技术领域
[0001] 本
发明属于食品领域，尤其是食品行业中的豆瓣酱技术领域，具体为一种鉴定豆瓣酱发酵年份的方法。
背景技术
[0002] 发酵豆类食品美味可口、营养丰富、利于消化，而且具有一定的药用价值，在我国有上千年的历史，成为人们日常饮食中必不可少的
调味品。郫县豆瓣酱产于四川省成都市的郫县境内，其生产工艺主要包括甜瓣子的制作、辣椒坯制作及混合后发酵生香的3个重要工艺阶段。目前豆瓣酱有红油豆瓣，特级豆瓣，有的特级豆瓣发酵时间较长，可达到5年。这些陈年豆瓣
风味较好，受到消费者的喜爱。然而，目前尚无客观手段评价豆瓣酱的发酵时长，消费者与市场监管者均不能准确判断豆瓣酱的新老。
[0003] 豆瓣酱发酵由于
微生物及各理化因素的不断作用，不同发酵时间所成豆瓣酱的风味物质、
氨基态氮、
水分、氨基酸等含量有呈现出差异。例如，氨基酸总量等指标随着发酵时间的延长其含量呈增加趋势，另外的指标如水分则随发酵时间的延长而含量减少。因此，有望通过建立豆瓣酱发酵时长与各指标含量的关系，作为判断豆瓣酱发酵时长的依据。
发明内容
[0004] 本发明的目的是针对上述技术问题，提供一种鉴定豆瓣酱发酵年份的方法，也可以根据该方法较好的检测豆瓣酱发酵的效果。该方法以氨基态氮、氨基酸、总酸、水分等指标的关系为
基础，提出通过各指标含量综合判断郫县豆瓣酱新老、年份的方法，该鉴定方法可客观、准确的判断出豆瓣酱的发酵时长，以区分豆瓣酱品质。
[0005] 为了实现上述目的，本发明的具体技术方案为：
[0006] 一种鉴定豆瓣酱发酵年份的方法，其包括以下步骤：
[0007] 1)豆瓣酱中水分含量的测定，得水分含量Y水分，然后根据水分与发酵时长的关系式Y＝0.0012t2-0.2729t+60.527进行计算，得t水分；
[0008] 2)豆瓣酱中总酸含量的测定，得总酸含量Y总酸，然后根据总酸与发酵时长的关系式Y＝0.0001t2-0.0045t+1.5169进行计算，得t总酸；
[0009] 3)豆瓣酱中氨基态氮含量的测定，得氨基态氮含量Y氨基态氮，然后根据氨基态氮含量与发酵时长的关系式Y＝-7×10-6t2+0.0032t+0.2469进行计算，得t 氨基态氮；
[0010] 4)豆瓣酱中氨基酸总量的测定，得氨基酸总量Y氨基酸，然后根据总酸与发酵时长的-5 2关系式Y＝4×10 t+0.0136t+5.8975进行计算，得t氨基酸；
[0011] 5)计算：豆瓣发酵时间＝(t氨基酸+t氨基态氮+t水分+t总酸)/4。
[0012] 所述1)豆瓣酱中水分的测定方法，包括以下步骤：
[0013] 固体试样：将混合均匀的试样迅速磨细至颗粒小于2mm，不易
研磨的样品应尽可能切碎，称取10g试样(精确至0.0001g)，放入此称量瓶中，试样厚度不超过5mm，如为疏松试样，厚度不超过10mm，加盖，精密称量后，置101℃～105℃干燥箱中，瓶盖斜支于瓶边，干燥2h～4h后，盖好取出，放入干燥器内冷却0.5h后称量。然后再放入101℃～105℃干燥箱中干燥1h 左右，取出，放入干燥器内冷却0.5h后再称量。并重复以上操作至前后两次
质量差不超过2mg，即为恒重。
[0014] 所述2)豆瓣酱中总酸测定的方法，包括以下步骤：
[0015] 称取约20.0g已研磨均匀的样品置于200mL小烧杯中，加入100mL水 (充分搅匀，必要时加热)，充分搅拌移入容量瓶中定容至200mL，混匀过滤得到样品稀释液备用。吸取10mL稀释液于200mL烧杯中，加入60mL 水，用NaOH标准溶液[c(NaOH)＝0.050mol/L]滴定至pH 8.2，记录消耗NaOH 标准溶液的体积(mL)，
[0016] 计算可以得到总酸含量试样中的总酸含量(以乳酸计)：
