成纤维细胞生长因子受体2的致癌异构体的抗体分子及其用途
阅读：762发布：2022-06-03
专利汇可以提供成纤维细胞生长因子受体2的致癌异构体的抗体分子及其用途专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种特异性结合至高度增生细胞（例如癌细胞或 肿瘤 细胞）的致癌表型所表达和/或相关的一个或多个蛋白异构体的 抗体 分子。所述蛋白异构体结合抗体分子能用于 治疗 ， 预防 和/或诊断癌症病情和/或 疾病 。同时也公开了使用蛋白异构体结合分子以选择性检测致癌的蛋白异构体，在体外，间接体内或体内降低表达致癌异构体的高度增生细胞的活性，和/或诱导表达致癌异构体的高度增生细胞自杀的方法。同时也公开了用于评估致癌异构体的功能或表达的诊断和/或筛选方法以及 试剂 。，下面是成纤维细胞生长因子受体2的致癌异构体的抗体分子及其用途专利的具体信息内容。
1.一种抗体分子，该抗体分子结合至人成纤维细胞生长因子受体2（FGFR2）亚型Ⅲc或其片段，并显示出与人FGFR2亚型Ⅲb低于10%的交叉反应性。
2.根据权利要求1所述的抗体分子，其特征在于，所述抗体分子选择性地结合至FGFR2的外显子Ⅲ编码的氨基酸序列，所述氨基酸序列与FGFR2-Ⅲc约301至360位的氨基酸(SEQ ID NO:2)、FGFR2-Ⅲc约314至324位的氨基酸(AAGVNTTDKEI,SEQ ID NO:4)、FGFR2-Ⅲc约328至337位的氨基酸(YIRNVTFEDA,SEQ ID NO:6)、FGFR2-ⅢC约350至
353位的氨基酸(ISFH,SEQ ID NO:8)、FGFR2Ⅲc约314-353位的氨基酸残基(AAGVNTTDKEIEVLYIRNVTFEDAGEYTCLAGNSIGISFH(SEQ ID NO:84))或FGFR2-Ⅲc约342至353位的氨基酸(TCLAGNSIGISFH(SEQ ID NO:86)相对应。
3.根据权利要求2所述的抗体分子，其特征在于，所述抗体分子选择性地结合至以下各项中的一个或多个：SEQ ID NO:84的第1位的丙氨酸，第2位丙氨酸，第4位缬氨酸，第6位苏氨酸，第7位苏氨酸，第8位天冬氨酸，第9位赖氨酸，第11位异亮氨酸，第12位谷氨酸，第13位缬氨酸，第15位酪氨酸，第16位异亮氨酸，第17位精氨酸，第21位苯丙氨酸，第22位谷氨酸，第28位苏氨酸，第30位亮氨酸，第31位丙氨酸，第32位甘氨酸，第34位丝氨酸，第37位异亮氨酸，第38位丝氨酸，第39位苯丙氨酸或第40位组氨酸(与AAGVNTTDKEIEVLYIRNVTFEDAGEYTCLAGNSIGISFH(SEQ ID NO:84)突出显示的氨基酸残基对应)；或SEQ ID NO:86的第1位苏氨酸，第3位亮氨酸，第4位丙氨酸，第5位甘氨酸，第7位丝氨酸，第
10位异亮氨酸，第11位丝氨酸，第12位苯丙氨酸或第13位组氨酸(与TCLAGNSIGISFH;SEQ ID NO:86突出显示的氨基酸残基对应)。
4.根据权利要求3所述的抗体分子，其特征在于，所述抗体分子显示出与人FGFR2亚型Ⅲb的氨基酸序列少于10%的交叉反应性，所述人FGFR2亚型Ⅲb的氨基酸序列选自：
人FGFR2亚型Ⅲb约314至351位的氨基酸(HSGINSSNAEVLALFNVTEADAGEYICKVSNYIGQANQ;SEQ ID NO:56)，人FGFR2亚型Ⅲb约314至328位的氨基酸(HSGINSSNAEVLALF;SEQ ID NO:57)，人FGFR2亚型Ⅲb约340至351位的氨基酸(CKVSNYIGQANQ;SEQ ID NO:58)。
5.根据权力要求2所述的抗体分子，其特征在于，所述抗体分子具有一个或多个选自以下各项的生物性质：
(i)所述抗体分子与单克隆抗体Atto-MuMab-01、Atto-MuMab-02或Atto-MuMab-03竞争结合；
(ii)所述抗体分子与人单克隆抗体Atto-HuMab-01、Atto-HuMab-06或Atto-HuMab-08竞争结合；
(iii)结合至FGFR2Ⅲc的314至353位(AAGVNTTDKEIEVLYIRNVTFEDAGEYTCLAGNSIGISFH(SEQ ID NO:84)的至少一个氨基酸残基；或结合至人FGFR2-Ⅲc的TCLAGNSIGISFH(SEQ ID NO:86)的至少一个氨基酸残基；
(iv)主要结合至存在于人FGFR2-Ⅲc中、但不是存在于人FGFR2-Ⅲb中的至少一个氨基酸残基，所述至少一个氨基酸残基选自以下各项中的一个或多个：SEQ ID NO:84的第1位的丙氨酸、第2位丙氨酸、第4位缬氨酸、第6位苏氨酸、第7位苏氨酸、第8位天冬氨酸、第9位赖氨酸、第11位异亮氨酸、第12位谷氨酸、第13位缬氨酸、第15位酪氨酸、第16位异亮氨酸、第17位精氨酸、第21位苯丙氨酸、第22位谷氨酸、第28位苏氨酸、第30位亮氨酸、第31位丙氨酸、第32位甘氨酸、第34位丝氨酸、第37位异亮氨酸、第38位丝氨酸、第
39位苯丙氨酸或第40位组氨酸(对应于AAGVNTTDKEIEVLYIRNVTFEDAGEYTCLAGNSIGISFH(SEQ ID NO:84)中突出显示的氨基酸残基)；或选自以下各项中的一个或多个：SEQ ID NO:86的第1位苏氨酸、第3位亮氨酸、第4位丙氨酸、第5位甘氨酸、第7位丝氨酸、第10位异亮氨酸、第11位丝氨酸、第12位苯丙氨酸或第13位组氨酸(对应于TCLAGNSIGISFH;SEQ ID NO:86中突出显示的氨基酸残基)；
(v)结合至重组、合成或天然人FGFR2-Ⅲc；
(vi)结合至存在于DU145人前列腺癌细胞系上的天然FGFR2-Ⅲc；
(vii)展示了与单克隆抗体Atto-MuMab-01、Atto-MuMab-02或Atto-MuMab-03相同或相似的结合至FGFR2-Ⅲc的结合选择性；
(viii)展示了与人单克隆抗体Atto-HuMab-01、Atto-HuMab-06或Atto-HuMab-08相同或相似的结合至人FGFR2-Ⅲc的结合选择性；
(ix)展示了与单克隆抗体Atto-MuMab-01、Atto-MuMab-02或Atto-MuMab-03相同或相似的结合至人FGFR2-Ⅲc的结合亲和力；
(x)展示了与人单克隆抗体Atto-HuMab-01、Atto-HuMab-06或Atto-HuMab-08相同或相似的结合至人FGFR2-Ⅲc的结合亲和力；
(xi)展示了与单克隆抗体Atto-MuMab-01、Atto-MuMab-02或Atto-MuMab-03相同或相似的结合动力学；和/或
(xii)展示了与人单克隆抗体Atto-HuMab-01、Atto-HuMab-06或Atto-HuMab-08相同或相似的结合动力学。
6.根据权利要求5所述的抗体分子，其特征在于，所述抗体分子为人单克隆抗体Atto-HuMab-01、Atto-HuMab-06或Atto-HuMab-08。
7.根据权利要求5所述的抗体分子，其特征在于，所述抗体分子具有重链可变区，所述重链可变区包括来自于Atto-MuMab-02、Atto-HuMab-01、Atto-HuMab-06或Atto-HuMab-08的重链可变区的至少一个互补决定区（CDR），其中所述至少一个互补决定区含有：分别展示于图35、28、29F、30F、37A、38、39或40的氨基酸序列，或由分别展示于图34A、29E、30E或
37B的CDR核苷酸序列编码的氨基酸序列，或与其至少95%一致或具有一个氨基酸取代、插入或缺失的氨基酸序列。
8.根据权利要求5所述的抗体分子，其特征在于，所述抗体分子具有轻链可变
区，所述轻链可变区包括分别来自Atto-MuMab-02、Atto-HuMab-01、Atto-HuMab-06或Atto-HuMab-08的轻链可变区的至少一个互补决定区（CDR），其中所述至少一个CDR含有：
展示于图35、28、29D、30D、37A、38、39或40的氨基酸序列，或由分别展示于图34B、29C、30C或37B的CDR核苷酸序列编码的氨基酸序列，或与其至少95%一致或具有一个氨基酸取代、插入或缺失的氨基酸序列。
9.根据权利要求5所述的抗体分子，其特征在于，所述抗体分子包含来自于
Atto-MuMab-02、Atto-HuMab-01、Atto-HuMab-06或Atto-HuMab-08的重链和轻链可变区的所有六个互补决定区（CDR），其中所述六个互补决定区（CDR）含有：分别展示于图35、28、
29D、29F、30D、30F、37A、38、39或40中的氨基酸序列，或由展示于图34A、34B、29C、29E、30C、
30E或37B中的CDR核苷酸序列编码的氨基酸序列，或与其至少95%一致或具有一个氨基酸取代、插入或缺失的氨基酸序列。
10.根据权利要求5所述的抗体分子，其特征在于，所述抗体分子包含来自重链可变区的至少一个、两个或三个CDR，所述重链可变区具有选自以下的氨基酸序列：CDR1的SSYAIS(SEQ ID NO:147)，或CDR2的RIIPIX1G X2ANYAQKFQGR，其中X1为F或L，并且X2为T或I(SEQ ID NO:153)，或CDR3的RDX1X2X3W X4X5X6FDX7，其中X1为R或P，X2为W或L，X3为D或L，X4为N或S，X5为D或缺失，X6为A或Y，并且X7为I或Y(SEQ ID NO:154)。
11.根据权利要求5所述的抗体分子，其特征在于，所述抗体分子包含来自轻链可变区的至少一个、两个或三个CDR，所述轻链可变区具有选自以下的氨基酸序列：CDR1的SGSSSNIG X1N X2V X3(SEQ ID NO:150)，其中X1为S或N，X2为T或Y，并且X3为S或N，或CDR2的X1NN X2RPSG X3，其中X1为S或DD，X2为Q或K，并且X3为V或I(SEQ ID NO:151)，或CDR3的X1X2WD X3SLX4X5VV，其中X1为A或G,X2为A或T,X3为D或S,X4为N或S，并且X5为G或A(SEQ ID NO:152)。
12.根据权利要求5所述的抗体分子，其特征在于，所述抗体分子包含：
(i)来自重链可变区的至少一个、两个或三个CDR，所述重链可变区具有选自以下的氨基酸序列：CDR1的SSYAIS(SEQ ID NO:147)，或CDR2的RIIPIX1G X2ANYAQKFQGR(SEQ ID NO:153)，其中X1为F或L，并且X2为T或I，或CDR3的RD X1X2X3W X4X5X6FDX7，其中X1为R或P，X2为W或L，X3为D或L，X4为N或S，X5为D或缺失，X6为A或Y，并且X7为I或Y(SEQ ID NO:154)；并且
(ii)来自轻链可变区的至少一个，两个或三个CDRs，所述轻链可变区具有选自以下的氨基酸序列：CDR1的SGSSSNIG X1N X2V X3，其中X1为S或N，X2为T或Y，并且X3为S或N(SEQ ID NO:150)，或CDR2的X1NN X2RPSG X3，其中X1为S或DD，X2为Q或K，并且X3为V或I(SEQ ID NO:151)，或CDR3的X1X2WD X3SLX4X5VV，其中X1为A或G,X2为A或T,X3为D或S,X4为N或S，并且X5为G或A(SEQ ID NO:152)。
13.根据权利要求5所述的抗体分子，其特征在于，所述抗体分子包含：
(i)来自重链可变区的三个CDR，所述重链可变区具有选自以下的氨基酸序列：CDR1的SSYAIS(SEQ ID NO:147)，CDR2的RIIPI X1G X2ANYAQKFQGR，其中X1为F或L，并且X2为T或I(SEQ ID NO:153)，和CDR3的RD X1X2X3W X4X5X6FDX7，其中X1为R或P，X2为W或L，X3为D或L，X4为N或S，X5为D或缺失，X6为A或Y，并且X7为I或Y(SEQ ID NO:154)；并且(ii)来自轻链可变区的三个CDR，所述轻链可变区具有选自以下的氨基酸序列：CDR1的SGSSSNIG X1N X2V X3，其中X1为S或N，X2为T或Y，并且X3为S或N(SEQ ID NO:150)，CDR2的X1NN X2RPSG X3，其中X1为S或DD，X2为Q或K，并且X3为V或I(SEQID NO:151)，和CDR3的X1X2WD X3SLX4X5VV，其中X1为A或G,X2为A或T,X3为D或S,X4为N或S，并且X5为G或A(SEQ ID NO:152)。
14.根据权利要求5-13中任一项所述的抗体分子，其特征在于，所述抗体分子进一步包含选自以下各项中的一个或多个轻链或重链可变框架：
(a)轻链或重链可变框架，所述轻链或重链可变框架包含来自于人成熟抗体、人胚系序列或人共有序列的人轻链或重链可变框架的至少85%的氨基酸残基；
(b)轻链或重链可变框架，所述轻链或重链可变框架包含来自于人成熟抗体、人胚系序列或人共有序列的人轻链或重链可变框架的20%至85%的氨基酸残基；
(c)非人框架；或
(d)已经修饰从而移除抗原性或细胞毒性的决定蔟，或部分人源化的非人框架。
15.根据权利要求14所述的抗体分子，其特征在于，所述抗体分子包含轻链和重链可变区，所述轻链和重链可变区包含展示于图28、29B、29D、29F、30B、30D、30F、37A、38或39的氨基酸序列，或与其至少85%一致的氨基酸序列。
16.根据权利要求14所述的抗体分子，其特征在于，所述抗体分子为人、人源、嵌合、骆驼或体外产生的抗体或其抗原结合片段，所述抗原结合片段选自以下各项中的一个或多个：Fab、F(ab')2、Fv、单链Fv片段、单域抗体、双体抗体(dAb)、双价或双特异性抗体或其片段，其单域抗体变体，或骆驼抗体。
17.根据权利要求14所述的抗体分子，其特征在于，进一步包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4人重链恒定区，或其突变形式，其中，所述突变形式增加或减少Fc受体结合、抗体糖基化、半胱氨酸残基的数量、效应细胞作用或互补作用中的一个或多个。
18.根据权利要求17所述的抗体分子，其特征在于，所述抗体分子进一步包括选自κ或λ轻链恒定区的人轻链恒定区。
19.根据权利要求14所述的抗体分子，其特征在于，所述抗体分子功能上连接至其它选自抗体、毒素、放射性同位元素、细胞毒素剂或细胞抑制剂和标签中的一个或多个分子实体。
20.根据权利要求19所述的抗体分子，其特征在于，所述细胞毒素剂或细胞抑制剂为：
治疗药物，放射性同位素，植物、真菌或细菌来源的分子，蛋白毒素，重组病毒外壳蛋白，或以上各项的混合物。
21.根据权利要求19所述的抗体分子，其特征在于，其中一个或多个分子实体选自美登醇、紫杉烷、加利车霉素、放射性同位素。
22.根据权利要求19所述的抗体分子，其特征在于，所述放射性同位素选自α、β或γ发射体，或β和γ发射体。
23.根据权利要求22所述的抗体分子，其特征在于，其中所述放射性同位素选自钇
90 177 225 211 186 212 213 188 131
( Y)、镥( Lu)、锕( Ac)、镨，砹( At)、铼( Re)、铋( Bi or Bi)、铑( Rh)、碘( I
125 111 99 32 14 3
或 I)、铟( In)、锝( mTc)、磷( P)、碳( C)，和氚(H)中的一个或多个。
24.一种药物组合物，所述药物组合物包含根据权利要求5-13中任何一项所述的抗体分子和药用可接受载体，赋形剂或稳定剂。
25.根据权利要求24所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物进一步包括以下一项或多项的组合：针对FGFs(1至23)、FGF受体(1至4)、VEGF、EGF或EGF受体、PSMA或Her-2/neu的抗体；选自美登木素、加利车霉素、紫杉烷、拓扑异构酶抑制剂的细胞毒素药物或细胞抑制药物；或者选自IL-1、2、4、6或12，干扰素α或γ，或GM-CSF的免疫调节剂，
26.一种分离核酸，该分离核酸编码权利要求5-13中任何一项所述的抗体分子的抗体重链或轻链可变区。
27.一种分离核酸，该分离核酸编码权利要求14所述的抗体分子的抗体重链或轻链可变区。
28.根据权利要求26所述的核酸，其特征在于，所述核酸包括展示于图29A、29E、30A、
30E、34A或37B的抗体重链可变区的核苷酸序列或与其至少85%相同的氨基酸序列。
29.根据权利要求26所述的核酸，其特征在于，所述核酸包括展示于图29A、29C、30A、
30C、34B或37B的抗体轻链可变区的核苷酸序列或与其至少85%相同的氨基酸序列。
30.一种寄主细胞，所述寄主细胞包含权利要求26所述的核酸。
31.一种寄主细胞，所述寄主细胞包含权利要求28所述的核酸。
32.一种表达载体，所述表达载体包含权利要求26所述的核酸。
33.一种表达载体，所述表达载体包含权利要求28所述的核酸。
34.一种制备抗体分子的方法，所述方法包括在适合基因表达的条件下培养权利要求
26所述的寄主细胞。
35.一种提供抗体分子的方法，所述抗体分子特异性结合至人FGFR2-Ⅲc，所述方法包括提供长度最高达60个氨基酸或更少的人FGFR2-Ⅲc特异性表位，其中所述表位包括FGFR2Ⅲc的314-353位的氨基酸残基(AAGVNTTDKEIEVLYIRNVTFEDAGEYTCLAGNSIGISFH(SEQ ID NO:84))或氨基酸TCLAGNSIGISFH(SEQ ID NO:86)；
获得特异性结合至人FGFR2-Ⅲc多肽的抗体分子；以及
评估以下各项中的一个或多个：
(a)评估抗体分子是否特异性结合至人FGFR2-Ⅲc多肽；
(b)评估在存在一种或多种人FGFR2-Ⅲc特异性表位的情况下，抗体分子和人
FGFR2-Ⅲc多肽之间的结合是否下降；或
(c)评估抗体分子在调节抑制人FGFR2-Ⅲc多肽的活性方面的功效。
36.一种人FGFR2-Ⅲc特异性表位，所述表位包括FGFR2Ⅲc314-353位的氨基
酸 残 基 (AAGVNTTDKEIEVLYIRNVTFEDAGEYTCLAGNSIGISFH(SEQ ID NO:84)) 或 氨 基 酸TCLAGNSIGISFH(SEQ ID NO:86)。
37.一种降低细胞生长或增殖、或诱导癌或肿瘤细胞自杀的方法，所述癌或肿瘤细胞表达FGFR2的致癌亚型，所述方法包括：将权利要求5-13中任何一项所述的抗体分子，以足够降低致癌亚型的活性的量接触癌或肿瘤细胞或接近癌或肿瘤细胞的细胞，从而降低癌或肿瘤细胞的细胞生长或增殖或诱导癌或肿瘤细胞自杀。
38.根据权利要求37所述的方法，其特征在于，权利要求5-13中任何一项所述的抗体分子为共轭或非共轭形式，仅作为单一疗法或与一种或多种治疗剂结合，从而杀死癌或肿瘤细胞或降低癌或肿瘤细胞的细胞生长或增殖。
39.根据权利要求37所述的方法，其特征在于，所述癌或肿瘤细胞来自：前列腺，睾丸，乳腺，胰腺，卵巢，膀胱，胃肠，肺鳞状细胞癌，非小细胞肺癌，甲状腺癌，子宫内膜癌，造血系统或脑癌（胶质母细胞瘤）。
40.一种治疗或防止前列腺、睾丸、乳腺、胰腺、膀胱、胃肠、肺鳞状细胞癌、非小细胞肺癌、甲状腺癌、子宫内膜癌、造血系统癌症或脑部的原发性、复发性或转移性癌症的方法，所述方法包括让实验对象服用能够有效治疗或防止这些癌症的量的权利要求5-13中任何一项所述的抗体分子。
41.根据权利要求40所述的方法，其特征在于，所述癌症为腺癌或前列腺癌或睾丸癌。
42.根据权利要求40所述的方法，其特征在于，所述癌症为与FGFR2-Ⅲc表达或高表达相关的耐激素或难治性前列腺癌。
43.根据权利要求42所述的方法，其特征在于，所述实验对象为正在接受前列腺切除术、化疗或其他抗肿瘤治疗中的一种或多种治疗方式的患者。
44.根据权利要求40所述的方法，其特征在于，所述实验对象为患有复发性或转移性前列腺癌的患者。
45.根据权利要求40所述的方法，其特征在于，所述实验对象患有有症状或无症状耐激素或难治性前列腺癌。
46.根据权利要求40所述方法，其特征在于，所述实验对象体内的一种或多种癌标记处于异常水平，所述癌标记选自前列腺特异抗原（PSA），前列腺特异性膜抗原（PSMA），前列腺干细胞抗原（PSCA），雄激素受体（AR），嗜铬粒蛋白，突触素，MIB-1，和α-甲酰基辅酶A消旋酶(AMACR)。
47.根据权利要求40所述的方法，其特征在于，进一步包括监测实验对象以下各项中的一个或多个变化：肿瘤大小；FGFR2Ⅲc水平或表达；循环前列腺衍生的FGFR2Ⅲc表达细胞的水平；一种或多种上皮细胞标记（Ep-CAM）水平或表达，FGF8，基质细胞衍生因子(SDF)，VEGF121，间充质细胞标记，PSA，PSMA，PSCA，AR，嗜铬粒蛋白，突触素，MIB-1，AMACR，碱性磷酸酶，或血清血红蛋白；新病灶出现的速度；新疾病相关症状的出现；或软组织肿块的大小。
48.根据权利要求47所述的方法，其特征在于，在治疗开始前、治疗期间或一个或多个治疗的要素已经实施后监测所述实验对象。
49.根据权利要求40所述的方法，其特征在于，进一步包括分析来自所述实验对象的核酸或蛋白的步骤，从而评估合适的具体剂量、给药模式、给药时间、辅助治疗的包含内容，或广泛地确定实验对象的可能的药物反应显型或基因型。
50.根据权利要求49所述的方法，其特征在于，进一步包括部分或根治性前列腺切除术、放射治疗、激素治疗、雄激素消融治疗和细胞毒性化疗中的一种或多种。
51.一种在体外样品中检测FGFR2多肽致癌亚型的存在的方法，包括：(i)在允许抗体分子和所述多肽发生相互作用的情况下，将权利要求5-13中任何一项所述的抗体分子接触样品（并且选择性地，采用标准样品）；以及(ii)检测抗体分子和样品（并且选择性地，采用标准样品）之间的复合物的形成。
52.根据权利要求51所述的方法，其特征在于，所述样品为血清、精液、尿液、血液运输的肿瘤细胞，或来自外科手术或活检的组织样品。
53.根据权利要求51所述的方法，其特征在于，相对于标准样品，所述样品中复合物的形成中的变化是该样品中存在致癌FGFR2亚型的象征。
54.一种用于检测体内FGFR2多肽致癌亚型的存在的方法，包括：(i)在容许亚型结合分子和多肽发生相互作用的情况下，使实验对象服用权利要求5-13中任何一项所述的抗体分子；以及(ii)检测亚型结合分子和多肽或基因表达产物之间的复合物的形成。
55.一种对实验对象体内的癌疾病进行诊断和/或分期、以及对所述癌疾病的治疗或进展进行监测的方法，包括：(i)识别患有或可能患有癌疾病的实验对象；(ii)获得受癌疾病影响的组织或细胞的样品；(iii)在容许抗体分子和亚型多肽发生相互作用的情况下，以权利要求5-13中任何一项所述的抗体分子接触所述样品或对照样品；以及(iv)检测复合物的形成，其中，抗体分子相对于标准样品之间复合物的形成的增加是癌疾病或癌疾病阶段的象征。
56.根据权利要求55所述的方法，其特征在于，所述抗体分子直接或间接用可检测的物质标记，所述可检测的物质选自：活性酶、辅基、荧光材料、发光材料、顺磁材料，和放射性材料。
成纤维细胞生长因子受体2的致癌异构体的抗体分子及其
用途
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求2010年8月12日提交的美国临时申请系列号61/373,072的优先权，其内容在此通过引用的方式全部纳入到本文中。
[0004] 本申请包括通过EFS-Web以ASCII格式提交的序列表，并在此通过引用将其其全文纳入到本申请中。上述ASCII副本创建于2011年8月12日，名称为A20497WO.txt，大小为301,554字节。
[0005] 政府资助
[0006] 本文所述工作至少部分使用来自美国政府所属的国家健康研究院(NIH)的合同号为
[0007] 1R43CA137929-01的基金进行。因此，美国政府可对本发明享有一定权利。
背景技术
[0008] 尽管医学研究取得了众多的进展，在美国，癌症仍然是一个主要的死亡原因。临床护理的传统模式，如手术切除，放疗和化疗，有很大的失败率，尤其是实体瘤。出现失败是因为早期肿瘤对治疗的反应迟钝，或因由于在原来的位置再生和/或转移而复发。癌症的病因、诊断和切除依然是医学研究和发展的中心焦点。
[0009] 由于在大多数情况下，完全缓解癌症的概率通过早期诊断大大提高，这是可取的，因为医生能尽早识别癌肿瘤。基于基因表达的变化来辨认癌细胞是可取的，因为基因表达的变化可能在组织学变化前发生，组织学变化将恶性细胞从正常细胞中区别开。使用能识别这些基因表达变化的生物标记物，当基因表达出现变化时，人们能识别癌细胞或前癌细胞，从而可以向受益于辅助疗法的个体提供有效地靶向治疗。但是能够对多种形式的癌症进行早期，快速，准确检测的方法和检测试剂成分的发展继续挑战医学界。因此，癌症治疗的重要的问题依然是使治疗处理或癌症的切除合适的检测和预后。
[0010] 例如，前列腺癌(CaP)是男性最普遍的恶性肿瘤之一，其发生率日益增加。在2007年，仅在美国就有大约218,900个男性被诊断出前列腺癌，并且大约27,050死于这种疾病。尽管前列腺恶性肿瘤的早期诊断通过PSA水平测量取得了重大进展，大约10%新诊断的患者具有局部晚期CaP的迹象并且5%患者在诊断时已经出现远程转
移 (Draisma 等 人，(2003)J.Natl.Cancer Inst.95:868-878;Thompson 等 人，(2003)N.Engl.J.Med.349,215-224;Makinen 等 人，(2003)Clin.Cancer Res.9,2435-2439). 治愈性疗法对局部晚期CaP是有效的(Bolla等人,(2002)Lancet360,103-106;Messing等 人 ,(1999)N.Engl.J.Med.341,1781-1788;D'Amico 等 人 ,(2004)J.Am.Med.
Assoc.292,821-827)。相反，具有远程转移迹象的患者的预后非常差(Cheville等人,(2002)Cancer95,1028-1036)。肿瘤转移是与前列腺癌相关的死亡的主要原因。激素抵抗性前列腺癌(HRPC)是侵入型前列腺癌的一个例子。
移 (Draisma 等 人，(2003)J.Natl.Cancer Inst.95:868-878;Thompson 等 人，(2003)N.Engl.J.Med.349,215-224;Makinen 等 人，(2003)Clin.Cancer Res.9,2435-2439). 治愈性疗法对局部晚期CaP是有效的(Bolla等人,(2002)Lancet360,103-106;Messing等 人 ,(1999)N.Engl.J.Med.341,1781-1788;D'Amico 等 人 ,(2004)J.Am.Med.
Assoc.292,821-827)。相反，具有远程转移迹象的患者的预后非常差(Cheville等人,(2002)Cancer95,1028-1036)。肿瘤转移是与前列腺癌相关的死亡的主要原因。激素抵抗性前列腺癌(HRPC)是侵入型前列腺癌的一个例子。
[0011] 一旦前列腺癌已经转移，目前只存在有限的治疗模式。例如，全身治疗仅限雄激素剥夺的各种形式。虽然大多数患者表现出初步的临床改善，但几乎不可避免雄激素非依赖性细胞发育。内分泌治疗是姑息性治疗，不是治愈性的。在1,387个带有可通过成像（例如，骨头或CT扫描）检测出转移性疾病的患者研究中，早期激素治疗（即，雄激素非依赖性的发展）后，目标疾病进展的中位时间（不包括生化/PSA进展）为16-48个月(Eisenberger等人，(1998)NEJM339:1036-42)。这些患者中总中位生存期为从激素治疗开始的28-52个月(Eisenberger M.A.,等人(1998)supra.)。
[0012] 雄激素非依赖性细胞发育之后，没有有效的标准治疗，并且中位生存期为 9-12 月 (Vollmer,R.T., 等 人 .(1999)Clin Can Res5:831-7;Hudes G. 等
人 ,(1997)Proc Am Soc Clin Oncol16:316a(abstract);Pienta K.J. 等 人，(1994)/Clin Oncol12(10):2005-12;Pienta K.J. 等 人 .(1997)Urology50:401-7;Tannock I.F. 等 人，(1996)/Clin Oncol14:1756-65;Kantoff P.W. 等 人 ,(1996)/.Clin.Oncol.15(Suppl):25:110-25)。在该年龄组中，细胞毒性化疗耐受性差并且一般被认为无效和/或不切实际的。此外，前列腺癌是比较抗细胞毒素剂。因此，化疗方案并没有在该患者群体中表现出明显的生存益处。鉴于现有的治疗和诊断的缺点，仍然需要改善用于预防，治疗和/或诊断癌症，如前列腺癌的靶向方式。
人 ,(1997)Proc Am Soc Clin Oncol16:316a(abstract);Pienta K.J. 等 人，(1994)/Clin Oncol12(10):2005-12;Pienta K.J. 等 人 .(1997)Urology50:401-7;Tannock I.F. 等 人，(1996)/Clin Oncol14:1756-65;Kantoff P.W. 等 人 ,(1996)/.Clin.Oncol.15(Suppl):25:110-25)。在该年龄组中，细胞毒性化疗耐受性差并且一般被认为无效和/或不切实际的。此外，前列腺癌是比较抗细胞毒素剂。因此，化疗方案并没有在该患者群体中表现出明显的生存益处。鉴于现有的治疗和诊断的缺点，仍然需要改善用于预防，治疗和/或诊断癌症，如前列腺癌的靶向方式。
发明内容
[0013] 本发明的特征至少部分地为抑制或减少一种或多种蛋白异构体相关活性的蛋白异构体特异性抑制剂，其中所述异构体特异性抑制剂包括，但不限于结合分子（在此也指“异构体结合分子”），所述结合分子与一个或多个异构体（例如异构体多肽或编码该异构体多肽的核酸）特异性作用，例如，结合，所述异构体从例如，选择性剪接，移码，翻译和/或翻译后事件中的一个或多个产生，从而导致不同的转录或翻译产物。在一个实施例中，该异构体特异性抑制剂特异性结合至致癌或恶性表型表达和/或相关的一种或多种异构体（在此指的是“致癌异构体”），和/或抑制致癌或恶性表型表达和/或相关的一种或多种异构体（在此指的是“致癌异构体”）的活性。例如，该异构体特异性抑制剂可能为致癌异构体结合分子，例如，抗体分子或核酸抑制剂，所述抗体分子或核酸抑制剂特异性与一个或多个致癌异构体（例如致癌异构体多肽或编码致癌异构体多肽的核酸）作用，例如，结合。在另一个实施例中，该异构体特异性抑制剂为降低或抑制一个或多个异构体（例如致癌异构体）相关活性的可溶受体多肽或其融合形式，或肽或其功能性变体。
[0014] 该致癌异构体可能从例如，在细胞例如高度增生细胞（例如癌或肿瘤细胞）中，的各种原癌基因表达产物的选择性剪接，移码，翻译和/或翻译后事件中产生。在此描述的异构体结合分子特异性结合至这些致癌异构体，并且基本不结合至衍生异构体的原癌基因。在一些实施例中，异构体结合分子（例如抗体分子）与成纤维细胞生长因子受体2(FGFR2)的致癌异构体（例如致癌FGFR2异构体Ⅲc）特异性作用，例如，结合。在其它实施例中，在此描述的异构体结合分子特异性结合至成纤维细胞生长因子受体1(FGFR1)（例如致癌FGFR1L）、RON受体酪氨酸激酶（c-met相关酪氨酸激酶）（例如缺失外显子5和6的致癌RON受体酪氨酸激酶）、KIT受体酪氨酸激酶(例如缺失外显子11的致癌KIT受体酪氨酸激酶)、血小板源性生长因子(PDGF)(例如缺失外显子6的致癌PDGF异构体)、或PDGF受体α（例如缺失外显子7和8的致癌PDGF受体α）的致癌异构体。因此，特异性结合至在此提供的致癌异构体的结合分子能用于识别与致癌异构体表达相关的癌或肿瘤细胞。
[0015] 因此，本发明提供异构体特异性抑制剂（例如抗体分子，可溶性受体多肽及其融合形式，肽及其功能性变异体，和核酸抑制剂），其药物组合物，以及制备这种异构体结合分子的核酸，重组表达载体和寄主细胞。在一些实施例中，该异构体特异性抑制剂选择性地结合至和/或降低，抑制或阻断致癌异构体与配体或共受体的相互作用，从而降低或抑制致癌活性。在一些实施例中，异构体特异性抑制剂与异构体（例如FGFR2-Ⅲc）竞争结合同源配体（例如FGF8b）。在其它实施例中，异构体特异性抑制剂作为负显性竞争者，例如与异构体结合但不产生细胞内信号的负显性竞争者。在其它实施例中，异构体结合分子可使细胞毒素剂或细胞抑制剂选择性地靶向高度增生细胞例如癌或肿瘤细胞。在此描述的异构体特异性抑制剂可用于处理，预防和/或诊断癌或恶性症状和/或疾病，比如癌症或肿瘤（原发，复发或转移），包括但不限于前列腺、膀胱、胰腺、乳腺、卵巢、脑（胶质母细胞瘤）和胃肠癌。用本发明的异构体结合分子检测致癌异构体的，以降低在体外，间接体内或体内表达致癌异构体的高度增生细胞的活性和/或杀死高度增生细胞的方法也包含在本发明中。也公布了用于评估致癌异构体的功能或表达的诊断和/或筛选方法和试剂。
[0016] 因此，一方面，本发明的特征是异构体特异性抑制剂（例如，抗体分子，可溶性受体多肽及其融合形式），该异构体特异性抑制剂与一个或多个异构体多肽或其片段相互作用7 -1
或更优选地特异性结合。典型的异构体结合分子以高亲和力，例如以至少约10M ，典型地
8 -1 9 -1 10 -1
约10M ，和更典型地约10M 至10 M 或更高的亲和力常数结合至一个或多个异构体多肽或其片段，并降低和/或抑制一种或多种异构体的活性，例如高度增生（例如癌或恶性）细胞和/或组织中的致癌异构体。例如，结合分子可选择性并特异性降低或抑制选自以下中的一个或多个的致癌异构体相关活性：（i）结合配体或共受体（例如，FGF配体，例如FGF8b，FGF2，FGF17或FGF18至FGFR2异构体Ⅲc）；（ii）受体二聚化（例如，FGFR2异构体Ⅲc二聚化）；（iii）异构体信号转导，例如，FGFR2异构体Ⅲc信号转导；（iv）高度增生（例如癌或肿瘤）细胞增殖，生长和/或存活，例如，通过诱导高度增生细胞凋亡；和/或（v）肿瘤的血管生成和/或血管形成。在一些实施例中，该抑制剂可能直接在高度增生（例如癌或恶性）细胞和/或组织中直接发挥作用（例如，直接诱导细胞自杀或凋亡）。在其它实施例中，该抑制剂可通过作用于邻近的细胞发挥作用，例如，高度增生（例如，癌或恶性）细胞和/或组织周边的细胞。例如，该抑制剂可能降低肿瘤组织的血管生成和/或血管形成。
或更优选地特异性结合。典型的异构体结合分子以高亲和力，例如以至少约10M ，典型地
8 -1 9 -1 10 -1
约10M ，和更典型地约10M 至10 M 或更高的亲和力常数结合至一个或多个异构体多肽或其片段，并降低和/或抑制一种或多种异构体的活性，例如高度增生（例如癌或恶性）细胞和/或组织中的致癌异构体。例如，结合分子可选择性并特异性降低或抑制选自以下中的一个或多个的致癌异构体相关活性：（i）结合配体或共受体（例如，FGF配体，例如FGF8b，FGF2，FGF17或FGF18至FGFR2异构体Ⅲc）；（ii）受体二聚化（例如，FGFR2异构体Ⅲc二聚化）；（iii）异构体信号转导，例如，FGFR2异构体Ⅲc信号转导；（iv）高度增生（例如癌或肿瘤）细胞增殖，生长和/或存活，例如，通过诱导高度增生细胞凋亡；和/或（v）肿瘤的血管生成和/或血管形成。在一些实施例中，该抑制剂可能直接在高度增生（例如癌或恶性）细胞和/或组织中直接发挥作用（例如，直接诱导细胞自杀或凋亡）。在其它实施例中，该抑制剂可通过作用于邻近的细胞发挥作用，例如，高度增生（例如，癌或恶性）细胞和/或组织周边的细胞。例如，该抑制剂可能降低肿瘤组织的血管生成和/或血管形成。
[0017] 在一个实施例中，异构体结合分子为结合至哺乳动物，例如人，异构体多肽或其片段的抗体分子。例如，该抗体分子结合至高度增生细胞，例如癌或肿瘤细胞，表达和/或相关的异构体多肽或片段。例如，该抗体分子特异性结合至表位，例如位于或主要在高度增生细胞，如癌或肿瘤细胞，的表面表达的线性表位或构象表位。在实施例中，抗体分子识别的表位是高度增生疾病，例如癌或恶性疾病表达的或相关的。例如，抗体分子识别的表位是外显子序列或外显子序列表达的或相关的，所述外显子序列主要由一种或多种癌或肿瘤细胞或疾病表达的或相关的；所述表位可能位于在一种或多种癌或肿瘤细胞或疾病中显著结合在一起的两个外显子之间的接合区，例如：由于框架内外显子缺失或选择性剪接外显子的使用。本发明的异构体结合分子识别的典型的异构体多肽或片段包括但不限于FGFR2，FGFR1，RON受体酪氨酸激酶，KIT受体酪氨酸激酶，PDGF和PDGF-受体α的致癌异构体。
[0018] 在一个实施例中，所述抗体分子结合至异构体，例如FGFR2，例如人FGFR2的致癌异构体。所述抗体分子能特异性结合至FGFR2异构体Ⅲc或其片段，例如，基本不结合至FGF受体的其它非致癌异构体，比如FGFR2的其它选择性剪接变体(例如，FGFR2Ⅲb(SEQ ID NO:21)，FGFR2异构体4(SEQ ID NO:22)，FGFR2异构体7(SEQ ID NO:23),FGFR2异构体9(SEQ ID NO:24)，FGFR2异构体10(SEQ ID NO:25)，FGFR2异构体11(SEQ ID NO:26)，FGFR2异构体12(SEQ ID NO:27)，FGFR2异构体13(SEQ ID NO:28)，FGFR2异构体14(SEQ ID NO:29)，FGFR2异构体15(SEQ ID NO:30)，FGFR异构体17(SEQ ID NO:31)，FGFR2异构体18(SEQ ID NO:52)或FGFR2异构体19(SEQ ID NO:53))。例如，所述抗体分子优先结合至FGFR2异构体Ⅲc或其片段，但基本不结合至（例如展示了与FGFR2异构体Ⅲb低于10%，8%，5%，4%，3%，2%，1%的交叉反应性）FGFR2异构体Ⅲb，例如，人FGFR2异构体Ⅲb约314至
351位的氨基酸
351位的氨基酸
[0019] (HSGINSSNAEVLALFNVTEADAGEYICKVSNYIGQANQ;SEQ ID NO:56)；人FGFR2异构体Ⅲb314至328位的氨基酸(HSGINSSNAEVLALF;SEQ ID NO:57)；或人FGFR2异构体Ⅲb340至351位的氨基酸(CKVSNYIGQANQ;SEQ ID NO:58)。在那些实施例中，所述抗体分子特异性结合至位于外显子Ⅲ的选择性剪接形式的至少一个或多个氨基酸（例如至少一个表位），例如从FGFR2-Ⅲc约301至360位的氨基酸(SEQ ID NO:2)；FGFR2-Ⅲc约314至324位的氨基酸(AAGVNTTDKEI,SEQ ID NO:4)；FGFR2-Ⅲc约328至337位的氨基酸(YIRNVTFEDA,SEQ ID NO:6)；FGFR2-Ⅲc约350至353of位的氨基酸(ISFH,SEQ ID NO:8)；FGFR2Ⅲc约
314-353位的氨基酸
314-353位的氨基酸
[0020] (AAGVNTTDKEIEVLYIRNVTFEDAGEYTCLAGNSIGISFH(SEP ID NO:84))；或
[0021] FGFR2-Ⅲc约341至353位的氨基酸(TCLAGNS IGIS FH(SEQ ID NO:86)，或SEQ ID NOs:1，3，5，7，83或85核苷酸序列编码的氨基酸序列；或与其基本相同的氨基酸或核苷酸序列。在一个实施例中，anti-FGFR2-Ⅲc抗体分子结合至SEQ ID NO:84的第1位的丙氨酸、第2位丙氨酸、第4位缬氨酸、第6位苏氨酸、第7位苏氨酸、第8位天冬氨酸、第9位赖氨酸、第11位异亮氨酸、第12位谷氨酸、第13位缬氨酸、第15位酪氨酸、第16位异亮氨酸、第17位精氨酸、第21位苯丙氨酸、第22位谷氨酸、第28位苏氨酸、第30位亮氨酸、第31位丙氨酸、第32位甘氨酸、第34位丝氨酸、第37位异亮氨酸、第38位丝氨酸、第39位苯丙氨酸，或第40位组氨酸中的一，二，三，四，五，六，七，八，九，十，十二，十四，十六，十八，二十，二十二或更多个(与
[0022] AAGVNTTDKEIEVLYIRNVTFEDAGEYTCLAGNSIGISFH(SEP ID NO:84))突出显示的氨基酸残基对应)；或SEQ ID NO:86的第1位苏氨酸，第3位亮氨酸，第4位丙氨酸，第5位甘氨酸，第7位丝氨酸，第10位异亮氨酸，第11位丝氨酸，第12位苯丙氨酸或第13位组氨酸中的一个或多个(与TCLAGNSIGISFH；SEQ ID NO:86突出显示的氨基酸残基对应)。
[0023] 实施例8-15公开了在本发明的范围内的典型的anti-FGFR2-Ⅲc抗体分子。在一个实施例中，anti-FGFR2-Ⅲc抗体分子结合至，例如，选择性结合至哺乳动物，例如，人FGFR2-Ⅲc（例如，位于的人FGFR2-Ⅲc胞外域FGFR2-Ⅲc(SEQ ID NO:2)约301至360位的氨基酸的表位，或与其至少85%，90%，95%，99%或更相同的序列）。在一些实施例中，所述anti-FGFR2-Ⅲc抗体分子结合至选自：(例如包含氨基酸残基的表位)人FGFR2-Ⅲc的314-353位的残基(AAGVNTTDKEIEVLYIRNVTFEDAGEYTCLAGNSIGISFH(SEQ ID NO:84))或氨基酸TCLAGNSIGISFH(SEQ ID NO:86)，或其修饰形式（例如片段或其取代(例如保守取代)形式）的一个或多个氨基酸残基。在一个实施例中，所述anti-FGFR2-Ⅲc抗体分子结合至人FGFR2-Ⅲc的胞外域上的合成，重组或天然的表位。在一些实施例中，所述anti-FGFR2-Ⅲc抗体分子结合至存在于前列腺癌细胞，例如人前列腺癌细胞(例如，DU145人前列腺癌细胞系)，或大鼠前列腺癌细胞系(例如，AT3B-1大鼠前列腺癌细胞系)的天然FGFR2-Ⅲc。在一个实施例中，anti-FGFR2-Ⅲc抗体分子优先结合至FGFR2异构体Ⅲc或其片段，但基本不结合至(例如展示与FGFR2异构体Ⅲb低于10%，8%，5%，4%，3%，2%，1%的交叉反应性)FGFR2异构体Ⅲb，例如人FGFR2异构体Ⅲb的胞外域（例如，人FGFR2异构体Ⅲb约314至351位的氨基酸
[0024] (HSGINSSNAEVLALFNVTEADAGEYICKVSNYIGQANQ;SEQ ID NO:56)；人FGFR2异构体Ⅲb约314至328位的氨基酸(HSGINSSNAEVLALF;SEQ ID NO:57)；人FGFR2异构体Ⅲb约340至351位的氨基酸(CKVSNYIGQANQ;SEQ ID NO:58)）。
[0025] 在一个实施例中，所述anti-FGFR2-Ⅲc抗体分子展示了优先结合至人FGFR2-Ⅲ c，如 图24A-24B，25A-25B，27A-27B，28，29A-29F，30A-30F，32-39 和41-44 所示的任何一种单克隆抗体。例如，所述anti-FGFR2-Ⅲc抗体分子展示了如图24A-24B或32的克隆B7(在此也是指"Atto-MuMab-03")、C5、D2、D10、E3、E8、F3、F10或G9；或图25A-25B、27A-27B、28、29A-29F、30A-30F、37-39和/或41-44的任何一种人克隆1(在此也是指"Atto-HuMab-01")、2、6(在此也是指"Atto-HuMab-06")、7或8(在此也是指"Atto-HuMab-08")相同或相似的结合选择性。在其它实施例中，anti-FGFR2-Ⅲc抗体分子展示了如Atto-MuMab-01或Atto-MuMab-02(图33，34A-34B，35和36A-36B所示的VH和VL)相同或相似结合选择性。在另一实施例中，所述anti-FGFR2-Ⅲc抗体分子展示了如图25A-25B,27A-27B,28-29,30A-30F,37-39和/或41-44的人克隆1,6,8(分别为Atto-HuMab-01,Atto-HuMab-06,Atto-HuMab-08)相同或相似的结合选择性。在一个实施例中，所述FGFR2-Ⅲc抗体分子特异性结合至人FGFR2-Ⅲc并竞争抑制第二抗体分子结合至FGFR2-Ⅲc，其中第二抗体分子可能为选自，例如：Atto-MuMab-01、Atto-MuMab-02、Atto-MuMab-03、Atto-HuMab-01、Atto-HuMab-06或Atto-HuMab-08，的抗体分子。
[0026] 图28展示了人scFv克隆6(Atto-HuMab-06)和克隆8(Atto-HuMab-08)的氨基酸序列比对。轻链和重链可变区的互补决定区(CDRs)的位点画上下划线并分别标记为VL-CDR-1,-2和-3以及VH-CDR-1,-2和-3。
[0027] 图38展示了人scFv克隆-1(Atto-HuMab-01)和克隆-6(Atto-HuMab-06)的氨基酸序列比对。轻链和重链可变区的互补决定区(CDRs)的位点画上下划线并分别标记为VL-CDR-1,-2和-3以及VH-CDR-1,-2和-3。
[0028] 图39展示了人scFv克隆-1(Atto-HuMab-01)和克隆-8(Atto-HuMab-08)的氨基酸序列比对。轻链和重链可变区的互补决定区(CDRs)的位点画上下划线并分别标记为VL-CDR-1,-2和-3以及VH-CDR-1,-2和-3。
[0029] 图29A-29B分别展示了人scFv克隆8(Atto-HuMab-08)的轻链可变区和重链可变区的全长编码区的核苷酸和氨基酸序列。图29C-29D分别展示了人scFv克隆
8(Atto-HuMab-08)的轻链可变区的核苷酸和氨基酸序列。图29E-29F分别展示了人scFv克隆8(Atto-HuMab-08)的重链可变区的核苷酸和氨基酸序列。
8(Atto-HuMab-08)的轻链可变区的核苷酸和氨基酸序列。图29E-29F分别展示了人scFv克隆8(Atto-HuMab-08)的重链可变区的核苷酸和氨基酸序列。
[0030] 图30A-30B分别展示了人scFv克隆6(Atto-HuMab-06)的轻链可变区和重链可变区的全长编码区的核苷酸和氨基酸序列。图30C-30D分别展示了人scFv克隆
6(Atto-HuMab-06)的轻链可变区的核苷酸和氨基酸序列。图30E-30F分别展示了人scFv克隆6(Atto-HuMab-06)的重链可变区的核苷酸和氨基酸序列。互补决定区(CDRs)的相关位点在前述图上画上下划线。
6(Atto-HuMab-06)的轻链可变区的核苷酸和氨基酸序列。图30E-30F分别展示了人scFv克隆6(Atto-HuMab-06)的重链可变区的核苷酸和氨基酸序列。互补决定区(CDRs)的相关位点在前述图上画上下划线。
[0031] 图35展示了Atto-MuMab-02的轻链和重链可变区的氨基酸序列(分别为SEQ ID NO:90和88)。图35指出了重链和轻链可变区中的CDRs的相关位置。图34A和34B分别展示了编码Atto-MuMab-02重链和轻链可变区的核苷酸序列(分别为SEQ ID NO:87和89)。
[0032] 图37A-37B分别展示了人scFv克隆1(Atto-HuMab-01)的轻链可变区和重链可变区的全长编码区的核苷酸和氨基酸序列(SEQ ID NOs:190-191)。图38-39分别展示了人scFv克隆1(Atto-HuMab-01)的轻链可变区氨基酸序列（对应上面的氨基酸序列的1-111位的氨基酸，在接头区之前）。图38-39展示了人scFv克隆1(Atto-HuMab-01)的重链可变区的氨基酸序列(对应上面的氨基酸序列的133-252位的氨基酸，在接头区之后)。互补决定区(CDRs)的相关位置在前述图上画上下划线并标记。图40为描述Atto-HuMab-01,-06,和-08的CDR区（重链和轻链CDRs）之间的比较的表。
[0033] 在其它实施例中，所述anti-FGFR2-Ⅲc抗体分子具有：图24A-24B或32的克隆B7
[0034] (Atto-MuMab-03)、C5、D2、D10、E3、E8、F3、F10或G9，或图25A-25B、27A-27B、28-29、30A-30F、37-39和/或41-44的人克隆1(Atto-HuMab-01)、2、6(Atto-HuMab-06)、
