通过酰基-辅酶A溶血磷脂酰基转移酶的表达对长链ω-3和ω-6多不饱和脂肪酸的生物合成的改善
阅读：687发布：2023-02-13
专利汇可以提供通过酰基-辅酶A溶血磷脂酰基转移酶的表达对长链ω-3和ω-6多不饱和脂肪酸的生物合成的改善专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且基于酰基-辅酶A：溶血磷脂酰基转移酶[“LPLAT”](例如Ale1、LPAAT、LPCAT)的过表达，本文提供了用于在生产长链多不饱和 脂肪酸 [“LC-PUFA”]的含油重组 微 生物 宿主细胞中提高C18-C20延伸转化效率和/或Δ4去饱和转化效率的方法。生产宿主细胞和通过本 发明 的方法生产的油类也受 权利要求 书保护。，下面是通过酰基-辅酶A溶血磷脂酰基转移酶的表达对长链ω-3和ω-6多不饱和脂肪酸的生物合成的改善专利的具体信息内容。
1.用于至少一种长链多不饱和脂肪酸的改善生产的含油重组微生物宿主细胞，所述宿主细胞包含至少一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸编码具有至少酰基-辅酶A：溶血磷脂酰基转移酶活性的多肽，其中所述多肽选自：
a)基于Clustal W比对方法，在与选自SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：11的氨基酸序列进行比较时，具有至少45％的氨基酸同一性的多肽；
b)具有至少一种膜结合O-酰基转移酶蛋白质家族基序的多肽，其中所述膜结合O-酰基转移酶蛋白质家族基序选自：SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：
28；
c)基于Clustal W比对方法，在与如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列进行比较时，具有至少90％的氨基酸同一性的多肽；
d)基于Clustal W比对方法，在与选自SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：
18的氨基酸序列进行比较时，具有至少43.9％的氨基酸同一性的多肽；和e)具有至少一种1-酰基-sn-甘油-3-磷酸酰基转移酶家族基序的多肽，其中所述
1-酰基-sn-甘油-3-磷酸酰基转移酶家族基序选自：SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：20；
其中所述编码具有至少酰基-辅酶A：溶血磷脂酰基转移酶活性的多肽的至少一种分离的多核苷酸可操作地连接到至少一种调控序列，所述调控序列是相同的或不同的；并且，其中所述宿主细胞还具有至少一种改善，所述改善选自：
(i)在与对照宿主细胞进行比较时，在生产至少一种长链多不饱和脂肪酸的含油微生物宿主细胞中C18-C20延伸转化效率的提高；
(ii)在与对照宿主细胞进行比较时，在生产至少一种长链多不饱和脂肪酸的含油微生物宿主细胞中Δ4去饱和转化效率的提高。
2.权利要求1的重组宿主细胞，其中所述至少一种长链多不饱和脂肪酸选自：二十碳二烯酸、二高-γ亚麻酸、花生四烯酸、二十碳三烯酸、二十碳四烯酸、二十碳五烯酸、二十二碳四烯酸、ω-6二十二碳五烯酸、ω-3二十二碳五烯酸和二十二碳六烯酸。
3.权利要求1的重组宿主细胞，其中所述编码具有至少酰基-辅酶A：溶血磷脂酰基转移酶活性的多肽的多核苷酸被稳定地整合；并且，其中所述宿主细胞还具有至少一种改善，所述改善选自：
a)在与对照宿主细胞进行比较时，在生产至少一种长链多不饱和脂肪酸的含油微生物宿主细胞中C18-C20延伸转化效率至少4％的提高；和，
b)在与对照宿主细胞进行比较时，在生产至少一种长链多不饱和脂肪酸的含油微生物宿主细胞中Δ4去饱和转化效率至少5％的提高。
4.权利要求3的重组宿主细胞，其中所述改善选自：
a)在与对照宿主细胞进行比较时，在生产二十碳五烯酸的宿主细胞中C18-C20延伸转化效率至少13％的提高；
b)在与对照宿主细胞进行比较时，在生产二十二碳六烯酸的宿主细胞中C18-C20延伸转化效率至少4％的提高；
c)在与对照宿主细胞进行比较时，在生产二十二碳六烯酸的宿主细胞中Δ4去饱和转化效率至少18％的提高；
d)在与对照宿主细胞进行比较时，在生产二十碳五烯酸的宿主细胞中，以总脂肪酸的重量百分比测量的至少9％重量的二十碳五烯酸的提高；
e)在与对照宿主细胞进行比较时，在生产二十二碳六烯酸的宿主细胞中，以总脂肪酸的重量百分比测量的至少2％重量的二十碳五烯酸的提高；和
f)在与对照宿主细胞进行比较时，在生产二十二碳六烯酸的宿主细胞中，以总脂肪酸的重量百分比测量的至少9％重量的二十二碳六烯酸的提高。
5.权利要求1-4中任一项的重组宿主细胞，其中所述微生物为酵母。
6.权利要求5的重组宿主细胞，其中所述酵母为解脂耶氏酵母。
7.包含二十碳五烯酸和/或二十二碳六烯酸的油，所述油从权利要求4的含油重组微生物宿主细胞获得。
8.用于制备包含二十碳五烯酸和/或二十二碳六烯酸的油的方法，所述方法包括：
a)培养权利要求4的含油微生物宿主细胞，其中生产包含二十碳五烯酸和/或二十二碳六烯酸的油；以及
b)任选地回收步骤(a)的微生物油。
9.权利要求8的方法，其中步骤(b)的回收的油被进一步加工。
10.权利要求8的方法，其中所述宿主细胞为含油酵母。
11.权利要求10的方法，其中所述含油酵母为解脂耶氏酵母。
12.用于在生产长链多不饱和脂肪酸的含油重组微生物宿主细胞中提高C18-C20延伸转化效率的方法，所述方法包括：
a)向所述生产长链多不饱和脂肪酸的重组宿主细胞中导入至少一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸编码具有至少酰基-辅酶A：溶血磷脂酰基转移酶活性的多肽，其中所述多肽选自：
(i)基于Clustal W比对方法，在与选自SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：11的氨基酸序列进行比较时，具有至少45％的氨基酸同一性的多肽；
(ii)具有至少一种膜结合O-酰基转移酶蛋白质家族基序的多肽，其中所述膜结合O-酰基转移酶蛋白质家族基序选自：SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：28；
(iii)基于Clustal W比对方法，在与如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列进行比较时，具有至少90％的氨基酸同一性的多肽；
(iv)基于Clustal W比对方法，在与选自SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：
18的氨基酸序列进行比较时，具有至少43.9％的氨基酸同一性的多肽；和，(v)具有至少一种1-酰基-sn-甘油-3-磷酸酰基转移酶蛋白质家族基序的多肽，其中所述1-酰基-sn-甘油-3-磷酸酰基转移酶蛋白质家族基序选自：SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：20；
其中所述编码具有至少酰基-辅酶A：溶血磷脂酰基转移酶活性的多肽的至少一种分离的多核苷酸可操作地连接到至少一种调控序列，所述调控序列是相同的或不同的；和，b)使所述含油微生物宿主细胞生长；
其中所述含油微生物宿主细胞的C18-C20延伸转化效率相对于对照宿主细胞是提高的。
13.权利要求12的方法，其中：
a)所述编码具有至少酰基-辅酶A：溶血磷脂酰基转移酶活性的多肽的多核苷酸被稳定地整合；并且，
b)在与对照宿主细胞进行比较时，生产二十碳五烯酸的宿主细胞中C18-C20延伸转化效率的提高为至少13％。
14.权利要求12的方法，其中：
a)所述编码具有至少酰基-辅酶A：溶血磷脂酰基转移酶活性的多肽的多核苷酸被稳定地整合；并且，
b)在与对照宿主细胞进行比较时，生产二十二碳六烯酸的宿主细胞中C18-C20延伸转化效率的提高为至少4％。
15.权利要求12的方法，其中所述宿主细胞为含油酵母。
16.权利要求15的方法，其中所述含油酵母为解脂耶氏酵母。
17.用于在生产长链多不饱和脂肪酸的含油重组微生物宿主细胞中提高Δ4去饱和转化效率的方法，所述方法包括：
a)向所述生产长链多不饱和脂肪酸的重组宿主细胞中导入至少一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸编码具有至少酰基-辅酶A：溶血磷脂酰基转移酶活性的多肽，其中所述多肽选自：
(i)基于Clustal W比对方法，在与选自SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：11的氨基酸序列进行比较时，具有至少45％的氨基酸同一性的多肽；
(ii)具有至少一种膜结合O-酰基转移酶蛋白质家族基序的多肽，其中所述膜结合O-酰基转移酶蛋白质家族基序选自：SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：28；
(iii)基于Clustal W比对方法，在与如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列进行比较时，具有至少90％的氨基酸同一性的多肽；
(iv)基于Clustal W比对方法，在与选自SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：
18的氨基酸序列进行比较时，具有至少43.9％的氨基酸同一性的多肽；和(v)具有至少一种1-酰基-sn-甘油-3-磷酸酰基转移酶蛋白质家族基序的多肽，其中所述1-酰基-sn-甘油-3-磷酸酰基转移酶蛋白质家族基序选自：SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：20；
其中所述编码具有至少酰基-辅酶A：溶血磷脂酰基转移酶活性的多肽的至少一种分离的多核苷酸可操作地连接到至少一种调控序列，所述调控序列是相同的或不同的；并且，b)使所述含油微生物宿主细胞生长；
其中所述含油微生物宿主细胞的Δ4去饱和转化效率相对于对照宿主细胞是提高的。
18.权利要求17的方法，其中：
a)所述编码具有至少酰基-辅酶A：溶血磷脂酰基转移酶活性的多肽的多核苷酸是稳定地整合的；并且
b)在与对照宿主细胞进行比较时，Δ4去饱和转化效率的提高为至少18％。
19.权利要求17的方法，其中所述宿主细胞为含油酵母。
20.权利要求19的方法，其中所述含油酵母为解脂耶氏酵母。
通过酰基-辅酶A溶血磷脂酰基转移酶的表达对长链ω-3
[0002] 本发明属于生物技术领域。更具体地讲，本发明涉及基于编码酰基-辅酶A(CoA)：溶血磷脂酰基转移酶[“LPLAT”]的基因的过表达，用于在生产长链多不饱和脂肪酸[“LC-PUFA”]的含油的重组微生物宿主细胞中提高C18-C20延伸转化效率和/或Δ4去饱和转化效率的方法。
[0003] 发明背景
[0004] 甘油磷脂是生物酶的主要组分，其包含甘油核心，脂肪酸作为R基连接在甘油核心的sn-1位和sn-2位上，而极性头基通过磷酸二酯键连接在sn-3位处。具体的极性头基(例如磷脂酸、胆碱、乙醇胺、甘油、肌醇、丝氨酸、心磷脂)决定着对特定的甘油磷脂的命名，由此得到了磷脂酰胆碱[“PC”]、磷酸酰乙醇胺[“PE”]、磷脂酰甘油[“PG”]、磷脂酰肌醇[“PI”]、磷脂酰丝氨酸[“PS”]和心磷脂[“CL”]。甘油磷脂拥有巨大的多样性，这不仅是可变的磷酰基头基所致，而且还因为它们的脂肪酸的链长和饱和程度不同。一般而言，饱和的和单不饱和的脂肪酸在sn-1位被酯化，而多不饱和脂肪酸在sn-2位被酯化。
[0005] 甘油磷脂的生物合成是复杂的。下面的表1概述了最初由Kennedy和Weiss(J.Biol.Chem.，222：193-214(1956))描述的从头合成途径的步骤：
[0006] 表1：甘油磷脂从头生物合成的一般反应
[0007]
[0008] 在它们从头合成之后，甘油磷脂能够经历在sn-2位的脂肪酰成分的快速翻转。这种“重构”，或“酰基编辑”，对于膜的结构和功能、对压力条件的生物学应答、以及在生物技术应用中对脂肪酸组成和数量的操纵是重要的。具体而言，这种重构被认为是甘油磷脂的脱酰反应和所得到的溶血磷脂随后的再酰化所致。
[0009] 在Lands循环(Lands，W.E，J.Biol.Chem.，231：883-888(1958))中，重构通过下列协同的反应发生：1)磷脂酶，例如磷脂酶A2，从磷脂酰胆碱的sn-2位释放脂肪酸；和，2)酰基-辅酶A：溶血磷脂酰基转移酶[“LPLAT”]，例如溶血磷脂酰胆碱酰基转移酶[“LPCAT”]，使溶血磷脂酰胆碱[“LPC”]在sn-2位再酰化。其他的甘油磷脂也可以在它们相应的溶血磷脂酰基转移酶活性作用下涉及重构，包括具有溶血磷酸酰乙醇胺酰基转移酶[“LPEAT”]活性、溶血磷脂酰丝氨酸酰基转移酶[“LPSAT”]活性、溶血磷脂酰甘油酰基转移酶[“LPGAT”]活性和溶血磷脂酰肌醇酰基转移酶[“LPIAT”]活性的LPLAT酶。在所有情况下，LPLAT负责从细胞的酰基-辅酶A库中移除酰基-辅酶A脂肪酸和在sn-2位酰化磷脂库中的多种溶血磷脂底物。最后，LPLAT还包括涉及从LPA向PA的从头生物合成的LPAAT酶。LPCAT活性与两个结构上不同的蛋白质家族相关联，其中一个属于LPAAT蛋白质家族而另一个属于膜结合O-酰基转移酶[“MBOAT”]蛋白质家族。
[0010] 在其他的情况下，这种sn-2位重构被认为是具有LPCAT活性的酶的正向和逆向反应所致(Stymne S.和A.K.Stobart，Biochem J.，223(2)：305-314(1984))。
[0011] Shindou等人最近的数篇综述提供了对甘油磷脂生物合成和LPLAT的功能的概述(J.Biol.Chem.，284(1)：1-5(2009)；J.Lipid Res.，50：S46-S51(2009))。在公开文献和专利文献中已报道了基于多种保守的基序的很多种LPLAT。
[0012] 由于脂肪酸的生物合成需要酰基-辅酶A库和磷脂库之间酰基基团的迅速交换，LPLAT对多不饱和脂肪酸[“PUFA”]生产的影响也已被设想。具体而言，去饱和主要在磷脂的sn-2位发生，而延伸在酰基-辅酶A库中发生。例如，国际申请公布WO 2004/076617描述了一种LPCAT从秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)(克隆T06E8.1)的分离，并报道了当这种LPCAT在分别用外源的18:2或α-亚麻酸[“ALA”；18:3]脂肪酸饲养的经生物工程改造的啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株中表达时，Δ6去饱和和Δ6延伸的效率的提高，以及长链PUFA二十碳二烯酸[“EDA”；20:2]和二十碳四烯酸[“ETA”；20:4]的生物合成分别的提高。
[0013] 此外，国际申请公布WO 2004/087902的实施例16描述了高山被孢霉(Mortierella alpina)除了在SEQ ID NO：93中有N端28个氨基酸残基的延伸外相同的LPAAT-样蛋白质(由SEQ ID NO：93和SEQ ID NO：95的蛋白质编码，分别具有417个氨基酸的长度或389个氨基酸的长度)的分离。国际申请公布WO 2004/087902还报道了这些蛋白质中的一种用与国际申请公布WO 2004/076617中的那些相似的方法的表达，表达导致了EDA和ETA生物合成的类似改善。
[0014] 国际申请公布WO 2004/076617和WO 2004/087902教导了EDA和ETA的生物合成的改善是由于一些LPAAT-样蛋白质中可逆的LPCAT活性，尽管不是所有的LPAAT-样蛋白质均具有LPCAT活性。它们没有教导LPCAT的表达将导致在不需要外源供给脂肪酸底物的菌株中或在啤酒糖酵母以外的微生物物种中的改善。它们也没有教导LPCAT在经基因工程改造的微生物中的表达导致EDA和ETA以外的高LC-PUFA，例如ARA、EPA和DHA，的生产的提高，或者LPCAT的表达能够导致Δ6去饱和以外的替代性去饱和反应的改善。两份参考文献均未教导LPCAT或LPAAT-样蛋白质对没有外源供给脂肪酸的Δ6延伸或对Δ4去饱和的影响。
[0015] 多份其他的参考文献一般地描述了LPLAT与PUFA生物合成基因的共表达对于在转基因生物的油中提高所期望的脂肪酸的量、提高总的油含量或选择性地提高所期望的脂肪酸的含量的有益效果(例如，国际申请公布WO2004/087902、WO 2006/069936、WO2006/052870、WO 2009/001315、WO2009/014140)。
[0016] 尽管有上述的工作，至今还没有人研究过在经过基因工程改造的含油生物中LPAAT和LPCAT在针对EDA和ETA以外的LC-PUFA(例如二十碳五烯酸[“EPA”；顺式-5，8，11，14，17-二十碳五烯酸]和/或二十二碳六烯酸[“DHA”；顺式-4，7，10，13，16，19-二十二碳六烯酸])的高水平生产和针对没有外源供给脂肪酸时改善的C18-C20延伸转化效率和/或改善的Δ4去饱和转化效率的效应。
[0017] 发明概述
[0018] 在一个实施方案中，本发明涉及用于提高至少一种长链多不饱和脂肪酸的生产的含油重组微生物宿主细胞，所述宿主细胞包含至少一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸编码具有至少酰基-辅酶A：溶血磷脂酰基转移酶活性的多肽，其中所述多肽选自：
[0019] (i)基于Clustal W比对方法，在与选自SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：11的氨基酸序列进行比较时，具有至少45％的氨基酸同一性的多肽；
[0020] (ii)具有至少一种膜结合O-酰基转移酶蛋白质家族基序的多肽，其中所述基序选自：SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：28；
[0021] (iii)基于Clustal W比对方法，在与如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列进行比较时，具有至少90％的氨基酸同一性的多肽；
[0022] (iv)基于Clustal W比对方法，在与选自SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18的氨基酸序列进行比较时，具有至少43.9％的氨基酸同一性的多肽；和
[0023] (v)具有至少一种1-酰基-sn-甘油-3-磷酸酰基转移酶家族基序的多肽，其中所述基序选自：SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：20；
[0024] 其中所述编码具有至少酰基辅酶A：溶血磷脂酰基转移酶活性的多肽的至少一种分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸可操作地连接到至少一种调控序列，所述调控序列是相同的或不同的，并且，
[0025] 进一步地，其中所述宿主细胞具有至少一种改善，所述改善选自：
[0026] a)与对照宿主细胞相比，在生产至少一种长链多不饱和脂肪酸的含油微生物宿主细胞中C18-C20延伸转化效率的提高；
[0027] b)与对照宿主细胞相比，在生产至少一种长链多不饱和脂肪酸的含油微生物宿主细胞中Δ4去饱和转化效率的提高。
[0028] 所述含油重组微生物宿主细胞可以是酵母，优选地为解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)。
[0029] 在第二个实施方案中，本发明涉及用于提高至少一种长链多不饱和脂肪酸的生产的含油重组微生物宿主细胞，其中所述长链多不饱和脂肪酸可以选自：二十碳二烯酸、二高-γ-亚麻酸、花生四烯酸、二十碳三烯酸、二十碳四烯酸、二十碳五烯酸、二十二碳四烯酸、ω-6二十二碳五烯酸、ω-3二十二碳五烯酸和二十二碳六烯酸。
[0030] 在第三个实施方案中，本发明涉及用于提高至少一种长链多不饱和脂肪酸的生产的含油重组微生物宿主细胞，其中编码具有至少酰基-辅酶A：溶血磷脂酰基转移酶活性的多肽的多核苷酸被稳定地整合；并且，进一步地，其中所述宿主细胞具有至少一种选自以下改善：
[0031] a)与对照宿主细胞相比，在生产至少一种长链多不饱和脂肪酸的含油微生物宿主细胞中C18-C20延伸转化效率至少4％的提高；和
[0032] b)与对照宿主细胞相比，在生产至少一种长链多不饱和脂肪酸的含油微生物宿主细胞中Δ4去饱和转化效率至少5％的提高。
[0033] 在第四个实施方案中，在至少一种长链多不饱和脂肪酸的生产的改善可以选自：
[0034] a)与对照宿主细胞相比，在生产二十碳五烯酸的宿主细胞中C18-C20延伸转化效率至少13％的提高；
[0035] b)与对照宿主细胞相比，在生产二十二碳六烯酸的宿主细胞中C18-C20延伸转化效率至少4％的提高；
[0036] c)与对照宿主细胞相比，在生产二十二碳六烯酸的宿主细胞中Δ4去饱和转化效率至少18％的提高；
[0037] d)与对照宿主细胞相比，在生产二十碳五烯酸的宿主细胞中，以总脂肪酸的重量百分比测量的至少9％重量的二十碳五烯酸的提高；
[0038] e)与对照宿主细胞相比，在生产二十二碳六烯酸的宿主细胞中，以总脂肪酸的重量百分比测量的至少2％重量的二十碳五烯酸的提高；和
[0039] f)与对照宿主细胞相比，在生产二十二碳六烯酸的宿主细胞中，以总脂肪酸的重量百分比测量的至少9％重量的二十二碳六烯酸的提高。
[0040] 在第五个实施方案中，本发明涉及包含二十碳五烯酸和/或二十二碳六烯酸的油，所述油从本发明的含油重组微生物宿主细胞获得。
[0041] 在第六个实施方案中，本发明涉及用于制备包含二十碳五烯酸和/或二十二碳六烯酸的油的方法，所述方法包括：
[0043] b)任选地回收步骤(a)的微生物油。
[0044] 在第七个实施方案中，本发明涉及用于在生产长链多不饱和脂肪酸的含油重组微生物宿主细胞中提高C18-C20延伸转化效率的方法，所述方法包括：
[0045] a)向所述生产长链多不饱和脂肪酸的重组宿主细胞中导入至少一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸编码具有至少酰基辅酶A：溶血磷脂酰基转移酶活性的多肽，其中所述多肽选自：
[0046] (i)基于Clustal W比对方法，在与选自SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：11的氨基酸序列进行比较时，具有至少45％的氨基酸同一性的多肽；
[0047] (ii)具有至少一种膜结合O-酰基转移酶蛋白质家族基序的多肽，其中所述基序选自：SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：28；
[0048] (iii)基于Clustal W比对方法，在与如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列进行比较时，具有至少90％的氨基酸同一性的多肽；
[0049] (iv)基于Clustal W比对方法，在与选自SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18的氨基酸序列进行比较时，具有至少43.9％的氨基酸同一性的多肽；和
[0050] (v)具有至少一种1-酰基-sn-甘油-3-磷酸酰基转移酶蛋白质家族基序的多肽，其中所述基序选自：SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：20；
[0051] 其中所述编码具有至少酰基辅酶A：溶血磷脂酰基转移酶活性的多肽的至少一种分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸可操作地连接到至少一种调控序列，所述调控序列是相同的或不同的；和，
[0052] b)使所述含油微生物宿主细胞生长；
[0053] 其中所述含油微生物宿主细胞的C18-C20延伸转化效率相对于对照宿主细胞是提高的。
[0054] 在第八个实施方案中，本发明涉及本发明的方法，其中：
[0055] a)所述编码具有至少酰基辅酶A：溶血磷脂酰基转移酶活性的多肽的多核苷酸被稳定地整合；并且，
[0056] b)与对照宿主细胞相比，在生产二十碳五烯酸的宿主细胞中C18-C20延伸转化效率的提高为至少13％并且/或者与对照宿主细胞相比，
[0057] 生产二十二碳六烯酸的宿主细胞中C18-C20延伸转化效率的提高为至少4％。
[0058] 在第九个实施方案中，本发明涉及用于在生产长链多不饱和脂肪酸的含油重组微生物宿主细胞中提高Δ4去饱和转化效率的方法，所述方法包括：
[0059] a)向所述生产长链多不饱和脂肪酸的重组宿主细胞中导入至少一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸编码具有至少酰基辅酶A：溶血磷脂酰基转移酶活性的多肽，其中所述多肽选自：
[0060] (i)基于Clustal W比对方法，在与选自SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：11的氨基酸序列进行比较时，具有至少45％的氨基酸同一性的多肽；
[0061] (ii)具有至少一种膜结合O-酰基转移酶蛋白质家族基序的多肽，其中所述基序选自：SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：28；
[0062] (iii)基于Clustal W比对方法，在与如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列进行比较时，具有至少90％的氨基酸同一性的多肽；
[0063] (iv)基于Clustal W比对方法，在与选自SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18的氨基酸序列进行比较时，具有至少43.9％的氨基酸同一性的多肽；和
[0064] (v)具有至少一种1-酰基-sn-甘油-3-磷酸酰基转移酶蛋白质家族基序的多肽，其中所述基序选自：SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：20；
[0065] 其中所述编码具有至少酰基辅酶A：溶血磷脂酰基转移酶活性的多肽的至少一种分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸可操作地连接到至少一种调控序列，所述调控序列是相同的或不同的，和，
[0066] b)使所述含油微生物宿主细胞生长；
[0067] 其中所述含油微生物宿主细胞的Δ4去饱和转化效率相对于对照宿主细胞是提高的。
[0068] 在第十个实施方案中，本发明涉及用于在生产长链多不饱和脂肪酸的含油重组微生物宿主细胞中提高Δ4去饱和转化效率的方法，其中：
[0069] a)所述编码具有至少酰基辅酶A：溶血磷脂酰基转移酶活性的多肽的多核苷酸被稳定地整合；并且，
[0070] b)与对照宿主细胞相比，Δ4去饱和转化效率的提高为至少18％。
[0071] 生物保藏
[0072] 下列生物材料保藏于美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)(ATCC)(10801 University Boulevard，Manassas，VA 20110-2209)，并具有下列名称、保藏号和保藏日期。
