯度(0--＞0.5M)洗脱该酶。将来自该柱的级分就CA活性进行分析，并将最具活性的级分汇集。将硫酸铵添加至CA汇集物至
2.0M终浓度，并将该酶施于在10mMHEPES/NaOH，2.0M(NH4)2SO4，pH 7.0中平衡的Toyopearl Phenyl 650S柱。在用平衡缓冲液彻底洗涤该Toyopearl Phenyl柱之后，在相同缓冲液中以六个柱体积用线性(NH4)2SO4梯度(2.0→0M)洗脱该酶。将来自该柱的级分就CA活性进行分析，并将最具活性的级分作为纯化产物汇集。将纯化产物在4-20％Tris-甘氨酸Gold SDS-PAGE上运行，揭示了一系列29-15kDa的条带，其中在29kDa的条带为全长成熟CA。通过N-末端测序分析条带。纯化产物中的所有序列匹配来自嗜热甲烷八叠球菌的CA，然而自翻译序列中的不同位置起始。预期23kDa-29kDa的条带包含活性CA，并构成产物的大约
60％。

[0193] 实施例5

[0194] 碳酸酐酶活性的检测

[0195] 用于碳酸酐酶检测的测试描述于Wilbur，1948，J. Biol.Chem.176：147-154。其设定是基于测定混合物由于式1中给出的从二氧化碳形成碳酸氢根而致的pH变化：

[0196] [CO2+H2O→HCO3-+H+]。

[0197] 用于该研究的活性测定法是来源于Chirica等，2001，Biochim.Biophys.Acta1544(1-2)：55-63的步骤。包含大约60至70mM CO2的溶液通过在测定之前大约30分钟使用注射器尖端将CO2鼓泡入100ml蒸馏水来制备。将CO2溶液在水浴中冷却至4℃。为了测试碳酸酐酶的存在，将2ml用25mM HCl溶液调整至pH 8.3的25mM Tris(包含足量的溴酚蓝以给出明显可见的蓝色)添加至两个在4℃水浴中冷却的13x100mm试管。向一个试管添加10微升的包含酶的溶液(例如发酵液或纯化的酶)，并将相等量的缓冲液添加至第二个试管作为对照。将2ml CO2溶液非常迅速而平稳地添加至每个试管底部。在添加CO2溶液的同时，将秒表起始。记录了溶液从蓝色变为黄色所需的时间(溴酚蓝的转变点为pH
6-7.6)。在CO2水合反应过程中的氢离子的产生降低溶液的pH直至达到溴酚蓝的颜色转变点。颜色变化所需的时间与样品中存在的碳酸酐酶的量反向相关。为了使结果可以重复，在测定过程中，试管必须维持浸泡在冰浴中。通常，未催化的反应(对照)需要40至60秒使得发生颜色变化，而酶催化反应在5至15秒完成，取决于酶溶液中添加的酶蛋白的量。
检测颜色变化有些主观性，但三重测量的误差对于催化的反应是在0至1秒差别的范围内。
一单位根据Wilbur定义[1U＝(1/tc)-(1/tu)x 1000]，此处U是单位，而tc和tu分别代表按秒计的催化和非催化反应的时间(Wilbur，1948，J. Biol.Chem.176：147-154)。这些单位亦称作Wilbur-Anderson单位(WAU)。

[0198] 实施例6

[0199] Caminibacter碳酸酐酶的热稳定性

[0200] 在提高温度处理之后评估了碳酸酐酶的融化温度以及活性

[0201] 差示扫描量热法(DSC)

[0202] 将实施例3中获得的纯化的Caminibacter CA酶在50mM HEPES/NaOH，pH7.0或1M倍半碳酸钠(Na-sesquicarbonate)，pH 10.0中稀释至大约1mg/ml。在来自MicroCal，MA的VP DSC中以90℃/小时的扫描率从20℃至120℃进行DSC。CA的融化点(在热分析图上变性峰顶部的温度)在pH 7.0为109℃而在pH10为103℃。据发明人所知这是迄今为止报道的碳酸酐酶的最高融化温度。