[0017]
[0018] 式中：
[0019] X总酸——试样中的总酸含量(以乳酸计)，单位为克每百克(g/100g)；
[0020] V1——测定试样稀释液消耗NaOH标准滴定溶液的体积，单位毫升 (mL)；
[0021] V2——
试剂空白消耗NaOH标准滴定溶液的体积，单位为毫升(mL)；
[0022] V3——试样稀释液取用量，单位为毫升(mL)；
[0023] c——NaOH标准滴定溶液的浓度，单位为摩尔每升(mol/L)；
[0024] 0.090——与1.00mL NaOH标准溶液[c(Na OH)＝1.000mol/L]相当的乳酸的质量，单位为克(g)。
[0025] 所述3)豆瓣酱中氨基态氮测定的方法，包括以下步骤：
[0026] 豆瓣酱中氨基态氮的测定：称取约20.0g已研磨均匀的样品置于200mL 小烧杯中，加入100mL水(充分搅匀，必要时加热)，充分搅拌移入容量瓶中定容至200mL，混匀过滤得到样品稀释液备用。于200mL烧杯中加入10mL 稀释液、60mL水，用NaOH标准溶液[c(Na OH)＝0.050mol/L]滴定至pH计指示pH 8.2，记录消耗NaOH标准溶液的体积(mL)。加入10.0mL甲
醛溶液并混匀，再继续用NaOH标准溶液滴定，记录pH 9.2时消耗的NaOH标准溶液的体积(mL)。
同时取70mL水，先用NaOH标准溶液调节pH为8.2，再加入10.0mL甲醛溶液，混匀后继续用NaOH标准溶液滴定至pH 9.2，同时做试剂空白试验。
[0027] 试样中氨基态氮的含量：
[0028]
[0029] X氨基态氮——试样中氨基态氮的含量，单位为克每百克(g/100g)；
[0030] V1——测定用试样稀释液加入甲醛后消耗NaOH标准滴定溶液的体积，单位毫升(mL)；
[0031] V2——试剂空白加入甲醛后消耗NaOH标准滴定溶液的体积，单位为毫升 (mL)；
[0032] V3——试样稀释液取用量，单位为毫升(mL)；
[0033] c——NaOH标准滴定溶液的浓度，单位为摩尔每升(mol/L)；
[0034] 0.014——与1.00mL NaOH标准溶液[C(Na OH)＝1.000mol/L]相当的氮的质量，单位为克(g)。
[0035] 步骤4)豆瓣酱中氨基酸总量的测定方法，包括以下步骤：
[0036] 氨基酸的测定采用L-8900型全自动氨基酸分析仪，HATACHI(日本日立)，根据GB5009.124-2016测定。
[0037] (1)试样制备
[0038] 固体或半固体试样使用组织
粉碎机或研磨机粉碎,液体试样用匀浆机打成匀浆密封冷冻保存，分析用时将其解冻后使用。
[0039] 准确称取5g样品置于
水解管中。在水解管内加10mL
盐酸溶液。继续向水解管内加入
苯酚3滴-4滴。将水解管放入冷冻剂中，冷冻3-5min。接到
真空泵的抽气管上。抽真空(接近0Pa)，然后充入氮气，重复抽真空-充入氮气3 次后，在充氮气状态下封口或拧紧螺丝盖。将已封口的水解管放在 110℃±1℃的电热鼓风恒温箱或水解炉内，水解22h后，取出，冷却至室温。打开水解管，将水解液过滤至50mL容量瓶内,用少量水多次冲洗水解管，水洗液移入同一50mL容量瓶内，最后用水定容至刻度，振荡混匀。准确吸取1.0mL滤液移入到15mL试管内，用试管浓缩仪或平行
蒸发仪在50℃加热环境下减压干燥，干燥后残留物用1-2mL水溶解，再减压干燥，最后蒸干。
[0040] 用1.0mL pH 2.2的
柠檬酸钠缓冲溶液加入到干燥后试管内溶解，振荡混匀后，吸取溶液通过0.22μm滤膜后，转移至仪器进样瓶，为样品测定液，供仪器测定用。
