经配制的受体多肽和相关方法
阅读：294发布：2021-09-25
专利汇可以提供经配制的受体多肽和相关方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本文揭露一种基于活化素受体IIB的组合物和相关使用方法，例如用于 治疗 实体 肿瘤 。还揭露制造化合物和配制物的方法。，下面是经配制的受体多肽和相关方法专利的具体信息内容。
1.一种包含蛋白质、赋形剂、缓冲剂和表面活性剂的溶液的组合物，其中所述组合物包含4-12的pH，其中所述蛋白质包含能够结合肌肉生长抑制素(myostatin)、活化素A或GDF-
11的多肽，其中所述多肽是选自由以下组成的群组：
(a)由SEQ ID NO:4、6、12和14组成的群组中所示的氨基酸序列组成的多肽；
(b)与(a)具有至少90％序列一致性的多肽，且所述多肽在对应于SEQ ID NO:2中所示序列的位置28的位置具有W或Y且在对应于SEQ ID NO:2中所示序列的位置44的位置具有T，和
(c)与(a)具有至少95％序列一致性的多肽，其中所述多肽在对应于SEQ ID NO:2中所示序列的位置28的位置具有W或Y且在对应于SEQ ID NO:2中所示序列的位置44的位置具有T；和
其中相对于所述组合物中的所述蛋白质在时间段开始时(0月)或相对于相同蛋白质
在-20℃或-70℃在其它相同条件下保存大于1个月，所述组合物中的所述蛋白质在溶液中在2-8℃或5℃保存时保持至少80％稳定性的时间段大于1个月；
且任选地，其中所述组合物进一步包含化学治疗剂或第二治疗剂。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述蛋白质是由SEQ ID NO:10中所示的序列组成，浓度为70mg/mL，所述赋形剂为8.8％重量/体积w/v蔗糖，所述缓冲剂为10mM磷酸钾缓冲剂，所述表面活性剂为0.006％(w/v)聚山梨醇酯20，且包含6.7的pH；且其中相对于所述组合物中的所述蛋白质在时间段开始时(0月)或相对于相同蛋白质在-20℃或-70℃在其它相同条件下保存大于6个月，所述组合物中的所述蛋白质在溶液中在2-8℃或5℃保存时保持至少90％稳定性的时间段大于6个月。
3.根据权利要求1所述的组合物，其包含至少4、5、6、7、8或9的pH，任选地，其中所述pH为4-10、4-8或5-7，任选地，其中所述pH为至少6-7，任选地，其中所述pH为至少6.0、6.1、
6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9或7.0。
4.根据前述权利要求中除权利要求2外的任一权利要求所述的组合物，其中所述赋形剂包含糖，任选地，其中所述糖为蔗糖，任选地，其中所述组合物中的所述赋形剂浓度为至少7-11％、8-10％、8-9％、8.8％、7％、8％、9％、10％、11％、8.0％、8.1％、8.2％、8.3％、
8.4％、8.5％、8.6％、8.7％、8.9％或9.0％重量/体积w/v。
5.根据前述权利要求中除权利要求2外的任一权利要求所述的组合物，其中所述缓冲剂包含磷酸盐，任选地，其中所述磷酸盐为磷酸钾，任选地，其中所述组合物中的所述缓冲剂浓度为至少7-13mM、8-12mM、9-11mM、8mM、9mM、10mM、11mM或12mM。
6.根据前述权利要求中除权利要求2外的任一权利要求所述的组合物，其中所述表面活性剂为非离子表面活性剂，任选地，其中所述非离子表面活性剂为聚山梨醇酯，任选地，其中所述聚山梨醇酯为聚山梨醇酯20，任选地，其中所述表面活性剂浓度为0.001-0.10％、
0.05-0.10％、0.001％、0.002％、0.003％、0.004％、0.005％、0.006％、0.007％、0.008％、
0.009％、0.010％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％或
0.10％(w/v)。
7.根据前述权利要求中除权利要求2外的任一权利要求所述的组合物，其中相对于所述组合物中的所述蛋白质在时间段开始时(0月)，所述组合物中的所述蛋白质在溶液中在
2-8℃或5℃保存时保持至少99.5-80％、90-85％、99.5％、99％、98％、97％、96％、95％、
94％、93％、92％、91％、90％、89％、88％、87％、86％、85％、84％、83％、82％、81％或80％稳定性的时间段大于1-54、6-48、12-36、24-36、1、2、3、6、12、18、24、36、48或54个月。
8.根据前述权利要求中除权利要求2外的任一权利要求所述的组合物，其中相对于相同蛋白质在-20℃或-70℃在其它相同条件下保存相等时间段，所述组合物中的所述蛋白质在溶液中在2-8℃或5℃保存时保持至少99.5-80％、90-85％、99.5％、99％、98％、97％、
96％、95％、94％、93％、92％、91％、90％、89％、88％、87％、86％、85％、84％、83％、82％、
81％或80％稳定性的时间段大于1-54、6-48、12-36、24-36、1、2、3、6、12、18、24、36、48或54个月。
9.根据前述权利要求中任一权利要求所述的组合物，其中相对于所述组合物中的所述蛋白质在时间段开始时(0月)，所述组合物中的所述蛋白质在溶液中在2-8℃或5℃保存时保持至少99.5-80％、90-85％、99.5％、99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、
