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发酵培养基及发酵工艺

阅读：909发布：2020-05-30

专利汇可以提供发酵培养基及发酵工艺专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明公开了一种发酵培养基，用于尼莫克汀发酵，所述培养基以豆油为碳源，并且所述培养基的pH值为7.0~7.5；其中，所述培养基中所述豆油的浓度为0.25-5.0克/升。本发明还公开了一种尼莫克汀的发酵工艺。本发明在蓝灰色链霉菌生产尼莫克汀的过程中添加豆油，能够有效地提高菌体合成，有利于生物量的积累和产物的生产，有效提高了目标产物尼莫克汀的产量。，下面是发酵培养基及发酵工艺专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种发酵培养基，用于尼莫克汀的发酵，其特征在于，所述培养基以豆油为碳源，并且所述培养基的pH值为7.0 7.5；其中，所述培养基中所述豆油的浓度为0.25-5.0克/升。
~
2.根据权利要求1所述的发酵培养基，其特征在于，所述发酵培养基的所述碳源还包括葡萄糖和麦芽糊精；其中，所述葡萄糖的浓度为15 25克/升，所述麦芽糊精的浓度为75 95~ ~
克/升。
3.根据权利要求1所述的发酵培养基，其特征在于，所述发酵培养基还包括氮源。
4.根据权利要求3所述的发酵培养基，其特征在于，所述氮源包括：黄豆饼粉和玉米浆；
其中，所述黄豆饼粉的浓度为20 30克/升，所述玉米浆的浓度为7 9克/升。
~ ~
5.根据权利要求1所述的发酵培养基，其特征在于，所述发酵培养基还包括助剂；所述助剂为稳定剂、微量元素、消泡剂中的至少一种。
6.根据权利要求5所述的发酵培养基，其特征在于，所述稳定剂为碳酸盐；所述微量元素为硫酸盐、碳酸盐、氯化盐、钼酸盐中的至少一种。
7.根据权利要求6所述的发酵培养基，其特征在于，所述硫酸盐为硫酸镁、硫酸铜、硫酸锌或硫酸锰中的一种或几种混合；所述氯化盐为氯化钴；所述钼酸盐为钼酸钠；所述碳酸盐为碳酸钙；所述发酵培养基中各组分的浓度为：硫酸镁0.8-1.2克/升、硫酸铜0.009-0.011克/升、氯化钴0.001-0.003克/升、硫酸锌0.001-0.002克/升、硫酸锰0.001-0.002克/升、钼酸钠0.001-0.003克/升、碳酸钙5-7克/升。
8.一种发酵工艺，利用权利要求1-7任一项所述的发酵培养基，其特征在于，所述发酵工艺包括：将目标孢子的悬浮液加入至种子培养基中进行种子培养以获得目标种子液的步骤；以及，将种子液转接至所述发酵培养基中进行发酵培养的步骤。
9.根据权利要求8所述的发酵工艺，其特征在于，在发酵培养的步骤中，发酵培养的温度为26 30℃，发酵培养时间为220 260小时。
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10.根据权利要求8所述的发酵工艺，其特征在于，在发酵培养的步骤中，所述种子液占所述发酵培养基的体积百分比为7 9%。
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说明书全文

发酵培养基及发酵工艺

技术领域

[0001] 本发明涉及发酵培养技术领域，尤其涉及一种发酵培养基及使用该发酵培养基的发酵工艺。本发明所述发酵培养基及发酵工艺尤其适合于尼莫克汀的发酵。

背景技术

[0002] 尼莫克汀（Nemadectin）是一种米尔贝霉素类（Milbemycin）十六元大环内脂类抗生素，它是由蓝灰色链霉菌（Streptomyces cyaneogriseus ssp. noncyanogenus）所生产的一种广谱杀虫剂。通过在尼莫克汀的第23位引入=N-OCH3基团可半化学合成莫西克汀（Moxidectin），其具有高效、安全、环保以及不易产生抗药性等特点，因此在农用驱虫类杀虫剂领域具有广阔的应用前景。此外，莫西克汀在治疗盘尾丝虫病方面也十分有效。然而目前有关尼莫克汀的研究多集中于育种、分子机制以及毒理药理等方面，关于发酵调控方面的研究较少。