7或8(Atto-HuMab-08)中的任何一个，并且具体地，抗体Atto-MuMab-01，Atto-MuMab-02，Atto-MuMab-03，Atto-HuMab-01，Atto-HuMab-06或Atto-HuMab-08，中任何克隆的一个或多个生物性质，所述生物性质包括但不限于：
7或8(Atto-HuMab-08)中的任何一个，并且具体地，抗体Atto-MuMab-01，Atto-MuMab-02，Atto-MuMab-03，Atto-HuMab-01，Atto-HuMab-06或Atto-HuMab-08，中任何克隆的一个或多个生物性质，所述生物性质包括但不限于：
[0035] (i)所述 抗体分 子结合 至人FGFR2-Ⅲc上 的相同 或相似 的表 位，如 抗 体 Atto-MuMab-01，Atto-MuMab-02，Atto-MuMab-03，Atto-HuMab-01，
Atto-HuMab-06或Atto-HuMab-08(例如anti-FGFR2-Ⅲc抗体分子与单克隆抗体
Atto-MuMab-01,Atto-MuMab-02,
Atto-HuMab-06或Atto-HuMab-08(例如anti-FGFR2-Ⅲc抗体分子与单克隆抗体
Atto-MuMab-01,Atto-MuMab-02,
[0036] Atto-MuMab-03,Atto-HuMab-01,Atto-HuMab-06,or Atto-HuMab-08竞争结合)；
[0037] (ii)结合至FGFR2Ⅲc第314-353位
[0038] (AAGVNTTDKEIEVLYIRNVTFEDAGEYTCLAGNSIGISFH_(SEQ ID NO:84))的至少一个氨基酸残基；或人FGFR2-Ⅲc的TCLAGNSIGISFH(SEQ ID NO:86)的至少一个氨基酸残基；
[0039] (iii)优先结合至存在于人FGFR2-Ⅲc，但不是存在于人FGFR2-Ⅲb的至少一个氨基酸残基，（例如：结合至SEQ ID NO:84的第1位的丙氨酸、第2位丙氨酸、第4位缬氨酸、第6位苏氨酸、第7位苏氨酸、第8位天冬氨酸、第9位赖氨酸、第11位异亮氨酸、第12位谷氨酸、第13位缬氨酸、第15位酪氨酸、第16位异亮氨酸、第17位精氨酸、第21位苯丙氨酸、第22位谷氨酸、第28位苏氨酸、第30位亮氨酸、第31位丙氨酸、第32位甘氨酸、第34位丝氨酸、第37位异亮氨酸、第38位丝氨酸、第39位苯丙氨酸，或第40位组氨酸中的一，二，三，四，五，六，七，八，九，十，十二，十四，十六，十八，二十，二十二或更多个(与AAGVNTTDKEIEVLYIRNVTFEDAGEYTCLAGNSIGISFH(SEP ID NO:84))突出显示的氨基酸残基对应)；
或SEQ ID NO:86的第1位苏氨酸，第3位亮氨酸，第4位丙氨酸，第5位甘氨酸，第7位丝氨酸，第10位异亮氨酸，第11位丝氨酸，第12位苯丙氨酸或第13位组氨酸中的一个或多个(与TCLAGNSIGISFH；SEQ ID NO:86突出显示的氨基酸残基对应)；
或SEQ ID NO:86的第1位苏氨酸，第3位亮氨酸，第4位丙氨酸，第5位甘氨酸，第7位丝氨酸，第10位异亮氨酸，第11位丝氨酸，第12位苯丙氨酸或第13位组氨酸中的一个或多个(与TCLAGNSIGISFH；SEQ ID NO:86突出显示的氨基酸残基对应)；
[0040] (iv)结合至重组、合成或天然人FGFR2-Ⅲc；
[0041] (v)结合至存在于前列腺癌细胞或肝癌细胞上的天然FGFR2-Ⅲc，所述前列腺癌细胞或肝癌细胞例如人前列腺癌细胞（例如：DU145人前列腺癌细胞系）或肝细胞系HepG2；
[0042] (vi)展示了与单克隆抗体Atto-MuMab-01，Atto-MuMab-02，Atto-MuMab-03，[0043] Atto-HuMab-01，Atto-HuMab-06或Atto-HuMab-08相同 或相 似的、结合 至FGFR2-Ⅲc的结合选择性；
[0044] (vii)展示了与单克隆抗体Atto-MuMab-01，Atto-MuMab-02，Atto-MuMab-03，[0045] Atto-HuMab-01，Atto-HuMab-06或Atto-HuMab-08相同或相似的结合亲和力；和/或
[0046] (viii)展示了与单克隆抗体Atto-MuMab-01，Atto-MuMab-02，Atto-MuMab-03，[0047] Atto-HuMab-01，Atto-HuMab-06或Atto-HuMab-08相同或相似的结合动力学。
[0048] 在一个实施例中，所述anti-FGFR2-Ⅲc抗体分子为单克隆抗体Atto-MuMab-01，[0049] Atto-MuMab-02，Atto-MuMab-03，Atto-HuMab-01，Atto-HuMab-06 或Atto-HuMab-08。
[0050] 在一个实施例中，所述anti-FGFR2-Ⅲc抗体分子以高亲和力，例如：以低于-7 -8 -9 -10 -1110 M,10 ,10 ,10 ,10 M或更好的Kd，结合至FGFR2-Ⅲc。在其它的实施例中，所述-8 -9 -10 -11
anti-FGFR2-Ⅲc抗体或其片段能以至少约10 ,10 ,10 ,10 M或更好的IC50降低一种或多种
anti-FGFR2-Ⅲc抗体或其片段能以至少约10 ,10 ,10 ,10 M或更好的IC50降低一种或多种
[0051] FGFR2-Ⅲc-相关活性。
[0052] 在其它实施例中，所述anti-FGFR2-Ⅲc抗体及其片段与人FGFR2-Ⅲc以在表面-4 -1 -6 -1等离子共振(Surface plasmon resonance,SPR)确定的低于1x10 s 至1x10 s 的kQff或
3 7 -1 -1
如表面等离子共振确定的在10 至10M S 之间kon的范围的动力学结合。anti-FGFR2-Ⅲc或其片段的亲和力和结合动力学能用，例如生物传感技术（BIACORE）测试。
3 7 -1 -1
如表面等离子共振确定的在10 至10M S 之间kon的范围的动力学结合。anti-FGFR2-Ⅲc或其片段的亲和力和结合动力学能用，例如生物传感技术（BIACORE）测试。
[0053] 在一个实施例中，所述anti-FGFR2-Ⅲc抗体分子为完整的抗体或其片段(例如Fab，F(ab')2，Fv，或单链Fv片段(scFv))。在一些实施例中，所述anti-FGFR2-Ⅲc抗体分子为单克隆抗体或具有单特异性的抗体。所述anti-FGFR2-Ⅲc抗体分子也可能为人，人源，嵌合，骆驼，鲨鱼，或体外产生的抗体分子。在一个实施例中，所述anti-FGFR2-Ⅲc抗体分子为人源化抗体分子。所述anti-FGFR2-Ⅲc抗体分子的重链和轻链可能为全长（例如抗体可能包括至少一条，并且优选两条完整的重链，并且至少一条，并且优选两条完整的轻链），或可能包括抗原结合片段（例如：Fab，F(ab')2，Fv，单链Fv片段，单域抗体，双体抗体(dAb)，二价或双特异性抗体或其片段，其单域抗体变体，或骆驼抗体）。在其它的实施例中，所述抗体分子具有重链恒定区(Fc)，所述重链恒定区选自：例如IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgM，IgA1，IgA2，IgD和IgE的重链恒定区；特别地，选自：例如，IgG1，IgG2，IgG3和IgG4的重链恒定区，更特别地，IgG1和IgG2(例如：人IgG1或IgG2)的重链恒定区。在一个实施例中，所述重链恒定区为人IgG1。在另一个实施例中，所述anti-FGFR2-Ⅲc具有轻链恒定区，所述轻链恒定区选自：例如，κ或λ，优选κ（例如，人κ）的轻链恒定区。在一个实施例中，恒定区被改变，例如，突变，从而修饰anti-FGFR2-Ⅲc抗体分子的性质（例如，增加或减少Fc受体结合，抗体糖基化，半胱氨酸残基的数量，效应细胞功能，或补偿功能中的一种或多种）。例如，在SEQ ID NO:55的296(M至Y)，298(S至T)，300(T至E)，477(H至K)和478(N to F)位突变从而改变Fc受体结合。
[0054] 在一些实施例中，所述anti-FGFR2-Ⅲc共价连接至细胞表面蛋白（例如，噬菌体）或可溶性分泌形式（例如，scFv或其融合物）。在其它实施例中，所述anti-FGFR2-Ⅲc以单链Fv分泌或融合至Fc恒定区（例如，形成人IgG1Fc融合的单链或双链结构）。
[0055] 在其它实施例中，所述anti-FGFR2-Ⅲc抗体分子包含至少一个抗原结合区，例如：可变区，所述可变区来自选自：例如Atto-MuMab-01，Atto-MuMab-02，Atto-MuMab-03，[0056] Atto-HuMab-01，Atto-HuMab-06，或Atto-HuMab-08，的抗体。在另一个实施例中，所述anti-FGFR2-Ⅲc抗体分子包括来自抗体的至少一个，两个，三个或四个可变区，所述抗体选自：例如，Atto-MuMab-01，Atto-MuMab-02，Atto-MuMab-03，Atto-HuMab-01，[0057] Atto-HuMab-06，或Atto-HuMab-08。在另一实施例中，所述anti-FGFR2-Ⅲc抗体分子包括来自抗体的至少一个或两个重链可变区，所述抗体选自：例如，Atto-MuMab-01，[0058] Atto-MuMab-02，Atto-MuMab-03，Atto-HuMab-01，Atto-HuMab-06， 或Atto-HuMab-08。在其它实施例中，所述anti-FGFR2-Ⅲc抗体分子包括来自抗体的至少一个或两个轻链可变区，所述抗体选自：例如，Atto-MuMab-01，Atto-MuMab-02，Atto-MuMab-03，
[0059] Atto-HuMab-01，Atto-HuMab-06，或Atto-HuMab-08。在另一实施例中，所述anti-FGFR2-Ⅲc抗体分子包括来自抗体重链可变区的至少一个，两个或三个互补决定区（CDRs），或特别地至少来自接触FGFR2-Ⅲc的那些CDRs的氨基酸，所述抗体选自：例如，Atto-MuMab-01，Atto-MuMab-02，Atto-MuMab-03，Atto-HuMab-01，Atto-HuMab-06，或Atto-HuMab-08。在另一个实施例中，所述anti-FGFR2-Ⅲc抗体分子包括来自抗体轻链可变区的至少一个，两个或三个互补决定区（CDRs），或特别地至少来自接触FGFR2-Ⅲc的那些CDRs的氨基酸，所述抗体选自：例如，Atto-MuMab-01，Atto-MuMab-02，Atto-MuMab-03，[0060] Atto-HuMab-01，Atto-HuMab-06，或Atto-HuMab-08。在在另一实施例中，所述[0061] anti-FGFR2-Ⅲc抗体分子包括来自抗体重链和轻链可变区的至少一个，两个，三个，四个，五个，或六个互补决定区（CDRs），所述抗体选自：例如，Atto-MuMab-01，Atto-MuMab-02，Atto-MuMab-03，Atto-HuMab-01，Atto-HuMab-06，或Atto-HuMab-08。
[0062] 在一个实施例中，所述anti-FGFR2-Ⅲc抗体分子包括来自Atto-MuMab-01，Atto-MuMab-02，Atto-MuMab-03，Atto-HuMab-01，Atto-HuMab-06，或Atto-HuMab-08的所有六个CDRs或密切相关的CDRs，例如，相同的或具有至少一个氨基酸改变，但不多于两个，三个，或四个改变（例如，取代，缺失，或插入，例如，保守取代）的CDRs。可选择地，该蛋白质可能包括在此描述的任何CDR。
[0063] 在另一实施例中，所述anti-FGFR2-Ⅲc抗体分子包括来自抗体重链可变区的至少一个，两个，或三个Chothia高变区环，或特别地至少来自接触FGFR2-Ⅲc的那些高变区环的氨基酸，所述抗体选自：例如Atto-MuMab-01，Atto-MuMab-02，Atto-MuMab-03，Atto-HuMab-01，Atto-HuMab-06，或Atto-HuMab-08。在另一实施例中，所述anti-FGFR2-Ⅲc抗体分子包括来自抗体轻链可变区的至少一个，两个，或三个高变区环，或至少包括来自接触
[0064] FGFR2-Ⅲc的那些高变区环的氨基酸，所述抗体选自：例如Atto-MuMab-01，[0065] Atto-MuMab-02，Atto-MuMab-03，Atto-HuMab-01，Atto-HuMab-06， 或Atto-HuMab-08。在另一个实施例中，所述anti-FGFR2-Ⅲc抗体分子包括来自抗体重链和轻链可变区的至少一个，两个，三个，四个，五个，或六个高变区环，所述抗体选自：例如Atto-MuMab-01，Atto-MuMab-02，Atto-MuMab-03，Atto-HuMab-01，Atto-HuMab-06，或Atto-HuMab-08。在一个实施例中，所述anti-FGFR2-Ⅲc抗体分子包括来自FGFR2-Ⅲc，的所有六个高变区环，或密切相关的高变区环，例如，相同的或具有至少一个氨基酸改变，但不多于两个，三个，或四个改变（例如，取代，缺失，或插入，例如，保守取代）的高变区环。可选择地，所述anti-FGFR2-Ⅲc抗体分子可能包括在此描述的任何高变区环。
[0066] 在另一个实施例中，所述anti-FGFR2-Ⅲc抗体分子包括至少一个，两个，或三个高变区环，所述高变区环具有与Atto-MuMab-01，Atto-MuMab-02，Atto-MuMab-03，Atto-HuMab-01，Atto-HuMab-06，或Atto-HuMab-08对应的高变区环相同的标准结构，例如，与
[0067] Atto-MuMab-01，Atto-MuMab-02，Atto-MuMab-03，Atto-HuMab-01，Atto-HuMab-06，或Atto-HuMab-08的重链和/或轻链可变区的至少环1和/或环2相
同的标准结构。参考，例如，用于描述高变区环标准结构的Chothia等人，(1992)J.Mol.Biol.227:799-817;Tomlinson等人，(1992)J.Mol.Biol.227:776-798。这些结构可通过翻阅在这些参考文献中描述的表格来确定。
同的标准结构。参考，例如，用于描述高变区环标准结构的Chothia等人，(1992)J.Mol.Biol.227:799-817;Tomlinson等人，(1992)J.Mol.Biol.227:776-798。这些结构可通过翻阅在这些参考文献中描述的表格来确定。
[0068] 在一个实施例中，所述anti-FGFR2-Ⅲc抗体分子的轻链或重链可变框架（例如，包含至少FR1，FR2，FR3，并且可选择地FR4的区）可选自：（a）包括来自人轻链或重链可变区框架的至少80%，85%，87%，90%，92%，93%，95%，97%，98%或优选100%的氨基酸残基的轻链或重链可变区框架，例如来自人成熟抗体，人胚系序列或人共同序列的轻链或重链可变区框架；（b）包括来自人轻链或重链可变区框架从20%至80%，40%至60%，60%至90%，或70%至95%的氨基酸残基的轻链或重链可变区框架，例如来自人成熟抗体，人胚系序列或人共同序列的轻链或重链可变区框架；（c）非人框架（例如，啮齿目动物框架）；或（d）已经修饰的非人框架，例如移除抗原或细胞毒素决定因子，例如，去免疫，或部分人源化。在一个实施例中，所述轻链或重链可变框架区（具体地FR1，FR2和/或FR3）包括与人胚系基因的VH片段的框架至少70，75，80，85，87，88，90，92，94，95，96，97，98，99%相同或相同的轻链或重链可变框架序列。
[0069] 在一个实施例中，所述anti-FGFR2-Ⅲc抗体分子的重链或轻链可变区包括氨基酸序列，所述氨基酸序列与在此描述的抗体，例如Atto-MuMab-01，Atto-MuMab-02，Atto-MuMab-03，Atto-HuMab-01，Atto-HuMab-06，或Atto-HuMab-08，的可变区至少80%，85%，90%，92%，95%，97%，98%，99%或更一致；或与在此描述的抗体，例如Atto-MuMab-01，Atto-MuMab-02，Atto-MuMab-03，Atto-HuMab-01，Atto-HuMab-06，或Atto-HuMab-08，的可变区有至少1或5个残基但低于40,30,20或10个残基的差别。
[0070] 在一个实施例中，所述anti-FGFR2-Ⅲc抗体分子的重链或轻链可变区包括氨基酸序列，所述氨基酸序列由在此描述的核酸序列，或与在此描述的核酸序列（例如，具体的核苷酸序列或编码在此描述的氨基酸序列的核苷酸序列）或其互补序列，例如在此描述的低严谨条件，中严谨条件，高严谨条件或其它杂交条件下杂交的核酸编码。
[0071] 在另一实施例中，所述anti-FGFR2-Ⅲc抗体分子包括至少一个，两个，三个或四个抗原结合区，例如，可变区，所述抗原结合区具有图28，29B，29D，29F，30B，30D，30F，35，36A，36B，37A，38，或39描述的氨基酸序列，或与其基本相同的序列（例如与其至少约
85%，90%，95%，99%或更一致，或与图28，29B，29D，29F，30B，30D，30F，35，36A，36B，37A，38，或39展示的序列不多于1，2，5，10或15个氨基酸残基区别的序列）在另一实施例中，所述anti-FGFR2-Ⅲc抗体分子包括VH和/或VL域，所述VH和/或VL域由具有图29A，29C，
29E，30A，30C，30E，34A，34B，或37B描述的核苷酸序列，或与其基本相同的序列（例如，与其至少约85%，90%，95%，99%或更一致的序列，或与图29A，29C，29E，30A，30C，30E，34A，34B，或
37所示序列有不多于3，6，15，30，或45个核苷酸区别的）的核酸编码。
85%，90%，95%，99%或更一致，或与图28，29B，29D，29F，30B，30D，30F，35，36A，36B，37A，38，或39展示的序列不多于1，2，5，10或15个氨基酸残基区别的序列）在另一实施例中，所述anti-FGFR2-Ⅲc抗体分子包括VH和/或VL域，所述VH和/或VL域由具有图29A，29C，
29E，30A，30C，30E，34A，34B，或37B描述的核苷酸序列，或与其基本相同的序列（例如，与其至少约85%，90%，95%，99%或更一致的序列，或与图29A，29C，29E，30A，30C，30E，34A，34B，或
37所示序列有不多于3，6，15，30，或45个核苷酸区别的）的核酸编码。
[0072] 在另一实施例中，所述anti-FGFR2-Ⅲc抗体分子包括来自于重链可变区的至少一个，两个或三个CDRs，所述重链可变区具有如图28，29F，30F，35，或38-40描述的氨基酸序列，或与其基本同源的序列（例如，与其至少约85%，90%，95%，99%或更一致，和/或具有一个，两个，三个，或更多个取代，插入，或缺失，例如保守取代的序列）。在另一实施例中，所述anti-FGFR2-Ⅲc抗体分子包括来自于轻链可变区的至少一个，两个或三个CDRs，所述轻链可变区具有如图28，29D，30D，35，或38-40描述的氨基酸序列，或与其基本同源的序列（例如，与其至少约85%，90%，95%，99%或更一致，和/或具有一个，两个，三个，或更多个取代，插入，或缺失，例如保守取代的序列）。在另一个实施例中，所述anti-FGFR2-Ⅲc抗体分子包括来自于重链和轻链可变区的至少一个，两个，三个，四个，五个或六个CDRs，所述重链和轻链可变区具有如图28，29D，29F，30D，30F，35，或38-40描述的氨基酸序列，或与其基本同源的序列（例如，与其至少约85%，90%，95%，99%或更一致，和/或具有一个，两个，三个，或更多个取代，插入，或缺失，例如保守取代的序列）。
[0073] 在一个实施例中，所述anti-FGFR2-Ⅲc抗体分子包括来自于重链可变区的至少一个，两个或三个CDRs，所述重链可变区具有Atto-HuMab-01(例如，SEQ ID NOs:147-149，分别对应CDRs1-3)，Atto-HuMab-06(例如，SEQ ID NOs:147，158，159，分别对应CDRs1-3)，或Atto-HuMab-08(例如，SEQ ID NOs:147-149，分别对应CDRs1-3)的氨基酸序列，如图40中所示，或与其基本同源的序列（例如，与其至少约85%，90%，95%，99%或更一致，和/或具有一个，两个，三个，或更多个取代，插入，或缺失，例如保守取代的序列）。在一个实施例中，所述anti-FGFR2-Ⅲc抗体分子包括来自于轻链可变区的至少一个，两个或三个CDRs，所述轻链可变区具有Atto-HuMab-01(例如，SEQ ID NOs:144-146，分别对应CDRs1-3),Atto-HuMab-06(例如，SEQ ID NOs:155-157，分别对应CDRs1-3)，或Atto-HuMab-08(例如，SEQ ID NOs:155，156，146，分别对应CDRs1-3)的氨基酸序列，如图40中所示，或与其基本同源的序列（例如，与其至少约85%，90%，95%，99%相同或更一致，和/或具有一个，两个，三个，或更多个取代，插入，或缺失，例如保守取代的序列）。
[0074] 在另一个实施例中，所述anti-FGFR2-Ⅲc抗体分子包括来自重链可变区的至少一个，两个或三个CDRs，所述重链可变区具有选自以下的氨基酸序列：CDR1的SSYAIS(SEQ ID NO:147)，或CDR2的RIIPI X1G X2ANYAQKFQGR(SEQ ID NO:153)，其中X1为F或L，并且X2为T或I，或CDR3的RDX1X2X3W X4X5X6FDX7(SEQ ID NO:154)，其中X1为R或P，X2为W或L，X3为D或L，X4为N或S，X5为D或缺失，X6为A或Y，并且X7为I或Y。
[0075] 在另一实施例中，所述anti-FGFR2-Ⅲc抗体分子包括来自轻链可变区的至少一个，两个或三个CDRs，所述轻链可变区具有选自以下的氨基酸序列：CDR1的SGSSSNIG[0076] X1NX2VX3(SEQ ID NO:150)，其中X1为S或N，X2为T或Y，并且X3为S或N，或CDR2的X1NNX2RPSGX3(SEQ ID NO:151)，其中X1为S或D，X2为Q或K，并且X3为V或I，或CDR3的X1X2WDX3SLX4X5VV(SEQ ID NO:152)，其中X1为A或G,X2为A或T,X3为D或S,X4为N或S，并且X5为G或A。
[0077] 在另一实施例中，所述anti-FGFR2-Ⅲc抗体分子包括：
[0078] (i)来自重链可变区的至少一个，两个或三个CDRs，所述重链可变区具有选自以下的氨基酸序列：CDR1的SSYAIS(SEQ ID NO:147)，或CDR2的RIIPIX1GX2ANYAQKFQGR(SEQ ID NO:153)，其中X1为F或L，并且X2为T或I，或CDR3的RD X1X2X3WX4X5X6FDX7(SEQ ID NO:154)，其中X1为R或P，X2为W或L，X3为D或L，X4为N或S，X5为D或缺失，X6为A或Y，并且X7为I或Y；并且
[0079] (ii)来自轻链可变区的至少一个，两个或三个CDRs，所述轻链可变区具有选自以下的氨基酸序列：CDR1的SGSSSNIG X1N X2V X3(SEQ ID NO:150)，其中X1为S或N，X2为T或Y，并且X3为S或N，或CDR2的X1NN X2RPSGX3(SEQ ID NO:151)，其中X1为S或D，X2为Q或K，并且X3为V或I，或CDR3的X1X2WDX3SLX4X5VV(SEQ ID NO:152)，其中X1为A或G,X2为A或T,X3为D或S,X4为N或S，并且X5为G或A。
[0080] 在一个实施例中，所述anti-FGFR2-Ⅲc抗体分子包括在此描述的，例如图40所描述的六个CDRs。本发明的特征也在于包括编码重链和轻链可变区以及所述anti-FGFR2-Ⅲc抗体分子的CDRs的核苷酸序列的核酸，如在此所述。例如，本发明的特征为分别编码
[0081] anti-FGFR2-Ⅲc抗体分子的重链和轻链可变区的第一或第二核酸，所述anti-FGFR2-Ⅲc抗体分子选自：例如，Atto-MuMab-01，Atto-MuMab-02，Atto-MuMab-03，Atto-HuMab-01，Atto-HuMab-06，或Atto-HuMab-08中的一个或多个的，如在此所述。例如，所述核酸可包括如图29A，29C，29E，30A，30C，30E，34A，34B，或37B描述的核苷酸序列，或与其基本一致的序列（例如，与其至少约85%，90%，95%，99%相同或更一致的，或与图29A，
29C，29E，30A，30C，30E，34A，34B，或37B所示的序列有不多于3，6，15，30，或45个核苷酸区别的序列）。在一些实施例中，所述核酸包括编码来自于重链可变区的至少一个，两个或三个CDRs的核苷酸序列，所述重链可变区具有如图28，29F，30F，35，或38-40描述的氨基酸序列，或与其基本同源的序列（例如，与其至少约85%，90%，95%，99%相同或更一致，和/或具有一个，两个，三个，或更多个取代，插入，或缺失，例如保守取代的序列）。在另一个实施例中，所述核酸包括编码来自于轻链可变区的至少一个，两个或三个CDRs的核苷酸序列，所述轻链可变区具有如图28，29D，30D，35，或38-40描述的氨基酸序列，或与其基本同源的序列（例如，与其至少约85%，90%，95%，99%相同或更一致，和/或具有一个，两个，三个，或更多个取代，插入，或缺失，例如保守取代的序列）。在另一实施例中，所述核酸包括编码来自于重链和轻链可变区的至少一个，两个，三个，四个，五个或六个CDRs的核苷酸序列，所述重链和轻链可变区具有如图28，29D，29F，30D，30F，35，或38-40描述的氨基酸序列，或与其基本同源的序列（例如，与其至少约85%，90%，95%，99%相同或更一致，和/或具有一个，两个，三个，或更多个取代，插入，或缺失，例如保守取代的序列）。
29C，29E，30A，30C，30E，34A，34B，或37B所示的序列有不多于3，6，15，30，或45个核苷酸区别的序列）。在一些实施例中，所述核酸包括编码来自于重链可变区的至少一个，两个或三个CDRs的核苷酸序列，所述重链可变区具有如图28，29F，30F，35，或38-40描述的氨基酸序列，或与其基本同源的序列（例如，与其至少约85%，90%，95%，99%相同或更一致，和/或具有一个，两个，三个，或更多个取代，插入，或缺失，例如保守取代的序列）。在另一个实施例中，所述核酸包括编码来自于轻链可变区的至少一个，两个或三个CDRs的核苷酸序列，所述轻链可变区具有如图28，29D，30D，35，或38-40描述的氨基酸序列，或与其基本同源的序列（例如，与其至少约85%，90%，95%，99%相同或更一致，和/或具有一个，两个，三个，或更多个取代，插入，或缺失，例如保守取代的序列）。在另一实施例中，所述核酸包括编码来自于重链和轻链可变区的至少一个，两个，三个，四个，五个或六个CDRs的核苷酸序列，所述重链和轻链可变区具有如图28，29D，29F，30D，30F，35，或38-40描述的氨基酸序列，或与其基本同源的序列（例如，与其至少约85%，90%，95%，99%相同或更一致，和/或具有一个，两个，三个，或更多个取代，插入，或缺失，例如保守取代的序列）。
[0082] 在另一方面，本申请的特征在于寄主细胞和含有在此描述的核酸的载体。所述核酸可能存在于单个载体或分别的载体中，所述分离的载体存在于相同的寄主细胞或分别的寄主细胞中。
[0083] 通过，例如Atto-MuMab-01或Atto-MuMab-02中的一个或多个识别的FGFR2-Ⅲc的表位，例如人FGFR2-Ⅲc具有特征。在一个实施例中，anti-FGFR2-Ⅲc抗体分子的表位包括FGFR2Ⅲc314-353位(AAGVNTTDKEIEVLYIRNVTFEDAGEYTCLAGNSIGISFH(SEP ID NO:84))的至少一个氨基酸残基，或TCLAGNS IGIS FH(SEQ ID NO:86)的至少一个氨基酸残基。在一个实施例中，人FGFR2-Ⅲc表位包括SEQ ID NO:84的第1位的丙氨酸、第2位丙氨酸、第4位缬氨酸、第6位苏氨酸、第7位苏氨酸、第8位天冬氨酸、第9位赖氨酸、第11位异亮氨酸、第12位谷氨酸、第13位缬氨酸、第15位酪氨酸、第16位异亮氨酸、第17位精氨酸、第21位苯丙氨酸、第22位谷氨酸、第28位苏氨酸、第30位亮氨酸、第31位丙氨酸、第32位甘氨酸、第34位丝氨酸、第37位异亮氨酸、第38位丝氨酸、第39位苯丙氨酸，或第40位组氨酸中的一，二，三，四，五，六，七，八，九，十，十二，十四，十六，十八，二十，二十二或更多个(与
[0084] AAGVNTTDKEIEVLYIRNVTFEDAGEYTCLAGNSIGISFH(SEP ID NO:84))突出显示的氨基酸残基对应)；或SEQ ID NO:86的第1位苏氨酸，第3位亮氨酸，第4位丙氨酸，第5位甘氨酸，第7位丝氨酸，第10位异亮氨酸，第11位丝氨酸，第12位苯丙氨酸或第13位组氨酸中的一个或多个(与TCLAGNSIGISFH；SEQ ID NO:86突出显示的氨基酸残基对应)。
[0085] 在实施例中，所述抗体分子抑制，降低或中和所述异构体，例如高度增生（例如，癌或肿瘤）细胞和/或组织中的致癌异构体的一种或多种活性。例如，所述抗体分子可选择性和特异性地降低或抑制选自以下中的一种或多种的致癌异构体相关活性：（i）结合配体或共受体（例如，FGF配体，(例如FGF8b，FGF2，FGF17或FGF18)结合至FGFR2异构体Ⅲc）；（ii）受体二聚化（例如，FGFR2异构体Ⅲc二聚化）；（iii）受体信号转导，例如，FGFR2异构体Ⅲc信号转导；（iv）高度增生（例如癌或肿瘤）细胞增殖，生长和/或存活，例如，通过诱导高度增生细胞凋亡；和/或（v）肿瘤的血管生成和/或血管形成。在一些实施例中，该抗体分子结合至一种或多种细胞毒素剂或细胞抑制剂或基团，例如治疗药物，发出辐射的化合物，植物、真菌、或细菌来源的分子，或生物蛋白质（例如，蛋白毒素）、或颗粒（例如通过病毒衣壳蛋白重组的重组病毒颗粒）。在共轭抗体分子结合至位于一种或多种癌或肿瘤细胞或疾病显著表达或相关的外显子序列或接合区上的表位（例如在此描述的表位）后，共轭抗体分子选择性地靶向或输送细胞毒素剂或细胞抑制剂至高度增生（例如，癌或肿瘤）细胞和/或组织。在其它实施例中，所述抗体分子能以非结合的形式单独使用从而通过，例如，抗体依赖性细胞自杀机制，比如补体介导的细胞溶解和/或效应细胞介导的细胞自杀降低高度增生（例如，癌或肿瘤）细胞和/或组织的活性（例如，细胞生长或增殖）和/或杀死高度增生（例如，癌或肿瘤）细胞和/或组织。在其它实施例中，所述抗体分子能干扰细胞内相互作用，例如，异构体，例如致癌异构体，与同源受体或配体的结合，从而降低或妨碍高度增生（例如，癌或肿瘤）细胞和/或组织的活性。例如，选择性地结合至FGFR2的外显子Ⅲc的所述抗体分子可降低或抑制FGFR2异构体Ⅲc与其配体，例如：FGF8b，FGF2，FGF17或FGF18，中的一个或多个的相互作用，从而降低FGFR2异构体Illc表达细胞的的增殖和/或存活。
[0086] 应该理解的是，在此描述的所述抗体分子，可溶性或融合蛋白，多肽和核酸抑制剂能功能性地连接或衍生（例如通过化学偶合，基因融合，非共价结合或其它）一个或更多个其它分子实体，比如抗体（例如，双特异性或多特异性抗体），毒素，放射性同位素，细胞毒素剂或细胞抑制剂，标记等等。例如，在此描述的所述抗体分子，可溶性或融合蛋白，多肽和核酸抑制剂能结合至标记，比如荧光标记，生物活性酶标记，放射性同位素（例如，放射性离子），核磁共振活性标记，发光标记，或生色团。在其它实施例中，在此描述的所述抗体分子，可溶性或融合蛋白和多肽能结合至治疗剂，例如，细胞毒性部分，例如治疗药物、放射性同位素、植物、真菌或细菌来源的分子，或生物蛋白质（例如，蛋白毒素），或颗粒（例如通过病毒衣壳蛋白重组的重组病毒颗粒），或其混合物。所述治疗剂可以是细胞内活化药物或其它试剂，比如短程辐射体，包括，例如在此描述的短程高能量α发射体。在一些优选实施例中，在此描述的所述抗体分子，可溶性或融合蛋白，和多肽可结合至植物或细菌来源的分子（或其衍生物）；例如美登木素，紫杉烷，加利车霉素。放射性同位素可以为α-，β-或γ-发90 177 225
射体或β-和γ-发射体。用作治疗剂的放射性同位素包括钇( Y)、镥( Lu)、锕( Ac)、
211 186 212 213 188
镨，砹( At)、铼( Re)、铋( Bi or Bi)、铑( Rh)。用作标记，例如用于诊断，的放射性
131 125 111 99 32 14 3
同位素包括，碘( I或 I)、铟( In)、锝( mTc)、磷( P)、碳( C)，和氚(H)。在此描述的所述抗体分子，可溶性或融合蛋白和多肽也可以连接至其它抗体，从而形成，例如双特异性或多特异性抗体。
射体或β-和γ-发射体。用作治疗剂的放射性同位素包括钇( Y)、镥( Lu)、锕( Ac)、
211 186 212 213 188
镨，砹( At)、铼( Re)、铋( Bi or Bi)、铑( Rh)。用作标记，例如用于诊断，的放射性
131 125 111 99 32 14 3
同位素包括，碘( I或 I)、铟( In)、锝( mTc)、磷( P)、碳( C)，和氚(H)。在此描述的所述抗体分子，可溶性或融合蛋白和多肽也可以连接至其它抗体，从而形成，例如双特异性或多特异性抗体。
[0087] 在另一方面，本发明提供，组合物，例如，药物组合物，和在此描述的至少一种异构体特异性抑制剂，所述药物组合物包括药用可接受载体，赋形剂或稳定剂。在一个实施例中，所述异构体特异性抑制剂结合至标记或治疗剂。在一个实施例中，所述组合物，例如药物组合物，包括前述异构体特异性抑制剂中的两个或多个的组合，或不同的抗体分子。例如，组合物，例如，包含在此描述的异构体特异性抑制剂的药物组合物，与其它生长因子抑制剂，比如针对FGF1-23，FGF受体1-4，VEGF，EGF或EGF受体，PSMA，或Her-2/neu，等等的抗体，结合。异构体特异性抑制剂和药物，例如治疗剂（例如，细胞毒素药物或细胞抑制药物，例如，DM1，加利车霉素，紫杉烷，拓扑异构酶抑制剂，或免疫调节剂，例如，IL-1、2、4、6或12，干扰素α或γ，或免疫细胞生长因子，比如GM-CSF）的结合也在本发明的范围内。
[0088] 本发明的特征也在于编码在此描述的异构体结合分子的核酸序列。例如，本发明的特征在于，分别编码在此描述的抗体分子的修饰的重链和轻链可变区的第一和第二核酸。在其它实施例中，本发明提供编码在此描述的可溶性受体，融合物，多肽及其功能类似物的核苷酸序列。在另一方面，本发明的特征在于包含本发明的核酸的寄主细胞和载体。所述寄主细胞可能为真核细胞，例如哺乳动物细胞，昆虫细胞，酵母细胞，或原核细胞，例如，大肠杆菌（E.coli）。例如哺乳动物细胞可能为培养的细胞或细胞系。典型的哺乳动物包括淋巴细胞系（例如，NSO），中国仓鼠卵巢细胞（CHO），COS细胞，卵母细胞，和来自于转基因动物的细胞，例如，乳腺上表皮细胞。例如，编码在此描述的异构体结合分子的核酸可在转基因动物中表达。在一个实施例中，所述核酸在组织特异性启动子（例如乳腺特异性启动子）的控制下定位，并且所述抗体在转基因动物中产生。例如，所述异构体结合分子分泌于转基因动物的乳汁中，比如，转基因牛，猪，马，绵羊，山羊或啮齿动物。
[0089] 在一方面，本发明的特征在于，一种制备异构体结合抗体分子的方法，所述异构体结合抗体分子特异性结合至异构体（例如，致癌异构体）多肽。所述方法包括：提供异构体特异性抗原（例如，包括在此描述的表位的至少一部分的抗原）；获得特异性结合至异构体多肽的抗体分子；以及评估抗体分子是否特异性结合至异构体多肽（例如，评估存在在此描述的一个或多个表位时，所述抗体分子和所述异构体多肽之间的结合是否下降），或评估所述抗体分子在调节，例如抑制，异构体（例如致癌异构体）多肽的功效。所述方法可进一步包括使实验对象，例如，人或非人动物，服用所述抗体分子。
[0090] 在此描述的异构体特异性表位，例如分离的表位，也包含在本发明中。所述表位可能为线性的或所述异构体（例如，致癌异构体）的构象蛋白，例如，约2至80，约4至75，约5至70，约10至60，约10至50，约10至40，约10至30，约10至20个氨基酸残基。在一些实施例中，所述表位包含，或包括的位于两个外显子之间的接合区的氨基酸序列，所述外显子在一个或多个癌或肿瘤细胞或疾病表达或相关的蛋白异构体中显著地结合在一起，例如，由于框架内外显子缺失或选择性剪切外显子的使用。例如。所述表位能包含或包括与外显子Ⅲ的选择性剪切形式一致的氨基酸序列，例如，从FGFR2-Ⅲc约301至360位的氨基酸(SEQ ID NO:2)，FGFR2-Ⅲc约314至324位的氨基酸(AAGVNTTDKEI,SEQ ID NO:4)，FGFR2-Ⅲc约328至337位的氨基酸(YIRNVTFEDA,SEQ ID NO:6)，FGFR2-Ⅲc约350至
353位的氨基酸(ISFH,SEQ ID NO:8)，或由SEQ ID NOs:1，3，5或7的核苷酸序列编码的氨基酸，或与其基本一致的氨基酸或核苷酸序列。在其它实施例中，FGFR2-Ⅲc例如，人FGFR2-Ⅲc，的表位可能包括或包含FGFR2Ⅲc314-353位
353位的氨基酸(ISFH,SEQ ID NO:8)，或由SEQ ID NOs:1，3，5或7的核苷酸序列编码的氨基酸，或与其基本一致的氨基酸或核苷酸序列。在其它实施例中，FGFR2-Ⅲc例如，人FGFR2-Ⅲc，的表位可能包括或包含FGFR2Ⅲc314-353位
[0091] (AAGVNTTDKEIEVLYIRNVTFEDAGEYTCLAGNSIGISFH(SEQ ID NO:84))的至少一个氨基酸残基，或TCLAGNS IGIS FH(SEQ ID NO:86)的至少一个氨基酸残基。在一个实施例中，人FGFR2-Ⅲc表位包括SEQ ID NO:84的第1位的丙氨酸、第2位丙氨酸、第4位缬氨酸、第6位苏氨酸、第7位苏氨酸、第8位天冬氨酸、第9位赖氨酸、第11位异亮氨酸、第12位谷氨酸、第13位缬氨酸、第15位酪氨酸、第16位异亮氨酸、第17位精氨酸、第21位苯丙氨酸、第22位谷氨酸、第28位苏氨酸、第30位亮氨酸、第31位丙氨酸、第32位甘氨酸、第34位丝氨酸、第37位异亮氨酸、第38位丝氨酸、第39位苯丙氨酸，或第40位组氨酸中的一，二，三，四，五，六，七，八，九，十，十二，十四，十六，十八，二十，二十二或更多个(与[0092] AAGVNTTDKEIEVLYIRNVTFEDAGEYTCLAGNSIGISFH(SEP ID NO:84))突出显示的氨基酸残基对应)；或SEQ ID NO:86的第1位苏氨酸，第3位亮氨酸，第4位丙氨酸，第5位甘氨酸，第7位丝氨酸，第10位异亮氨酸，第11位丝氨酸，第12位苯丙氨酸或第13位组氨酸中的一个或多个(与TCLAGNSIGISFH；SEQ ID NO:86突出显示的氨基酸残基对应)。
[0093] 本发明的特征也在于一种降低高度增生细胞，例如，癌或肿瘤细胞（例如，表达致癌异构体，比如在此描述的FGFR2-ⅢC和FGFR1，RON，ΚIT，PDGF以及PDGFR-α的外显子缺失异构体的癌或肿瘤细胞）活性（例如，细胞生长或增殖），或诱导高度增生细胞自杀（例如，诱导凋亡）的方法。所述方法包括用在此描述的一种或多种异构体特异性抑制剂以足以降低异构体，例如致癌异构体的表达或活性的量接触高度增生细胞，或靠近高度增生细胞的细胞（例如，血管细胞），从而降低高度增生细胞的活性，或杀死高度增生细胞。在此描述的异构体特异性抑制剂能以结合或非结合的形式单独用作单一疗法或与一种或多种治疗剂结合，从而杀死高度增生细胞或降低高度增生细胞的活性，例如抑制高度增生细胞的生长。
[0094] 在实施例中，所述异构体结合分子为特异性结合至FGFR2-Ⅲc的抗体分子，例如，特异性结合至与外显子Ⅲ的选择性剪切形式一致的氨基酸序列，例如从FGFR2-ⅢC约301至360位的氨基酸(SEQ ID NO:2)，FGFR2-Ⅲc约314至324位的氨基酸(AAGVNTTDKEI,SEQ ID NO:4)，FGFR2-Ⅲc约328至337位的氨基酸(YIRNVTFEDA,SEQ ID NO:6)，FGFR2-Ⅲc约350至353位的氨基酸(ISFH,SEQ ID NO:8)，或由SEQ ID NOs:1，3，5或7的核苷酸序列编码的氨基酸，或与其基本一致的氨基酸或核苷酸。在这样的实施例中，所述高度增生细胞为来自于前列腺，乳腺，胰腺，卵巢，脑（胶质母细胞瘤），胃癌，肺鳞状细胞癌，非小细胞肺癌，甲状腺癌，子宫内膜癌，造血系统癌症，和骨骼疾病，比如颅面骨发育不全1，克鲁宗综合症（Crouzon syndrome），菲佛综合症（Pfeiffer syndrome），杰克逊-魏斯综合症（Jackson-Weiss syndrome）与阿佩尔综合症（Apert syndrome），的癌或肿瘤细胞。
[0095] 所述方法可用于例如在体外或间接体内培养的细胞。例如，高度增生细胞（例如，癌或肿瘤细胞（例如，前列腺的，肾脏的，泌尿道上皮的（例如，膀胱），睾丸的，卵巢的，乳腺，结肠，直肠，肺（例如，非小细胞肺癌），肝，脑，神经的（例如，神经内分泌的），神经胶质的（例如，胶质母细胞瘤），胰脏的，黑色素瘤（例如，恶性黑色素瘤），或软组织肉瘤癌或转移性细胞））能在体外培养基中培养，并且接触步骤可通过增加异构体结合分子至培养基实现。可选地，所述方法可在存在于实验对象的高度增生细胞上进行，作为体内（例如，治疗的或预防疾病的）方案的一部分。
[0096] 本发明的方法可用于，例如，通过使实验对象服用在此描述的，足以治疗或预防这些疾病的量的，异构体特异性抑制剂治疗或预防高度增生疾病，例如，前列腺，乳腺，胰腺和脑（胶质母细胞瘤）癌(原发，复发或转移)。在一个实施例中，所述癌为腺癌或前列腺癌和/或睾丸肿瘤。例如，所述癌为耐激素或难治性前列腺癌。在一个实施例中，所述癌为与FGFR2-Ⅲc高表达相关的耐雄激素或难治性前列腺癌。例如，所述癌展示了相对于参考值（例如，非癌前列腺组织）的高水平或表达的FGFR2-Ⅲc蛋白或mRNA，可选择地，伴随一种或多种上皮标记的下降（例如，上皮细胞表面粘附分子(Ep-CAM)的水平或表达下降和/或间叶细胞标记的增加）。在一些实施例中，所述癌为转移癌，所述转移癌展示了高水平的前列腺衍生的循环肿瘤细胞（例如，前列腺衍生的循环FGFR2Ⅲc表达前列腺肿瘤细胞）。在此描述的方法和组合物对治疗与前列腺癌相关的转移灶特别有用。在一些实施例中，患者将进行前列腺切除术，化疗，或其它抗肿瘤治疗中的一种或多种，并且主要或唯一的目标是转移灶，例如，在骨髓或淋巴结中的转移。
[0097] 在其它实施例中，以在此描述的异构体特异性抑制剂治疗的所述癌包括，但不限于，实体瘤，软组织肿瘤，和转移灶。实体瘤的例子包括恶性肿瘤，例如，各种器官系统的肉瘤，腺癌和癌，比如那些影响肺，乳腺，淋巴的，胃肠的（例如，结肠），生殖器和泌尿生殖道（例如，肾脏的，泌尿道上皮的，膀胱细胞），咽，CNS（例如，大脑，神经的或神经胶质细胞），皮肤（例如，黑色素瘤），和胰腺，以及包括恶性肿瘤，比如，大多数结肠癌，直肠癌，肾细胞癌，肝癌，肺非小细胞肺癌，小肠癌和食管癌的腺癌。在此描述的方法和组合物对治疗与上述癌症相关的转移灶特别有用。在一些实施例中，所述患者将进行组织手术切除，化疗，或其它抗癌治疗中的一种或多种，并且主要或唯一的目标是转移灶，例如，在骨髓或淋巴结中的转移。例如，FGFR2-Ⅲc致癌异构体的表达或活性的下降能用于预防和/或治疗激素难治性前列腺癌，乳腺癌，膀胱癌，甲状腺癌或其它形式的癌。
[0098] 在一个实施例中，治疗所述实验对象以预防高度增生疾病，例如，在此描述的高度增生疾病。所述实验对象可能为哺乳动物，例如，灵长类动物，优选地，高级灵长类动物，例如，人（例如，具有或可能具有在此描述的高度增生疾病例如前列腺癌疾病的患者）。在一个实施例中，所述实验对象为具有前列腺癌的患者（例如，患有复发或转移性前列腺癌的患者）。所述试验对象可以是具有所述疾病风险的人，例如，对所述疾病具有相关苦恼的对象，例如，其祖父母/外祖父母、父母、叔/舅或姑/姨、兄弟姐妹或孩子中的一个或多个患有所述疾病的对象，或具有与所述疾病风险有关的遗传性状的对象。在一个实施例中，所述实验对象可能为有症状的或无症状的。例如，所述实验对象可能受有症状的或无症状的前列腺癌，例如患有耐激素或难治性前列腺癌。在一些实施例中，所述实验对象患有转移性前列腺癌。在一些实验中，所述实验对象具有高水平的前列腺衍生循环肿瘤细胞（例如，前列腺衍生循环FGFR2Ⅲc表达前列腺肿瘤细胞）。在其它实施例中，所述实验对象具有一种或多种正常水平的癌例如前列腺癌，标记。例如，所述实验对象具有正常水平的前列腺特异抗原（PSA），前列腺特异性膜抗原（PSMA），前列腺干细胞抗原（PSCA），雄激素受体（AR），嗜铬粒蛋白，突触素，MIB-1，和/或α-甲酰基辅酶A消旋酶(AMACR)。
[0099] 实验对象能全身地（例如，口服、肠胃外给药、皮下给药、静脉注射、直肠给药、肌肉给药、腹膜内给药、经鼻给药、经皮给药、或通过吸入或腔内置入），局部地，或通过敷用在黏膜，比如鼻子，咽喉和支气管服用在此描述的异构体特异性抑制剂。
[0100] 本发明的方法，例如，治疗或预防的方法，可进一步包括监测实验对象的步骤，例如，以下变化（增加或下降）中的一个或多个：肿瘤大小、癌标记的水平（例如，前列腺癌的患者的FGFR2Ⅲc水平或表达、循环前列腺衍生的FGFR2Ⅲc表达细胞的水平、上皮细胞标记（Ep-CAM）、FGF配体（例如，FGF8）、基质细胞衍生因子(SDFa)、VEGF（例如，VEGF121）、间叶细胞标记、PSA、PSMA、PSCA、AR、嗜铬粒蛋白、突触素、MIB-1、AMACR、碱性磷酸酶、和/或血清血红蛋白；新病灶出现的速度，例如，在骨扫描中；新疾病相关症状的出现；或软组织肿块的大小，例如，减小或稳定化；生活质量，例如疾病相关疼痛量，例如，骨痛；或任何其它临床结果相关参数。所述实验对象可在以下一个或多个阶段中监测：治疗开始前，治疗期间，或已经执行一个或多个治疗元素后。监测可用于评估用相同的异构体结合分子进一步治疗或用另外的试剂进行另外治疗的需要。通常，上文所述的一个或多个参数的下降是实验对象症状改良的象征，尽管实验对象的症状改良可能伴随血清血红蛋白水平的提高。
[0101] 本发明的方法可进一步包括分析来自实验对象的核酸或蛋白质的步骤，例如，分析实验对象的基因型。在一个实施例中，分析编码异构体，例如致癌异构体，和/或异构体信号转导的上游或下游元件的核酸，例如，异构体的细胞外或细胞内激活因子或抑制因子。该分析能用于，例如，评价可选的治疗，例如，具体剂量，输送模式，传送时间，辅助治疗的包含内容，例如与第二试剂结合服用，的合适性，或在上述可选的治疗之间选择，或广泛地确定实验对象的可能的药物反应显型或基因型。可在治疗的任何阶段，但优选服用异构体特异性抑制剂之前分析核酸或蛋白质，从而确定用于实验对象预防疾病或治疗疾病的合适的异构体特异性抑制剂剂量和治疗方案（例如，每次治疗的用量或治疗的频率）。
[0102] 异构体特异性抑制剂（例如异构体特异性结合试剂）可以非结合的形式单独使用，从而通过，例如抗体依赖性细胞自杀机制，比如补体介导的细胞溶解和/或效应细胞介导的细胞自杀，降低异构体表达高度增生或癌细胞的活性或诱导异构体表达高度增生或癌细胞的自杀。在其它实施例中，所述异构体特异性抑制剂可结合至底物，例如细胞毒素剂或基团（例如，治疗药物，发出辐射的化合物，植物、真菌或细菌来源的分子，或生物蛋白质（例如，蛋白毒素），或颗粒（例如通过病毒衣壳蛋白重组的重组病毒颗粒）。例如，异构体特异性抑制剂可结合至放射性同位素，比如α-，β-或γ-发射体或β-和γ-发射体。放射性同131 125 90 177 225 212 213