[0073]
[0074]
[0075] 上面列出的生物材料将按照国际承认的用于专利程序目的的微生物保藏的布达佩斯条约的有关条款来保存。所列出的保藏物将会被保持在指定的国际保藏机构中至少30年，并且一旦准予专利公开它就将会对公众开放。在由政府行为授予的专利权的部分废除中，保藏物的可用性不会构成实践主题发明的许可。
[0077] 图1A和图1B示出了ω-3/ω-6脂肪酸生物合成途径，并且当考虑下文对该途径的描述时应被视为一起。
[0078] 图2图示了解脂耶氏酵母菌株Y8406的培养，该菌株生产大于51.2EPA％TFA(总脂肪酸)。
[0079] 图3提供了pY116的质粒图谱。
[0080] 图4提供了下列质粒的图谱：(A)pZKSL-5S5A5；和，(B)pZP3-Pa777U。
[0081] 图5提供了下列质粒的图谱：(A)pZKUM；和，(B)pZKL2-5mB89C。
[0082] 图6提供了下列质粒的图谱：(A)pZKL1-2SR9G85；和，(B)pZSCP-Ma83。
[0083] 图7图示了解脂耶氏酵母菌株Y5037的开发，该菌株生产18.6EPA％TFA、22.8DPA％TFA和9.7DHA％TFA。
[0084] 图8提供了下列质粒的图谱：(A)pZKL4-220EA41B；和，(B)pZKL3-4GER44。
[0085] 图9提供了pZKLY-G20444的质粒图谱。
[0086] 图10提供了下列质粒的图谱：(A)pY201，包含嵌合的YAT1::ScAle1S::Lip1基因；和，(B)pY168，包含嵌合的YAT1::YlAle1::Lip1基因。
[0087] 图11提供了下列质粒的图谱：(A)pY208，包含嵌合的YAT1::MaLPAAT1S::Lip1基因；和，(B)pY207，包含嵌合的YAT1::YlLPAAT1::Lip1基因。
[0088] 图12提供了下列质粒的图谱：(A)pY175，包含嵌合的YAT1::CeLPCATS::Lip1基因；和，(B)pY153，包含嵌合的FBAIN::CeLPCATS::YlLPAAT1基因。
[0089] 图13提供了下列质粒的图谱：(A)pY222，包含嵌合的YAT1::ScLPAATS::Lip1基因；和(B)pY177，包含嵌合的YAT1::YlLPAAT1::Lip1基因。
[0090] 根据下面的详细描述和附带的序列描述可以更充分地理解本发明，下面的详细描述和附带的序列描述形成了本申请的一部分。
[0091] 下面的序列遵循37C.F.R.§1.821-1.825(“对含有核酸序列和/或氨基酸序列公开的专利申请的要求—序列规则”(“Requirements for Patent Applications Containing Nuceotide Sequences and/or Amino Acid Sequence Disclosures-the Sequence Rules”))，并且符合世界知识产权组织(World Intellectual Property Organization)(WIPO)ST.25标准(1998)以及EPO和PCT的序列表要求(规则5.2和49.5(a-bis)以及行政指令(Administrative Instructions)的208节和附录C)。用于核苷酸和氨基酸序列数据的符号和格式遵循在37C.F.R.§1.822中所列出的规定。
[0092] SEQ ID NO：1-101为编码启动子、基因或蛋白质(或它们的片段)或质粒的ORF，如表2中所述。
[0094]
[0095]
[0096]
[0097]
[0098]
[0099] 发明详述
[0100] 本文描述的是，基于具有LPLAT活性的多肽(例如Ale1、LPAAT、和LPCAT)的表达，用于在生产长链多不饱和脂肪酸[“LC-PUFA”]的含油重组微生物宿主细胞中提高C18-C20延伸转化效率和/或Δ4去饱和转化效率的方法。通过提高C18-C20延伸和/或Δ4去饱和的转化效率，以总脂肪酸的％重量计的LC-PUFA二十碳五烯酸[“EPA”；顺式-5，8，11，14，17-二十碳五烯酸]和/或二十二碳六烯酸[“DHA”；顺式-4，7，10，13，16，19-二十二碳六烯酸]的浓度提高。
[0101] PUFA如EPA和DHA(或其衍生物)可用作膳食替代品或补充剂，尤其是婴儿代乳品，用于接受静脉内营养法的患者或用来预防或治疗营养不良。作为另外一种选择，可以将纯化的PUFA(或其衍生物)掺入食用油、脂肪或调配的人造黄油中，以便食用者在正常使用中将获得所需量的膳食补充。PUFA还可被掺入婴儿代乳品、营养补充剂或其他食品和饮料产品中，并可被用作心血管保护剂、抗抑郁剂、抗炎剂或降胆固醇剂。任选地，该组合物可以用于药用(人药或兽药)。
[0102] 本文所引用的所有专利、专利申请和出版物均以引用的方式全文并入本文。
[0103] 在本公开中，使用了大量的术语和缩写。给出了如下定义。
[0104] “开放阅读框”缩写为ORF。
[0105] “聚合酶链反应”缩写为“PCR”。
[0106] “美国典型培养物保藏中心”缩写为“ATCC”。
[0107] “多不饱和脂肪酸”缩写为“PUFA”。
[0108] “二酰基甘油酰基转移酶”缩写为“DAG AT”或“DGAT”。
[0109] “三酰基甘油”缩写为“TAG”。
[0110] “辅酶A”缩写为“CoA”。
[0111] “总脂肪酸”缩写为“TFA”。
[0113] “细胞干重”缩写为“DCW”。
[0114] “长链多不饱和脂肪酸”缩写为“LC-PUFA”。
[0115] “酰基-辅酶A：溶血磷脂酰基转移酶”或“溶血磷脂酰基转移酶”缩写为“LPLAT”。
[0117] 术语“甘油磷脂”是指一大类分子，它们具有甘油核心，在甘油核心的sn-1位和sn-2位有脂肪酸，并且极性的头基(例如，磷酸酯、胆碱、胆胺、甘油、肌醇基、丝氨酸、心磷脂)通过磷酸二酯键连接到sn-3位。因此，甘油磷脂包括磷脂酰胆碱[“PC”]、磷酸酰乙醇胺[“PE”]、磷脂酰甘油[“PG”]、磷脂酰肌醇[“PI”]、磷脂酰丝氨酸[“PS”]和心磷脂[“CL”]。
[0118] “溶血磷脂”通过sn-2位脂肪酸的脱酰反应而衍生自甘油磷脂。溶血磷脂包括，例如，溶血磷脂酸[“LPA”]、溶血磷脂酰胆碱[“LPC”]、溶血磷脂酰乙醇胺[“LPE”]、溶血磷脂酰丝氨酸[“LPS”]、溶血磷脂酰甘油[“LPG”]和溶血磷脂酰肌醇[“LPI”]。
[0119] 术语“酰基转移酶”是指负责将酰基基团从供体脂质转移至受体脂质分子的酶。
[0120] 术语“酰基-辅酶A：溶血磷脂酰基转移酶”或“溶血磷脂酰基转移酶”[“LPLAT”]是指具有使多种溶血磷脂底物在sn-2位酰化的能力的一大类酰基转移酶。更具体地讲，LPLAT包括具有催化LPA至PA的转化的能力的LPA酰基转移酶[“LPAAT”]，具有催化LPC至PC的转化的能力的LPC酰基转移酶[“LPCAT”]，具有催化LPE至PE的转化的能力的LPE酰基转移酶[“LPEAT”]，具有催化LPS至PS的转化的能力的LPS酰基转移酶[“LPSAT”]，具有催化LPG至PG的转化的能力的LPG酰基转移酶[“LPGAT”]，和具有催化LPI至PI的转化的能力的LPI酰基转移酶[“LPIAT”]。LPLAT命名的标准化还未被正式化，因此多种其他的命名也在本领域中被使用(例如，LPAAT也被称为酰基-辅酶A：1-酰基-sn-甘油-3-磷酸2-O-酰基转移酶、1-酰基-sn-甘油-3-磷酸酰基转移酶和/或1-酰基甘油磷酸酰基转移酶[“AGPAT”]，而LPCAT经常被称为酰基-辅酶A：1-酰基溶血磷脂酰胆碱酰基转移酶)。此外，值得注意的是，一些LPLAT如啤酒糖酵母Ale1(ORF YOR175C；SEQ ID NO：9)，具有广泛的特异性，因此单种酶可能够催化若干种LPLAT反应，包括LPAAT、LPCAT和LPEAT反应(Tamaki，H.等人，J.Biol.Chem.，282：34288-34298(2007)； U.等人，FEBS Letters，582：305-309(2008)；Chen，Q.等人，FEBS Letters，581：5511-5516(2007)；Benghezal，M.等 人，J.Biol.Chem.，282：30845-30855(2007)；Riekhof，等 人，J.Biol.Chem.，282：28344-28352(2007))。
[0121] 更具体地讲，术语“具有至少溶血磷脂酰胆碱酰基转移酶[“LPCAT”]活性的多肽”将指那些能够催化下列反应的酶：酰基-辅酶A+1-酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱＝辅酶A+1，2-二酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(EC 2.3.1.23)。LPCAT活性已被描述于两个结构上不同的蛋白质家族中，即LPAAT蛋白质家族(Hishikawa，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，105：2830-2835(2008)；国际申请公布WO 2004/076617)和ALE1蛋白质家族(Tamaki，H.等人，参见上文； U.等人，参见上文；Chen，Q.等人，参见上文；Benghezal，M.等人，参见上文；Riekhof，等人，参见上文)。
[0122] 术语“LPCAT”是指满足下列的ALE1蛋白质家族的蛋白质：1)具有LPCAT活性(EC2.3.1.23)并且基于Clustal W比对方法，在与选自SEQ ID NO：9(ScAle1)和SEQ ID NO：
11(YlAle1)的氨基酸序列进行比较时，具有至少约45％的氨基酸同一性；和/或，2)具有LPCAT活性(EC 2.3.1.23)并且具有至少一种膜结合O-酰基转移酶[“MBOAT”]蛋白质家族基序，所述基序选自M(V/I)LxxKL(SEQ ID NO：3)、RxKYYxxW(SEQ ID NO：4)、SAxWHG(SEQ ID NO：5)和EX11WNX2-[T/V]-X2W(SEQ ID NO：28)。ALE1多肽的实例包括ScAle1和YlAle1。
11(YlAle1)的氨基酸序列进行比较时，具有至少约45％的氨基酸同一性；和/或，2)具有LPCAT活性(EC 2.3.1.23)并且具有至少一种膜结合O-酰基转移酶[“MBOAT”]蛋白质家族基序，所述基序选自M(V/I)LxxKL(SEQ ID NO：3)、RxKYYxxW(SEQ ID NO：4)、SAxWHG(SEQ ID NO：5)和EX11WNX2-[T/V]-X2W(SEQ ID NO：28)。ALE1多肽的实例包括ScAle1和YlAle1。
[0123] 术语“ScAle1”是指从啤酒糖酵母(ORF“YOR175C”)分离的LPCAT(SEQ ID NO：9)，其被如SEQ ID NO：8所示的核苷酸序列编码。与此相对，术语“ScAle1S”是指来源于啤酒糖酵母的合成的LPCAT，其经密码子优化以在解脂耶氏酵母中表达(即，SEQ ID NO：12和13)。
[0124] 术语“YlAle1”是指从解脂耶氏酵母分离的LPCAT(SEQ ID NO：11)，其被如SEQ ID NO：10所示的核苷酸序列编码。
[0125] 术语“LPCAT”还指具有LPCAT活性(EC 2.3.1.23)，并且基于Clustal W比对方法，在与如SEQ ID NO：2(CeLPCAT)所示的氨基酸序列进行比较时，具有至少约90％的氨基酸同一性的蛋白质。
[0126] 术语“CeLPCAT”是指从秀丽隐杆线虫分离的LPCAT酶(SEQ ID NO：2)，其被如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列编码。与此相对，术语“CeLPCATS”是指来源于秀丽隐杆线虫的合成LPCAT，其经密码子优化以在解脂耶氏酵母中表达(即，SEQ ID NO：6和7)。
[0127] 术语“具有至少溶血磷脂酸酰基转移酶[“LPAAT”]活性的多肽”将指那些能够催化下列反应的酶：酰基-辅酶A+1-酰基-sn-甘油3-磷酸＝辅酶A+1，2-二酰基-sn-甘油3-磷酸(EC 2.3.1.51)。
[0128] 术语“LPAAT”是指满足下列的蛋白质：1)具有LPAAT活性，并且基于Clustal W比对方法，在与选自SEQ ID NO：15(MaLPAAT1)、SEQ ID NO：17(YlLPAAT1)和SEQ ID NO：18(ScLPAAT1)的氨基酸序列进行比较时，具有至少约43.9％的氨基酸同一性；和/或，2)具有LPAAT活性并且具有至少一种1-酰基-sn-甘油-3-磷酸酰基转移酶家族基序，所述基序选自：NHxxxxD(SEQ ID NO：19)和EGTR(SEQ ID NO：20)。LPAAT多肽的实例包括ScLPAAT、MaLPAAT1和YlLPAAT1。
[0129] 术语“ScLPAAT”是指从啤酒糖酵母(ORF“YDL052C”)分离的LPAAT(SEQ ID NO：18)。
[0130] 术语“MaLPAAT1”是指从高山被孢霉分离的LPAAT(SEQ ID NO：15)，其被如SEQ ID NO：14所示的核苷酸序列编码。与此相对，术语“MaLPAAT1S”是指来源于高山被孢霉的合成的LPAAT，其经密码子优化以在解脂耶氏酵母中表达(即，SEQ ID NO：21和22)。
[0131] 术语“YlLPAAT1”是指从解脂耶氏酵母分离的LPAAT(SEQ ID NO：17)，其被如SEQ ID NO：16所示的核苷酸序列编码。
[0132] 术语“直系同源物”是指如通过在系统发育树分析中处于一个进化枝上和催化相同的酶反应显示的，从共同的祖先蛋白质进化而来的来自不同物种的同源蛋白质。
[0133] 术语“保守结构域”或“基序”意指进化上相关的蛋白质的比对序列中在特定位置处保守的一组氨基酸。虽然同源蛋白质之间在其他位置的氨基酸可以发生变化，但在特定位置高度保守的氨基酸很可能意味着其为对蛋白质的结构、稳定性或活性来说是必需的氨基酸。因为它们可通过它们在蛋白质同系物家族的比对序列中的高度保守来鉴定，所以它们可用作识别标签或“签名”来确定具有新的测定序列的蛋白质是否属于以前鉴定的蛋白质家族。
[0134] 术语“油脂”是指在25℃时为液体且通常为多不饱和的脂类物质。在含油生物中，油脂构成了总脂质的主要部分。“油脂”主要由三酰基甘油[“TAG”]组成，但还可包含其他中性脂质、磷脂和游离脂肪酸。油中的脂肪酸组合物和总脂质的脂肪酸组合物一般来讲是相似的；因此，总脂质中的PUFA浓度的提高或降低将对应于油中的PUFA浓度的提高或降低，反之亦然。
[0135] “中性脂质”指那些一般作为贮存脂肪存在于细胞中的脂质体中的脂质，它们之所以被称为“中性脂质”，是因为在细胞的pH下，所述脂质无带电基团。它们一般是完全非极性的，对水无亲和力。中性脂质一般指脂肪酸的甘油单酯、二酯、和/或三酯，也分别称为单酰基甘油、二酰基甘油或三酰基甘油，或统称为酰基甘油。为了从酰基甘油中释放游离脂肪酸，必须发生水解反应。
[0136] 术语“三酰基甘油”[“TAG”]是指由三个脂肪酰残基酯化一个甘油分子组成的中性脂质。TAG可包含LC-PUFA和饱和脂肪酸，以及较短的饱和的和不饱和的脂肪酸。
[0137] 本文所用术语“总脂肪酸”[“TFA”]是指所有细胞脂肪酸的总量，所述脂肪酸在给定样品中能通过碱酯交换方法(如本领域所已知的)被衍生为脂肪酸甲酯[“FAME”]，所述样品可以是例如生物质或油脂。因此，总脂肪酸包括来自中性脂类级分(包括二酰基甘油、单酰基甘油和TAG)的脂肪酸和来自极性脂质级分(包括PC和PE级分)的脂肪酸，但不包括游离脂肪酸。
[0138] 术语细胞的“总脂质含量”是TFA的量度，以干细胞重量[“DCW”]的百分比的形式表示，不过总脂质含量可近似地以FAME占DCW的百分比[“FAME％DCW”]量度。因此，总脂质含量[“TFA％DCW”]等于，例如，每100毫克DCW的脂肪酸毫克数。
[0139] 本文将总脂质中的脂肪酸浓度表示为TFA％重量[“％TFA”]，例如每100毫克TFA的给定脂肪酸毫克数。除非本文公开中另外具体声明，给定脂肪酸对总脂质的百分比等同于以％TFA表示的脂肪酸浓度(例如总脂质的％EPA等同于EPA％TFA)。
[0140] 在一些情况下，将给定的脂肪酸在细胞中的含量表示为其占干细胞重量的％重量[“％DCW”]是有用的。如此，例如，将根据下式测定EPA％DCW：(EPA％TFA)*(TFA％DCW)]/100。然而，以给定的脂肪酸占干细胞重量的％重量[“％DCW”]表示的给定的脂肪酸在细胞中的含量可以近似计算为：(EPA％TFA)*(FAME％DCW)]/100。
[0141] 术语“脂质谱”和“脂质组成”是可互换的，并且指在特定脂质级分中，例如在总脂质或油脂中，包含的各种脂肪酸各自的量，其中所述量以TFA的％重量形式表示混合物中存在的各个脂肪酸的总量应当是100。
[0142] 术语“脂肪酸”指不同链长的长链脂族酸(链烷酸)，链长为约C12-C22(尽管更长和更短链长的酸都是已知的)。主要的链长介于C16和C22之间。脂肪酸的结构可用简单的记号系统“X:Y”来表示，其中X表示具体脂肪酸中碳(“C”)原子的总数，而Y表示双键的数目。另外的关于“饱和脂肪酸”对“不饱和脂肪酸”、“单不饱和脂肪酸”对“多不饱和脂肪酸”(“PUFA”)、以及“ω-6脂肪酸”(ω-6或n-6)对“ω-3脂肪酸”(ω-3或n-3)之间的区别的详细信息在美国专利7,238,482中有所提供，该专利以引用方式并入本文。
[0143] 表3提供了用于描述本文PUFA的命名。在标题为“简化符号”一栏中，ω-指代系统用于表明碳数目、双键的数目和最接近ω碳的双键位置，双键位置的计数从ω碳开始(为此ω碳的编号为1)。该表的其余部分汇总了ω-3和ω-6脂肪酸以及它们的前体的通用名、将在整个说明书中使用的缩写以及每种化合物的化学名。
[0144] 表3：多不饱和脂肪酸及前体的命名法
[0145]
[0146]
[0147] 术语“长链多不饱和脂肪酸”[“LC-PUFA”]是指具有C20或更大的链长的那些PUFA。因此，术语LC-PUFA至少包括EDA、DGLA、ARA、ETrA、ETA、EPA、DTA、DPAn-6、DPA和DHA。
[0148] 代谢途径或生物合成途径在生物化学意义上可认为是发生于细胞内由酶催化的一系列化学反应，以实现细胞待使用的或待贮存的代谢产物的形成，或启动另一代谢途径(称作流量产生步骤)。很多此类途径均很精细，并涉及对起始物质的逐步修饰以使之形成具有期望的精确化学结构的产物。
[0149] 术语“PUFA生物合成途径”是指将油酸转化成例如LA、EDA、GLA、DGLA、ARA、DRA、DTA和DPAn-6的ω-6脂肪酸和例如ALA、STA、ETrA、ETA、EPA、DPA和DHA的ω-3脂肪酸的代谢过程。该过程在文献中已有很好的描述(如参见国际申请公布WO 2006/052870)。简而言之，该过程涉及通过添加碳原子来延伸碳链和通过加入双键来使分子去饱和，这通过存在于内质网膜内的一系列特异性去饱和酶和延伸酶(称为“PUFA生物合成途径酶”)进行。更具体地讲，“PUFA生物合成途径酶”指与PUFA生物合成相关联的任何以下酶(以及编码所述酶的基因)，包括：Δ4去饱和酶、Δ5去饱和酶、Δ6去饱和酶、Δ12去饱和酶、Δ15去饱和酶、Δ17去饱和酶、Δ9去饱和酶、Δ8去饱和酶、Δ9延伸酶、C14/16延伸酶、C16/18延伸酶、C18/20延伸酶和/或C20/22延伸酶。
[0150] 术语“去饱和酶”指可以在一种或多种脂肪酸中去饱和(即引入双键)而产生所关注的脂肪酸或前体的多肽。尽管在整个说明书中使用ω-指代系统来指代特定的脂肪酸，但使用Δ-系统从底物的羧基端计数来表示去饱和酶的活性更方便。本文尤其关注的是：Δ8去饱和酶；Δ5去饱和酶；Δ17去饱和酶；Δ12去饱和酶；Δ15去饱和酶；Δ9去饱和酶；Δ6去饱和酶；和Δ4去饱和酶。Δ17去饱和酶，以及Δ15去饱和酶，基于它们将ω-6脂肪酸转化为它们的ω-3对应物的能力，有时也被称为“omega-3去饱和酶”、“w-3去饱和酶”和/或“ω-3去饱和酶”。
[0151] 术语“延伸酶”指能延伸脂肪酸碳链从而产生比该延伸酶作用于其上的脂肪酸底物长2个碳原子的酸的多肽。该延伸过程在与脂肪酸合酶相关的多步骤机制中发生，如国际申请公布WO 2005/047480中所述。延伸酶体系催化的反应的实例如GLA至DGLA、STA至ETA、ARA至DTA以及EPA至DPA的转化。一般来讲，延伸酶的底物选择性有些广泛，但由链长度和不饱和的程度及类型两者来区分。例如，C14/16延伸酶将会利用C14底物(如肉豆蔻酸)，C16/18延伸酶将会利用C16底物(如棕榈酸)，C18/20延伸酶将会利用C18底物(如LA、ALA、GLA、STA)，而C20/22延伸酶(也被称为C20延伸酶或Δ5延伸酶，这些术语可互换使用)将会利用C20底物(如ARA、EPA)。就本文目的而言，能够确定两种不同类型的C18/20延伸酶：Δ6延伸酶将催化GLA和STA分别向DGLA和ETA的转化，而Δ9延伸酶能够催化LA和ALA分别向EDA和ETrA的转化。
[0152] 术语“转化效率”和“底物转化百分比”是指特定酶(如去饱和酶或延伸酶)能够将底物转化成产物的效率。转化效率根据下式测量：([产物]/[底物+产物])*100，其中‘产物’包括直接产物和在该途径中衍生自它的所有产物。
[0153] 术语“C18-C20延伸转化效率”是指C18//20延伸酶能够将C18底物(即LA、ALA、GLA、STA)转化为C20产物(即EDA、ETrA、DGLA、ETA)的效率。这些C18//20延伸酶可以是Δ9延伸酶或是Δ6延伸酶。
[0154] 术语“Δ9延伸转化效率”和“Δ9延伸酶转化效率”是指Δ9延伸酶能够将C18底物(即LA、ALA)转化为C20产物(即EDA、ETrA)的效率。
[0155] 术语“Δ4去饱和转化效率”和“Δ4去饱和酶转化效率”是指Δ4去饱和酶能够将底物(即DTA、DPAn-3)转化为产物(即DPAn-6、DHA)的效率。
[0156] 术语“含油”是指倾向于以油的形式贮存它们的能源的那些生物(Weete，Fungal Lipid Biochemistry，第2版，Plenum，1980)。一般来讲，含油微生物的细胞油脂含量符合S形曲线，其中脂质浓度提高直至在对数生长期晚期或稳定生长期早期达到最高浓度，随后在稳定生长期晚期和死亡期逐渐下降(Yongrmanitchai和Ward，Appl.Environ.Microbiol.，57：419-25(1991))。含油微生物积累油超过它们的干细胞重量的约25％的情形并不鲜见。含油微生物包括多种细菌、藻类、类眼虫、苔藓、真菌(例如被孢霉属)、酵母和原生藻菌(stramenopiles)(例如裂殖壶菌属)。
[0157] 术语“含油酵母”指那些能够产油并被归类为酵母的微生物。含油酵母的实例包括但不限于以下属：耶氏酵母属、假丝酵母属、红酵母属、红冬孢酵母属、隐球酵母属、丝孢酵母属和油脂酵母属。
[0158] 术语“可发酵的碳源”指微生物将其代谢以获取能量的碳源。典型的碳源包括但不限于：单糖、二糖、低聚糖、多糖、烷烃、脂肪酸、脂肪酸的酯、甘油、单酸甘油酯、甘油二酯、甘油三酯、二氧化碳、甲醇、甲醛、甲酸盐和含碳胺类。
[0159] 如本文所用，术语“生物质”具体地讲是指耗费的或使用的细胞物质，其来自以商业上有意义的量生产PUFA的重组生产宿主的发酵，其中优选的生产宿主是耶氏酵母属的含油酵母的重组菌株。生物质可以是以下形式：全细胞、全细胞溶解产物、匀化细胞、部分水解细胞物质、和/或部分纯化细胞物质(例如微生物产生的油)。
[0160] 术语“多核苷酸”、“核苷酸序列”、“核酸序列”、“核酸片段”和“分离的核酸片段”本文可互换使用。这些术语涵盖核苷酸序列等的范围。多核苷酸可以是RNA或DNA的聚合物，它们可以是单链或双链，任选含有合成的、非天然的或改变的核苷酸碱基。DNA聚合物形式的多核苷酸可由cDNA、基因组DNA、合成DNA或它们的混合物的一个或多个片段构成。核苷酸(通常以它们的5’-单磷酸形式存在)通过单字母命名指代如下：“A”指腺苷酸或脱氧腺苷酸(分别用于RNA或DNA)，“C”指胞苷酸或脱氧胞苷酸，“G”指鸟苷酸或脱氧鸟苷酸，“U”指尿苷酸，“T”指脱氧胸苷酸，“R”指嘌呤(A或G)，“Y”指嘧啶(C或T)，“K”指G或T，“H”指A或C或T，“I”指肌苷，“N”指任何核苷酸。
[0161] 如本文所用，当在合适的温度和溶液离子强度条件下单链形式的核酸片段可以退火至另一核酸片段时，核酸片段“可杂交”至另一核酸片段，例如cDNA、基因组DNA或RNA分子。杂交条件和洗涤条件是众所周知的，并例示于Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第二版，ColdSpring Harbor Laboratory：Cold Spring Harbor，NY(1989)，该文献以引用方式并入本文，尤其是其中的第11章和表11.1。
[0162] 氨基酸或核苷酸序列的“基本部分”指这样的部分，该部分包含的多肽的氨基酸序列或基因的核苷酸序列足以通过推定鉴定所述多肽或基因，所述鉴定或可由本领域技术人员通过对所述序列的人工评估进行，或可利用诸如BLAST(Basic Local Alignment Search Tool；Altschul，S.F.等人，J.Mol.Biol.，215：403-410(1993))。一般来讲，为了推测鉴定多肽或核酸序列是否与已知的蛋白质或基因同源，需要有10个或更多邻接氨基酸的序列或30个或更多核苷酸的序列。此外，对于核苷酸序列，包含20-30个连续核苷酸的基因特异性寡核苷酸探针可用于序列依赖性的基因鉴定(例如Southern杂交)和基因分离(如细菌菌落或噬菌斑的原位杂交)的方法中。此外，12至15个碱基的短寡核苷酸可在PCR中用作扩增引物，以便获得包含该引物的特定核酸片段。因此，核苷酸序列的“基本部分”所包含的序列应足以特异性地鉴定和/或分离包含该序列的核酸片段。
[0163] 术语“互补的”用于描述核苷酸碱基之间能够彼此杂交的关系。例如，对于DNA，腺嘌呤与胸腺嘧啶互补，而胞嘧啶与鸟嘌呤互补。
[0164] 如本文所用，术语“同源”和“同源的”可互换使用。它们指这样的核酸片段，即其中一个或多个核苷酸碱基改变并不会影响该核酸片段介导基因表达或产生某种表型的能力。这些术语也指核酸片段的修饰，例如缺失或插入一个或多个核苷酸，相对于初始的未经修饰的核酸片段，所述修饰基本上不会改变所得核酸片段的功能特性。
[0165] 此外，技术人员认识到，同源核酸序列也通过它们在中等严格条件(如0.5X×SSC，0.1％SDS，60℃)下，与本文所例示的序列杂交的能力，或杂交至本文公开的核苷酸序列和与其功能相当的序列的任何部分的能力而被限定。可调节严格性条件以筛选中度相似的片段(例如来自远缘生物体的同源序列)，到筛选高度相似的片段(例如从近缘生物复制功能性酶的基因)。杂交后的洗涤确定严格性条件。核酸杂交的广泛指南存在于Tijssen，Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic Acid Probes，Part I，Chapter 2“Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays”，Elsevier，New York(1993)；以及Current Protocols in Molecular Biology，Chapter 2，Ausubel等人编辑，Greene Publishing and Wiley-Interscience，New York(1995)中。