[0003] 为了尽可能发挥出尼莫克汀生产菌株蓝灰色链霉菌的性能，本发明对尼莫克汀的发酵工艺进行优化，提高目标产物尼莫克汀的产量。

发明内容

[0004] 本发明的目的在于提供一种发酵培养基，尤其是用于提高尼莫克汀产量的发酵培养基，以及应用该发酵培养基的发酵工艺。在本发明中，通过发酵培养基中添加豆油作为碳源，可以显著提高目标产物尼莫克汀的产量。

[0005] 为了实现上述目的，本发明首先提供一种发酵培养基，用于尼莫克汀的发酵。所述培养基以豆油为碳源，并且所述培养基的pH值为7.0 7.5；其中，所述培养基中所述豆油的~浓度为0.25-5.0克/升。

[0006] 在本发明一实施例中，所述发酵培养基的所述碳源还包括葡萄糖和麦芽糊精；其中，所述葡萄糖的浓度为15 25克/升，所述麦芽糊精的浓度为75 95克/升。~ ~

[0007] 在本发明一实施例中，所述发酵培养基还包括氮源。

[0008] 在本发明一实施例中，所述氮源包括：黄豆饼粉和玉米浆；其中，所述黄豆饼粉的浓度为20 30克/升，所述玉米浆的浓度为7 9克/升。~ ~

[0009] 在本发明一实施例中，所述发酵培养基还包括助剂；所述助剂为稳定剂、微量元素、消泡剂中的至少一种。

[0010] 在本发明一实施例中，所述稳定剂为碳酸盐；所述微量元素为硫酸盐、碳酸盐、氯化盐、钼酸盐中的至少一种。

[0011] 在本发明一实施例中，所述硫酸盐为硫酸镁、硫酸铜、硫酸锌或硫酸锰中的一种或几种混合；所述氯化盐为氯化钴；所述钼酸盐为钼酸钠；所述碳酸盐为碳酸钙；所述发酵培养基中各组分的浓度为：硫酸镁0.8-1.2克/升、硫酸铜0.009-0.011克/升、氯化钴0.001-0.003克/升、硫酸锌0.001-0.002克/升、硫酸锰0.001-0.002克/升、钼酸钠0.001-0.003克/升、碳酸钙5-7克/升。

[0012] 在本发明一较佳实施例中，提供一种发酵培养基，包含：碳源、氮源和助剂；其中，所述碳源包括豆油、葡萄糖和麦芽糊精；所述氮源包括：黄豆饼粉和玉米浆；所述助剂包括：硫酸盐、碳酸盐、氯化盐、钼酸盐和消泡剂。优选地，各组份的浓度为：豆油0.25 5.0克/升、~
葡萄糖15 25克/升、麦芽糊精75 95克/升、黄豆饼粉20 30克/升、玉米浆7 9克/升。
~ ~ ~ ~

[0013] 优选地，所述硫酸盐为硫酸镁、硫酸铜、硫酸锌和硫酸锰的混合物；所述碳酸盐为碳酸钙；所述钼酸盐为钼酸钠。优选地，所述碳酸钙的浓度为5 7克/升，所述钼酸钠的浓度~为0.001 0.003克/升。
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[0014] 在本发明一较佳实施例中，提供一种发酵培养基，包含：碳源、氮源和助剂；其中，所述碳源包括豆油、葡萄糖和麦芽糊精；所述氮源包括：黄豆饼粉和玉米浆；所述助剂包括：硫酸镁、硫酸铜、硫酸锌、硫酸锰、碳酸钙、钼酸钠和消泡剂。优选地，各组份的浓度为：豆油
0.25 5.0克/升、葡萄糖15 25克/升、麦芽糊精75 95克/升、黄豆饼粉20 30克/升、玉米浆7~ ~ ~ ~ ~
9克/升、硫酸镁0.8 1.2克/升、硫酸铜0.009 0.011克/升、氯化钴0.001 0.003克/升、硫酸~ ~ ~
锌0.001 0.002克/升、硫酸锰0.001 0.002克/升、钼酸钠0.001 0.003克/升、碳酸钙5 7克/~ ~ ~ ~
升。并且，所述发酵培养基中所述消泡剂的质量分数为0.6-1.0%。