位素的例子包括碘( I或 I)、钇( Y)、镥( Lu)、锕( Ac)、镨、或铋( Bi or Bi)。选择性地，所述异构体结合分子可结合至生物蛋白，植物或细菌来源的分子（或其衍生物），例如美登木素（例如，美登醇或DM1），以及紫杉烷（例如，紫杉醇或泰索帝），加利车霉素。所述美登木素可以为，例如，美登醇或美登醇类似物。美登醇类似物的例子包括具有修饰性芳香环（例如，C-19-脱氯基，C-20-脱甲氧，C-20-酰氧基）和在其它位置（例如，C-9-CH，C-14-烷氧甲基，C-14-羟甲基或乙酰氧基甲基，C-15-羟基/酰氧基，C-15-甲氧基，C-18-N-去甲基
4,5-脱氧）有修饰的那些。例如，美国专利号6,333,410描述了美登醇或美登醇类似物，在此引用其内容作为参考。加利车霉素可以为，例如，溴复合物加利车霉素（例如，α，β，γ，溴复合物），碘复合物加利车霉素（例如，α，β，γ，碘复合物），或其类似物和仿制物。溴复合物加利车霉素包括α1-BR，α2-BR，α3-BR，α4-BR，β1-BR，β2-BR和γ1-BR。碘复合物加利车霉素包括α1-I，α2-I，α3-I，β1-Ι，β2-Ι，δ1-Ι和γ1-BR。例如，1990年11月13日公布的美国专利号4,970,198，1993年11月23日公布的美国专利号5,264,586，1996年
8月27日公布的美国专利号5,550,246，1998年1月27日公布的美国专利号5,712,374，和
1998年2月3日公布的美国专利号5,714,586描述了加利车霉素及其突变体，类似物和仿制物，在此引用其内容作为参考。美登醇能结合至抗体，所述抗体使用，例如，N-琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶二硫基)丙酸酯（也称为N-琥珀酰亚胺基4-(2-吡啶二硫基)戊酸或SPP），
4-琥珀酰亚胺基-羰氧基-a-(2-吡啶二硫基)甲苯(SMPT)，N-琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶二硫基)丁酸(SDPB)，2-亚氨硫杂戊烷，或S-乙酰琥珀酸酐。
位素的例子包括碘( I或 I)、钇( Y)、镥( Lu)、锕( Ac)、镨、或铋( Bi or Bi)。选择性地，所述异构体结合分子可结合至生物蛋白，植物或细菌来源的分子（或其衍生物），例如美登木素（例如，美登醇或DM1），以及紫杉烷（例如，紫杉醇或泰索帝），加利车霉素。所述美登木素可以为，例如，美登醇或美登醇类似物。美登醇类似物的例子包括具有修饰性芳香环（例如，C-19-脱氯基，C-20-脱甲氧，C-20-酰氧基）和在其它位置（例如，C-9-CH，C-14-烷氧甲基，C-14-羟甲基或乙酰氧基甲基，C-15-羟基/酰氧基，C-15-甲氧基，C-18-N-去甲基
4,5-脱氧）有修饰的那些。例如，美国专利号6,333,410描述了美登醇或美登醇类似物，在此引用其内容作为参考。加利车霉素可以为，例如，溴复合物加利车霉素（例如，α，β，γ，溴复合物），碘复合物加利车霉素（例如，α，β，γ，碘复合物），或其类似物和仿制物。溴复合物加利车霉素包括α1-BR，α2-BR，α3-BR，α4-BR，β1-BR，β2-BR和γ1-BR。碘复合物加利车霉素包括α1-I，α2-I，α3-I，β1-Ι，β2-Ι，δ1-Ι和γ1-BR。例如，1990年11月13日公布的美国专利号4,970,198，1993年11月23日公布的美国专利号5,264,586，1996年
8月27日公布的美国专利号5,550,246，1998年1月27日公布的美国专利号5,712,374，和
1998年2月3日公布的美国专利号5,714,586描述了加利车霉素及其突变体，类似物和仿制物，在此引用其内容作为参考。美登醇能结合至抗体，所述抗体使用，例如，N-琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶二硫基)丙酸酯（也称为N-琥珀酰亚胺基4-(2-吡啶二硫基)戊酸或SPP），
4-琥珀酰亚胺基-羰氧基-a-(2-吡啶二硫基)甲苯(SMPT)，N-琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶二硫基)丁酸(SDPB)，2-亚氨硫杂戊烷，或S-乙酰琥珀酸酐。
[0103] 本发明的方法和组合物能与其它治疗方式结合使用。在一个实施例中，本发明的方法包括使实验对象服用在此描述的，有效治疗或预防所述疾病的量的，结合细胞毒素剂的异构体特异性抑制剂。所述结合分子和细胞毒素剂能同时或相继服用。在其它实施例中，本发明的方法和组合物与手术和/或辐射过程结合使用。在其它实施例中，所述方法可与免疫调节剂，例如，IL-1，2，4，6或12，或干扰素α或γ，或免疫细胞生长因子，比如GM-CSF，结合使用。能与异构体特异性抑制剂结合服用的典型的细胞毒素剂包括抗微小管剂、拓扑异构酶抑制剂、抗代谢物、有丝分裂抑制剂、烷基化剂、嵌入剂、能干扰信号转导途径的试剂，促进凋亡的试剂和放射物。
[0104] 在前列腺疾病，例如前列腺癌，的治疗中，异构体特异性抑制剂能与现有的治疗方式，例如，前列腺切除术（局部的或根治的），放射治疗，激素治疗，雄激素消融治疗，和细胞毒性化疗结合使用。通常，激素治疗用于降低患者的雄激素水平，并可能包含服用促黄体生成素释放激素(LHRH)类似物或兴奋剂（例如，醋酸亮丙瑞林（Lupron），诺雷德（Zoladex），亮丙瑞林（leuprolide），布舍瑞林（buserelin），或戈舍瑞林（goserelin）），以及拮抗剂（例如，阿巴瑞克（Abarelix））。非固醇抗雄激素，例如，氟他胺（flutamide），比卡鲁胺（bicalutimade），或尼鲁米特（nilutamide），也可用于激素治疗，以及固醇抗雄激素（例如，醋酸环丙孕酮或醋酸甲地孕酮），雌激素（例如，己烯雌酚），外科手术阉割， 二级或三级激素调控（例如，包括皮质类固醇（例如，氢化可的松（hydrocortisone），强的松（prednisone）或地塞米松（dexamethasone），）甲酮康唑（ketoconazole），和/或氨鲁米特（aminogluthethimide）），5α还原酶抑制剂（例如，非那雄胺（finisteride）），中药制剂（例如，PC-SPES），垂体切除术，和肾上腺切除术。此外，激素治疗能间歇地进行，或采用结合上述任何治疗，例如结合使用亮丙瑞林和氟他胺进行。
[0105] 异构体特异性抑制剂和其他治疗方式可结合使用或相继使用。所述异构体特异性抑制剂和其它治疗方式可在疾病活跃阶段，或在疾病活跃减轻或减少阶段期间服用。上述异构体特异性抑制剂和其它治疗方式可在治疗前，治疗的同时，治疗后，或在疾病减轻期间服用。
[0106] 在另一方面，本发明的特征在于用于检测存在于体外样品（例如，生物样品，例如血清，精液或尿液，或活检组织，例如，来自高度增生或癌病灶）中的异构体（例如在此描述的致癌异构体）多肽或基因表达产物。题述方法可用于评估（例如，对在此描述的实验对象的疾病，例如高度增生或癌疾病，进行监测治疗或进展，诊断和/或分期）。所述方法包括：(i)在容许异构体结合分子和所述多肽或基因表达产物发生相互作用的情况下，以在此描述的异构体结合分子（例如抗体分子）接触样品（并且选择性地，标准样品，例如对照样品）；
以及(ii)检测异构体结合分子和样品（并且选择性地，标准样品，例如对照样品）之间的复合物的形成。复合物的形成是多肽或基因表达产物存在的象征，并且能指示在此描述的治疗的适用性和需求。例如，相对于标准样品，例如对照样品，样品中复合物形成的统计上的重大变化是样品中异构体，例如，致癌异构体存在的象征。在一些实施例中，所述方法包括使用多于一种异构体结合分子，例如，结合至相同致癌异构体（例如，FGFR2异构体Ⅲc），或不同致癌异构体上的不同表位的两种抗体分子。例如，所述方法可能包括免疫组织化学、免疫细胞化学、FACS、抗体分子复合磁珠，ELISA分析，PCR技术（例如，RT-PCR），例如，如在所附实施例中所述。
以及(ii)检测异构体结合分子和样品（并且选择性地，标准样品，例如对照样品）之间的复合物的形成。复合物的形成是多肽或基因表达产物存在的象征，并且能指示在此描述的治疗的适用性和需求。例如，相对于标准样品，例如对照样品，样品中复合物形成的统计上的重大变化是样品中异构体，例如，致癌异构体存在的象征。在一些实施例中，所述方法包括使用多于一种异构体结合分子，例如，结合至相同致癌异构体（例如，FGFR2异构体Ⅲc），或不同致癌异构体上的不同表位的两种抗体分子。例如，所述方法可能包括免疫组织化学、免疫细胞化学、FACS、抗体分子复合磁珠，ELISA分析，PCR技术（例如，RT-PCR），例如，如在所附实施例中所述。
[0107] 在另一方面，本发明通过一种检测体内的异构体（例如在此描述的致癌异构体）多肽或基因表达产物（例如实验对象的体内成像）的方法。所述方法可用于在实验对象中，例如哺乳动物，例如灵长类动物，例如人类（例如，对在此描述的疾病，例如高度增生或癌疾病，进行监测治疗或进展，诊断和/或分期）评估。所述方法包括：i)在容许异构体结合分子和多肽或基因表达产物发生相互作用的情况下，使实验对象服用异构体结合分子（例如在此描述的抗体分子）；以及(ii)检测异构体结合分子和多肽或基因表达产物之间的复合物的形成。相对于标准样品，例如对照样品或实验对象的底线，样品中复合物的形成的统计上的重大变化是多肽或基因表达产物存在的象征。
[0108] 在其它实施例中，提供一种评估方法（例如，对在此描述的实验对象的高度增生或癌疾病，的监测治疗或进展，诊断和/或阶段）。所述方法包括：(i)识别患有所述疾病，可能患有所述疾病的实验对象；(ii)获得受所述疾病影响的组织或细胞的样品；(iii)在容许所述结合分子和异构体多肽或产物发生相互作用的情况下，以在此描述的异构体结合分子，例如在此描述的抗体分子，接触所述样品或对照样品；以及(iv)检测复合物的形成。相对于标准样品，例如对照样品，复合物的形成的统计上的重大变化是所述疾病或所述的阶段的象征。
[0109] 典型地，在体内和体外诊断方法中使用的异构体结合分子直接或间接地用可检测的物质标记从而有利于已结合结合剂或未结合结合剂的检测。合适的可检测物质包括各种生物活性酶，辅基，荧光材料，发光材料，顺磁（例如，核磁共振活性）材料，和放射性材料。111 131 125
在一些实施例中，异构体结合分子结合至放射性离子，例如，铟( In)、碘( I或 I）、钇
90 177 225 212 213 35 14 3 188
( Y)、镥( Lu)、锕( Ac)、铋( Bi or Bi)、硫（ S）、碳( C)，和氚(H)、铑( Rh)、锝
99 32
( mTc)、镨、磷（ P）。
在一些实施例中，异构体结合分子结合至放射性离子，例如，铟( In)、碘( I或 I）、钇
90 177 225 212 213 35 14 3 188
( Y)、镥( Lu)、锕( Ac)、铋( Bi or Bi)、硫（ S）、碳( C)，和氚(H)、铑( Rh)、锝
99 32
( mTc)、镨、磷（ P）。
[0110] 在此描述的检测/诊断方法可进一步包括监测实验对象的步骤，例如，以下中的一个或多个变化（增加或下降）：肿瘤大小、癌症标记的水平（例如，前列腺癌的患者的FGFR2Ⅲc水平或表达、循环前列腺衍生的FGFR2Ⅲc表达细胞的水平、上皮细胞标记（Ep-CAM）、FGF配体（例如，FGF8）、基质衍生因子α(SDFα)、VEGF（例如，VEGF121）、间叶细胞标记、PSA、PSMA、PSCA、AR、嗜铬粒蛋白、突触素、MIB-1、AMACR、碱性磷酸酶、和/或血清血红蛋白）、新病灶出现的速度，例如，在骨扫描中、新疾病相关症状的出现、或软组织肿块的大小，例如，减小或稳定化、生活质量，例如疾病相关疼痛量，例如，骨痛、或任何其它临床结果相关参数。可在以下一个或多个时期中监测所述实验对象：治疗开始前，治疗期间，已经执行一个或多个治疗元素后。监测可用于评估用相同的异构体结合分子进一步治疗或用另外的试剂进行另外治疗的需要。一般地，上文所述的一个或多个参数的下降是实验对象的症状改良的象征，尽管实验对象的症状改良可能伴随血清血红蛋白水平的提高。
[0112] 在此使用的冠词“一”指的是一个（种）或多于一个（种）（例如，至少一个（种））的合乎语法的物体。
[0113] 在此使用的术语“或”意为术语“和/或”并且与术语“和/或”可交替地使用，除非上下文特别指出。
[0114] 术语“蛋白质”和“多肽”可交替地使用。
[0115] “大约”和“接近”一般意为在给定测量性质或准确性的情况下，测得的数量的误差的可接受程度。误差的典型程度在给定值或值的范围的百分之20（%）内，典型地，在10%内，并且更典型地，在5%内。
[0116] 引用在此提及的所有公布，专利申请，专利和其它参考文献的全文作为参考。
附图说明
[0118] 图1描述了FGFR2受体酪氨酸激酶的异构体结构。上面：异构体Ⅲb在正常前列腺上皮细胞中表达。下面：异构体Ⅲc在激素难治性前列腺癌中表达。TM=跨膜;AB=酸性区域；I,II或III=Ig样环I,II或III。
[0119] 图2描述了Ⅲc异构体(SEQ ID NO:2)和Ⅲb异构体(SEQ ID NO:65)的序列比对。
[0120] 图3A描述了人FGFR2Ⅲc的氨基酸序列(SEQ ID NO:19)。
[0121] 图3B描述了人FGFR2Ⅲc的核苷酸序列(SEQ ID NO:20)。
[0122] 图4A描述了FGFR2Exon-Ⅲc的核苷酸序列(SEQ ID NO:1)。
[0123] 图4B描述了FGFR2Exon-Ⅲb的核苷酸序列(SEQ ID NO:64)。
[0124] 图5A描述了肽Ⅲc-314的氨基酸序列(SEQ ID NO:4)和核苷酸序列(SEQ ID NO:3)。
[0125] 图5B描述了肽Ⅲc-328的氨基酸序列(SEQ ID NO:6)和核苷酸序列(SEQ ID NO:5)。
[0126] 图5C描述了肽Ⅲc-350的氨基酸序列(SEQ ID NO:8)和核苷酸序列(SEQ ID NO:7)。
[0127] 图6A描述了Ⅲb(Loop3-C)片段：氨基酸314-351的氨基酸序列(SEQ ID NO:56)和核苷酸序列(SEQ ID NO:60)。
[0128] 图6B描述了Ⅲb表位：氨基酸314-328的氨基酸序列(SEQ ID NO:57)和核苷酸序列(SEQ ID NO:61)。
[0129] 图6CⅢb表位：氨基酸340-351的氨基酸序列(SEQ ID NO:58)和核苷酸序列(SEQ ID NO:62)。
[0130] 图7描述了FGFR1的异构体结构。
[0131] 图8描述了在接合部分的FGFR1L表位序列的氨基酸序列(SEQ ID NO:9)和核苷酸序列(SEQ ID NO:10)。
[0132] 图9描述了在外显子4和外显子7之间的接合区的RONA160表位的氨基酸序列(SEQ ID NO:11)和核苷酸序列(SEQ ID NO:12)。
[0133] 图10描述了为抗体靶向KIT异构体而设计的抗原表位的氨基酸序列(SEQ ID NO:13)和核苷酸序列(SEQ ID NO:14)。
[0134] 图11描述了为抗体靶向PDGF异构体而设计的表位的核苷酸序列(SEQ ID NO:15)和氨基酸序列(SEQ ID NO:16)。
[0135] 图12描述了PDGFR-α异构体的表位的核苷酸序列(SEQ ID NO:17)和氨基酸序列(SEQ ID NO:18)。
[0136] 图13A描述了可溶性FGFR2Ⅲc-Fc融合蛋白的结构。
[0137] 图13B描述了可溶性FGFR2Ⅲc-Fc融合蛋白的核苷酸序列(SEQ ID NO:54)。
[0138] 图13C描述了可溶性FGFR2Ⅲc-Fc融合蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO:55)。信号肽对应于SEQ ID NO:55的氨基酸1至21.
[0139] 图13D描述了表达可溶性FGFR2Ⅲc-Fc的重组融合蛋白的CHO稳定细胞系的SDS-PAGE分析的Western blot。
[0140] 图13E为描述了可溶性受体FGFR2β-ECD与FGF8b配体结合的柱状图。
[0141] 图13F为描述了鼠抗Atto-MuMab-03抑制FGFR2Ⅲc结合至的GF8b配体的线性图。
[0142] 图14描述了来自人和大鼠的FGFR2受体免疫球蛋白样环3区域的序列比对。环3的C端是由产生Ⅲc(黑体所示)(SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:67的第6-53位残基)的
外显子8和产生;或者由产生Ⅲb(斜体)(SEQ ID NO:65和SEQ ID NO:68的第6-51位残基)的外显子9和产生。人和大鼠序列在这些区域是100%一致的。
外显子8和产生;或者由产生Ⅲb(斜体)(SEQ ID NO:65和SEQ ID NO:68的第6-51位残基)的外显子9和产生。人和大鼠序列在这些区域是100%一致的。
[0143] 图15描述了FGFR2受体的双重靶向策略。抗体Ab-1靶向受体的胞外配体结合位点；并且TKI(例如RO4383596或Pazopanib)靶向胞内酪氨酸激素域。
[0144] 图16描述了用于分析FGFR2Ⅲc和Ⅲb异构体的PCR引物。
[0145] 图17A描述了人FGFR2基因的氨基酸序列(SEQ ID NO:32)。
[0146] 图17B-17C分别描述了人FGFR2Ⅲb的氨基酸序列(SEQ ID NO:21)和核苷酸序列(SEQ ID NO:63)。
[0147] 图17D–17O分别描述了人FGFR2异构体4的氨基酸序列(SEQ ID NO:22)，异构体7的氨基酸序列(SEQ ID NO:23)，异构体9的氨基酸序列(SEQ ID NO:24)，异构体10的氨基酸序列(SEQ ID NO:25)，异构体11的氨基酸序列(SEQ ID NO:26)，异构体12的氨基酸序列(SEQ ID NO:27)，异构体13的氨基酸序列(SEQ ID NO:28)，异构体14的氨基酸序列(SEQ ID NO:29)，异构体15的氨基酸序列(SEQ ID NO:30)，异构体17的氨基酸序列(SEQ ID NO:31)，异构体18的氨基酸序列(SEQ ID NO:52)和异构体19的氨基酸序列(SEQ ID NO:53)。图18A描述了人FGFR1基因的氨基酸(SEQ ID NO:33)。
[0148] 图18B-18H分别描述了人FGFR1异构体1的氨基酸序列(SEQ ID NO:38)，异构体4的氨基酸序列(SEQ ID NO:39)，异构体14的氨基酸序列(SEQ ID NO:40)，异构体16的氨基酸序列(SEQ ID NO:41)，异构体17的氨基酸序列(SEQ ID NO:42)，异构体3的氨基酸序列(SEQ ID NO:43)和异构体18的氨基酸序列(SEQ ID NO:44)。
[0149] 图19A描述了人RON基因的氨基酸序列(SEQ ID NO:34)。
[0150] 图19B描述了人非癌RON异构体的氨基酸序列(SEQ ID NO:45)。
[0151] 图20A描述了人KIT基因的氨基酸序列(SEQ ID NO:35)。
[0152] 图20B描述了缺失了外显子11的人KIT变体的氨基酸序列(SEQ ID NO:46)。
[0153] 图20C描述了人全长KIT的氨基酸序列(SEQ ID NO:47)。
[0154] 图21A描述了人PDGF基因的氨基酸序列(SEQ ID NO:36)。
[0155] 图21B描述了人PDGF异构体2的氨基酸序列(SEQ ID NO:48)。
[0156] 图21C描述了人全长PDGF的氨基酸序列(SEQ ID NO:49)。
[0157] 图22A描述了人PDGFR-α基因的氨基酸序列(SEQ ID NO:37)。
[0158] 图22B描述了人PDGFR-α异构体1的氨基酸序列(SEQ ID NO:50)。
[0159] 图22C描述了缺失了外显子7-8的人PDGFR-α异构体的氨基酸序列(SEQ ID NO:51)。
[0160] 图23描述了人FGF8的氨基酸序列(SEQ ID NO:66)。
[0161] 图24A为描述了与结合至FGFR2Ⅲb相比，单克隆抗体克隆B7，C5，D2，D10，E3，E8，F3，F10和G9选择性结合至FGFR2Ⅲc-Fc的柱状图。克隆B7在此是指“Atto-MuMab-03”。图24B为描述了与结合至FGFR2Ⅲb相比，指定的单克隆抗体克隆(包括Atto-MuMab-03)结合至FGFR2Ⅲc-Fc的OD值和标准偏差表。
[0162] 图25A为描述了与结合至不相关人卵白蛋白(OA)和人铁蛋白(Fer)对照相比，人抗体scFv克隆1-8群选择性结合至含有128氨基酸（235-353位氨基酸）的FGFR2Ⅲc异构体的环3区的柱状图。
[0163] 图25B为描述了与结合至不相关OA和Fer对照相比，人抗体scFv克隆群结合至FGFR2Ⅲc(mFc)的128个氨基酸的片段的OD值和标准偏差表。
[0164] 图26为针对与FGFR2Ⅲc的30种不同的人抗体scFv克隆的DNA指纹的图片。
[0165] 图27A为描述了指定的人抗体scFv克隆选择性结合至FGFR2异构体Ⅲc对比结合至FGFR2Ⅲb的的柱状图。
[0166] 图27B为描述了指定的人scFv克隆选择性结合至异构体Ⅲc对比结合至FGFR2Ⅲb的OD值和标准偏差表。
[0167] 图28描述了人scFv克隆6(SEQ ID NO:160)和克隆8(SEQ ID NO:161)的氨基酸序列比对。轻链和重链可变区的互补决定区域(CDRs)的位置有下划线并分别标记为VL-CDR-1，-2和-3,以及VH-CDR-1，-2和-3。接头序列加有阴影。克隆6和克隆8在此也分别指"Atto-HuMab-06"和"Atto-HuMab-08"。
[0168] 图29A-29B分别描述了人scFv克隆8(Atto-HuMab-08)的轻链可变区和重链可变区的全长编码区的核苷酸序列(SEQ ID NO:162)和氨基酸序列(SEQ ID NO:161)。
[0169] 图29C-29D分别描述了人scFv克隆8(Atto-HuMab-08)的轻链可变区的核苷酸序列(SEQ ID NO:164)和氨基酸序列(SEQ ID NO:163)。CDR序列(SEQ ID NOS:184-186分别对应CDRs1-3的核苷酸序列；SEQ ID NOS:155,156和146分别对应CDRs1-3的氨基酸序列)有下划线。
[0170] 图29E-29F分别描述了人scFv克隆8(Atto-HuMab-08)的重链可变区的核苷酸序列(SEQ ID NO:166)和氨基酸序列(SEQ ID NO:165)。CDR序列(SEQ ID NOS:187-189分别对应CDRs 1-3的核苷酸序列；SEQ ID NOS:147-149分别对应CDRs1-3的氨基酸序列)有下划线。
[0171] 图30A-30B分别描述了人scFv克隆6(Atto-HuMab-06)的轻链可变区和重链可变区的全长编码区的核苷酸序列(SEQ ID NO:167)和氨基酸序列(SEQ ID NO:160)。
[0172] 图30C-30D分别描述了scFv克隆6(Atto-HuMab-06)的轻链可变区的核苷酸序列(SEQ ID NO:169)和氨基酸序列(SEQ ID NO:168)。CDR序列(SEQ ID NOS:178-180分别对应CDRs1-3的核苷酸序列；SEQ ID NOS:155-157分别对应CDRs1-3的氨基酸序列)有下划线。
[0173] 图30E-30F分别描述了scFv克隆6(Atto-HuMab-06)的重链可变区的核苷酸序列(SEQ ID NO:171)和氨基酸序列(SEQ ID NO:170)。CDR序列(SEQ ID NOS:181-183分别对应CDRs 1-3的核苷酸序列；SEQ ID NOS:147，158和159分别对应CDRs1-3的氨基酸序列)有下划线。
[0174] 图31为描述了文库筛选中噬菌体克隆回收率的表。
[0175] 图32为描述单克隆抗体Atto-MuMab-03结合至肿瘤细胞中内源性FGFR2Ⅲc的蛋白质印迹（Western blot）的图片。
[0176] 图33描述了蛋白质印迹，该蛋白质印迹法展示了mAb Atto-MuMab-01结合至前列腺癌细胞系DU145中的内源性FGFR2Ⅲc蛋白。条带1：来自50,000个细胞的DU145细胞溶解产物；条带2：来自500,000个DU145细胞的溶解产物的mAb IP；条带3：空白；条带4：FGFR2Ⅲc-Fc(100ng)的正对照。
[0177] 图34A描述了Atto-MuMab-02重链可变区的核苷酸序列(SEQ ID NO:87;358bp)。CDRs(SEQ ID NOS:91,93和95分别对应CDRs1-3)的核苷酸序列和框架区分别以下划线和斜体展示。
[0178] 图34B描述了Atto-MuMab-02轻链可变区的核苷酸序列(SEQ ID NO:89;324bp)。CDRs(SEQ ID NOS:97,99和101分别对应CDRs1-3)的核苷酸序列和框架区分别以下划线和斜体展示。
[0179] 图35描述了Atto-MuMab-02轻链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO:90;21-LC)和重链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO:88;21-HC)。SEQ ID NOS:98,100和102分别对应VL CDRs1-3。SEQ ID NOS:92,94和96分别对应VH CDRs1-3。
[0180] 图36A描述了Atto-MuMab-02和小鼠免疫球蛋白μ链的氨基酸序列比对。21HC：
[0181] Atto-MuMab-02免疫球蛋白重链可变区(SEQ ID NO:88)；实验对象：免疫球蛋白μ链[小家鼠](SEQ ID NO:142;GenBank:AAA88255.1)。
[0182] 图36B描述了Atto-MuMab-02轻链可变区和鼠抗人黑素瘤免疫球蛋白轻链的氨基酸序列比对。21LC：Atto-MuMab-02轻链可变区(SEQ ID NO:90的1-106位残基)；实验对象：抗人黑素瘤免疫球蛋白轻链[小家鼠](SEQ ID NO:143;GenBank:AA049727.1)。
[0183] 图37A-37B分别描述了人scFv克隆1(scFv-1，在此也表示为"Atto-HuMab-01")的轻链可变区和重链可变区的全长编码区的氨基酸序列(SEQ ID NO:190)和核苷酸序列(SEQ ID NO:191)。接头画上阴影。CDR序列画上下划线，SEQ ID NOS:144-146分别对应VL CDRs1-3的氨基酸序列。SEQ ID NOS:147-149分别对应VH CDRs1-3的氨基酸序列。SEQ ID NOS:172-174分别对应VL CDRs1-3的核苷酸序列。SEQ ID NOS:175-177分别对应VH CDRs1-3的核苷酸序列。
[0184] 图38描述了人scFv克隆1(scFv-1,SEQ ID NO:142)和克隆6(scFv-6,SEQ ID NO:160)的氨基酸序列比对。轻链和重链可变区的互补决定区(CDRs)的位置画上下划线并分别标记为VL-CDR-1,-2和-3，以及VH-CDR-1,-2和-3。接头序列画上阴影。克隆1和克隆6在此也分别表示为"Atto-HuMab-01"和"Atto-HuMab-06"。
[0185] 图39描述了人scFv克隆1(scFv-1,SEQ ID NO:142)和克隆8(scFv-8;SEQ ID NO:161)的氨基酸序列比对。轻链和重链可变区的互补决定区(CDRs)的位置画上下划线并分别标记为VL-CDR-1,-2和-3，以及VH-CDR-1,-2和-3。接头序列画上阴影。克隆1和克隆6在此也分别表示为"Atto-HuMab-01"和"Atto-HuMab-06"。
[0186] 图40为描述了人scFv克隆scFv-1,scFv-6和scFv-8之间的CDR区同源性对比。独特的氨基酸残基画上下划线。三个克隆中的两个之间具有序列同源性的氨基酸残基用斜体表示。所有三个克隆之间同源的氨基酸残基以常规字体表示。
[0187] 图41描述了人scFv克隆1(scFv-1)结合至FGFR2Ⅲc表达CHO细胞的免疫细胞化学(ICC)着色的图像。
[0188] 图42描述了由荧光激活细胞分离技术(FACS)确定的人scFv克隆1(dcFv-01)的Fc融合与FGFR2Ⅲc表达CHO细胞结合的曲线图。
[0189] 图43描述了免疫细胞化学(ICC)着色的图像。所述免疫细胞化学(ICC)着色展示了人scFv克隆1(dcFv-01)的Fc融合与大鼠前列腺癌细胞系AT3B-1的结合。
[0190] 图44描述了由荧光激活细胞分离技术确定(FACS)的人scFv克隆1(dcFv-01)的Fc融合与大鼠前列腺癌细胞系AT3B-1结合的图像。具体实施例
[0191] 本发明至少部分地提供异构体特异性抑制剂，该异构体特异性抑制剂抑制或降低一种或多种异构体相关活性。在一些实施例中，该异构体（例如，多肽或核酸异构体）由致癌或恶性表型（在此以致癌异构体表示）表达和/或与致癌或恶性表型（在此以致癌异构体表示）相关。例如，该异构体可从例如，选择性剪接，移码，翻译和/或翻译后事件中的一个或多个产生，从而导致不同的转录或翻译产物。在一个实施例中，所述异构体特异性抑制剂为异构体结合分子，例如抗体分子，或核酸抑制剂。在另一实施例中，所述异构体特异性抑制剂为可溶性受体多肽及其融合形式，或肽及其功能性变体。例如，所述异构体特异性抑制剂可为致癌异构体结合分子，例如，抗体分子或核酸抑制剂，该抗体分子或核酸抑制剂特异性与一种或多种致癌异构体（例如，致癌异构体多肽或编码致癌异构体多肽的核酸）相互作用，例如，结合。在另一实施例中，所述异构体特异性抑制剂为降低或抑制一种或多种异构体（例如，致癌异构体）相关活性的可溶性受体多肽或其融合形式，或肽或其功能性变体。在实施例中，所述可溶性受体或融合物降低或抑制（例如，竞争地抑制）异构体（例如，致癌异构体）多肽和其同源配体和受体的相互作用。
[0192] 所述致癌异构体可从例如细胞，例如高增生细胞（例如癌或肿瘤细胞）中的各种原癌基因表达产物的选择性剪接，移码，翻译和/或翻译后事件中产生。在此描述的所述异构体结合分子结合至这些致癌异构体，但基本不结合至衍生出所述异构体的原癌基因的占优势的非致癌序列。
[0193] 在蛋白质或多肽的上下文中，在此使用的术语“异构体”指的是可从选择性剪接，移码，翻译和/或翻译后事件中衍生的任何长度的氨基酸的聚合物。选择性剪接事件包括在给定的RNA分子内的一个或多个选择性外显子（编码蛋白质的基因的部分）结合从而由相同的基因产生不同的mRNA的过程（在转录期间）。每个这种mRNA被称为“基因转录本”。通常，由于细胞或组织特异性造成不同的外显子结合，单个基因可编码几条不同的mRNA转录本。例如，成纤维细胞生长因子受体1-3(FGFR1-3)的多种形式被认为由mRNA的选择性剪接产生。涉及FGFR1和2的频繁的剪接事件产生受体，所述受体包含三个免疫球蛋白(ig)域，通常被称为α异构体，或仅免疫球蛋白Ⅱ（IgⅡ）和IgⅢ，被称为β异构体。所述α异构体被识别为FGFR3和FGFR4。在此被称为FGFRⅢb和FGFR2Ⅲc的，带有选择性IgⅢ域的FGF受体由涉及由FGFR2基因衍生的两个相互排斥的选择性外显子编码的IgⅢ域的C端的FGFR1-3的剪接事件产生（参看，Galzie,Z.等人，(1997)Biochem.Cell.Biol.75:669-685;Burke,D.等人(1998)Trends Biochem Sci23:59-62）。FGFR2-Ⅲc使用选择性外显子Ⅲ，所述外显子Ⅲ编码的序列与FGFR2-Ⅲb编码的序列不同。选择性剪接的其它原因/来源包括移码（即，核糖体将mRNA/转录本中的三个密码子翻译为不同的组）或改变翻译起始或停止位置，导致假性内含子保留在mRNA转录本中。不同的机体组织和一些疾病与选择性剪接事件相关，并因此在不同的组织或有病的组织中产生不同的蛋白质。
[0194] “致癌异构体”指的是可能由选择性剪接，移码，翻译和/或翻译后事件中的一种或多种衍生的任何蛋白质，多肽，mRNA，或cDNA，其存在或异常水平与癌或恶性表型相关。例如，与参考值，例如非疾病对照的组织或细胞相比，发现受疾病影响的组织衍生的细胞中的异常水平。可能是蛋白质异构体以异常高水平表达，变化的表达与癌的出现和/或进展关联。致癌异构体也可能为突变基因或遗传变异的表达产物，该突变基因或遗传变异基因对癌症的病因负有直接责任或在与对癌症的病因负有责任的其它基因的连锁不平衡中。典型的致癌异构体包括但不限于，FGFR2（例如，致癌FGFR2异构体Ⅲc）、FGFR1（例如致癌FGFR1L）、RON受体酪氨酸激酶（例如，缺失外显子5和6的致癌RON受体酪氨酸激酶）、KIT受体酪氨酸激酶(例如，缺失外显子11的致癌KIT受体酪氨酸激酶)和PDGF受体α（例如缺失外显子7和8的致癌PDGF受体α）
[0195] 简单地，“非致癌异构体”或“非致癌原癌基因”指的是在非癌细胞或组织中主要发现的蛋白质，多肽，mRNA或cDNA。这些异构体和原癌基因可能在恶性病情下表达，但通常不与恶性表型相关。
[0196] 本发明的组合物和方法包含多肽和核酸，所述多肽和核酸具有特定的序列或与其基本一致或相似的序列，例如与特定的序列至少85%，90%，95%相同或更一致的序列。氨基酸序列的上下文中，在此使用的术语“基本一致”或“基本相同”指的是第一氨基酸序列包含与第二氨基酸序列中的比对的氨基酸i)一致，或ii)保守取代，的足够的或最少量氨基酸，从而使第一和第二氨基酸序列可具有相同的结构域和/或相同的功能活性。例如，包含与参考序列至少约85%,90%.91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%或99%相同的普通结构域的氨基酸，例如SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6，为基本一致的。
[0197] 在核苷酸的上下文中，在此使用的术语“基本一致”或“基本相同”指的是第一氨基酸序列包含与第二核酸序列中的比对的核酸i)一致/相同，或ii)保守取代，的足够的或最少量的核酸残基，从而使第一和第二核酸序列编码具有普通功能活性的多肽，或编码普通结构多肽域或具有普通功能多肽活性的多肽。例如，与参考序列至少约85%,90%.91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%或99%相同的核酸序列，例如,SEQ ID NO:1，3或5为基本相同的。
[0198] 术语“功能性变体”指的是具有与自然生成的序列基本一致的氨基酸序列的，或由基本一致的核苷酸序列编码的，并能具有自然生成的序列的一种或多种活性的多肽。
[0199] 序列之间的同源或序列一致性（在此，该术语可交替使用）的计算按下面进行。
[0200] 为确定两条氨基酸序列或两条核酸序列的百分比一致性，为了最优比较目的，比对序列（例如，为了最优比对，将间隙引入第一和第二条氨基酸或核苷酸序列中的一条或两条中，并且为了比较的目的，非同源序列可被忽略）。在一个优选的实施例中，为了比较目的而比对的参考序列的长度至少为参考序列的长度的30%,优选至少40%，更优选至少50%，60%，并且更优选至少70%，80%，90%，100%。然后比较在对应的氨基酸位点或核苷酸位点的氨基酸残基或核苷酸。当第一序列的位点被在第二序列上对应位点一致的氨基酸残基或核苷酸占据时，该分子在该位点是一致的（在此使用的氨基酸或核酸“一致性”等同于氨基酸或核酸“同源性”）
[0201] 两条序列之间的百分比一致性受序列共有的一致位点的数量的影响，考虑了为两条序列的最优比对需要引入的间隙的数量和每个间隙的长度。
[0202] 序列的比较和两条序列之间的百分比一致性的确定可以用数学算法完成。在优选的实施例中，用Needleman和Wunsch算法((1970)J.Mol.Biol.48:444-453)确定两条氨基酸序列之间的百分比一致性。Needleman和Wunsch算法已经包含在GCG软件包(参见http://www.gcg.com)的GAP程序中，GAP程序使用Blossum62矩阵或PAM250矩阵和间隙权重16，14，12，10，8，6或4和长度权重1，2，3，4，5或6。在另一个优选的实施例中，用GCG软件包(参见http://www.gcg.com)的GAP程序确定两条核苷酸序列之间的百分比一致性，GAP程序使用NWSgapdna.CMP矩阵与间隙权重40，50，60，70或80和长度权重1，2，3，4，5或6。参数的具体优选设置（以及除了特别说明之外应该使用的参数）为间隙罚分为12，间隙延伸罚分为4和移码间隙罚分为5的Blossum62打分矩阵。
[0203] 两条氨基酸或核苷酸序列的百分比一致性可以用E.Meyers和W.Miller((1989)CABIOS,4:11-17)算法确定，E.Meyers和W.Miller算法已经包含在使用PAM120重量残渣表,间隙长度罚分为12和间隙罚分为4的ALIGN程序(版本2.0)中。
[0204] 在此描述的核酸和蛋白序列可用作“查询序列”进行公共数据库搜索从而，例如，识别其它家族成员或相关序列。这些搜索能用Altschul等人，(1990)J.Mol.Biol.215:403-10的NBLAST和XBLAST程序(版本2.0)进行。BLAST核苷酸搜索能以NBLAST程序，分值=100，字长=12进行以获取与本发明的核酸(SEQ ID NO:1)分子同源的核苷酸序列。BLAST蛋白搜索能以XBLAST程序，分值=50，字长=3进行以获得与本发明的蛋白质分子同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的间隙比对，可以使用Altschul等人在(1997)Nucleic Acids Res.25:3389-3402中描述的间隙BLAST。当使用BLAST和间隙BLAST时，可以使用每一个程序(例如XBLAST和NBLAST)的缺省参数。参见http://www.ncbi.nlm.nih.gov。
[0205] 在此使用的术语“低严谨条件，中严谨条件，高严谨条件或非常高严谨条件下的杂交”描述杂交和洗脱条件。最新分子生物学实验方法汇编（Current Protocols in Molecular Biology）John Wiley&Sons,N.Y.(1989),6.3.1-6.3.6上有进行杂交反应的指南，引用其内容作为参考。该参考文献中描述了水相法和非水相法，可使用这两种方法中的一种。在此，在此指的具体杂交条件如下：1)低严谨杂交条件为6X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)，45°C，随后以0.2X SSC,0.1%SDS，至少50°C洗脱两次(低严谨条件下洗脱温度可以提高至55°C)；2)中严谨杂交条件为6X SSC，约45°C，随后以0.2X SSC,0.1%SDS在60°C洗脱一次或更多次；3)高严谨杂交条件为6X SSC，约45°C，随后以0.2XSSC,0.1%SDS，65°C洗脱一次或更多次；并且更优选地4)非常高严谨杂交条件为0.5M磷酸钠，7%SDS，65°C，随后以0.2X SSC，1%SDS，65°C洗脱一次或更多次。非常高严谨条件(4)为优选条件并且是除特别说明外应该使用的条件。
[0206] 应该理解的是本发明的分子可能具有另外的保守或非必需氨基酸的取代，这在它们的功能上不会有实质的影响。
[0207] 术语“氨基酸”意指包括无论自然的或合成的，含有氨基功能和酸功能两者的，并且能包含于自然生成的氨基酸的聚合物中的所有的分子。典型的氨基酸包括自然生成的氨基酸，及其类似物、衍生物和同类，具有变异的侧链的氨基酸类似物，和之前任何的立体异构体。在此使用的术语“氨基酸”包括D-或L-旋光异构体和模拟肽两者。
[0208] “保守氨基酸取代”是氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基所替换。本领域中已经定义具有相似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括具有碱性侧链（例如，赖氨酸，精氨酸，组氨酸），酸性侧链（例如，天冬氨酸，谷氨酸），不带电的极性侧链（例如，甘氨酸，天冬酰胺酸，谷氨酰胺，丝氨酸，苏氨酸，酪氨酸，半胱氨酸），非极性侧链（例如，丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，蛋氨酸，色氨酸），β分支侧链（例如，苏氨酸，缬氨酸，异亮氨酸）和芳香族侧链（例如，酪氨酸，苯丙氨酸，色氨酸，组氨酸）。
[0209] 术语“多肽”，“肽”和“蛋白质”（如果是单链）在此可交替使用，指的是任何长度的氨基酸的聚合物。该聚合物可能为线性的或分支的，其可能包括修饰的氨基酸，并且其可能被非氨基酸中断。该术语也可能包含已经修饰的氨基酸聚合物，例如，二硫键形成，糖基化，脂质化，乙酰化，磷酸化，或其它操作，比如与标签组合物结合。在此使用的术语“多肽”指的是通过一个氨基酸的α羧基和另一个氨基酸的α氨基之间的肽键连接的两个或更多的氨基酸。多肽可通过自然资源分离，可为从真核或原核寄主通过重组技术产生的产物，或可为合成过程的产物。
[0210] 术语“核酸”，“核酸序列”，“核苷酸序列”或“多核苷酸序列”和“多核苷酸”可交替使用。其指的是任何长度的核苷酸的聚合形式，脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其类似物。多核苷酸可以为单链或双链，并且单链可为编码链或非编码（反义）链。多核苷酸可具有三维结构，并可执行各种已知或未知的功能。以下为多核苷酸的非限制性例子：基因或基因片段的编码或非编码区，连锁分析确定的位点（位点），外显子，内含子，信使RNA(mRNA)，转移RNA，核糖体RNA，核酶，cDNA，重组多核苷酸，分枝多核苷酸，质粒，载体，任何序列的分离的DNA，任何序列的分离的RNA，核酸探针和引物。多核苷酸可能包括修饰的核苷酸，比如甲基化核苷酸和核苷酸类似物。如果存在，对核苷酸结构的修饰可在聚合物组装前或后进行。核苷酸序列可被非核苷酸组合物中断。核苷酸在聚合，比如通过与标签组合物结合后，进一步修饰。该核酸可为重组多核苷酸，或基因组的，cDNA，半合成的，或不是自然生成的或连接至另一个非自然排列的多核苷酸的合成起源的多核苷酸。
[0211] “寡核苷酸”指的是具有少于约100个核苷酸，少于约75，50，25或10个核苷酸的单链多核苷酸。在此使用的“寡核苷酸”指的是核糖核酸（RNA）和脱氧核糖核酸（DNA）或其类似物的寡聚物或聚合物。该术语包括由自然生成的碱基，糖和共价核苷（骨架）键组成的寡核苷酸以及具有非自然生成的，有相似功能的部分的寡核苷酸。由于想要的性质，如增强的细胞吸收，提高的核酸靶标的亲和力和提高的在核酸酶存在下的稳定性，这种修饰的或取代的寡核苷酸通常优于天然形态的寡核苷酸。
[0212] 在此使用的术语“分离的”或“分离”是指从其原始的或天然的环境（例如，自然环境，如果其是自然生成的）移除的材料。例如，自然生成的多核苷酸或存在于在活的动物中的多肽不是分离的，但通过人为干预从自然系统中的一些或所有的共存材料分开的相同的多核苷酸或多肽是分离的。这种多核苷酸可为载体的一部分和/或这种多核苷酸或多肽可为组合物的一部分，当所述载体或组合物并非环境（该环境为在自然界中发现所述载体或组合物时的环境）的一部分时，则所述多核苷酸或多肽仍然是分离的。
[0213] 本发明的各个方面在下文进一步详细描述。补充定义贯穿全文。
[0214] 致癌异构体或其表位的多肽
[0215] 本发明提供致癌异构体或其表位的多肽，或大致与其一致的序列。术语“表位”或“表位片段”是指抗体分子优先并特异性结合在抗原上的区域。单克隆抗体优先结合至分子上可以在一个分子水平上定义的特定表位。具体蛋白或蛋白异构体的表位可能由有限数量的氨基酸残基组成，例如在蛋白或蛋白异构体上以线性或非线性组织的2-30个残基。通过抗体识别的表位可能为，例如横跨在蛋白的正常异构体中不存在的致癌异构体的两个域或两条多肽片段的接合部分的2-30个氨基酸的短肽。致癌异构体可能为相对于编码的正常蛋白的RNA缺失一个或多个外显子或具有额外的外显子的RNA选择性剪接变体的翻译产物。该表位可能包含或包括在SEQ ID NOs:10,12,14或18中的任何一条的15-16,15-17,15-18,15-19,15-20,15-21,15-22,15-23,15-24,15-25,15-26,15-27,15-28,15-29或 15-30位置的残基。在另一实施例中，该表位可能包含或包括在SEQ ID NOs:10,12,14或18中的任何一条的14-16,14-17,14-18,14-19,14-20,14-21,14-22,14-23,14-24,14-25,14-26,14-27,14-28,14-29或14-30位置的残基。在另一实施例中，该表位可能包含或包括在SEQ ID NOs:10,12,14或18中的任何一条的13-16,13-17,13-18,13-19,13-20,13-21,13-22,1
3-23,13-24,13-25,13-26,13-27,13-28,13-29或13-30位置的残基。在另一实施例中，该表位可能包含或包括在SEQ ID NOs:10,12,14或18中的任何一条的12-16,12-17,12-18,
12-19,12-20,12-21,12-22,12-23,12-24,12-25,12-26,12-27,12-28,12-29或12-30位置的残基。在另一实施例中，该表位可能包含或包括在SEQ ID NOs:10,12,14或18中的任何一条的11-16,11-17,11-18,11-19,11-20,11-21,11-22,11-23,11-24,11-25,11-26,11-2
7,11-28,11-29或11-30位置的残基。在另一实施例中，该表位可能包含或包括在SEQ ID NOs:10,12,14或18中的任何一条的10-16,10-17,10-18,10-19,10-20,10-21,10-22,10-
23,10-24,10-25,10-26,10-27,10-28,10-29或10-30位置的残基。在另一实施例中，该表位可能包含或包括在SEQ ID NOs:10,12,14或18中的任何一条的9-16,9-17,9-18,9-19,9-20,9-21,9-22,9-23,9-24,9-25,9-26,9-27,9-28,9-29或9-30位置的残基。在另一实施例中，该表位可能包含或包括在SEQ ID NOs:10,12,14或18中的任何一条的8-16,8-17,8-18,8-19,8-20,8-21,8-22,8-23,8-24,8-25,8-26,8-27,8-28,8-29或8-30位置的残基。
在另一实施例中，该表位可能包含或包括在SEQ ID NOs:10,12,14或18中的任何一条的7-16,7-17,7-18,7-19,7-20,7-21,7-22,7-23,7-24,7-25,7-26,7-27,7-28,7-29或7-30位置的残基。在另一实施例中，该表位可能包含或包括在SEQ ID NOs:10,12,14或18中的任何一条的6-16,6-17,6-18,6-19,6-20,6-21,6-22,6-23,6-24,6-25,6-26,6-27,6-28,6-2