[0166] 如本文所用，术语“同一性百分比”指两个或更多个多肽序列或两个或更多个多核苷酸序列之间的关系，它通过序列比较进行测定。“百分比”也指多肽或多核苷酸序列间的序列关联程度，根据具体情况，通过比较序列间的匹配百分比进行测定。可通过已知方法容易地计算“同一性百分比”和“相似性百分比”，包括但不限于在以下文献中描述的那些方法：1)Computational Molecular Biology(Lesk，A.M.编辑)，Oxford University：NY(1988)；2)Biocomputing：Informatics and Genome Projects(Smith，D.W. 编 辑 )，Academic：NY(1993)；3)Computer Analysis of Sequence Data，Part I(Griffin，A.M.和Griffin，H.G.编辑)，Humania：NJ(1994)；4)Sequence Analysis in Molecular Biology(von Heinje，G.，编辑)Academic(1987)；和5)Sequence Analysis Primer(Gribskov，M.和Devereux，J.，编辑)Stockton：NY(1991)。
[0167] 设定确定同一性百分比的优选方法来用于给出待测试序列之间的最佳匹配。用于测定同一性百分比和相似性百分比的方法在公开可获得的计算机程序中进行编辑。序列比对和同一性百分比计算可以用LASERGENE生物信息学计算软件包(LASERGENE TM
bioinformatics computing suite(DNASTAR Inc.，Madison，WI))中的MegAlign 程序进行。序列的多重比对使用“Clustal比对方法”进行，该方法涵盖若干种不同的算法，包括“Clustal V比对方法”和“Clustal W比对方法”(该方法描述于Higgins和Sharp，CABIOS，
5：151-153(1989)；Higgins，D.G.等人，Comput.Appl.Biosci.，8：189-191(1992))并且存TM
在于LASERGENE生物信息学计算软件包(DNASTAR Inc.)的MegAlign 程序(8.0.2版)中。
使用Clustal W比对方法进行的多重蛋白质比对的默认参数是：空位罚分＝10，空位长度罚分＝0.2，延迟分歧序列(Delay Divergent Seqs)(％)＝30，DNA转换权重(Transition Weight)＝0.5，蛋白质权重矩阵＝Gonnet系列，DNA权重矩阵＝IUB，采用“慢速-准确(slow-accurate)”选项。用Clustal程序比对序列后，可通过查看程序中的“序列距离”表来获得“同一性百分比”。
bioinformatics computing suite(DNASTAR Inc.，Madison，WI))中的MegAlign 程序进行。序列的多重比对使用“Clustal比对方法”进行，该方法涵盖若干种不同的算法，包括“Clustal V比对方法”和“Clustal W比对方法”(该方法描述于Higgins和Sharp，CABIOS，
5：151-153(1989)；Higgins，D.G.等人，Comput.Appl.Biosci.，8：189-191(1992))并且存TM
在于LASERGENE生物信息学计算软件包(DNASTAR Inc.)的MegAlign 程序(8.0.2版)中。
使用Clustal W比对方法进行的多重蛋白质比对的默认参数是：空位罚分＝10，空位长度罚分＝0.2，延迟分歧序列(Delay Divergent Seqs)(％)＝30，DNA转换权重(Transition Weight)＝0.5，蛋白质权重矩阵＝Gonnet系列，DNA权重矩阵＝IUB，采用“慢速-准确(slow-accurate)”选项。用Clustal程序比对序列后，可通过查看程序中的“序列距离”表来获得“同一性百分比”。
[0168] 本领域的技术人员非常清楚，多种程度的序列同一性可用于从其他物种中鉴定多肽，其中这类多肽具有相同或相似的功能或活性。同一性百分比的有用实例包括从34％至100％之间的任何整数百分比，例如35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、
44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、
59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、
74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、
89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。该分离的核苷酸片段的任何全长或部分互补的序列也是受关注的。合适的核酸片段不但具有上述同源性，而且通常编码具有至少50个氨基酸，优选至少100个氨基酸，更优选至少150个氨基酸，更优选至少200个氨基酸，最优选至少250个氨基酸的多肽。
44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、
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74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、
89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。该分离的核苷酸片段的任何全长或部分互补的序列也是受关注的。合适的核酸片段不但具有上述同源性，而且通常编码具有至少50个氨基酸，优选至少100个氨基酸，更优选至少150个氨基酸，更优选至少200个氨基酸，最优选至少250个氨基酸的多肽。
[0169] “密码子简并性”是指允许核苷酸序列在不影响所编码多肽的氨基酸序列的情况下发生变化的遗传密码的性质。技术人员非常了解具体宿主细胞在使用核苷酸密码子来确定给定氨基酸时所表现出的“密码子偏倚性”。因此，当合成基因用以改善在宿主细胞中的表达时，希望对基因进行设计，使得其密码子使用频率接近该宿主细胞优选的密码子使用频率。
[0170] “合成基因”可由使用本领域技术人员已知的方法化学合成的寡核苷酸基本单位装配而成。将这些寡核苷酸基本单位进行退火并随后连接以形成基因节段，该基因节段随后在酶促作用下装配而构建成完整的基因。因此，基于最优化核苷酸序列以反映宿主细胞的密码子偏好性，可以定制基因用以最优化基因表达。如果密码子使用偏向于宿主偏好的那些密码子，则技术人员会理解成功的基因表达的可能性。优选的密码子的确定可基于对来源于宿主细胞的基因(其中序列信息可获得)的检测。例如在美国专利公开7,125,672中提供了解脂耶氏酵母的密码子使用谱。
[0171] “基因”指能够表达特定蛋白的核酸片段，并且其可单独指编码区或可包括在编码序列之前(5′非编码序列)和之后(3′非编码序列)的调节序列。“天然基因”指与其自身调节序列一起天然存在的基因。“嵌合基因”指非天然基因的任何基因，包含非天然一起存在的调节序列和编码序列。因此，嵌合基因可包含源自不同来源的调控序列和编码序列，或者源自相同来源、但是排列方式与天然存在的排列方式不同的调控序列和编码序列。“内源基因”是指在生物基因组中的天然位置的天然基因。“外来”基因指通过基因转移导入至宿主生物内的基因。外来基因可包括插入到非天然生物内的天然基因、导入到天然宿主内的新位置的天然基因，或嵌合基因。“转基因”是已通过转化方法导入基因组内的基因。“经密码子最优化的基因”是其密码子使用频率经设计用以模仿宿主细胞优选的密码子使用频率的基因。
[0172] “编码序列”指编码特定氨基酸序列的DNA序列。“合适的调控序列”指位于编码序列上游(5′非编码序列)、中间、或下游(3′非编码序列)并影响相关联的编码序列的转录、RNA加工或稳定性、或翻译的核苷酸序列。调控序列可包括启动子、增强子、沉默子、5′非翻译前导序列(例如在转录起始位点和翻译起始密码子之间的序列)、内含子、多腺苷酸化识别序列、RNA加工位点、效应子结合位点和茎-环结构。
[0173] “启动子”指能够控制编码序列或功能性RNA表达的DNA序列。一般来讲，编码序列位于启动子序列的3′端。启动子可整体源于天然基因，或者由源于天然存在的不同启动子的不同元件构成，或者甚至可包含合成的DNA片段。本领域内的技术人员应当理解，不同的启动子可以在不同的组织或细胞类型中，或者在不同的发育阶段，或者响应不同的环境条件或生理条件而引导基因的表达。导致基因在大部分时间内在大多数细胞类型中表达的启动子通常称为“组成型启动子”。还应当进一步认识到，由于在大多数情况下调控序列的确切边界尚未完全确定，因此不同长度的DNA片段可能具有相同的启动子活性。
[0174] 术语“3′非编码序列”和“转录终止子”指位于编码序列下游的DNA序列。这包括多腺苷酸化识别序列和编码能影响mRNA加工或基因表达的调节信号的其他序列。多腺苷酸化信号通常表征为影响多腺苷酸片添加到mRNA前体的3′末端。3′区可影响相关编码序列的转录、RNA加工或稳定性或翻译。
[0175] “RNA转录物”指由RNA聚合酶催化的DNA序列转录所产生的产物。当RNA转录物与DNA序列拷贝完全互补时，它被称为初级转录物，或者它可以是来源于初级转录物的转录后加工的RNA序列，并被称为成熟的RNA。“信使RNA”或“mRNA”是指无内含子的RNA，它可以被细胞翻译成蛋白质。“cDNA”是指与mRNA互补并来源于其的双链DNA。
[0176] 术语“可操作地连接”指核酸序列在单个核酸片段上的缔合，使得其中一个核酸序列的功能受到另一个核酸序列的影响。例如，当启动子能够影响编码序列的表达时，它可操作地连接编码序列。即，编码序列处于启动子的转录控制下。编码序列可以按有义或反义的取向可操作地连接到调控序列。
[0177] 如本文所用，术语“表达”是指有义(mRNA)或反义RNA的转录和稳定积聚。表达也可指将mRNA翻译成多肽。
[0178] “转化”是指将核酸分子转移进宿主生物。例如，核酸分子可以是自主复制的质粒，例如，或者它可以整合进宿主生物的基因组中。含有转化核酸片段的宿主生物被称为“转基因”或“重组”或“转化”或“转化体”生物体。
[0179] “稳定转化”是指将核酸片段转移进宿主生物的基因组中(既包括核基因组也包括细胞器基因组)，导致基因稳定遗传(即，该核酸片段被“稳定地整合”)。相反“瞬时转化”指核酸片段转移进宿主生物体的胞核中或含DNA的细胞器中，从而导致基因表达而不整合或不稳定遗传。
[0180] 术语“质粒”和“载体”指通常携带有不属于细胞中心代谢的部分的基因的染色体外元件，并且常常是环状双链DNA片段的形式。这类元件可以是源自任何来源的自主复制序列、基因组整合序列、噬菌体或单链或双链DNA或RNA的核苷酸序列(线性或环状)，其中多个核苷酸序列已连接或重组为一种独特构建体，该独特构建体能够将表达盒引入细胞中。
[0181] 术语“表达盒”指DNA片段，所述DNA片段包含：所选基因的编码序列和所选基因产物表达所需的位于该编码序列之前(5′非编码序列)和之后(3′非编码序列)的调控序列。因此，表达盒通常由下列组成：1)启动子序列；2)编码序列[“ORF”]；和3)3′非翻译区(即终止子)，所述非翻译区在真核生物中通常包含多聚腺苷酸化位点。表达盒通常包含于载体中以有利于克隆和转化。只要能针对每种宿主使用正确的调控序列，则可以将不同表达盒转化进包括细菌、酵母、植物和哺乳动物细胞在内的不同生物体中。
[0182] 术语“序列分析软件”指用于分析核苷酸或氨基酸序列的任何计算机算法或软件程序。“序列分析软件”可商购获得或独立开发。典型的序列分析软件将包括但不限于：1)GCG程序软件包(Wisconsin Package Version9.0，Genetics Computer Group(GCG)，Madison，WI)；2)BLASTP，BLASTN，BLASTX(Altschul 等 人，J.Mol.Biol.，215：403-410(1990))；3)DNASTAR(DNASTAR，Inc.Madison，WI)；4)Sequencher(Gene Codes Corporation，Ann Arbor，MI)；和5)整合了Smith-Waterman算法的FASTA程序(W.R.Pearson，Comput.Methods Genome Res.，[Proc.Int.Symp.](1994)，Meeting Date
1992，111-20。编辑：Suhai，Sandor.Plenum：New York，NY)。在本专利申请的上下文中应当理解，使用序列分析软件进行分析时，分析结果将基于所参考程序的“默认值”，除非另外指明。在此所用的“默认值”将指在首次初始化软件时软件最初加载的任何值或参数集。
1992，111-20。编辑：Suhai，Sandor.Plenum：New York，NY)。在本专利申请的上下文中应当理解，使用序列分析软件进行分析时，分析结果将基于所参考程序的“默认值”，除非另外指明。在此所用的“默认值”将指在首次初始化软件时软件最初加载的任何值或参数集。
[0183] 如上文所述，基于编码LPLAT的基因在甘油磷脂的从头合成和重构中的密切关系，其中LPLAT从细胞的酰基-辅酶A库移除酰基-辅酶A脂肪酸并且在磷脂库中在sn-2位酰化多种溶血磷脂底物，编码LPLAT的基因存在于所有的真核细胞中。可公开获得的编码LPLAT的序列包括ScAle1(SEQ ID NO：9)、ScLPAAT(SEQ ID NO：18)、MaLPAAT1(SEQ ID NO：15)和CeLPCAT(SEQ ID NO：2)。ScAle1(SEQ ID NO：9)和ScLPAAT(SEQ ID NO：18)蛋白质序列被用作查询序列，以从公开的解脂耶氏酵母蛋白质数据库(“Yeast project Genolevures”(Center for Bioinformatics，LaBRI，Talence Cedex，France)(另参见Dujon，B.等人，Nature，430(6995)：35-44(2004))鉴定直系同源物。基于对最佳匹配结果的分析，来自解脂耶氏酵母的Ale1和LPAAT直系同源物在本文中分别被鉴定为YlAle1(SEQ ID NO：11)和YlLPAAT1(SEQ ID NO：17)(参见下文的实施例5)。
[0184] 当在优选的宿主生物内特定的LPLAT基因或蛋白质的序列是未知的时，可将本文中以SEQ ID NO：2、9、11、15、17和18示出的LPLAT序列或它们的部分用于利用序列分析软件在相同的或其他的藻类、真菌、卵菌纲真菌、类眼虫、原生藻菌、酵母或植物物种中搜索LPLAT同源物。通常，这种计算机软件通过将同源程度赋予多种置换、缺失和其他修饰来匹配相似的序列。利用软件算法，例如采用低复杂度过滤器和下列参数的BLASTP比对方法：期望值＝10，矩阵＝Blosum 62(Altschul，等人，Nucleic Acids Res.，25：3389-3402(1997))，将任何LPLAT蛋白质与核酸或蛋白质序列数据库进行比较并从而在优选的宿主生物种鉴定相似的已知序列，是为人们所熟知的。
[0185] 使用软件算法搜索已知序列数据库尤其适用于分离对可公开获得的LPLAT序列具有相对低的同一性百分比的同源物，例如SEQ ID NO：2、9、11、15、17和18中描述的那些。可预测，分离与可公开获得的LPLAT序列具有至少约70％-85％同一性的LPLAT同源物将是相对更容易的。此外，那些至少约85％-90％相同的序列将尤其适于分离，那些至少约
90％-95％相同的序列将最容易分离。
90％-95％相同的序列将最容易分离。
[0186] 通过使用LPLAT酶独有的基序也能够鉴定LPLAT同源物。这些基序很可能代表着LPLAT蛋白质的那些对蛋白质的结构、稳定性或活性重要的区域，并且这些基序作为用于新的LPLAT基因的快速鉴定的检测工具是有用的。
[0187] 已提出了多种LPLAT基序，它们根据在被分析的比对中所包括的特定物种存在少量变异。例如，Shindou等人(Biochem.Biophys.Res.Comm.，383：320-325(2009))基于对来自人类(Homo sapiens)、红原鸡(Gallus gallus)、斑马鱼(Danio rerio)和秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)的序列的比对，提出了下列对LPLAT活性重要的膜结合O-酰基转移酶[“MBOAT”]家族基序：WD、WHGxxxGYxxxF(SEQ ID NO：23)、YxxxxF(SEQ ID NO：24)和YxxxYFxxH(SEQ ID NO：25)。这些之中，WD、WHGxxxGYxxxF和YxxxxF基序存在于ScAle和YlAle1中，但YxxxYFxxH基序不是。就Ale1同源物而言，替代性的非植物基序也描述于美国专利公布2008-0145867-A1中；具体而言，这些包括：M-[V/I]-[L/I]-xxK-[L/V/I]-xxxxxxDG(SEQ ID NO：26)、RxKYYxxWxxx-[E/D]-[A/G]xxxxGxG-[F/Y]-xG(SEQ ID NO：27)、EX11WNX2-[T/V]-X2W(SEQ ID NO：28)和SAxWHGxxPGYxx-[T/F]-F(SEQ ID NO：29)。
[0188] 类似地，Lewin，T.W.等人(Biochemistry，38：5764-5771(1999))和Yamashita等人(Biochim，Biophys.Acta，1771：1202-1215(2007))基于对来自细菌、酵母、线虫和哺乳动物的序列的比对，提出了下列对LPLAT活性重要的1-酰基-sn-甘油-3-磷酸酰基转移酶[“LPAAT”]家族基序：NHxxxxD(SEQ ID NO：19)、GxxFI-[D/R]-R(SEQ ID NO：30)、EGTR(SEQ ID NO：20)以及[V/I]-[P/X]-[I/V/L]-[I/V]-P-[V/I](SEQ ID NO：31)和IVPIVM(SEQ ID NO：32)二者之一。上述NHxxxxD和EGTR基序存在于MaLPAAT1、YlLPAAT1和CeLPCAT中，但其他基序不存在于其中。
[0189] 基于可公开获得的Ale1、LPCAT和LPAAT蛋白质序列，包括本文中所述的那些，本发明涉及下列MBOAT家族基序：M(V/I)LxxKL(SEQ ID NO：3)、RxKYYxxW(SEQ ID NO：4)、SAxWHG(SEQ ID NO：5)和EX11WNX2-[T/V]-X2W(SEQ ID NO：28)。类似地，1-酰基-sn-甘油-3-磷酸酰基转移酶家族基序是如下列所示的那些：NHxxxxD(SEQ ID NO：19)和EGTR(SEQ ID NO：20)。
[0190] 作为另外一种选择，可公开获得的LPLAT序列或它们的基序可以是用于鉴定同源物的杂交试剂。杂交方法是为本领域的普通技术人员所熟知的，如上文所示。
[0191] 任何LPLAT核酸片段或任何鉴定的同源物可用于从相同的或其他的藻类、真菌、卵菌、类眼虫、原生藻菌、酵母或植物物种中分离编码同源蛋白的基因。使用序列依赖性规程分离同源基因是本领域熟知的。序列依赖性规程的实例包括但不限于：1)核酸杂交方法；2)DNA和RNA扩增方法例如核酸扩增技术的各种应用，例如，聚合酶链反应[“PCR”](美国专利4,683,202)；连接酶链反应[“LCR”](Tabor，S.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，82：1074(1985))；或链置换扩增反应[“SDA”](Walker等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，89：392(1992)；以及3)文库构建和互补筛选方法。
[0192] 例如，对于与可公开获得的LPLAT基因或它们的基序相似的编码蛋白或多肽的基因，可通过用那些可公开获得的核酸片段的全部或部分作为DNA杂交探针，利用为人们所熟知的方法筛选来自任何所期望的生物的文库而直接分离它们。基于可公开获得核酸序列，特异性寡核苷酸探针可通过本领域已知的方法(Maniatis，参见上文)设计和合成。而且，整个序列可直接用于通过技术人员已知的方法，例如随机引物DNA标记、切口平移或末端标记技术，来合成DNA探针，或使用可用的体外转录体系来合成RNA探针。此外，能设计特异性引物并用于扩增部分或全长公开可获得的序列或它们的基序。所得的扩增产物可在扩增反应过程中直接标记或在扩增反应后标记，并用作探针来在合适的严格条件下分离全长的DNA片段。
[0193] 通常，在PCR类型的扩增技术中，引物具有不同的序列而且彼此之间不互补。取决于所需的检测条件，应该设计引物序列以提供既有效又可靠的靶核酸的复制。PCR引物设计方法是常见且为人们所熟知的(Thein和Wallace，“The use of as specific hybridization probes in the Diagnosis of Genetic Disorders”，Human Genetic Diseases：A Practical Approach，K.E.Davis编辑，(1986)pp 33-50，IRL：Herndon，VA；Rychlik，W.，In Methods in Molecular Biology，White，B.A.编辑，(1993)Vol.15，pp
31-39，PCR Protocols：Current Methods and Applications.Humania：Totowa，NJ)。
31-39，PCR Protocols：Current Methods and Applications.Humania：Totowa，NJ)。
[0194] 通常，可以将可获得的LPLAT序列的两个短片段在PCR规程中用于从DNA或RNA扩增编码同源基因的更长的核酸片段。也可以对克隆的核酸片段文库进行PCR，其中一个引物的序列来源于可获得的核酸片段或它们的基序。其他引物序列利用mRNA前体编码基因3′末端存在的多腺苷酸片。
[0195] 备选地，第二个引物序列可以基于来源于克隆载体的序列。例如，技术人员可以按照RACE规程(Frohman等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，85：8998(1988))，通过用PCR扩增在转录物内单个位点与3′或5′端之间的区域的拷贝来产生cDNA。以3′和5′方向取向的引物可以从能利用可获得的序列设计。使用可商购获得的3′RACE或5′RACE体系(例如BRL，Gaithersburg，MD)，可以分离特异性的3′或5′cDNA片段(Ohara等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，86：5673(1989)；Loh等人，Science，243：217(1989))。
[0196] 基于所讨论的为人们所熟知的这些方法中的任何一种，在选择的任何优选的真核生物中鉴定和/或分离LPLAT基因同源物将是可能的。任何推定的LPLAT基因的活性能够容易地通过在生产LC-PUFA的宿主生物体内表达该基因而得到确认，因为C18-C20延伸和/或Δ4去饱和会相对于在没有LPLAT转基因的生物体内的那些升高(参见上文)。
[0197] 此前LPCAT已被假定对于解脂耶氏酵母TAG组分的EPA的积累可能是重要的。(美国专利公布2006-0115881-A1)。如该文献中所述，这一假设基于下列的研究：1)Stymne S.和A.K.Stobart(Biochem J.，223(2)：305-314(1984))，他们假设酰基-辅酶A库和PC库之间的交换可能是由于LPCAT的正向和逆向反应；2)Domergue，F.等人(J.Bio.Chem.，278：
35115(2003))，他们提出GLA在PC的sn-2位的积累和酵母中ARA不能被有效地合成是因为涉及PUFA生物合成的延伸步骤在酰基-辅酶A库中发生，而Δ5和Δ6去饱和步骤主要在PC的sn-2位发生；3)Abbadi，A.等人(The Plant Cell，16：2734-2748(2004))，他们根据在转基因油料种子植物中对PUFA积累限制的分析，提出LPCAT在Δ6去饱和酶/Δ6延伸酶途径的成功重构中起着关键作用；和4)国际申请公布WO 2004/076617A2(Renz，A.等人)，他们提供了编码来自秀丽隐杆线虫(T06E8.1)的LPCAT的基因[“CeLPCAT”]，在用适合Δ6延伸的外源脂肪酸底物供给的啤酒糖酵母中，该基因充分提高了基因工程导入的Δ6去饱和酶/Δ6延伸酶途径中的延伸效率。Renz等人推断，LPCAT允许新合成的脂肪酸在磷脂和酰基-辅酶A库之间有效的和持续的交换，因为去饱和酶催化双键向PC-偶联的脂肪酸中的引入而延伸酶专门地催化辅酶A酯化的脂肪酸(酰基-辅酶A)的延伸。然而，国际申请公布WO 2004/076617没有教导CeLPCAT对Δ5延伸转化效率、Δ4去饱和转化效率、或在没有外源性供给脂肪酸的宿主细胞中的Δ6延伸转化效率的影响。
35115(2003))，他们提出GLA在PC的sn-2位的积累和酵母中ARA不能被有效地合成是因为涉及PUFA生物合成的延伸步骤在酰基-辅酶A库中发生，而Δ5和Δ6去饱和步骤主要在PC的sn-2位发生；3)Abbadi，A.等人(The Plant Cell，16：2734-2748(2004))，他们根据在转基因油料种子植物中对PUFA积累限制的分析，提出LPCAT在Δ6去饱和酶/Δ6延伸酶途径的成功重构中起着关键作用；和4)国际申请公布WO 2004/076617A2(Renz，A.等人)，他们提供了编码来自秀丽隐杆线虫(T06E8.1)的LPCAT的基因[“CeLPCAT”]，在用适合Δ6延伸的外源脂肪酸底物供给的啤酒糖酵母中，该基因充分提高了基因工程导入的Δ6去饱和酶/Δ6延伸酶途径中的延伸效率。Renz等人推断，LPCAT允许新合成的脂肪酸在磷脂和酰基-辅酶A库之间有效的和持续的交换，因为去饱和酶催化双键向PC-偶联的脂肪酸中的引入而延伸酶专门地催化辅酶A酯化的脂肪酸(酰基-辅酶A)的延伸。然而，国际申请公布WO 2004/076617没有教导CeLPCAT对Δ5延伸转化效率、Δ4去饱和转化效率、或在没有外源性供给脂肪酸的宿主细胞中的Δ6延伸转化效率的影响。
[0198] 本文中证明了LPAAT和LPCAT对于解脂耶氏酵母的TAG部分中的EPA和DHA的积累的确是重要的。然而，令人意外地，发现了LPLAT的过表达能够导致Δ9延伸酶转化效率和/或Δ4去饱和酶转化效率的改善。如上文所定义的，术语“转化效率”是指特定的酶，例如Δ4去饱和酶或Δ9延伸酶，能够将底物转化为产物的效率。因此，在被改造以生产EPA的菌株中，Δ9延伸酶转化效率的改善被证明导致EPA％TFA或EPA％DCW的提高。类似地，在被改造以生产DHA的菌株中，Δ9延伸酶和/或Δ4去饱和酶转化效率的改善被证明导致DHA％TFA或DHA％DCW的提高。
[0199] PUFA去饱和发生在磷脂上，而脂肪酸延伸发生在酰基-辅酶A上。因此，基于上述研究，预期LPLAT的过表达将由于在磷脂中改善的底物可用性而导致去饱和作用的改善，而预期LPLAT的表达不会导致需要在辅酶A库中改善的底物可用性的延伸的改善。