[0015] 进一步，所述发酵培养基按浓度计包括成分：豆油0.25-5.0克/升、葡萄糖15-25克/升、麦芽糊精75-95克/升、黄豆饼粉20-30克/升、玉米浆7-9克/升、硫酸镁0.8-1.2克/升、硫酸铜0.009-0.011克/升、氯化钴0.001-0.003克/升、硫酸锌0.001-0.002克/升、硫酸锰0.001-0.002克/升、钼酸钠0.001-0.003克/升、碳酸钙5-7克/升。

[0016] 进一步，所述发酵培养基中豆油的浓度为0.75-2.5克/升。

[0017] 进一步，所述发酵培养基中含有质量分数为0.6-1.0%的消泡剂。

[0018] 本发明还提供一种发酵工艺，利用上述任意一种发酵培养基。所述发酵工艺包括：将目标孢子的悬浮液加入至种子培养基中进行种子培养以获得目标种子液的步骤；以及，将种子液转接至所述发酵培养基中进行发酵培养的步骤。

[0019] 在本发明一实施例中，在发酵培养的步骤中，发酵培养的温度为26 30℃，发酵培~养时间为220 260小时。
~

[0020] 在本发明一实施例中，在发酵培养的步骤中，所述种子液占所述发酵培养基的体积比百分比为7 9%。~

[0021] 在本发明一较佳实施例中，提供一种尼莫克汀的发酵工艺，利用上述任意一种发酵培养基，包括如下步骤：将孢子悬浮液加入至种子培养基中进行种子培养，后转接至发酵培养基中，并置于反应器中进行发酵培养。

[0022] 进一步，所述孢子悬浮液的制备方法如下：将蓝灰色链霉菌接种于斜面培养基中，在26-30℃下培养6-8天，待孢子成熟时用无菌0.9%氯化钠溶液将孢子从斜面上刮洗下来并转接至无菌的带玻璃珠250毫升三角瓶中，以200-220转/分钟的转速震荡3-5分钟，打碎菌丝释放出孢子，得到孢子悬浮液，其浓度为2.8 3.2×107CFU/毫升，转接至无菌保菌管中备~用；
所述种子培养的具体方法如下：取1毫升的孢子悬浮液加入至种子培养基中，在温度为
25-30℃、转速为220-260转/分钟的条件下培养32-40小时，得到种子液；
所述发酵培养的具体方法如下：按7-9%的体积比将种子液转接到发酵培养基中，并在
26-30℃温度下培养220-260小时。

[0023] 进一步，所述种子液的离心压缩体积为20-22%。

[0024] 进一步，所述斜面培养基按浓度计包括组分：麦芽糖1.0-1.5克/升、酵母提取物3.5-4.5克/升、硫酸镁0.5-0.6克/升、碳酸钙0.8-1.2克/升、琼脂粉18-22克/升，并且所述斜面培养基的pH值为6.8-7.2；
所述种子培养基按浓度计包括组分：葡萄糖17-22克/升、麦芽糊精17-22克/升、黄豆饼粉12-17克/升、棉籽饼粉13-18克/升、磷酸氢二钾0.8-1.2克/升、硫酸镁0.8-1.2克/升，并且所述种子培养基的pH值为6.8-7.2。

[0025] 本发明中，蓝灰色链霉菌为华东理工大学国家生化工程技术研究中心保藏的蓝灰色链霉菌S-1。

[0026] 本发明的有益效果在于：①本发明通过在蓝灰色链霉菌生产尼莫克汀的发酵培养基中添加低浓度（0.25-5g/L）的豆油，可以有效提高菌体的生物量和产物合成单位。豆油作为一种碳源，在供氧充足的条件下很容易被好氧菌代谢利用，而在这个过程中，能够产生抗生素合成所需的酰基辅酶A和大量能量，可提高菌体的初级代谢活性，促进次级代谢过程中产物的合成，同时它也在一定程度上维持菌体的次级代谢活性，延长了尼莫克汀的有效发酵周期。本发明选择添加低浓度的豆油，可避免高浓度豆油的添加带来不利于菌体的生长和代谢的氧限制问题。

[0027] ②本发明在5L反应器上进行过程动态多参数采集，通过获得的实验参数可知本发明的豆油组中的蓝灰色链霉菌菌浓相对于对照组提高29%，尼莫克汀的产物浓度提高了27.33%，达到1475μg/mL，豆油的添加能够显著提高尼莫克汀的生物合成。同时，豆油的添加能够有效提高本发明蓝灰色链霉菌的初级代谢活性，其三羧酸循环效率更高，产生了大量的能量（ATP和NADH）用于菌体的生长和维持，在一定程度上也能维持菌体的次级代谢活性，延长尼莫克汀的合成期。
附图说明