9或6-30位置的残基。在另一实施例中，该表位可能包含或包括在SEQ ID NOs:10,12,14或18中的任何一条的5-16,5-17,5-18,5-19,5-20,5-21,5-22,5-23,5-24,5-25,5-26,5-27,5-28,5-29或5-30位置的残基。在另一实施例中，该表位可能包含或包括在SEQ ID NOs:10,12,14或18中的任何一条的4-16,4-17,4-18,4-19,4-20,4-21,4-22,4-23,4-24,4-25,4-26,4-27,4-28,4-29或4-30位置的残基。在另一实施例中，该表位可能包含或包括在SEQ ID NOs:10,12,14或18中的任何一条的3-16,3-17,3-18,3-19,3-20,3-21,3-22,3-23,3-24,3-25,3-26,3-27,3-28,3-29或3-30位置的残基。在另一实施例中，该表位可能包含或包括在SEQ ID NOs:10,12,14或18中的任何一条的2-16,2-17,2-18,2-19,2-20,2-21,2-22,2-23,2-24,2-25,2-26,2-27,2-28,2-29或2-30位置的残基。在另一实施例中，该表位可能包含或包括在SEQ ID NOs:10,12,14或18中的任何一条的1-16,1-17,1-18,
1-19,1-20,1-21,1-22,1-23,1-24,1-25,1-26,1-27,1-28,1-29或1-30位置的残基。“表位”可以用于产生特异性结合致癌异构体的抗体(例如基本不结合相同的原癌基因衍生的非致癌异构体)。
3-23,13-24,13-25,13-26,13-27,13-28,13-29或13-30位置的残基。在另一实施例中，该表位可能包含或包括在SEQ ID NOs:10,12,14或18中的任何一条的12-16,12-17,12-18,
12-19,12-20,12-21,12-22,12-23,12-24,12-25,12-26,12-27,12-28,12-29或12-30位置的残基。在另一实施例中，该表位可能包含或包括在SEQ ID NOs:10,12,14或18中的任何一条的11-16,11-17,11-18,11-19,11-20,11-21,11-22,11-23,11-24,11-25,11-26,11-2
7,11-28,11-29或11-30位置的残基。在另一实施例中，该表位可能包含或包括在SEQ ID NOs:10,12,14或18中的任何一条的10-16,10-17,10-18,10-19,10-20,10-21,10-22,10-
23,10-24,10-25,10-26,10-27,10-28,10-29或10-30位置的残基。在另一实施例中，该表位可能包含或包括在SEQ ID NOs:10,12,14或18中的任何一条的9-16,9-17,9-18,9-19,9-20,9-21,9-22,9-23,9-24,9-25,9-26,9-27,9-28,9-29或9-30位置的残基。在另一实施例中，该表位可能包含或包括在SEQ ID NOs:10,12,14或18中的任何一条的8-16,8-17,8-18,8-19,8-20,8-21,8-22,8-23,8-24,8-25,8-26,8-27,8-28,8-29或8-30位置的残基。
在另一实施例中，该表位可能包含或包括在SEQ ID NOs:10,12,14或18中的任何一条的7-16,7-17,7-18,7-19,7-20,7-21,7-22,7-23,7-24,7-25,7-26,7-27,7-28,7-29或7-30位置的残基。在另一实施例中，该表位可能包含或包括在SEQ ID NOs:10,12,14或18中的任何一条的6-16,6-17,6-18,6-19,6-20,6-21,6-22,6-23,6-24,6-25,6-26,6-27,6-28,6-2
9或6-30位置的残基。在另一实施例中，该表位可能包含或包括在SEQ ID NOs:10,12,14或18中的任何一条的5-16,5-17,5-18,5-19,5-20,5-21,5-22,5-23,5-24,5-25,5-26,5-27,5-28,5-29或5-30位置的残基。在另一实施例中，该表位可能包含或包括在SEQ ID NOs:10,12,14或18中的任何一条的4-16,4-17,4-18,4-19,4-20,4-21,4-22,4-23,4-24,4-25,4-26,4-27,4-28,4-29或4-30位置的残基。在另一实施例中，该表位可能包含或包括在SEQ ID NOs:10,12,14或18中的任何一条的3-16,3-17,3-18,3-19,3-20,3-21,3-22,3-23,3-24,3-25,3-26,3-27,3-28,3-29或3-30位置的残基。在另一实施例中，该表位可能包含或包括在SEQ ID NOs:10,12,14或18中的任何一条的2-16,2-17,2-18,2-19,2-20,2-21,2-22,2-23,2-24,2-25,2-26,2-27,2-28,2-29或2-30位置的残基。在另一实施例中，该表位可能包含或包括在SEQ ID NOs:10,12,14或18中的任何一条的1-16,1-17,1-18,
1-19,1-20,1-21,1-22,1-23,1-24,1-25,1-26,1-27,1-28,1-29或1-30位置的残基。“表位”可以用于产生特异性结合致癌异构体的抗体(例如基本不结合相同的原癌基因衍生的非致癌异构体)。
[0216] 在一个实施例中，本发明提供人致癌异构体或其表位的分离的多肽。在一个实施例中，异构体或其表位为选自以下的原癌基因的致癌形式：人FGFR2(SEQ ID NO:32)，人FGFR1(SEQ ID NO:33)，人RON受体酪氨酸激酶(SEQ ID NO:34)，人KIT受体酪氨酸激酶(SEQ ID NO:35)，人PDGF(SEQ ID NO:36)和人PDGFR-α(SEQ ID NO:37)或与其基本一致的序列。
[0217] 在一个实施例中，本发明提供致癌异构体或其表位的分离的大鼠多肽。在一个实施例中，本发明提供人致癌异构体或其表位的分离的小鼠多肽。在其它的实施例中，人致癌异构体或其表位的分离的多肽会来源于其它物种，包括但不限于，狗、猪、豚鼠和兔。
[0218] FGFR2
[0219] 成纤维生长因子受体2（FGFR2）在本领域也称为细菌表达激酶（BEK），角化细胞生长因子受体（KGFR），JWS，CEK3，CFDl，ECTl，TK14，TK25，BFR-1，CD332，K-SAM和FLJ98662。FGFR2为成纤维细胞生长因子受体家族的成员并且对酸性的，碱性的和/或角化细胞生长因子具有高亲和力。FGFR2与导致有丝分裂和分化的信号转导相关。FGFR2突变与颅面骨发育不全1，克鲁宗综合症（Crouzon syndrome），菲佛综合症（Pfeiffer syndrome），杰克逊-魏斯综合症（Jackson-Weiss syndrome）与阿佩尔综合症（Apert syndrome）相关。
[0220] 例 如，Dionne 等 人，(1990)EMBO J.9:2685-2692 和 Miki 等 人，(1992)PNAS89:246-250公开了人FGFR2的核苷酸和蛋白质序列。例如，Miki等人，(1991)Science251:72-75和Mansukhani等人，(1992)PNAS89:3305-3309公开了小鼠FGFR2的核苷酸和蛋白质序列。人FGFR2未加工前体长度为约821个氨基酸并且分子量为约90310Da。小鼠FGFR2未加工前体长度为约821个氨基酸并且分子量为约90310Da。
[0221] 在一个实施例中，本发明提供由核酸编码的致癌异构体或其表位的分离的多肽，所述核酸包括来源于编码FGFR2的核酸的外显子Ⅲ的选择性使用的一段核苷酸。在一个实施例中，当与FGFR2Ⅲb比对时，外显子Ⅲ的选择性使用导致从301-360位氨基酸区域的序列变化。因此，在一个实施例中，所述多肽包含或包括选自SEQ NOs:2，4，6和8的序列。在另一实施例中，所述多肽包含或包括选自SEQ NOs:1，3，5和7的核酸编码的序列，或与其大致一致的序列。
[0222] FGFR1
[0223] 成纤维细胞生长因子受体1（FGFR1）在本领域中也被称为CEK、FLG、FLT2、KAL2、BFGFR、CD331、FGFBR、HBGFR、N-SAM和FLJ99988。FGFR2为成纤维细胞生长因子受体家族的成员并且对酸性的和碱性的成纤维细胞生长因子两者具有高亲和力。FGFR1与导致有丝分裂和分化的信号转导相关并参与肢体诱导。
[0224] 例如，Isacchi等人，Nucleic Acids Res.18:1906-1906(1990)和Hou等 人，Science251:665-668(1991)公开了人FGFR1的核苷酸和蛋白质序列。例如，Harada等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.205:1057-1063(1994)公开了小鼠FGFR1的核苷酸和蛋白质序列。人FGFR1未加工前体长度为约822个氨基酸并且分子量为约90420Da。小鼠FGFR1未加工前体长度为约822个氨基酸并且分子量为约90420Da。
[0225] FGFR1突变与菲佛综合症（Pfeiffer syndrome），杰克逊-魏斯综合症（Jackson-Weiss syndrome），Antley-Bixler综合症，软骨发育不良和常染色体显性Kallmann综合症2相关。涉及该基因的染色体畸变与干细胞骨髓增殖性疾病和干细胞白血病淋巴瘤综合症相关。
[0226] 在一个实施例中，本发明提供由核酸编码的致癌异构体或其表位的分离的多肽，所述核酸包括来源于编码FGFR1的核酸中选择性缺失了外显子7和8的一段核苷酸。在一个实施例中，当与FGFR1原癌基因比对时，外显子7和8的选择性缺失导致105个氨基酸的缺失。因此，在一个实施例中，所述多肽包含或包括SEQ NO:10序列，或与其基本一致的序列。在另一方面，所述多肽包括由SEQ NO:9核酸序列编码的序列，或与其基本一致的序列。
[0227] 在另一实施例中，所述表位包含或包括与FGFR1L的Ig-Ⅱ和Ig-Ⅲ之间的接合区，或其片段一致的氨基酸序列，或由SEQ ID NO:9的核苷酸序列或其片段编码的氨基酸序列，或与上述序列基本一致的氨基酸或核苷酸序列。
[0228] RON受体酪氨酸激酶
[0229] 巨噬细胞刺激1受体(c-met相关酪氨酸激酶)(RON)在本领域被称为MST1R,PTK8,CD136和CDwl36。RON为巨噬细胞刺激蛋白（MSP）受体并具有酪氨酸蛋白激酶活性。其参与上皮组织，骨和神经内分泌衍生物的发展。已经公布了人RON的核苷酸和蛋白质序列，例如Ronsin C.等人，Oncogene8:1195-1202(1993);和Collesi C.等人,Mol.Cell.Biol.16:5518-5526(1996)。已经公布了小鼠RON的核苷酸和蛋白质序列，例如Iwama A.等人，Blood83:3160-3169(1994)；Waltz S.E.等人，Oncogene16:27-42(1998)；
和Persons D.A.等人，Nat.Genet.23:159-165(1999)。人RON未加工前体长度为约1400个氨基酸并且分子量为约152227Da。小鼠RON未加工前体长度为约1378个氨基酸并且分子量为约150538Da。
和Persons D.A.等人，Nat.Genet.23:159-165(1999)。人RON未加工前体长度为约1400个氨基酸并且分子量为约152227Da。小鼠RON未加工前体长度为约1378个氨基酸并且分子量为约150538Da。
[0230] 在一个实施例中，本发明提供由核酸编码的致癌异构体或其表位的分离的多肽，所述核酸包括来源于编码RON受体酪氨酸激酶的核酸中选择性缺失了外显子5和6的一段核苷酸。在一个实施例中，当与RON受体酪氨酸激酶原癌基因比对时，外显子5和6的选择性缺失导致胞外域中109个氨基酸的框架内缺失。在一个实施例中，所述多肽包含或包括外显子4和7融合和并置产生的多肽序列。因此，在一个实施例中，所述多肽组成或包括SEQ NOs:12序列，或与其基本一致的序列。在另一个实施例中，所述多肽组成或包括由SEQ NO:11核酸序列编码的序列，或与其基本一致的序列。
[0231] 在其它实施例中，所述表位包含或包括，与异构体RON△160的外显子4和外显子7之间的接合区(SEQ ID NO:12)一致的氨基酸序列或其片段，或由SEQ ID NO:11核苷酸序列编码的氨基酸序列或其片段，或与上述序列基本一致的氨基酸或核苷酸序列。
[0232] KIT受体酪氨酸激酶
[0233] v-kit Hardy-Zuckerman4猫肉瘤病毒癌基因同源物（KIT）在本领域也被为PBT、SCFR、C-Kit和CDl17。KIT编码原癌基c-kit的人同源物。KIT为MGF（肥大细胞生长因子，也被称为干细胞因子）3型跨膜受体。
[0234] 公 布 了 人KIT 的 核 苷 酸 和 蛋 白 质 序 列，例 如Yarden 等 人，EMBO J.6:3341-3351(1987)和Giebel等人，Oncogene7:2207-2217(1992)。公布了小鼠KIT的核苷酸和蛋白质序列，例如Qiu等人，EMBO J.7:1003-1011(1988)和Rossi等人，Dev.Biol.152:203-207(1992)。人KIT未加工前体长度约976个氨基酸并且分子量约107360Da。小鼠KIT未加工前体长度约10725个氨基酸，并且分子量为150538Da。
[0235] KIT突变与胃肠道间质肿瘤，肥大细胞疾病，急性骨髓性白血病，和斑驳病相关。
[0236] 在一个实施例中，本发明提供由核酸编码的致癌异构体或其表位片段的分离的多肽，所述核酸包括由编码KIT受体酪氨酸激酶的核酸中选择性缺失了外显子11的产生的一段核苷酸。因此，在一个实施例中，所述多肽包含或包括SEQ NO:14序列或与其基本一致的序列。在另一实施例中，所述多肽包含或包括由SEQ NO:13的核酸序列编码的序列，或与其基本一致的序列。
[0237] 在另一实施例中，所述表位包含或包括与SEQ ID NO:14的外显子10和12之间的KIT接合区相同的氨基酸序列或其片段，或由SEQ ID NO:13的核苷酸序列编码的氨基酸序列或其片段，或与上述序列基本一致的氨基酸或核苷酸序列。
[0238] PDGF
[0239] 血小板衍生生长因子α多肽(PDGFA)在本领域也被称为PDGF1和PDGF-A。PDGFA为血小板衍生生长因子家族的一个成员。PDGFA为间叶细胞来源的细胞的有丝分裂因子并且具有八个半胱氨酸修饰的特征。
[0240] 公布了人PDGFA的核苷酸和蛋白质序列，例如Bonthron等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85:1492-1496(1988)和Betsholtz等人，Nature320:695-699(1986)。公布了小鼠PDGFA的核苷酸和蛋白质序列，例如Rorsman等人，Growth Factors6:303-313(1992)和Mercola等人，Dev.Biol.138:114-122(1990)。人PDGFA未加工前体长度约211个氨基酸并且分子量约23210Da。小鼠PDGFA未加工前体长度约211个氨基酸，并且分子量为23210Da。
[0242] 在一个实施例中，本发明提供由核酸编码的致癌异构体或其表位片段的分离的多肽，所述核酸包括来源于编码PDGF的核酸中框架内选择性缺失了外显子6的一段核苷酸。因此，在一个实施例中，所述多肽包含或包括SEQ NO:16序列或与其基本一致的序列。在另一实施例中，所述多肽包含或包括由SEQ NO:15的核酸序列编码的序列或与其基本一致的序列。
[0243] 在另一实施例中，所述表位包含或包括与SEQ ID NO:16的外显子5和7之间的PDGF接合区一致的氨基酸序列或其片段，或由SEQ ID NO:15的核苷酸序列编码的氨基酸序列或其片段，或与上述序列基本一致的氨基酸或核苷酸序列。
[0244] PDGFR-α
[0245] 血小板衍生生长因子受体，α多肽(PDGFA)在本领域也被称为CD140A、PDGFR2、[0246] MGC74795和Rhe-PDGFRA。PDGFA为血小板衍生生长因子家族成员编码了细胞表面酪氨酸激酶受体。这些生长因子为间叶细胞来源的细胞的有丝分裂原。
[0247] 公布了人PDGFA的核苷酸和蛋白质序列，例如Bonthron等人，Pwc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85:1492-1496(1988)和Betsholtz等人，Nature320:695-699(1986)。公布了小鼠PDGFA的核苷酸和蛋白质序列，例如Stiles等人，Mol.Cell.Biol.10:6781-6784(1990)和Carninci等人，Science309:1559-1563(2005)。人PDGFA未加工前体长度约1089个氨基酸并且分子量约119790Da。小鼠PDGFA未加工前体长度约1089个氨基酸，并且分子量为119790Da。
[0248] 由于中间染色体缺失，PDGFRA和FIP1L1的融合(FIP1LI-PDGFRA)是高嗜酸性粒细胞综合症(HES)的一些病例的原因。HES为罕见的血液系统疾病，其具有在骨髓中嗜酸性粒细胞持续增高，嗜酸性粒细胞增多，组织浸润和器官损害的特征。
[0249] 在一个实施例中，本发明提供由核酸编码的致癌异构体或其表位的分离的多肽，所述核酸包括来源于编码PDGFα的核酸中选择性缺失了外显子7和8（例如374-456位的氨基酸）的一段核苷酸。因此，在一个实施例中，所述多肽包含或包括SEQ NO:18序列或与其基本一致的序列。在另一实施例中，所述多肽包含或包括由SEQ NO:17核酸序列编码的序列或与其基本一致的序列。
[0250] 在另一实施例中，所述表位包含或包括与SEQ ID NO:18的外显子6和9之间的PDGFα接合区一致的氨基酸序列或其片段，或由SEQ ID NO:17核苷酸序列编码的氨基酸序列或其片段，或与上述序列基本一致的氨基酸或核苷酸序列。
[0251] 选择性地，致癌异构体或其表位的分离的多肽可能由与在此提供的致癌异构体或其表位片段的核酸基本一致的核酸编码。同样地，致癌异构体或其表位的分离的多肽可能与在此提供的致癌异构体或其表位基本一致。
[0252] 一种制备致癌异构体或其表位片段的方法
[0253] 多肽致癌异构体或其表位片段可从自然资源中分离，或可能为化学合成过程的产物，或可以从原核或真核寄主通过重组技术产生。
[0254] 本发明也提供制备致癌异构体或其表位片段的方法，所述方法包括在容许致癌异构体或其表位片段表达的情况下培养寄主细胞；以及分离致癌异构体或其表位片段，从而制备致癌异构体或其表位片段。在一个实施例中，本发明提供一种制备人致癌异构体或其表位片段的方法。用上述方法制备多肽的过程对本领域技术人员来说是众所周知的。
[0255] 异构体特异性抑制剂
[0256] 本发明至少部分地提供，异构体特异性抑制剂（例如抗体分子，可溶性受体多肽及其融合形式，肽及其功能变体，和核酸抑制剂），所述异构体特异性抑制剂抑制和/或降低异构体的一种或多种活性，或与一条或多条异构体多肽或其片段，或编码一条或多条异构体多肽或其片段的核酸相互反应或更优选地特异性结合。在一个实施例中，所述异构体特异性抑制剂为异构体结合分子，例如抗体分子，或核酸抑制剂。在另一实施例中，所述异构体特异性抑制剂为可溶性受体多肽及其融合形式，或肽及其功能性变体。在一些实施例中，所述异构体结合分子特异性结合至致癌异构体多肽或其片段，或编码一种或多种致癌异构体多肽或其片段的核酸。
[0257] 典型的异构体特异性抑制剂（例如异构体结合分子）以高亲和力，例如以至少约7 -1 8 -1 9 -1 10 -1
10M ，典型地约10M ，和更典型地约10M 至10 M 或更强的亲和力常数结合至一条或多条异构体多肽或其片段，并降低和/或抑制异构体，例如高度增生（例如癌或恶性）细胞和/或组织中的致癌异构体的一种或多种活性。例如，异构体特异性抑制剂可选择性和特异性降低或抑制选自一下中的一种或多种致癌异构体相关活性：（i）结合配体或共受体（例如，FGF配体，（例如FGF8b，FGF2，FGF17或FGF18）结合至FGFR2异构体Ⅲc）；（ii）受体二聚化（例如，FGFR2异构体Ⅲc同源二聚化或FGFR2异构体Ⅲc与其它受体或受体异构体异源二聚化）；（iii）异构体信号转导，例如，FGFR2异构体Ⅲc信号转导；（iv）高度增生（例如癌或肿瘤）细胞增殖，生长和/或存活，例如，通过诱导高度增生细胞凋亡；和/或（v）肿瘤的血管生成和/或血管形成。
10M ，典型地约10M ，和更典型地约10M 至10 M 或更强的亲和力常数结合至一条或多条异构体多肽或其片段，并降低和/或抑制异构体，例如高度增生（例如癌或恶性）细胞和/或组织中的致癌异构体的一种或多种活性。例如，异构体特异性抑制剂可选择性和特异性降低或抑制选自一下中的一种或多种致癌异构体相关活性：（i）结合配体或共受体（例如，FGF配体，（例如FGF8b，FGF2，FGF17或FGF18）结合至FGFR2异构体Ⅲc）；（ii）受体二聚化（例如，FGFR2异构体Ⅲc同源二聚化或FGFR2异构体Ⅲc与其它受体或受体异构体异源二聚化）；（iii）异构体信号转导，例如，FGFR2异构体Ⅲc信号转导；（iv）高度增生（例如癌或肿瘤）细胞增殖，生长和/或存活，例如，通过诱导高度增生细胞凋亡；和/或（v）肿瘤的血管生成和/或血管形成。
[0258] 在此使用的术语“特异性结合”是指结合反应，该结合反应由一类蛋白质和其它生物中存在的靶标（例如特异性多肽或核苷酸）决定。因此，“特异性结合”至致癌异构体的结合分子意为该化合物结合本发明的致癌异构体，但不结合至相同的原癌基因衍生的非致癌异构体。本领域技术人员会知道，取决于所用的条件，例如，所用的靶标蛋白浓度，盐和缓冲液，以及其它条件，所述异构体结合分子可在致癌和非致癌异构体之间展示不同程度的交叉反应性。在一些实施例中，术语“特异性结合”或“特异性结合的”是指异构体结合分子7 -1 8 -1 9 -1 10 -1
以高亲和力，例如以至少约10M ，典型地约10M ，和更典型地约10M 至10 M 或更强的亲和力常数结合至一条或多条异构体多肽或其片段，或编码一条或多条异构体多肽或其片段的核酸的性质；以及(2)以比结合至非致癌异构体的亲和力高至少2倍，50倍，100倍，
1000倍或更高的亲和力优选地结合至异构体。在一些实施例中，异构体结合分子优选结合至致癌异构体，但基本不结合至（例如，展示了与非致癌相对物低于0%，8%，5%，4%，3%，2%，1%的交叉反应性）其非致癌相对物。
以高亲和力，例如以至少约10M ，典型地约10M ，和更典型地约10M 至10 M 或更强的亲和力常数结合至一条或多条异构体多肽或其片段，或编码一条或多条异构体多肽或其片段的核酸的性质；以及(2)以比结合至非致癌异构体的亲和力高至少2倍，50倍，100倍，
1000倍或更高的亲和力优选地结合至异构体。在一些实施例中，异构体结合分子优选结合至致癌异构体，但基本不结合至（例如，展示了与非致癌相对物低于0%，8%，5%，4%，3%，2%，1%的交叉反应性）其非致癌相对物。
[0259] 抗体分子
[0260] 在一个实施例中，所述异构体结合分子为抗体分子，所述抗体分子结合至哺乳动物，例如，人，异构体多肽或其片段（例如Fab，F(ab')2，Fv，单链Fv片段，或骆驼变体）。例如，所述抗体分子结合至高度增生细胞，例如癌或肿瘤细胞，表达和/或相关的异构体多肽或片段。例如所述抗体分子特异性结合至表位，例如线性或构象表位，（例如在此描述的表位），所述表位位于或主要表达于高度增生细胞，例如癌或肿瘤细胞，的表面。在实施例中，由抗体分子识别的表位在高度增生疾病，例如癌症或恶性疾病中表达或与高度增生疾病，例如癌症或恶性疾病相关。例如，所述抗体分子识别的表位由外显子序列表达或与外显子序列相关，所述外显子序列主要在一种或多种癌或肿瘤细胞或疾病中表达或与一种或多种癌或肿瘤细胞或疾病相关；所述表位可能位于在一种或多种癌细胞或肿瘤细胞或疾病中显著结合在一起的两个外显子之间的接合区，例如：由于框架内外显子缺失或选择性剪接外显子的使用。异构体结合分子识别的，本发明的典型的异构体多肽或片段包括但不限于FGFR2，FGFR1，RON受体酪氨酸激酶，KIT受体酪氨酸激酶，PDGF和PDGF-受体α的致癌异构体。在一个实施例中，所述抗体分子结合的致癌异构体为人致癌异构体。在另一个实施例中，所述抗体分子结合的多肽异构体为表1列举的致癌异构体或其表位的多肽。
[0261] 在一个实施例中，所述抗体分子特异性结合至多肽，所述多肽包括SEQ ID NO:2，4，6，8，10，12，14，16，或18展示的氨基酸序列或与其基本一致的序列。在另一实施例中，所述抗体分子特异性结合至SEQ ID NO:2，4，6，或8的多肽FGFR2-Ⅲc异构体，但基本不结合至人FGFR2-Ⅲb的多肽异构体。在另一实施例中，所述抗体分子结合至，例如SEQ ID NO:19的人FGFR2多肽，但基本不结合至FGFR2-Ⅲb（例如，SEQ ID NO:21）或FGFR2的其它异构体（例如SEQ ID NOs:22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、52和/或53）。
[0262] 在另一实施例中，所述抗体分子特异性结合至FGFR1例如人FGFR1的异构体，例如，致癌异构体。例如，所述抗体分子特异性结合至异构体FGFR1L，所述异构体FGFR1L在外显子7和8之间缺失了约105个氨基酸，与FGFR1的部分免疫球蛋白域Ⅱ(Ig-Ⅱ)和部分Ig-Ⅲ对应，从而在Ⅱ和Ⅲ之间形成接合区。例如，抗体分子优选结合至FGFR1L或其片段，但基本不结合至（例如，展示了与FGFR1低于10%，8%，5%，4%，3%，2%，1%的交叉反应性）FGFR1（例如，非致癌人FGFR1，例如FGFR1异构体4(SEQ ID NO:39)，FGFR1异构体14(SEQ ID NO:40)，FGFR1异构体16(SEQ ID NO:41)，FGFR1异构体17(SEQ ID NO:42)，FGFR1异构体3(SEQ ID NO:43)，或FGFR1异构体18(SEQ ID NO:44)）。在这些实施例中，所述抗体分子特异性结合至SEQ ID NO:10的Ig-Ⅱ和Ig-Ⅲ之间的接合区上发现的至少一个表位或其片段，或由SEQ ID NO:9核苷酸序列编码的氨基酸序列或其片段，或与上述序列基本一致的氨基酸或核苷酸序列。
[0263] 在其它实施例中，所述抗体分子结合至异构体，例如，RON受体酪氨酸激酶，例如人RON受体酪氨酸激酶，的致癌异构体。例如所述抗体分子特异性结合至异构体RON△160，所述异构体RON△160框架内缺失了跳过RON的胞外域的外显子5和6的约109个氨基酸，从而在外显子4和7之间形成接合区。例如，所述抗体分子优选结合至RON△160或其片段，但基本不结合至（例如，展示了与RON受体酪氨酸激酶低于10%，8%，5%，4%，3%，2%，1%的交叉反应性）RON受体酪氨酸激酶（例如，非致癌人RON受体酪氨酸激酶，例如SEQ ID NO:45）。在这些实施例中，所述抗体分子特异性结合至SEQ ID NO:12的外显子4和外显子7之间的接合区上发现的至少一个表位或其片段，或由SEQ ID NO:11核苷酸序列编码的氨基酸序列或其片段，或与上述序列基本一致的氨基酸或核苷酸序列。
[0264] 在另一实施例中，所述抗体分子特异性结合至KIT受体酪氨酸激酶，例如人KIT受体酪氨酸激酶的异构体，例如，致癌异构体。例如，所述抗体分子特异性结合至KIT异构体，所述KIT异构体缺失了外显子11。例如，所述抗体分子优选结合至外显子11缺失的KIT异构体(SEQ ID NO:46)或其片段，但基本不结合（例如，展示了与KIT低于10%，8%，5%，4%，3%，2%，1%的交叉反应性）至KIT（例如，非致癌人KIT，例如，全长受体(SEQ ID NO:47)）。在这些实施例中，所述抗体分子特异性结合至SEQ ID NO:14的外显子10和外显子12之间的接合区上发现的至少一个表位或其片段，或由SEQ ID NO:13核苷酸序列编码的暗示序列或其片段，或与上述序列基本一致的氨基酸或核苷酸序列。
[0265] 在另一实施例中，所述抗体分子特异性结合至异构体，例如，PDGF，例如，人PDGF，的致癌异构体。例如所述抗体分子特异性结合至PDGF异构体，所述PDGF异构体框架内缺失了外显子6。例如，所述抗体分子优选结合至外显子6缺失的PDGF异构体或其片段，但基本不结合至（例如，展示了与PDGF低于10%，8%，5%，4%，3%，2%，1%的交叉反应性）PDGF（例如，非致癌人PDGF，例如,PDGF异构体1(SEQ ID NO:49)）。在这些实施例中，所述抗体分子特异性结合至SEQ ID NO:16的外显子5和7之间的接合区上发现的至少一个表位或其片段，或由SEQ ID NO:15的核苷酸序列编码的氨基酸序列或其片段，或与上述序列基本一致的氨基酸或核苷酸序列。
[0266] 在另一实施例中，所述抗体分子特异性结合至PDGF受体α，例如，人PDGF受体α，的异构体，例如，致癌异构体。例如所述抗体分子特异性结合至PDGFα异构体，所述PDGFα异构体框架内缺失了外显子7和8。例如，所述抗体分子优选结合至外显子7/8缺失的PDGFα异构体(SEQ ID NO:51)或其片段，但基本不结合（例如，展示了与PDGFα低于10%，8%，5%，4%，3%，2%，1%的交叉反应性）至PDGFα（例如，非致癌人PDGFα，例如,PDGFα异构体1(SEQ ID NO:50)）。在这些实施例中，所述抗体分子特异性结合至SEQ ID NO:18的外显子6和9之间的接合区上发现的至少一个表位或其片段，或由SEQ ID NO:17的核苷酸序列编码的氨基酸序列或其片段，或与上述序列基本一致的氨基酸或核苷酸序列。
[0267] 在此使用的术语“抗体分子”指的是包含至少一个免疫球可变区域序列的蛋白质。术语抗体分子包括，例如，全长，成熟抗体和抗体的结合抗原的片段。例如，所述抗体分子可包括重（H）链可变区序列（在此缩写为VH），和轻（L）链可变区序列（在此缩写为VL）。在另一实施例中，抗体分子包括两条重（H）链可变区序列和两条轻（L）链可变区序列，从而形成两个抗原结合位点，比如，Fab，Fab'，F(ab')2，Fc，Fd，Fd'，Fv，单链抗体（例如，scFv），可变区单域抗体，双价抗体(DAb)(二价或双特异性)，和嵌合（例如，人源化的）抗体，这些抗体可通过对整个抗体或用DNA重组技术重新合成的抗体制备。这些功能性抗体片段保持与其分别的抗原或受体选择性结合的能力。抗体和抗体片段可能来自于抗体的任何类型，包括但不限于IgG，IgA，IgM，IgD，和IgE，并且来自抗体的任何亚类（例如，IgG1，IgG2，IgG3，和IgG4）。本发明的抗体可以为单克隆的或多克隆的。所述抗体可以为人，人源化的，CDR-移植，或体外产生的抗体。该抗体可具有选自，例如IgG1，IgG2，IgG3，或IgG4的重链恒定区。
该抗体可得具有选自κ或λ的轻链。
该抗体可得具有选自κ或λ的轻链。
[0268] 抗体结合片段的例子包括：（ⅰ）Fab片段，单价片段包括VL，VH，CL和CH1区；（ⅱ）F(ab')2片段，二价片段，所述二价片段包括在铰链区通过二硫键连接的两条Fab片段；
（ⅲ）Fd片段，所述Fd片段包括VH和CHI区；（ⅳ）Fv片段，所述Fv片段由抗体的单臂的VL和VH区组成；（ⅴ）双体抗体（dAb）片段，所述双体抗体片段由VH区组合；（ⅵ）骆驼或骆驼化可变区；（ⅶ）单链Fv(scFv)，参见Bird等人，(1988)Science242:423-426和Huston等人，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:5879-5883)；（ⅷ）单域抗体。所述抗体片段用本领域技术人员所知的常用技术获得，并且所述片段以与完整的抗体相同的方式筛选以使用。
（ⅲ）Fd片段，所述Fd片段包括VH和CHI区；（ⅳ）Fv片段，所述Fv片段由抗体的单臂的VL和VH区组成；（ⅴ）双体抗体（dAb）片段，所述双体抗体片段由VH区组合；（ⅵ）骆驼或骆驼化可变区；（ⅶ）单链Fv(scFv)，参见Bird等人，(1988)Science242:423-426和Huston等人，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:5879-5883)；（ⅷ）单域抗体。所述抗体片段用本领域技术人员所知的常用技术获得，并且所述片段以与完整的抗体相同的方式筛选以使用。
[0269] 术语“抗体”包括完整的分子以及其功能性片段。抗体的恒定区可以改变，例如，突变，从而修饰抗体的性质（例如增加或减少：Fc受体结合，抗体糖基化，半胱氨酸残基的数量，效应细胞功能或补体功能中的一种或多种）
[0270] 本发明的抗体也可为单域抗体。单域抗体可包括其互补决定区为单域多肽的一部分的抗体。例子包括，但不限于，重链抗体，天然缺少轻链的抗体，由常规4链抗体衍生的单域抗体，基因工程抗体和单域支架，除了那些抗体衍生的单域抗体外。单域抗体可以为本领域任何抗体或未来的任何单域抗体。单域抗体可能由任何物种衍生，所述物种包括，但不限于，小鼠，人，骆驼，骆羊，鱼，鲨鱼，山羊，兔，牛。根据本发明的另一方面，单域抗体为自然生成的，被称为缺少轻链的重链抗体的单域抗体。例如，在WO9404678一文中公布了这些单域抗体。为了清晰的原因，从重链抗体中衍生，自然缺少轻链的所述可变区在此被称为VHH或纳米抗体以将其从四链免疫球蛋白常规VH区分开。这种VHH分子可能从在骆驼属物种，例如，在骆驼，骆羊，单峰骆驼，羊驼和骆马，产生的抗体中衍生。除了骆驼属的其它物种可制备自然缺少轻链的重链抗体；这些VHH也在本发明的范围内。
[0271] VH和VL区可再分为高可变区，被称为“互补决定区”，通过更加保守的，被称为“框架区”(FR)的区分散。框架区和CDRs的范围已经由许多方法精确确定（参见Kabat,E.A.,等人(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,Fifth Edition,U.S.Department of Health and Human Services,NIH PublicationNo.91-3242;Chothia,C.等人(1987)J.Mol.Biol.196:901-917），并且牛津分子的AbM抗体模型软件使用AbM定义，参见，一般地，例如，抗体基因工程实验手册（Antibody Engineering Lab Manual）中的抗体可变区的蛋白质序列和结合分析(Ed.:Duebel,S.和Kontermann,R.,Springer-Verlag,Heidelberg）。一般地，除非特别指出，使用以下定义：重链可变区的CDR1的AbM定义和其它CDRs的Kabat定义。此外，对Kabat或AbM CDRs的描述的本发明的具体实施例也可用Chothia高可变区环实施。每个VH和VL典型地包括三个CDR和四个FR，从氨基末端至羧基末端以下面的顺序排列：FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。
[0272] 在此使用的“免疫球蛋白可变区序列”指的是能形成免疫球蛋白可变区结构的氨基酸序列。例如，所述序列可能包括自然生成的可变区的氨基酸序列的全部或一部分。例如，所述序列可能或不可能包括一个，两个或多个N或C端氨基酸，或可能包括与蛋白质结构信息相容的其它改变。
[0273] 术语“抗原结合位点”指的是包含形成结合至异构体多肽的接触面的决定簇的抗体分子部分或其表位。相对于蛋白质（或蛋白质模拟物），抗原结合位点典型地包括一个或多个形成结合至异构体多肽的接触面的（至少四个氨基酸或氨基酸模拟物的）环。典型地，抗体分子的抗原结合位点包括至少一个或两个CDR或更典型地，至少三个，四个，五个或六个CDR。
[0274] 在此使用的术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”指的是单个分子组合物的抗体分子的制备。单克隆抗体组合物展示了单个结合特异性和对特定表位的亲和力。单克隆抗体可通过杂交瘤技术或通过不利用杂交瘤技术的方法（例如，重组方法）制备。
[0275] “有效的人”蛋白质是不会引起失效的抗体反应例如人抗鼠抗体(HAMA)反应的蛋白质。
[0276] HAMA在许多情况下是有问题的，例如如果抗体分子重复服用，例如，在治疗慢性或复发疾病病情中。由于血清中上升的的抗体清除率（参见，例如，Saleh等人，Cancer Immunol.Immunother.,32:180-190(1990)）同时也由于潜在的过敏性反应（参见，例如LoBuglio等人，Hybridoma,5:5117-5123(1986)），HAMA反应可使反复的抗体服用潜在地无效。
[0277] 所述抗异构体抗体可为多克隆或单克隆抗体。在其它实施例中，所述抗体可通过重组制备，例如通过噬菌体展示或通过组合方法制备。
[0278] 本领域已知用于产生抗体异构体抗体的噬菌体展示和组合方法（如在，例如，Ladner 等 人，U.S.Patent No.5,223,409；Kang 等 人，International Publication No.WO92/18619；Dower等人，International Publication No.WO91/17271；Winter等人，International Publication WO92/20791；Markland等人，International Publication No.WO92/15679；Breitling等人，International Publication WO93/01288；McCafferty等 人，International Publication No.WO92/01047；Garrard 等 人，International Publication No.WO92/09690；Ladner等人，International Publication No.WO90/02809；Fuchs 等 人，(1991)Bio/Technology9:1370-1372；Hay 等 人，(1992)Hum Antibod Hybridomas3:81-85；Huse等 人，(1989)Science246:1275-1281；Griffths等 人，(1993)EMBO J12:725-734；Hawkins等人，(1992)J Mol Biol226:889-896；Clackson等人，(1991)Nature352:624-628；Gram 等 人，(1992)PNAS89:3576-3580；Garrad 等 人，(1991)Bio/Technology9:1373-1377；Hoogenboom等人，(1991)Nuc Acid Res19:4133-4137；和Barbas等人，(1991)PNAS88:7978-7982，中所述，在此引用其全部内容作为参考）。
[0279] 在一个实施例中，所述抗异构体抗体为全人抗体（例如，在经过基因改造以产生人免疫球蛋白序列的抗体的小鼠内制备的抗体），或非人抗体，例如，啮齿目动物（小鼠或大鼠），山羊，灵长类动物（例如，猴子），骆驼抗体。优选地，非人抗体为啮齿目动物（小鼠或大鼠抗体）。本领域已知制备啮齿目动物抗体的方法。
[0280] 人单克隆抗体可由携带人免疫球蛋白基因而非小鼠系统的转基因鼠产生。来自这些转基因鼠的，用感兴趣的抗原免疫的脾细胞用于制备杂交瘤，所述杂交瘤分泌对来自人蛋白质的表位具有特别的亲和力的人mAbs（参见，例如，Wood等人的国际申请WO91/00906；Kucherlapati等人的PCT公布WO91/10741；Lonberg等人的国际申请WO92/03918；Kay等人的国际申请92/03917；Lonberg,N.等人，1994Nature368:856-859；Green,L.L.等人，
1994Nature Genet.7:13-21；Morrison,S.L.等人，1994Proc.Natl.Acad.Sci.USA[0281] 81:6851-6855；Bruggeman 等 人，1993Year Immunol7:33-40；Tuaillon 等 人，
1993PNAS90:3720-3724；Bruggeman等人，1991Eur J Immunol21:1323-1326）。
1994Nature Genet.7:13-21；Morrison,S.L.等人，1994Proc.Natl.Acad.Sci.USA[0281] 81:6851-6855；Bruggeman 等 人，1993Year Immunol7:33-40；Tuaillon 等 人，
1993PNAS90:3720-3724；Bruggeman等人，1991Eur J Immunol21:1323-1326）。
[0282] 抗异构体抗体可以为在该抗体中，其可变区或可变区的一部分例如CDR，在非人有机体，例如，大鼠或小鼠中产生的抗体。嵌合，CDR移植，和人源化抗体在本发明内。在非人有机体例如，大鼠或小鼠中产生，然后例如在可变区框架或恒定区修饰，从而降低人的抗原性的抗体在本发明内。
[0283] 嵌合抗体可通过本领域已知的重组DNA技术制备。例如，编码鼠（或其它物种）单克隆抗体分子Fc恒定区的基因用限制性酶消化从而移除编码鼠Fc的区，并且替换编码人Fc恒定区的该基因的对等部分（参见Robinson等人，国际专利公布PCT/US86/02269；Akira等人，欧洲专利申请184,187；Taniguchi,M.,欧洲专利申请171,496；Morrison等人，欧洲专利申请173,494；Neuberger等人，国际申请WO86/01533；Cabilly等人，美国专利号4,816,567；Cabilly等人，欧洲专利申请125,023；Better等人，(1988Science240:1041-1043)；Liu 等 人，(1987)PNAS84:3439-3443；Liu 等 人，1987,J.Immunol.139:3521-3526；Sun等人，(1987)PNAS84:214-218；Nishimura等人，1987,Cane.Res.47:999-1005；Wood 等 人，(1985)Nature314:446-449；和 Shaw等 人，1988,J.Natl Cancer Inst.80:1553-1559）。
[0284] 人源或CDR移植抗体具有至少一个或两个但一般地具有所有的三个以供体CDR替换的受体（免疫球蛋白重链和/或轻链的）CDR。所述抗体可能被非人CDR的至少一部分替换或仅仅一些CDR被非人CDR替换。只需要替换需要将人源化抗体结合至异构体的CDR的数量。优选地，供体为啮齿类动物抗体，例如，大鼠或小鼠抗体，并且，受体为人框架或人保守框架。典型地，提供CDR的免疫球蛋白称为“供体”，并且提供框架的免疫球蛋白称为“受体”。在一个实施例中，供体免疫球蛋白为非人（例如，啮齿类动物）。受体框架为自然生成的（例如，人）框架或保守框架，或与其约85%，或更高，优选90%，95%，99%或更一致的序列。
[0285] 在此使用的术语“保守序列”指的是在相关序列的家族中最频繁出现的氨基酸（或核苷酸）形成的序列（参见，例如Winnaker,From Genes to Clones(Verlagsgesellschaft,Weinheim,Germany1987)）。在蛋白质家族中，保守序列的每个位置由在该家族的该位置最频繁出现的氨基酸占据。如果两个氨基酸同样频繁出现，保守序列可包括任何一个。“保守序列”指的是在保守的免疫球蛋白序列中的框架区。
[0286] 抗体可通过本领域已知的方法人源化。人源化抗体可通过以人Fv可变区对等序列替换不直接参与抗原结合的Fv可变区序列。产生人源化抗体的一般方法由Morrison,S.L.,1985,Science229:1202-1207；Oi 等 人，1986,BioTechniques4:214 和 Queen 等 人，US5,585,089,US5,693,761and US5,693,762提供，在此引用其全部内容作为参考。这些方法包括分离，操纵和表达编码来自重链或轻链的至少一条的免疫球蛋白Fv可变区的全部或一部分的核酸序列。这些核酸的来源对本领域技术人员来说是已知的，并且，例如可从制备针对异构体的抗体的杂交瘤中获得。编码人源化抗体的重组DNA或其片段可克隆到合适的表达载体中。
[0287] 人源化或CDR移植抗体可通过CDR移植或CDR取代制备，其中免疫球蛋白链的一个，两个或所有的CDR可被替换。参见，美国专利5,225,539；Jones等人，
1986Nature321:552-525；Verhoeyan等 人，1988Science239:1534；Beidler等 人，1988J.Immunol.141:4053-4060；Winter US5,225,539，在此特意引用其全部内容作为参考。
Winter描述了CDR移植方法，所述CDR移植方法可用于制备本发明的人源化抗体（1987年
3月26日提交的英国专利申请GB2188638A，Winter US5,225,539），特意引用其内容作为参考。
1986Nature321:552-525；Verhoeyan等 人，1988Science239:1534；Beidler等 人，1988J.Immunol.141:4053-4060；Winter US5,225,539，在此特意引用其全部内容作为参考。
Winter描述了CDR移植方法，所述CDR移植方法可用于制备本发明的人源化抗体（1987年
3月26日提交的英国专利申请GB2188638A，Winter US5,225,539），特意引用其内容作为参考。
[0288] 取代、缺失或增加特异性氨基酸的人源化抗体同样在本发明的范围内。优选人源化抗体在框架区具有氨基酸取代，比如为了改善与抗原的结合。例如，人源化抗体具有与供体框架残基或除了受体框架残基外的另一个氨基酸一致的框架残基。为了产生这样的抗体，选定的少量的人源化免疫球蛋白链的受体框架残基可被相应的供体氨基酸替换。优选的取代位置包括靠近CDR或能与CDR相互反应的氨基酸残基（参见，例如US5,585,089）。从供体中选择氨基酸的标准在US5,585,089，例如US5,585,089的第12-16列，例如US5,585,08的第12-16列，在此引用其内容作为参考。在Padlan等人公开于1992年12月
23日的EP519596Al中描述人源化抗体的其它技术。
23日的EP519596Al中描述人源化抗体的其它技术。
[0289] 在一个实施例中，抗体可通过用纯抗异构体抗原，或其片段或表位，例如在此描述的片段，与抗原，组织相关的膜免疫制备，例如，天然组织制备，整个细胞，优选活细胞，裂解细胞或细胞分裂，例如膜分裂。
[0290] 所述抗异构体抗体可以为单链抗体。单链抗体(scFV)可以改造（参见，例如Colcher,D.等人，(1999)Ann N Y Acad Sci880:263-80和Reiter,Y.(1996)Clin Cancer Res2:245-52）。所述单链抗体可以二聚化或多聚化从而产生对相同靶异构体蛋白质的不同表位具有特异性的多价抗体。
[0291] 在其它实施例中，所述抗体分子具有重链恒定区，所述重链恒定区选自，例如IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgM，IgA1，IgA2，IgD，和IgE的重链恒定区，特别地，选自，例如，所述（例如，人）IgG1，IgG2，IgG3，和IgG4的重链可变区。在另一实施例中，所述抗体分子具有轻链恒定区，所述轻链恒定区选自，例如，所述（例如，人）κ和λ轻链恒定区。恒定区可以改变，例如，突变，从而修饰抗体的性质（例如，从而增加或减少Fc受体结合，抗体糖基化，半胱氨酸残基数量，效应细胞功能，和/或补体功能中的一个或多个）。在一个实施例中，所述抗体具有：效应因子功能，并能固定补体。在其它实施例中，所述抗体没有补偿效应细胞或固定补体。在另一实施例中，所述抗体具有减小的或没有能力结合至Fc受体。例如，同种型或异构体，片段或其它突变体不支持结合至Fc受体，例如，其具有诱变的或缺失的Fc受体结合区。