[0041] (2)测定
[0042] 色谱参考条件
[0044] b)检测
波长：570nm和440nm。
[0045] 试样的测定
[0046] 混合氨基酸标准工作液和样品测定液分别以相同体积注入氨基酸分析仪，以外标法通过峰面积计算样品测定液中氨基酸的浓度。
[0047] 本发明的积极效果为：
[0048] (一)、本发明通过测定豆瓣酱发酵时长相关的各指标含量，采用多指标综合判断豆瓣酱发酵时长。根据本方法，测定其水分、氨基酸总量、氨基态氮、总酸含量，将所测得指标数值代入该指标对应的公式，得到该豆瓣酱的发酵时长。测定多个指标与
数据库对比后取得到发酵时长的平均值；若有出入较大者则去掉其最高、最低值，得到豆瓣酱发酵的一个时间范围。
[0049] (二)、首次提出通过测定豆瓣酱发酵时长相关的各指标含量判断豆瓣酱发酵时长的技术，提出的方法客观、准确，使人们可较好的判断出豆瓣酱的生产年份、晾晒时长等重要信息。
附图说明
[0050] 图1为豆瓣发酵时间与水分含量的关系曲线图；
[0051] 图2为豆瓣发酵时间与总酸含量的关系曲线图；
[0052] 图3为豆瓣发酵时间与氨基态氮含量的关系曲线图；
[0053] 图4为发酵时间与氨基酸的关系曲线图。
具体实施方式
[0054] 为了使本发明的发明目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合具体实施方式对本发明作进一步的详细描述，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于下述
实施例。
[0055] 从某豆瓣生产厂家直接取不同发酵时间的豆瓣酱为样品进行测定。
[0056] 一种鉴定豆瓣酱发酵年份的方法，其包括以下步骤：
[0057] 1)豆瓣酱中水分含量的测定，得水分含量Y水分，然后根据水分与发酵时长的关系式Y＝0.0012t2-0.2729t+60.527进行计算，得t水分；
[0058] 2)豆瓣酱中总酸含量的测定，得总酸含量Y总酸，然后根据总酸与发酵时长的关系式2
Y＝0.0001t-0.0045t+1.5169进行计算，得t总酸；
[0059] 3)豆瓣酱中氨基态氮含量的测定，得氨基态氮含量Y氨基态氮，然后根据氨基态氮含量与发酵时长的关系式Y＝-7×10-6t2+0.0032t+0.2469进行计算，得t 氨基态氮；
[0060] 4)豆瓣酱中氨基酸总量的测定，得氨基酸总量Y氨基酸，然后根据总酸与发酵时长的关系式Y＝4×10-5t2+0.0136t+5.8975进行计算，得t氨基酸；
[0061] 5)计算：豆瓣发酵时间＝(t氨基酸+t氨基态氮+t水分+t总酸)/4。
[0062] 所述1)豆瓣酱中水分的测定方法，包括以下步骤：
[0063] 固体试样：将混合均匀的试样迅速磨细至颗粒小于2mm，不易研磨的样品应尽可能切碎，称取10g试样(精确至0.0001g)，放入此称量瓶中，试样厚度不超过5mm，如为疏松试样，厚度不超过10mm，加盖，精密称量后，置101℃～105℃干燥箱中，瓶盖斜支于瓶边，干燥2h～4h后，盖好取出，放入干燥器内冷却0.5h后称量。然后再放入101℃～105℃干燥箱中干燥1h 左右，取出，放入干燥器内冷却0.5h后再称量。并重复以上操作至前后两次质量差不超过2mg，即为恒重。
[0064] 发酵时间与水分含量的关系
[0065] 图1所示为郫县豆瓣酱的晾晒时间与其中水分含量的关系。结果表明，随着发酵时间的增加，豆瓣酱中水分含量呈逐渐减少趋势，由10个月时的58％降至96个月时的45％。即发酵时间越长，郫县豆瓣酱中的水分含量越低。水分和发酵时间拟合函数关系为：