[0028] 图1为本发明实施例5和对比例1中的菌形变化对比图。

[0029] 图2a-2d为本发明实施例5和对比例1中的蓝灰色链霉菌生长相关参数变化图，其中图2a为菌浓（PMV）变化图，图2b为干重变化图，图2c为比生长速率变化图，图2d为细胞活性TPF变化图。

[0030] 图3a-3b为本发明实施例5和对比例1中的总糖的变化图，其中图3a为残糖变化，图3b为糖的消耗速率变化。

[0031] 图4a-4b为本发明实施例5和对比例1中的尼莫克汀产物浓度的变化图，其中图4a为效价变化图，图4b为尼莫克汀比生产速率变化图。

[0032] 图5a-5c为本发明实施例5和对比例1中尼莫克汀合成相关的生理代谢参数变化图，其中图5a为溶氧（DO）变化图，图5b为氧消耗速率（OUR）变化图，图5c为pH变化图。

[0033] 图6a-6b为本发明实施例5和对比例1中尼莫克汀发酵过程中的胞外有机酸变化图，其中图6a为胞外丙酮酸（PYR）的变化图，图6b为胞外α-酮戊二酸（AKG）的变化图。

具体实施方式

[0034] 下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

[0035] 实施例1一种发酵培养基，用于尼莫克汀发酵，所述培养基中包含豆油，并且所述发酵培养基的pH值为7.5；
所述发酵培养基中包括碳源、氮源、助剂、消泡剂；其中，所述碳源包括豆油、葡萄糖、麦芽糊精；所述氮源包括黄豆饼粉、玉米浆；所述助剂包括硫酸镁、硫酸铜、氯化钴、硫酸锌、硫酸锰、钼酸钠、碳酸钙；
所述发酵培养基按浓度计包括成分：豆油5.0g/L、葡萄糖15g/L、麦芽糊精95g/L、黄豆饼粉20g/L、玉米浆9g/L、硫酸镁0.8g/L、硫酸铜0.011g/L、氯化钴0.001g/L、硫酸锌0.002g/L、硫酸锰0.001g/L、钼酸钠0.003g/L、碳酸钙5g/L；所述发酵培养基中含有质量分数为1.0%的消泡剂。

[0036] 所述尼莫克汀的发酵工艺，包括如下步骤：将孢子悬浮液加入至种子培养基中进行种子培养，后转接至发酵培养基中，并置于反应器中进行发酵培养；所述孢子悬浮液的制备方法如下：将蓝灰色链霉菌接种于斜面培养基中，在30℃下培养6天，待孢子成熟时用无菌0.9%氯化钠溶液将孢子从斜面上刮洗下来并转接至无菌的带玻璃珠250mL三角瓶中，以220rpm的转速震荡3min，打碎菌丝释放出孢子，得到孢子悬浮液，其浓度为3.2×107CFU/mL，转接至无菌保菌管中备用；
所述种子培养的具体方法如下：取1mL的孢子悬浮液加入至种子培养基中，在温度为25℃、转速为260rpm的条件下培养32h，得到种子液；所述种子液的离心压缩体积（PMV）为22%；
所述发酵培养的具体方法如下：按7%的体积比将种子液转接至发酵培养基中，并在26℃温度下培养260h；
所述斜面培养基按浓度计包括组分：麦芽糖1.0g/L、酵母提取物4.5g/L、硫酸镁0.5g/L、碳酸钙1.2g/L、琼脂粉18g/L，并且所述斜面培养基的pH值为7.2；所述种子培养基按浓度计包括组分：葡萄糖22g/L、麦芽糊精17g/L、黄豆饼粉17g/L、棉籽饼粉13g/L、磷酸氢二钾
0.8g/L、硫酸镁1.2g/L，并且所述种子培养基的pH值为6.8。