[0200] 尽管有这些假设，实施例5表明，LPLAT的表达没有以可比较的方式在生产DHA的耶氏酵母菌株中改善全部去饱和作用的转化效率。具体而言，Δ4去饱和酶的转化效率被选择性地改善，而类似的改善未见于Δ12、Δ8、Δ5或Δ17去饱和作用中。据推测，Δ4去饱和酶由于磷脂中DPA底物有限的可用性而受限。
[0201] 此外，实施例4和5表明，LPLAT基于至少一种稳定整合的编码LPLAT多肽的多核苷酸的表达，在分别生产EPA和DHA的耶氏酵母菌株中显著地改善了Δ9延伸酶转化效率。然而，令人吃惊地，在DHA菌株中，LPLAT没有导致EPA向DPA的C20/22延伸的效率可比较的改善。总体而言，在过表达LPLAT的菌株中相对于没有的那些菌株，总脂质含量没有显著的改变。
[0202] 显然，难以对LPLAT在生产PU
[0203] FA的宿主细胞中的过表达的效应进行广泛概括。相反，LPLAT活性的效应必须基于具有特定活性的去饱和酶和延伸酶的亚类(即，Δ12去饱和酶、Δ8去饱和酶、Δ5去饱和酶、Δ17去饱和酶、Δ4去饱和酶、Δ9延伸酶、C14/16延伸酶、C16/18延伸酶、C18/20延伸酶[“也叫Δ6延伸酶”]、C20/22延伸酶[“也叫Δ5延伸酶”])来考虑。
[0204] 基于上述讨论，在本文的一个实施方案中，提供了在生产LC-PUFA的含油重组微生物宿主细胞中改善C18-C20延伸转化效率的方法，其中所述方法包括：
[0205] a)向所述生产LC-PUFA的重组宿主细胞中导入至少一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸编码具有至少酰基辅酶A：溶血磷脂酰基转移酶活性的多肽，其中所述多肽选自：
[0206] (i)基于Clustal W比对方法，在与选自SEQ ID NO：9(ScAle1)和SEQ ID NO：11(YlAle1)的氨基酸序列进行比较时，具有至少45％的氨基酸同一性的多肽；
[0207] (ii)具有至少一种膜结合O-酰基转移酶蛋白质家族基序的多肽，其中所述基序选自：M(V/I)LxxKL(SEQ ID NO：3)、RxKYYxxW(SEQ ID NO：4)、SAxWHG(SEQ ID NO：5)和EX11WNX2-[T/V]-X2W(SEQ ID NO：28)；
[0208] (iii)基于Clustal W比对方法，在与如SEQ ID NO：2(CeLPCAT)所示的氨基酸序列进行比较时，具有至少90％的氨基酸同一性的多肽；
[0209] (iv)基于Clustal W比对方法，在与选自SEQ ID NO：15(MaLPAAT1)SEQ ID NO：17(YlLPAAT1)和SEQ ID NO：18(ScLPAAT1)的氨基酸序列进行比较时，具有至少43.9％的氨基酸同一性的多肽；和
[0210] (v)具有至少一种1-酰基-sn-甘油-3-磷酸酰基转移酶蛋白质家族基序的多肽，其中所述基序选自：NHxxxxD(SEQ ID NO：19)和EGTR(SEQ ID NO：20)；
[0211] 其中所述编码具有至少酰基辅酶A：溶血磷脂酰基转移酶活性的多肽的至少一种分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸可操作地连接到至少一种调控序列，所述调控序列是相同的或不同的；和，
[0212] b)使所述含油微生物宿主细胞生长；
[0213] 其中所述含油微生物宿主细胞的C18-C20延伸转化效率相对于对照宿主细胞提高。
[0214] 在优选的实施方案中，基于至少一种稳定整合的编码LPLAT多肽的多核苷酸，与对照宿主细胞相比，在生产至少一种LC-PUFA的含油微生物宿主细胞中，C18-C20延伸转化效率的提高为至少4％，尽管C18-C20延伸转化效率的任何大于4％的提高是尤其优选的，包括至少约4-10％的提高，更优选至少约10-20％，更优选至少约20-40％，最优选至少约40-60％或更高。
[0215] 例如，在本文展示的一种方法中，与对照宿主细胞相比，生产EPA的宿主细胞中C18-C20延伸转化效率的提高为至少13％并且与对照宿主细胞相比，在生产DHA的宿主细胞中C18-C20延伸转化效率的提高为至少4％。
[0216] 类似地，本文还描述了用于在生产LC-PUFA的含油重组微生物宿主细胞中提高Δ4去饱和转化效率的方法，其中所述方法包括：
[0217] a)向所述生产LC-PUFA的重组宿主细胞中导入至少一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸编码具有至少酰基辅酶A：溶血磷脂酰基转移酶活性的多肽，其中所述多肽选自：
[0218] (i)基于Clustal W比对方法，在与选自SEQ ID NO：9(ScAle1)和SEQ ID NO：11(YlAle1)的氨基酸序列进行比较时，具有至少45％的氨基酸同一性的多肽；
[0219] (ii)具有至少一种膜结合O-酰基转移酶蛋白质家族基序的多肽，其中所述基序选自：M(V/I)LxxKL(SEQ ID NO：3)、RxKYYxxW(SEQ ID NO：4)、SAxWHG(SEQ ID NO：5)和EX11WNX2-[T/V]-X2W(SEQ ID NO：28)；
[0220] (iii)基于Clustal W比对方法，在与如SEQ ID NO：2(CeLPCAT)所示的氨基酸序列进行比较时，具有至少90％的氨基酸同一性的多肽；
[0221] (iv)基于Clustal W比对方法，在与选自SEQ ID NO：15(MaLPAAT1)SEQ ID NO：17(YlLPAAT1)和SEQ ID NO：18(ScLPAAT1)的氨基酸序列进行比较时，具有至少43.9％的氨基酸同一性的多肽；和
[0222] (v)具有至少一种1-酰基-sn-甘油-3-磷酸酰基转移酶蛋白质家族基序的多肽，其中所述基序选自：NHxxxxD(SEQ ID NO：19)和EGTR(SEQ ID NO：20)；
[0223] 其中所述编码具有至少酰基辅酶A：溶血磷脂酰基转移酶活性的多肽的至少一种分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸可操作地连接到至少一种调控序列，所述调控序列是相同的或不同的；和，
[0224] b)使所述含油微生物宿主细胞生长；
[0225] 其中所述含油微生物宿主细胞的Δ4去饱和转化效率相对于对照宿主细胞提高。
[0226] 在优选的实施方案中，基于至少一种稳定整合的编码LPLAT多肽的多核苷酸，与对照宿主细胞相比，在生产至少一种LC-PUFA的含油微生物宿主细胞中，Δ4去饱和转化效率的提高为至少5％，尽管Δ4去饱和转化效率的任何大于5％的提高是尤其优选的，包括至少约5-10％的提高，更优选至少约10-20％，更优选至少约20-40％，最优选至少约40-60％或更高。
[0227] 例如，在本文展示的一种方法中，与对照宿主细胞相比，在生产DHA的宿主中Δ4去饱和转化效率的提高为至少18％。
[0228] 除以上所述的方法外，本文还描述了重组的宿主细胞。具体而言，这些重组的宿主细胞包含至少一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸编码具有至少酰基辅酶A：溶血磷脂酰基转移酶活性的多肽，其中所述多肽选自：
[0229] (a)基于Clustal W比对方法，在与选自SEQ ID NO：9(ScAle1)和SEQ ID NO：11(YlAle1)的氨基酸序列进行比较时，具有至少45％的氨基酸同一性的多肽；
[0230] (b)具有至少一种膜结合O-酰基转移酶蛋白质家族基序的多肽，其中所述基序选自：M(V/I)LxxKL(SEQ ID NO：3)、RxKYYxxW(SEQ ID NO：4)、SAxWHG(SEQ ID NO：5)和EX11WNX2-[T/V]-X2W(SEQ ID NO：28)；
[0231] (c)基于Clustal W比对方法，在与如SEQ ID NO：2(CeLPCAT)所示的氨基酸序列进行比较时，具有至少90％的氨基酸同一性的多肽；
[0232] (d)基于Clustal W比对方法，在与选自SEQ ID NO：15(MaLPAAT1)，SEQ ID NO：17(YlLPAAT1)和SEQ ID NO：18(ScLPAAT1)的氨基酸序列进行比较时，具有至少43.9％的氨基酸同一性的多肽；和，
[0233] (e)具有至少一种1-酰基-sn-甘油-3-磷酸酰基转移酶家族基序的多肽，其中所述基序选自：NHxxxxD(SEQ ID NO：19)和EGTR(SEQ ID NO：20)；
[0234] 其中所述编码具有至少酰基辅酶A：溶血磷脂酰基转移酶活性的多肽的至少一种分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸可操作地连接到至少一种调控序列，所述调控序列是相同的或不同的，并且所述重组的宿主细胞进一步具有至少一种改善，所述改善选自：
[0235] a)与对照宿主细胞相比，生产至少一种LC-PUFA的含油微生物宿主细胞中C18-C20延伸转化效率的提高；
[0236] b)与对照宿主细胞相比，生产至少一种LC-PUFA的含油微生物宿主细胞中Δ4去饱和转化效率的提高。
[0237] 在优选的宿主细胞中，编码具有至少酰基辅酶A：溶血磷脂酰基转移酶活性的多肽的多核苷酸被稳定地整合；并且，进一步地，其中所述宿主细胞具有至少一种改善，所述改善选自：
[0238] a)与对照宿主细胞相比，在生产至少一种长链多不饱和脂肪酸的含油微生物宿主细胞中C18-C20延伸转化效率至少4％的提高；和
[0239] b)与对照宿主细胞相比，在生产至少一种长链多不饱和脂肪酸的含油微生物宿主细胞中Δ4去饱和转化效率至少5％的提高。
[0240] 在具有至少一种稳定整合的编码LPLAT多肽的多核苷酸的更优选的宿主细胞中，所述至少一种改善选自：
[0241] a)与对照宿主细胞相比，在生产EPA的宿主细胞中C18-C20延伸转化效率至少13％的提高；
[0242] b)与对照宿主细胞相比，在生产EPA的宿主细胞中EPA占TFA的至少9％的提高；
[0243] c)与对照宿主细胞相比，在生产DHA的宿主细胞中C18-C20延伸转化效率至少4％的提高；
[0244] d)与对照宿主细胞相比，在生产DHA的宿主细胞中EPA占TFA的至少2％的提高；
[0245] e)与对照宿主细胞相比，在生产DHA的宿主细胞中Δ4去饱和转化效率至少18％的提高；和
[0246] f)与对照宿主细胞相比，在生产DHA的宿主细胞中DHA占TFA的至少9％的提高。
[0247] 当然，本领域的技术人员应当理解，以上所述的改善应被视为示例性的，而非对本发明构成限制。
[0248] 基于上述改善，本领域的技术人员将会知道，在生产长链PUFA(例如EDA、DGLA、ARA、DTA、DPAn-6、ETrA、ETA、EPA、DPA和DHA)的重组宿主细胞中，当期望使这些脂肪酸的生产最优化时，表达LPLAT的价值。
[0249] 对于制备重组构建体有用的标准来源的材料涉及，尤其是：1)构建、操纵和分离大分子(例如DNA分子、质粒等)的特定条件和程序；2)重组DNA片段和重组表达构建体的产生；以及3)克隆的筛选和分离。参见：Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory：Cold Spring Harbor，NY(1989)(下文中称为“Maniatis”)；Silhavy，T.J.，Bennan，M.L.和Enquist，L.W.，Experiments with Gene Fusions，Cold Spring Harbor Laboratory Cold：
Spring Harbor，NY(1984)；以及Ausubel，F.M.等人，Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing Assoc.and Wiley-Interscience出版，Hoboken，NJ(1987)。
Spring Harbor，NY(1984)；以及Ausubel，F.M.等人，Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing Assoc.and Wiley-Interscience出版，Hoboken，NJ(1987)。
[0250] 一般来讲，存在于构建体中的序列的具体选择取决于期望的表达产物、宿主细胞的性质以及提出的相对于未转化细胞分离转化细胞的手段。技术人员知道必须存在于质粒载体上以成功地转化、选择并增殖包含嵌合基因的宿主细胞的遗传因子。然而，通常载体或盒含有引导相关基因的转录和翻译的序列、选择标记和允许自主复制或染色体整合的序列。适合的载体包含控制转录启动的基因的5′区域(即启动子)、基因编码序列和控制转录终止的DNA片段的3′区域(即终止子)。最优选的是当两个控制区都来源于来自转化的宿主细胞的基因，尽管它们无需来源于对生产宿主是天然的基因。
[0251] 用于驱动在期望宿主细胞中的异源基因或部分异源基因表达的转录启动区或启动子有多种，并且为人们所熟知。这些控制区可包含启动子、增强子、静默子、内含子序列、3’UTR和/或5′UTR区域、以及蛋白和/或RNA稳定元件。此类元件的强度和特异性可以不同。事实上，能够指导这些基因在所选择的宿主细胞中的表达的任何启动子(即天然的、合成的或嵌合的启动子)都是适合的，但来自宿主物种的转录和翻译区是尤其有用的。在宿主细胞中的表达能够以诱导型或组成型的方式发生。诱导型表达通过诱导可操作地连接到受关注的LPLAT基因的可调控启动子的活性实现，而组成型表达通过利用组成型启动子实现。
[0252] 编码转录终止区域的3′非编码序列可在重组构建体中提供，并且可来自基因的3′区域或来自不同的基因，其中所述3′区域获自初始区。大量的终止区是已知的并且当用于与它们所源自的相同和不同的属和物种时，其在多种宿主中发挥的功能令人满意。终止区也可以源于优选宿主的多种天然基因。选择终止区通常更多的是从方便的角度出发而不是为了任何特性。
[0253] 就在酵母中的使用而言，尤其有用的终止区是来源于酵母基因，尤其是糖酵母属、裂殖糖酵母属、假丝酵母属、耶氏酵母属或克鲁维酵母属。编码γ-干扰素和α-2干扰素的哺乳动物基因的3′区域也已知能在酵母中起作用。3′-区也可以是合成的，因为本领域的技术人员可利用可获得的信息来设计和合成用作转录终止子的3′-区序列。终止区可以是非必需的，但是是高度优选的。
[0254] 载体除了上述调控元件之外还可包含选择性的和/或可评分的标记。优选地，标记基因是抗生素抗性基因，使得用抗生素处理细胞引起未转化细胞的生长抑制或死亡，但不抑制转化细胞的生长。为了选择酵母转化体，可使用在酵母中发挥功能的任何标记，使之具有对卡那霉素、潮霉素、和氨基配醣物G418的抗性并能够在缺乏尿嘧啶、赖氨酸、组氨酸、或亮氨酸的培养基上生长的标记是尤其有用的。
[0255] 仅仅将基因(例如编码LPLAT的基因)插入克隆载体不确保它能以期望的速率、浓度、量等表达。响应于对高表达率的需要，通过操作许多控制转录、RNA稳定性、翻译、蛋白质稳定性和位置、氧限制和从微生物宿主细胞的分泌的不同遗传元件，已经建立了许多专用的表达载体。一些受操纵的特性包括：相关转录启动子和终止子序列的性质，所克隆基因的拷贝数目，以及该基因是质粒携带的还是被整合进了宿主细胞的基因组中，所合成蛋白质的最终细胞定位，蛋白质在宿主生物内的翻译和正确折叠的效率，所克隆基因的mRNA和蛋白质在宿主细胞内的固有稳定性和所克隆基因中的密码子使用，以使得其频率与宿主细胞的优选密码子使用频率接近。这些性质每种均可被用于本文所述的方法和宿主细胞中，以进一步优化LPLAT基因的表达。
[0256] 例如，通过使用更强的启动子(调控型的或组成型的)引起表达提高、通过从mRNA或所编码的蛋白质中移除/删除去稳定化序列、或通过将稳定化序列加到mRNA(美国专利4,910,141)上，能够在转录水平上提高LPLAT的表达。作为另外一种选择，可将附加拷贝的LPLAT基因导入重组宿主细胞中，从而提高EPA和/或DHA的生产和积累，这或通过在单表达构建体中克隆附加拷贝的基因，或通过将附加拷贝导入宿主细胞中而实现，其中后者通过提高质粒拷贝数，或通过多次地将克隆基因被整合进基因组中进行。
[0257] 在制备包含至少一个嵌合基因(其包含启动子、LPLAT开放阅读框[“ORF”]和终止子)的重组构建体后，将其置于能够在宿主细胞中自主复制的质粒载体中，或直接被整合到宿主细胞基因组中。表达盒的整合可以在宿主基因组中随机地发生，或可以通过使用这样的构建体来靶向，即该构建体含有足以靶向宿主基因座中的重组的与宿主基因组同源的区。如果构建体靶向内源性基因座，则转录和翻译调控区的全部或某些可以由内源性基因座提供。
[0258] 当两个或更多个基因从独立的复制载体表达时，每个载体可具有不同的选择手段并且应当缺乏与其他构建体的同源性以便维持稳定表达和防止元件在构建体之间重配(reassortment)。可用实验方法确定对调控区、选择手段和所引入的构建体的增殖方法的正确选择，以便所有导入的基因都以需要的水平表达从而提供所需产品的合成。
[0259] 包含所关注的基因的构建体可以通过任何标准技术导入宿主细胞中。这些技术包括转化(如醋酸锂转化(Methods in Enzymology，194：186-187(1991)))、基因枪轰击、电穿孔、显微注射、真空过滤或将所关注的基因引入宿主细胞中的任何其它方法。
[0260] 为方便起见，已经通过任何方法被操纵以摄取DNA序列(如表达盒)的宿主细胞在本文中将称为“转化的”或“转化体”或“重组体”。转化的宿主将具有至少一个表达构建体的拷贝，而且可以具有两个或更多个拷贝，这取决于该基因是整合进基因组内、被扩增还是存在于具有多拷贝数的染色体外元件上。
[0261] 转化宿主细胞能通过选择导入构建体上包含的标记进行鉴定。作为另外一种选择，分离的标记构建体可用期望的构建体进行共转化，该方法与多种将多个DNA分子导入宿主细胞的转化技术一样。
[0262] 典型地，就转化的宿主在选择性培养基上生长的能力对它们进行选择，所述选择性培养基可掺入了抗生素或缺少未被转化的宿主生长所必需的因子，例如营养物质或生长因子。导入的标记基因可赋予抗生素抗性，或编码必需的生长因子或酶，从而当在转化宿主中表达时允许在选择培养基上生长。转化宿主的选择也能发生在表达标记蛋白能被直接地或间接地检测出来时。附加的选择技术在美国专利7,238,482和美国专利7,259,255中进行了描述。
[0263] 无论选择哪种宿主或表达构建体，必须筛选多个转化子以获取显示期望表达水平和模式的菌株。例如，Juretzek等人(Yeast，18：97-113(2001)提出在解脂耶氏酵母中的整合DNA片段的稳定性取决于单个转化子、受体菌株和所用的靶向平台。此类筛选可以通过DNA印迹的Southern分析(Southern，J.Mol.Biol.，98：503(1975))、mRNA表达的Northern分析(Kroczek，J.Chromatogr.Biomed.Appl.，618(1-2)：133-145(1993))、蛋白质表达的Western分析、PUFA产物的表型分析或GC分析来完成。
[0264] 油酸在其中转化成LC-PUFA的代谢过程涉及通过添加碳原子使碳链延伸和通过加入双键使分子去饱和。这需要存在于内质网膜内的一系列特殊去饱和酶和延伸酶。然而，如在图1中看到的和如下文所述的，存在多个用于LC-PUFA生产的替代途径。
[0265] 具体地讲，图1描述了下文所述的途径。所有途径都需要最初通过Δ12去饱和酶将油酸转化成亚油酸[“LA”](第一个ω-6脂肪酸)。然后使用“Δ9延伸酶/Δ8去饱和酶途径”并用LA作底物，如下形成长链ω-6脂肪酸：1)通过Δ9延伸酶将LA转化成二十碳二烯酸[“EDA”]；2)通过Δ8去饱和酶将EDA转化成二高-γ-亚麻酸[“DGLA”]；3)通过Δ5去饱和酶将DGLA转化成花生四烯酸[“ARA”]；4)通过C20/22延伸酶将ARA转化成二十二碳四烯酸[“DTA”]；以及，5)通过Δ4去饱和酶将DTA转化成二十二碳五烯酸[“DPAn-6”]。
[0266] “Δ9延伸酶/Δ8去饱和酶途径”也能够利用α-亚麻酸[“ALA”]作为底物生产长链ω-3脂肪酸如下：1)通过Δ15去饱和酶将LA转化成ALA，第一个ω-3脂肪酸；2)通过Δ9延伸酶将ALA转化成二十碳三烯酸[“ETrA”]；3)通过Δ8去饱和酶将ETrA转化成二十碳四烯酸[“ETA”]；4)通过Δ5去饱和酶将ETA转化成二十碳五烯酸[“EPA”]；5)通过C20/22延伸酶将EPA转化成二十二碳五烯酸[“DPA”]；以及6)通过Δ4去饱和酶将DPA转化成二十二碳六烯酸[“DHA”]。任选地，Δ6脂肪酸可转化成Δ3脂肪酸。例如，ETA和EPA通过Δ17去饱和酶活性分别由DGLA和ARA生成。就本文目的而言，有利的是Δ9延伸酶/Δ8去饱和酶途径能够生产不含显著量的γ-亚麻酸[“GLA”]的EPA油。
[0267] ω-3/ω-6脂肪酸生物合成的替代途径利用Δ6去饱和酶和C18/20延伸酶，即“Δ6去饱和酶/Δ6延伸酶途径”。更具体地讲，通过Δ6去饱和酶，LA和ALA可分别被转化为GLA和十八碳四烯酸[“STA”]；然后，C18/20延伸酶将GLA转化为DGLA并且/或者将STA转化为ETA。
[0268] 生产LC-PUFA的重组宿主细胞将具有至少一种上述的生物合成途径，无论这种途径对该宿主细胞是天然的还是遗传工程的。优选地，宿主细胞将能够产生占宿主细胞总脂质至少约2-5％的LC-PUFA，更优选占总脂质至少约5-15％的LC-PUFA，更优选占总脂质至少约15-35％的LC-PUFA，更优选占总脂质至少约35-50％的LC-PUFA，更优选占总脂质至少约50-65％的LC-PUFA，最优选占总脂质至少约65-75％的LC-PUFA。LC-PUFA的结构形式不受限制；因此，例如EPA或DHA可以在总脂质中以游离脂肪酸形式或酯化形式存在，例如酰基甘油、磷脂、硫脂或糖脂。
[0269] 多种真核微生物，包括细菌、酵母、藻类、原生藻菌、卵菌纲、类眼虫和/或真菌，能够生产(或经基因工程改造为能够生产)LC-PUFA。它们可包括在包括简单或复杂的碳水化合物、脂肪酸、有机酸、油、甘油和醇类和/或烃类的多种原料上于广泛的温度和pH值范围内生长的那些宿主。
[0270] 优选的微生物宿主是含油生物。这些含油生物天然能够合成并积聚油脂，其中总油脂含量可占干细胞重量的超过约25％，更优选占干细胞重量的超过约30％，最优选占干细胞重量的超过约40％。多种细菌、藻类、眼虫、苔藓、真菌、酵母和原生藻菌被天然地分类为含油。在这个广泛的宿主类群中，特别要关注的是天然产生ω-3/ω-6脂肪酸的那些生物。例如，ARA、EPA和/或DHA通过小环藻属(Cyclotella sp.)、隐甲藻属(Crypthecodinium sp.)、被孢霉属(Mortierella sp.)、菱形藻属(Nitzschia sp.)、腐霉属(Pythium)、破囊壶菌属(Thraustochytrium sp.)和裂殖壶菌属(Schizochytrium sp.)产生。因此，例如，用处于诱导型或调节型启动子控制下的任何本发明的LPLAT基因转化高山被孢霉(其在商业上被用于生产ARA)，能够产生能合成增加量的ARA的转化生物。Mackenzie等人(Appl.Environ.Microbiol.，66：4655(2000))描述了转化高山被孢霉的方法。类似地，美国专利7,001，772中公开了用于转化破囊壶菌目(Thraustochytriales)微生物(例如，破囊壶菌属(Thraustochytrium)、裂殖壶菌属(Schizochytrium))的方法。在替代实施方案中，非含油生物能够经基因修饰变成含油，例如酵母如啤酒糖酵母(美国专利公布2007/0015237-A1)。
[0271] 在较优选的实施方案中，微生物宿主细胞是含油酵母。通常鉴定为含油酵母的属包括但不限于：耶氏酵母属(Yarrowia)、假丝酵母属(Candida)、红酵母属(Rhodotorula)、红冬孢酵母属(Rhodosporidium)、隐球酵母属(Cryptococcus)、丝孢酵母属(Trichosporon)和油脂酵母属(Lipomyces)。更具体地讲，例证性的合成油的酵母包括：圆红冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides)、斯达氏油脂酵母(Lipomyces starkeyii)、产油油脂酵母(L.lipoferus)、拉可夫氏假丝酵母(Candida revkaufi)、铁红假丝酵母(C.pulcherrima)、热带假丝酵母(C.tropicalis)、产朊假丝酵母(C.utilis)、茁芽丝孢酵母(Trichosporon pullans)、皮状丝孢酵母(T.cutaneum)、胶粘红酵母(Rhodotorula glutinus)、牧草红酵母(R.graminis)和解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)(过去被分类为解脂假丝酵母(Candida lipolytica))。最优选的是含油酵母解脂耶氏酵母；并且，在另一个实施方案中，最优选的是称为ATCC#18944、ATCC#8862、ATCC#20362、ATCC#76982和/或LGAMS(7)1的解脂耶氏酵母菌株(Papanikolaou S.和Aggelis G.，Bioresour.Technol.，82(1)：43-9(2002))。
[0272] 可应用于在解脂耶氏酵母中通过基因工程建立ARA、EPA和DHA的表达的具体教导分别提供于美国专利公布2006-0094092-A1、美国专利公布2006-0115881-A1、美国专利公布2009-0093543-A1和美国专利公布2006-0110806-A1中。这些文献还描述了当使用该特定宿主物种时，通过将线性DNA片段整合到宿主基因组中在解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)中表达基因的优选方法、优选的启动子、终止区、整合座位和中断、以及优选的选择方法。
[0273] 本领域的技术人员将能够使用所引用的美国专利公布2006-0094092-A1、美国专利公布2006-0115881-A1、美国专利公布2009-0093543-A1和美国专利公布2006-0110806-A1中的教导重组工程化其他宿主细胞用于PUFA生产。
[0274] 转化的重组宿主细胞在使嵌合基因(例如，编码去饱和酶、延伸酶、LPLAT等的基因)的表达最优化的条件下生长，产生最大的和最经济的PUFA产量。通常，可通过改变碳源的类型和量、氮源的类型和量、碳氮比、不同矿物离子的量、氧水平、生长温度、pH、生物质生产期的时长、油积聚期的时长以及细胞收获的时间和方法优化培养基条件。
[0275] 解脂耶氏酵母通常生长在复合培养基(如酵母提取物-蛋白胨-葡萄糖液体培养基[“YPD”])或缺乏生长所必需的成分并由此强迫选择所需表达盒的确定成分的基本培养基中(如Yeast Nitrogen Base(DIFCO Laboratories，Detroit，MI))。
[0276] 用于本文所述方法和宿主细胞的发酵培养基必须包含合适的碳源，如在美国专利7,238,482和美国专利申请12/641,929(提交于2009年12月19日)中提出的碳源。尽管预期所利用的碳源可以涵盖许多种含碳源，但优选的碳源是糖类、甘油和/或脂肪酸。最优选的是葡萄糖、蔗糖、转化蔗糖、果糖和/或包含介于10-22个之间的碳原子的脂肪酸。例如，可发酵的碳源可以选自转化蔗糖、葡萄糖、果糖和这些的组合，前提是葡萄糖与转化蔗糖和/或果糖联合使用。