[0203] 温度稳定性测定

[0204] 在热处理之后就升高温度和增加温育时间评估了本发明的Caminibacter碳酸酐酶和已知的来自嗜热甲烷八叠球菌的嗜热碳酸酶的残余活性。

[0205] 稳定性作为升高的温度的函数

[0206] 从实施例3和5获得的纯化的CA酶的热稳定性如下所述测量：将10微升每种酶在pH 8的1MNaHCO3中稀释10倍，并在所需温度温育15分钟。为了测量tu，将1M NaHCO3在相同温度加热，所述tu对应于实施例5中解释的非催化反应的反应时间。将样品冷却至室温，并使用实施例5中所述的Wilbur-Anderson测定来测量碳酸酐酶活性。

[0207] 在高温下温育之后的残余活性计算为热处理之后的活性除以在处理之前酶在25℃的活性，乘以100％。结果示于表1，其清楚地显示Caminibacter CA在热稳定性方面优于嗜热甲烷八叠球菌CA。

[0208] 表1在1MNaHCO3中15分钟热处理之后的温度稳定性

[0209]

[0210] n.d.＝未确定

[0211] 稳定性作为增加的温育时间的函数

[0212] 将从实施例 3 和 5获得的两种碳酸酐酶用1M NaHCO3pH 8 或0.1MBritton-Robinson(B-R)缓冲液pH 8(包含62.4体积％的0.1M酸(0.1M磷酸，0.1M乙酸，0.1M硼酸)和37.6体积％的0.5M氢氧化钠)稀释10倍，并在80℃加热所示时间。残余活性如上所述测量。结果示于表2，其清楚地显示Caminibacter碳酸酐酶在pH 8，80℃温育2小时之后能够在1M NaHCO3中保持83％残余活性而在0.1M Britton-Robinson缓冲液中保持82％残余活性。

[0213] 表2在80℃的热处理之后的残余活性

[0214]

[0215]

[0216] n.d.＝未确定

[0217] 实施例7

[0218] 在中空纤维膜生物反应器中从混合气体流提取CO2

[0219] 设置实验室规模的中空纤维膜生物反应器(HFMB)以从类似烟道气的气体流选择性捕获CO2。

[0220] 中空纤维膜生物反应器设置

[0221] 多孔的疏水中空纤维膜提供了气体流和载液之间的高接触表面积。结果是它们2
促进了液体的碳酸化或CO2从液体移除。选定的模块由2300支具有0.18m 活性表面积和
0.01x0.04微米的平均孔径的平行的中空纤维((Liqui- 1x5.5购自
Membrana，North Carolina，USA)。这些膜易于放大至产业规模，并已在产业上用于废水处理和饮料碳酸化。生物反应器设置的示意图示于图1。在该设置中，使用容积泵使载液流经中空纤维腔。液流速率设为约4ml/分钟。包含15％CO2(9CCM)和85％N2(51CCM)的混合物的气体流(进料气)进入中空纤维的进样侧，与载液流逆流，而经处理的气体流(洗涤气)在中空纤维的吹扫侧(sweep side)排出模块。在整个实验中使用两个质流控制器以稳定的浓度混合氮和二氧化碳。质流计用于在洗涤气排出反应器时监测其流量。调整气流和液流和压力以避免使得液体进入模块气相以及气体在模块液相中起泡。

[0222] 该设置的目的是为了说明CO2吸收入载液，导致CO2水合为碳酸氢根。吸收是通过使用气相色谱(GC)分析进样气和洗涤气中CO2浓度来测量的。

[0223] 载液

[0224] 使用1M碳酸氢钠和1M氢氧化钠溶液(pH＝9)的混合物作为载液对照。然后，将实施例3中所述的纯化而获得的0.03mg/mL碳酸酐酶(CA)酶蛋白添加至贮器(reservoir)。温度维持在室温。

[0225] 气相色谱方法(GC-TCD)