[0066] Y＝0.0012t2-0.2729t+60.527进行计算，得t水分：晾晒时间(月)。
[0067] 所述2)豆瓣酱中总酸测定的方法，包括以下步骤：
[0068] 称取约20.0g已研磨均匀的样品置于200mL小烧杯中，加入100mL水 (充分搅匀，必要时加热)，充分搅拌移入容量瓶中定容至200mL，混匀过滤得到样品稀释液备用。吸取10mL稀释液于200mL烧杯中，加入60mL 水，用NaOH标准溶液[c(NaOH)＝0.050mol/L]滴定至pH 8.2，记录消耗NaOH 标准溶液的体积(mL)，
[0069] 计算可以得到总酸含量试样中的总酸含量(以乳酸计)：
[0070]
[0071] 式中：
[0072] X——试样中的总酸含量(以乳酸计)，单位为克每百克(g/100g)；
[0073] V1——测定试样稀释液消耗NaOH标准滴定溶液的体积，单位毫升 (mL)；
[0074] V2——试剂空白消耗NaOH标准滴定溶液的体积，单位为毫升(mL)；
[0075] V3——试样稀释液取用量，单位为毫升(mL)；
[0076] c——NaOH标准滴定溶液的浓度，单位为摩尔每升(mol/L)；
[0077] 0.090——与1.00mL NaOH标准溶液[c(Na OH)＝1.000mol/L]相当的乳酸的质量，单位为克(g)。
[0078] 发酵时间与总酸的关系
[0079] 图2所示为豆瓣酱的晾晒时间与其中总酸含量的关系。豆瓣酱中总酸含量随着发酵时间的延长呈总体增加趋势。其中，10个月至24个月期间总酸含量略有降低；发酵24个月以后豆瓣酱中的总酸含量逐渐增加，发酵96个月后达 2.25g/kg。总酸和发酵时间拟合函数关系为：Y＝0.0001t2-0.0045t+1.5169进行计算，；Y：总酸(g/kg)，t：晾晒时间(月)。
[0080] 所述3)豆瓣酱中氨基态氮测定的方法，包括以下步骤：
[0081] 豆瓣酱中氨基态氮的测定：称取约20.0g已研磨均匀的样品置于200mL 小烧杯中，加入100mL水(充分搅匀，必要时加热)，充分搅拌移入容量瓶中定容至200mL，混匀过滤得到样品稀释液备用。于200mL烧杯中加入10mL 稀释液、60mL水，用NaOH标准溶液[c(Na OH)＝0.050mol/L]滴定至pH计指示pH 8.2，记录消耗NaOH标准溶液的体积(mL)。加入10.0mL甲醛溶液并混匀，再继续用NaOH标准溶液滴定，记录pH 9.2时消耗的NaOH标准溶液的体积(mL)。
同时取70mL水，先用NaOH标准溶液调节pH为8.2，再加入10.0mL甲醛溶液，混匀后继续用NaOH标准溶液滴定至pH 9.2，同时做试剂空白试验。
[0082] 试样中氨基态氮的含量：
[0083]
[0084] X——试样中氨基态氮的含量，单位为克每百克(g/100g)；
[0085] V1——测定用试样稀释液加入甲醛后消耗NaOH标准滴定溶液的体积，单位毫升(mL)；
[0086] V2——试剂空白加入甲醛后消耗NaOH标准滴定溶液的体积，单位为毫升 (mL)；
[0087] V3——试样稀释液取用量，单位为毫升(mL)；
[0088] c——NaOH标准滴定溶液的浓度，单位为摩尔每升(mol/L)；
[0089] 0.014——与1.00mL NaOH标准溶液[c(Na OH)＝1.000mol/L]相当的氮的质量，单位为克(g)。
[0090] 发酵时间与氨基酸态氮的关系
[0091] 图3所示为豆瓣酱中氨基态氮含量与发酵时长的关系。结果显示，郫县豆瓣酱中氨基酸态氮含量随其发酵时间逐渐增加，其含量由10个月时的0.27 g/100g增加至96个月时的0.49g/100g。氨基态氮和发酵时间拟合函数关系为：Y＝-7×10-6t2+0.0032t+0.2469；Y：氨基态氮(g/100g)，t：晾晒时间 (月)。