[0292] 本领域已知改变抗体恒定区的方法。带有改变的功能，例如，对效应因子配体，比如细胞上的FcR，或配体的Cl组合物，的改变的亲和力的抗体可通过以不同的残基替换在所述抗体的恒定区的至少一个氨基酸残基制备（参见，例如EP388,151Al，美国专利号5,624,821和美国专利号5,648,260，在此引用其全部内容作为参考），可以描述相同类型的改变，如果所述改变实施在鼠或其它物种上，免疫球蛋白将降低或消除这些功能。
[0293] 异构体特异性抑制剂（例如，异构体结合分子）可衍生或连接至另一功能分子（例如另一多肽或蛋白质）。在此使用的“衍生的”抗体分子为已经修饰的抗体分子。衍生方法包括但不限于荧光基团，放射性核苷酸，毒素，酶或亲和配体比如生物素的增加。因此，本发明的抗体分子包括在此描述的抗体的衍生的或其它修饰形式，包括免疫黏附分子。例如，抗体分子可（通过化学耦合，基因融合，非共价结合或其它）功能性连接至一个或多个其它分子实体，例如另一个抗体（例如，双特异性抗体或双体抗体），可检测的试剂，细胞毒素剂，药物试剂，和/或能调节抗体或抗体部分与其它分子的结合的蛋白质或多肽（比如链霉亲和素核心区或多组氨酸标记）。
[0294] 通过两个或多个（相同类型或不同类型的，例如，为了产生双特异性抗体）抗体交联制备一种类型的衍生抗体分子。合适的交联剂包括异型双功能或同型双功能（例如，双琥珀酰亚胺辛二酸酯）的交联，该异型双功能的交联具有两个不同的，由合适的空间分开的反应基团（例如m马来酰亚胺苯甲酸-N-琥珀酰亚胺酯）。这些交联剂可在Pierce Chemical Company,Rockford,Ⅲ中找到。
[0295] 具有本发明的抗体分子的有用的可检测试剂可以衍生（或标记）从而含有荧光化合物，各种酶，辅基，发光材料，生物发光材料，发出荧光金属原子，例如，铕（Eu），和其它镧系元素和放射性材料（如下文所述）。典型的荧光可检测试剂包括荧光素，异硫氰酸荧光素，罗丹明，5-二甲胺基-1-萘磺酰氯，藻红蛋白等等。抗体也可用可检测的酶衍生，例如碱性磷酸酶，辣根过氧化物酶，β半乳糖苷酶，乙酰胆碱酯酶，葡萄糖氧化酶等等。当抗体用可检测的酶衍生时，其通过添加所述酶用于制备可检测的反应产品的另外的试剂检测。例如当存在可检测的试剂辣根过氧化物酶，过氧化氢和二氨基联苯胺的添加产生显色反应产物，该显色反应产物是可检测的。抗体分子也可用辅基（例如链霉亲和素/生物素和亲和素/生物素）衍生。例如，抗体可通过生物素衍生并通过对亲和素或链霉亲和素结合的间接测量检测。合适的荧光材料的例子包括伞形酮，荧光素，异硫氰酸荧光素，罗丹明，二氯三嗪氨基荧光素（dichlorotriazinylamine fluorescein），丹酰氯或藻红蛋白；发光材料的例如包括鲁米诺，并且生物荧光材料的例子包括萤光素酶，虫荧光素和发光蛋白质。
[0296] 被标记的抗体分子可例如，在许多情况下诊断性和/或实验地用于，，包括（ⅰ）通过标准技术比如亲和层析或免疫沉淀分离预定抗原；（ⅱ）为了评估蛋白质表达的充分性和方式，检测预定抗原；（例如，细胞裂解产物或细胞上清液中）（ⅲ）监测组织中的蛋白质水平作为临床试验过程的一部分，例如，确定给定的治疗方案的功效。
[0297] 抗异构体抗体分子可结合至其它分子实体，典型地，标签或治疗的（例如，细胞毒素的或细胞抑制的）试剂或基团。
[0298] 放射性同位素可用于诊断或治疗应用。可结合至抗PSMA的放射性同位素包括，但131
不限于α，β，或γ发射体，或β和γ发射体。这些放射性同位素包括，但不限于碘( I或
125 90 177 225 211 186 212 213 111
I)、钇( Y)、镥( Lu)、锕( Ac)、镨，砹( At)、铼( Re)、铋( Bi or Bi)、铟( In)、
99 32 188 35 14 3 51 36 57
锝( mTc)、磷( P)、铑( Rh)、硫( S)、碳( C)、氚(H)、铬( Cr)、氯( C1)、钴( Co或
58 90 177
Co)、铁(Fe)、硒(Se)、镓(Ga)。用作治疗剂的放射性同位素包括钇( Y)、镥( Lu)、锕
225 211 186 212 213 188
( Ac)、镨，砹( At)、铼( Re)、铋( Bi or Bi)和铑( Rh)。用作标记，例如用于诊断，
131 125 111 99 32 14 3
的放射性同位素包括，碘( I或 I)、铟( In)、锝( mTc)、磷( P)、碳( C)，和氚(H)，或上述列举的一种或多种治疗同位素。
不限于α，β，或γ发射体，或β和γ发射体。这些放射性同位素包括，但不限于碘( I或
125 90 177 225 211 186 212 213 111
I)、钇( Y)、镥( Lu)、锕( Ac)、镨，砹( At)、铼( Re)、铋( Bi or Bi)、铟( In)、
99 32 188 35 14 3 51 36 57
锝( mTc)、磷( P)、铑( Rh)、硫( S)、碳( C)、氚(H)、铬( Cr)、氯( C1)、钴( Co或
58 90 177
Co)、铁(Fe)、硒(Se)、镓(Ga)。用作治疗剂的放射性同位素包括钇( Y)、镥( Lu)、锕
225 211 186 212 213 188
( Ac)、镨，砹( At)、铼( Re)、铋( Bi or Bi)和铑( Rh)。用作标记，例如用于诊断，
131 125 111 99 32 14 3
的放射性同位素包括，碘( I或 I)、铟( In)、锝( mTc)、磷( P)、碳( C)，和氚(H)，或上述列举的一种或多种治疗同位素。
[0299] 本发明提供放射性标记的抗体分子以及其标记的方法。在一个实施例中，公开了标记抗体分子的方法。所述方法包括以螯合剂接触抗体分子从而制备共轭抗体。所述共轭111 90 177
抗体用放射性同位素，例如， 铟、钇和 镥，放射性标记，从而制备标记的抗体分子。
抗体用放射性同位素，例如， 铟、钇和 镥，放射性标记，从而制备标记的抗体分子。
[0300] 所上文所述，该抗体分子结合至治疗剂。治疗活性放射性同位素已经提及。其它治疗剂的例子包括紫杉醇、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、吐根碱、丝裂霉素、足叶乙甙（etoposide）、替尼泊苷（tenoposide）、长春新碱、长春碱、秋水仙碱、链霉素、柔红霉素、二羟基炭疽菌素二酮、米托蒽醌、光辉霉素、放线菌素D、去氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔(propranolol)、嘌呤霉素，美登木素，例如美登醇（参见美国专利号5,208,020），CC-1065（参见美国专利号5,475,092，5,585,499，5,846,545）及其类似物或同源物。治疗剂包括，但不限于，抗代谢物（例如，甲氨喋呤，6-巯基嘌呤，6-巯鸟嘌呤，阿糖胞苷，5-氟尿嘧啶氮烯咪胺（5-fluorouracil decarbazine）），烷基化剂（例如，氮芥，thioepa苯丁酸氮芥，CC-1065，美法仑，卡氮芥（bsnu）、和洛莫司汀（CCNU），环磷酰胺，白消安，二溴甘露醇，链脲佐菌素，丝裂霉素C，和顺氯氨铂（DDP）顺铂），蒽环类（例如，柔红霉素（原名道诺霉素）和链霉素），抗生素（例如，更生霉素（原名放线菌素），博莱霉素（bleomycin），光辉霉素（mithramycin），和氨茴霉素（AMC）），和抗有丝分裂试剂（例如，长春新碱，长春碱，紫杉醇和美登木素）。
[0301] 本发明的共轭物可用于修饰给定的生物反应。治疗剂不是解释为限于典型的化学治疗剂。例如，所述治疗剂可为具有想要的生物活性的蛋白质或多肽。这些蛋白质包括，例如，毒素，比如相思豆毒素、蓖麻毒素A、假单胞菌外毒素、白喉毒素、或其成分（例如假单胞菌外毒素的成分为PE38）；蛋白质，比如肿瘤坏死因子、干扰素、神经生长因子、血小板衍生生长因子、组织纤维蛋白溶解原激活剂，或生物反应修饰剂，例如，淋巴因子，白介素1("IL-1")，白介素2("IL-2")，白介素6("IL-6")，粒细胞—巨噬细胞集落刺激因子("GM-CSF")，粒细胞集落刺激因子("G-CSF")，或其它生长因子。简单地，所述治疗剂可以为病毒颗粒，例如重组病毒颗粒，所述病毒颗粒（例如通过化学接头）与本发明的抗异构体抗体结合或融合。
[0302] 在一方面，本发明的特征为一种提供靶标结合分子的方法，所述分子特异性结合至异构体受体。例如，所述靶标结合分子为抗体分子。所述方法包括：提供包括非人蛋白的至少一部分的靶标蛋白，该一部分与人靶标蛋白的对应部分（与其至少70，75，80，85，87，90，92，94，95，96，97，98%一致）同源，但有至少一个氨基酸（例如至少一个，两个，三个，四个，五个，六个，七个，八个或九个氨基酸）的区别；获得特异性结合至抗原的抗体分子；并评估结合试剂在调节靶标蛋白的活性方面的功效。所述方法可进一步包括使人实验对象服用所述结合试剂（例如，抗体分子）或衍生物（例如人源的抗体分子）。
[0303] 本发明提供编码上述抗体分子的分离的核酸分子，载体，及其寄主细胞。所述核酸分子包括但不限于RNA，基因组DNA和cDNA。
[0304] 可溶性受体及其融合物
[0305] 在其它实施例中，所述异构体特异性抑制剂为异构体受体蛋白的全长或片段，例如，异构体受体多肽的抑制性配体结合区。例如，所述异构体特异性抑制剂可为FGFR2异构体Ⅲc受体的可溶形式（例如，包含配体（例如，FGF）结合区的哺乳动物（例如，人）FGFR2异构体Ⅲc受体的可溶形式）。例如异构体特异性抑制剂可包括人FGFR2异构体Ⅲc受体约1-262位的氨基酸（图13C，SEQ ID NO:55，1-262位的氨基酸，包括信号序列）；或与其基本一致的序列。选择性地，所述异构体特异性抑制剂可包括由人FGFR2异构体Ⅲc约1至786位的核苷酸的核苷酸序列（图13B，SEQ ID NO:54的1-786核苷酸）编码的氨基酸，或与其基本一致的氨基酸。
[0306] 在此使用的“FGFR2异构体Ⅲc受体的可溶形式”或“异构体受体多肽的可溶形式”为受体异构体，例如，不能使自身锚定于膜上的FGFR2异构体Ⅲc受体多肽。这些可溶性多肽包括，例如，在此描述的异构体受体多肽，例如FGFR2异构体Ⅲc受体多肽，其锚定多肽的跨膜区缺失了足够的部分，或被修饰使得跨膜区没有功能的。典型地，可溶性异构体受体多肽保持结合至异构体配体，例如FGF配体，的能力。例如，FGFR2异构体Ⅲc受体多肽的可溶性片段（例如，包含人FGFR2异构体Ⅲc受体的胞外域的FGFR2异构体Ⅲc受体的片段，包括人FGFR2异构体Ⅲc受体约1至262位的氨基酸（图13C，SEQ ID NO:55的1-262位的氨基酸，包括信号序列），或与其基本一致的氨基酸序列。可溶性FGFR2异构体Ⅲc受体多肽可另外包括，例如，融合至，第二基团，例如多肽（例如，免疫球蛋白链，GST，Lex-A或MBP多肽序列）。例如，融合蛋白质可包括FGFR2异构体Ⅲc受体多肽的至少一段，其能结合FGF配体，融合至第二基团，例如，多肽（例如，免疫球蛋白链、Fc片段、各种同种型，包括，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgAl、IgA2、IgD和IgE的重链恒定区）。
[0307] 异构体受体多肽的可溶形式可单独使用或（通过化学耦合，基因或多肽融合，非共价结合或其它）功能性连接至第二基团，例如免疫球蛋白Fc区，血清蛋白，聚乙二醇，GST，Lex-A或MBP多肽序列。在此使用的“融合蛋白”指的是包含两个或多个可操纵结合的，例如，连接的，基团，例如蛋白质基团的蛋白质。典型地，所述基团共价结合。所述基团可通过间隙或接头直接结合或连接。
[0308] 融合蛋白可另外包括将第一基团例如可溶性异构体受体，接合至第二基团的接头序列。例如，所述融合蛋白可包括肽接头，例如，长度约为4至20个，更优选地，5至10个氨基酸的肽接头，所述肽接头长度为8个氨基酸。肽接头中每个氨基酸选自甘氨酸、丝氨酸、天冬酰胺、苏氨酸和丙氨酸。所述肽接头包括甘氨酸-丝氨酸元件。在其它实施例中，所述融合蛋白包括肽接头，并且所述肽接头包括具有具有(丝氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸)y分子式的序列，其中y为1，2，3，4，5，6，7，或8(SEQ ID NOs:73-80)。
[0309] 例如，异构体受体多肽的可溶形式可与各种同种型的重链恒定区融合，所述同种型包括IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgM，IgAl，IgA2，IgD，和IgE。例如，融合蛋白可包括人FGFR2异构体Ⅲc受体的胞外域（或与其同源的序列），和，例如融合至人免疫球蛋白Fc链，例如人IgG（例如，人IgG1或人IgG2，或其突变形式）。Fc序列可在一个或多个氨酸上突变从而增强或降低效应细胞功能，Fc受体结合和/或补体活性。例如，所述恒定区在SEQ ID NO:55的296(M至Y)，298(S至T)，300(T至E)，477(H至K)和478(N至F)位突变从而改变Fc受体结合。图13C(SEQ ID NO:55)展示了包含人FGFR2异构体Ⅲc受体的约1至262位的氨基酸（图13C，SEQ ID NO:55的1-262位氨基酸）的一个典型的融合蛋白通过精氨酸-丝氨酸接头融合至人IgG1Fc。
[0310] 在其它实施例中，另外的氨基酸序列可增加至融合蛋白的N或C端从而有利于表达，检测和/或分离或纯化。例如，融合蛋白可连接至一个或多个另外的基团，例如GST，His6标签，(His-His-His-His-His-His;SEQ ID NO:81)，FLAG标签。例如，融合蛋白可另外连接至GST融合蛋白，其中所述融合蛋白序列融合至GST（即，谷胱甘肽S转移酶）序列的C端。这些融合蛋白可有利于受体融合蛋白的纯化。
[0311] 在一个实施例中，所述融合蛋白在其N端包含异源信号序列（例如，由受体核酸编码，在多肽中不存在的多肽序列）。例如，受体本身的信号序列可移除并用来自另一蛋白质的信号序列替换。在一些寄主细胞（例如哺乳动物寄主细胞）中，通过使用异源信号序列可增加受体的表达和/或分泌。
[0312] 本发明的嵌合或融合蛋白可通过标准的DNA重组技术制备。例如，编码不同多肽序列的DNA片段根据常规技术在框架内结合在一起，例如，通过使用平末端和粘末端连接，限制性酶消化从而提供合适的末端，填补为合适的粘性末端，碱性磷酸酶处理从而避免不想要的连接，以及酶促连接。在另一实施例中，所述融合基因可通过常规技术合成，所述常规技术包括自动的DNA合成仪。可选地，使用锚定引物在两条连续的基因片段之间产生互补突出，随后所述两条连续的基因片段退火并再扩增，从而产生嵌合基因序列，实现基因片段的PCR扩增（参见，例如。Ausube等人(eds.)Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,1992）。此外，在商业上可获得许多能编码融合基团（例如，免疫球蛋白重链的Fc区）的表达载体。编码受体的核酸可克隆到这种表达载体，使得融合基团在框架内连接至免疫球蛋白。
[0313] 在一些实施例中，受体融合多肽作为寡聚体存在，例如二聚体或三聚体。
[0314] 在其它实施例中，该受体多肽基团为变异的受体多肽，所述变异的受体多肽在自然生成的受体序列（野生型）上突变，导致更高的（相对于非突变序列），使所述受体多肽结合至相应的配体的亲和力。
[0315] 在其它实施例中，附加氨基酸序列可增加至融合蛋白的N或C端从而有利于表达，空间的灵活性，检测和/或分离或纯化。该第二条多肽优选可溶的。在一些实施例中，第二条多肽提高连接的多肽的半衰期（例如，血清的半衰期）。在一些实施例中，所述第二条多肽包含有利于融合多肽与第二多肽结合的序列。在实施例中，所述第二条多肽包含免疫球蛋白多肽的至少一部分。免疫球蛋白融合多肽在本领域中是已知的，并在，例如，美国专利号5,516,964、5,225,538、5,428,130、5,514,582、5,714,147、和5,455,165中描述。例如，受体的可溶形式可融合至各种同种型的重链恒定区，所述同种型包括IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgM，IgAl，IgA2，IgD，和IgE。典型地，所述融合蛋白可包括人受体的胞外域（或与其同源的序列），并，例如融合至，人免疫球蛋白Fc链，例如，人IgG（例如，人IgG1或人IgG2，或其突变形式）。
[0316] Fc序列可在一个或多个氨基酸上突变从而降低效应细胞功能，Fc受体结合和/或补体活性。改变抗体恒定区的方法在本领域是已知的。带有改变的功能例如，针对效应配体，比如细胞上的FcR，或补体的Cl组合物的改变的亲和力的抗体，可通过以不同的残基替换所述抗体的恒定部分的至少一个氨基酸残基制备（参见，例如EP388,151Al，美国专利号5,624,821和美国专利号5,648,260）。可以描述相同类型的改变，如果所述改变实施在鼠或其它物种上，免疫球蛋白将增加或减小这些功能。例如，通过在其侧链以具有合适的功能的残基替换特定的残基，或通过引入带电荷的功能团，比如谷氨酸或天冬氨酸，或芳香族非极性残基，比如苯丙氨酸，酪氨酸，色氨酸或丙氨酸可以改变抗体的Fc区与FcR（例如，FcγRI）或Clq结合的亲和性（参见，例如美国专利号5,624,821）。
[0317] 在实施例中，第二条多肽具有比野生型免疫球蛋白重链的Fc区的效应功能更少的效应功能。Fc效应功能包括，例如，Fc受体结合，补体固定和T细胞消耗活性（参见，例如，美国专利号6,136,310）。分析T细胞消耗活性，Fc效应功能和抗体稳定性的方法在本领域是已知的。在一个实施例中，所述第二条多肽对Fc受体具有低亲和力或不具有可检测的亲和力。在一个可选的实施例中，所述第二条多肽对补体蛋白Clq具有低亲和力或不具有可检测的亲和力。在其它实施例中，所述第二条多肽具有增加的效应细胞功能，例如，增加结合至Fc受体（例如，FcyRI，FcyRIIA，FcyRIIB，FcyRIIIA和FcRn受体），如在，例如Shields等人，(JBC,276:6591-6604,2001)和美国专利号6,737,056中所述。
[0318] 应该理解的是，在此描述的所述抗体分子和可溶性受体或融合蛋白（例如，通过化学耦合，基因融合，非共价连接或其它）可功能性连接至一个或多个其它分子实体，例如抗体（例如，双特异性或多特异性抗体），毒素，放射性同位素，细胞毒素剂或细胞抑制剂等。
[0319] 肽或其功能性变体
[0320] 在另一实施例中，所述异构体特异性抑制剂包括肽或其功能性变体（例如，功能性类似物或其衍生物）。
[0321] 在此使用的肽“类似物”指的是其氨基酸序列与除了所述肽的氨基酸序列相同,可以有高于10，典型地高于8，高于6，高于5，高于4，高于3，高于2，或高于1个氨基酸的插入，缺失和/或替换。典型地，类似物如所述肽一样结合至相同的生物受体，并展示了所述肽的至少一些生物活性。所述肽可能衍生或连接至另一功能分子（例如，另一多肽或蛋白质，例如载体蛋白）和/或通过增加荧光基团，放射性核苷酸，毒素，酶，聚乙二醇（PEG），或亲和配体比如生物素。
[0322] 在此使用的术语“载体蛋白”为蛋白质或肽，所述蛋白质或肽能够改善蛋白质的抗体的生产，所述蛋白质为与载体蛋白相关的蛋白质和/或可用于检测与载体蛋白相关的蛋白质的蛋白质。为了免疫的目的，许多不同的载体蛋白大部可用于与肽耦合。选择使用哪种载体应该基于免疫原性，可溶性，是否可实现与载体的适当结合并且使用筛选试验以使抗体识别靶标蛋白。两种最常用的载体为血蓝蛋白（KLH）和牛血清白蛋白(BSA)。其它两种包括分泌型碱性磷酸酶(SEAP)，辣根过氧化物酶，荧光素酶，β-半乳糖苷酶，IgG Fc(γ链)，谷胱甘肽转移酶(GST)，含多聚组氨酸的标签和其它酶，如β-内酰胺酶，其它分泌型蛋白质或多肽。
[0323] 本发明的修饰的肽，结合物或化合物包括共价连接至肽或蛋白质的活性基团。选择能与血清蛋白或多肽形成稳定的共价键的活性基团，例如，通过与一种或多种氨基基团，羟基基团，或硫基基团在血清蛋白或多肽上反应的反应基团。典型地，反应基团与一种氨基基团，羟基基团，或硫基基团在血清蛋白或多肽上反应。典型地，反应基团与特定的氨基基团，羟基基团，或硫基基团在血清蛋白或多肽上反应。本发明的结合物包括修饰的肽，所述肽共价通过反应基团与氨基基团，羟基基团，或硫基基团在血清蛋白或肽上的反应连接至血清蛋白或肽。因此，本发明的结合物包括修饰的肽，在所述肽中，所述反应基团的残基与血清蛋白或肽形成共价键。在此使用的“反应基团的残基”或“反应基团残基”指的是由反应基团和其它基团，例如肽或血中存在的蛋白质，之间的共价键形成产生的化学结构。在本发明的修饰的肽，结合物或化合物的实施例中，反应基团为马来酰亚胺，该马来酰亚胺包含选自γ马来酰亚胺丁酸胺(GMBA)，马来酰亚胺丙酸（MPA），N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，N-羟基硫代琥珀酰亚胺(sulfo-NHS)，马来酰亚胺基苯甲酸琥珀酰亚胺酯(MBS)和γ马来酰亚胺丁酸琥珀酰亚胺酯(GMBS)。
[0324] 本发明的肽包括肽接头基团，所述肽可能通过肽标准的固相或液相化学方法合成。Stewart 和 Young(1963)Solid Phase Peptide Synthesis，W.H.Freeman Co.(San Francisco), 和 Meienhofer(1973)Hormonal Proteins and Peptides,Academic Press(New York)中可发现固相技术摘要。经典的液相合成参见Schroder和Lupke，The Peptides,Vol.1,Academic Press(New York)。
[0325] 一般地，这些方法包括连续性增加一个或多个氨基酸或合适的被保护的氨基酸为增长链。通常，第一个氨基酸的氨基或羧基通过合适的保护基团保护。被保护的氨基连接至惰性固体支架或通过在序列中增加下一个氨基酸在溶液中使用，所述序列具有合适保护的并在一定条件下适合形成肽键的互补（氨基或羧基）基团。然后保护基团从新增加的氨基酸残基移除并且增加下一个氨基酸(合适保护的)，以此进行。在所有想要的氨基酸连接成合适的序列后，任何保留的保护基团（和任何固体支架）相继或同时移除从而提供最终的肽。通过对该一般程序简单修饰，可能每次增加多于一个氨基酸至增长链，例如，通过将被保护的三肽（在不使手性中心消旋的情况下）连接至合适的被保护的二肽，从而在去保护后形成五肽。
[0326] 在某些实施例中，本发明的肽类通过用作前体药物的氨基和羧基保护基团来合成。保护基团是保护肽类上的反应基团以免发生不理想的反应的化学部分。在一个实施例中，本发明的修饰肽通过一个或多个保护基团来合成，所述保护基团用于在体内分裂，以此在实验对象服用肽类之后使修饰肽的反应基或基团暴露于血清蛋白。
[0327] 术语“氨基-保护基”指用于保护氨基酸或肽类的氨基末端，或保护氨基酸或肽类的氨基以免发生不理想的反应。在Greene(1981)Protective Groups in Organic Synthesis(John Wiley&Sons,New York)中公开了一般使用的氨基-保护基团，该文章的内容在此参考引入。此外，例如通过酶水解，可使用在体内容易分裂的保护基团，以此暴露氨基用于在体内和血清蛋白发生反应。
[0328] 术语“羰基保护基”指用于阻止或防止羧酸功能性的羧酸保护酯或酰胺基。在Greene的"Protective Groups in Organic Synthesis"pp.152-186(1981)中公开了羰基保护基团，该文章的内容在此参考引入。此外，羰基保护基可用作药物前体，因此，羰基保护基可在体内例如通过酶水解而容易地分裂，以此暴露羰基，以在体内和血清蛋白发生反应。本领域的技术人员非常熟悉这种羰基保护基团，这些羰基保护基团广泛地用于青霉素和头孢菌素领域中羰基团的保护，如美国专利3,840,556和3,719,667中所述，该专利的内容在此参考引入。
[0329] 本发明的优选的羰基保护肽类是其中的保护羰基为低级烷基，环烷基或芳基烷基酯的肽类，例如：甲酯，乙酯，丙酯，异丙酯，丁酯，仲丁基酯，异丁酯，正戊酯，异戊酯，辛酯，环己基酯和苯乙基酯或酰基氧烷基，环酰基烷氧基，芳酰基氧烷基或芳基烷基羰基烷氧基酯。优选的酰胺羧基保护基团为低级烷基氨基羰基基团。例如，天冬氨酸在C-末端上通过酸不稳定基团（例如，叔丁基）来得到保护，并在β-C-末端通过加氢不稳定基团（例如：苯甲基）来得到保护，随后在合成中去保护。
[0330] 在某些实施例中，肽类或肽类的功能性变异体由氨基酸序列构成，或包括氨基酸序列，所述氨基酸序列位于两个外显子之间的接合区，该外显子主要在一种或多种癌细胞或肿瘤细胞或疾病表达或有关的蛋白异构体中结合在一起，例如，由于框架内外显子缺失或选择性剪切外显子的使用。在某些实施例中，肽类或肽类的功能性变异体由氨基酸序列构成，或包括氨基酸序列，所述氨基酸序列位于两个外显子之间的接合区，该外显子主要在一种或多种癌细胞或肿瘤细胞或疾病表达或有关的蛋白异构体中结合在一起，例如，由于框架内外显子缺失或选择性剪切外显子的使用。在一个实施例中，肽类或肽类的功能性变异体由氨基酸序列构成，或包括氨基酸序列，所述氨基酸序列达到或少于60种氨基酸（例如，达到或少于50，40，30，20，10的氨基酸），并等于外显子III的选择性剪切形式，例如，来自FGFR2-IIIc约301-360氨基酸(SEQ ID NO:2)，FGFR2-IIIc约314-324氨基酸(AAGVNTTDKEI,SEQ ID NO:4)，FGFR2-IIIC约328-337氨基酸(YIRNVTFEDA,SEQ ID NO:6)，FGFR2-IIIc约350-353氨基酸(ISFH,SEQ ID NO:8)；FGFR2-IIIc约314-353氨基酸(AAGVNTTDKEIEVLYIRNVTFEDAGEYTCLAGNSIGISFH_(SEQ ID NO:84))，或FGFR2-IIIc约氨基酸TCLAGNS IGIS FH(SEQ ID NO:86)，或由SEQ ID NOs1,3,5,7,83或85的核苷酸序列编码的氨基酸序列，或大致与其相等的氨基酸或核苷酸序列。在另一个实施例中，肽类或肽类的功能性变异体由氨基酸序列构成，或包括氨基酸序列，所述氨基酸达到或少于60种氨基酸（例如，达到或少于50,40,30,20,10的氨基酸），且等于FGFRIL(SEQ ID NO:10)或其片段的Ig-II和Ig-III之间的接合区域，或由SEQ ID NO:9或其片段的核苷酸序列编码的氨基酸序列；或大致与其相等的氨基酸或核苷酸序列。在另一个实施例中，多肽类或其功能性变异体由氨基酸序列构成，或包括氨基酸序列，所述氨基酸序列达到或少于60种氨基酸（例如，达到或少于50,40,30,20,10种氨基酸），并等同于异构体RONA160或其片段的外显子4和外显子7之间的接合区域，或由SEQ ID NO:11或其片段的核苷酸序列编码的氨基酸序列，或大致与其相等的氨基酸或核苷酸序列。在另一个实施例中，肽类或其功能性变异体由氨基酸序列构成，或包括氨基酸序列，所述氨基酸序列达到或少于60种氨基酸（例如，达到或少于50,40,30,20,10种氨基酸），并等同于SEQ ID NO:14或其片段的外显子10和12之间的KIT的接合区域，或由SEQ ID NO:13或其片段的核苷酸序列编码的氨基酸序列，或大致与其相等的氨基酸或核苷酸序列。在另一个实施例中，肽类或其功能性变异体由氨基酸序列构成，或包括氨基酸序列，所述氨基酸序列达到或少于60种氨基酸（例如，达到或少于50,40,30,20,10种氨基酸），并等同于SEQ ID NO:16或其片段的外显子5和7之间的PDGF的接合区域，或由SEQ ID NO:15或其片段的核苷酸序列编码的氨基酸序列，或大致与其相等的氨基酸或核苷酸序列。在另一个实施例中，肽类或其功能性变异体由氨基酸序列构成，或包括氨基酸序列，所述氨基酸序列达到或少于60种氨基酸（例如，达到或少于50,40,30,20,10种氨基酸）。并等同于SEQ ID NO:18或其片段的外显子6和9之间的PDGFR–α接合区域，或由SEQ ID NO:17或其片段的核苷酸序列编码的氨基酸序列，或大致与其相等的氨基酸或核苷酸序列。
[0331] 肽类或其功能性变异体可例如使用固相合成技术来重新组合或合成，该异构体-特异性抑制剂可包括至少一种或选择性地，两种或以上的上述肽类或其变异体。例如，可选择地通过连接序列，设置两种或以上的肽类或肽类变异体的任意结合。该肽类可功能性地与一种或以上的其它分子实体，例如：载体（例如：免疫球蛋白Fc区，血清白蛋白，聚乙二醇，GST，Lex-A或MBP多肽序列）连接（例如，通过化学结合，基因融合，非共价结合或其它方面），以增强体内的肽类稳定性。肽类可选择性地通过例如，加入化学保护基团来增加体内的肽类稳定性。
[0332] 聚乙二醇
[0333] 用于增加制药蛋白的半衰期和/或降低致免疫性所广泛使用的技术包括加入合适的药理学可接受聚合物，例如，聚（乙二醇）（PEG）或其衍生物（例如，甲氧基聚（乙二醇）或mPEG）。一般来说，可使用任何聚乙二醇的合适形式，例如，在抗体分子领域适合用的聚乙二醇；关于此的文献有Chapman的Nat.Biotechnol.,54,531-545(2002);Veronese和Harris 的 Adv.Drug Deliv.Rev.54,453-456(2003),Harris 和 Chess 的 Nat.Rev.Drug.Discov.,2,(2003)以及WO04/060965。聚乙二醇蛋白的不同试剂同样可商业获得，例如，从Nektar Therapeutics,USA处获得。
[0334] 优 选 地，尤 其 通 过 半 胱 氨 酸 残 基（例 如：Yang et al.,Protein Engineering,16,10,761-770(2003)）可使用定点聚乙二醇。例如，为此，PEG可连接到在异构体特异性抑制剂中自然存在的半胱氨酸残基，该抑制剂可经过修饰而合适地引入一个或更多的半胱氨酸残基来与PEG连接，或者包括一个或更多半胱氨酸残基来与PEG接合的氨基酸序列可融合到本发明抑制剂的N-和/或C-末端，这些都是使用本领域技术人员熟悉的技术来实现的。
[0335] 优选地，对于异构体特异性抑制剂，使用分子量大于5000，例如大于10,000小于200,000,如小于100,000；例如在20,000-80,000范围内的PEG。
[0336] 对于聚乙二醇，要注意，一般情况下，本发明同样包括任何的在一个或更多的氨基酸位置上加入聚乙二醇的SDAM分子，优选地，其方式使得聚乙二醇(1)增加体内的半衰期；或（2）减少致免疫性；或（3）或提供一个或更多的另外的聚乙二醇本身所熟悉的有利特点；
（4）并没实质性地影响SDAB分子的亲和性（例如，没有减少90%的所述亲和性，优选地没有减少大于50%，且没有减少大于10%，如合适的文章所确定，例如以下实施例所述的）；或（4）没有影响异构体-特异性抑制剂的任何其它理想性质。合适的PEG-基团和连接它们的方法，无论是特定的或者是非特定的，对于本领域技术人员来说都是熟悉的。
（4）并没实质性地影响SDAB分子的亲和性（例如，没有减少90%的所述亲和性，优选地没有减少大于50%，且没有减少大于10%，如合适的文章所确定，例如以下实施例所述的）；或（4）没有影响异构体-特异性抑制剂的任何其它理想性质。合适的PEG-基团和连接它们的方法，无论是特定的或者是非特定的，对于本领域技术人员来说都是熟悉的。
[0337] 用于这种聚乙二醇的合适的套件和试剂可例如从Nektar(CA,USA)处获得。此外，一般次优选的修饰包括N-连接或O-连接糖基化，一般作为共翻译和/或翻译后修饰，取决于用于表达异构体特异性抑制剂的宿主细胞。
[0338] 核酸结合分子
[0339] 在另一个实施例中，异构体-特异性抑制剂（例如：异构体-结合分子）抑制核酸编码异构体的表达，例如：致癌异构体（例如，在此所述的致癌异构体）。这种异构体-结合分子的实施例包括核酸分子，例如，反义分子，核酶，RNAi，杂交成核酸编码异构体，例如：致癌异构体的三重螺旋分子，或转录调节区域，并阻止或减少异构体，例如：致癌异构体的mRNA表达。在一个实施例中，可抑制致癌异构体表达的核酸结合分子为反义寡核苷酸，该反义寡核苷酸可专门杂交成至瘤异构体。
[0340] 在本领域中应该理解反义化合物的序列不需要100%补充其目标核酸，以专门杂交成该序列。当化合物与目标DNA或RNA序列结合干预了正常功能的目标DNA或RNA时，反义化合物专门杂交成目标DNA或RNA序列。这种干预应该引起效用的损失，且需要有足够的补充程度以避免在需要特定结合的情况下，反义化合物与非目标序列的非专门结合，该情况即为体内化验或治疗处理条件下，以及体外化验的情况下，处于进行化验的情况下的生理条件。
[0341] 可专门杂交成致癌异构体的反义寡核苷酸序列可通过常规实验鉴定。在一个实施例中，该反义寡核苷酸序列能专门地杂交成在此提供的核酸序列，例如：选自SEQ ID NOs：2,4,6,8,10,12,14,16和18的序列编码多肽。在另一个实施例中，反义寡核苷酸序列能专门杂交成核酸，所述核酸包括SEQ ID NO:1,3,5,7,9,11,13,15或17的序列。
[0342] 在另一个实施例中，可抑制致癌异构体表达的化合物为RNAi构建。在一个实施例中的RNAi构建能专门杂交成在此所述的核酸序列，例如，选自包括SEQ ID NOs:2,4,6,8,10,12,14,16,和18或大致与其相等的序列编码多肽。
[0343] 该反义寡核苷酸和RNA构建可用于专门抑制致癌多肽异构体的表达，而不会抑制从同样原癌基因而来的非致癌多肽异构体。用这种技术，可研究每个致癌多肽异构体的特定功能。此外，翻译寡核苷酸和RNAi构建可用于疾病治疗。
[0344] 该反义寡核苷酸为相对短的核酸，该相对短的核酸补充编码特定蛋白质的mRNA的编码链（正义链）。虽然反义寡核苷酸通常为RNA基，它们仍可为DNA基。此外，反义寡核苷酸通常经过修饰以增加它们的稳定性。例如，见Antisense Technology in Methods in Enzymology,Vols.313-314,ed.by Phillips,Abelson and Simon,Academic Press,1999。
[0345] 该寡核苷酸可为DNA或RNA，或它们的嵌合混合物或衍生物，或它们的修饰版，单链或双链。该寡核苷酸可在碱部分，糖部分，或磷酸盐骨架进行修饰，例如，提高其稳定性，杂交性等。该寡核苷酸可包括其它的附加基团，例如，肽类（例如用于目标宿主细胞受体），或有助于在细胞膜上传输的试剂（请见，例如：Letsinger et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.86:6553-56(1989);Lemaitre et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.84:648-52(1987);International Patent Publication No.WO88/09810），或血脑障壁（请见，例如：International Patent Publication No.WO89/10134），杂交-触发分裂试剂(请见，例如：Krol et al.,BioTechniques6:958-76(1988))或插入试剂,(请见,例如：Zon,Pharm.Res.5:539-49(1988))。因此，该寡核苷酸可与其它分子偶联。反义寡核苷酸可同样包含中性类似肽的骨架。这种分子称为肽核酸（PNA）-低聚体，并如Perry-O'Keefe et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.93:14670(1996)and in Eglom et al.,Nature365:566(1993)中所述。
[0346] 本发明的寡核苷酸可通过本领域熟悉的标准方法来合成，例如，通过使用自动DNA合 成 仪（例 如 可 从Biosearch Technologies,Inc.(Novato,Calif.)，Applied Biosystems(Foster City,Calif.)和其它地方商用获得）。例如，硫代磷酸寡核苷酸可通过Stein et al.(Nucl.Acids Res.16:3209(1988))的方法来合成，而甲基膦酸寡核苷酸可通过使用控制孔隙的玻璃聚合物支撑(Sarin et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85:7448-51(1988))）来制备。
[0347] 基于上述的说明，合适寡核苷酸的选择可轻易地通过本领域技术人员进行。对于给定的编码特定蛋白质的核酸，本领域的技术人员可设计结合该蛋白的反义寡核苷酸，并测试这些寡核苷酸，并在体内或活体系统内测试这些寡核苷酸，以确定它们结合并调停编码特定蛋白质的mRNA的降解。为了设计专门结合并调停特定蛋白质降解的反义寡核苷酸，由寡核苷酸确认的序列可对于该特定蛋白是唯一或大致唯一的。例如，对于专门确认并降解特定信息的寡核苷酸的设计，在蛋白质上频繁重复的序列可并非理想的选择。本领域的技术人员可设计一种寡核苷酸，并将该寡核苷酸的序列与核酸序列进行比较，以确定该序列为对于特定蛋白是特定的，或大致特定的，该核酸序列置于公众可获得的数据库。
[0348] 目前发展了许多将反义DNA或RNA传输至细胞的许多方法，例如，反义分子可直接注入组织位置，或将用于目标理想细胞（例如，与肽类或抗体连接的反义分子，该肽类或抗体特定地与在目标分子表面上表达的受体或抗原结合）的修饰反义分子给实验对象全身服用。请见，例如：Antisense Technology in Methods in Enzymology,Vols.313-314,ed.by Phillips,Abelson和Simon,Academic Press,1999。
[0349] RNAi构建包括可专门阻止目标基因表达的双链RNA，“RNA干扰”或“RNAi”术语最初用于在植物和蠕虫中所观察到的现象，其中双链-RNA(dsRNA)以特定且后-转录的方式阻止基因表达。在没有受到任何特定理论限制的情况下，RNAi似乎包括mRNA降解；然而，其生物化学机理成为实验的活跃领域。
[0350] 如此所述，术语“dsRNA”指siRNA分子，或其它包括双链特性，并可处理成为细胞内siRNA的RNA分子，例如：发夹RNA部分。
[0351] 如此所述，术语“RNAi构建”为整个说明书中的基因术语，其包括干扰RNAs(siRNAs)，发夹RNAs和其它RNA种类，这些RNA种类可在体内分裂，以形成siRNAs。
RNAi构建在此同样包括表达载体（还指RNAi表达载体），该表达载体能引起形成细胞内dsRNAs或发夹RNAs的转录，和/或产生活体内siRNAs的转录。
RNAi构建在此同样包括表达载体（还指RNAi表达载体），该表达载体能引起形成细胞内dsRNAs或发夹RNAs的转录，和/或产生活体内siRNAs的转录。
[0352] “RNAi表达载体”（dsRNA-编码质体）（同样称为“dsRNA-编码”质体）指用于表达（转录）RNA的可复制的核酸构建，该RNAi表达载体在构建表达的细胞内产生siRNA部分。这种载体包括由以下（1）（2）和（3）装配的转录单元，（1）遗传成分，该遗传成分在基因表达上具有调控作用，例如，激活子，操纵子，或增强子，并有效地与（2）“编码”序列连接，该“编码”序列经过转录产生双-链RNA（两个RNA部分在细胞内退火以形成siRNA，或单个发夹RNA，该发夹RNA可加工成siRNA），以及（3）合适转录起始和终止序列。
[0353] 激活子和其它调控成分的选择一般根据宿主细胞而变化。一般来说，重组DNA技术效用的表达载体一般为“质体”形式，其指圆形双链DNA环，它们的载体形式并非限于染色体。在本发明的说明书中，“质体”和“载体”可交换地使用，因为质体是载体的最常用形式。然而，本发明的目的在于包括表达载体的这种其它形式，所述其它形式用作等效功能，并在此之后为本领域所熟悉的。化学修饰RNA分子的方法可适用于修饰RNAi构建(请见,例如,Heidenreich et al.,Nucleic Acids Res.25:776-80(1997);Wilson et al.,J.Mol.Recog.7:89-98(1994);Chen et al,Nucleic Acids Res.23:2661-68(1995);Hirschbein et al,Antisense Nucleic Acid Drug Dev.7:55-61(1997))。作为说明，RNAi构建的骨架可用硫代磷酸，磷酰胺酯，二硫代磷酸酯，嵌合的甲基膦酸酯-磷化物-脂，肽核酸，包括低聚体或糖修饰的-5-丙炔基-嘧啶（例如，2'-取代的核糖核苷，a-构型）。
[0354] 该双-链结构可通过单个自补RNA链或两个互补RNA链来形成。RNA双工形成可在细胞内或细胞外引发。该RNA可以一定数量引入，这使得每个细胞配送至少一个复制。当更低的剂量对于特定的应用来说同样有用，双链材料的更多剂量（例如：每个细胞至少有
5,10,100,500或1000个复制）可产生更有效的抑制。抑制为序列特定的，因为对应于RNA双工区的核苷酸序列将基因抑制作为目标。
5,10,100,500或1000个复制）可产生更有效的抑制。抑制为序列特定的，因为对应于RNA双工区的核苷酸序列将基因抑制作为目标。
[0355] 该siRNA分子可用本领域技术人员熟悉的多种技术来获得。例如，可通过本领域熟悉的技术来化学合成，或重组产生。例如，短的正义和反义RNA低聚体可进行合成和退火以形成在每端悬挂的2-核苷酸的双链RNA结构(Caplen et al,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,98:9742-47(2001);Elbashir et al.,EMBO J.,20:6877-88(2001))Elbashir et al.,EMBO J.,20:6877-88(2001))。这些双链siRNA结构可通过下述被动吸收或配送系统的选择可随后直接引入细胞。
[0356] 本发明同样提供了一种抑制细胞内的在此提供的致癌异构体的方法，该方法包括用能抑制致癌异构体表达的化合物来接触细胞。致癌异构体表达的抑制可有用于癌症的预防和/或治疗。FGFR2-IIIc致癌异构体表达的抑制可用于预防和/或治疗激素难治性前列腺癌，乳腺癌，膀胱癌，甲状腺癌或其它形式的癌症。FGFR1L表达的抑制可用于预防和/或治疗胰腺癌，前列腺癌，或其它形式的癌症。RON受体酪氨酸激酶Δ160异构体表达的抑制可用于预防和/或治疗转移性直肠癌，乳腺癌，卵巢癌，肺癌，膀胱癌，或其它形式的癌症。KIT受体酪氨酸激酶致癌异构体表达的抑制可用于防止和/或治疗胃肠道间质瘤（GISTs）或其它形式的癌症.PDGFR-a异构体可用于防止和/或治疗脑癌，胶质母细胞瘤，前列腺癌，骨转移，GIST，或其它形式的癌症。
[0357] 在一个实施例中，该方法在体外进行。在另一个实施例中，该方法在体内进行。这些方法可在与致癌异构体表达有关的研究，诊断和治疗方面使用。在研究中，可使用这些方法来，例如：来说明本发明致癌异构体的作用机理。
[0358] 制药组合物和套件
[0359] 在另一方面，本发明提供了一种组合物，例如，药学上可接受的组合物，该组合物包括在此所述的异构体-特定抑制剂，与药学上可接受的载体一起配制。如此所述，“药学上可接受的载体”包括任何以及所有的溶剂，分散介质，等渗和吸收延迟剂，等。它们为生理可兼容，该载体适用于静脉，肌肉，皮下，肠胃外，直肠或表皮给药（例如：通过注射或滴注）。
[0360] 本发明的组合物可为不同的形式。包括，例如：液体，半固体和固体制剂形式，（例如：可注射和难溶溶液），分散剂或悬浮液，脂质体和栓剂。其优选的形式取决于所需要服用的模式和治疗中的应用。典型的优选组合物为可注射或难溶溶液。给药的优选模式为肠胃外给药（例如，静脉，皮下，腹膜内，肌肉）。在一个优选的实施例中，抗体通过滴注或注射来给药。在另一个优选的实施例中，该抗体通过肌肉或皮下注射来给药。
[0361] 在此所述的术语“肠胃外给药”和“肠胃外地服用”指服用的模式，而不是一般通过注射的肠胃和局部给药，且非限制性地包括：静脉，肌肉，动脉，鞘内，囊内，框内，心脏内，腹膜内，经气管，皮下，表皮下，关节内，囊下，蛛网膜下，脊柱内，硬脑膜外和胸骨内注射和滴注。
[0362] 治疗组合物一般应为消毒，且在生产和存储条件下稳定。该组合物可配制成溶液，微乳液，分散剂，脂质体，或其他适用于高抗体浓度的有序结构。无菌可注射溶液可通过并入所需数量的溶于上述列举的一种成分或多种成分结合的合适溶剂中的活性化合物（即：抗体或抗体部分）来制得。根据需要，接着进行过滤消毒。一般来说，分散剂通过将活性化合物并入消毒载体制得，该消毒载体包括基本的分散介质和上述列举的其它所需成分。在制备消毒的可注射溶液的消毒粉末情况下，制备的优选方法为真空干燥和冷冻干燥，其产生了活性成分粉末加上其它的理想的来自前述的其消毒-过滤溶液，可以通过，例如：使用如卵磷脂的涂层，如果是分散剂则通过保持所需的颗粒尺寸，并通过使用表面活性剂来保持溶液的合适流动性。可注射组合物的持续吸收可通过组合物中包括延迟吸收的试剂来实现，该延迟吸收的试剂例如为：单硬脂酸盐和动物胶。
[0363] 本发明的异构体-特异性抑制剂可通过本领域的不同方法进行给药，尽管在许多治疗的领域中，给药的优选途径/模式为注射或滴注。例如，抗体分子通过以小于10mg/2
min，优选地小于或等于5mg/min的速度进行静脉注射，以达到约1-100mg/m，优选为约
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5-50mg/m，约7-25mg/m，更优选为10mg/m。如本领域技术人员所理解的，给药的途径和/或方式随着理想的效果而变化。在某些实施例中，活性化合物可与保护该化合物免受快速释放的载体一起制备，该载体例如为控制释放的配方，包括：埋填剂，经皮贴剂，和装入微胶囊的配送系统。可使用生物可分解的，生物相容的聚合物，例如，乙烯醋酸乙烯酯，聚酐类，聚乙醇酸，胶原，多正酯类，和聚乳酸。有许多关于制备这种配方的方法出现或为本领域技术人员所熟悉。见：例如:Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems,J.R.Robinson,ed.,Marcel Dekker,Inc.,New York,1978。
min，优选地小于或等于5mg/min的速度进行静脉注射，以达到约1-100mg/m，优选为约
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5-50mg/m，约7-25mg/m，更优选为10mg/m。如本领域技术人员所理解的，给药的途径和/或方式随着理想的效果而变化。在某些实施例中，活性化合物可与保护该化合物免受快速释放的载体一起制备，该载体例如为控制释放的配方，包括：埋填剂，经皮贴剂，和装入微胶囊的配送系统。可使用生物可分解的，生物相容的聚合物，例如，乙烯醋酸乙烯酯，聚酐类，聚乙醇酸，胶原，多正酯类，和聚乳酸。有许多关于制备这种配方的方法出现或为本领域技术人员所熟悉。见：例如:Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems,J.R.Robinson,ed.,Marcel Dekker,Inc.,New York,1978。
[0364] 在某些实施例中，本发明特异性抑制剂异构体可口服，例如，用惰性稀释剂或可吸收的可食用载体。该化合物（需要时，和其它成分）可同样包入硬的或软壳胶囊内，压缩成为药片，或直接并入实验对象的日常饮食中。对于口服治疗，该化合物可连同赋形剂一起使用，并以可吸收的药片，口含药片，糖锭，胶囊，万能药，悬浮液，糖浆，薄片等形式来使用。除了通过用肠胃外给药的方式来服用本发明的化合物，可涂上防止该化合物失活的材料，或与该化合物一起服用。治疗组合物可同样用本领域熟悉的医疗装置来服用。