[0037] 实施例2一种发酵培养基，用于尼莫克汀发酵，所述培养基中包含豆油，并且所述发酵培养基的pH值为7.0；
所述发酵培养基中包括碳源、氮源、助剂、消泡剂；其中，所述碳源包括豆油、葡萄糖、麦芽糊精；所述氮源包括黄豆饼粉、玉米浆；所述助剂包括硫酸镁、硫酸铜、氯化钴、硫酸锌、硫酸锰、钼酸钠、碳酸钙；
所述发酵培养基按浓度计包括成分：豆油0.25g/L、葡萄糖25g/L、麦芽糊精75g/L、黄豆饼粉30g/L、玉米浆7g/L、硫酸镁1.2g/L、硫酸铜0.009g/L、氯化钴0.003g/L、硫酸锌0.001g/L、硫酸锰0.002g/L、钼酸钠0.001g/L、碳酸钙7g/L；所述发酵培养基中含有质量分数为0.6%的消泡剂。

[0038] 所述尼莫克汀的发酵工艺，包括如下步骤：将孢子悬浮液加入至种子培养基中进行种子培养，后转接至发酵培养基中，并置于反应器中进行发酵培养；所述孢子悬浮液的制备方法如下：将蓝灰色链霉菌接种于斜面培养基中，在26℃下培养8天，待孢子成熟时用无菌0.9%氯化钠溶液将孢子从斜面上刮洗下来并转接至无菌的带玻璃珠250mL三角瓶中，以200rpm的转速震荡5min，打碎菌丝释放出孢子，得到孢子悬浮液，其浓度为2.8×107CFU/mL，转接至无菌保菌管中备用；
所述种子培养的具体方法如下：取1mL的孢子悬浮液加入至种子培养基中，在温度为30℃、转速为220rpm的条件下培养40h，得到种子液；所述种子液的离心压缩体积（PMV）为20%；
所述发酵培养的具体方法如下：按9%的体积比将种子液转接至发酵培养基中，并在30℃温度下培养220h；
所述斜面培养基按浓度计包括组分：麦芽糖1.5g/L、酵母提取物3.5g/L、硫酸镁0.6g/L、碳酸钙0.8g/L、琼脂粉22g/L，并且所述斜面培养基的pH值为6.8；所述种子培养基按浓度计包括组分：葡萄糖17g/L、麦芽糊精22g/L、黄豆饼粉12g/L、棉籽饼粉18g/L、磷酸氢二钾
1.2g/L、硫酸镁0.8g/L，并且所述种子培养基的pH值为7.2。

[0039] 实施例3一种发酵培养基，用于尼莫克汀发酵，所述培养基中包含豆油，并且所述发酵培养基的pH值为7.4；
所述发酵培养基中包括碳源、氮源、助剂、消泡剂；其中，所述碳源包括豆油、葡萄糖、麦芽糊精；所述氮源包括黄豆饼粉、玉米浆；所述助剂包括硫酸镁、硫酸铜、氯化钴、硫酸锌、硫酸锰、钼酸钠、碳酸钙；
所述发酵培养基按浓度计包括成分：豆油2.5g/L、葡萄糖18g/L、麦芽糊精90g/L、黄豆饼粉22g/L、玉米浆9g/L、硫酸镁0.9g/L、硫酸铜0.01g/L、氯化钴0.002g/L、硫酸锌0.002g/L、硫酸锰0.001g/L、钼酸钠0.003g/L、碳酸钙5g/L；所述发酵培养基中含有质量分数为0.9%的消泡剂。

[0040] 所述尼莫克汀的发酵工艺，同实施例1。

[0041] 实施例4一种发酵培养基，用于尼莫克汀发酵，所述培养基中包含豆油，并且所述发酵培养基的pH值为7.2；
所述发酵培养基中包括碳源、氮源、助剂、消泡剂；其中，所述碳源包括豆油、葡萄糖、麦芽糊精；所述氮源包括黄豆饼粉、玉米浆；所述助剂包括硫酸镁、硫酸铜、氯化钴、硫酸锌、硫酸锰、钼酸钠、碳酸钙；
所述发酵培养基按浓度计包括成分：豆油0.75g/L、葡萄糖22g/L、麦芽糊精80g/L、黄豆饼粉27g/L、玉米浆8g/L、硫酸镁1g/L、硫酸铜0.01g/L、氯化钴0.002g/L、硫酸锌0.001g/L、硫酸锰0.002g/L、钼酸钠0.002g/L、碳酸钙6.5g/L；所述发酵培养基中含有质量分数为0.8%的消泡剂。