[0226] 将具有热传导检测器和气体取样阀的Shimadzu 2010气相色谱仪用于CO2浓度测量。将毛细管Carboxen Plot 1010柱用于检测氮气和二氧化碳。将柱在35℃等温加热7分钟，将温度以20℃/分钟的速率增加至200℃，并在200℃维持2分钟。将进样器和检测器温度维持在230℃。柱流为1ml/分钟，分流比为10比1，而载气为氦。氮和二氧化碳峰分别在6.4和15.3分钟的保留时间检测出。CO2峰使用购自Scott Specialty Gases(Pennsylvania，USA)的三种具有氮气中按重量计0.1％、1％和10％CO2的二氧化碳标样来校准。

[0227] 结果

[0228] 表3显示使用含或不含碳酸酐酶的载液从GC收集的数据。每个数据点为在室温运行时间过程中来自每次注入的测量。不考虑每组测量(含或不含碳酸酐酶的载液)中来自第一次注入的数据以消除对保留在管或柱中残余气体的疑虑。结果表明来自Caminibacter的0.03mg/mL碳酸酐酶酶蛋白相对于在相同条件下不含酶的对照运行(～44.5％)增加了CO2移除的效率至约80.0％。进样气中CO2百分比平均为17.4％。

[0229] 表3载液对排出中空纤维膜生物反应器的气体流的CO2浓度的作用

[0230]

[0231] 实施例8

[0232] 在碳酸酐酶热处理之后在中空纤维膜生物反应器中从混合气体流提取CO2[0233] 研究了本发明的Caminibacter碳酸酐酶和另一种已知的来自嗜热甲烷八叠球菌的热稳定性碳酸酐酶是否能够在高温预处理之后提取CO2。

[0234] 热处理

[0235] 将从实施例3中获得的Caminibacter CA溶液和从实施例5中获得的嗜热甲烷八叠球菌CA用经1M NaOH调整至pH＝9±0.1的1M NaHCO3稀释10倍加热至80℃，并在80℃维持2小时。在两小时之后，将溶液冷却至室温并用1M NaHCO3/NaOH pH＝9溶液稀释以达到0.03mg/ml酶蛋白。将这些经热处理的酶溶液用作中空纤维膜生物反应器设置中的载液，以比较这两种酶与对照溶液，1MNaHCO3/NaOH pH＝9，在从混合气提取CO2中的性能。

[0236] 分析CO2提取

[0237] 基本上如实施例7中所述设置实验室规模的中空纤维膜生物反应器(HFMB)测定以选择性地从类似烟道气的气体流捕获CO2。所述设置包含下述次要区别。液体流速降低至约2ml/分钟。替代将碳酸酐酶添加至载液，在对照运行之后，对于每次运行用150mL如上所述制备的包含0.03mg/mL酶蛋白的经热处理的CA溶液替代对照载液。对于每次酶运行使用新的中空纤维膜模块以避免污染。

[0238] 结果

[0239] 表4显示了从使用含或不含碳酸酐酶的载液的GC收集的数据。每个数据点为在室温运行时间过程中来自每次注入的测量。在每次碳酸酐酶之前，对对照载液进行数次注入，且不考虑来自每组测量(含或不含碳酸酐酶的载液)的第一次注入的数据以消除关于保留在管或柱中的残余气体的疑虑。结果显示甚至在高盐浓度存在下在80℃热处理两小时之后，来自Caminibacter的0.03mg/ml碳酸酐酶酶蛋白增加了CO2移除的效率至约62％，相对于相同条件下不含酶的对照运行中的44％CO2移除。然而，已知的来自嗜热甲烷八叠球菌的热稳定性CA在相同蛋白浓度相对于对照(～41％)并不改变载液溶液的CO2移除效率(～38％)。

[0240] 表4载液对排出中空纤维膜生物反应器的气体流的CO2浓度的作用

[0241]

[0242] 实施例9

[0243] Caminibacter碳酸酐酶的长期热稳定性

[0244] 如下所述在pH 8测量从实施例3获得的Caminibacter CA酶的长期热稳定性：将10微升酶在pH 8的0.1M Britton-Robinson缓冲液中稀释10倍，并在实验的运行时间期间在50℃温育。为了测量tu，将0.1M Britton-Robinson缓冲液在50℃加热相同时间，tu对应于如实施例5中解释的未催化的反应的反应时间。将样品冷却至室温，并使用实施例
5中所述的Wilbur-Anderson测定法测量碳酸酐酶活性。在温育不同时间之后的残余活性示于表5。结果显示在pH 8，Caminibacter CA酶在50℃加热30日之后保留了超过60％的其原始活性。