[0365] 可调整给药方案来提供优化的理想效果（例如，治疗效果）。例如，可服用单个大药丸，随着时间服用几个分开的剂量，或按照治疗情况的急切需要来按比例减少或增加剂量。为了服用的简便以及剂量的统一，以剂量单元的形式来配制肠胃外组合物是十分有利的。
在此使用的剂量单元指物理分散的单元，该物理分散的单元适用于当作有待治疗的对象的单元剂量。每个单元包括预定量的活性化合物，该活性化合物的数量可连同所需的制药载体产生理想的治疗效果。本发明的剂量单元形式说明可由或直接取决于(a)活性化合物的独特特点和所要达到的特定治疗效果，以及(b)本领域中研制这种用于治疗个体灵敏性的活性化合物的固有限制。
在此使用的剂量单元指物理分散的单元，该物理分散的单元适用于当作有待治疗的对象的单元剂量。每个单元包括预定量的活性化合物，该活性化合物的数量可连同所需的制药载体产生理想的治疗效果。本发明的剂量单元形式说明可由或直接取决于(a)活性化合物的独特特点和所要达到的特定治疗效果，以及(b)本领域中研制这种用于治疗个体灵敏性的活性化合物的固有限制。
[0366] 在一个实施例中，用于治疗或预防的有效量的抗体或抗体部分的非限制范围是0.1-20mg/kg，更优选为1-10mg/kg，异构体-特异性抑制剂通过小于10mg/min，更优选为小
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于或等于5mg/min的速度进行静脉注射，以达到约1至100mg/m 的剂量，优选为约5-50mg/
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m，约7-25mg/m，更优选为约10mg/m。要注意，剂量可随着要减轻的状况的类型和严重程度而改变。对于任何特定的对象，要更进一步地理解特定剂量体系可随着个体需要和组合物给药或管理给药的人员的专业判断来随着时间进行调整。而在此所述的剂量范围仅仅为示例，并非用于限制所要保护的组合物的范围或应用。
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于或等于5mg/min的速度进行静脉注射，以达到约1至100mg/m 的剂量，优选为约5-50mg/
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m，约7-25mg/m，更优选为约10mg/m。要注意，剂量可随着要减轻的状况的类型和严重程度而改变。对于任何特定的对象，要更进一步地理解特定剂量体系可随着个体需要和组合物给药或管理给药的人员的专业判断来随着时间进行调整。而在此所述的剂量范围仅仅为示例，并非用于限制所要保护的组合物的范围或应用。
[0367] 本发明的制药组合物可包括“治疗有效量”或“预防有效量”的抗体或抗体部分。“治疗有效量”指在必要的时间周期内获得理想的治疗结果的有效剂量。修饰的抗体或抗体片段的治疗有效量可根据例如，个体的疾病状态，年龄，性别，和体重，以及抗体或抗体部分在个体中探出理想效果的能力而改变。治疗有效量同样为治疗有利效果超过修饰的抗体或抗体片段中任何的毒性或有害效果时的治疗有效量。相对于未治疗的对象，“治疗有效量”优选地抑制了可测量的参数，例如，肿瘤的生长速度抑制至少约20%，更优选为至少约40%，更优选为至少约60%，且更优选为至少80%。化合物抑制可测量参数，例如：癌症的能力可在预测人类肿瘤功效的动物模型系统中进行评定，可替代地，组合物的性质可通过检测化合物抑制的能力来进行评定，这种通过分析的体外抑制为本领域技术人员所熟悉。
[0368] “预防有效量”指在必要的周期时间内，达到理想预防效果的有效剂量。通常，由于在疾病的早期阶段之前使用预防剂量，该预防有效量可小于治疗有效量。
[0369] 同样，在本发明的范围内为包括特定抑制剂异构体的套件。
[0370] 该套件包括一个或多个其它的元件，包括：使用说明；其他试剂，例如：标记，治疗剂，或试剂用于螯合，或反过来，将抗体连接到标贴或治疗试剂，或放射保护组合物；装置或其它用于制备服用的抗体的材料；药学上可接受的载体；以及装置和实验对象服用的材料。使用说明可包括异构体-结合分子在体外，例如，在样品中，如：癌症或前列腺疾病患者的活组织或细胞，和体内的诊断应用的说明。该说明可包括具有建议用量和/或服用方式的治疗应用的说明，例如，具有癌症或前列腺疾病的患者中。其它说明可包括将抗体连接到螯合剂，标记或治疗试剂，或用于净化偶联抗体，如：来自未反应的共轭成分的说明。如上所述，该套件可包括标记，例如在此所述的任何标记。如上所述，该套件可包括治疗试剂，例如：在此所述的治疗试剂。该套件可包括试剂，用于将标记或治疗试剂螯合，或反过来结合到抗体，例如：在此所述的试剂。例如，大环螯合剂，优选为包括1,4,7,10-四氮杂环十二烷-N,N',N",N"',4-四乙酸(DOTA)。该DOTA可作为单独的成分来提供，或DOTA（或其它螯合剂或偶联剂）可与抗体结合后来提供。其它的偶联剂，例如：N-羟基丁二酰亚胺(NHS)可提供用于将螯合剂，例如：DOTA结合至抗体。在某些应用中，该抗体会与其它成分反应，该其它成分例如为：螯合剂或标记，或治疗试剂，例如：放射性同位素，如：钇或镏。在这种情况下，该套件可包括一个或多个实现反应的容器，或分隔的装置。例如：色谱柱，用于将成品与起始原料或反应中间体分离。
[0371] 该套件还可包括至少一个额外的试剂，例如：诊断或治疗试剂，例如：如此处所述的诊断或治疗试剂，和/或一种或多种额外的异构体-特异性抑制剂，以一种或多种分开的药物制备来进行合适配制。
[0372] 该套件还可包括辐射防护剂。同位素的辐射本质，例如：已知的90钇(90Y)。为了避免辐射分解，可包括辐射防护剂，例如：在反应缓冲液中，只要这些辐射防护剂是温和的，90
意思是它们不会抑制或相反不利于标记反应的效果，例如为同位素，如：Y与抗体的标记反应。
意思是它们不会抑制或相反不利于标记反应的效果，例如为同位素，如：Y与抗体的标记反应。
[0373] 本发明的配方缓冲液可包括辐射防护剂，例如：人血清白蛋白(HSA)或抗坏血酸盐，其由于钇或其它放射性核素使辐射分解最小化。其它的辐射防护剂为本领域所熟悉的，并可同样用于本发明的配方缓冲液，即：自由基清除剂（酚，亚硫酸盐，谷胱甘肽，半胱氨酸，龙胆酸，烟酸，棕榈酸抗坏血酸酯HOP(:0)H2I甘油，甲醛次硫酸氢钠，Na2S2O,Na2S2O3,和SO2等）。
[0374] 优选的套件通过给患者服用治疗的放射性同位素来进行放射性同位素标记螯合剂偶联蛋白或肽类。该套件包括(i)装有螯合剂偶联抗体的小瓶，(ii)包含用于稳定并将放射性标记抗体给患者服用的配方缓冲液的小瓶，以及(iii)进行放射性标记步骤的说明。该套件提供了如说明中所建议的，在温和条件下将螯合剂-偶联抗体暴露于放射性同位素或其盐以足够量的时间。产生了具有足够的纯度，特定的活性和特异性结合的放射性标记抗体。该放射性标记可稀释至合适的浓度，例如：在配置的缓冲液中，并经过或无须经过进一步的净化来直接给患者服用。该螯合剂-偶联抗体可以冻干的形式来提供。
[0375] 本发明的用途
[0376] 本发明的异构体-特异性抑制剂具有体外和体内的诊断，以及治疗和预防作用。例如，这些结合分子可给药至培养中的细胞，例如：在体外或体内，或在对象中，例如：体内，以治疗，防止和/或诊断不同的疾病，例如：癌症（前列腺和非前列腺癌）。如此处所述，术语“对象”包括人类和非人类动物，优选的人类动物包括具有以异构体-表达细胞，例如癌细胞或前列腺细胞的非正常功能为特征的疾病人类患者。本发明的术语“非人类动物”是指包括所有的脊椎动物，例如：哺乳动物和非哺乳动物，例如：非人类灵长类动物，绵羊，够，牛，鸡，两栖动物，爬行动物等。
[0377] 在一个实施例中，实验对象为人类对象。可替代地，该对象可为表达异构体-类抗原的哺乳动物，其中本发明的异构体-特异性抑制剂与该异构体-类抗原交叉反应。本发明的异构体-特异性抑制剂可给人类对象服用，用于治疗目的（以下讨论）。此外，异构体-特异性抑制剂可给表达异构体-类抗原的非人类哺乳动物服用，其中修饰抗体与该异构体-类抗原交叉反应，用于兽医用途或作为人类疾病的动物模型。关于后者，这种动物模型可用于评定本发明抗体的治疗效果（例如：剂量的测试，以及服用的时间过程）。
[0378] 治疗作用
[0379] 在一个实施例中，本发明提供了一种治疗，例如，去除或消灭如：增生细胞（例如：前列腺癌），或恶性肿瘤，非前列腺细胞，例如：在非-前列腺固体肿瘤中找到的细胞，软组织肿瘤，或转移病灶（例如，在肾脏，泌尿道上皮（如：膀胱），睾丸，结肠，直肠，肺（如：非-小细胞肺癌），乳房，肝脏，神经（例如：神经内分泌），神经胶质（例如：胶质母细胞瘤），胰脏（例如：胰管）癌症和/或转移，黑素瘤（例如：黑素肉瘤），或软组织肉瘤）。本发明的方法包括将过度增生细胞与在此所述的异构体-特异性抑制剂结合的步骤，其中的量足以治疗，例如：
减少活性，融化或杀死该过度增生细胞。
减少活性，融化或杀死该过度增生细胞。
[0380] 该对象方法可用于培养中的细胞，例如：体外或体内。例如，癌症或转移性细胞（例如：前列腺，肾脏，泌尿道上皮，结肠，直肠，肺，乳房或肝脏，癌症或转移性细胞）可在体外用培养基培养，并通过加入异构体-特异性抑制剂至培养基来开始接触步骤。该方法可在实验对象的细胞（例如：癌症或转移性细胞）上进行，作为体内（例如：治疗或预防）协议的一部分。对于体外的实施例，该接触步骤在实验对象内引起，并包括在引起允许抑制和/或减少一种或多种异构体活性，或将异构体-结合分子结合到细胞的状况下给实验对象服用异构体-特异性抑制剂，以此治疗，例如：杀死或融化细胞。
[0381] 在此，术语“癌症”指包括所有类型的癌细胞生长或致癌过程，转移性组织或恶性转化细胞，组织或器官，不管病理类型或侵染的阶段。癌症疾病的实施例非限制性地包括：实体瘤，软组织瘤，和转移性病灶。实体瘤的实施例包括：不同器官系统的恶性肿瘤，例如肉瘤，肺鳞癌和癌症。例如：感染的前列腺，肺，乳房，淋巴，肠胃（例如：结肠），和生殖泌尿道（例如：肾脏，上皮细胞），咽头。肺鳞癌包括恶性肿瘤，例如，多数的结肠癌，直肠癌，肾细胞癌，肝癌，肺部的非小细胞癌，小肠癌和食道癌。上述癌症的转移性病变可同样用本发明的方法和组合物来治疗和预防。
[0382] 上述方法在治疗不同器官系统恶性肿瘤方面十分有用，该不同的器官例如：感染的肺部，乳房，淋巴，肠胃（例如：结肠），膀胱，生殖泌尿道（例如：前列腺），咽头，以及肺鳞癌，这些疾病包括恶性肿瘤，例如大多数的癌症，肾细胞癌，前列腺癌和/或肿瘤，肺部非小细胞癌，小肠癌和食道癌。
[0383] 以上说明了服用本发明的异构体-特异性抑制剂的方法。所使用分子的合适剂量将取决个体的年龄，体重和所使用的特定药物。该修饰的抗体分子可用作配体结合的竞争性试剂，以抑制，减少不理想的影响。
[0384] 本发明的异构体-特异性抑制剂可通过自身，或与第二试剂，例如：细胞毒素药，放射性同位素，或蛋白质，如：蛋白毒素或病毒蛋白结合。该方法包括：给需要治疗的对象单独，或与细胞毒素药结合来服用异构体-特异性抑制剂。
[0385] 本发明的异构体-特异性抑制剂可用于配送不同的治疗试剂，例如：细胞毒性部分，如：治疗药物，发放射性同位素，植物分子，细菌源，或生物蛋白（例如：蛋白质毒素）或颗粒（例如：重组病毒颗粒，如：通过病毒衣壳蛋白），及其混合物。该治疗试剂可为细胞内活性药物或其它试剂，例如：短程辐射发射器，例如，上述的短程，高能α发射器。在某些实施例中，本发明的异构体-特异性抑制剂可与植物分子或细菌源（或其衍生物）结合，例如：美登素。美登素是细胞毒素剂，该细胞毒素剂通过阻止微管形成以及现存微管的解聚作用来启动细胞消灭。与抗癌药物相比，大约具有100-1000倍的细胞毒素，该抗癌药物例如为：阿霉素，甲氨蝶呤，长春花生物碱，这些药物一般为临床使用。可替代地，异构体-结合分子可与紫杉烷，刺孢霉素，蛋白酶体抑制剂或拓扑异构酶抑制剂结合。[(lR)-3-甲基-l-[[(2S)-l-氧-3-苯基-2-[(3-巯基乙酰基)氨基]丙基]氨基]丁基]硼酸是一种合适的蛋白酶体抑制剂。N,N'-双[2-(9-甲基吩嗪-l-羧酰氨基)乙基]-l,2-乙二胺是一种拓扑异构酶抑制剂。
[0386] 酶催化活性的毒素及其片段的例子有白喉毒素A片段，白喉毒素的非结合活性片段，外毒素A（来自铜绿假单胞菌），蓖麻毒素A链，相思豆毒蛋白A链，蒴莲素A链，α-萨克林，某些油桐蛋白，某些石竹素蛋白，垂序商陆根蛋白(PAP,PAPII和PAP-S)，苦瓜抑制剂，泻果素，巴豆毒蛋白，皂质厚朴抑制剂，白树因，丝裂吉菌素，局限曲菌素，酚霉素和伊诺霉素。在一个实施例中，异构体结合分子与美登木素生物碱偶联，该美登木素生物碱例如为：美登醇（请见：U.S.Pat.No.5,208,020），CC-1065（请见：Pat.Nos.5,475,092,5,585,499,5,846,545）。制备酶的活性多肽的步骤在WO84/03508和WO85/03508中有所说明，该两篇专利在此参考引入。细胞毒素部分的实施例可与抗体偶联，所述抗体包括：阿霉素，苯丁酸氮芥，道诺霉素，甲氨蝶呤，新制癌菌素和白金。
[0387] 为了杀灭或脱落前列腺上皮癌细胞，第一异构体-结合分子可与药物前体偶联，该药物前体当与药物前体活化剂接近时被活化。该药物前体活化剂与本发明的第二异构体-结合分子偶联，优选地结合在前列腺特异性膜抗原分子的非竞争性位置。可通过传统的竞争性结合分析来确定两个修饰抗体是否结合到竞争性或非竞争性结合位置。
[0388] 适用于本发明的药物-前体药物对在Blakely等.,"ZD2767an Improved System for Antibody-directed Enzyme Prodrug Therapy That Results in Tumor Regressions in Colorectal Tumor Xenografts,"(1996)Cancer Research,56:3287-3292中有所说明，该文章的内容在此参考引入。
[0389] 可替代地，本发明的异构体-结合分子可与高能辐射体结合，例如，放射性同位素，如：131I，γ-发射体，其可位于肿瘤位置，导致数个细胞半径的消灭，请见：例如：S.E.Order,"Analysis,Results,and Future Prospective of the Therapeutic Use of Radiolabeled Antibody in Cancer Therapy",Monoclonal Antibodies for Cancer Detection and Therapy,R.W.Baldwin et al.(eds.),pp303-316(Academic Press1985)，
213
该文章的内容在此参考引入。其它的合适放射性同位素包括α-发射体，例如：Bi, Bi,和
211 186 90
At,以及β-发射体，例如：Re和 Y，预计放射疗法比较实用，因为前列腺上皮癌细胞和
117
血管内皮癌细胞相对放射性敏感。此外，Lu可同样用作成像和细胞毒性剂。
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该文章的内容在此参考引入。其它的合适放射性同位素包括α-发射体，例如：Bi, Bi,和
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At,以及β-发射体，例如：Re和 Y，预计放射疗法比较实用，因为前列腺上皮癌细胞和
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血管内皮癌细胞相对放射性敏感。此外，Lu可同样用作成像和细胞毒性剂。
[0390] 使用以131I,90Y,和117Lu标记的放射免疫治疗(RIT)处于激烈的临床研究中。这三种放射性核素的物理性质有显著区别，因此，为了将最大的辐射剂量配送至肿瘤处，放90
射性核素的选择可非常重要。 Y更高的能量粒子有益于巨大肿瘤，但并非对小肿瘤是必
131
要的，特别是骨转移（例如：前列腺癌所常见的）。 I的相对低能β-粒子则比较理想，但
177
体内的碘标记分子的脱卤作用对于内化抗体来说是较大的缺点。相反， Lu具有能量较
90
低的β-粒子，其只有0.2-0.3mm范围，并相对 Y来说配送更低的辐射剂量至骨髓。此
90 177
外，由于更长的物理半衰期（相对于 Y），肿瘤的停留时间相对较长。结果， Lu标记试剂的更高活性（更多的mCi量）可以相对少的辐射剂量对骨髓给药。有几份临床研究，调查
177
了在治疗不同的癌症中，Lu标记抗体的使用。(Mulligan T et al,(1995)Clin Cancer Res.1:1447-1454;Meredith R F,et al.(1996)J Nucl Med37:1491-1496;Alvarez R D,et al,(1997)Gynecologic Oncology65:94-101)。
射性核素的选择可非常重要。 Y更高的能量粒子有益于巨大肿瘤，但并非对小肿瘤是必
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要的，特别是骨转移（例如：前列腺癌所常见的）。 I的相对低能β-粒子则比较理想，但
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体内的碘标记分子的脱卤作用对于内化抗体来说是较大的缺点。相反， Lu具有能量较
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低的β-粒子，其只有0.2-0.3mm范围，并相对 Y来说配送更低的辐射剂量至骨髓。此
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外，由于更长的物理半衰期（相对于 Y），肿瘤的停留时间相对较长。结果， Lu标记试剂的更高活性（更多的mCi量）可以相对少的辐射剂量对骨髓给药。有几份临床研究，调查
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了在治疗不同的癌症中，Lu标记抗体的使用。(Mulligan T et al,(1995)Clin Cancer Res.1:1447-1454;Meredith R F,et al.(1996)J Nucl Med37:1491-1496;Alvarez R D,et al,(1997)Gynecologic Oncology65:94-101)。
[0391] 本发明的异构体-特异性抑制剂同样可偶联或融合到病毒颗粒化上出现的病毒表面蛋白处。例如，本发明的异构体-结合分子可融合（例如，形成融合蛋白）到病毒表面蛋白。可替代地，整个异构体-特异性抑制剂可化学地偶联（例如：通过化学连接）到病毒表面蛋白。优选地，病毒是用内吞膜融合的，例如，流感病毒，这样，病毒与异构体-特异性抑制剂一起内在化，并以此感染异构体-表达细胞。该病毒可作为细胞毒素来进行基因处理。例如，病毒可表达或引导对细胞有毒的基因表达，例如：细胞死亡促进基因。优选地，这种病毒能进行病毒复制。
[0392] 本发明的异构体-特异性抑制剂可直接在体内应用，以通过自然补充或抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)来消除抗原-表达细胞。本发明的异构体-特异性抑制剂同样在补体存在的条件下也可使用，该异构体-特异性抑制剂具有补体结合位置，例如：来自结合补体的IgGl,-2,或-3或IgM的部分。在一个实施例中，体外细胞数量治疗可通过加入补体或包含补体的血清来补充，该细胞数量包括具有本发明的结合试剂以及合适效应细胞的目标细胞。目标细胞的吞噬作用可通过结合补体蛋白来改善，该目标细胞涂有本发明修饰的抗体或其片段。在另一个实施例中，该目标细胞涂有本发明的异构体-特异性抑制剂，并同样通过补体来细胞溶解。
[0393] 本发明同样包括一种杀灭或脱落细胞的方法，所述方法包括使用本发明的异构体-特异性抑制剂用于防止异构体相关的疾病。例如，这些材料可用于预防或延迟前列腺或其它癌症的发展或进展。
[0394] 本发明的用于治疗前列腺和其它癌症的治疗方法的使用具有许多优点。由于本发明的异构体-特异性抑制剂只针对目标癌细胞，其它的组织为备用。结果，用这种异构体-特异性抑制剂的治疗比较安全，尤其是对于年老患者来说。根据本发明的治疗预计会特别有效，因为其将异构体-特异性抑制剂直接导向至骨髓和淋巴结，此处多数为前列腺癌和其它癌转移之处。此外，本发明的方法特别适用于治疗前列腺癌，因为前列腺癌的肿瘤位置倾向于比较小，因此容易被细胞毒素剂摧毁。根据本发明的治疗可有效地用临床参数来有效控制，例如，在前列腺癌的情况下，一种或多种标记选自以下：血清PSA，PSMA,PSCA,AR,突触素，MIB-1和/或AMACR),和/或患者癌症的病例特点，包括阶段，Gleason评分，囊外，精液，小囊或嗜神经侵袭，切缘阳性，受累淋巴结，疾病相关疼痛，等。可替代地，这些参数可用于指明什么时候需要使用这些治疗。在此同样提供了DNA疫苗，该DNA疫苗包括核苷酸序列，该核苷酸序列编码致癌多肽异构体的表位，其用于预防或治疗癌症。该表位可为短肽，所述短肽来自致癌多肽异构体的直线或非直线序列的10-15氨基酸残基。该表位优选地跨越连个外显子之间的结合位置，该结合位置对特定的多肽异构体为独特的，该多肽异构体与癌症相关，并没有出现在正常实验对象或疾病对象的正常组织上找到的蛋白异构体上。在某些实施例中，DNA疫苗编码两个或两个以上表位，该表位来自单个蛋白异构体，或来自多种蛋白异构体，并可在这种结合中使用，例如：用于某种疾病的指示。DNA疫苗可同样编码表位特定序列，例如：编码10-15氨基酸，融合到框架内到载体蛋白，例如：血清白蛋白，SEAP或其它分泌肽或蛋白。DNA疫苗可如以下进一步讨论的用于预防或治疗疾病。典型的DNA疫苗包括核苷酸序列，该核苷酸序列编码在此所述的，或在此所鉴定的序列肽。
[0395] 为了检测DNA疫苗的效果，该疫苗可用于实验动物模型。动物模型为本领域所熟悉的用于多种疾病，例如：人类肿瘤。在一个说明性的实施例中，接种疫苗的动物会在接种DNA疫苗之前或之后面临人类肿瘤的接种。疫苗的保护或积极效果通过实验性动物的减少的肿瘤重量来体现。不受限于特定作用的机理中，肿瘤-特异性疫苗可激发身体的一个或两个免疫装备，即：细胞免疫和体液免疫。
[0396] 联合疗法
[0397] 本发明的异构体-特异性抑制剂可与其它疗法一起使用。例如，该联合疗法包括本发明的组合物与一种或多种额外的治疗试剂共同配制，和/或共同服用，例如：一种或多种抗癌试剂，细胞毒素或细胞抑制剂，激素治疗，疫苗，和/或其它免疫疗法。在其它实施例中，该异构体-特异性抑制剂与其它治疗方式一起使用，包括手术，辐射，冷冻手术，和/或温热疗法。这种结合疗法有利地利用所服用的治疗试剂的较低剂量，以此避免与不同单一疗法有关的可能的毒性或并发症。
[0398] 在此所述的“联合”服用，意味着在实验对象经历疾病痛苦的过程中，配送两种（或以上）的不同的治疗。例如：在实验对象诊断出疾病之后，以及在疾病得到治疗或消除之前，配送两种或以上的治疗。在某些实施例中，第一种治疗的配送在配送第二种治疗开始时仍然在进行，使得具有重叠。这有时称为“同时”或“同时配送”。在其它实施例中，一种治疗的配送在另一种治疗开始之前结束。在任意一种情况的某些实施例中，该治疗因为联合服用而更有效。例如，第二种治疗更有效，如：用较少的第二治疗可看到同等的疗效，或相比于没有使用第一治疗所看到的效果来说，第二治疗可更大程度地减少症状，或第一治疗也发生类似的情况。在某些实施例中，配送使得症状的减少，或与疾病相关的其它参数的减少大于只配送一种治疗而没有另一种时所观察的情况。两种治疗的效果可为部分添加剂，全部添加剂，或大于添加剂。该配送可使得在配送第二治疗时，第一治疗配送的效果为可检测。
[0399] 本发明的异构体-特异性抑制剂可与一种或多余一种的现有模式来服用，以治疗前列腺癌，并非限制性地包括：手术（例如：根治性前列腺切除术）；辐射治疗（例如：外照射治疗，该辐射治疗包括三围，适形放射治疗，其辐射的范围设计为符合待治疗的组织的体积；间质放射治疗，其用超声引导来植入放射化合物的种子，以及外照射治疗和间质放射治疗)；荷尔蒙疗法，其可在根治性前列腺切除术或辐射前后使用（例如：减少血清睾酮浓度的治疗，或抑制睾酮活动，例如：促黄体释放激素(LHRH)类似物，或兴奋剂（例如：醋酸亮丙瑞林，醋酸高舍瑞林，亮脯利特，乙基酰胺或戈舍瑞林）或拮抗剂（例如：阿巴瑞克）。可在荷尔蒙疗法中使用非类固醇的抗雄激素，例如：氟他米特，bicalutimade或尼鲁米特，以及甾体类抗雄激素（例如：环丙氯地孕酮或美仑孕酮乙酸酯），雌激素（例如：己烯雌酚），第二或第三荷尔蒙操作（例如：包括皮质类固醇（例如：氢化可的松，强的松或地塞米松），甲酮康唑，和/或氨鲁米特），5α-还原酶抑制剂（例如：非那雄胺），中草药制剂（例如：PC-SPES），垂体切除手术和肾上腺切除术）。此外，荷尔蒙疗法可间歇地进行或使用上述方法的任意结合来进行，例如：亮丙瑞林和氟他米特的结合使用。
[0400] 在某些实施例中，本发明的异构体-特异性抑制剂与免疫调节剂结合使用，该免疫调节剂例如为：IL-1,2,4,6,或12，或干扰素α或γ。例如：具有人恒定区和IL-2的抗体结合潜在地预计将增加单克隆抗体效率。IL-2将预计用于扩大网状内皮系统，以通过其在NK细胞和巨噬细胞的作用识别抗原-抗体复合物。因此，通过刺激NK细胞以释放IFN,GM-CSF,和TNF，这些细胞因子将增加Fc受体的细胞表面密度，以及这些细胞的吞噬能力。因此，体液免疫和细胞装装备的效应器将人工地得到提高。净效应将提高单克隆抗体治疗的效率，使得可获得最大的效应。少数临床试验将IL-2和单克隆抗体结合(Albertini et al.(1997)Clin Cancer Res3:1277-1288;Frost et al.(1997)Cancer80:317-333;Kossman et al.(1999)Clin Cancer Res5:2748-2755)。IL-2可通过大药丸或持续滴注来服用。因此，本发明的抗体可与IL-2结合服用，以使他们的治疗潜能最大化。
[0401] 诊断应用
[0402] 一方面，本发明提供了一种用于检测异构体存在的诊断方法，如异构体蛋白的体外(生物样品如来自癌组织的组织活检)或体内(如受试者的活体成像)检测。所述方法包括：(i)将样本与本文所述的异构体结合分子(抗-FGFR2-IIIc抗体分子)接触，或给受试者服用异构体结合分子；(可选择地)(ii)与参考样本如对照样本(即对照生物样本，如血浆、组织、活检)或对照受试者接触；(iii)检测异构体结合分子和样本或受试者、对照样本或受试者之间络合物的形成，其中样本或受试者相对于对照样本或受试者形成的络合物在统计学上的显著变化表明样本异构体的存在。异构体结合分子可以直接或间接标记有可以测量的物质，可以方便测量是否结合有抗体。如上所述，适合可测量的物质包括不同的酶、辅基、荧光物质、发光材料或放射性物质，将会在下文有更详细的描述。
[0403] 术语“样本”是指用于检测多肽的样本，包括但不限于细胞、细胞裂解液、细胞蛋白质或膜提取物、体液或组织样本。
[0404] 异构体结合分子或异构体之间络合物的形成可以通过测定或设想异构体抗原是否与结合
[0406] 作为标记异构体结合分子的替代，样本中的异构体的存在可以通过竞争免疫法进行分析，所述竞争免疫法采用标记有可检测物质的标准品和非标记的异构体结合分子。在这种分析中，生物样本、标记的标准品和结合分子相结合，再测定与非标记结合分子相结合的标记标准品的量。样本中的异构体量和与结合分子结合的标记标准品的量成反比。
[0407] 在另一个实施例中，本发明提供了检测体内异构体表达的癌组织的方法。该方法包括：(i)受试者(如患癌病人)服用与可检测标记物共轭的异构体结合分子；(ii)采用检测异构体表达组织或细胞中可检测标记物的方法检测受试者。
[0408] 在其中一个实施例中，上述可与多肽致癌异构体特异结合的结合分子为抗体分子。在另一个实施例中，本文中所述的结合分子为抗FGFR2-IIIc抗体分子。在一个实施例中，与多肽特异结合的抗体具有序列号如SEQ ID NO:2,4,6,8,10,12,14,16,18或与其大致相同的氨基酸序列。
[0409] 检测受试者是否表达致癌异构体对于癌症诊断非常有用。检测受试者是否表达FGFR2-IIIc致癌异构体可用于诊断激素难治性前列腺癌、乳腺癌、膀胱癌、甲状腺癌或其他癌症。检测受试者是否表达FGFR1L可用于诊断胰腺癌、前列腺癌或其他癌症。检测受试者是否表达RON受体酪氨酸激酶Δ160异构体可用于诊断转移性结直肠癌，乳腺癌，卵巢癌，肺癌，膀胱癌或其他癌症。检测受体是否表达K IT受体酪氨酸致癌异构体可用于诊断胃肠道间质瘤（GIST）或其他癌症。检测受试者是否表达PDGFR-α异构体癌症可用于诊断脑癌、胶质母细胞瘤，前列腺癌，骨转移、GIST或其他癌症。
[0410] 当在显著水平没有检测到与致癌多肽异构体结合的化合物时，诊断结果为负。当在显著水平检测到与致癌多肽异构体结合的化合物时，诊断结果为正。
[0411] 根据本发明，对影像诊断有用的标记可为放射性标记物如
[0412] 131I,111In,123I,99mTc,32P,1251,3H,14C,和mRh,荧光标签如荧光素、若丹明、核磁共振有源标签，可被正电子发射断层扫描("PET")扫描仪检测的发射正电子的同位素，化学发光如荧光素，酶标记物如过氧化物酶或磷酸酶。可以采用短距离的辐射发射器，例如可采用短距离检测器探头，如经直肠探头检测同位素。当联合使用这些同位素和直肠探测器探头时，对检测前列腺窝复发，盆腔淋巴结病变尤其有用。利用现有的公知技术可将这些试剂标记修饰的抗体。例如，Wensel和Meares(1983)，放射免疫显像及放射免疫治疗，Elsevier N.Y.,记载了有关放射性标记抗体的技术，在此作为参考。又如D.Colcher et al.,(1986)Meth.恩赛莫耳.121:802-816，在此也作为参考。
[0413] 在给患者服用放射性标记的修饰抗体的情况下，修饰的抗体在承载有与修饰抗体反应的抗原的肿瘤部位集中，可采用现有的公知技术如核放射扫描伽马相机或发射断层扫描被检测到或在体内“显像”。见A.R.Bradwell等，“抗体显像的进展”，单克隆抗体检测和癌症治疗，和R.W.Baldwin等，pp65785(科学出版社1985)，在此作为参考。
[0414] 作为可选择的，当有放射性标记的发射正电子(如UC,18F,150,13N)时可以使用正电子发射横断断层扫描仪，如位于布鲁克海文国家实验室，命名为Pet VI。
[0415] 荧光基团和发色团标记修饰抗体可以通过现有技术公知的标准基团制备得到。由于抗体和其他蛋白质吸收光具有约为310nm的波长，必须选择在超过310nm波长处、优选400nm处具有大量吸收的荧光基团。Stryer(1968)科学，162:526和Brand,L.等(1972)，生物化学年度回顾,41:843-868描述了多种荧光基团和发色团，在此作为参考。可以通过如US专利Nos.3,940,475,4,289,747和4,376,110所述的常规程序，采用荧光发色团标记异构体结合分子，在此作为参考。
[0416] 如上所述的具有一些预期性能的荧光增白剂是吨染料，其包括来源于3,6-二羟基-9-苯基水解黄嘌呤的荧光素和来源于3,6-二氨基-9-苯基水解黄嘌呤和丽丝胺若丹明B的克里萨明和若丹明。9-氧-羧基苯基水解黄嘌呤的若丹明和荧光素衍生物具有9-氧-羧基苯基基团。具有反应耦合基团如氨基，异硫氰酸基团如异硫氰酸荧光素和荧光胺的荧光化合物都是现成的。另外一些荧光化合物是萘胺(氨基萘)，其在α或β位置具有氨基。
[0417] 在另一些实施例中，本发明还提供了测定剂量如辐射剂量的方法，其方法为：当受试者如人体受试者服用与放射性同位素共轭的异构体结合分子时，检测不同的组织。该方法包括：(i)受试者服用如前所述的放射性同位素标记的异构体结合分子；(ii)在不同的时间点测定不同组织如胰腺、肝、肾或血液中的放射性同位素的量，直到一些或所有放射性同位素在受试者的体内消失；(iii)计算分析的每个组织接收到的辐射物的总量。测量可以在预定的时间点如受试者服用放射性标记的异构体结合分子(0天)后的第1、2、3、5、7和12天进行。给定组织中存在的放射物浓度，对时间积分，乘以放射物的特定活性，可以用m于计算给定组织接收的剂量。使用放射性同位素如γ-射线，In标记的异构体结合分子产生的药理信息，可以用于计算同一个组织从不同的、不容易测定的放射性同位素如β-射
90
线，Y接收到的预期剂量。
90
线，Y接收到的预期剂量。
[0418] 药理学
[0419] 至于预防和治疗方法，这些方法都可以基于药理学领域的知识进行特别的整修或修饰。“药理学”在此处是指基因技术如基因测序、统计遗传学，基因表达，临床开发和市场上药物的蛋白质生物标志物的表达分析等的应用。参见Eichelbaum,M.等,(1996)Clin.Exp.Pharmaco.Physiol.23:983-985和Linder,M.W.等(1997)Clin.Chem.43:254-266。代谢疗法的差异(改变药理学活性药物的剂量和血药浓度之间的关系)可能会导致严重的毒性或治疗失败。通常来说，可区分两种类型的药理学条件。改变药物作用于人体的方式(改变药物活性)作为遗传性条件的单一因子，或改变人体作用于药物的方式(改变药物代谢)作为遗传性条件的单一因子。这些药理学条件以罕见的遗传性缺陷或自然存在的多态性形式发生。更具体的，术语是指对患者的基因是如何决定他/她对药物的反应(如患者是“药物反应表现型”或“药物反应基因型”)的研究。因此，本发明的另一方面提供了根据个体的药物反应基因型而对个体的预防或治疗方法的修饰方法。
[0420] 药理基因组学的研究信息可以用于决定预防或治疗方法的合适剂量和治疗方案。这些知识应用于剂量或药物选择方面时，可以防止不良反应或治疗失败，因此，当作为治疗紊乱(如前所述的癌症)的一种方法，给患者服用包括一种或几种异构体特异性抑制剂或其衍生物的治疗组合物时，可以加强预防或治疗效果。
[0421] 在一个实施例中，在决定受试者是否服用药物组合物，如包括一种或几种异构体特异性抑制剂、或其衍生物、或选择第二剂的组合物时，医生或临床医生可能会考虑应用有关药物基因组学研究获得的知识。在另一个实施例中，在决定受试者服用如前所述的药物组合物的剂量如每次治疗用量或治疗频率时，医生或临床医生可能会考虑应用这些知识。
[0422] 在另一个实施例中，医生或临床医生可能决定参与临床试验的受试者的一个或几个基因位点的基因型，其中受试者表现紊乱，如前所述的癌症或前列腺障碍；设计临床试验来测试包含一种或多种异构体特异性抑制剂、或选择第二剂的药物组合物的功效，医生或临床医生试图将受试者的基因型与其对药物组合物的反应关联起来。
[0423] 利用RT-PCR或PCR检测编码致癌异构体核酸的方法
[0424] 本发明还提供了检测编码致癌异构体的核酸的方法，包括(a)从合适的样本的mRNA中获取cDNA；(b)扩增原癌基因、致癌异构体或其抗原表位片段对应的cDNA；(c)将已知编码原癌基因、致癌异构体或其抗原表位片段的DNA与扩增的cDNA进行比较，其中扩增的cDNA中致癌异构体的存在表明检测到编码致癌异构体的核酸。
[0425] 本发明还提供了一种编码致癌异构体的核酸的检测方法，包括：(a)将合适的样本与上述可与编码致癌异构体的核酸特异结合的化合物接触；(b)检测是否有化合物与核酸结合，其中样本中有与核酸结合的化合物的存在表明检测到编码致癌异构体的核酸。
[0426] 术语“样本”是指用于检测核酸的样本，包括但不限于细胞、细胞裂解液、细胞的核酸提取物、组织样本或人体血液。体液包括但不限于血、血浆和唾液。在其中一个实施例中，从受试者中获取合适的样本。
[0427] 从合适的样本中获取mRNA的方法是现有技术。从mRNA制备cDNA的方法，如逆转录也是现有技术。
[0428] 在这里，“扩增”表示增加特定DNA片段若干个拷贝。在其中一个实施例中，cDNA的扩增是采用PCR(聚合酶链式反应)进行的。
[0429] 在其中一个实施例中，cDNA的扩增是采用编码致癌异构体多肽的原癌基因的整个阅读框的引物侧翼进行的。在另一个实施例中，cDNA的扩增是采用编码多肽致癌异构体的核酸的引物两侧部分如外显子进行的。在另一个实施例中，一条或多条引物与致癌异构体的序列杂交，该序列在编码致癌异构体的核酸中存在、而在编码非致癌异构体的核酸中是缺失的，反之亦然。在另一个实施例中，引物可以与选自SEQ ID NOs:1,3,5,7,9,11,13,15,17中的一条序列杂交。在其它实施例中，引物长度可为18-22个核苷酸。
[0430] 在一个实施例中，比较扩增的cDNA和已知编码原癌基因、致癌异构体或其抗原表位片段的cDNA是通过将扩增的cDNA的序列与已知的对应于原癌基因、致癌异构体或其抗原表位片段的序列进行比较。扩增序列中序列的存在或缺失将表明致癌异构体存在或不存在。在另一个实施例中，比较扩增的cDNA和已知编码原癌基因、致癌异构体或其抗原表位片段的cDNA是通过将扩增的cDNA与已知的对应于原癌基因、致癌异构体或其抗原表位片段的基因的大小进行比较。大小的不同将表明扩增的DNA编码致癌异构体。
[0431] 本发明还提供了测定受试者是否表达致癌异构体的方法，包括：(a)从合适的受试者样本的mRNA中获取cDNA；(b)扩增原癌基因、致癌异构体或其抗原表位片段对应的cDNA；(c)将已知编码原癌基因、致癌异构体或其抗原表位片段的DNA与扩增的cDNA进行比较，其中扩增的cDNA中致癌异构体的存在表明受试者编码致癌异构体。
[0432] 上述测定受试者是否表达致癌异构体的方法中，术语“合适的样本”是指可能包括致癌异构体的受试者的任何样本。包括但不限于体液和组织样本。体液包括但不限于血液、血浆、尿液和唾液。
[0433] 扩增、比较和检测cDNA的存在可如上述进行。
[0434] 核苷酸
[0435] 如本文所述，本发明还提供了包含编码抗FGFR2-IIIc抗体的重链可变区、轻链可变区和CDRs的核苷酸序列的核苷酸。例如，本发明提供了分别编码抗FGFR2-IIIc抗体分子的重链可变区和轻链可变区第一核苷酸和第二核苷酸，所述抗FGFR2-IIIc抗体分子 选 自 Atto-MuMab-01,Atto-MuMab-02,Atto-MuMab-03,Atto-HuMab-01,Atto-MuMab-06,Atto-MuMab-08中的一个或多个。核苷酸包括如图29A,29C,29E,30A,30C,30E,34A(重链可变区的SEQ ID NO:87),34B(轻链可变区的SEQ ID NO:89),37B所示的核苷酸序列，或与其大致相同的序列(如约85%,90%,95%,99%或一致性更高的序列)，或与图29A,29C,29E,30A,30C,30E,34A(重链可变区的SEQ ID NO:87),34B(轻链可变区的SEQ ID NO:89),37B所示的核苷酸序列相差不超过3,6,15,30,或45个核苷酸。
[0436] 在一些实施例中，核酸包括编码具有如图35(分别为重链可变区的CDRs1-3的 SEQ ID NOs:92,94,96),28,29F(分 别 为 重 链 可 变 区 的 CDRs1-3 的 SEQ ID NOs:147-149),30F(分别为重链可变区的CDRs1-3的SEQ ID NOs:147,158,159),38,39(分别为重链可变区的CDRs1-3的SEQ ID NOs:147-149),或40,或与其基本同源(如约85%,90%,95%,99%或一致性更高,和/或具有一个或多个保守替代的序列)的氨基酸序列的重链可变区的至少一个、两个或三个CDRs的核苷酸序列。在另一些实施例中，核酸包括编码具有如图35(分别为轻链可变区的CDRs1-3的SEQ ID NOs:98,100,102),28,29D(分别为轻链可变区的CDRs1-3的SEQ ID NOs:155,156,146),30D(分别为轻链可变区的CDRs1-3的SEQ ID NOs:155-157),38,39(分别为轻链可变区的CDRs1-3的SEQ ID NOs:144-146),或40,或与其基本同源(如约85%,90%,95%,99%或一致性更高,和/或具有一个或多个保守替代的序列)的氨基酸序列的轻链可变区的至少一个、两个或三个CDRs的核苷酸序列。
在另一个实施例中，核酸包括编码具有如图35(分别为重链可变区的CDRs1-3的SEQ ID NOs:92,94,96，分别为轻链可变区的CDRs1-3的SEQ ID NOs:98,100,102),28,29D(分别为轻链可变区的CDRs1-3的SEQ ID NOs:155,156,146),29F(分别为重链可变区的CDRs1-3的SEQ ID NOs:147-149)，30D(分别为轻链可变区的CDRs1-3的SEQ ID NOs:155-157),30F(分别为重链可变区的CDRs1-3的SEQ ID NOs:147,158,159),38,39(分别为轻链可变区的CDRs1-3的SEQ ID NOs:144-146，分别为重链可变区的CDRs1-3的SEQ ID NOs:147-149),或40,或与其基本同源(如约85%,90%,95%,99%或一致性更高,和/或具有一个或多个保守替代的序列)的氨基酸序列的重量可变区和轻链可变区的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个CDRs的核苷酸序列。
在另一个实施例中，核酸包括编码具有如图35(分别为重链可变区的CDRs1-3的SEQ ID NOs:92,94,96，分别为轻链可变区的CDRs1-3的SEQ ID NOs:98,100,102),28,29D(分别为轻链可变区的CDRs1-3的SEQ ID NOs:155,156,146),29F(分别为重链可变区的CDRs1-3的SEQ ID NOs:147-149)，30D(分别为轻链可变区的CDRs1-3的SEQ ID NOs:155-157),30F(分别为重链可变区的CDRs1-3的SEQ ID NOs:147,158,159),38,39(分别为轻链可变区的CDRs1-3的SEQ ID NOs:144-146，分别为重链可变区的CDRs1-3的SEQ ID NOs:147-149),或40,或与其基本同源(如约85%,90%,95%,99%或一致性更高,和/或具有一个或多个保守替代的序列)的氨基酸序列的重量可变区和轻链可变区的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个CDRs的核苷酸序列。
[0437] 在一些实施例中，核酸包括编码具有如图34A(分别为重链可变区的CDRs1-3的SEQ ID NOs:91,93,95),29E(分别为重链可变区 的CDRs1-3的SEQ ID
NOs:187-189),30E(分别为重链可变区的CDRs1-3的SEQ ID NOs:181-183),37B(分
别为重链可变区的CDRs1-3的SEQ ID NOs:175-177),或与其基本同源(如至少
85%,90%,95%,99%或一致性更高,或可在严格条件下杂交的序列)的氨基酸序列的重链可变区的至少一个、两个或三个CDRs的核苷酸序列。在另一些实施例中，核酸包括编码具有如图34B(分别为轻链可变区的CDRs1-3的SEQ ID NOs:97,99,101),29C(分别为轻链可变区的CDRs1-3的SEQ ID NOs:184-186),30C(分别为轻链可变区的CDRs1-3的SEQ ID NOs:178-180),37B(分别为轻链可变区的CDRs1-3的SEQ ID NOs:172-174),或与其基本同源(如约85%,90%,95%,99%或一致性更高,或可在严格条件下杂交的序列)的氨基酸序列的轻链可变区的至少一个、两个或三个CDRs的核苷酸序列。在另一个实施例中，核酸包括编码具有如图34A(分别为重链可变区的CDRs1-3的SEQ ID NOs:91,93,95),34B(分别为轻链可变区的CDRs1-3的SEQ ID NOs:97,99,101),29C(分别为轻链可变区的CDRs1-3的SEQ ID NOs:184-186)，29E(分别为重链可变区的CDRs1-3的SEQ ID NOs:187-189)，30C(分别为轻链可变区的CDRs1-3的SEQ ID NOs:178-180),30E(分别为重链可变区的CDRs1-3的SEQ ID NOs:181-183),37B(分别为重链可变区的CDRs1-3的SEQ ID NOs:175-177，分别为轻链可变区的CDRs1-3的SEQ ID NOs:172-174),或与其基本同源(如约85%,90%,95%,99%或一致性更高,或可在严格条件下杂交的序列)的氨基酸序列的重量可变区和轻链可变区的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个CDRs的核苷酸序列。
NOs:187-189),30E(分别为重链可变区的CDRs1-3的SEQ ID NOs:181-183),37B(分
别为重链可变区的CDRs1-3的SEQ ID NOs:175-177),或与其基本同源(如至少
85%,90%,95%,99%或一致性更高,或可在严格条件下杂交的序列)的氨基酸序列的重链可变区的至少一个、两个或三个CDRs的核苷酸序列。在另一些实施例中，核酸包括编码具有如图34B(分别为轻链可变区的CDRs1-3的SEQ ID NOs:97,99,101),29C(分别为轻链可变区的CDRs1-3的SEQ ID NOs:184-186),30C(分别为轻链可变区的CDRs1-3的SEQ ID NOs:178-180),37B(分别为轻链可变区的CDRs1-3的SEQ ID NOs:172-174),或与其基本同源(如约85%,90%,95%,99%或一致性更高,或可在严格条件下杂交的序列)的氨基酸序列的轻链可变区的至少一个、两个或三个CDRs的核苷酸序列。在另一个实施例中，核酸包括编码具有如图34A(分别为重链可变区的CDRs1-3的SEQ ID NOs:91,93,95),34B(分别为轻链可变区的CDRs1-3的SEQ ID NOs:97,99,101),29C(分别为轻链可变区的CDRs1-3的SEQ ID NOs:184-186)，29E(分别为重链可变区的CDRs1-3的SEQ ID NOs:187-189)，30C(分别为轻链可变区的CDRs1-3的SEQ ID NOs:178-180),30E(分别为重链可变区的CDRs1-3的SEQ ID NOs:181-183),37B(分别为重链可变区的CDRs1-3的SEQ ID NOs:175-177，分别为轻链可变区的CDRs1-3的SEQ ID NOs:172-174),或与其基本同源(如约85%,90%,95%,99%或一致性更高,或可在严格条件下杂交的序列)的氨基酸序列的重量可变区和轻链可变区的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个CDRs的核苷酸序列。
[0438] 在另一方面，本发明提供了包含上述核酸的宿主细胞和载体。核酸可以在同一宿主细胞或各个宿主细胞的单个载体或各个载体中存在，在下文中将详细描述。
[0439] 在本发明的其中一个实施例中，提供了编码致癌多肽异构体的分离的核酸，或其大致相同的序列。
[0440] 在一个实施例中，本发明还提供了编码致癌异构体的多肽或其抗原表位片段的分离的核酸。在一个实施例中，本发明提供了编码人类致癌异构体的多肽或其抗原表位片段的分离的核酸。在一个实施例中，所述分离的核酸编码原癌基因的致癌形式的异构体或其抗原表位片段，所述原癌基因选自FGFR2,FGFR1,RON受体酪氨酸激酶，KIT受体酪氨酸激酶，PDGF和PDGFR-α。
[0441] 在一个实施例中，本发明提供了编码致癌异构体或其抗原表位片段的小鼠多肽的分离的核酸。在一个实施例中，本发明提供了编码人类致癌异构体或其抗原表位片段的鼠多肽的分离的核酸。在另一个实施例中，所述编码人类致癌异构体或其抗原表位片段的分离的核酸来自于其它种类，包括但不限于狗、猪、豚鼠和兔。