[0277] 术语“转化蔗糖”，在本文中也称为“转化糖”，是指包含由蔗糖水解而来的相等部分的果糖和葡萄糖的混合物。转化蔗糖可以包含25至50％葡萄糖和25至50％果糖的混合物。转化蔗糖还可以包含蔗糖，蔗糖的量取决于水解度。
[0278] 氮可以由无机源(如(NH4)2SO4)或有机源如尿素或谷氨酸)提供。除了合适的碳源和氮源，发酵培养基还必须含有合适的矿物质、盐、辅因子、缓冲液、维生素和本领域技术人员已知的适合生产高水平EPA和/或DHA的宿主细胞生长并促进生产EPA和/或DHA的酶+2 +2 +2途径的其它组分。特别关注的是促进脂质和PUFA合成的几种金属离子，例如Fe 、Cu 、Mn 、+2 +2 +2
Co 、Zn 和Mg (Nakahara，T.等人，Ind.Appl.Single Cell Oils，D.J.Kyle和R.Colin，编辑，pp 61-97(1992))。
Co 、Zn 和Mg (Nakahara，T.等人，Ind.Appl.Single Cell Oils，D.J.Kyle和R.Colin，编辑，pp 61-97(1992))。
[0279] 用于本文所述方法和宿主细胞的优选的生长培养基是常规的商业制备培养基，例如酵母氮源基础培养基(Yeast Nitrogen Base，DIFCO Laboratories，Detroit，MI)。也可以使用其它确定成分的生长培养基或合成的生长培养基，且适于解脂耶氏酵母生长的培养基对微生物学或发酵科学领域的技术人员来说将是已知的。适于发酵的pH范围通常介于约pH4.0至pH8.0之间，其中优选将pH5.5至pH7.5作为初始生长条件的范围。发酵可以在有氧或厌氧条件下进行，其中优选微氧条件。
[0280] 通常，在含油酵母细胞中积聚高水平的PUFA需要包括两个阶段的过程，由于代谢状态必须在生长和脂肪的合成/贮存之间达到“平衡”。因此，最优选地，两阶段的发酵过程是在解脂耶氏酵母中生产EPA和/或DHA所必需的。这种方法在美国专利7,238,482中有所描述，其也描述了多种合适的发酵工艺设计(即分批式、补料分批式和连续式)和生长过程中的注意事项。
[0281] 在一些方面，初级产物是含油微生物生物质。如此，从生物质中分离和纯化包含LC-PUFA的油可能是不必要的(即，其中全细胞生物质是产品)。
[0282] 然而，某些最终用途和/或产品形式可能需要对来自生物质的包含LC-PUFA的油部分和/或全部分离/纯化，以产生部分纯化的生物质、纯化的油、和/或纯化的LC-PUFA。包括PUFA在内的脂肪酸可以以游离脂肪酸或酯化形式如酰基甘油、磷脂、硫脂或糖脂形式存在于宿主微生物中。这些脂肪酸可通过本领域熟知的多种方法从宿主细胞中提取。关于酵母脂质的提取技术、质量分析和可接受标准的一篇综述是Z.Jacobs(Critical Reviews in Biotechnology，12(5/6)：463-491(1992))。A.Singh和O.Ward(Adv.Appl.Microbiol.，
45：271-312(1997))。
45：271-312(1997))。
[0283] 一般来讲，用于纯化脂肪酸(包括LC-PUFA)的手段可包括用有机溶剂萃取(例如，美国专利6,797,303和美国专利5,648,564)、超声处理、超临界流体萃取(例如，使用二氧化碳)、皂化和物理手段(例如挤压)，或它们的组合。参见美国专利7,238,482。
[0284] 许多食物和饲料产品包含ω-3和/或ω-6脂肪酸，尤其是ALA、GLA、ARA、EPA、DPA和DHA。预期通过本文所述的方法和宿主细胞制备的包含LC-PUFA的含油酵母生物质、包含LC-PUFA的部分纯化的生物质、包含LC-PUFA的纯化的油、和/或纯化的LC-PUFA，通过摄入因它们的添加而被改善的食物或饲料，而赋予健康有益效果。举例来说，可将这些油加到食物类似物、饮料、肉产品、谷类产品、烘焙食品、小吃食品和乳制品中。参见美国专利申请公布2006-0094092。
[0285] 这些组合物通过加入到医疗食品(包括医疗营养物质、饮食补充剂、婴儿代乳品和药品)中可赋予健康有益效果。技术人员将会知道加到食品、饲料、饮食补充剂、营养物质、药品、和其它可摄取的产品中以赋予健康有益效果的油的量。本领域描述了摄取这些油获得的健康有益效果，它是技术人员已知的并进行了持续的研究。本文所指的量是“有效”量，除了其它方面的原因，它取决于摄入的包含这些油的产品的性质以及它们旨在治疗的病症。实施例
[0286] 在以下实施例中进一步描述本发明，所述实施例示出了实施本发明的简要方法，但不完全限定其所有可能变型。
[0287] 一般方法
[0288] 实施例中使用的标准的重组DNA和分子克隆技术是本领域所熟知的并且描述于：1)Sambrook，J.，Fritsch，E.F. 和 Maniatis，T.Molecular Cloning：A Laboratory Manual；Cold Spring Harbor Laboratory：Cold Spring Harbor，NY(1989)(Maniatis)；2)T.J.Silhavy，M.L.Bennan 和 L.W.Enquist，Experiments with Gene Fusions；Cold Spring Harbor Laboratory：Cold Spring Harbor，NY(1984)；和 3)Ausubel，F.M. 等人，Current Protocols in Molecular Biology，公布于Greene Publishing Assoc.and Wiley-Interscience，Hoboken，NJ(1987)。
[0289] 适用于微生物培养物的维持和生长的材料和方法是本领域熟知的。适用于下述实施例的技术可见于Manual of Methods for General Bacteriology(Phillipp Gerhardt，R.G.E.Murray，Ralph N.Costilow，Eugene W.Nester，Willis A.Wood，Noel R.Krieg和 G.Briggs Phillips，编 辑 )，American Society for Microbiology：Washington，D.C.(1994))；或 者 Thomas D.Brock in Biotechnology：A Textbook of Industrial Microbiology，第2版，Sinauer Associates：Sunderland，MA(1989)。除非另外指明，用于生长和维持微生物细胞的所有试剂、限制性酶和材料得自Aldrich Chemicals(Milwaukee，WI)、DIFCO Laboratories(Detroit，MI)、New England Biolabs，Inc.(Beverly，MA)、GIBCO/BRL(Gaithersburg，MD)、或Sigma Chemical Company(St.Louis，MO)，除非另外说明。通常于37℃下在Luria Bertani[“LB”]平板上培养大肠杆菌(E.coli)菌株。
[0290] 一般的分子克隆根据标准方法(Sambrook等人，同上)来完成。使用载体和插入-特异性引物的组合，利用末端标记技术(美国专利5,366,860；EP 272,007)，在ABI自动测序仪上获得DNA序列。序列编辑是在Sequencher(Gene Codes Corporation，Ann Arbor，MI)中进行的。所有序列在两个方向上覆盖至少两次。
[0291] 缩写含义如下：“sec”表示秒，“min”表示分钟，“h”表示小时，“d”表示天，“μL”表示微升，“mL”表示毫升，“L”表示升，“μM”表示微摩尔每升，“mM”表示毫摩尔每升，“M”表示摩尔每升，“mmol”表示毫摩尔，“μmole”表示微摩尔，“g”表示克，“μg”表示微克，“ng”表示纳克，“U”表示单位，“bp”表示碱基对，“kB”表示千碱基，“DCW”表示干细胞重量，“TFA”表示总脂肪酸。
[0292] 表达盒的命名
[0293] 表达盒的结构将通过简单的记号系统“X::Y::Z”表示，其中X描述启动子片段，Y描述基因片段而Z描述终止子片段，它们均彼此可操作地连接。
[0294] 解脂耶氏酵母的转化和培养
[0295] 解脂耶氏酵母菌株ATCC#20362购自美国典型培养物保藏中心(Rockville，MD)。解脂耶氏酵母菌株于28-30℃常规培养于若干种培养基中(例如，YPD琼脂培养基，基础的基本培养基[“MM”]，基本培养基+尿嘧啶[“MMU”]，基本培养基+亮氨酸+赖氨酸[“MMLeuLys”]，基本培养基+5-氟乳清酸[“MM+5-FOA”]，高葡萄糖培养基[“HGM”]和发酵培养基[“FM”])，如美国专利申请公布2009-0093543-A1中所述。
[0296] 解脂耶氏酵母的转化如美国专利申请公布2009-0093543-A1中所述进行。
[0297] 解脂耶氏酵母的脂肪酸分析
[0298] 对于脂肪酸[“FA”]分析，将细胞通过离心收集并如Bligh，E.G.和Dyer，W.J.(Can.J.Biochem.Physiol.，37：911-917(1959))所述提取脂质。通过将脂质提取物与甲醇钠进行酯交换反应而制备脂肪酸甲酯[“FAME”](Roughan，G.和Nishida I.，Arch Biochem Biophys.，第276卷，第1期，第38-46页(1990))并随后将其用配有30m×0.25mm(内径)HP-INNOWAX(Hewlett-Packard)柱的Hewlett-Packard 6890气相色谱仪(GC)进行分析。炉温以3.5℃/分钟从170℃(保持25分钟)升至185℃。
[0299] 为了进行直接的碱催化酯交换反应，收获耶氏酵母细胞(0.5mL培养物)，在蒸馏水中洗涤一次，并在Speed-Vac中在真空下干燥5-10分钟。将甲醇钠(100μl，浓度为1％)和已知量的C15:0三酰基甘油(C15:0TAG；目录号T-145，Nu-Check Prep，Elysian，MN)加入样品，然后涡旋振荡并于50℃摇动样品30分钟。加入3滴1M NaCl和400μl己烷，然后涡旋振荡并旋转样品。移除上层并用GC进行分析。
[0300] 经由GC分析记录的FAME峰值在与已知脂肪酸进行比较时通过它们的保留时间进行鉴定，并且通过比较FAME与已知量的内部标准品(C15:0TAG)的峰面积进行定量。因此，根据下式计算任何脂肪酸FAME[“μgFAME”]的近似量(μg)：(指定脂肪酸的FAME峰面积/标准品FAME峰面积)*(μg标准品C15:0TAG)，根据下式计算任何脂肪酸[“μg FA”]的量(μg)：(指定脂肪酸的FAME峰面积/标准品FAME峰面积)*(μg标准品C15:0TAG)*0.9503，因为1μg C15:0TAG等于0.9503μg脂肪酸。注意：0.9503的转换因子是大多数脂肪酸测定的近似值，其范围介于0.95和0.96之间。
[0301] 概述每种单个脂肪酸以TFA％重量表示的量的脂质特征通过用单个FAME峰面积除以所有FAME峰面积的总数并乘以100进行计算。
[0302] 就以干细胞重量的百分比[“％DCW”]测定单种脂肪酸或总脂肪酸的量而言，通过离心收集来自10mL培养物的细胞，用10mL水洗涤一次，并再次通过离心收集。细胞被重悬于1-2mL水中，倒入预先称过重的铝质称量盘中，并用1-2mL水清洗，清洗的水也被加入同一称量盘中。所述盘于80℃被置于真空下过夜。对所述盘称重，通过减去空盘的重量计算DCW。然后，能够基于μgFAME或μg FA作为μg DCW的部分计算以％DCW测定的脂肪酸(例如，FAME％DCW被计算为μg FAME/μg DCW*100)。
[0303] 实施例1
[0304] 生产占总脂肪酸约51％的EPA的解脂耶氏酵母菌株Y8406的构建
[0305] 本实施例描述了来源于解脂耶氏酵母ATCC#20362的菌株Y8406的构建，该菌株能通过Δ9延伸酶/Δ8去饱和酶途径的表达生产相对于总脂质而言约51％的EPA。该菌株在实施例4中被用作生产EPA的宿主细胞。
[0306] 菌株Y8406(图2)的开发需要构建菌株Y2224、Y4001、Y4001U、Y4036、Y4036U、L135、L135U9、Y8002、Y8006U6、Y8069、Y8069U、Y8154、Y8154U、Y8269和Y8269U。
[0307] Y4036U菌株的产生
[0308] 简而言之，菌株Y8406通过菌株Y2224(由野生型耶氏酵母菌株ATCC#20362的Ura3基因自主突变而产生的FOA抗性突变体)、菌株Y4001(产生17％EDA，具有Leu-表型)、菌株Y4001U1(Leu-和Ura-)、菌株Y4036(产生18％DGLA，具有Leu-表型)和菌株Y4036U(Leu-和Ura-)的构建，来源于解脂耶氏酵母ATCC#20362。关于菌株Y2224、Y4001、Y4001U、Y4036和Y4036U的构建的进一步细节描述于美国专利申请公布2008-0254191的一般方法部分，该文献以引用方式并入本文。
[0309] 相对于野生型解脂耶氏酵母ATCC#20362，菌株Y4036U最终的基因型为Ura3-，YAT1::ME3S::Pex16，EXP1::EgD9eS::Lip1，FBAINm::EgD9eS::Lip2，GPAT::EgD9e::Lip2，FBAINm::EgD8M::Pex20，EXP1::EgD8M::Pex16，GPD::FmD12::Pex20，YAT1::FmD12::OCT(其中FmD12是串珠镰刀菌(Fusarium moniliforme)Δ12去饱和酶基因[美国专利7,504,259]；ME3S是经密码子优化的C16/18延伸酶基因，来源于高山被孢霉[美国专利
7,470,532]；EgD9e是小眼虫Δ9延伸酶基因[美国专利7,645,604]；EgD9eS是经密码子优化的Δ9延伸酶基因，来源于小眼虫[美国专利7,645,604]；EgD8M是合成的突变型Δ8去饱和酶[美国专利7,709,239]，来源于小眼虫[美国专利7,256,033])。
7,470,532]；EgD9e是小眼虫Δ9延伸酶基因[美国专利7,645,604]；EgD9eS是经密码子优化的Δ9延伸酶基因，来源于小眼虫[美国专利7,645,604]；EgD8M是合成的突变型Δ8去饱和酶[美国专利7,709,239]，来源于小眼虫[美国专利7,256,033])。
[0310] 带有Pex3染色体缺失的L135菌株(Ura3+、Leu-、Δpex3)的产生
[0311] 菌株L135的构建描述于国际申请公布WO 2009/046248的实施例12中，该文献以引用方式并入本文。简而言之，构建体pY157被用于在菌株Y4036U中敲除编码过氧化物酶体生物发生因子3蛋白质[过氧化物酶体装配蛋白质Peroxin 3或“Pex3p”]的染色体基因，从而产生菌株L135(也被称为菌株Y4036(Δpex3))。与菌株Y4036(其天然的Pex3p未被敲除)中相比，菌株L135中染色体Pex3基因的敲除导致了下列结果：更高的脂质含量(TFAs％DCW)(大约6.0％对4.7％)，更高的DGLA％TFA(46％对19％)，更高的DGLA％DCW(大约2.8％对0.9％)和降低的LA％TFA(12％对30％)。此外，Δ9延伸酶转化效率百分数从菌株Y4036中的大约48％提高至菌株L135中的83％。
[0312] 相对于野生型解脂耶氏酵母ATCC#20362，菌株L135最终的基因型是Ura3+，Leu-，Pex3-，未知1-，YAT1::ME3S::Pex16，EXP1::EgD9eS::Lip1，FBAINm::EgD9eS::Lip2，GPAT::EgD9e::Lip2，FBAINm::EgD8M::Pex20，EXP1::EgD8M::Pex16，GPD::FmD12::Pex20，YAT1::FmD12::OCT。
[0313] L135U9(Leu-、Ura3-)菌株的构建
[0314] 通过在菌株L135中瞬时表达质粒pY116(图3；SEQ ID NO：33；描述于国际申请公布WO 2008/073367的实施例7中，该文献以引用方式并入本文)中的Cre重组酶以产生Leu-和Ura-表型，构建了菌株L135U。根据“一般方法”，将质粒pY116用于转化新鲜生长的L135细胞。将转化细胞铺在MMLeuUra平板上并在30℃下维持3至4天。挑取三个菌落，将其在30℃下接种至3mL液体YPD培养基中并以250rpm/min摇动1天。将培养物用液体MMLeuUra培养基稀释至1∶50,000，将100μL铺至新的YPD平板上并在30℃下维持2天。从三个平板中的每一个挑取八个菌落(总计24个菌落)并划线至MMLeu和MMLeuUra选择平板上。选择在MMLeuUra平板上生长但不在MMLeu平板上生长的菌落并通过GC分析来确定C20:2(EDA)的存在。具有Leu-和Ura-表型的一个菌株被命名为L135U9。
[0315] 生产占TFA约32％的ARA的Y8002菌株的构建
[0316] 构建了构建体pZKSL-5S5A5(图4A；SEQ ID NO：34)以将三种Δ5去饱和酶基因整合进菌株L135U9的Lys基因座，由此使得能够产生ARA。pZKSL-5S5A5质粒含有如下组分：
[0317] 表4：质粒pZKSL-5S5A5(SEQ ID NO：34)的描述
[0318]
[0319]
[0320] 将pZKSL-5S5A5质粒用AscI/SphI消化，然后根据“一般方法”将其用于转化菌株L135U9。将转化细胞铺在MMUraLys平板上并在30℃下维持2至3天。然后将单菌落再次划线至MMUraLys平板上，随后将其在30℃下接种至液体MMUraLys中并以250rpm/min摇动2天。根据“一般方法”，对细胞进行了脂肪酸分析。
[0321] GC分析显示，ARA存在于含有pZKSL-5S5A5的3种嵌合基因的转化体中，但不存在于亲本L135U9菌株中。将生产了占TFA约32.2％、32.9％、34.4％、32.1％和38.6％的ARA的五个菌株(即，#28、#62、#73、#84和#95)分别命名为菌株Y8000、Y8001、Y8002、Y8003和Y8004。进一步的分析显示，pZKSL-5S5A5的三种嵌合基因没有整合进Y8000、Y8001、Y8002、Y8003和Y8004菌株中的Lys5位点。所有菌株都具有Lys+表型。
[0322] 相对于野生型解脂耶氏酵母ATCC#20362，菌株Y8000、Y8001、Y8002、Y8003和Y8004最终的基因型为Ura-，Pex3-未知1-，未知2-，Leu+，Lys+，YAT1::ME3S::Pex16，GPD::FmD12::Pex20，YAT1::FmD12::Oct，GPAT::EgD9e::Lip2，FBAINm::EgD9eS::Lip2，EXP1::EgD9eS::Lip1，FBAINm::EgD8M::Pex20，EXP1::EgD8M::Pex16，FBAIN::EgD5SM::Pex20，EXP1::EgD5M::Pex16，YAT1::EaD5SM::Oct。
[0323] 生产占TFA约41％的ARA的Y8006菌株的构建
[0324] 构建了构建体pZP3-Pa777U(图4B；SEQ ID NO：39；描述于美国专利申请公布2009-0093543-A1的表9中，该文献以引用方式并入本文)，以将三种Δ17去饱和酶基因整合进菌株Y8002的Pox3基因座(GenBank登录号AJ001301)。
[0325] 将pZP3-Pa777U质粒用AscI/SphI消化，然后根据“一般方法”将其用于转化菌株Y8002。将转化细胞铺在MM平板上并在30℃下维持2至3天。然后将单菌落再次划线至MM平板上，随后将其在30℃下接种至液体MM中并以250rpm/min摇动2天。根据“一般方法”，对细胞进行了脂肪酸分析。
[0326] GC分析显示，在所选择的96个包含pZP3-Pa777U的3种嵌合基因的转化体中，大多数中存在占TFA 26％至31％的EPA，而在亲本Y8002菌株中不存在。菌株#69生产了占TFA约38％的EPA并被命名为Y8007。有一个菌株(即，菌株#9)没有生产
EPA，但是生产了占TFA约41％的ARA。该菌株被命名为Y8006。基于菌株Y8006中EPA生产的缺失，其相对于野生型解脂耶氏酵母ATCC#20362的基因型被假定为Pex3-，未知1-，未 知2-，未 知3-，Leu+，Lys+，Ura+，YAT1::ME3S::Pex16，GPD::FmD12::Pex20，YAT1::FmD12::Oct，GPAT::EgD9e::Lip2，FBAINm::EgD9eS::Lip2，EXP1::EgD9eS::Lip1，FBAINm::EgD8M::Pex20，EXP1::EgD8M::Pex16，FBAIN::EgD5SM::Pex20，
EXP1::EgD5M::Pex16，YAT1::EaD5SM::Oct。
EPA，但是生产了占TFA约41％的ARA。该菌株被命名为Y8006。基于菌株Y8006中EPA生产的缺失，其相对于野生型解脂耶氏酵母ATCC#20362的基因型被假定为Pex3-，未知1-，未 知2-，未 知3-，Leu+，Lys+，Ura+，YAT1::ME3S::Pex16，GPD::FmD12::Pex20，YAT1::FmD12::Oct，GPAT::EgD9e::Lip2，FBAINm::EgD9eS::Lip2，EXP1::EgD9eS::Lip1，FBAINm::EgD8M::Pex20，EXP1::EgD8M::Pex16，FBAIN::EgD5SM::Pex20，
EXP1::EgD5M::Pex16，YAT1::EaD5SM::Oct。
[0327] 与此相对，菌株Y8007相对于野生型解脂耶氏酵母ATCC#20362的最终基因 型 为Pex3-，未 知1-，未 知2-，未 知 3-，Leu+，Lys+，Ura+，YAT1::ME3S::Pex16，GPD::FmD12::Pex20，YAT1::FmD12::Oct，GPAT::EgD9e::Lip2，FBAINm::EgD9eS::Lip2，EXP1::EgD9eS::Lip1，FBAINm::EgD8M::Pex20，EXP1::EgD8M::Pex16，
FBAIN::EgD5SM::Pex20，EXP1::EgD5M::Pex16，YAT1::EaD5SM::Oct，YAT1::PaD17S::Lip1，EXP1::PaD17::Pex16，FBAINm::PaD17::Aco( 其 中 PaD17 是 瓜 果 腐 霉 菌 (Pythium aphanidermatum)Δ17去饱和酶[美国专利7,556,949]；PaD17S是经密码子优化的Δ17去饱和酶，来源于瓜果腐霉菌[美国专利7,556,949]。
FBAIN::EgD5SM::Pex20，EXP1::EgD5M::Pex16，YAT1::EaD5SM::Oct，YAT1::PaD17S::Lip1，EXP1::PaD17::Pex16，FBAINm::PaD17::Aco( 其 中 PaD17 是 瓜 果 腐 霉 菌 (Pythium aphanidermatum)Δ17去饱和酶[美国专利7,556,949]；PaD17S是经密码子优化的Δ17去饱和酶，来源于瓜果腐霉菌[美国专利7,556,949]。
[0328] pZP3-Pa777U的3种嵌合基因在Pox3基因座(GenBank登录号AJ001301)的整合在菌株Y8006和Y8007中未被确认。
[0329] 菌株Y8006U6(Ura3-)的构建
[0330] 为了破坏Ura3基因，构建体pZKUM(图5A；SEQ ID NO：40；描述于美国专利申请公布2009-0093543-A1的表15中，该文献以引用方式并入本文)被用于将Ura3突变型基因整合进菌株Y8006的Ura3基因。
[0331] 将质粒pZKUM用SalI/PacI消化，然后根据“一般方法”将其用于转化菌株Y8006。转化后，将细胞铺至MM+5-FOA选择平板上并在30℃下维持2至3天。
[0332] 挑取在MM+5-FOA平板上生长的总共8个转化体，并且再次分别划线接种到MM平板和MM+5-FOA平板上。所有8个菌株具有Ura-表型(即，细胞能在MM+5-FOA平板上生长，但不能在MM平板上生长)。从MM+5-FOA平板上刮下细胞，并根据“一般方法”对其进行脂肪酸分析。
[0333] GC分析显示，在生长于MM+5-FOA平板上的pZKUM-转化体菌株#1、#2、#4、#5、#6和#7中，分别存在占TFA 22.9％、25.5％、23.6％21.6％、21.6％和25％的ARA。这六个菌株分别被命名为菌株Y8006U1、Y8006U2、Y8006U3、Y8006U4、Y8006U5和Y8006U6(统称为Y8006U)。
[0334] 生产占TFA约37.5％的EPA的Y8069菌株的构建
[0335] 构建体pZP3-Pa777U(图4B；SEQ ID NO：39；描述于美国专利申请公布2009-0093543-A1的表9中，该文献以引用方式并入本文)被用于将三种Δ17去饱和酶基因整合进菌株Y8006U6的Pox3基因座(GenBank登录号AJ001301)。
[0336] 将pZP3-Pa777U质粒用AscI/SphI消化，然后根据“一般方法”将其用于转化菌株Y8006U6。将转化细胞铺在MM平板上并在30℃下维持2至3天。然后将单菌落再次划线至MM平板上，随后将其在30℃下接种至液体MM中并以250rpm/min摇动2天。根据“一般方法”，对细胞进行了脂肪酸分析。
[0337] GC分析显示，EPA存在于含有pZP3-Pa777U的3种嵌合基因的转化体中，但不存在于亲本Y8006U6菌株中。所择选的24个菌株中大部分产生占TFA 24-37％的EPA。将生产了占TFA约37.5％、43.7％、37.9％和37.5％的EPA的四个菌株(即，#1、#6、#11和#14)分别命名为菌株Y8066、Y8067、Y8068和Y8069。pZP3-Pa777U的3种嵌合基因在菌株Y8066、Y8067、Y8068和Y8069的Pox3基因座(GenBank登录号AJ001301)的整合未被确认。
[0338] 菌株Y8066、Y8067、Y8068和Y8069相对于野生型解脂耶氏酵母ATCC#20362的最终基因型为Ura+，Pex3-，未知1-，未知2-，未知3-，未 知4-，Leu+，Lys+，YAT1::ME3S::Pex16，GPD::FmD12::Pex20，YAT1::FmD12::Oct，GPAT::EgD9e::Lip2，FBAINm::EgD9eS::Lip2，EXP1::EgD9eS::Lip1，FBAINm::EgD8M::Pex20，EXP1::EgD8M::Pex16，FBAIN::EgD5SM::Pex20，EXP1::EgD5M::Pex16，YAT1::EaD5SM::Oct，YAT1::PaD17S::Lip1，EXP1::PaD17::Pex16，FBAINm::PaD17::Aco。
[0339] 菌株Y8069U(Ura3-)的构建
[0340] 为了破坏Ura3基因，构建体pZKUM(图5A；SEQ ID NO:40；描述于美国专利申请公布2009-0093543-A1的表15中)以与关于pZKUM对菌株Y8006的转化所述的(参见上文)相似的方式，被用于将Ura3突变型基因整合进菌株Y8069的Ura3基因中。总计3个转化体被培养并被鉴定为具有Ura-表型。
[0341] GC分析显示，在生长于MM+5-FOA平板上的pZKUM-转化体菌株#1、#2和#3中，分别存在占TFA 22.4％、21.9％和21.5％的EPA。这三个菌株分别被命名为菌株Y8069U1、Y8069U2、和Y8069U3(统称为Y8069U)。