[0245] 表5.在pH 8在0.1M Britton-Robinson缓冲液中在50℃长期热处理过程中的残余活性

[0246]

[0247] 实施例10

[0248] 鉴定来自Caminibacter hydrogeniphilus DSM 14510的碳酸酐酶(CA)基因[0249] 使用商业上可获得的Next-Generation DNA 测序技术 Illumina Solexa(Fasteris，Switzerland) 对 Caminibacter hydrogeniphilus DSM 14510 的部分基因组进行测序。将10,242,572个序列的原始数据装配为453个重叠群(contig)，该技术对于本领域技术人员是已知的。部分碳酸酐酶基因通过使用SEQ ID NO：2的C.mediatlanticus CA序列作为检索项通过BLASTP检索鉴定为在重叠群ZY504820上。通过手动装配几个单独序列鉴定出了全长酶，且在标为D6YWW的重叠群上鉴定出了编码序列(SEQ ID NO：12)。翻译的蛋白序列对应于SEQ ID NO：13，其中氨基酸1-22对应于信号肽，而氨基酸23-243对应于预测的成熟CA。CA编码序列，SEQ ID NO：12，通过PCR扩增基因组DNA覆盖CA基因的部分来验证。将一微升基因组DNA制备物(模板)，10pmol的各寡聚物Chydrof和Chydror，dNTP和聚合酶(Finnzymes，Finland)混合于Phusion GC缓冲液中。PCR条件如实施例1中所述。对所得的PCR产物(大约800bp，PCR条件)进行测序，并用相同的寡聚物和寡聚Chydroseq通过Sanger测序来确证。

[0250] Chydrof ATACTTCTTTACAATTTTCTCG(SEQ ID NO：17)

[0251] Chydror AGAAGAGTGGAGTGATAAAAGG(SEQ ID NO：18)

[0252] Chydroseq TTTCTAAACAACGGCCATAC(SEQ ID NO：19)

[0253] 实施例11

[0254] 枯草芽孢杆菌中天然C.hydrogeniphilus DSM 14510 CA基因的克隆和表达[0255] 基本上，使用与实施例1中所述的相同步骤来将天然CA基因克隆入枯草芽孢杆菌。在此，将C.hydrogeniphilus DSM 14510的基因组DNA用作模板，并用寡聚物C6224r和C6224f通过PCR扩增基因。

[0256] C6224r CCA AGG CCG GTT TTT TAT GTT TTA TTT TAG TAT TACTCT TGC GTT(SEQ ID NO：20)

[0257] C6224f CAT CAG CAC CAA CAC CAG CAT ACA TGG AGC TAC AGCGGAAAAAC(SEQ ID NO：21)

[0258] 将融合的基因片段(SEQ ID NO：14)转化入枯草芽孢杆菌，并如实施例1中所述进行该酶(SEQ ID NO：15)在一个正确的表达克隆中的表达。通过使用实施例5中的测定法，未观察到CA活性，表明SEQ ID NO：14的碳酸酐酶基因未在枯草芽孢杆菌中表达。

[0259] 实施例12

[0260] 枯草芽孢杆菌中合成C.hydrogeniphilus DSM 14510CA基因的克隆和表达[0261] 为了使得能够表达来自C.hydrogeniphilus DSM 14510的CA，设计了编码碳酸酐酶的合成基因。该合成基因基于SEQ ID NO：14。对枯草芽孢杆菌优化了密码子使用，导致SEQ ID NO：16的经优化的序列。SEQ ID NO：16的翻译对应于SEQ ID NO：15，其中氨基酸1-27对应于克劳氏芽孢杆菌aprH信号肽，氨基酸28-34是亲和标记，氨基酸35-36是凝血酶切割位点而氨基酸37-257对应于预期的成熟CA。