[0442] FGFR2
[0443] 在本发明的一个实施例中，提供了一种分离的核酸，该核酸编码致癌多肽异构体或其表位片段，其包括核苷酸部分，该核苷酸部分由编码FGFR2的核酸外显子III的选择性使用而产生。在一个实施例中，外显子III的选择性使用导致301-360氨基酸区域的序列变异，该区域氨基酸对应于FGFR2Illb。因此，一方面，该核酸编码多肽，所述多肽包括选自一组SEQ NO:2,4,6,和8的序列。在另一方面，该核酸包括选自一组包含EQ NO:1,3,5,和7的序列。
[0444] FGFR1
[0445] 在另一个实施例中，本发明提供了一种分离的核酸，该核酸编码致癌多肽异构体或其表位片段，其包括由选择性的FGFR1外显子7和8缺失引起的核苷酸部分。在一个实施例中，当与FGFR1原癌基因比对时，该选择性的外显子7和8缺失导致105氨基酸缺失。因此，在一方面，该分离的核酸编码多肽，所述多肽包括SEQ NO:9的序列。
[0446] RON受体酪氨酸激酶
[0447] 在另一个实施例中，本发明提供了一种分离的核酸，该分离的核酸编码致癌异构体或其表位片段的多肽，其包括核苷酸部分，该核苷酸部分由选择性的RON受体酪氨酸激酶的外显子5和6缺失产生。在一个实施例中，该选择性的外显子5和6的缺失导致当与RON受体酪氨酸激酶原癌基因比对时109氨基酸在胞外区的框内缺失。在一个方面，该分离的核酸包括外显子4和7的并排。因此，在一方面，该分离的核酸编码多肽，所述多肽包括SEQ NO:12的序列。在另一方面，该分离的核酸包括SEQ NO:11的序列。
[0448] KIT受体酪氨酸激酶
[0449] 在另一个实施例中，本发明提供了一种分离的核酸，该分离的核酸编码致癌异构体或其表位片段的多肽，其包括核苷酸部分，该核苷酸部分由核酸编码KIT受体酪氨酸激酶的选择性外显子11缺失而产生。因此，在一方面，该分离的核酸编码多肽，所述多肽包括SEQ NO:14序列。另一方面，该核酸包括SEQ NO:13序列。
[0450] PDGF
[0451] 在另一个实施例中，本发明提供了一种分离的核酸，该分离的核酸编码致癌异构体或其表位片段的多肽，其包括核苷酸部分，所述核苷酸部分由选择性的PDGF外显子6框内缺失而产生。因此，一方面，该分离的核酸编码多肽，所述多肽包括SEQ NO:16序列。在另一方面，该分离的核酸包括SEQ NO:15序列。
[0452] PDGFR-α
[0453] 在另一个实施例中，本发明提供了一种分离的核酸，该分离的核酸编码致癌异构体或其表位片段的多肽，该多肽包括由可替代的PDGFR-α外显子7和8（例如：氨基酸374-456）缺失引起的核苷酸部分。因此，在一个方面，该分离的核酸编码多肽，该多肽包括SEQ NO:18序列。在另一方面，该核酸包括SEQ NO:17序列。
[0454] 可替代地，该编码致癌异构体或其表位片段的多肽的分离核酸由核酸编码，该核酸大致等于在此的致癌异构体或其表位片段的核酸。此外，分离的核酸可编码致癌异构体或其表位片段的多肽，该多肽大致等于致癌异构体或其表位片段。
[0455] “大致对应”另一个序列的序列（多肽或核酸）可为使得单个氨基酸或核苷酸替代，缺失和/或插入。在一个实施例中，大致等于的序列具有80%的序列一致性。在另一个实施例中，大致对应的序列具有90%的序列一致性。在另一个实施例中，大致对应的序列具有95%的序列一致性。在另一个实施例中，大致对应的序列具有97%的序列一致性。在另一个实施例中，大致对应的序列具有99%的序列一致性。
[0456] 在另一个实施例中，核酸编码致癌异构体或其表位片段，该致癌异构体或其表位片段包括在SEQ ID NOs:2,4,6,8,10,12,14,16,18,19,或20中说明的氨基酸序列，但具有保守氨基酸替代。在另一个实施例中，核酸编码致癌异构体或其表位片段，该致癌异构体或其表位片段包括相对于SEQ ID NOs:2,4,6,8,10,12,14,16,18,19,或20的1,2,3,4,5,6,7,8,9或10的保守氨基酸替代。该核酸编码致癌多肽插入变异，该致癌多肽插入变异包括相对于SEQ ID NOs:2,4,6,8,10,12,14,16,18,19,或20的
11,12,13,14,15,16,17,18,19,或20保守氨基酸替代。
11,12,13,14,15,16,17,18,19,或20保守氨基酸替代。
[0457] 本发明同样提供了分离的核酸，该分离的核酸特定地与在此的核酸结合，或与能在高度严格的条件下杂交到在此所述的核酸，或与其大致相等序列的核酸结合。
[0458] 本发明提供了一种分离的核酸，该分离的核酸可在高度严格的条件下杂交到编码致癌异构体或其表位片段的核酸，该致癌异构体或其表位片段的核酸包括SEQ ID NO:2,4,6,8,10,12,14,16,18,19,或20，或与其大致相等序列。本发明提供了一种分离的核酸，该分离的核酸可在高度严格的条件下杂交到包括序列为SEQ ID NO:1,3,5,7,9,11,13,15,或17或其片段的核酸。
[0459] 本发明还提供了一种分离的核酸，该分离的核酸编码了致癌异构体或其表位片段，其中该核酸至少80%等于编码致癌异构体或其表位片段的核酸，其中该编码致癌或其表位片段的核酸在对应于选择性剪切连接处的位置上包括核苷酸部分，在所述位置上使用时提供多肽致癌。在更优选的实施例中，并非80%，其百分数为85%,90%,95%,97%,或99%。
[0460] 在此所述的核酸可通过可检测标志物来标志。该可检测标志物非限制性地包括：放射性标记物，比色标记物，发光标记物，酶标记物和荧光标记物。放射性标记物非限制性
3 14 32 33 35 36 51 57 59 59 90 125 13 186
地包括：H, C, P, P, S, C1, Cr, Co, Co, Fe, Y, I, 1I,和 Re。
3 14 32 33 35 36 51 57 59 59 90 125 13 186
地包括：H, C, P, P, S, C1, Cr, Co, Co, Fe, Y, I, 1I,和 Re。
[0461] 荧光标记物非限制性地包括：荧光素，罗丹明和金胺。
[0462] 比色标记非限制性地包括：生物素和异羟基洋地黄毒甙元。将标记物加至核酸的合适方法可与本发明的核苷酸一起使用，许多这些方法都是本领域所述熟悉的。
[0463] 此外，本发买那个提供了与在此公开的核酸互补的核酸。通过核酸序列“同源”或“互补”意味着核酸选择性地与目标核酸序列进行杂交，双链或结合。例如，腺嘌呤与胸腺嘧啶互补，因为他们形成两个氢键。类似地，鸟嘌呤和胞嘧啶互补，因为它们形成氢键。与目标序列同源的核酸序列可包括短于或长于目标序列的序列，只要这种序列符合所说明的功能测试要求。
[0464] 本领域的技术人员明白，当指代特定序列表时，这种指代包括大致等于其互补序列，以及所说明的可有轻微序列错误，单个碱基变化，缺失，替代的序列，这样，任何这种序列变化对应于编码多肽的核酸，该多肽与相关的序列表有关。
[0465] 载体
[0466] 本发明同样提供了载体，该载体包括核苷酸，该核苷酸编码在此提供的致癌异构体或其表位的多肽。在一个实施例中，该载体包括核苷酸，该核苷酸编码在此提供的致癌异构体或其表位片段的多肽。在一个实施例中，该载体包括在此所述的核苷酸序列。该载体非限制性地包括：病毒，质体，粘粒，噬菌体或酵母菌人工染色体(YAC)。
[0467] 根据本发明，可使用多个载体系统。例如，一类载体利用DNA成分，该DNA成分来自动物病毒，例如，牛乳头瘤病毒，多瘤病毒，腺病毒，牛痘病毒，杆状病毒，逆转录酶病毒(劳氏肉瘤病毒,MMTV或MOMLV)或SV40病毒，另一类载体利用RNA成分，该RNA成分来自RNA病毒，例如，利基森林病毒，东部马脑炎病毒和虫媒病毒。
[0468] 此外,具有稳定将DNA合并到它们染色体的细胞可通过引入一种或多种标记来选择，该一个或多个标记容许转染宿主细胞的选择。该标记可提供，例如：质子转移至营养缺陷型主体，杀生体抗性（例如：抗生素），或耐重金属，例如：铜，或类似物。可选择的标记基因可直接与要表达的DNA序列连接，或通过并发转移引入相同的细胞内。同样需要额外的成分用于mRNA的优化合成。这些成分可包括拼接信号，以及转录启动子，增强子，以及终止信号。
[0469] 一旦包含构建的表达载体或DNA序列制备用于表达时，该表达载体可转染或引入合适的宿主细胞。这可通过不同的技术获得，例如，原生质体融合，磷酸钙沉淀，电穿孔，逆转录病毒转导，病毒转染，基因枪，脂质转染或其它传统的技术。在原生质体融合的情况下，细胞在介质中生长，并根据合适活性来筛选。
[0470] 编码致癌异构体或其表位片段的多肽的基因表达导致致癌异构体或其表位片段的多肽产生。
[0471] 基于本发明，培养所得的转染细胞和恢复致癌异构体或其表位片段的多肽的方法和条件对于本领域技术人员来说是熟悉的，并可随着特定的表达载体和所采用的哺乳动物宿主细胞来变化或优化。
[0472] 细胞
[0473] 本发明同样提供了包括核酸的宿主细胞，该核酸编码在此所述的致癌异构体或其表位片段的多肽的核酸。
[0474] 在一个实施例中，宿主细胞为基因处理，以包括编码致癌异构体或其表位片段的核酸。
[0475] 在一个实施例中，宿主细胞为通过使用表达盒的基因处理。术语“表达盒”指核苷酸序列，该核苷酸序列能影响与这种序列相容的主体内的基因表达。这种盒可包括增强子，具有或没有内含子的开放阅读框，以及终止信号。
[0476] 同样可使用其它的必要或有用于影响表达的因子，例如：诱导型启动子。
[0477] 本发明还提供了包括上述载体的宿主细胞。
[0478] 该细胞可非限制性地包括：真核细胞，细菌细胞，昆虫细胞，或人类细胞。合适的真核细胞非限制性地包括：细胞毒素细胞，海拉细胞，COS细胞，CHO细胞，HEK293细胞，BHK细胞和MDCKⅡ细胞。合适的昆虫细胞非限制性地包括：sf9细胞。
[0479] 以下通过非限制的实施例来帮助理解本发明。
[0480] 实施例
[0481] 实施例1：异构体特异性表位
[0482] 实施例1.1：FGFR2:异构体FGFR2-IIIc(SEQ ID NO:19)
[0483] 成纤细胞生长因子受体2（FGFR2）的异构体主要在激素难治性前列腺癌中表达。外显子III的替换使用在胞外域的Ig类环（Ig-like loop）上产生不同序列，这对于配体结合非常重要。异构体IIIb在正常的前列腺上皮细胞中表达。恶性前列腺癌细胞转化为IIIc异构体，它对具有高转化活性的生长因子如FGF8b异构体，有高的结合力。
[0484] FGFR2-IIIc使用替换的外显子III，其编码与异构体FGFR2-IIIb不同的序列。在羟基末端区，Ig-环III的一半区，从氨基酸314至353位，FGFR2-IIIc异构体包含与IIIb异构体非同源的序列。FGFR2的异构体结构如图1所示。
[0485] IIIc和IIIb异构体的序列比对（sequence alignment）展示了在Ig环III区的一半的羟基末端的差异。
[0486] FGFR2-IIIc的氨基酸（SEQ ID NO:19）和核苷酸（SEQ ID NO:20）序列分别如图3A和3B所示。
[0487] FGFR2外显子IIIc的核苷酸（SEQ ID NO:1）和氨基酸（SEQ ID NO:2）序列分别如图4A和2所示。FGFR2外显子IIIb的核苷酸（SEQ ID NO:64）和氨基酸（SEQ ID NO:65）序列分别如图4B和2所示。
[0488] 短肽序列也可用作产生单克隆抗体的表位。IIIc-314的氨基酸（SEQ ID NO:4）和核苷酸（SEQ ID NO:3）序列如图5A所示。IIIc-328的氨基酸（SEQ ID NO:6）和核苷酸（SEQ ID NO:5）序列如图5B所示。IIIc-350的氨基酸（SEQ ID NO:8）和核苷酸（SEQ ID NO:7）序列如图5C所示。IIIb（环3-C’）片段：氨基酸314-351的氨基酸（SEQ ID NO:56）和核苷酸（SEQ ID NO:60）序列如图6A所示。IIIb表位：氨基酸314-328的氨基酸（SEQ ID NO:57）和核苷酸（SEQ ID NO:61）序列如图6B所示。IIIb表位：氨基酸340-351的氨基酸（SEQ ID NO:58）和核苷酸（SEQ ID NO:62）序列如图6C所示。
[0489] 实施例1.2：FGFR1:异构体FGFR1L（缺失外显子7&8；105氨基酸；Ig-II部分和Ig-III部分)
[0490] 成纤细胞生长因子受体1（FGFR1）的异构体结构如图7所示。位于连接点（junction）的表位的氨基酸（SEQ ID NO:10）和核苷酸（SEQ ID NO:9）序列如图8所示。
[0491] 实施例1.3：RON受体酪氨酸激酶：异构体RON△160
[0492] 巨噬细胞刺激受体1（RON）的异构体为组成性激活的。跳过外显子5和6在胞外域产生氨基酸109的框内缺失。
[0493] 表位位于外显子4和外显子7之间的连接点上。该表位的核苷酸（SEQ ID NO:11）和氨基酸（SEQ ID NO:12）序列如图9所示。
[0494] 实施例1.4：KIT受体酪氨酸激酶（在外显子11上的缺失）
[0495] 大部分胃肠道间质瘤，GISTs，在v-kit Hardy-Zuckerman4猫科动物的肉瘤病毒癌基因同源性（KIT）基因上具有致癌基因突变，这些影响激酶的近膜域的主要突变由外显子11编码。该表位的核苷酸（SEQ ID NO:13）和氨基酸（SEQ ID NO:14）序列如图10所示。
[0496] 实施例1.5：PDGF：异构体2（外显子6的框内缺失）
[0497] 血小板衍生生长因子（PDGF）异构体2具有外显子6的框内缺失。该表位的核苷酸（SEQ ID NO:15）和氨基酸（SEQ ID NO:16）序列如图11所示。
[0498] 实施例1.6：PDGFR-α：δ-外显子7和8（氨基酸374-456）
[0499] 血小板衍生生长因子受体α（PDGFR-α）具有外显子7和8的缺失。该表位的核苷酸（SEQ ID NO:17）和氨基酸（SEQ ID NO:18）序列如图12所示。
[0500] 表1.用于异构体特异性抗体的表位的序列
[0501] 阴影区=核苷酸序列 空白区=氨基酸序列
[0502]
[0503] 实施例2：FGFR2异构体特异性抗体的产生
[0504] 从市面上可获得异构体非特异性的FGFR2抗体。然而，这些抗体在不同异构体中不能明显区分出。为了研究异构体蛋白质分布以及对肿瘤和正常组织的作用，设计了用于FGFR2-IIIc和IIIb（图1）的抗体识别异构体特异性序列。通过常见的杂交瘤技术，生产单克隆抗体。简单地，分别基于SEQ ID NOs:19和63的基因序列，PCR扩增或化学合成编码序列。接着将DNA片段克隆至商用真核表达载体。该表达载体用于5只小鼠的基因免疫，用于每种抗原。ELISA测试测得的血清效价大于40000倍的免疫小鼠用于与骨髓瘤SP2/0细胞融合，以产生杂交瘤克隆。
[0505] 通过ELISA和蛋白质印迹法筛选单克隆抗体的亲和力和特异性。每种异构体的多个单克隆抗体克隆进一步的特征为对靶受体的结合特异性、亲和力和IC50（50%抑制的浓度）。受体被制备为全长膜结合受体（用于基于细胞的测试）或与人IgG Fc融合的胞外域的可溶性形式（用于基于ELISA的测试）。选择FGFR2IIIc的阳性单克隆抗体克隆，基于以下标准进一步研究（i）未检测到与FGFR2IIIb异构体的交叉反应，（ii）基于EC50值，对它的受体的纳摩尔亲和力，（iii）在前列腺肿瘤、其它肿瘤和正常组织对照组中的染色轮廓。通过类似标准选择抗-FGFR2IIIb单克隆抗体克隆，并用作体外实验研究的对照，以及用于正常组织和肿瘤组织的IHC染色。
[0506] 通过常规方法，可将这些单克隆抗体人源化。例如，人源抗-FGFR2异构体特异性抗体可通过取代Fv可变区的序列来生成，未直接参与来自人Fv可变区的等同 序 列的 抗 原结 合，如 Morrison,S.L.,1985,Science229:1202-1207，和Oi et al.,1986,BioTechniques4:214， 和 Queen et al.,US5,585,089,US5,693,761 和US5,693,762所描述的，其全部内容通过参考引入此处。人源抗-FGFR2异构体特异性抗体也可通过CDR移植或CDR替换产生，其中免疫球蛋白链中的一个、两个或所有CDRs都被取代，如U.S.专利5,225,539;Jones et al.,1986Nature321:552-525;Verhoeyan et al.,1988Science239:1534;Beidler et al.,1988J.Immunol.141:4053-4060；Winter US5,225,539中所述，其全部内容通过参考引入此处。
[0507] 所述抗FGFR2异构体特异性抗体也可以通过噬菌体展示技术来产生。在本领域已知噬菌体展示技术可生产抗FGFR2异构体特异性抗体。（如以下文献中所述：Ladner等的美国专利5,223,409;Kang等的国际专利公布号为WO92/18619的专利申
请;Dower等的国际专利公布号为WO91/17271的专利申请;Winter等的国际专利公布号为WO92/20791的专利申请;Markland等的国际专利公布号为WO92/15679的专利申请;Breitling等的国际专利公布号为WO93/01288的专利申请;McCafferty等的国际专利公布号为WO92/01047的专利申请;Garrard等的国际专利公布号为WO92/09690的专利申请;Ladner等的国际专利公布号为WO90/02809的专利申请;Fuchs et al.,(1991)Bio/Technology9:1370-1372;Hay et al.,(1992)Hum Antibod Hybridomas3:81-85;Huse et al.,(1989)Science246:1275-1281;Griffths et al.,(1993)EMBO J12:725-734;Hawkins et al.(1992)J Mol BioI226:889-896;Clackson et al.(1991)Nature352:624-628;Gram et al.,(1992)PNAS89:3576-3580;Garrad et al.,(1991)Bio/Technology9:1373-1377;Hoogenboom et al.,(1991)Nuc Acid Res19:4133-4137;以及Barbas et al.,(1991)PNAS88:7978-7982,其全部内容通过参考引入此处）。
请;Dower等的国际专利公布号为WO91/17271的专利申请;Winter等的国际专利公布号为WO92/20791的专利申请;Markland等的国际专利公布号为WO92/15679的专利申请;Breitling等的国际专利公布号为WO93/01288的专利申请;McCafferty等的国际专利公布号为WO92/01047的专利申请;Garrard等的国际专利公布号为WO92/09690的专利申请;Ladner等的国际专利公布号为WO90/02809的专利申请;Fuchs et al.,(1991)Bio/Technology9:1370-1372;Hay et al.,(1992)Hum Antibod Hybridomas3:81-85;Huse et al.,(1989)Science246:1275-1281;Griffths et al.,(1993)EMBO J12:725-734;Hawkins et al.(1992)J Mol BioI226:889-896;Clackson et al.(1991)Nature352:624-628;Gram et al.,(1992)PNAS89:3576-3580;Garrad et al.,(1991)Bio/Technology9:1373-1377;Hoogenboom et al.,(1991)Nuc Acid Res19:4133-4137;以及Barbas et al.,(1991)PNAS88:7978-7982,其全部内容通过参考引入此处）。
[0508] 实施例3：可溶性FGFR2IIIc-Fc受体的产生
[0509] 将DNA序列编码的人FGFR2-β（IIIc）蛋白（SEQ ID NO：54的核苷酸1-786）的胞外域融合入人IgG1的羧基末端Fc区。该两个基因片段通过来自限制性内切酶（Bgl-II）的6核苷酸连接器（nucleotide linker）连接起来，该限制性内切酶产生两个氨基酸残基，精氨酸和丝氨酸。全序列编码491氨基酸的多肽。信号序列为21氨基酸，因此该嵌合体的成熟蛋白为470氨基酸的长度。计算的分子量为52.81千道尔顿（kDa）。
[0510] 该融合蛋白的结构如图13A所示。
[0511] 可溶性FGFR2IIIc-Fc融合蛋白的核苷酸（SEQ ID NO:54）和氨基酸（SEQ ID NO:55）序列分别如图13B和13C所示。
[0512] 融合蛋白通过在CHO宿主细胞中产生稳定的细胞株而表达。该重组蛋白是可溶性的，且在培养基中被分泌。通过在还原条件下分析SDS-PAGE，所述重组蛋白的迁移约为95kDa蛋白，大概结果为糖基化（图13D）。在图13D中，条带7展示了分子量标准。在印迹上（条带1-6,8-14）分析13个克隆细胞株。来自每个克隆的条件培养液（20微升/条带）在SDS-PAGE凝胶上爬行，然后转移进行蛋白质印迹法（Western blot）。该印迹由第二抗体，山羊抗人IgG偶联碱性磷酸酶染色。条带3、10、11和14展示了来自稳定克隆数1D2、1F5、
1F7和1F10的FGFR2β-ECD的Fc融合蛋白的阳性表达。
1F7和1F10的FGFR2β-ECD的Fc融合蛋白的阳性表达。
[0513] 克隆1D2用作产生用于蛋白纯化的细胞条件培养液的细胞株。在72小时的细胞培养后，收集细胞条件培养液的上清液。使用蛋白G琼脂糖快速流（GE Healthcare,Life Sciences-Products），根据经销商的方法，通过亲和层析纯化FGFR2β-ECD的融合蛋白。如图13E所示，通过配体结合实验证明了纯化的可溶性受体的功能活性。将配体蛋白FGF8b以2微克/毫升涂敷至ELISA板上，于4℃下过夜。用含有0.05%吐温-20（PBST）的PBS冲洗涂层板，然后在室温下将其在含有2%BSA的PBST缓冲液内阻断2小时。随后，将浓度为4微克/毫升的纯化的融合蛋白FGFR2β-ECD的制剂结合至涂敷在所述板上的FGF8b。通过加入第二抗体，山羊抗人IgG Fc偶联辣根过氧物酶（HRP）以及使用显色基质3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)来检测该结合。在ELISA板读数仪上检测吸收波长450nm处的信号。
[0514] 在图13E中，将4微克/毫升的蛋白G纯化的可溶性融合受体FGFR2cβ-ECD的两种不同制剂（制剂A和制剂B）加入所述板上，100微升/孔。在室温下孵化60分钟后，用山羊抗人IgG Fc-HRP和TMB基质来检测该结合。在一个板读数仪上检测450nm的信号。结果显示，在ELISA结合实验中，纯化的可溶性受体的两种制剂均显示出对其配体FGF8b类似的结合活性。
[0515] 图13E描述的实验方法用于测定抗体抗FGFR2IIIc对于阻断配体结合至异构体受体FGFR2IIIc的抑制活性。FGF8b是一种用于受体FGFR2的异构体IIIc的特异性生长因子配体，没有检测到它结合至相同受体的IIIb异构体（数据未示出；Zhang et al.,(2006)J Biol Chem.281,
[0516] 15694-15700）。
[0517] 为了证明小鼠单克隆抗体Mo-3B6（文中也称为“Atto-MuMab-03”）可阻断受体FGFR2IIIc的配体结合，在所述单克隆抗体Atto-MuMab-03存在或不存在时，进行如图13E所描述的配体结合实验。在将其添加至所述配体（FGF8b）涂层板之前，用FGFR2IIIc-ECD-Fc预孵化Atto-MuMab-03。通过第二抗体偶联HRP（山羊抗人IgG Fc-HRP）在不同浓度的Atto-MuMab-03存在下，或不存在下，检测FGFR2IIIc与配体的结合。如图13F所示，抗体Atto-MuMab-03表现了在配体结合活性上对受体FGFR2IIIc的特异性和浓度依赖性的抑制。阴性对照小鼠抗体、无关的单克隆克隆、被称为5D3对于受体FGFR2IIIc结合至配体未表现出明显的阻断效果。
[0518] 实施例4：FGFR2IIIc肽的生成
[0519] FGFR2IIIc的异构体特异性肽可通过标准的重组或固相合成来产生。
[0520] 例如，具有如表1和图6A-6C所示的氨基酸序列的肽可通过将相应的核苷酸序列克隆至实施例2所描述的表达载体上生成。
[0521] 或者，可通过固相或液相肽化学反应的标准方法来合成肽。该固相技术的概述可以在以下文献中发现：Stewart and Young(1963)Solid Phase Peptide Synthesis，W.H.Freeman Co.(San Francisco), 和 Meienhofer(1973)Hormonal Proteins and Peptides,Academic Press(纽约)。对于经典的液相合成，可参见Schroder and Lupke,The Peptides,Vol.1,Academic Press(纽约)。一般而言，一种或多种氨基酸或适当保护的氨基酸可相继加入增长的肽链。随后将所述保护的氨基酸连接至惰性固体载体或通过加入在序列中具有补充基团（氨基或羧基）的下一个氨基酸而在溶液中利用，该补充基团可适当的保护并在一定条件下适合形成酰胺键。该保护基团随后从新加入的氨基酸残基中去除，且下一个氨基酸（被合适的保护）被加入，等等。当所有理想氨基酸已经连接至适当序列，依次或同时去除任何残留的保护基团（以及任意固体载体），以获得最终的肽。一次可将多个氨基酸加入生长链，例如，在脱保护之后，通过将保护的三肽与合适保护的二肽结合（在没有外消旋中心的情况下），以形成五肽。
[0522] 实施例5：以前列前癌中成纤细胞生长因子受体2（FGFR2）异构体IIIc为靶向的抗体分子的测试
[0523] 该实施例评估了在前列腺癌模式中，对抗FGFR2IlIc的抗体药物（抗FGFR2-IlIc抗体）的治疗可行性。所述抗体的分子靶点，FCFR2异构体IIIc，已经与雄激素非依赖性的肿瘤的生长和转移相关。这种方法基于该受体在激素抵抗性前列腺癌（HRPC）的高表达水平，它的关键在于提高肿瘤细胞的入侵行为（上皮向间质转化，EMT）。设计这种异构体特异性抗体药物的目标在于以肿瘤上的FGFR2受体的“坏异构体”为靶向（targeting），但是不去管在正常前列腺上皮上、具有抑制肿瘤生长功能的“好异构体”FGFR2-IIIb。
[0524] 细胞株
[0525] 本研究使用的雄激素非依赖性人前列腺癌细胞DU145（ATCC）和DU9479（Duke University）都是表现出转移性能和雄激素非依赖性生长的良好的特征细胞株。DU145来源于前列腺癌转移至大脑的癌（Stone et al.(1978)Int.J.Cancer21:274-281）。该细胞株表现了显著的FGFR2-IIIc（Carstens et al.,(1997)Oncogene15,3059-3065）。它常被用于肿瘤生长和血管生成的动物模型研究中（Garrison et al.,(2007)
Cancer Res.67:11344-11352;Russel and Voeks(2003)Methods in Molecular
TM
Medicine :"Prostate Cancer:Methods and Protocols"Animal Models of Prostate Cancer.Page89-112）。其它人前列腺肿瘤株，如PC-3（激素非依赖性）或LNCaP（激素依赖性，表达IIIb）在一些工作中用作对比或阴性对照。DU9497是另一种雄激素不敏感柱，包括全部的FGFR2IIIc异构体（Carstens et al.,(1997)Oncogene15,3059-3065）。
Cancer Res.67:11344-11352;Russel and Voeks(2003)Methods in Molecular
TM
Medicine :"Prostate Cancer:Methods and Protocols"Animal Models of Prostate Cancer.Page89-112）。其它人前列腺肿瘤株，如PC-3（激素非依赖性）或LNCaP（激素依赖性，表达IIIb）在一些工作中用作对比或阴性对照。DU9497是另一种雄激素不敏感柱，包括全部的FGFR2IIIc异构体（Carstens et al.,(1997)Oncogene15,3059-3065）。
[0526] 对于体外细胞实验中，DU145适合大部分实验，包括增殖和受体激活实验。对于配体结合实验，使用表达重组FGFR2IIIc靶点的转染细胞。
[0527] 单克隆抗体抗FGFR2IIIc和IIIb是生产出来并描述了特征的（文中分别称为“Ab-1”或“Atto-MuMab-01”以及“Ab-2”或“Atto-MuMab-02”）。其它生化试剂（FGFs）和免疫化学试剂（如磷酸酪氨酸抗体、Grb2,ERK1/2,STAT1和SHP2的信号分子）可从不同商业供应商处购买。
[0528] 使用激素非依赖性肿瘤株，DU145和DU9479对抗体分子进行体外和体内测试。可进行以下实验：
[0529] 1）测试Ab-1的体外活性及细胞机理
[0530] a．抑制受体激活和发出信号
[0531] b．阻断配体结合或受体二聚化
[0532] c．影响细胞增殖和凋亡
[0533] 2）测试Ab-1对人前列腺癌移植瘤物（xenografts）的体内功效
[0534] d．对抑制肿瘤生长、肿瘤血管生成的作用
[0535] 在该设计中开发具有双重功能的单克隆抗体Atto-MuMab-01。该抗体的作用模式可包括抑制功能，即阻断受体的激活，以及免疫功能，即诱导细胞毒性T细胞活性。Atto-MuMab-01结合至FGFR2IIIc受体的Ig类环3的异构体特异性区域。该区域涉及配体结合的特异性，如以前晶体结构分析所证明的（Shaun et al.,(2006)Genes&Dev.20:185-198）。预计抗体Atto-MuMab-01可阻断配体结合，因此抑制受体激活。
第二，所述抗体可激活人体的细胞免疫功能。这种抗体为人IgG1异构体（isotype），且可诱导出抗体依赖性细胞的细胞毒性（ADCC）的强烈的免疫反应，和/或补体介导的细胞溶解。
将Atto-MuMab-01设计在位于Fc区的从谷氨酸至丙氨酸的氨基酸333位上，以进一步提高所述抗体的ADCC活性。因此，当所述抗体结合至FGFR2IIIc阳性肿瘤细胞上时，它可以通过ADCC吸收细胞毒性的T细胞，以增加有效的肿瘤杀死活性。
第二，所述抗体可激活人体的细胞免疫功能。这种抗体为人IgG1异构体（isotype），且可诱导出抗体依赖性细胞的细胞毒性（ADCC）的强烈的免疫反应，和/或补体介导的细胞溶解。
将Atto-MuMab-01设计在位于Fc区的从谷氨酸至丙氨酸的氨基酸333位上，以进一步提高所述抗体的ADCC活性。因此，当所述抗体结合至FGFR2IIIc阳性肿瘤细胞上时，它可以通过ADCC吸收细胞毒性的T细胞，以增加有效的肿瘤杀死活性。
[0536] 因此，Atto-MuMab-01具备强大的抗肿瘤活性，同时，可具备有吸引力的安全特征。因为它严格地结合至IIIc阳性肿瘤，它可选择性的杀死肿瘤细胞，而对正常上皮组织不产生严重的副作用（表达IIIb异构体）。
[0537] 实施例5.1：用于FGFR2IIIc表达的验证试验
[0538] 在范围广泛的癌症细胞株，包括前列腺、膀胱、肺（NSCLC）和甲状腺中进行FGFR2IIIc表达的验证试验。也通过组织分布分析（IHC染色）研究FGFR2IIIc的表达。进行下面研究。
[0539] 证明特异性结合至前列腺肿瘤细胞，而不匹配正常的前列腺（Tissue Arrays compliant with FDA,from US Biomax,Rockville,MD20849;Multi-Tumor Microarrays from Invitrogen）。
[0540] 用IHC染色30种器官组织阵列，以证明与健康组织无交叉反应（Tissue Arrays from US Biomax,Rockville,MD20849）。
[0541] 实施例5.2：构建FGF8-SEAP
[0542] 进行该构建，以便于灵敏的、非标记配体结合实验。对从cDNA模板克隆的FGF8b的编码序列（SEQ ID NO：66）进行PCR，并插入市售表达载体中的分泌型碱性磷酸酶基因后面。将10氨基酸GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:59)的灵活的连接器加入所述两个片段中，并将其标签插入所述融合蛋白的C端，以便于蛋白纯化。所得融合蛋白FGF8-SEAP可在细胞上清液中容易的被制备制成分泌型，其可直接用于大部分的实验。为了定量酶活性，纯化的SEAP（商用）用作标准，化学发光的基质用于测定光信号。SEAP活性直接与所述配体FGF8b的量相关。
[0543] 实施例5.3：细胞机理的体外研究
[0544] 已建立的抗癌抗体药物，例如赫赛汀（用于乳癌的抗Her2受体）以及艾比特思（用于头部和颈部癌症的抗EGFR受体），通过不同机理表现抗肿瘤活性。这些机理包括阻断受体信号，影响配体受体结合，触发细胞凋亡，以及通过ADCC或补体介导裂解诱导细胞毒作用（Baselga et al.,(2001)Semin Oncol.5Suppl16:4-11;Trauth et al.(1989)Science245:301;Yang et al.(1999)Cancer Res.59:1236）。在这种情况下，可通过几个体外实验来研究Ab-1对前列腺癌细胞的抗肿瘤活性，目的是提供理解在前列腺癌细胞中的药物细胞机理的信息。
[0545] 为了提供理解抗体对肿瘤细胞的作用的细胞机理，可检查细胞功能的三个方面。
[0546] A．抗体Ab-1对FGF信号的阻断效果
[0547] 受体激活实验-剂量依赖性抑制：可检查在DU145细胞中，FGFR2受体激活的抗体的中和活性。已知DU145表达FGFR1、FGFR2IIIc（显著的）和FGFR4（Coombes et al.,(2000)Book“Endocrine Oncology”,Chapter12,237-253;Carstens et al.,(1997)Oncogene15,3059-3065）。FGFR2IIIc与FGF8和FGF2结合并有响应，但是异构体IIIb受体对这些生长因子并不响应（Zhang et al.,(2006)J Biol Chem.281:15694-15700）。受体的激活可以磷酸化增加来分析，可通过对细胞裂解物（cell lysate）的蛋白质印迹分析来分析。在一些情况下，有必要通过与所述抗受体FGFR2IIIc的免疫沉淀反应，从全细胞裂解物中“拉下”所述受体。在SDS凝胶上分析所得免疫沉淀物，随后使用抗磷酸酪氨酸抗体进行蛋白质印迹法。
[0548] 为了获得IC50值的剂量依赖性抑制曲线，在与FGF8竞争之前，用或不用浓度增加的抗体孵化DU145。抗体的浓度范围可凭经验确定，这由具体细胞的抗体亲和力和受体的表达水平决定。可通过磷酸化的受体的定量（例如光密度扫描）来建立抗体抑制曲线，从而通过这些分析，可推导出受体激活的抗体抑制的IC50值。
[0549] 此外，通过分析FGFR2的信号分子或效应物，如Grb2、ERK1/2、p38或STAT1，来检查下游信号事件。这些额外的读数可用于确定数据。受体激活，以及磷酸化分析，这些结果提供药物潜在效力的信息。
[0550] 这些数据可证明抗体Ab-1是否具有中和活性。理论上，所述抗体可与结合至所述受体的配体竞争，或者它可阻断受体二聚化。二者都可给出抑制受体激活和受体信号的相同读数。以下实验用于解答这些问题。
[0551] B．阻断配体结合或受体二聚化的作用
[0552] 以前报道的FGFR2晶体结构分析（Olsen et al.,(2006)Genes&Dev.20:185-198）表明C’端环3的一半，由可替换的外显子8编码，参与所述受体的配体结合的特异性。IIIc异构体的环3结合至FGF8，但是IIIb的环3结合至FGF7。然而，报道还称所述受体的环2也可促进配体结合。因此，有必要通过实验获得直接证据，证明是否Ab-1通过结合至其环3的一半的C’端的表位，来完全阻断配体FGF8结合至它的受体FGFR2IIIc。配体结合的抗体抑制的实验如下进行。
[0553] 分别地，另一个作用—是否抗体结合至受体可影响受体的二聚化，可检测受体激活和发送信号的前提步骤。同时，这些分子间相互作用分析可为抗体的作用模式的分子机理提供详细的解释。
[0554] 配体结合实验
[0555] 为了评价抗体对配体结合的抑制，将表达所述受体FGFR2-IIIc的转染HEK293用于96孔板实验中。开发非放射性和敏感的发光实验来检测配体与其受体的结合。该实验设计(assay format)包括使用注入分泌型碱性磷酸酶、FGF8-SEAP的重组FGF8（如上所述）。该实验设计通过强劲的发光信号使配体受体结合事件以即时酶的读出。根据以前报道的配体结合条件，可使用的FGF8-SEAP的浓度范围为20pM至5nM（Zhang et al.,(2006)J Biol Chem.281:15694-15700）。加入浓度为10μg/ml的肝磷脂，以便于FGF8结合至所述受体。通过加入SEAP的化学发光的基质（来自Applied Biosystems的 或来自KPLTM
的PhosphaGLO ），可直接定量所述受体结合配体，用酶标仪来测定（Luminoskan,Thermo Scientific）。
的PhosphaGLO ），可直接定量所述受体结合配体，用酶标仪来测定（Luminoskan,Thermo Scientific）。
[0556] 从竞争实验中获得IC50值，其中抗体Ab-1与浓度为1pM至100nM的细胞预孵化。然后，将配体SEAP-FGF8加入该细胞培养液中。SEAP信号的剂量依赖性降低意味着抗体与配体竞争受体上的结合位点。
[0557] 统计分析--可通过用非线性回归拟合具有可变斜率的S型曲线分析统计-结合曲线。分组数据报告为平均+/-SD或SEM。
[0558] 受体二聚化实验
[0559] 已知FGFs结合至它们的受体，以诱导受体二聚化。这可通过化学交联剂，例如交联剂SDP（琥珀酰亚胺基丙酸酯）来证明。基于非还原性SDS凝胶上的表观分子量区分单体和二聚体受体，随后进行蛋白质印迹法。来自未处理细胞的受体应该以单体（92Kda）存在。FGF8处理的细胞应该显示为主要的二聚体（约180Kda）。
[0560] 为了检查抗体Ab-1是否可阻断受体的二聚化，将表达FGFR2IIIc的转染细胞（在6孔培养板中）与抗体在0、EC50和饱和浓度下预孵化。无关的抗体可作为阴性对照。在抗体预孵化之后，将FGF8加入细胞中，以诱导受体的二聚化。然后向细胞中加入化学交联剂DSP，在室温下额外孵化10至15分钟。最后，制备细胞裂解物，并利用抗-受体抗体进行蛋白质印迹分析。印迹表明主要的受体单体在未刺激的细胞中，增加的二聚体在FGF8刺激的细胞中（没有Ab-1处理）。用阴性对照抗体的预孵化没有减少FGF8刺激样品中的二聚体的量。比较Ab-1处理的细胞与用阴性对照抗体处理的细胞在FGF8诱导之后，二聚体的减少。
该数据提供了Ab-1抗体是否阻断受体二聚体形成的证据。
该数据提供了Ab-1抗体是否阻断受体二聚体形成的证据。
[0561] C．Ab-1对细胞增殖和细胞凋亡的作用：
[0562] 可评估抗体Ab-1的抗增殖作用。此外，可分析抗体Ab-1对肿瘤细胞的促细胞凋亡作用。
[0563] 增殖实验：
[0564] 使 用 前 面 描 述 的 MTT 实 验（Mosmann et al.,(1983)J.lmmunol.Methods,65:55-63）在96孔板上分析来自前列腺癌的几个细胞株，包括PC-3,DU145和LNCaP。MTT提供在细胞中的线粒体脱氢酶活性的测量，从而提供细胞增殖状态的指示。
[0565] 呈指数增长的细胞可以2000-3000细胞密度播种在96孔板的孔中。将nM范围的AB-1加入具有培养基的孔中，并孵化48小时。将MTT（1mg/ml）加入所述细胞中，在37℃下孵化2小时。细胞裂解，并在酶标分析仪上测定染料在600nm处的吸光度。
[0566] 细胞凋亡的评估：
[0567] 用如前面所述的方法（Reid et al.,(1996)J lmmunol Methods,192:43-54），使用亲脂性染料MC540结合DNA染色染料Hoechest33342，可检查抗体Ab-1对肿瘤细胞上细胞凋亡的诱导作用。MC540检查早期的细胞凋亡（即质膜上的构象变化）。用前述用于增殖实验类似的方式，用抗体处理肿瘤细胞。通过加入染料MC540来测定膜的变化。为了进一步评价凋亡细胞中的生化改变，申请人通过蛋白质印迹法检查了半胱天冬酶-7的激活型的表达。可从Cell Signaling Technology购买抗-半胱天冬酶-7。
[0568] 实施例5.4：体内实验中，Ab-1对人肿瘤移植瘤物的作用
[0569] 用DU145移植物可检查Ab-1对裸鼠的激素非依赖性的肿瘤的体内疗效。端点（endpoints）包括肿瘤体积、重量、肿瘤血管和转移指数。还可分析其它读数，如存活期、免疫反应和毒理实验。
[0570] d．在移植瘤物中对肿瘤生长和/或肿瘤血管生成的阻断作用
[0571] 每两天检查参与实验的小鼠毒性和不适的标记，包括重量、活跃程度、皮肤异常、痢疾和一般外貌。
[0572] 可使用用DU145前列前癌细胞建立的皮下（s.c.）肿瘤移植瘤物模型（Coombes et al.,Book"Endocrine Oncology",Edited by Stephen P.Ethier.Chapter12,237-253）。简6 3
单地，将5x10 肿瘤细胞接种至6周龄的裸鼠，并使肿瘤长大至1cm（对于DU145为3-4周）。
3
将100mm 体积的肿瘤片段移植至小鼠。每3天，用卡尺从外部测量肿瘤的生长。将荷瘤小鼠分成3组，每组10只。可用紫杉醇处理组1，作为阳性对照组。可用10mg/kg的抗体Ab-1处理组2，每周2次，腹腔内注射，连续5周。可用媒介物处理组3，作为阴性对照组。通过外部测量监控肿瘤的生长。从眼窝丛取肝素化血液样本，用于确定血浆Ab-1浓度。
单地，将5x10 肿瘤细胞接种至6周龄的裸鼠，并使肿瘤长大至1cm（对于DU145为3-4周）。
3
将100mm 体积的肿瘤片段移植至小鼠。每3天，用卡尺从外部测量肿瘤的生长。将荷瘤小鼠分成3组，每组10只。可用紫杉醇处理组1，作为阳性对照组。可用10mg/kg的抗体Ab-1处理组2，每周2次，腹腔内注射，连续5周。可用媒介物处理组3，作为阴性对照组。通过外部测量监控肿瘤的生长。从眼窝丛取肝素化血液样本，用于确定血浆Ab-1浓度。
[0573] 在实验结束后，切除肿瘤并称重，并固定于福尔马林中。收集以下端点数据：
[0574] 1.肿瘤湿重（克）
[0575] 2.第二位置的转移-淋巴结、肺、胰、脾、肾、肾上腺，横膈膜，骨和脑[0576] 3.对在肿瘤上表达的靶点FGFR2IIIc的固定样本的免疫组化染色分析，FGFR2IIIc的激活/磷酸化，以及Ab-1在肿瘤上的积累（通过IHC方法使用抗人抗体染色）[0577] 4.利用抗-CD31染色（Dako）评估血管分布。在5个不同领域计算阳性血管[0578] 内皮细胞。
[0579] 统计分析：肿瘤体积计算为V=(L2/I)/2，其中L和I代表较大或较小的肿瘤直径。肿瘤的端点测量是以克为单位的湿重。利用ANOVA进行统计比较，以分析不同值之间的意义。进行卡尺量和湿重的回归分析。分组数据以平均+/-SD或SEM报告。P值<0.005为显著的。实施例5.5：可选择的策略
[0580] a.移植瘤研究：
[0581] 对于转移性HRPC，在疾病发展中涉及复杂的机理和多个阶段。涉及FGFR2IIIc的疾病的机理的关键阶段可通过Ab-1来探索，在已建立的移植瘤模型中可证明Ab-1的抗肿瘤活性。该研究可用于确定单克隆抗体在肿瘤模型中的活性。进一步的研究可能需要使用不同的肿瘤接种方法，如原位接种或心脏内注射，从而在肿瘤转移的主要阶段进行解剖分析。
[0582] 除了DU145移植瘤，也可使用其它具有靶受体高表达的CaP肿瘤株。
[0583] 或者，可使用邓宁大鼠前列腺癌模型以及AT-3激素非依赖性细胞株。该模型系统已经被广泛用于研究FGFR2异构体的功能/调节，并被认为与人HRPC相关（Sebastian et al.,(2006)PNAS103:14116-14121;Muh et al.,(2002)JBC277:50143-50154;Carstens et al.,(2000)MCB,20:7388-7400）。该方法可被评估以确定单克隆抗体，Ab-1和Ab-2（分别为抗FGFR2IIIc和抗FGFR2IIIb）与大鼠受体的交叉反应。在IIIc（Human:amino acids301-353of SEQ ID NO:2;Rat:SEQ ID NO:67）和IIIb（Human:amino acids301-351of SEQ ID NO:65;Rat:SEQ ID NO:68）的选择性剪切区（alternatively spliced region）的氨基酸序列在人和大鼠之间完全保守（图14）。
[0584] B．体外研究
[0585] 除了DU145细胞，具有低内源性FGFR2IIIc表达的转染细胞可用于体外研究。
[0586] 实施例5.6：其它实验
[0587] 其它实验，包括从体外研究中测试Ab-1的免疫作用，以及在单克隆抗体处理过的肿瘤细胞中，测试T细胞介导的细胞毒性。另外，可对结合使用抗体和FGFR选择性酪氨酸激酶抑制剂（TKIs），例如R04383596或Pazopanib（如图15所示）的双靶向策略（dual targeted strategy）进行分析。具体地，研究Ab-1对TKI耐药肿瘤细胞的作用。这种双靶向策略表明在EGFR靶向癌症中增加的抗肿瘤活性（Huang et al.,(2004)Cancer Res.64:5355-5362）。实施例6：FGFR2-IIIc作为用于前列腺癌中循环肿瘤细胞的潜在的生物标记物
[0588] 该实施例通过传统的、已批准的组织病理学方法，通过CTC检测呈阳性检查患者外周血细胞中的类似激素难治性前列腺癌的细胞株上的FGFR2IIIc受体的存在。利用异构体特异性引物集（primer sets）通过PCR方法来确认FGFR2IIIc表达的细胞阳性的肿瘤性质。该研究结果来识别肿瘤和转移依赖于FGFR2异构体IIIc表达的患者亚组，其，以及识别利用Ep-CAM的现有和批准的CTC测试的额外增加的特异性。
[0589] 具体地，该实施例评价了检测和丰富CTCs（或上皮向间质转化（ETM）的前列腺肿瘤细胞）的可行性，其表达具有异构体特异性抗体的致癌受体FGFR2异构体IIIc（FGFR2IIIc）。最初的重点在于对取自患有已知的转移性疾病的患者外周血、携带FGFR2IIIc的循环细胞进行识别和检测。一旦建立阳性检测和特异性数据，可在健康对照组、良性前列腺增生患者和前列腺癌患者中继续进行检测灵敏度的技术优化。
[0590] 以下为本实施例的具体目标：
[0591] 1）研究源自外周血的FGFR2IIIc阳性CTCs的存在，并确认这些细胞为癌细胞。
[0592] 2）通过免疫纯化丰富和分离FGFR2IIIc阳性CTCs。
[0593] 3）使用外显子特异性PCR引物，通过RT-PCR分析确定携带FGFR2IIIc受体的CTC的存在。
[0594] 该实施例为FGFR2IIIc作为识别前列腺癌CTCs的有效生物标记物的功效的可行性研究，CTCs用于诊断无症状的前列腺癌患者的转移性疾病和恶性肿瘤。进一步的研究集中于：