[0042] 所述尼莫克汀的发酵工艺，同实施例2。

[0043] 实施例5一种发酵培养基，用于尼莫克汀发酵，所述培养基中包含豆油，并且所述发酵培养基的pH值为7.4；
所述发酵培养基中包括碳源、氮源、助剂、消泡剂；其中，所述碳源包括豆油、葡萄糖、麦芽糊精；所述氮源包括黄豆饼粉、玉米浆；所述助剂包括硫酸镁、硫酸铜、氯化钴、硫酸锌、硫酸锰、钼酸钠、碳酸钙；
所述发酵培养基按浓度计包括成分：豆油1.5g/L、葡萄糖20g/L、麦芽糊精85g/L、黄豆饼粉25g/L、玉米浆8g/L、硫酸镁1.0g/L、硫酸铜0.01g/L、氯化钴0.002g/L、硫酸锌0.001g/L、硫酸锰0.001g/L、钼酸钠0.002g/L、碳酸钙6g/L；所述发酵培养基中含有质量分数为0.8%的消泡剂。

[0044] 所述尼莫克汀的发酵工艺，包括如下步骤：将孢子悬浮液加入至种子培养基中进行种子培养，后转接至发酵培养基中，并置于反应器中进行发酵培养；所述孢子悬浮液的制备方法如下：将蓝灰色链霉菌接种于斜面培养基中，在28℃下培养7天，待孢子成熟时用无菌0.9%氯化钠溶液将孢子从斜面上刮洗下来并转接至无菌的带玻璃珠250mL三角瓶中，以220rpm的转速震荡3min，打碎菌丝释放出孢子，得到孢子悬浮液，其浓度为3×107CFU/mL，转接至无菌保菌管中备用；
所述种子培养的具体方法如下：取1mL的孢子悬浮液加入至种子培养基中，在温度为28℃、转速为240rpm的条件下培养36h，得到种子液；所述种子液的离心压缩体积（PMV）为20%；
所述发酵培养的具体方法如下：按8%的体积比将所述种子液转接至所述发酵培养基中，并在28℃温度下培养240h；
所述斜面培养基按浓度计包括组分：麦芽糖1.3g/L、酵母提取物4.0g/L、硫酸镁0.55g/L、碳酸钙1g/L、琼脂粉20g/L，并且所述斜面培养基的pH值为7；所述种子培养基按浓度计包括组分：葡萄糖10g/L、麦芽糊精20g/L、黄豆饼粉20g/L、K2HPO41g/L、α-淀粉酶0.02g/L，并且所述种子培养基的pH值为7。

[0045] 对比例1对比例1与实施例5相比，区别仅在于：所述的发酵培养基中不添加豆油。

[0046] 试验例1（1）实验方法：为了进一步详细分析豆油对蓝灰色链霉菌菌体生长和产物尼莫克汀合成代谢的影响，以实施例5为豆油组、对比例1为对照组进行实验，在5L高级发酵罐系统（5L反应器）上进行过程动态多参数采集，并结合离线和在线参数，分析豆油对蓝灰色链霉菌代谢的影响和控制以及豆油在尼莫克汀合成过程中的作用。（本发明中5L反应器选自中国上海国强生化工程装备有限公司，用于微生物发酵）
（2）参数测定
①菌浓测定：
通过PMV法测定发酵液中菌体浓度。取10mL发酵液于10mL离心管中，4000rpm离心10min后，将上清与沉淀分离，沉淀物体积在10mL体积中所占百分比即为菌体PMV(Packed mycelia volume，PMV)。

[0047] ②尼莫克汀产量测定：通过高效液相色谱仪HPLC(Agilent 1100，USA)进行检测。采用安捷伦C18柱进行分离，流动相为1mL/min的甲醇：水（9：1）进行洗脱，柱温为30°C，检测波长为245nm。

[0048] ③pH测定：使用METTLER TOLEDO F120进行测定。

[0049] ④总糖浓度测定：采用3,5－二硝基水杨酸（3,5-Dinitrosalicylic acid，DNS）法测定。

[0050] ⑤细胞活性测定：采用氯代三苯基四氮唑（TTC）法测定细胞活性。通过添加200 μL发酵液，加入1mL
0.1mol/L Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液（pH=7.0）和50μL 0.5% TTC溶液混匀后在40℃下培养
3h，之后通过12000rpm离心去除上清，然后在沉淀中加入1mL甲醇并超声30min以提取胞内TPF（转铁蛋白），最后使用96孔板以及酶标仪在485nm下进行吸光度测定。