[0262] 该合成基因的克隆步骤和表达遵循实施例11中所述的原理。

[0263] 当与缺乏碳酸酐酶基因的枯草芽孢杆菌表达宿主相比较时，通过SDS-PAGE分析观察到从正确的CA表达克隆获得了弱CA表达。在具有合成CA基因的枯草芽孢杆菌菌株的培养上清中测量出一至三个Wilbur单位。将培养上清在80℃处理15分钟，未观察到CA活性丧失，表明来自C.hydrogeniphilus DSM 14510的CA是热稳定性酶。

[0264] 实施例13

[0265] 将碳酸酐酶固定化于中空纤维膜生物反应器

[0266] 本公开的Caminibacter碳酸酐酶吸收至由聚丙烯制成的中空纤维膜的能力是通过比较洗涤膜之前和之后的CO2的洗涤效率，并进一步与其他碳酸酐酶在洗涤膜之前和之后的CO2洗涤性能相比较来测量的。如实施例7中所述设置实验室规模的中空纤维膜生物反应器(HFMB)来从类似烟道气的气体流选择性捕获CO2。

[0267] 载液

[0268] 将1M碳酸氢钠和1M氢氧化钠(pH＝9)溶液的混合物用作载液对照。然后，将实施例3中所述的纯化而获得的0.03mg/mL Caminibacter碳酸酐酶酶蛋白，或来源于克劳氏芽孢杆菌KSM-K16(Uniprot登录号Q5WD44)的克劳氏芽孢杆菌碳酸酐酶添加至贮器(reservoir)。温度维持在室温。在HFMB中在实施例7中所述的酶溶液的存在下实施CO2洗涤以测量“洗涤之前的”CO2洗涤结果。在清空贮器中的酶溶液之后，如下所述用洗涤溶液填充贮器并进行洗涤。然后使用洗涤的HFMB来实施第二次CO2洗涤以测量“洗涤之后的”CO2洗涤结果。

[0269] 膜洗涤

[0270] 在洗涤膜之前和之后测量膜的CO2洗涤效率以阐明Caminibacter碳酸酐酶可吸收于膜，并甚至在膜洗涤之后仍能相对于无酶的对照实现改善的CO2洗涤性能。在收集了“洗涤之前的”CO2洗涤结果之后，将膜模块用去离子水漂洗过夜。在该期间模拟的烟道气连续地经过该模块。在用去离子水漂洗之后，用1M氢氧化钠溶液调整至pH 9的1M碳酸氢钠水溶液填充贮器，其充当用于收集“洗涤之后的”CO2洗涤结果的载液。未向该“洗涤之后的”载液添加其他酶。因此，CO2洗涤效率的改善可归结于在洗涤步骤之前吸收于膜并在洗涤步骤之后仍在膜上保持可用并且有活性的酶。

[0271] 结果

[0272] 表6显示了在洗涤膜之前和之后，使用含或不含碳酸酐酶(CA)的载液从GC收集的数据。每个数据点是室温运行时间过程中来自三次注入的测量的平均值。进料气中CO2的百分比平均值为15％。不考虑来自每组测量(含或不含碳酸酐酶的载液)第一次注入的数据以消除关于保留在管或柱中的残余气体的疑虑。结果显示“在洗涤之前”，以约4mL/分钟的速率流经HFMB的来自Caminibacter的0.03mg/mL碳酸酐酶蛋白溶液的存在增加了CO2移除的效率至约72.9％，相对于在相同条件下不含酶的对照运行(～27.9％)。在洗涤膜之后，且未添加任何其他酶，数据显示实现73.4％的CO2移除。该结果阐明了Caminibacter碳酸酐酶在“洗涤之前的”步骤过程中吸收于或固定化于聚丙烯膜，并未被去离子水或新鲜的碳酸氢根载液所洗去(wash off)。使用中空纤维膜生物反应器中的0.03mg/mL来自克劳氏芽孢杆菌的碳酸酐酶溶液遵循同样的“之前/之后”步骤。表6显示“在洗涤之前”，膜添加来自克劳氏芽孢杆菌的碳酸酐酶增加CO2移除效率至约75.2％，相对于在相同条件不含酶的对照运行(～29.7％)。然而，在洗涤膜之后，CO2去除效率减少至23.8％，这类似于酶从未存在的对照处理的CO2洗涤效率。该数据显示Caminibacter碳酸酐酶相对于其他碳酸酐酶可有效地吸收于并附着于聚丙烯表面。该吸收于表面的能力对于涉及酶固定化的技术和工艺是有益性质。