[0092] 步骤4)豆瓣酱中氨基酸总量的测定方法，包括以下步骤：
[0093] 氨基酸的测定采用L-8900型全自动氨基酸分析仪，HATACHI(日本日立)，根据GB5009.124-2016测定。
[0094] (1)试样制备
[0095] 固体或半固体试样使用组织粉碎机或研磨机粉碎,液体试样用匀浆机打成匀浆密封冷冻保存，分析用时将其解冻后使用。
[0096] 准确称取5g样品置于水解管中。在水解管内加10mL盐
酸溶液。继续向水解管内加入苯酚3滴-4滴。将水解管放入冷冻剂中，冷冻3-5min。接到
真空泵的抽气管上。抽真空(接近0Pa)，然后充入氮气，重复抽真空-充入氮气3 次后，在充氮气状态下封口或拧紧螺丝盖。将已封口的水解管放在 110℃±1℃的电热鼓风恒温箱或水解炉内，水解22h后，取出，冷却至室温。打开水解管，将水解液过滤至50mL容量瓶内,用少量水多次冲洗水解管，水洗液移入同一50mL容量瓶内，最后用水定容至刻度，振荡混匀。准确吸取1.0mL滤液移入到15mL试管内，用试管浓缩仪或平行蒸发仪在50℃加热环境下减压干燥，干燥后残留物用1-2mL水溶解，再减压干燥，最后蒸干。
[0097] 用1.0mL pH 2.2的柠檬酸钠缓冲溶液加入到干燥后试管内溶解，振荡混匀后，吸取溶液通过0.22μm滤膜后，转移至仪器进样瓶，为样品测定液，供仪器测定用。
[0098] (2)测定
[0099] 色谱参考条件
[0100] a)色谱柱:磺酸型阳离子树脂：
[0101] b)检测波长：570nm和440nm。
[0102] 试样的测定
[0103] 混合氨基酸标准工作液和样品测定液分别以相同体积注入氨基酸分析仪，以外标法通过峰面积计算样品测定液中氨基酸的浓度。
[0104] 发酵时间与氨基酸含量的关系
[0105] 图4所示为豆瓣酱中氨基酸含量与发酵时长的关系。结果显示，郫县豆瓣酱中氨基酸含量随其发酵时间逐渐增加，经过96个月的发酵，其中氨基酸总量达到7.63g/kg。氨基酸含量和发酵时间拟合函数关系为：Y＝4×10-5t2+ 0.0136t+5.8975；Y：氨基酸含量(g/100g)，t：晾晒时间(月)。
[0106] 实施例1：
[0107] 取一豆瓣酱样品(取自某一豆瓣酱厂家，80个月)，采用上述方法进行测定后：其氨基酸含量为7.2g/kg，氨基态氮含量为0.45g/100g，水分为 46.00％，总酸含量为1.83g/100g。已知各指标与豆瓣酱发酵时长的关系如下：
[0108] 公式1，氨基酸含量与发酵时长的关系：Y＝4×10-5t2+0.0136t+5.8975[0109] 公式2，氨基态氮含量与发酵时长的关系：Y＝-7×10-6t2+0.0032t+ 0.2469[0110] 公式3，水分与发酵时长的关系：Y＝0.0012t2-0.2729t+60.527
[0111] 公式4，总酸与发酵时长的关系：Y＝0.0001t2-0.0045t+1.5169
[0112] 分别将各指标值带入拟合的函数，计算出该豆瓣的发酵时间分别为：
[0113] t氨基酸＝77.94(月) t氨基态氮＝76.16(月) t水分＝85.01(月) t总酸＝83.00(月)[0114] 豆瓣发酵时间＝(t氨基酸+t氨基态氮+t水分+t总酸)/4＝80.53(月)
[0115] 根据本发明的判断方法，该豆瓣酱的发酵时长约为81个月，实际发酵时长为80个月，预测年份与实际年份一致。
[0116] 实施例2：