[0051] ⑥胞外有机酸测定：通过高效液相色谱仪（HPLC）进行分析。HPLC配备离子排斥柱和吸收检测器分光光度计。采用安捷伦H柱进行分离，流动相为0.5mL/min的10mmol/L H2SO4，柱温为50°C，检测波长为210nm。

[0052] 本实验中高效液相色谱仪采用日本岛津制作所制造的LC-20A高效液相色谱仪。

[0053] ⑦在线氧摄取率OUR及二氧化碳释放率CER检测：在线OUR及CER采用过程质谱仪进行测定，数据的采集使用生工中心自主研发的
Biostar 软件进行，能够将尾气质谱采集的数据在线处理并将服务器中存储的数据信息发送至终端电脑显示。OUR和CER计算的具体计算公式如下：
其中，Fin为通气流量（mmol/L），V为发酵液体积（L），Cinertin、CO2in和CCO2in分别为进气中的N2、O2和CO2的浓度（%），CO2out、CCO2out分别为尾气中O2和CO2的浓度，tin、Pin、h分别为温度、进气压力以及尾气湿度。尾气中O2、CO2检测的装置为尾气质谱仪，采用美国Extrel公司的MAX300-LG。

[0054] （3）结果分析：本发明以实施例5和对比例1为实验观察对象，在5L反应器中进行了过程动态多参数采集，得到图1-6以及表1，如下所示：
图1为本发明实施例5和对比例1中的菌形变化对比图；
图2a-2d为本发明实施例5和对比例1中的蓝灰色链霉菌生长相关参数变化图，其中图
2a为菌浓（PMV）变化图，图2b为干重变化图，图2c为比生长速率变化图，图2d为细胞活性TPF（转铁蛋白）变化图；
图3a-3b为本发明实施例5和对比例1中的总糖的变化图，其中图3a为残糖变化，图3b为糖的消耗速率变化；
图4a-4b为本发明实施例5和对比例1中的尼莫克汀产物浓度的变化图，其中图4a为效价变化图，图4b为尼莫克汀比生产速率变化图；
图5a-5c为本发明实施例5和对比例1中尼莫克汀合成相关的生理代谢参数变化图，其中图5a为溶氧（DO）变化图，图5b为氧消耗速率（OUR）变化图，图5c为pH变化图；
图6a-6b为本发明实施例5和对比例1中尼莫克汀发酵过程中的胞外有机酸变化图，其中图6a为胞外丙酮酸（PYR）的变化图，图6b为胞外α-酮戊二酸（AKG）的变化图。

[0055] 表1 不同发酵条件下尼莫克汀发酵参数汇总表aμ：比生长速率；
bYP/S：基于葡萄糖消耗的产物得率。

[0056] 如图1所示，从图1中可以看出生长期的菌丝逐渐伸长，菌丝体聚集成团粒，48h时菌丝团开始分化，菌丝开始变短，断裂的小菌丝也有所增多。比较豆油组和对照组，如图1所示，72 h以后，豆油组还有部分小菌丝团，而对照组已基本完全碎裂成小菌丝，这说明豆油的添加对菌丝团的维持有一定的作用。链霉菌的产物合成与菌形变化存在一定关系，部分链霉菌在丝状菌丝状态下的产物合成能够有所增加，但如果菌丝断裂严重，对产物合成速率也会有显著的负面影响。尼莫克汀发酵过程中后期，产物浓度较高的条件下菌丝会更长，同时也能维持一定的菌丝团形态，而本发明中豆油的添加能够较好地维持这种菌丝团，因此，豆油的添加能够有效维持次级代谢产物的合成。

[0057] 如图2a-2d、图3a-3b所示，从图2 a-2d中可以看出，0-36h菌体处于生长期，菌浓不断提高，经过短暂的稳定期后生物量从48h开始逐渐下降并进入次级代谢，而此时尼莫克汀大量合成。比较豆油组和对照组的发酵过程曲线变化，可以发现，在初级代谢阶段，添加豆油后菌体的生长量较对照组有明显增加（见图2a、2b、2c），豆油添加组最大菌浓（PMV）达到了38.76%，比对照组的最大菌浓（PMV为30.05%）高出了29%，并且豆油组和对照组的最高比生长速率分别能达到0.0249h-1和0.0237h-1。当菌体进入尼莫克汀合成期后，豆油组的PMV一直处于较高的水平，甚至发酵中后期的PMV仍能维持在22%以上，根据检测结果可知，本发明中豆油的添加能够有效维持次级代谢阶段菌浓。