[0342] 生产占TFA约44.8％的EPA的菌株Y8154的构建
[0343] 构建了构建体pZKL2-5mB89C(图5B；SEQ ID NO：41)，以将一个Δ5延伸酶基因、一个Δ9延伸酶基因、一个Δ8去饱和酶基因和一个解脂耶氏酵母二酰基甘油胆碱磷酸转移酶基因(CPT1)整合到菌株Y8069U3的Lip2位点(GenBank登录号AJ012632)中，从而使得能产生更高水平的EPA。pZKL2-5mB89C质粒含有如下组分：
[0344] 表5：质粒pZKL2-5mB89C(SEO ID NO：41)的描述
[0345]
[0346]
[0347] 将pZKL2-5mB89C质粒用AscI/SphI消化，然后根据“一般方法”将其用于转化菌株Y8069U3。将转化细胞铺在MM平板上并在30℃下维持3至4天。将单菌落再次划线至MM平板上，随后将其在30℃下接种至液体MM中并以250rpm/min摇动2天。通过离心收集细胞，将其重悬浮于HGM中，然后以250rpm/min摇动5天。根据“一般方法”，对细胞进行了脂肪酸分析。
[0348] GC分析显示，所选择的96个菌株中大多数生产占TFA大约38-44％的EPA。将生产了占TFA约44.7％、45.2％、45.4％、44.8％、46.1％、48.6％和45.9％的EPA的七个菌株(即，#1、#39、#49、#62、#70、#85和#92)分别命名为菌株Y8151、Y8152、Y8153、Y8154、Y8155、Y8156和Y8157。在这些EPA菌株中，Lip2基因的敲除未被确认。
[0349] 菌株Y8151、Y8152、Y8153、Y8154、Y8155、Y8156和Y8157相对于野生型解脂耶氏酵母ATCC#20362的最终基因型为Ura+，Pex3-，未知1-，未知2-，未知3-，未知4-，未知 5-，Leu+，Lys+，YAT1::ME3S::Pex16，FBAINm::EgD9eS::Lip2，EXP1::EgD9eS::Lip1，GPAT::EgD9e::Lip2，YAT1::EgD9eS::Lip2，FBAINm::EgD8M::Pex20，EXP1::EgD8M::Pex16，FBAIN::EgD8M::Lip1，GPD::FmD12::Pex20，YAT1::FmD12::Oct，EXP1::EgD5M::Pex16，YAT1::EaD5SM::Oct，FBAIN::EgD5SM::Pex20，GPDIN::EgD5SM::Aco，FBAINm::PaD17::Aco，EXP1::PaD17::Pex16，YAT1::PaD17S::Lip1，YAT1::Y1CPT::Aco。
[0350] 菌株Y8154U1(Ura3-)的构建
[0351] 为了破坏Ura3基因，构建体pZKUM(图5A；SEQ ID NO：40；描述于美国专利申请公布2009-0093543-A1的表15中)以与关于pZKUM对菌株Y8006的转化所述的(参见上文)相似的方式，被用于将Ura3突变型基因整合进菌株Y8154的Ura3基因中。总计8个转化体被培养并被鉴定为具有Ura-表型。
[0352] GC分析显示，在pZKUM-转化体菌株#7中有占TFA 23.1％的EPA。该菌株被命名为菌株Y8154U1。
[0353] 生产占TFA约45.3％的EPA的菌株Y8269的构建
[0354] 构建了构建体pZKL1-2SR9G85(图6A；SEQ ID NO：48)，以将一个DGLA合酶、一个Δ12去饱和酶基因和一个Δ5去饱和酶基因整合到菌株Y8154U1的Lip1基因座(GenBank登录号Z50020)中，从而使得能产生更高水平的EPA。DGLA合酶是复合酶，包括连接到Δ8去饱和酶的Δ9延伸酶(美国专利申请公布2008-0254191-A1)。
[0355] pZKL1-2SR9G85质粒含有如下组分：
[0356] 表6：质粒pZKL1-2SR9G85(SEQ ID NO：48)的描述
[0357]
[0358]
[0359] 将pZKL1-2SR9G85质粒用AscI/SphI消化，然后根据“一般方法”将其用于转化菌株Y8154U1。将转化细胞铺在MM平板上并在30℃下维持3至4天。将单菌落再次划线至MM平板上，随后将其在30℃下接种至液体MM中并以250rpm/min摇动2天。通过离心收集细胞，将其重悬浮于HGM中，然后以250rpm/min摇动5天。根据“一般方法”，对细胞进行了脂肪酸分析。
[0360] GC分析显示，所选择的96个菌株中大多数生产占总脂质40-44.5％的EPA。将生产了占TFA约44.8％、45.3％、47％、44.6％和44.7％的EPA的五个菌株(即，#44、#46、#47、#66和#87)分别命名为菌株Y8268、Y8269、Y8270、Y8271和Y8272。在这些EPA菌株中，Lip1基因座的敲除(GenBank登录号Z50020)未被确认。
[0361] 菌 株Y8268、Y8269、Y8270、Y8271和Y8272 相 对 于 野 生 型 解 脂 耶 氏 酵母ATCC#20362的最终基因型为Ura+，Pex3-，未知1-，未知2-，未知3-，未知4-，未知 5-， 未 知 6-，YAT1::ME3S::Pex16，FBAINm::EgD9eS::Lip2，EXP1::EgD9eS::Lip1，GPAT::EgD9e::Lip2，YAT1::EgD9eS::Lip2，FBAINm::EgD8M::Pex20，EXP1::EgD8M::Pex16，FBAIN::EgD8M::Lip1，YAT1::E389D9eS/EgD8M::Lip1，GPD::FmD12::Pex20，YAT1::FmD12::Oct，EXP1::FmD12S::Aco，EXP1::EgD5M::Pex16，YAT1::EaD5SM::Oct，FBAIN::EgD5SM::Pex20，GPDIN::EgD5SM::Aco，GPM::EgD5SM::Oct，FBAINm::PaD17::Aco，EXP1::PaD17::Pex16，YAT1::PaD17S::Lip1，YAT1::YlCPT::Aco。
[0362] 菌株Y8269U(Ura3-)的构建
[0363] 为了破坏Ura3基因，构建体pZKUM(图5A；SEQ ID NO:40；描述于美国专利申请公布2009-0093543-A1的表15中)以与关于pZKUM对菌株Y8006的转化所述的(参见上文)相似的方式，被用于将Ura3突变型基因整合进菌株Y8269的Ura3基因中。总计8个转化体被培养并被鉴定为具有Ura-表型。
[0364] GC分析显示，在pZKUM-转化体菌株#2、#3和#5中分别有占TFA23.0％、23.1％和24.2％的EPA。这些菌株分别被命名为菌株Y8269U1、Y8269U2和Y8269U3(统称为Y8269U)。
[0365] 生产占TFA约51.2％EPA和55.8％的菌株Y8406和菌株Y8412的构建
[0366] 构建了构建体pZSCP-Ma83(图6B；SEQ ID NO：53)，以将一种Δ8去饱和酶基因、一种C16/18延伸酶基因和一种丙二酰-辅酶A合成酶基因整合进菌株Y8269U1的SCP2基因座(GenBank登录号XM_503410)，从而使得能生产高水平的EPA。pZSCP-Ma83质粒含有如下组分：
[0367] 表7：质粒pZSCP-Ma83(SEQ ID NO：53)的描述
[0368]
[0369]
[0370] 将pZSCP-Ma83质粒用AscI/SphI消化，根据“一般方法”将其用于分别地转化菌株Y8269U1、Y8269U2和Y8269U3。将转化细胞铺在MM平板上并在30℃下维持3至4天。将单菌落再次划线至MM平板上，随后将其在30℃下接种至液体MM中并以250rpm/min摇动2天。通过离心收集细胞，将其重悬浮于HGM中，然后以250rpm/min摇动5天。根据“一般方法”，对细胞进行了脂肪酸分析。
[0371] 通过GC对来自每一pZSCP-Ma83转化(即转入Y8269U1、Y8269U2和Y8269U3)的总计96个菌株进行了分析。所择选的288个菌株中大部分产生占TFA 43-47％的EPA。将生产了占TFA约51.3％、47.9％、50.8％、48％、47.8％、47.8％和47.8％的EPA的用pZSCP-Ma83转化的七个Y8269U1菌株(即，#59、#61、#65、#67、#70、#81和#94)分别命名为菌株Y8404、Y8405、Y8406、Y8407、Y8408、Y8409和Y8410。将生产了占TFA约48.8％、50.8％、和49.3％的EPA的用pZSCP-Ma83转化的三个Y8269U2菌株(即，#4、#13和#17)分别命名为菌株Y8411、Y8412和Y8413。并且，将生产了占TFA约49.3％和53.5％的EPA的用pZSCP-Ma83转化的两个Y8269U3菌株(即，#2，和#16)分别命名为菌株Y8414和Y8415。
[0372] 在任何的这些通过用pZSCP-Ma83转化产生的EPA菌株中，SCP2基因座(GenBank登录号XM_503410)的敲除未被确认。
[0373] 菌株Y8404、Y8405、Y8406、Y8407、Y8408、Y8409、Y8410、Y8411、Y8412、Y8413、Y8414和Y8415相对于野生型解脂耶氏酵母ATCC#20362的最终基因型为Ura+，Pex3-，未知1-，未知2-，未知3-，未知4-，未知5-，未知6-，未知7-，YAT1::ME3S::Pex16，GPD::ME3S::Pex20，FBAINm::EgD9eS::Lip2，EXP1::EgD9eS::Lip1，GPAT::EgD9e::Lip2，YAT1::EgD9eS::Lip2，FBAINm::EgD8M::Pex20，EXP1::EgD8M::Pex16，FBAIN::EgD8M::Lip1，GPD::EaD8S::Pex16，YAT1::E389D9eS/EgD8M::Lip1，GPD::FmD12::Pex20，YAT1::FmD12::Oct，EXP1::FmD12S::Aco，EXP1::EgD5M::Pex16，YAT1::EaD5SM::Oct，FBAIN::EgD5SM::Pex20，GPDIN::EgD5SM::Aco，GPM::EgD5SM::Oct，FBAINm::PaD17::Aco，EXP1::PaD17::Pex16，YAT1::PaD17S::Lip1，YAT1::Y1CPT::Aco，YAT1::MCS::Lip1。
[0374] 解脂耶氏酵母菌株Y8406于2009年5月14日被保藏于美国典型培养物保藏中心，并被命名为ATCC PTA-10025。解脂耶氏酵母菌株Y8412于2009年5月14日被保藏于美国典型培养物保藏中心，并被命名为ATCCPTA-10026。
[0375] 通过烧瓶检测法对总脂质含量和组成的分析
[0376] 培养了来自YPD平板的菌株Y8404、Y8405、Y8406、Y8407、Y8408、Y8409、Y8410、Y8411、Y8412、Y8413、Y8414和Y8415的细胞并就总脂质含量和组成对它们进行了分析，如下所述。
[0377] 具体而言，一个接种环的新鲜划线的细胞被接种至3mL FM培养基，并于30℃以250rpm培养过夜。测量OD600nm，在125mL烧瓶中，加入一个等分试样的细胞，使得25mL FM培养基中最终的OD600nm为0.3。在30℃振荡培养箱中以250rpm培养2天后，通过离心收集
6mL培养物，并在125mL烧瓶中重悬于25mL HGM中。30℃振荡培养箱中以250rpm培养5天后，使用1mL等分试样进行脂肪酸分析(同上)，并且干燥10mL用于干细胞重量[“DCW”]测定。
6mL培养物，并在125mL烧瓶中重悬于25mL HGM中。30℃振荡培养箱中以250rpm培养5天后，使用1mL等分试样进行脂肪酸分析(同上)，并且干燥10mL用于干细胞重量[“DCW”]测定。
[0378] 就DCW测定而言，通过在Beckman GS-6R离心机的Beckman GH-3.8转子中以4000rpm离心5分钟，收集了10mL培养物。沉淀被重悬于25mL水中，并如上文所述重新收集。将洗涤后的沉淀物重悬在20mL水中并转移到预先称过重的铝盘上。在80℃的真空炉中干燥上述细胞悬浮液过夜。测定细胞的重量。
[0379] 来自烧瓶检测法的数据显示为表8。该表显示了所述细胞的总的干细胞重量[“DCW”]、细胞的总脂质含量[“FAME％DCW”]、以TFA的％重量[“％TFA”]表示的每种脂肪酸的浓度和以干细胞％重量表示的EPA含量[“EPA FAME％DCW”]。更具体地讲，脂肪酸将被鉴定为16:0(棕榈酸)、16:1(棕榈油酸)、18:0(硬脂酸)、18:1(油酸)、18:2(LA)、ALA、EDA、DGLA、ARA、ETrA、ETA、EPA和其他。
[0380]
[0381] 菌株Y8406U(Ura3-)的构建
[0382] 为了破坏Ura3基因，构建体pZKUM(图5A；SEQ ID NO：40；描述于美国专利申请公布2009-0093543-A1的表15中)以与关于pZKUM对菌株Y8006的转化所述的(参见上文)相似的方式，被用于将Ura3突变型基因整合进菌株Y8406的Ura3基因中。若干个转化体被培养并被鉴定为具有Ura-表型。
[0383] GC分析显示，在pZKUM-转化体菌株#4和#5中有占FAME 26.1％的EPA。这两个菌株分别被命名为菌株Y8406U1和Y8406U2(统称为Y8406U)。
[0384] 实施例2
[0385] 生产占总脂肪酸约18.6％的EPA、22.8％的DPA和9.7％的DHA的解脂耶氏酵母菌株Y5037的构建
[0386] 本实施例描述了来源于解脂耶氏酵母ATCC#20362的菌株Y5037的构建，该菌株能通过Δ9延伸酶/Δ8去饱和酶途径的表达生产相对于总脂质而言约18.6％的EPA、22.8％的DPA和9.7％的DHA。该菌株在实施例5中被用作生产DHA的宿主细胞。
[0387] 简而言之，如图7中所示，菌株Y5037通过菌株Y2224(由野生型耶氏酵母菌株ATCC#20362的Ura3基因自主突变而产生的FOA抗性突变体)、菌株Y4001(产生17％EDA，具有Leu-表型)、菌株Y4001U1(Leu-和Ura-)、菌株Y4036(产生18％DGLA，具有Leu-表型)、菌株Y4036U(Leu-和Ura-)、菌株Y4070(产生12％ARA，具有Ura-表型)、菌株Y4086(产生14％EPA)、菌株Y4086U1(Ura3-)、菌株Y4128(产生37％EPA；于2007年8月23日保藏于美国典型培养物保藏中心，并被命名为ATCC PTA-8614)、菌株Y4128U3(Ura-)、菌株Y4217(产生42％EPA)、菌株Y4217U2(Ura-)、菌株Y4259(产生46.5％EPA)、菌株Y4259U2(Ura-)、菌株Y4305(产生53.2％EPA)、菌株Y4305U3(Ura-)、菌株Y5004(产生
17％EPA、18.7％DPA和6.4％DHA)、菌株Y5004U1(Ura-)、菌株Y5018(产生25.4％EPA、
11.4％DPA和9.4％DHA)、菌株Y5018U1(Ura-)和菌株Y5037(产生相对于总的TFA 18.6％的EPA、22.8％的DPA和9.7％的DHA)的构建，来源于解脂耶氏酵母ATCC#20362。关于菌株Y2224、Y4001、Y4001U、Y4036、Y4036U、Y4070、Y4086、Y4086U1、Y4128、Y4128U3、Y4217、Y4217U2、Y4259、Y4259U2、Y4305和Y4305U3的构建的进一步细节描述于美国专利申请公布
2008-0254191-A1的一般方法部分和美国专利申请公布2009-0093543-A1的实施例1-3中，上述文献以引用方式并入本文。
17％EPA、18.7％DPA和6.4％DHA)、菌株Y5004U1(Ura-)、菌株Y5018(产生25.4％EPA、
11.4％DPA和9.4％DHA)、菌株Y5018U1(Ura-)和菌株Y5037(产生相对于总的TFA 18.6％的EPA、22.8％的DPA和9.7％的DHA)的构建，来源于解脂耶氏酵母ATCC#20362。关于菌株Y2224、Y4001、Y4001U、Y4036、Y4036U、Y4070、Y4086、Y4086U1、Y4128、Y4128U3、Y4217、Y4217U2、Y4259、Y4259U2、Y4305和Y4305U3的构建的进一步细节描述于美国专利申请公布
2008-0254191-A1的一般方法部分和美国专利申请公布2009-0093543-A1的实施例1-3中，上述文献以引用方式并入本文。
[0388] 菌株Y4305的完全脂质分布如下：16:0(2.8％)、16:1(0.7％)、18:0(1.3％)、18:1(4.9％)、18:2(17.6％)、ALA(2.3％)、EDA(3.4％)、DGLA(2.0％)、ARA(0.6％)、ETA(1.7％)、和EPA(53.2％)。细胞的总脂质含量[“TFAs％DCW”]为27.5。
[0389] 菌株Y4305相对于野生型解脂耶氏酵母ATCC#20362的最终基因型为SCP2-(YALI0E01298g)，YALI0C18711g-，Pex10-，YALI0F24167g-，未 知 1-，未 知 3-，未 知 8-，GPD::FmD12::Pex20，YAT1::FmD12::OCT，GPM/FBAIN::FmD12S::OCT，EXP1::FmD12S::Aco，YAT1::FmD12S::Lip2，YAT1::ME3S::Pex16，EXP1::ME3S::Pex20(3拷 贝 )，GPAT::EgD9e::Lip2，EXP1::EgD9eS::Lip1，FBAINm::EgD9eS::Lip2，
FBA::EgD9eS::Pex20，GPD::EgD9eS::Lip2，YAT1::EgD9eS::Lip2，YAT1::E389D9eS::OCT，FBAINm::EgD8M::Pex20，FBAIN::EgD8M::Lip1(2 拷 贝 )，EXP1::EgD8M::Pex16，GPDIN::EgD8M::Lip1，YAT1::EgD8M::Aco，FBAIN::EgD5::Aco，EXP1::EgD5S::Pex20，YAT1::EgD5S::Aco，EXP1::EgD5S::ACO，YAT1::RD5S::OCT，YAT1::PaD17S::Lip1，EXP1::PaD17::Pex16，FBAINm::PaD17::Aco，YAT1::YlCPT1::ACO，GPD::YlCPT1::ACO(其中FmD12是串珠镰刀菌Δ12去饱和酶基因[美国专利7,504,259]；FmD12S是经密码子优化的Δ12去饱和酶基因，来源于串珠镰刀菌，[美国专利7,504,259]；ME3S是经密码子优化的C16/18延伸酶基因，来源于高山被孢霉[美国专利7,470,532]；EgD9e是小眼虫Δ9延伸酶基因[美国专利7,645,604]；EgD9eS是经密码子优化的Δ9延伸酶基因，来源于小眼虫[美国专利7,645,604]；E389D9eS是经密码子优化的Δ9延伸酶基因，来源于小型绿藻属(Eutreptiella sp.)CCMP389[美国专利7,645,604]；EgD8M是合成的突变型Δ8去饱和酶[美国专利7,709,239]，来源于小眼虫[美国专利7,256,033]；EgD5是小眼虫Δ5去饱和酶[美国专利7,678,560]；EgD5S是经密码子优化的Δ5去饱和酶基因，来源于小眼虫[美国专利7,678,560]；RD5S是经密码子优化的Δ5去饱和酶，来源于多甲藻属(Peridinium sp.)CCMP626[美国专利7,695,950]；PaD17是瓜果腐霉菌(Pythium aphanidermatum)Δ17去饱和酶[美国专利7,556,949]；PaD17S是经密码子优化的Δ17去饱和酶，来源于瓜果腐霉菌[美国专利7,556,949]；以及，YlCPT1是解脂耶氏酵母二酰基甘油磷酸胆碱转移酶基因[国际申请公布WO2006/052870])。
FBA::EgD9eS::Pex20，GPD::EgD9eS::Lip2，YAT1::EgD9eS::Lip2，YAT1::E389D9eS::OCT，FBAINm::EgD8M::Pex20，FBAIN::EgD8M::Lip1(2 拷 贝 )，EXP1::EgD8M::Pex16，GPDIN::EgD8M::Lip1，YAT1::EgD8M::Aco，FBAIN::EgD5::Aco，EXP1::EgD5S::Pex20，YAT1::EgD5S::Aco，EXP1::EgD5S::ACO，YAT1::RD5S::OCT，YAT1::PaD17S::Lip1，EXP1::PaD17::Pex16，FBAINm::PaD17::Aco，YAT1::YlCPT1::ACO，GPD::YlCPT1::ACO(其中FmD12是串珠镰刀菌Δ12去饱和酶基因[美国专利7,504,259]；FmD12S是经密码子优化的Δ12去饱和酶基因，来源于串珠镰刀菌，[美国专利7,504,259]；ME3S是经密码子优化的C16/18延伸酶基因，来源于高山被孢霉[美国专利7,470,532]；EgD9e是小眼虫Δ9延伸酶基因[美国专利7,645,604]；EgD9eS是经密码子优化的Δ9延伸酶基因，来源于小眼虫[美国专利7,645,604]；E389D9eS是经密码子优化的Δ9延伸酶基因，来源于小型绿藻属(Eutreptiella sp.)CCMP389[美国专利7,645,604]；EgD8M是合成的突变型Δ8去饱和酶[美国专利7,709,239]，来源于小眼虫[美国专利7,256,033]；EgD5是小眼虫Δ5去饱和酶[美国专利7,678,560]；EgD5S是经密码子优化的Δ5去饱和酶基因，来源于小眼虫[美国专利7,678,560]；RD5S是经密码子优化的Δ5去饱和酶，来源于多甲藻属(Peridinium sp.)CCMP626[美国专利7,695,950]；PaD17是瓜果腐霉菌(Pythium aphanidermatum)Δ17去饱和酶[美国专利7,556,949]；PaD17S是经密码子优化的Δ17去饱和酶，来源于瓜果腐霉菌[美国专利7,556,949]；以及，YlCPT1是解脂耶氏酵母二酰基甘油磷酸胆碱转移酶基因[国际申请公布WO2006/052870])。
[0390] 菌株Y4305U(Ura3-)通过将Ura3突变型基因整合进菌株Y4305的Ura3基因产生。
[0391] 生产占TFA约17.0％的EPA、18.7％的DPA和6.4％的DHA的Y5004菌株的构建[0392] 构建了构建体pZKL4-220EA41B(图8A；SEQ ID NO：60)，以将两种C20/22延伸酶基因和两种Δ4去饱和酶基因整合进菌株Y4305U3的脂肪酶4-样基因座(GenBank登录号XM_503825)。pZKL4-220EA41B质粒包含如下组分：
[0393] 表9：质粒pZKL4-220EA41B(SEQ ID NO：60)的组分
[0394]
[0395]
[0396] 将pZKL4-220EA41B质粒用AscI/SphI消化，然后根据“一般方法”将其用于转化菌株Y4305U3(参见上文)。在MM平板上选择转化株。在30℃生长5天后，采集在MM平板上生长的72个转化子并再划线接种到新制MM平板上。生长之后，将这些菌株单个地接种在30℃下的3mL液体MM中，以250rpm/min摇动2天。通过离心收集细胞，将其重悬浮于HGM中，然后以250rpm/min摇动5天。根据“一般方法”，对细胞进行了脂肪酸分析。
[0397] GC分析显示，在采用pZKL4-220EA41B的转化体中存在DHA，但在亲本Y4305U菌株中不存在。所选择的72个菌株中，大多数生产占TFA约22％的EPA、18％的DPA和5％的DHA。菌株#2生产了17％的EPA、18.7％的DPA和6.4％的DHA，而菌株#33生产了21.5％的EPA、21％的DPA和5.5％的DHA。这两个菌株被分别命名为Y5004和Y5005。
[0398] 在菌株Y5004或Y5005中，脂肪酶4-样基因座(GenBank登录号XM_503825)的敲除均未被确认。
[0399] 菌株Y5004U(Ura3-)的构建
[0400] 为了破坏Ura3基因，构建体pZKUM(图5A；SEQ ID NO：40；描述于美国专利申请公布2009-0093543-A1的表15中)以与关于pZKUM对菌株Y8006的转化所述的(实施例1)相似的方式，被用于将Ura3突变型基因整合进菌株Y5004的Ura3基因中。
[0401] 挑取在MM+5-FOA平板上生长的总共8个转化体，并且再次分别划线接种到MM平板和MM+5-FOA平板上。所有8个菌株具有Ura-表型(即，细胞能在MM+5-FOA平板上生长，但不能在MM平板上生长)。从MM+5-FOA平板上刮下细胞，并根据“一般方法”对其进行脂肪酸分析。
[0402] GC分析显示，在转化体#5中存在占TFA 14.8％的EPA、17.4％的DPA和0.4％的DHA，在转化体#8中存在占TFA 15.3％的EPA、17.2％的DPA和0.4％的DHA。这两个菌株分别被命名为菌株Y5004U1和Y5004U2(统称为Y5004U)。
[0403] 生产占TFA约25.4％的EPA、11.4％的DPA和9.4％的DHA的Y5018菌株的构建[0404] 构建了构建体pZKL3-4GER44(图8B；SEQ ID NO：69)，以将一种C20/22延伸酶基因和三种Δ4去饱和酶基因整合进菌株Y5004U1的脂肪酶3-样基因座(GenBank登录号XP_506121)。pZKL3-4GER44质粒包含如下组分：
[0405] 表10：质粒pZKL3-4GER44(SEQ ID NO：69)的组分
[0406]
[0407]
[0408] 将pZKL3-4GER44质粒用AscI/SphI消化，然后根据“一般方法”将其用于转化菌株Y5004U1。在MM平板上选择转化株。在30℃生长5天后，采集在MM平板上生长的96个转化子并再划线接种到新制MM平板上。生长之后，将这些菌株单个地接种在30℃下的3mL液体MM中，以250rpm/min摇动2天。通过离心收集细胞，将其重悬浮于HGM中，然后以250rpm/min摇动5天。根据“一般方法”，对细胞进行了脂肪酸分析。
[0409] GC分析显示，所选择的96个菌株中，大多数生产占TFA约19％的EPA、22％的DPA和7％的DHA。菌株#1生产了23.3％的EPA、13.7％的DPA和8.9％的DHA，而菌株#49生产了25.2％的EPA、11.4％的DPA和9.4％的DHA。这两个菌株被分别命名为Y5011和Y5018。
[0410] 在菌株Y5011和Y5018中，脂肪酶3-样基因座(GenBank登录号XP_506121)的敲除未被确认。
[0411] 菌株Y5018U(Ura3-)的构建
[0412] 为了破坏Ura3基因，构建体pZKUM(图5A；SEQ ID NO：40；描述于美国专利申请公布2009-0093543-A1的表15中)以与关于pZKUM对菌株Y8006的转化所述的(实施例1)相似的方式，被用于将Ura3突变型基因整合进菌株Y5018的Ura3基因中。总计18个转化体被培养并被鉴定为具有Ura-表型。
[0413] GC分析显示，在pZKUM-转化体菌株#2中存在占FAME 16.6％的EPA、10.4％的DPA和0.0％的DHA，在pZKUM-转化体菌株#4中存在占FAME17.0％的EPA、10.8％的DPA和0.0％的DHA。这两个菌株分别被命名为菌株Y5018U1和Y5018U2(统称为Y5018U)。