[0117] 取一豆瓣酱样品(取自某一豆瓣酱厂家，48个月)，采用上述方法进行测定后：其氨基酸含量为6.7g/kg，氨基态氮含量为0.38g/100g，水分为 50.00％，总酸含量为1.62g/100g。已知各指标与豆瓣酱发酵时长的关系如下：
[0118] 公式1，氨基酸含量与发酵时长的关系：Y＝4×10-5t2+0.0136t+5.8975[0119] 公式2，氨基态氮含量与发酵时长的关系：Y＝-7×10-6t2+0.0032t+ 0.2469[0120] 公式3，水分与发酵时长的关系：Y＝0.0012t2-0.2729t+60.527
[0121] 公式4，总酸与发酵时长的关系：Y＝0.0001t2-0.0045t+1.5169
[0122] 分别将各指标值带入拟合的函数，计算出该豆瓣的发酵时间分别为：
[0123] t氨基酸＝51.27(月) t氨基态氮＝46.28(月) t水分＝49.23(月) t总酸＝46.00(月)[0124] 豆瓣发酵时间＝(t氨基酸+t氨基态氮+t水分+t总酸)/4＝48.2(月)
[0125] 根据本发明的判断方法，该豆瓣酱的发酵时长约为48个月，实际发酵时长为48个月，预测年份与实际年份一致。
[0126] 实施例3：
[0127] 取一豆瓣酱样品(取自某一豆瓣酱厂家，60个月)，采用上述方法进行测定后：其氨基酸含量为6.85g/kg，氨基态氮含量为0.41g/100g，水分为 49.00％，总酸含量为1.68g/100g。已知各指标与豆瓣酱发酵时长的关系如下：
[0128] 公式1，氨基酸含量与发酵时长的关系：Y＝4×10-5t2+0.0136t+5.8975[0129] 公式2，氨基态氮含量与发酵时长的关系：Y＝-7×10-6t2+0.0032t+ 0.2469[0130] 公式3，水分与发酵时长的关系：Y＝0.0012t2-0.2729t+60.527
[0131] 公式4，总酸与发酵时长的关系：Y＝0.0001t2-0.0045t+1.5169
[0132] 分别将各指标值带入拟合的函数，计算出该豆瓣的发酵时间分别为：
[0133] t氨基酸＝59.59(月) t氨基态氮＝58.44(月) t水分＝56.06(月) t总酸＝58.80 (月)[0134] 豆瓣发酵时间＝(t氨基酸+t氨基态氮+t水分+t总酸)/4＝58.22(月)
[0135] 根据本发明的判断方法，该豆瓣酱的发酵时长约为58个月，实际发酵时长为60个月，预测年份与实际年份一致。
[0136] 本
申请经过多批(＞50次)检测，豆瓣酱实际发酵年份与经本方法预测的年份准确率为100％。
[0137] 本发明以豆瓣酱发酵时长与水分、氨基酸、氨基态氮、总酸含量等指标的关系为基础，提出通过各指标含量综合判断郫县豆瓣酱新老、年份的方法。具体来讲，豆瓣酱中的水分随着晾晒时间的延长而呈降低趋势，如晾晒10个月到96个月期间，水分值由58％降至45％；而氨基酸、氨基酸态氮、总酸等指标则随发酵时长呈含量逐渐增加趋势。如晾晒时间
10、24、36、54、72、84、 96个月期间，郫县豆瓣酱中氨基态氮的平均含量分别为0.27、0.32、
0.37、 0.40、0.42、0.47、0.49g/100g。因此，通过测定豆瓣酱中相应指标的含量可判断其晾晒时长及生产年份；指标越多则越能精准判断该值。
[0138] 由以上结果可以看出，不同年份样品的发酵年份与实际年份一致，说明该方法能够用于检测分析出豆瓣酱的发酵年份。
[0139] 以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何
修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