[0273] 表6在洗涤步骤之前和之后载液对排出中空纤维膜生物反应器的气体流的CO2浓度的作用

[0274] 表6

[0275]

[0276] 实施例14

[0277] 用尼龙丸(pellet)填充的柱中碳酸酐酶的固定化

[0278] 设置实验室规模的填充柱生物反应器以从类似烟道气的气体流选择性捕获CO2。该反应器是使用带夹套的玻璃柱构建的，其中烟道气从底部进入该柱，而吸收溶液从柱顶部滴下。吸收发生于柱填充物，其可为可固定有碳酸酐酶的丸或珠。柱的性能可用下述来测试：用以1M氢氧化钠溶液调整至pH 9的1M碳酸氢钠水溶液作为载液，溶液中含或不含CA，而微孔状尼龙颗粒作为填充材料。将由Membrana GmbH，42289Wuppertal，Germany提供的尼龙丸(Accurel微孔聚合物-Polyamide 6Pellets XP700)浸泡于用1M氢氧化钠溶液调整至pH 9的1M碳酸氢钠水溶液中35分钟。然后将颗粒填充入经填充的柱反应器。然后将载液滴入柱顶部，并在柱底部鼓泡包含15％CO2的模拟的烟道气流。将来自柱顶部的洗涤气送至使用实施例7中所述的方法的GC。在收集所有需用于对照的数据之后，将本公开的来自Caminibacter的碳酸酐酶添加至载液，并收集了洗涤气数据。表7显示从使用含或不含碳酸酐酶(CA)的载液的GC收集的数据。每个数据点是在室温运行时间过程中来自三次注入的测量的平均值。不考虑来自每组测量(含或不含碳酸酐酶的载液)的第一次注入的数据以消除关于保留在管或柱中的残余气体的任何疑虑。结果表明在该实施例中，来自Caminibacter的0.03mg/mL碳酸酐酶酶蛋白增加CO2移除的效率至约58％，相对于相同条件下不含酶的对照运行(～16.4％)。将酶溶液在柱中过夜循环以确保最大量的酶吸附于柱上。翌日将柱用去离子水漂洗一小时。然后用以1M氢氧化钠溶液调整至pH 9的1M碳酸氢钠水溶液替代去离子水，并在该洗涤步骤之后对于不含添加的任何其他酶的载液测量洗涤气的CO2含量。数据显示甚至在过夜洗涤步骤之后可实现32.0％的CO2移除。因此，CA酶固定化于丸上。使用来自克劳氏芽孢杆菌的碳酸酐酶在填充柱反应器中遵循相同的步骤。表7显示来自克劳氏芽孢杆菌的碳酸酐酶的添加增加CO2移除效率至约52.9％，相对于在相同条件下不含酶的对照运行(～16.6％)。然而，当用去离子水继以用1M氢氧化钠溶液调整至pH 9的1M碳酸氢钠水溶液漂洗该模块时，容易地从膜模块洗去酶，且CO2移除效率减少回21.6％。该数据显示通过该步骤仅使用Caminibacter碳酸酐酶可实现固定化，这使该酶成为对于固定化特别适合的酶。

[0279] 表7在洗涤步骤之前和之后载液对排出填充柱生物反应器的气体流的CO2浓度的作用

[0280] 表7

[0281]

[0282] 应理解的是，可对本文中公开的实施方案进行多种修饰。因此，上述描述不应认为是限制性的，而是仅为实施方案的例示。本领域技术人员会想到所附权利要求书的范围和精神之内的其他修饰。

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