[0414] 生产占TFA约18.6％的EPA、22.8％的DPA和9.7％的DHA的Y5037菌株的构建[0415] 构建了构建体pZKLY-G20444(图9；SEQ ID NO：74)，以将一种DHA合酶和两种Δ4去饱和酶基因整合进菌株Y5018U1的脂肪酶7-样基因座(GenBank登录号AJ549519)。DHA合酶是复合酶，包括连接到Δ4去饱和酶的C20延伸酶。pZKLY-G20444质粒包含如下组分：
[0416] 表11：质粒pZKLY-G20444(SEQ ID NO：74)的组分
[0417]
[0418]
[0419] 将pZKLY-G20444质粒用AscI/SphI消化，然后根据“一般方法”将其用于转化菌株Y5018U1。在MM平板上选择转化株。在30℃生长5天后，采集在MIM平板上生长的96个转化子并再划线接种到新制MM平板上。生长之后，将这些菌株单个地接种在30℃下的3mL液体MM中，以250rpm/min摇动2天。通过离心收集细胞，将其重悬浮于HGM中，然后以
250rpm/min摇动5天。根据“一般方法”，对细胞进行了脂肪酸分析。
250rpm/min摇动5天。根据“一般方法”，对细胞进行了脂肪酸分析。
[0420] GC分析显示，所选择的96个菌株中，大多数生产占TFA约19％的EPA、22％的DPA和9％的DHA。菌株#3生产了18.6％的EPA、22.8％的DPA和9.7％的DHA；菌株#9生产了18.4％的EPA、21％的DPA和的9.6％DHA；菌株#27生产了17.8％的EPA、20.6％的DPA和
10％的DHA；而菌株#40生产了18.8％的EPA、21.2％的DPA和9.6％的DHA。这四个菌株分别被命名为Y5037、Y5038、Y5039和Y5040。
10％的DHA；而菌株#40生产了18.8％的EPA、21.2％的DPA和9.6％的DHA。这四个菌株分别被命名为Y5037、Y5038、Y5039和Y5040。
[0421] 在这些敲除菌株中，脂肪酶7-样基因座(GenBank登录号AJ549519)的敲除未被确认。
[0422] 菌株Y5037、Y5038、Y5039和Y5040相对于野生型解脂耶氏酵母ATCC#20362的最终基因型为SCP2-(YALI0E01298g)，YALI0C18711g-，Pex10-，YALI0F24167g-，未知1-，未知3-，未知8-，未知9-，未知10-，未知11-，GPD::FmD12::Pex20，YAT1::FmD12::OCT，GPM/FBAIN::FmD12S::OCT，EXP1::FmD12S::Aco，YAT1::FmD12S::Lip2，YAT1::ME3S::Pex16，EXP1::ME3S::Pex20(3 拷 贝 )，GPAT::EgD9e::Lip2，EXP1::EgD9eS::Lip1，FBAINm::EgD9eS::Lip2，FBA::EgD9eS::Pex20，GPD::EgD9eS::Lip2，YAT1::EgD9eS::Lip2，YAT1::E389D9eS::OCT，FBAINm::EgD8M::Pex20，FBAIN::EgD8M::Lip1(2 拷 贝 )，EXP1::EgD8M::Pex16，GPDIN::EgD8M::Lip1，YAT1::EgD8M::Aco，FBAIN::EgD5::Aco，EXP1::EgD5S::Pex20，YAT1::EgD5S::Aco，EXP1::EgD5S::ACO，YAT1::RD5S::OCT，YAT1::PaD17S::Lip1，EXP1::PaD17::Pex16，FBAINm::PaD17::Aco，YAT1::YlCPT1::ACO，GPD::YlCPT1::ACO，FBAINm::EaC20ES::Pex20，YAT1::EgC20ES::Lip1，
FBAINm::EgC20ES::Pex20，EXP1::EaD4S-1::Lip2，EXP1::EaD4S-1::Pex16，
YAT1::EaD4S-1::Lip1，GPDIN::EaD4SB::Aco，EXP1::E1594D4S::Oct，
FBAINm::E1594D4S::Pex16，GPDIN::EgD4S-1::Aco，YAT1::EgDHAsyn1S::Lip1。
FBAINm::EgC20ES::Pex20，EXP1::EaD4S-1::Lip2，EXP1::EaD4S-1::Pex16，
YAT1::EaD4S-1::Lip1，GPDIN::EaD4SB::Aco，EXP1::E1594D4S::Oct，
FBAINm::E1594D4S::Pex16，GPDIN::EgD4S-1::Aco，YAT1::EgDHAsyn1S::Lip1。
[0423] 菌株Y5037U(Ura3-)的构建
[0424] 为了破坏Ura3基因，构建体pZKUM(图5A；SEQ ID NO：40；描述于美国专利申请公布2009-0093543-A1的表15中)以与关于pZKUM对菌株Y5004的转化所述的(参见上文)相似的方式，被用于将Ura3突变型基因整合进菌株Y5037的Ura3基因中。总计12个转化体被培养并被鉴定为具有Ura-表型。
[0425] GC分析显示，在pZKUM-转化体菌株#4中存在12.1％的EPA、10.2％的DPA和3.3％的DHA，在pZKUM-转化体菌株#11中存在12.4％的EPA、10.3％的DPA和3.5％的DHA。
这两个菌株分别被命名为菌株Y5037U1和Y5037U2(统称为Y5037U)。
这两个菌株分别被命名为菌株Y5037U1和Y5037U2(统称为Y5037U)。
[0426] 实施例3
[0427] 包含不同LPLAT开放阅读框的不同表达载体的构建
[0428] 本实施例描述了一系列载体的构建，每种载体包含适合在解脂耶氏酵母中的表达的LPLAT开放阅读框。LPLAT开放阅读框包括啤酒糖酵母Ale1、解脂耶氏酵母Ale1、高山被孢霉LPAAT1、解脂耶氏酵母LPAAT1和秀丽隐杆线虫LPCAT。实施例4、5和6描述了将这些载体转入解脂耶氏酵母之后获得的结果。
[0429] LPLAT的起源
[0430] 在专利文献和公开文献中，已有多种LPLAT被鉴定，但这些基因的官能度此前还未被直接比较。表12总结了可公开获得的LPLAT(即，ScAle1、ScLPAAT、MaLPAAT1和CeLPCAT)和本文中鉴定的LPLAT直系同源物(即，YlAle1和YlLPAAT1)，在就在解脂耶氏酵母中的表达对异源基因进行密码子优化之后(参见下文)，这些基因被用于实施例中。
[0431] 表12：功能性描述的LPLAT
[0432]
[0433]
[0434] *啤酒糖酵母Ale1和秀丽隐杆线虫LPCAT被用作比较实施例。
[0435] 更具体地讲，利用华盛顿大学圣路易斯医学院(St.Louis School of Medicine)的 BLAST 2.0(WU-BLAST；http://blast.wustl.edu)，ScLPAAT(SEQ ID NO：18) 和ScAle1(SEQ ID NO：9)蛋白质序列被用作查询序列，以从“Yeast project Genolevures(酵母基因组计划)” (Center for Bioinformatics，LaBRI，Talence Cedex，France)(另参见Dujon，B.等人，Nature，430(6995)：35-44(2004))的公开的解脂耶氏酵母蛋白质数据库鉴定直系同源物。基于对最佳匹配结果的分析，来自解脂耶氏酵母的Ale1和LPAAT直系同源物在本文中分别被鉴定为YlAle1(SEQ ID NO：11)和YlLPAAT(SEQ ID NO：17)。通过进行反向BLAST，进一步确认了YlAle1和YlLPAAT1分别作为ScAle1和ScLPAAT的直系同源物的鉴定，所述反向BLAST即，用SEQ ID NO：11和17作为查询序列，针对啤酒糖酵母公开的蛋白质数据库，分别找到ScAle1和ScLPAAT作为最佳匹配结果。
[0436] 利用LASERGENE生物信息学计算软件包(DNASTAR，Inc.，Madison，WI)的MegAlignTM程序(版本8.0.2)的Clustal W方法(slow，accurate，Gonnet选项；Thompson等人，Nucleic Acids Res.，22：4673-4680(1994))，比对了以上鉴定为ScAle1(SEQ ID NO：9)，YlAle1(SEQ ID NO：11)、 ScLPAAT(SEQ ID NO：18)、MaLPAAT1(SEQ ID NO：15)、YlLPAAT1(SEQ ID NO：1 7)和CeLPCAT(SEQ ID NO：2)的LPLAT蛋白质。由此得到了表13，其中相似度百分比显示在该表的上方三角形中，而趋异度百分比显示在下方三角形中。
[0437] 表13：不同LPLAT之间的同一性和趋异度百分比
[0438]
[0439] 通过该方法显示的同一性百分比允许每种LPAAT多肽之间最小的同一性百分比和每种Ale1多肽之间最小的同一性百分比的确定。LPAAT多肽之间同一性的范围为34.0％同一性(MaLPAAT1和YlLPAAT1)至43.9％同一性(ScLPAAT和YlLPAAT1)，而ScAle1和YlAle1多肽之间的同一性为45％。
[0440] 膜结合O-酰基转移酶[“MBOAT”]家族基序：通过用ScAle1(SEQ ID NO：9)作为查询序列，采用默认参数(期望阈值＝10；字长＝3；得分参数矩阵＝BLOSUM62；空位罚分：空位＝11，延伸＝1)针对“nr”蛋白质数据库(包括全部的非冗余GenBank CDS翻译、来源于来自布鲁克海文蛋白质数据库(Brookhaven Protein Data Bank[“PDB”])的3维结构的序列、除来自WGS计划的那些环境样本外的包括在SWISS-PROT蛋白质序列数据库的最新的主要发布、PIR和PRF中的序列)中的真菌蛋白质进行美国国立生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information[“NCBI”])BLASTP 2.2.20(蛋白质-蛋白质基本局部比对搜索工具(Basic Local Alignment Search Tool)；Altschul等人，Nucleic Acids Res.，25：3389-3402(1997)；和Altschul等人，FEBS J.，272：5101-5109(2005))检索，鉴定了ScAle1蛋白质序列(SEQ ID NO：9)的直系同源物。获得了下列匹配结果：
[0441] 表14：基于BLAST分析的ScAle1(SEQ ID NO：9)真菌直系同源物
[0442]
[0443]
[0444] 用DNASTAR比对了表14的酵母和真菌蛋白质序列。使用Clustal W比对方法(参见上文)进行了多重序列比对和同一性百分比计算。
[0445] 更具体地讲，使用Clustal W比对方法进行的多重蛋白质比对的默认参数是：空位罚分＝10，空位长度罚分＝0.2，延迟分歧序列(Delay Divergent Seqs)(％)＝30，DNA转换权重(Transition Weight)＝0.5，蛋白质权重矩阵＝Gonnet系列，DNA权重矩阵＝IUB，采用“慢速-准确(slow-accurate)”选项。对所得到的比对进行了分析，以确定Ale1同源物的非植物基序的存在或不存在，如美国专利公布2008-0145867-A1中所鉴定的。具体而言，这些包括：M-[V/I]-[L/I]-xxK-[L/V/I]-xxxxxxDG(SEQ ID NO：26)、RxKYYxxWxxx-[E/D]-[A/G]xxxxGxG-[F/Y]-xG(SEQ ID NO：27)、EX11WNX2-[T/V]-X2W(SEQ ID NO：28)和SAxWHGxxPGYxx-[T/F]-F(SEQ ID NO：29)，其中X编码任何氨基酸残基。SEQ ID NO：29中的His残基已被报道可能是该蛋白中的活性位点残基。
[0446] 只有一个基序，即，EX11WNX2-[T/V]-X2W(SEQ ID NO：28)，在所比对的全部33种生物中是完全保守的。其余的M-[V/I]-[L/I]-xxK-[L/V/I]-xxxxxxDG(SEQ ID NO：26)、RxKYYxxWxxx-[E/D]-[A/G]xxxxGxG-[F/Y]-xG(SEQ ID NO：27) 和 SAxWHGxxPGYxx-[T/F]-F(SEQ ID NO：29)基序仅为部分保守的。因此，为了本方法的目的，这些基序被适当地截短，以符合0错配(即，SAxWHG[SEQ ID NO：5])、1错配(即，RxKYYxxW[SEQ ID NO：4])、或2错配(即，M(V/I)(L/I)xxK(LVI)[SEQ ID NO：3])。
[0447] 1-酰基-sn-甘油-3-磷酸酰基转移酶[“LPAAT”]家族基序：对包括ScLPAAT(SEQ ID NO：18)、MaLPAAT1(SEQ ID NO：15)和YlLPAAT1(SEQ ID NO：17)的蛋白质比对的分析显示，1-酰基-sn-甘油-3-磷酸酰基转移酶家族基序EGTR(SEQ ID NO：20)存在于每种上述LPAAT直系同源物中。基于此，MaLPAAT1被鉴定为一种可能的LPAAT，其与国际申请公布WO2004/087902中公开的Ma LPAAT-样蛋白质(即，SEQ ID NO：93和95)有明显的区别。
[0448] 值得注意的是，EGTR(SEQ ID NO：20)基序尽管在国际申请公布WO2004/087902中的LPCAT序列中不存在，但却存在于CeLPCAT(SEQ ID NO：2)中。似乎是其他残基在LPAAT-样蛋白质中区别了LPAAT和LPCAT序列。一个此类的残基可能是EGTR(SEQ ID NO：20)基序的延伸。具体而言，ScLPAAT(SEQ ID NO：18)、MaLPAAT1(SEQ ID NO：15)和YlLPAAT1(SEQ ID NO：17)中的EGTR基序直接接着的是一个丝氨酸残基，而CeLPCAT中的EGTR基序直接接着的是一个天冬酰胺残基。与此相对，国际申请公布WO 2004/087902中的两种LPCAT在EGTR基序中具有缬氨酸对精氨酸残基的取代，并且该基序直接接着的是缬氨酸残基。
[0449] 包含经密码子优化的啤酒糖酵母Ale1基因的pY201的构建
[0450] 通过DNA 2.0(Menlo Park，CA)，对被命名为“ScAle1”的啤酒糖酵母ORF(SEQ ID NO：8)，就在解脂耶氏酵母中的表达进行了优化。除密码子优化外，还将5’Pci1和3’Not1克隆位点引入了该合成基因中(即，ScAle1S；SEQ ID NO：12)。在ScAle1S基因中的修改均未改变所编码的蛋白质的氨基酸序列(即，经密码子优化的基因所编码的蛋白质序列[即，SEQ ID NO：13]与野生型蛋白质序列[即，SEQ ID NO：9]是相同的)。ScAle1S被克隆进pJ201(DNA 2.0)，得到pJ201:ScAle1S。
[0451] 从pJ201:ScAle1S切下了包含ScAle1S的1863bp Pci1/Not1片段，并用于构建pY201(SEQ ID NO：77；表15；图10A)。除包含嵌合的YAT1::ScAle1S::Lip1基因外，pY201还包含解脂耶氏酵母URA3选择标记，所述标记两侧为LoxP位点，必要时其可通过重组酶介导的重组用于随后的移除。YAT1::ScAle1S::Lip1嵌合基因和URA3基因的两侧均与与解脂耶氏酵母Pox3基因的5’和3’区域具有同源性的片段相接，以有利于通过双重同源重组的整合，尽管向解脂耶氏酵母中的整合的发生已知通常不通过同源重组。如此，构建体pY201因此包含以下组分：
[0452] 表15：对质粒pY201(SEQ ID NO：77)的描述
[0453]
[0454]
[0455] 包含解脂耶氏酵母Ale1基因的pY168的构建
[0456] 使用PCR引物798和799(SEQ ID NO分别为：79和80)，通过PCR从解脂耶氏酵母ATCC#20362cDNA文库扩增了被命名为“YlAle1”的解脂耶氏酵母开放阅读框(GenBank登录号XP_505624；SEQ ID NO：10)。此外，通过PCR引物800和801(SEQ ID NO分别为：81和82)从pY201(SEQ ID NO：77)扩增了YAT启动子。由于上述引物对被设计为产生两种彼此具有一段重叠的PCR产物，随后使用引物798和801(SEQ ID NO分别为：79和82)并用这两种PCR片段作为模板，通过重叠PCR扩增了YAT1::YlAle1融合片段。PCR采用制造商的TM
推荐规范和Pfu Ultra 高保真DNA聚合酶(Stratagene，目录号600380)在RoboCycler Gradient 40PCR仪(Stratagene)中进行。扩增的进行如下：首先于95℃变性4分钟，然后是30个循环的：95℃变性30秒，55℃退火1分钟，72℃延伸1分钟。最后在72℃进行10分钟的延伸循环，随后在4℃终止反应。
推荐规范和Pfu Ultra 高保真DNA聚合酶(Stratagene，目录号600380)在RoboCycler Gradient 40PCR仪(Stratagene)中进行。扩增的进行如下：首先于95℃变性4分钟，然后是30个循环的：95℃变性30秒，55℃退火1分钟，72℃延伸1分钟。最后在72℃进行10分钟的延伸循环，随后在4℃终止反应。
[0457] 凝胶纯化了包含YAT1::Yl Ale1融合片段的PCR产物，并用ClaI/NotI进行了消化。该Cla1-Not1片段被连接到已被类似地消化过(从而移除了YAT1::ScAle1S片段)的pY201，以产生包含嵌合的YAT1::YlAle1::Lip1基因的pY168(SEQ ID NO：83)。通过DNA测序确认了耶氏酵母Ale1开放阅读框的DNA序列。除了pY168中的是YAT1::YlAle1::Lip1基因而pY201(图10A)中是YAT1::ScAle1S::Lip1基因之外，pY168(图10B；SEQ ID NO：83)中存在的组分与pY201中存在的那些是相同的。注意在图10B中YlAle1被标记为“Yl LPCAT”。
[0458] 包含高山被孢霉LPAAT1基因的pY208的构建
[0459] 通过DNA 2.0(Menlo Park，CA)，对被命名为“MaLPAAT1”的高山被孢霉开放阅读框(SEQ ID NO：14)，就在解脂耶氏酵母中的表达进行了优化。除密码子优化外，还将5’Pci1和3’Not1克隆位点引入了该合成基因中(即，MaLPAAT1S；SEQ ID NO：21)。在MaLPAAT1S基因中的修改均未改变所编码的蛋白质的氨基酸序列(即，经密码子优化的基因所编码的蛋白质序列[即，SEQ ID NO：22]与野生型蛋白质序列[即，SEQ ID NO：15]是相同的)。MaLPAAT1S被克隆进pJ201(DNA 2.0)，得到pJ201:MaLPAAT1S。
[0460] 从pJ201:MaLPAAT1S切下包含MaLPAAT1S的945bp Pci1/Not1片段，并用于在与pY201(SEQ ID NO：77)的两个片段的3方连接中构建pY208(SEQ ID NO：84)。具体而言，将MaLPAAT1片段与3530bp的Sph-NotIpY201片段和4248bp的NcoI-SphI pY201片段连接，从而得到pY208。除了pY208中的是YAT1::MaLPAAT1S::Lip1基因而pY201(图10A)中是YAT1::Sc Ale1S::Lip1基因之外，pY208(图11A；SEQ ID NO：84)中存在的组分与pY201中存在的那些是相同的。
[0461] 包含解脂耶氏酵母LPAAT1基因的pY207的构建
[0462] 在美国专利7,189,559中描述了来自解脂耶氏酵母的推定的LPAAT1(本文中命名为“YlLPAAT1”；SEQ ID NO：17)，其GenBank登录号为XP_504127。该蛋白质被注释为“与uniprot|P33333啤酒糖酵母YDL052cSLC1脂肪酰基转移酶相似”。
[0463] 用解脂耶氏酵母ATCC#20362cDNA文库作为模板，并使用PCR引物856和857(SEQ ID NO分别为：85和86)通过PCR扩增了YlLPAAT1开放阅读框(SEQ ID NO：16)。PCR使用与上文中关于在合成pY168之前对YAT1::Yl Ale1融合片段的扩增所述的相同的组分和条件进行。
[0464] 用PciI和NotI消化包含YlLPAAT1开放阅读框的PCR产物，然后将其用于与来自pY168的两种片段的3方连接中。具体而言，将YlLPAAT1片段与3530bp的Sph-NotI pY168片段和4248bp的NcoI-SphI pY168片段连接，以产生包含YAT1::YlLPAAT1::Lip1嵌合基因的pY207。通过DNA测序确认了解脂耶氏酵母LPAAT1开放阅读框。除了pY207中的是YAT1::YlLPAAT1::Lip1嵌合基因而pY201(图10A)中是YAT1::ScAle1S::Lip1基因之外，pY207(图11B；SEQ ID NO：87)中存在的组分与pY201中存在的那些是相同的。注意在图11B中YlLPAAT1被标记为“Yl LPAT1 ORF”。
[0465] 包含秀丽隐杆线虫LPCAT基因的pY175的构建
[0466] 由GenScript Corporation(Piscataway，NJ)对被命名为“CeLPCAT”(SEQ ID NO：1)的秀丽隐杆线虫开放阅读框，就在解脂耶氏酵母中的表达进行了优化。除密码子优化外，还将5’Nco1和3’Not1克隆位点引入了该合成基因中(即，CeLPCATS；SEQ ID NO：6)。在CeLPCATS基因中的修改均未改变所编码的蛋白质的氨基酸序列(即，经密码子优化的基因所编码的蛋白质序列[即，SEQ ID NO：7]与野生型蛋白质序列[即，SEQ ID NO：2]是相同的)。
[0467] 包含CeLPCATS的Nco1-Not1片段被用于在与来自pY168(SEQ ID NO：83)的两种片段的3方连接中构建pY175(SEQ ID NO：88)。具体而言，将包含CeLPCATS的Nco1-Not1片段与3530bp的Sph-NotI pY168片段和4248bp的NcoI-SphI pY168片段连接，从而得到pY175。除了pY175中的是YAT1::CeLPCATS::Lip1基因而pY201(图10A)中是YAT1::ScAle1S::Lip1基因之外，pY175(图12A；SEQ ID NO：88)中存在的组分与pY201中存在的那些是相同的。注意在图12A中CeLPCATS被标记为“Ce.LPCATsyn”。
[0468] 包含秀丽隐杆线虫LPCAT基因的pY153的构建
[0469] 同上的包含CeLPCATS的Nco1-Not1片段被用于构建pY153(SEQ ID NO:89；图12B)。除包含FBAIN::CeLPCATS::3’Yl LPAAT1嵌合基因之外，pY153还包含解脂耶氏酵母URA3选择标记。FBAIN::CeLPCATS::3’YlLPAAT1嵌合基因和URA3基因的两侧均与与解脂耶氏酵母LPAAT1基因的5’和3’区域具有同源性的片段相接，以有利于通过双重同源重组的整合，尽管向解脂耶氏酵母中的整合的发生已知通常不通过同源重组。如此，构建体pY153因此包含以下组分：
[0470] 表16：对质粒pY153(SEQ ID NO：89)的描述
[0471]
[0472]
[0473] 实施例4
[0474] 不同的LPLAT在生产EPA的解脂耶氏酵母菌株Y8406中的功能表征
[0475] 生产EPA的解脂耶氏酵母菌株Y8406U被用于从功能上表征在啤酒糖酵母Ale1、解脂耶氏酵母Ale1、高山被孢霉LPAAT1、解脂耶氏酵母LPAAT1和秀丽隐杆线虫LPCAT在被稳定地整合进耶氏酵母宿主染色体中后的过表达的效应。这与包含其天然的LPLAT(即Ale1和LPAAT1)的宿主构成了比较。
[0476] 转化和生长
[0477] 用实施例3中所述的整合载体的线性SphI-AscI片段，其中每种LPCAT处于耶氏酵母YAT启动子的控制下，分别地转化了解脂耶氏酵母菌株Y8406U(实施例1)。具体而言，根据“一般方法”转化了载体pY201(YAT1::ScAle1S::Lip1)、pY168(YAT1::YlAle1::Lip1)、pY208(YAT1::MaLPAAT1S::Lip1)、pY207(YAT1::YlLPAAT1::Lip1) 和pY175(YAT1::CeLPCATS::Lip1)。
[0478] 每一转化混合物被铺在MM琼脂平板上。挑取了若干个所得到的URA+转化体，并接种至3mL FM培养基(Biomyx，目录号CM-6681，BiomyxTechnology，San Diego，CA)中，上述FM培养基每升包含：6.7g不含氨基酸的Difco Yeast Nitrogen Base(酵母氮源)、5g酵母提取物、6gKH2PO4、2g K2HPO4、1.5g MgSO4·7H2O、1.5mg硫胺素·HCl和20g葡萄糖。在摇动器上以200rpm和30℃生长2天后，通过离心收集培养物，并重悬于3mL包含0.63％磷酸二氢钾、2.7％磷酸氢二钾、8.0％葡萄糖的HGM培养基(目录号2G2080，Teknova Inc.，Hollister，CA)中，调节至pH 7.5。在摇动器上以200rpm和在30℃生长5天后，通过离心收集1mL培养物的等分试样并通过GC分析。具体而言，经过培养的细胞通过在13,000rpm下离心1分钟进行收集，提取总脂质并通过酯交换制备脂肪酸甲酯[“FAMEs”]，随后用Hewlett-Packard 6890GC(一般方法)进行分析。
[0479] 基于所述3mL培养物的脂肪酸组成，通过烧瓶检测法进一步表征了经过选择的转化体。具体而言，选择了用表达载体pY201(包含ScAle1S)转化的菌株Y8406U的克隆#5和#11，并分别命名为“Y8406U::ScAle1S-5”和“Y8406U::ScAle1S-11”；选择了用表达载体pY168(包含YlAle1)转化的菌株Y8406U的克隆#16，并命名为“Y8406U::YlAle1”；选择了用表达载体pY208(包含MaLPAAT1S)转化的菌株Y8406U的克隆#8，并命名为
“Y8406U::MaLPAAT1S”；选择了用表达载体pY207(包含YlLPAAT1)转化的菌株Y8406U的克隆#21，并命名为“Y8406U::YlLPAAT1”；并且选择了用表达载体pY175(包含CeLPCATS)转化的菌株Y8406U的克隆#23，并命名为“Y8406U::CeLPCATS”。此外，菌株Y8406(作为菌株Y8406U(Ura-)的亲本的Ura+菌株)被用作对照物。
“Y8406U::MaLPAAT1S”；选择了用表达载体pY207(包含YlLPAAT1)转化的菌株Y8406U的克隆#21，并命名为“Y8406U::YlLPAAT1”；并且选择了用表达载体pY175(包含CeLPCATS)转化的菌株Y8406U的克隆#23，并命名为“Y8406U::CeLPCATS”。此外，菌株Y8406(作为菌株Y8406U(Ura-)的亲本的Ura+菌株)被用作对照物。
[0480] 每种经过选择的转化体和对照物被划线至MM琼脂平板上。然后，一个接种环的新鲜划线的细胞被接种至3mL FM培养基，并于30℃以250rpm培养过夜。测量OD600nm，在125mL烧瓶中，加入一个等分试样的细胞，使得25mL FM培养基中最终的OD600nm为0.3。在