[0058] 另一方面，豆油组的细胞活性水平始终高于对照组（见图2d），而葡萄糖消耗情况也显示在生长期（0-48h）间，豆油组的葡萄糖消耗速率要略高于对照组（见图3b）。综上所述，本发明中豆油的添加能够有效提高蓝灰色链霉菌的初级代谢活性，并提供能量从而有利于菌体的生长和维持。

[0059] 参考图4a-4b和表1，在产物合成方面，与对照组相比，发酵结束后放罐时豆油组的尼莫克汀效价为1475μg/mL，相对于对照组的1158μg/mL提高了27.33%。同时，豆油组的最高合成速率为10.839mg/L/h，比对照组高了24.61%，发酵过程中尼莫克汀的平均合成速率也明显高于对照组。此外，豆油组的比产率至发酵结束依然能维持在0.247mg/g/h，可见豆油的添加能有效维持次级代谢阶段的菌体活性，有利于产物合成。

[0060] 参考图5a-5c，根据图5a可知，在溶氧（Dissolved oxygen，DO）变化曲线中，两种培养工艺之间的变化趋势基本一致，但在整个过程中，豆油组溶氧始终略低于对照组。实验过程中进气量、罐压、转速等均保持一致，由此可知豆油组对氧的需求要大于实验组，印证了豆油组的代谢活性要优于对照组。

[0061] 此外，发酵过程中氧消耗速率（oxygen uptake rate，OUR）变化曲线能够直接反应细胞的呼吸代谢情况。根据图5b可知，豆油添加后菌体的OUR最高能够达到29.8 mmol/L/h，也明显高于对照组的26.7 mmol/L/h，表明豆油添加能够显著促进菌体的初级代谢活力，促使菌体浓度的增加。在192-240h间，豆油组的OUR能维持在9mmol/L/h左右，而对照组则呈快速下降趋势，最低降至5mmol/L/h左右，表明次级代谢阶段豆油组菌体活力优于对照组，能够较好地维持产物合成活性。

[0062] 如图5c所示，根据尼莫克汀发酵过程中的pH变化显示，对照组的pH值最低降至为5.6，而豆油组的pH值最低仅降至为6.3；从24h起两组pH值均开始逐步回升，豆油组在66h时pH值达到7.7，而对照组则在96h时才达到7.7。

[0063] 参考图6a-6b，为了考察发酵过程中pH值产生变化的原因，本发明对胞外有机酸进行了测定。发酵过程中主要检测到的胞外有机酸有α-酮戊二酸和丙酮酸。通过考察这两者的变化情况，如图6a-6b所示，发现在生长期（0-48h）胞外有机酸积累量较大，间接表明菌体的初级代谢活性较高，并且积累了大量能量，同时也可使发酵过程中得pH值产生变化；在48h后，两组的胞外丙酮酸浓度趋于0，而α-酮戊二酸的浓度也开始下降，表明菌体开始进入次级代谢状态。

[0064] 如图6a、6b所示，比较对照组和豆油组的胞外有机酸，发现在0-48h期间，对照组的胞外丙酮酸积累量高于豆油组的，而α-酮戊二酸的含量则是豆油组高于对照组。丙酮酸是尼莫克汀合成前体辅酶A物质的重要来源，而在供氧充足的条件下，豆油很容易通过EMP（糖酵解）以及TCA循环途径（三羧酸循环）产生丙酮酸，促进抗生素合成所需的酰基辅酶A和大量能量的积累，保证有充足的能量能够顺利进入呼吸链从而进行氧化磷酸化，更有利于菌体的代谢以及增强尼莫克汀的合成途径。而由于对照组胞外丙酮酸的浓度较高，导致其pH值偏低，同时其pH值回升也会更慢。

[0065] 综上所述，根据本发明的实验结果及其分析可知，本发明通过在蓝灰色链霉菌的发酵培养基中添加一定量的豆油，能够有效地提高菌体合成，有利于生物量的积累和产物的生产。

[0066] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

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