[0595] A.通过定量回收外周血样品中稀释的（spiked in）前列腺肿瘤细胞（FGFR2-IIIc阳性，例如DU145,PC3），优化所述检测方法。
[0596] B.在良性前列腺增生的TURP（经尿道前列腺切除术）之前及之后，计算前列腺切除手术之前和之后的患者的外周血中FGFR2IIIc阳性细胞。
[0597] C.从无症状和有症状的激素难治性前列腺癌患者收集大量数据集，以确定该测试的诊断值和预测值。
[0598] 实施例6.1：检测循环肿瘤细胞的测试的意义
[0599] 在血液或淋巴中传播的转移性肿瘤细胞为“循环肿瘤细胞”（CTCs），在骨髓中传播的转移性肿瘤细胞为“扩散的肿瘤细胞”（DTCs）。CTCs和DTCs代表独特的诊断和治疗靶点。循环肿瘤细胞在非恶性疾病的患者中极为罕见，但是却以非常广泛的概率存在于各种转移癌中（Allard et al.(2004)Clin Cancer Res.1O:6897-6904）。一些临床研究表明CTCs的评估可协助医生检查和预测癌症进展以及评价转移性癌患者对治疗 的 反 应（Berrepoot et al.,(2004)Ann Oncol.15:139-145;Aquino et al.,(2002)J.Chemother.14:412-416;Katoh et al.,(2004)Anticancer Res.24:1421-1425）。在去势抵抗性前列腺癌（CRPC）中对治疗后CTC计数和总生存期（OS）的关系的近期研究表明CTC计数预测OS在所有时间点都优于PSA递减算法（de Bono et al.,(2008)Clin Cancer Res.4(19):6302-9）。
[0600] 目前的CTC检测方法基于上皮性标记物，例如Ep-CAM可能漏掉FGFR2-IIIc阳性循环肿瘤细胞，因为FGFR2IIIc在前列腺癌细胞上的表达与上皮性标记物的缺失和间叶细胞标记物的获得有关（Moffa and Ethier(2007)J Cell Physiol.210(3):720-31）。
[0601] 用于单独或结合检测CTCs的几个常用的方法归类如下：
[0602] i）分子生物学：例如RT-PCR（逆转录PCR）
[0603] ii）免疫化学：例如抗体偶联的磁珠；免疫荧光显微镜；流式细胞仪（FACS）分析[0604] RT-PCR提供一种高灵敏度的方法来检测基因。但是，PCR检测活细胞、死细胞以及游离的DNA，存在潜在的假阳性。扩增的靶基因的特异性为其诊断值或预测值的限制因素。
[0605] 人们相信，在雄激素非依赖性肿瘤上发现的携带致癌受体FGFR2IIIc异构体的肿瘤细胞分别对侵入性肿瘤的生长，以及器官内传播引起的转移，以及血流引起的传染负责。通过FGFR2IIIc特异性抗体识别前列腺衍生循环肿瘤细胞（CTCs）为前列腺癌的诊断和分期的选择性步骤。在前列腺摘除术之后，在循环中仍然存在这些细胞可表明转移性疾病的发展。因此，该实施例展示的CTC检测可提供额外的灵敏度和特异性，用于为HPCR患者诊断转移。
[0606] 实施例6.2：在前列腺癌中CTC计数对总生存期的预测
[0607] 已知通过免疫磁性获取的延时间在基线上获取的CTC计数比PSA水平和变化更加可靠的预测总生存期不利的结果（de Bono et al.,(2008)Clin Cancer Res.14(19):6302-9;Danila et al.,(2007)Clin Cancer Res.13(23):7053-8）。在前列腺癌中，作为CTCs潜在的生物标记物的FGFR2IIIc的检测有助于理解前列腺癌和转移性疾病的分子机理。此外，该分析可提供用于目前未确认的HRPC亚群的特异性实验。
[0608] 实施例6.3：在正常血液中飙升的DU145肿瘤细胞的免疫磁性纯化
[0609] 为了纯化稀释于正常血液中的DU145肿瘤细胞，进行以下方法。
[0610] A．制备免疫磁珠：将FGFR2IIIc（在含有1%BSA的0.1mg/ml的PBS）的单克隆抗体固定在于磁珠上，该磁珠与山羊抗小鼠Fc（来自Becton Dickinson）通过在4℃下过夜孵化而预偶联。
[0611] B．肿瘤细胞加标稀释实验（spiking experiment）：PC12（FGFR2IIIc阴性），DU145（FGFR2IIIc阳性）肿瘤细胞用活体细胞的荧光染料钙黄绿素（来自Molecular Probes,Eugene,Oregon）预加载，在37℃下孵化5分钟。将标记细胞稀释于以下比率的7.5ml的正常血细胞中：1000细胞、500细胞、100细胞、50细胞、10细胞。这些标记细胞暴露于免疫磁珠，在荧光显微镜下通过20x放大或通过流式细胞仪FACS分析计算恢复的荧光细胞（recovered fluorescent cells）。恒定的恢复率证明FGFR2IIIc阳性细胞的免疫磁性选择的良好效果。
[0612] 实施例6.4：对来自前列腺癌患者的CTCs的检测和丰富
[0613] 这根据Veridex公布的方法和仪器（de Bono et al.,(2008)Clin Cancer Res.14(19):6302-9）。通过之前报道的方法，用患者的血液样本检测携带FGFR2IIIc的 CTCs（Berrepoot et al.,(2004)Ann Oncol.15:139-145;Aquino et al.,(2002)JChemother.14:412-416;Katoh et al.(2004)Anticancer Res.24:1421-1425;Allard et al.(2004)Clin Cancer Res.10:6897-6904;de Bono et al.,(2008)Clin Cancer Res.14(19):6302-9）。基本上，血液样本被吸入10ml EDTA真空采集管（Becton Dickinson），加入细胞防腐剂（Berrepoot et al.,(2004)Ann
[0614] Oncol.15:l39-145;Aquino et al.,(2002)J Chemother.14:412-416;Katoh et al.(2004)Anticancer Res.24:1421-1425;Allard et al.(2004)Clin Cancer Res.10:6897-6904;de Bono et al.,(2008)Clin Cancer Res.14(19):6302-9）。在收集之后，将样品保持在室温下，并在72小时内处理。将细胞与加载磁珠的抗FGFR2IIIc进行孵化。荧光核酸染料DAPI（4,2-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐）用于染色有核细胞。可通过细胞监视者分析仪进行FGFR2IIIc阳性CTCs的识别和计数，该细胞监视者分析仪为一种半自动荧光基显微系统，其使计算机产生细胞图像的重组。循环肿瘤细胞被计算为表达FGFR2IIIc的有核细胞。为了确定分离的CTCs的上皮细胞特性，用上皮细胞标记物细胞角蛋白19双重染色，用另一种荧光染料藻红蛋白（PE）标记。
[0615] 实施例6.5：FGFR2IIIc异构体的RT-PCR
[0616] 为了证明FGFR2IIIc阳性CTCs的免疫磁性选择的特异性，进行RT-PCR实验，以确认异构体FGFR2-IIIc在分离细胞中的表达。可使用包含RNase-Free DNase Set的RNeasy Mini试剂盒（Qiagen,Hilden，德国）分离RNA。为了逆转录，将RNA稀释于15μl的RNase-free水中，在65℃下孵化5分钟，并置于冰上。制备含有2μl的oligp（dT）15引物（0.8μg/μl），2μl的脱氧核苷三磷酸（5mM），0.5μl的RNAsin（40单位/μl），1μl的Omniscript逆转录酶（4.5单位/μl），和2μl的逆转录缓冲液（x10）的7.5μl的混合液，并将其加入所述稀释的RNA中。在37℃下孵化1小时，在95℃下破坏Omniscript逆转录酶的活性5分钟，将cDNA存储于-20℃。使用IIIc外显子特异性引物（(IIIc-F:
[0617] aggttctcaaggccgccggtgt(SEQ ID NO:71)和IIIc-R:caaccatgcagagtgaaagga(SEQ ID NO:72)；IIIb外显子特异性引物(IIIb-F:ggttctcaagcactcgggga(SEQ ID NO:69)和IIIb-R:
[0618] gccaggcagactggttggcc(SEQ ID NO:70)）作为参考进行PCR扩增。用于PCR分析的异构体特异性引物的设计如图16所示。肿瘤细胞、PC-3（IIIb阳性）和DU145（IIIc阳性）可用作PCR实验的阳性对照。所述PCR产物应该显示为在琼脂糖凝胶上的140碱基对频带。
[0619] 实施例6.6：其它实验
[0620] 其它实验包括优化该测试方法和评估/提升在HRPC患者临床结果中的CTCs计数的临床相关性。使用生物统计方法来进行数据分析和询问。
[0621] 实施例7：FGFR2IIIc作为生物标记物，用于检测激素难治性前列腺癌
[0622] 该实施例描述了用于检测侵入性、激素抵抗型前列腺癌的免疫组化染色（IHC）实验的建立。如所公开的，FGFR2异构体IIIc与雄激素非依赖性肿瘤的生长和转移相关，且它在前列腺癌组织的表面表达。
[0623] 开发了几种生物标记物用于前列腺癌的免疫组化（IHC）染色实验。这些包括前列腺特异性抗原（PSA），前列腺特异性膜抗原（PSMA），前列腺干细胞抗原（PSCA），雄激素受体（AR），嗜铬粒蛋白，突触小泡蛋白，MIB-1，以及α-甲酰基辅酶A消旋酶（AMACR）。这些标记物对于转移状态或转移潜能不是特异性的。FGFR2异构体IIIc和IIIb在活组织检查和手术切除标本中的表达的检查应该为激素难治性疾病和潜在的转移的患者提供额外的信息。
[0624] 前列腺癌细胞株DU145和LNCaP为最初从美国典型培养物保藏中心（ATCC）获得的。这些细胞培养物使用标准方法保持。
[0625] 具有匹配的正常前列腺组织芯片的前列腺癌，和人组织芯片可从美国Biomax（Rockville,MD20849）获得；多肿瘤基因芯片将从Invitrogen（CA）获得。这些组织应该符合FDA以及监管要求。患者的临床数据，例如Gleason评分以及疾病的病理阶段是可以得到的。患者的私人信息受到保护。
[0626] IHC实验可用于来自根治性前列腺切除术、或针刺活检（NBX）和经尿道前列腺切除术（TURP）的手术样本。
[0627] 该实施例的目的包括（i）使用固定于石蜡中作为细胞沉淀的肿瘤细胞株建立IHC实验方法；（ii）利用来自前列腺癌患者以及良性前列腺增生患者的组织样本评估该IHC诊断方法的功效。
[0628] 进行以下实验：
[0629] i．研究FGFR2的两种功能不同的异构体受体在前列腺肿瘤细胞株，DU145（IIIc阳性）和LNCaP（IIIb阳性）中不同的表达。证明mAbs对用于IHC应用的每种异构体的特异性和灵敏度。建立IHC方法。
[0630] ii．染色30器官组织芯片，从而利用来自US Biomax（Rockville,MD20849）的组织芯片研究IIIb和IIIc的不同的组织分布。
[0631] iii．前列腺癌和良性前列腺增生（BPHs）各检查约20例，以分辨肿瘤和非癌组织（来自Invitrogen，CA的肿瘤芯片）。
[0632] iv．分析IHC染色并确定分级和染色模式；例如阳性、阴性得分，以及FGFR2IIIc在肿瘤组织/细胞中的表达模式（与病理学专家共同工作）。
[0633] v.探索生物标记物与疾病严重程度的临床相关性，并评估使用阻断转移疾病的靶抗体药物的优点。
[0634] 该生物标记物也可与其它IHC组织标记物结合用于多生物标记物分析。
[0635] 实施例7.1：IHC染色方法
[0636] 下面描述用于FGFR2受体的mAbs一般染色方法。可以为抗FGFR IIIc或IIIb的每个mAbs优化实验条件。
[0637] 用石蜡包埋组织切片的免疫组化
[0638] 抗体：单克隆抗-FGFR2IIIc和抗-FGFR2IIIb抗体如上所述产生。单克隆抗-细胞角蛋白（Pan）克隆AE1/AE3抗体来自Zymed（San Francisco,CA），多克隆抗-PSA抗体来TM TM自Dako Cytomation。与过氧化酶，ChemMate ,DAKO Envision 检测试剂盒偶联的第二抗体来自Dako Cytomation（Denmark）。
[0639] 二氨基联苯胺（DAB）可用作色原体，随后进行Meyer's苏木精复染色。
[0640] I．切片的制备
[0641] 从DU145和LNCaP细胞制备细胞沉淀，固定于10%的福尔马林中过夜，然后以常规的方法处理成病理标本，以产生石蜡包埋的细胞块。通过商业供应商的石蜡块制备组织切片。
[0642] II.去石蜡化
[0643] 1.用铅笔清楚标记所有切片，指明抗体和稀释度。
[0644] 2.按如下方式去石蜡和水化：在二甲苯中5分钟，3次；100%乙醇中5分钟，2次；在95%乙醇中5分钟，2次；80%乙醇中5分钟，一次。
[0645] 3.在室温下将全部切片（sections）放置于内源性阻断液（甲醇+2%过氧化氢）20分钟。
[0646] 4.在去离子水中冲洗切片两次，每次5分钟。
[0647] 5.在pH7.4的磷酸盐缓冲盐水（PBS）中冲洗切片2次，每次5分钟。
[0648] III．阻断和染色
[0649] 1.在室温下用PBS/1%牛血清白蛋白（PBA）阻断所有切片1小时。
[0650] 2.将切片在稀释于PBA（2%）的兔血清中在室温下孵化30分钟，以减少抗体的非特异性结合。在密闭的湿度箱中进行孵化，以防止组织切片被空气干燥。
[0652] 4.在PBS中冲洗两次，每次5分钟，小心抖动。
[0653] 5.小心取出多余的PBS，并在室温下，在湿度箱中用稀释于PBA中的HRP偶联兔抗小鼠抗体覆盖切片30分钟至1小时。
[0654] 6.在PBS中冲洗切片2次，每次5分钟，轻轻抖动。
[0655] 免疫组化染色的评分：
[0656] 经验丰富的泌尿病理学家（专科医生）可评估染色切片。将开发一种基于染色强度的不同程度和细胞染色的百分比的评分方法。该评估将以双盲方式进行。
[0657] 统计分析：
[0658] 可利用Fisher’s精确检验评估与FGFR2表达和Gleason评分相关的单变量，以及雄激素非依赖性的临床阶段和级数。对于所有的分析，认为p<0.05为统计上显著的。
[0659] 实施例7.3：其它实验
[0660] 其它实验包括在AB-1作为前列腺癌的治疗药剂的临床开发中，患者的选择和特征分析的功效。
[0661] 对来自患者的更大的数据集的进行回顾性分析以及绘制具有疾病严重程度和临床病理学参数的生物标记物表达谱。
[0662] 实施例8：FGFR2IIIc特异性单克隆抗体的产生
[0663] 用DNA结构编码的40氨基酸FGFR2IIIc片段（SEQ ID NO:84；FGFR2IIIc的氨基酸残基314-353）或合成FGFR2IIIc特异性肽（TCLAGNSIGISFH(SEQ ID NO:86）免疫，纯化Balb-c小鼠，并使其与KLH偶联。
[0664] 在第一个方法中，融合在小鼠IgG Fc的羧基末端的40氨基酸片段（FGFR2的氨基酸残基313-352；AAGVNTTDKEIEVLYIRNVTFEDAGEYTCLAGNSIGISFH(SEQ ID NO:84)）用作免疫原。首要的，下划线的字母表示异构体FGFR2中独特的残基，与异构体FGFR2IIIb不同源。将核苷酸序列编码的40氨基酸FGFR2IIIc片段（SEQ ID NO:84;氨基酸残基313-352）插入来自Invivogen，San Diego CA的改良的载体聚乙酸乙烯酯（pVAC），结果产生FGFR2IIIc的胞外（EC）域的40氨基酸片段的膜结合表面表达。改良的pVAC-40-氨基酸载体用于DNA免疫。它表达为膜锚定蛋白。mFc-40氨基酸用作蛋白抗原。它从条件培养液中的转染CHO细胞纯化为分泌型蛋白。
[0665] 以下的PCR引物设计为用于克隆FGFR2IIIc的第1242至1361（nt）位的核苷酸序列的编码区：
[0666] 正向引物（包括BamH I位点）：ATAGGATCCTTGCCGCCGGTGTTAAC(SEQ ID NO:103)反向引物（包括EcoR I位点）：GCGGAATTCGTGAAAGGATATCCC(SEQ ID NO:104)
[0667] 为了产生FGFR2IIIc（40aa）-mFc，将核苷酸序列编码的FGFR2IIIc胞外（EC）域的40氨基酸片段（氨基酸残基314-353）与小鼠IgG1-Fc在框内融合。将以下PCR引物设计为对120bp片段编码的40氨基酸进行PCR反应。每个寡核苷酸引物序列包含限制性内切酶位点和3-端悬突。
[0668] PCR引物：
[0669] 正向引物（包括BamH I位点）：
[0670] ATAGGATCCTT GCCGCCGGTGTTAAC(SEQ ID NO:105)
[0671] 反向引物（包括EcoR I位点）：
[0672] GCGGAATTC GTGAAAGGATATCCC(SEQ ID NO:106)
[0673] 在第二种方法中，FGFR2IIIc的氨基酸残基337-352（TCLAGNSIGISFH;SEQ ID NO:86）的表位肽与KHL偶联，用作免疫原。首位和下划线的字母表示异构体FRFR2IIIc中独特的残基，与异构体FGFR2IIIb非同源。
[0674] 在其抗血清中具有高效价的免疫小鼠用于分离脾细胞。脾细胞与骨髓癌细胞株SP20/Ag-14（ATCC号CRL-1581）融合，以根据已建立的方法产生杂交瘤细胞（Georges Kohler and Cesar Milstein1975）。SP20/Ag-14细胞保持在Dulbecco改良的Eagle培养基，以及10%的胎牛血清中。首先在培养液中筛选出阳性杂交瘤群（hybridoma populations），用于阳性结合至在标准ELISA中与载体蛋白BSA偶联的FGFR2IIIc表位肽（TCLAGNSIGISFH(SEQ ID NO:86)）。进一步检测阳性克隆，用于结合至如以下实施例9所述的重组受体蛋白FGFR2IIIc-Fc。
[0675] 在ELISA中，将抗血清从1:1000稀释至1:27000，如下表2所示。使用与HRP偶联的山羊抗小鼠IgG检测涂敷在板上的抗原的结合。
[0676] 表2展示了检测信号的O.D值。
[0677] 表2.对来自表位肽免疫小鼠的抗血清效价的ELISA测试
[0678]
[0679] 通过有限稀释在96孔培养板中，获得单杂交瘤克隆。在显微镜下通过目视检查观察该单克隆。重复观察两次该过程，直至获得单克隆。
[0680] 利用小鼠抗体异构体试剂盒，根据制造商的说明（Sigma-Aldrich,Catalog number ISO-2）确定个体单克隆抗体的异构体。
[0681] 与KLH或BSA偶联的合成肽从GenScipt公司，Piscataway，NJ.获得。PCR引物和测序引物从SigmaGenosys,Sigma-Aldrich,St Louis,MO获得。与辣根过氧化酶（HRP）或碱性磷酸酶（AP）偶联的第二抗体均购自Santa Cruz Biotechnology Inc.,Santa Cruz,CA,或Sigma-Aldrich,St Louis,MO。
[0682] 结论：用对具有高效价（18000倍稀释）的异构体受体产生免疫反应的表位特异性肽，以及表位肽抗体识别的天然受体FGFR2IIIc产生的抗体对小鼠进行免疫。
[0683] 实施例9：筛选选择性结合至FGFR2IIIc的单克隆抗体
[0684] 进行杂交瘤的筛选实验，以选择选择性结合至FGFR2IIIc的mAbs，以及消除与异构体FGFR2IIIb交叉反应的克隆。利用FGFR2IIIc-Fc通过ELISA分析进行初步的筛选，以选择可与FGFR2IIIc异构体结合的杂交瘤。在第二次ELISA筛选中，用FGFR2IIIb-Fc来识别并排除与IIIb异构体对应的抗体。人IgG1用作阴性对照，以去除与人IgG的Fc部分交叉反应的任何抗体。
[0685] 下面描述ELISA方法。在聚苯乙烯微孔板（Maxisorb/NUNC,Roskilde,Denmark）上涂0.05M碳酸氢盐缓冲液（pH9.6）中的2μg/ml蛋白抗原，在4℃下过夜。用含有0.05%吐温20的磷酸盐缓冲盐水冲洗后，在室温下将板在1%的牛血清白蛋白阻断2小时。将杂交瘤每孔加入100μ1细胞分泌条件培养液，并在37℃下孵化1小时。然后冲洗所述孔，利用辣根过氧化酶偶联的山羊抗小鼠抗体（Santa Cruz Biotechnology,USA）检测结合抗体。
[0686] 在另一个基于ELISA的结合分析中，在被5μg/ml的山羊抗小鼠IgG预先涂敷的ELISA板上俘获单克隆抗体。进行冲洗或阻断步骤后，将与碱性磷酸酶（人PRL3-AP）同样融合的FGFR2IIIc（128氨基酸）-AP以及无关对照蛋白添加至板上，并在37℃下孵化1小时。在冲洗孔之后，通过添加用于碱性磷酸酶的基质，pNPP（Sigma-Aldrich）检测结合抗原。通过碱性磷酸酶与128氨基酸FGFR2IIIc片段（SEQ ID NO:107;FGFR2IIIc的氨基酸残基250-377）的羧基末端域的融合而产生FGFR2IIIc（128氨基酸）-AP，并从DNA结构pATTO-FGFR2I1Ic(128aa)-AP表达。模板cDNA克隆从Open Biosystems（BC039243;Protein ID:AAH39243）处订购。
[0687] 包含FGFR2IIIc的第三Ig类环的编码序列的所述克隆片段的氨基酸序列如下：（该2个位点"R"and"T"由载体上的克隆位点产生）：
[0688] RTERSPHRPI LQAGLPANAS TVVGGDVEFV CKVYSDAQPH IQWIKHVEKNGSKYGPDGLP YLKVLKAAGV NTTDKEIEVL YIRNVTFEDA GEYTCLAGNSIGISFHSAWL TVLPAPGREKEITASPDYLE(SEQ ID NO:82)
[0689] 设计以下PCR引物，用于克隆编码128氨基酸FGFR2IIIc片段的核苷酸序列：
[0690] 正向引物：GAGCGATCGCCTCACCGGCC(SEQ ID NO:108)
[0691] 反向引物：CTCCAGGTAGTCTGGGGAAGCT(SEQ ID NO:109)
[0692] 在另一个 基于ELISA的结合 分析中，使用2mg/ml的 FGFR2IIIc-Fc'和FGFR2IIIb-Fc'（购于R&D Systems,Inc.Minneapolis,MN；目录号：665-FR和684-FR）涂敷ELISA板（4℃下过夜孵化）。通过在室温下孵化1小时，将杂交瘤细胞条件培养液（100ml）中的单克隆抗体结合至涂敷的蛋白。利用HRP偶联第二抗体（山羊抗小鼠-HRP）检测结合，随后加入基质四甲基联苯胺（TMB）。测定450nm出的O.D.值。在筛选的25种克隆中，基于与FGFR2IIIc异构体的选择性结合，选择4种克隆。克隆4、9、16、21表现出与FGFR2IIIc的强烈的选择性结合，或者具有本底水平的结合（background level of binding），或者与FGFR2IIIb异构体非常弱的结合。测试来自杂交瘤细胞克隆-9和-21的单克隆抗体的异构体，所有抗体均为鼠科IgG2b。将这两种单克隆抗体分别设计为Atto-MuMab-01和Atto-MuMab-02。
[0693] 实施例10：结合至FGFR2IIIc的抗体的蛋白质印迹分析
[0694] 进行蛋白质印迹分析，以检测结合至可溶形式的FGFR2融合蛋白（Fc融合蛋白）、FGFR2IIIc-Fc或作为纯化蛋白或作为条件培养液中的CHO细胞分泌蛋白的FGFR2IIIb-Fc的特异性抗体。在8%的SDS-PAGE凝胶上对蛋白进行电泳分离，并涂抹至硝酸纤维素膜上（Amersham Pharmacia Biotech,Uppsala,Sweden）。在4℃，在磷酸盐缓冲盐水中用5%的脱脂牛奶过夜阻断非特异性结合。将硝酸纤维素膜与mAb Atto-MuMab-01在室温下孵化1小时，随后用辣根过氧化酶偶联的山羊抗小鼠IgG在室温下处理1小时。冲洗几次之后，通过添加显色底物DAB（DAKO,Carpinteria,Calif.,USA）进行处理。
[0695] FGFR2IIIc’和FGFR2IIIb’（IIIb’和IIIc’）的Fc融合蛋白的阳性对照购自R&D Systems,Inc.Minneapolis,MN;目录号:665-FR和684-10FR。通过转染CHO细胞制备FGFR2IIIb(IIIb)和FGFR2IIIc(IIIc)的融合蛋白，作为分泌蛋白。如实施例3所示，通过人IgG1-Fc（227氨基酸）与FGFR2IIIc（FGFR2IIIc的氨基酸残基1-262）的胞外（EC）域的羧基端框内融合产生FGFR2IIIc-Fc。设计以下PCR引物，用于克隆FGFR2IIIc的64至786（nt）位的核苷酸序列的编码区。
[0696] 正向引物（包括EcoR I位点）：AGAGAATTCGCGGCCCTCCTTCAGTTTAGT(SEQ ID NO:112)[0697] 反向引物（包括BglII位点）:
[0698] GTGAGATCTCTCCAGGTAGTCTGGGGAAGCT(SEQ ID NO:113)
[0699] 通 过 人 IgG1-Fc（SEQ ID NO:110;227 氨 基 酸） 与 FGFR2IIIb（SEQ ID NO:114;FGFR2IIIb的氨基酸残基32-289(SEQ ID NO:192)）的胞外（EC）域的羧基末端的框内融合产生FGFR2IIIb-Fc。设计以下PCR引物，用于克隆SEQ ID NO:193从94至867（nt）位的核苷酸序列的编码区：
[0700] 正向引物（包括EcoR I位点）：AGAGAATTCGCGGCCCTCCTTCAGTTTAGT(SEQ ID NO:115)[0701] 反向引物（包括Bgl11位点）：
[0702] GTGAGATCTCTCCAGGTAGTCTGGGGAAGC(SEQ ID NO:116)
[0703] 用 于 FGFR2IIIb 的PCR 扩 增 的DNA 模 板 购 自 Open Biosystems,Thermo Scientific,Huntsville AL(目录号IHS1380-8840381)。
[0704] 实施例11：结合至肿瘤细胞中的内源性蛋白的抗-FGFR2IIIc抗体
[0705] 该实施例展示了本发明的抗FGFR2IIIC抗体与如DU145和HepG2等的肿瘤细胞的结合。通过免疫沉淀反应（IP）分析细胞裂解物，然后进行蛋白质印迹法。
[0706] DU145，一种人前列腺癌细胞株，从ATCC获得（ATCC号HTB-81）。它最初来源于转移至大脑的人前列腺癌。将该细胞株在Eagle’s极限最低培养基和10%的胎牛血清中繁殖。
[0707] 通过免疫沉淀反应（IP）分析HepG2，肝癌细胞株，随后进行蛋白质印迹法。
[0708] 为了进行免疫沉淀反应，按照如下方法从DU145细胞或HepG2细胞的新鲜的培养液制备细胞裂解物。收获细胞，离心沉淀细胞，并将其再悬浮在含有50mM Tris（pH7.5），150mM NaCl，1%Triton-X100，10mM DTT和蛋白酶抑制剂混合物（PMSF、抑蛋白酶肽、亮抑酶肽、胃酶抑素）的裂解缓冲液中。将细胞在冰上的裂解缓冲液中孵化15分钟，然后在
10,000g、4℃条件下离心10分钟。该裂解上清液通过与Atto-Mu mAb-01或Atto-Mu mAb-B7（文中也称为“Atto-mu Mab-03”）在4℃过夜孵化，用于免疫沉淀反应。蛋白-A琼脂糖用于纯化免疫复合物，该免疫复合物随后通过SDS PAGE分离出来，然后按如下所描述的蛋白质印迹法进行分析。
10,000g、4℃条件下离心10分钟。该裂解上清液通过与Atto-Mu mAb-01或Atto-Mu mAb-B7（文中也称为“Atto-mu Mab-03”）在4℃过夜孵化，用于免疫沉淀反应。蛋白-A琼脂糖用于纯化免疫复合物，该免疫复合物随后通过SDS PAGE分离出来，然后按如下所描述的蛋白质印迹法进行分析。
[0709] 为了进行蛋白质印迹法，通过SDS-PAGE在8%聚丙烯酰胺凝胶上分析样品，随后电转染至硝酸纤维素膜（Amersham Pharmacia Biotech,Uppsala,Sweden）。在磷酸盐缓冲盐水中，4℃下，用5%的脱脂牛奶过夜阻断非特异性结合。然后将硝酸纤维素膜与Atto-Mu mAb-01或Atto-mu Mab-03在室温下孵化1小时，随后与辣根过氧化物酶偶联的山羊抗小鼠IgG在室温下孵化1小时。冲洗后，根据试剂盒（Amersham Pharmacia Biotech）说明处理印迹，以增强化学发光（ECL）。结果记录于X射线胶片上。
[0710] 图32描绘了蛋白质印迹，展示了mAb ATTO-mu Mab-03与肝癌细胞株，HepG2中的内源性FGFR2IIIc的结合。条带1和2：来自阳性对照稳定CHO表达的FGFRIIIc受体的胞质溶胶和细胞膜成分。条带3和4：HepG2的胞质溶胶和细胞膜成分。如图32所示，通过ATTO-Mu mAb-B7识别85KDa的表观分子量带。因此，单克隆抗体ATTO-Mu mAb-B7结合至肿瘤细胞中的内源性FGFR2IIIc。
[0711] 如图33所示，通过mAb Atto-Mu mAb-01识别110KDa的表观分子量带。50KDa和25KDa带分别为IgG重链和轻链，来自用于IP中的mAb。
[0712] 实施例12：小鼠单克隆抗体克隆与FGFR2的IIIc异构体的选择性结合
[0713] 血清效价高于16,000的免疫小鼠用于与骨髓瘤细胞SP2/0融合，以产生杂交瘤细胞。在HAT选择培养基中生长7-10天后，利用抗原涂敷板，例如128aa-mFc或40aa-mFc，通过ELISA筛选杂交瘤细胞。进一步测试用于IIIc或IIIb可溶性受体蛋白，FGFR2IIIcβ-ECD和FGFR2IIIbβ-ECD的异构体选择性的阳性结合剂（positive binders）。利用山羊抗小鼠IgG Fc-HRP测试单克隆抗体与涂敷在板上的可溶性受体的结合。图24A描述与指定的FGFR2IIIc克隆的强烈结合信号的条形图，然而检测到与FGFR2IIIb异构体的克隆较低或没有结合活性。在该图中，未去除背景信号（图24B）。克隆B7在本文中称为“Atto-Mu-Mab03”。
[0714] 实施例13：通过筛选噬菌体展示库分离人抗体scFv
[0715] 按照前面Sblattero D.et al.(2000)Nature Biotechnology18,74-
[0716] 80中所描述的制备包含约1至10×1010噬菌体抗体的人噬菌体展示库。为了筛选用于异构体特异性抗体的库，具有FGFR2IIIc表位插入位点（epitope inserts）（如实施例1.1所述）片段的融合蛋白用作生物洗脱过程中的诱饵。将融合蛋白构建在小鼠IgG Fc融合主干中，例如含有128氨基酸（氨基酸235-353），120氨基酸（mFc）或40氨基酸（氨基酸314-353）40aa-mFc的FGFR2IIIc异构体环3区。
[0717] 利用偶联至免疫管（Nunc,Rochester,NY）融合蛋白在4微克/ml下过夜进行噬菌体抗体的选择，在2%脱脂牛奶磷酸盐缓冲盐水（MPBS）中阻断，并用噬菌体抗体库（同样在MPBS中阻断）孵化1-2小时。在第一轮之后的冲洗包括5次PBS冲洗和5次PBS-0.1%吐温20的冲洗。通过在OD5500.5中添加1ml DH5aF洗脱噬菌体。洗脱之后，扩增细菌，并为进一步的选择步骤准备噬菌体。随后的冲洗更加严格，在第四轮之后，通过ELISA测试噬菌体抗体反应。图31展示了每轮富集的结合至靶蛋白的噬菌体的汇总表。
[0718] 为了检测抗体结合特异性，用噬菌体ELISA识别结合至靶蛋白的阳性克隆，例如128aa（mFc）。利用两种不相关的蛋白，人卵清蛋白（OA）和人铁蛋白（Fer）来检查阴性对照蛋白的非特异性结合。简单地，在四轮生物淘选和筛选之后，挑选出个体噬菌体克隆，然后在噬菌体ELISA中测试。图25A描述了对涂敷在ELISA板上的FGFR2IIIc-128aa的结合实验中的8个克隆检测的代表结果的条形图。使用涂敷在板上的人卵清蛋白（OA）和人铁蛋白（Fer）作为阴性对照蛋白。这些克隆表现出对FGFR2IIIc-128aa抗原蛋白的阳性结合，且没有检测出与不相关的对照蛋白人卵清蛋白（OA）和人铁蛋白（Fer）的结合。
[0719] 也可对用于特异性结合至靶向异构体受体FGFR2IIIc的个体噬菌体克隆进行噬菌体ELISA检测。利用ELISA格式进行结合测试。利用2微克/ml的可溶性受体FGFR2IIIcβ-ECD涂敷ELISA板。以相同浓度的相反的（counter）异构体受体融合蛋白FGFR2IIIbβ-CED用于交叉反应实验。卵清蛋白（OA）作为阴性对照。图27A-27B展示了可溶性scFv抗体对FGFR2IIIc结合与FGFR2IIIb结合的对比结果。用FGFR2IIIc-hFc（2微克/ml）或FGFR2IIIb-hFc（2微克/ml）涂敷ELISA板。将由scFv克隆制得的可溶性抗体结合至涂敷在板上的异构体受体。卵清蛋白（OA）作为阴性对照。在30个诱导克隆中，通过ELISA结合分析，8个克隆表现了对抗原FGFR2IIIc（128aa-mFc）的活性。测试这些克隆对异构体FGFR2IIIc的选择性。如图27A所示，8个克隆中的5个表现了对异构体IIIc的选择性结合。8个中的3个可结合至异构体IIIc和IIIb。
[0720] 为了确定噬菌体抗体克隆为具有不同编码序列的不同的克隆，利用DNA指纹图谱分析克隆。从一轮文库筛选中，通过DNA指纹图谱的模式分析101个克隆。对这些克隆进行CDR区的PCR扩增。利用CL-6B微柱分离PCR产物。利用限制性内切酶Mva1消化DNA产物。图26所示的DNA片段通过不同的DNA指纹图谱识别出30种个体克隆。
[0721] 对这些阳性克隆进行序列分析。通过将序列提交至V BASE19，以及利用在线信息工具分析不同V基因的特征。图28描述了人scFv克隆6和克隆8的氨基酸序列比对。轻链和重链可变区的互补决定区域(CDRs)的位置有下划线并分别标记为VL-CDR-1，-2和-3,以及VH-CDR-1，-2和-3。连接序列加有阴影。克隆6和克隆8在此也分别指
"Atto-HuMab-06"和"Atto-HuMab-08"。数据表明它们是在CDR区具有不同编码序列的不同的抗体克隆。
"Atto-HuMab-06"和"Atto-HuMab-08"。数据表明它们是在CDR区具有不同编码序列的不同的抗体克隆。
[0722] 图29A-29B分别描述了人scFv克隆8(Atto-HuMab-08)的轻链可变区和重链可变区的全长编码区的核苷酸序列和氨基酸序列。连接序列加有阴影。
[0723] 图29C-29D分别描述了人scFv克隆8(Atto-HuMab-08)的轻链可变区的核苷酸序列和氨基酸序列。CDR序列有下划线。
[0724] 图29E-29F分别描述了人scFv克隆8(Atto-HuMab-08)的重链可变区的核苷酸序列和氨基酸序列。CDR序列有下划线。
[0725] 图30A-30B分别描述了人scFv克隆6(Atto-HuMab-06)的轻链可变区和重链可变区的全长编码区的核苷酸序列和氨基酸序列。连接序列有阴影。
[0726] 图30C-30D分别描述了人scFv克隆6(Atto-HuMab-06)的轻链可变区的核苷酸序列和氨基酸序列。CDR序列有下划线。
[0727] 图30E-30F分别描述了scFv克隆6(Atto-HuMab-06)的重链可变区的核苷酸序列和氨基酸序列。CDR序列有下划线。
[0728] 进行可溶性scFv抗体的表达，以在大肠杆菌系统中制备可溶性抗体。检测由基因指纹识别的30种独立的克隆的可溶性表达，该30种独立克隆通过辅助噬菌体M13影响HB2151株来制备。在0.5mM IPTG诱导后，产生scFv的分泌型可溶性抗体。利用镍柱的层析法纯化抗体。通过免疫化学、免疫荧光和免疫组化技术，利用这些纯化的抗体样本在肿瘤细胞和肿瘤样本中进行结合研究。通过增殖实验、配体结合实验和基于细胞的受体激活实验，研究这些scFv抗体的阻断活性。在小鼠肿瘤移植瘤模型中研究这些抗体对阻断肿瘤生长、侵入和生存率的体内活性。
[0729] 实施例14：抗体Atto-MuMab-01和Atto-MuMab-02的重链和轻链可变区的克隆[0730] 利用MagMAXTM-96Total RNA提取试剂盒（Ambion）对杂交瘤细胞（105细胞）进行TMRNA分离。利用Superscript 111逆转录酶（Invitrogen）合成第一链cDNA。使用以下引物进行cDNA的合成：
[0731] Cy2b:CGACTAGTCGACCAGGGATCCAGAGTTCCAAG(SEQ ID NO:117)
[0732] MKVL:GCGCCGTCTAGAATTAACACTCATTCCTGTTGAA(SEQ ID NO:118)
[0733] 利用以下引物，通过PCR法扩增重链（VH）和轻链（VL）的CDR编码序列：
[0734] VH的PCR引物：
[0735] VHB1:SAGGTCCAGCTGCAGCAGYYTGG(SEQ ID NO:119)
[0736] VHB2:GAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGK(SEQ ID NO:120)
[0737] VHF1:GAGGAAACGGTGACCGTGGT(SEQ ID NO:121)
[0738] VHF2:GAGGAGACTGTGAGAGTGGT(SEQ ID NO:122)
[0739] VHF3:GCAGAGACAGTGACCAGAGT(SEQ ID NO:123)
[0740] VHF4:GAGGAGACGGTGACTGAGGT(SEQ ID NO:124)
[0741] VL的PCR引物：
[0742] VLB1:GATGYTKTKVTGACCCAAACTCC(SEQ ID NO:125)
[0743] VLB2:GATATCCAGA TGACACAGACTAC(SEQ ID NO:126)
[0744] VLB3:RACATTGTGCTGACMCAATCTCC(SEQ ID NO:127)
[0745] VLB4:SAAAWTGTKCTCWCCCAGTCTCC(SEQ ID NO:128)
[0746] VLB5:GAMATCMWGATGACCCARTCTCC(SEQ ID NO:129)
[0747] VLB6:RRCATTGTGATGACCCAGWCTCM(SEQ ID NO:130)
[0748] VLB7:GATATTGTGATRACBCAGGYTGM(SEQ ID NO:131)
[0749] VLB8:RAMATTDTGWTGWCACAGTCTAY(SEQ ID NO:132)
[0750] VLB9:GACATCCAGATGACWCARTCTYC(SEQ ID NO:133)
[0751] VLB10:GACATCCAGATGAMMCAGTCTCC(SEQ ID NO:134)
[0752] VLB11:GA Y ATYSTGMTRACRCAGTCTCC(SEQ ID NO:135)
[0753] VLB12:GACATTGTGATGACTCAGTCTCC(SEQ ID NO:136)
[0754] VLB13:GAAACAACTGTGACCCAGTCTCC(SEQ ID NO:137)
[0755] VLF1:ACGTTTGATTTCCAGCTTGG(SEQ ID NO:138)
[0756] VLF2:ACGTTTTATTTCCAGCTTGG(SEQ ID NO:139)
[0757] VLF3:ACGTTTTATTTCCAACTTTG(SEQ ID NO:140)
[0758] VLF4:ACGTTTCAGCTCCAGCTTGG(SEQ ID NO:141)
[0759] PCR方法如下：在94℃下变性5分钟，随后94℃下1分钟，63℃下30秒，58℃下50秒，72℃下1分钟，进行7轮，然后在94℃下1分钟，63℃下30秒，72℃下1分钟，最后在
72℃下5分钟，进行23轮。
72℃下5分钟，进行23轮。
[0760] PCR扩增的DNA片段被克隆至pUCm-T载体上（Biomatik USA,L LC,Wilmington，DE,USA）。
[0761] Atto-MuMab-02重链（SEQ ID NO:87）和轻链（SEQ ID NO:89）可变区的核苷酸序列分别展示于图34A和34B中。Atto-MuMab-02重链（SEQ ID NO:88）和轻链（SEQ ID NO:90）可变区的氨基酸序列展示于图35。如图36A和36B所示，具有小鼠免疫球蛋白基因库的Atto-MuMab-02免疫球蛋白重链（SEQ ID NO:88）或轻链（SEQ ID NO:90）可变区的氨基酸序列比对分别揭示了Atto-MuMab-02重链可变区（SEQ ID NO:88）与小鼠免疫球蛋白mu链可变区（SEQ ID NO:142;基因库:AAA88255.1）91%的同源性，以及轻链可变区（SEQ ID NO:90）与抗人黑色素瘤免疫球蛋白轻链可变区（EQ ID NO:143;基因库:AA049727.1）92%的同源性，表明来自AttoMuMab-02的重链和轻链序列为新序列。
[0762] 实施例15：对选择性结合至FGFR2的IIIc异构体的人抗体ATTO-HuMAb-01的克隆和分析
[0763] 选择性结合至FGFR2的IIIc异构体的人抗体ATTO-HuMAb-01来自最初人scFv克隆1（scFv-l）。例如，实施例13描述了几个单链人抗体克隆，例如scFv-1,scFv-2,scFv-6,以及scFv-8。具体地，图25A-25B和27A-27B描述了scFv-1。该实施例中的scFv抗体克隆之间的序列比对的分析展示了轻链和重链VL-CDR或VH-CDR区的高的同源性。进一步的研究表明scFv-1比scFv-2,scFv-6,以及scFv-8具有相似或更好的结合性能（例如，结合至作为可溶性分子的靶受体，及结合至表达在细胞表面的靶受体），以及更好的稳定表达和结构特征。
[0764] 如该实施例中所示，在以下的抗体形式中已经建成及测试scFv-1克隆：噬菌体展示scFv片段，文中称为“scFv-1（噬菌体）”；大肠杆菌表达分泌型，作为纯化的scFv可溶性抗体，在文中称为“scFv-1(sol)”；作为人IgG1Fc融合的双链结构，在文中称为“dcFv-01”；以及完整人IgG分子（在具有全长重链和轻链的传统IgG1结构的框内），在文中称为“ATTO-HuMAB-01”。
[0765] 实施例15.1：scFv抗体克隆之间的序列比对的分析
[0766] 图37A-37B分别描述了人scFv-1的轻链可变区和重链可变区的全长编码区的氨基酸和核苷酸序列。连接序列为阴影。互补决定区（CDR）序列有下划线。
[0767] 人scFv-1和scFv-6的氨基酸序列比对展示于图38中。轻链和重链可变区的CDRs的位置有下划线，并分别被标记为VL-CDR-1,-2,和-3,和VH-CDR-1,-2,和-3。序列比对（sequence alignment）的结果揭示了在scFv-1与scFv-6之间217/252(86%)一致性，232/252(92%)相似性（positives），以及1/252(0%)空隙（gaps）（评分=434位(1117),期望=8e-127,方法:组成整列调整（Compositional matrix）adjust）。
[0768] 人scFv-1和scFv-8的氨基酸序列比对展示于图39中。轻链和重链可变区的互补决定区（CDRs）的位置有下划线，并分别被标记为VL-CDR-1,-2,和-3,和VH-CDR-1,-2,和-3。序列比对的结果揭示了在scFv-1与scFv-8之间240/252(95%)一致性，247/252(98%)相似性，以及0/252(0%)空隙（评分=491位(1264),期望=6e-144,方法：组成整列调整）。
[0769] scFv抗体克隆（scFv-1,scFv-6,和scFv-8）之间的CDR区的比较展示于图40中。如图40所示，结合至FGFR2IIIc的这些scFv克隆在轻链CDRs和重链CDRs区共享高程度的序列同源性。
[0770] 因此，scFv抗体克隆之间的序列比对的分析展示了在包含VL-CDR或VH-CDR区的轻链和重链中的高的同源性。
[0771] 实施例15.2：瞬时转染的CHO细胞的免疫细胞化学（ICC）染色
[0772] 利用瞬时表达FGFR2-IIIb或FGFR2-IIIc的CHO细胞，通过免疫细胞化学（ICC）染色证明人抗体scFv-1对细胞表面受体FGFR2IIIc的结合。简单地，CHO细胞或者是模拟转染，或者是具有用位于胞外域的N末端FLAG标签表达FGFR2-IIIb或FGFR2-IIIc的构建的转染。FGFR2-IIIb或FGFR2-IIIc在细胞表面的表达通过使用抗FLAG抗体的ICC染色展示出。图41描述了免疫细胞化学（ICC）染色的代表图像。如图41所示，纯化的人抗体scFv-1（sol）特别地对FGFR2-IIIc表达CHO细胞染色，而不对FGFR2-IIIb-表达CHO细胞染色。实施例15.3：对结合至CHO细胞稳定表达表面受体FGFR2-IIIc的dcFv-01的荧光激活细胞分类（FACS）分析
[0773] 通过将scFv-1片段融合至人IgG1Fc的N末端，来将人抗体克隆sdFv-1构建为双链抗体。所得抗体称为dcFv-01。通过流式细胞仪检查dcFv-01与表达表面受体FGFR2-IIIc的细胞的结合活性。代表染色模式的数据展示于图42中。如图42所示，dcFv-01染色阳性的CHO细胞，CHO细胞稳定表达全长FGFR2-IIIc受体（中间的图）。当使用抗FGFR2抗体（R&D系统）作为阳性对照时（左图），也可观察到阳性染色。进一步的实验证明dcFv-01没有染色FGFR2-III表达细胞。
[0774] 实施例15.4：利用dcFv-01对大鼠前列腺癌细胞株AT3B-1进行免疫细胞化学（ICC）染色
[0775] 通过ICC染色检查Fc融合抗体、dcFv-01与大鼠前列腺癌细胞株AT3B-1的结合。用人IgF（阴性对照）或dcFv-01对AT3B-1细胞染色。图43描述了免疫细胞化学（ICC）染色的代表图像。如图43所示，dcFv-01结合至AT3B-1细胞（右图），而人IgG没有染色AT3B-1细胞（中间图）。
[0776] 实施例15.5：对结合至大鼠前列腺细胞株AT3B-1的dcFv-01的荧光激活细胞分类（FACS）分析
[0777] 通过流式细胞仪检查dcFv-01对大鼠前列腺细胞株AT3B-1的结合活性。代表染色模式数据展示于图44中。如图44所示，dcFv-01表现了对AT3B-1细胞群的23%的阳性染色。相反，AT3B-1细胞群的阴性对照（没有主抗体）和非相关对照（人IgG-1）染色分别为11%和12%。
[0778] 表3.Atto-MuMab-02,Atto-HuMab-01,Atto-HuMab-06,和Atto-HuMab-08序列的汇总
[0779]
[0780]
[0781]
[0782] 通过参考的引入
[0783] 文中提及的所有的公开文本、专利以及登录号通过参考引入其全部内容，就如同每个单独的公开文本或专利具体地、单独的通过参考被引入。
[0784] 等同物
[0785] 尽管讨论了本发明的具体实施例，但是上述说明是说明性质的，而非限制性的。在说明书以及以下权利要求的基础上，对本发明作出很多的变更对于本领域技术人员而言是显而易见的。本发明的范围应该由权利要求、以及其等同物的全部范围，说明书及变更例限定。
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