30℃振荡培养箱中以250rpm培养2天后，通过离心收集6mL培养物，并在125mL烧瓶中重悬于25mL HGM中。30℃振荡培养箱中以250rpm培养5天后，使用1mL等分试样进行GC分析(同上)，并且干燥10mL用于干细胞重量[“DCW”]测定。
30℃振荡培养箱中以250rpm培养2天后，通过离心收集6mL培养物，并在125mL烧瓶中重悬于25mL HGM中。30℃振荡培养箱中以250rpm培养5天后，使用1mL等分试样进行GC分析(同上)，并且干燥10mL用于干细胞重量[“DCW”]测定。
[0481] 就DCW测定而言，通过在Beckman GS-6R离心机的Beckman GH-3.8转子中以4000rpm离心5分钟，收集了10mL培养物。沉淀被重悬于25mL水中，并如上文所述重新收集。将洗涤后的沉淀物重悬在20mL水中并转移到预先称过重的铝盘上。在80℃的真空炉中干燥上述细胞悬浮液过夜。测定细胞的重量。
[0482] 脂质含量、脂肪酸组成和转化效率
[0483] 在相同条件下进行了总共四次单独的实验。实验1比较了对照菌株Y8406对菌株Y8406U::ScAle1S-5。实验2比较了对照菌株Y8406对菌株Y8406U::YlAle1。实验3比较了对照菌株Y8406对菌株Y8406U::YlAle1、strain Y8406U::ScAle1S-11、和strain Y8406U::MaLPAAT1S。实验4比较了对照菌株Y8406对菌株Y8406U::MaLPAAT1S、strain Y8406U::YlLPAAT1和strain Y8406U::CeLPCATS。
[0484] 在每一实验中，对于Y8406对照菌株和Y8406U转化体菌株的1个、2个或3个重复的培养物[“重复样品”]，对脂质含量、脂肪酸组成和EPA占DCW的百分比进行了定量。此外，每种Y8406U转化体的数据还被显示为占Y8406对照物的百分比。下面的表17总结了细胞的总脂质含量[“TFA％DCW”]、以TFA的％重量[“％TFA”]表示的每种脂肪酸的浓度和以干细胞重量的百分比表示的EPA含量[“EPA％DCW”]。更具体地讲，脂肪酸被鉴定为16:0(棕榈酸)、16:1(棕榈油酸)、18:0(硬脂酸)、18:1(油酸)、18:2(LA)、ALA、EDA、DGLA、ARA、ETrA、ETA和EPA。
[0485] 表18总结了在PUFA生物合成途径中起作用并且为EPA的生产所需的每种去饱和酶和Δ9延伸酶的转化效率。具体而言，对于每一Y8406对照菌株和Y8406U转化体菌株，提供了Δ12去饱和酶转化效率[“Δ12CE”]、Δ8去饱和酶转化效率[“Δ8CE”]、Δ5去饱和酶转化效率[“Δ5CE”]、Δ17去饱和酶转化效率[“Δ17CE”]和Δ9延伸转化效率[“Δ9e CE”]；每种Y8406U转化体的数据被显示为占Y8406对照物的百分比。转化效率按照下列式子计算：产物/(产物+底物)*100，其中产物既包括产物又包括产物衍生物。
[0486]
[0487]
[0488] 基 于 表 17 和 18 中 关 于 实 验 1、2 和 3 的 数 据，LPLAT在 EPA 菌 株Y8406U::ScAle1S-5、Y8406U::ScAle1S-11、Y8406U::YlAle1和Y8406U::MaLPAAT1S中的过表达导致了以TFA的重量％计的LA(18:2)浓度[“LA％TFA”]的显著降低(达对照物的67％或更低)、以TFA的重量％计的EPA浓度[“EPA％TFA”]的升高(达对照物的至少12％)、和Δ9延伸酶转化效率的升高(达对照物的至少16％)。与Y8406U::ScAle1S-5和Y8406U::ScAle1S-11相比，Y8406U::YlAle1具有更低的LA％TFA、更高的EPA％TFA、更好的Δ9延伸酶转化效率、和略低的TFAs％DCW和EPA％DCW。除MaLPAAT1S的过表达导致了较低的LA％TFAs、EPA％TFAs和EPA％DCW外，Y8406U::Yl Ale1和Y8406U::MaLPAAT1S是相似的。
[0489] 实 验 4显 示，LPLAT 在 EPA菌 株 Y8406U::YlLPAAT1、Y8406U::MaLPAAT1S 和Y8406U::CeLPCATS中的过表达导致了LA％TFA的显著降低(达对照物的67％或更低)、EPA％TFA的升高(达对照物的至少9％)、和Δ9延伸酶转化效率的升高(达对照物的至少13％)。与Y8406U::CeLPCATS相比，Y8406U::YlLPAAT1和Y8406U::MaLPAAT1S均具有更低的LA％TFA、更高的EPA％TFAs、更高的EPA％DCW、以及略好的TFA％DCW。除MaLPAAT1S的过表达导致了较低的LA％TFA、略低的EPA％TFA和EPA％DCW、以及略低的Δ9延伸酶转化效率外，Y8406U::YlLPAAT1和Y8406U::MaLPAAT1S是相似的。
[0490] 在本领域中众所周知，大多数去饱和发生在磷脂的sn-2位上，而脂肪酸延伸发生在酰基-辅酶A上。此外，预期ScAle1S、YlAle1、MaLPAAT1S和YlLPAAT1仅使酰基基团从酰基-辅酶A库掺入溶血磷脂，例如溶血磷脂酸[“LPA”]和溶血磷脂酰胆碱[“LPC”]的sn-2位。因此，预期ScAle1S、YlAle1、MaLPAAT1S和YlLPAAT1的表达将由于提高的磷脂底物可用性而导致去饱和的提高，而不导致需要辅酶A库中提高的底物可用性的延伸的提高。我们的数据(参见上文)显示，意外地，ScAle1S、YlAle1、MaLPAAT1S、和YlLPAAT1的表达在生产EPA的耶氏酵母菌株中显著提高了Δ9延伸酶转化效率但并未提高(以Δ12去饱和酶转化效率、Δ8去饱和酶转化效率、Δ5去饱和酶转化效率或Δ17去饱和酶转化效率测量的)去饱和效率。
[0491] CeLPCAT此前已被显示在供给LA或GLA的啤酒糖酵母中提高Δ6延伸转化效率(国际申请公布WO 2004/076617)。这归因于其使脂肪酸从磷脂释放至辅酶A库的可逆的LPCAT活性。在国际申请公布WO 2004/076617中，并未预期含油微生物(如解脂耶氏酵母；经基因工程改造以高水平生产LC-PUFA)在没有供给脂肪酸情况下Δ9延伸转化效率的改善。
[0492] 此外，在生产EPA的耶氏酵母菌株中，ScAle1S、YlAle1、MaLPAAT1S、YlLPAAT1和CeLPCATS的表达没有显著改变所积累的PUFA水平或总脂质含量。
[0493] 在先的研究已显示，由于在磷脂和酰基-辅酶A库之间酰基基团的转移不良，Δ6延伸和Δ9延伸都是长链PUFA生物合成中的瓶颈。基于上文所展示的LPCAT的过表达造成的A9延伸酶转化效率的提高，预期本文所述的LPCAT和它们的直系同源物如Sc LPAAT，将同样提高Δ6延伸转化效率。
[0494] 实施例5
[0495] 不同的LPLAT在生产DHA的解脂耶氏酵母菌株Y5037中的功能表征
[0496] 生产DHA的解脂耶氏酵母菌株Y5037U被用于从功能上表征在啤酒糖酵母Ale1、高山被孢霉LPAAT1和秀丽隐杆线虫LPCAT在被稳定整合进耶氏酵母宿主染色体中后，它们的过表达的效应。这与包含其天然的LPLAT(即Ale1和LPAAT1)的宿主构成了比较。
[0497] 转化和生长
[0498] 用实施例3中所述的整合载体的线性SphI-AscI片段，其中ScAle1S和MaLPAAT1S处于耶氏酵母YAT启动子的控制下，而CeLPCATS处于耶氏酵母FBAIN启动子的控制下，分别地转化了解脂耶氏酵母菌株Y5037U(实施例2)。具体而言，根据“一般方法”转化了载体pY201(YAT1::ScAle1S::Lip1)、pY208(YAT1::MaLPAAT1S::Lip1)和pY153(FBAIN::CeLPCATS::YlLPAAT1)。
[0499] 每一转化混合物被铺在MM琼脂平板上。进一步表征了经过选择的转化体，如下文所述。具体而言，选择了用表达载体pY153(包含CeLPCATS)转化的菌株Y5037U的克隆#7，并命名为“Y5037U::FBAIN-CeLPCATS”；选择了用表达载体pY201(包含ScAle1S)转化的菌株Y5037U的克隆#18，并命名为“Y5037U::ScAle1S”；并且选择了用表达载体pY208(包含MaLPAAT1S)转化的菌株Y5037U的克隆#6，并命名为“Y5037U::MaLPAAT1S”。此外，菌株Y5037(作为菌株Y5037(Ura-)的亲本的Ura+菌株)被用作对照物。
[0500] 在基于不同的培养条件和菌株的3mL培养物中总共进行了四次分别的实验，以检测LPLAT的过表达对脂质含量、脂肪酸组成和转化效率的影响。实验1比较了在200rpm的摇动器上和30℃下于MM培养基中生长2天，随后在3mL HGM培养基中孵育了3天之后的对照菌株Y5037对菌株Y5037U::FBAIN-CeLPCATS和Y5037U::ScAleIS。MM培养基(目录号CML-MM，Biomyx Technology)，pH 6.1，每升包含：1.7g不含氨基酸和NH4SO4的酵母氮源[“YNB”]、1g脯氨酸、0.1g腺嘌呤、0.1g赖氨酸，和20g葡萄糖。
[0501] 实验2比较了在200rpm的摇动器上和在30℃下于CSM-U培养基中生长2天，随后在3mL HGM培养基中孵育了3天之后的对照菌株Y5037对菌株Y5037U::ScAleIS。CSM-U培养基(目录号C8140，Teknova Inc，Hollister，CA)包含：0.13％不含尿嘧啶的氨基酸减成分粉末，0.17％酵母氮源，0.5％(NH4)2SO4，和2.0％葡萄糖。
[0502] 实验3比较了在200rpm的摇动器上和在30℃下于MM培养基中生长2天，随后在3mL HGM培养基中孵育了5天之后的对照菌株Y5037对菌株Y5037U::FBAIN-CeLPCATS和Y5037U::ScAleIS。
[0503] 实验5比较了在200rpm的摇动器上和在30℃下于FM培养基中生长2天，随后在3mL HGM培养基中孵育了3天之后的对照菌株Y5037对菌株Y5037U::MaLPAAT1S。FM培养基的组成描述于实施例4中。
[0504] 在HGM中生长3天(实验1、2、和5)或5天(实验3)之后，通过离心收集了培养物的1mL等分试样并通过GC进行了分析，如实施例4中所述。
[0505] 实验4比较了如上文所述在25mL FM培养基中生长2天，随后在HGM培养基中孵育了5天之后的对照菌株Y5037对菌株Y5037U::FBAIN-CeLPCATS和Y5037U::ScAleIS。具体而言，一个接种环的来自MM琼脂平板的新鲜划线的细胞被接种至3mL FM培养基，并于30℃以250rpm培养过夜。测量OD600nm，在125mL烧瓶中，加入一个等分试样的细胞，使得25mL FM培养基中最终的OD600nm为0.3。在30℃振荡培养箱中以250rpm培养2天后，通过离心收集6mL培养物，并在125mL烧瓶中重悬于25mLHGM中。30℃振荡培养箱中以250rpm培养5天后，使用1mL等分试样进行GC分析(参见上文)，并且干燥10mL用于干细胞重量[“DCW”]测定(参见上文的实施例4)。
[0506] 脂质含量、脂肪酸组成和转化效率
[0507] 在每一实验中，对于Y5037对照菌株和Y5037U转化体菌株的1个、2个、3个或4个重复的培养物[“重复样品”]，对脂质含量和脂肪酸组成进行了定量。此外，每种Y5037U转化体的数据还被显示为占Y5037对照物的百分比。下文的表19总结了以TFA的％重量计的每种脂肪酸的浓度[“％TFA”]。更具体地讲，脂肪酸被鉴定为16:0(棕榈酸)、16:1(棕榈油酸)、18:0(硬脂酸)、18:1(油酸)、18:2(LA)、ALA、EDA、DGLA、ARA、ETrA、ETA、EPA、DPA、DHA和EDD(对应于EPA加DPA加DHA的总和)。此外，还提供了DHA％TFA/DPA％TFA的比率。
[0508] 表20总结了总的DCW(mg/mL)、细胞的总脂质含量[“TFA％DCW”]、和在PUFA生物合成途径中起作用并且为DHA的生产所需的每种去饱和酶和延伸酶的转化效率。具体而言，对于每一Y5037对照菌株和Y5037U转化体菌株，提供了Δ12去饱和酶转化效率[“Δ12CE”]、Δ8去饱和酶转化效率[“Δ8CE”]、Δ5去饱和酶转化效率[“Δ5CE”]、Δ17去饱和酶转化效率[“Δ17CE”]、Δ4去饱和酶转化效率[“Δ4CE”]、Δ9延伸转化效率[“Δ9e CE”]和Δ5延伸转化效率[“Δ5e CE”]；每种Y5037U转化体的数据被显示为占Y5037对照物的百分比。转化效率按照下列式子计算：产物/(产物+底物)*100，其中产物既包括产物又包括产物衍生物。
[0509]
[0510]
[0511] 基 于 表 19 和 表 20 中 的 数 据，LPLAT 在 DHA菌 株 Y5037U::CeLPCATS、Y5037U::ScAleIS和Y5037U::MaLPAAT1S中的过表达导致了以TFA的重量％计的LA浓度的降低[“LA％TFA”]、以TFA的重量％计的EPA浓度的升高[“EPA％TFA”]、以TFA的重量％计的DHA浓度的升高[“DHA％TFA”]、以TFA的重量％计的EPA+DPA+DHA浓度的升高[“EDD％TFA”](除了在实验4中的菌株Y5037U::ScAleIS之外)、DHA％TFA对DPA％TFA比率的升高[“DHA/DPA”]、Δ9延伸酶转化效率的升高和Δ4去饱和酶转化效率的升高。
[0512] 更具体地讲，取决于培养条件，与对照物相比，CeLPCATS在Y5037U::CeLPCATS中的过表达能够降低LA％TFA至45％、升高EPA％TFA至175％、升高DHA％TFA至169％、升高Δ9延伸效率至124％、和升高Δ4去饱和效率至226％。类似地，依赖于培养条件，与对照物相比，ScAle1S在Y5037U::ScAleIS中的过表达能够降低LA％TFA至72％、升高EPA％TFA至125％、升高DHA％TFA至222％、升高Δ9延伸效率至113％和升高Δ4去饱和效率至191％。最后，与对照物相比，MaLPAAT1在Y5037U::MaLPAAT1S中的过表达能够降低LA％TFA至94％、升高EPA％TFA至115％、升高DHA％TFA至120％、升高Δ9延伸效率至104％和升高Δ4去饱和效率至118％。
[0513] 尽管在实验4中Y5037U::CeLPCATS具有显著较低的总脂质含量[“TFA％DCW”]，但在菌株Y5037U::ScAleIS中总脂质含量显著地提高了。脂质含量的这一提高是对菌株Y5037U::ScAleIS中较低的EDD％TFA可能的解释。
[0514] 通过EPA的DHA生物合成涉及两个步骤：EPA通过C20/22延伸酶(也被称为“C20”延伸酶或Δ5延伸酶)向DPA的延伸和DPA通过Δ4去饱和酶向DHA的去饱和。DPA的积累表明，从EPA向DHA的生产中的重要瓶颈是Δ4去饱和步骤，尽管这一限制的详细机制是未知的。以上的结果显示，ScAle1S、YlAle1、YlLPAAT1、MaLPAAT1S、和CeLPCATS蛋白质的表达显著地提高了Δ4去饱和。因此，Δ4去饱和不因Δ4去饱和酶活性自身而构成限制。相反，Δ4去饱和因磷脂sn-2位的DPA底物的受限的可用性而构成限制。上述结果显示，意外地，(不同于其他去饱和底物)受限的DPA向磷脂中的掺入能够通过Ale1、LPAAT和LPCAT蛋白质的过表达而被克服。
[0515] 在先地，国际申请公布WO 2004/076617显示，CeLPCAT(SEQ ID NO：2)在啤酒糖酵母中的表达提高了外源提供的GLA向DGLA的Δ6延伸。它推测CeLPCAT从磷脂的sn-2位移除了酰基链，从而使得被移除的酰基基团可用于在辅酶A库中的延伸。在本研究中显示，在经过基因工程改造以生产高水平的EPA(实施例4)和DHA(实施例5)的解脂耶氏酵母菌株中，经密码子优化的CeLPCATS在YAT1启动子控制下的表达，分别提高了内源生产的LA向EDA的Δ9延伸。然而，CeLPCATS在生产DHA的菌株Y5037U::CeLPCATS中的表达意外地没有导致提高的EPA向DPA的Δ5延伸。与此相对，CeLPCATS在生产DHA的菌株Y5037U::CeLPCATS中的表达非常显著地提高了DPA向DHA的Δ4延伸(参见上文)。这尤其地出人意料，因为去饱和主要发生在磷脂的sn-2位而延伸发生在辅酶A库中。
[0516] 基于上文所展示的LPCAT的过表达造成的Δ4去饱和转化效率的提高，预期本文所述的LPCAT和它们的直系同源物如ScLPAAT，将同样提高Δ4去饱和转化效率。
[0517] 实施例6
[0518] 不同的LPLAT在生产ARA的解脂耶氏酵母菌株Y8006U中的功能表征
[0519] 生产ARA的解脂耶氏酵母菌株Y8006U被用于从功能上表征在啤酒糖酵母Ale1、高山被孢霉LPAAT1和秀丽隐杆线虫LPCAT在被整合进耶氏酵母宿主染色体中后，它们的过表达的效应。这与包含其天然的LPLAT(即Ale1和LPAAT1)的宿主构成了比较。
[0520] 转化和生长
[0521] 将用实施例3中所述的整合载体的线性SphI-AscI片段，以与实施例4中所采用的可比较的方式，分别地转化解脂耶氏酵母菌株Y8006U(实施例1)。URA+转化体将被选择，在FM培养基中生长2天和在HGM培养基中生长5天，然后将通过离心收集上述培养物的1mL等分试样并通过GC进行分析(实施例4)。基于3mL培养物的脂肪酸组成，用菌株Y8006(作为菌株Y8006U(Ura-)的亲本的Ura+菌株)作为对照物，经过选择的转化体将被进一步表征。
[0522] 每种被选择的转化体和上述对照物将被再次培养于FM和HGM培养基中，如实施例4中所述，然后接受GC分析和DCW测定。
[0523] 对于Y8006对照菌株和Y8006转化体菌株，脂质含量、脂肪酸组成和以DCW的百分比表示的ARA将被定量。此外，每种Y8006U转化体的数据将被测定为占Y8006对照的百分比。在PUFA生物合成途径中起作用并且为ARA的生产所需的每种去饱和酶和Δ9延伸酶的转化效率将以与实施例4和5中的相似的方式同样被测定并与对照物进行比较。
[0524] 推测ScAle1S、YlAle1、MaLPAAT1S、YlLPAAT1和CeLPCATSLPLATs在上述ARA菌株中的过表达将导致以TFA的重量％计的LA(18:2)浓度的降低[“LA％TFA”]、以TFA的重量％计的ARA的浓度的升高[“ARA％TFA”]、和Δ9延伸酶转化效率的升高。
[0525] 实施例7
[0526] 包含LPAAT开放阅读框和自主复制序列的表达载体的构建
[0527] 本实施例描述了适用于在解脂耶氏酵母中没有整合的LPAAT基因表达的、包含自主复制序列[“ARS”]和LPAAT开放阅读框的载体的构建。开放阅读框包括编码SEQ ID NO：18的啤酒糖酵母LPAAT和编码SEQ ID NO：17的解脂耶氏酵母LPAAT1。实施例8描述了将这些载体转入解脂耶氏酵母之后获得的结果。
[0528] 包含经密码子优化的啤酒糖酵母LPAAT基因的pY222的构建
[0529] 通过DNA 2.0(Menlo Park，CA)，对被命名为“ScLPAAT”的啤酒糖酵母开放阅读框(SEQ ID NO：18)，就在解脂耶氏酵母中的表达进行了优化。除密码子优化外，还将5’Pci1和3’Not1克隆位点引入了该嵌合基因中(即，ScLPAATS；SEQ ID NO：96)。在ScLPAATS基因中的修改均未改变所编码的蛋白质的氨基酸序列(即，经密码子优化的基因所编码的蛋白质序列[即，SEQ ID NO：97]与野生型蛋白质序列[即，SEQ ID NO：18]是相同的)。ScLPAATS被克隆进pJ201(DNA 2.0)，得到pJ201:ScLPAATS。
[0530] 包含ScLPAATS的926bp的Pci1/Not1片段被从pJ201:ScLPAATS上切下，并被克隆进NcoI-Not1切割的pYAT-DG2-1中，以构建pY222(SEQ ID NO：100；表21；图13A)。因此，构建体pY222包含下列组分：
[0531] 表21：对质粒pY222(SEQ ID NO：100)的描述
[0532]
[0533] 包含解脂耶氏酵母LPAAT1基因的pY177的构建
[0534] 使用引物869(SEQ ID NO：98)和引物870(SEQ ID NO：99)，以质粒pYAT-DG2-1作为模板，通过标准PCR扩增了解脂耶氏酵母着丝粒和自主复制序列[“ARS”]。用AscI/AvrII消化了PCR产物，并克隆进AscI-AvrII消化过的pY207(SEQ ID NO：87；实施例3)中，以构建pY177(SEQ ID NO：101；表22；图13B)。因此，除AscI和AvrII之间373bp的pY207序列被包含ARS的1341bp序列替换之外，pY177中村中的组分与pY207(图11B)中的那些是相同的。更具体地讲，pY177包含下列组分：
[0535] 表22：对质粒pY177(SEQ ID NO：101)的描述
[0536]
[0537] 实施例8
[0538] 不同的LPAAT在生产EPA的解脂耶氏酵母菌株Y8406中的功能表征
[0539] 生产EPA的解脂耶氏酵母菌株Y8406U被用于从功能上表征在自主复制质粒上的没有整合的啤酒糖酵母LPAATS(SEQ ID NO：96)和解脂耶氏酵母LPAAT1(SEQ ID NO：16)的表达的效应。这与包含其天然的LPAAT的宿主构成了比较。
[0540] 转化和生长
[0541] 用来自实施例7的未切割的质粒分别地转化了解脂耶氏酵母菌株Y8406U(实施例1)。具体而言，按照“一般方法”转化了载体pY177(YAT1::YlLPAAT1::Lip1)[SEQ ID NO：
101]和pY222(YAT1::ScLPAATS::Lip1)[SEQ ID NO：100]。
101]和pY222(YAT1::ScLPAATS::Lip1)[SEQ ID NO：100]。
[0542] 每一转化混合物被铺在MM琼脂平板上。挑取了若干个所得到的URA+转化体，并接种至3mL CSM-U培养基(Teknova目录号C8140，Teknova Inc.，Hollister，CA)中，其中CSM-U培养基是指含有葡萄糖减去尿嘧啶的CM肉汤，包含0.13％减尿嘧啶的氨基酸省却成分粉末，0.17％酵母氮源，0.5％(NH4)2SO4，和2.0％葡萄糖。在摇动器上以200rpm和30℃生长2天后，通过离心收集培养物，并重悬于3mL HGM培养基(目录号2G2080，Teknova Inc.)中。在摇动器上生长5天后，收集上述培养物的1mL等分试样并通过GC进行分析，如实施例4中所述。
[0543] 基于所述3mL培养物的脂肪酸组成，通过烧瓶检测法进一步表征了经过选择的转化体。具体而言，选择了用表达载体pY222(包含ScLPAATS)转化的菌株Y8406U的克隆#5和#6，并分别命名为“Y8406U::ScLPAATS-5”和“Y8406U::ScLPAATS-6”；选择了用表达载体pY177(包含YlLPAAT1)转化的菌株Y8406U的克隆#1，并命名为“Y8406U::YlLPAAT1”。
[0544] 此外，菌株Y8406(作为菌株Y8406U(Ura-)的亲本的Ura+菌株)被用作对照物。
[0545] 每种经过选择的转化体和对照物被划线至MM琼脂平板上。然后，一个接种环的新鲜划线的细胞被接种至3mL CSM-U培养基，并于30℃以250rpm培养过夜。测量OD600nm，在125mL烧瓶中，加入一个等分试样的细胞，使得25mL CSM-U培养基中最终的OD600nm为0.3在
30℃振荡培养箱中以250rpm培养2天后，通过离心收集6mL培养物，并在125mL烧瓶中重悬于25mL HGM中。30℃振荡培养箱中以250rpm培养5天后，使用1mL等分试样进行GC分析(参见上文)，并且干燥10mL用于干细胞重量[“DCW”]测定，如实施例4中所述。
30℃振荡培养箱中以250rpm培养2天后，通过离心收集6mL培养物，并在125mL烧瓶中重悬于25mL HGM中。30℃振荡培养箱中以250rpm培养5天后，使用1mL等分试样进行GC分析(参见上文)，并且干燥10mL用于干细胞重量[“DCW”]测定，如实施例4中所述。
[0546] 脂质含量、脂肪酸组成和转化效率
[0547] 对于Y8406对照菌株和Y8406U转化体菌株的2个重复的培养物[“重复样品”]，对脂质含量、脂肪酸组成和EPA占DCW的百分比进行了定量。此外，每种Y8406U转化体的数据还被显示为占Y8406对照物的百分比。下面的表23总结了细胞的总脂质含量[“TFA％DCW”]、以TFA的％重量[“％TFA”]表示的每种脂肪酸的浓度和以干细胞重量的百分比表示的EPA含量[“EPA％DCW”]。更具体地讲，脂肪酸被鉴定为16:0(棕榈酸)、16:1(棕榈油酸)、18:0(硬脂酸)、18:1(油酸)、18:2(LA)、ALA、EDA、DGLA、ARA、ETrA、ETA和EPA。
[0548] 表24以与实施例4中所述的相同的方式总结了在PUFA生物合成途径中起作用，并且为EPA的生产所需的每种去饱和酶和Δ9延伸酶的转化效率。
[0549]
[0550] 基于以上表23和表24中的数据，ScLPAATS和YlLPAAT1在生产EPA的菌株Y8406U::YlLPAAT1、Y8406U::ScLPAATS-5和Y8406U::ScLPAATS-6中的表达均导致了按TFA的重量％计的LA(18:2)浓度[“LA％TFA”]的降低(达对照物的76％或更低)，和Δ9延伸酶转化效率的升高(达对照物的至少7％)。ScLPAATS和YlLPAAT1对脂质谱具有相似的影响。
[0551] 然后，将以上获得的结果与实施例4中获得的那些进行了比较，尽管采用了不同的方式来表征LPLAT。具体而言，在实施例4中，由于载体缺少ARS序列，携带LPLAT的线性化的DNA通过染色体整合被转化。这导致了稳定地整合，并且在预培养和被转至HGM之前2天的生长中，菌株均生长于相对丰富的、非选择性的FM生长培养基中。
[0552] 在实施例8中，从功能上对YlLPAAT1和ScLPAATS的表征在自我复制的质粒上进行。因此，用携带每种LPAAT和ARS序列的环状DNA转化了解脂耶氏酵母菌株Y8406。为了维持这些质粒并检测没有整合的基因的表达，在预培养和被转至HGM之前的2天的生长中，必须使转化体在选择培养基(即，CSM-U培养基)上生长。
[0553] 以上所述的这些差异能够促成脂质谱和脂质含量的差异，如实施例4和8中通过YlLPAAT1的表达所显示的。在实施例4中，基于YlLPAAT的表达，LA％TFA、EPA％TFA、以及Δ9延伸酶转化效率相对于对照物的变化分别为63％、115％和115％，而在实施例8中，基于YlLPAAT的表达，LA％TFA、EPA％TFA、以及Δ9延伸酶转化效率相对于对照物的变化分别为76％、101％和107％。因此，与实施例4中所观察到的相比，实施例8中Δ9延伸和LC-PUFA生物合成的改善是最小化的。这些差异可以归因于染色体整合的“位置效应”和/或不同的生长条件。
[0554] 由于就在自主复制质粒上被转入解脂耶氏酵母菌株Y8406的ScLPAATS和YlLPAAT而言，LC-PUFA生物合成的改善(测量为LA％TFA的降低、EPA％TFA的升高和Δ9延伸酶转化效率的升高)是相似的，预期这两种LPLAAT在稳定整合进宿主染色体时将同样发挥相似的功能。因此，ScLPAATS将很可能以与YlLPAAT1被稳定地整合进宿主染色体的实施例4和5中所观察到的相似的方式改善脂质谱。
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