91％、90％、89％、88％、87％、86％、85％、84％、83％、82％、81％或80％活性的时间段大于
1-54、6-48、12-36、24-36、1、2、3、6、12、18、24、36、48或54个月，任选地，其中活性是使用基于细胞的生物分析测定。
10.根据前述权利要求中任一权利要求所述的组合物，其中相对于相同蛋白质在-20℃或-70℃在其它相同条件下保存相等时间段，所述组合物中的所述蛋白质在溶液中在2-8℃或5℃保存时保持至少99.5-80％、90-85％、99.5％、99％、98％、97％、96％、95％、94％、
93％、92％、91％、90％、89％、88％、87％、86％、85％、84％、83％、82％、81％或80％活性的时间段大于1-54、6-48、12-36、24-36、1、2、3、6、12、18、24、36、48或54个月，任选地，其中活性是使用基于细胞的生物分析测定。
11.根据前述权利要求中任一权利要求所述的组合物，其中所述组合物中的所述蛋白质的稳定性百分比是通过以下中的一或多者测定：目测外观、重量摩尔渗透浓度
(osmolality)、pH、体积、尺寸排阻高效液相色谱SE-HPLC、成像毛细管等电聚焦icIEF、十二烷基硫酸钠毛细管电泳CE-SDS、非还原性nrCE-SDS、还原性CE-SDS、酶联免疫特异性分析ELISA、基于细胞的生物分析、内毒素含量、无菌性、显微颗粒(subvisible particles)和聚山梨醇酯20浓度。
12.根据前述权利要求中除权利要求2外的任一权利要求所述的组合物，其中所述肽是由SEQ ID NO:6中所示的氨基酸序列组成。
13.根据前述权利要求中除权利要求2外的任一权利要求所述的组合物，其中所述蛋白质是由SEQ ID NO:10中所示的氨基酸序列组成。
14.根据前述权利要求中除权利要求2外的任一权利要求所述的组合物，其中所述蛋白质是由SEQ ID NO:10中所示的氨基酸序列组成，所述赋形剂为蔗糖，所述缓冲剂为磷酸钾缓冲剂，且所述表面活性剂为聚山梨醇酯20。
15.根据前述权利要求中除权利要求2外的任一权利要求所述的组合物，其中所述蛋白质的浓度为至少50-90、60-80、65-70、70-75、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、
73、74、75、76、77、78、79或80mg/mL。
16.根据前述权利要求中除权利要求2外的任一权利要求所述的组合物，其中所述多肽包含SEQ ID NO:6中所示的序列，所述赋形剂为8.8％(w/v)蔗糖，所述缓冲剂为10mM磷酸钾缓冲剂，所述表面活性剂为0.006％(w/v)聚山梨醇酯20，且所述pH为6.7。
17.根据前述权利要求中除权利要求2外的任一权利要求所述的组合物，其中所述蛋白质是由SEQ ID NO:10中所示的氨基酸序列组成，浓度为70mg/mL，所述赋形剂为8.8％(w/v)蔗糖，所述缓冲剂为10mM磷酸钾缓冲剂，所述表面活性剂为0.006％(w/v)聚山梨醇酯20，且所述pH为6.7。
18.根据前述权利要求中任一权利要求所述的组合物，其包含化学治疗剂阿霉素
(doxorubicin)。
19.一种抑制个体的实体肿瘤生长或治疗个体的实体肿瘤或抑制、减轻或治疗个体的恶病质的方法，其包含向所述个体施用一剂量根据上述组合物权利要求中任一权利要求所述的组合物。
20.一种抑制个体的实体肿瘤生长或治疗个体的实体肿瘤的方法，其包含向所述个体施用至少0.1mg/kg至20mg/kg范围内的固定剂量的蛋白质，其中所述蛋白质包含能够结合肌肉生长抑制素、活化素A或GDF-11的多肽，所述多肽选自由以下组成的群组：
(a)由SEQ ID NO:4、6、12和14组成的群组中所示的氨基酸序列组成的多肽；
(b)与(a)具有至少90％序列一致性的多肽，且所述多肽在对应于SEQ ID NO:2中所示序列的位置28的位置具有W或Y且在对应于SEQ ID NO:2中所示序列的位置44的位置具有T，和
(c)与(a)具有至少95％序列一致性的多肽，且所述多肽在对应于SEQ ID NO:2中所示序列的位置28的位置具有W或Y且在对应于SEQ ID NO:2中所示序列的位置44的位置具有T。
21.根据前述方法权利要求中任一权利要求所述的方法，其中所述剂量为至少0.1-
10mg/kg、0.25-5mg/kg、1-4mg/kg、0.25mg/kg、0.5mg/kg、1mg/kg、2mg/kg、3mg/kg、4mg/kg或
5mg/kg。
22.根据前述方法权利要求中任一权利要求所述的方法，其中所述剂量每1-5、2-4、1、
2、3或4周施用所述个体至少一次。
23.根据前述方法权利要求中任一权利要求所述的方法，其中所述剂量是静脉内IV施用所述个体。
24.根据前述方法权利要求中任一权利要求所述的方法，其中所述蛋白质是由SEQ ID NO:10中所示的氨基酸序列组成。
25.根据前述方法权利要求中任一权利要求所述的方法，其中所述蛋白质是根据任一前述组合物权利要求配制。
26.根据前述方法权利要求中任一权利要求所述的方法，其进一步包含向所述个体施用阿霉素。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述阿霉素至少以40mg/m2输注施用所述个体。
28.根据权利要求26所述的方法，其中所述阿霉素为脂质体阿霉素。
29.根据权利要求26所述的方法，其中所述阿霉素是在所述蛋白质之前、之后或同时施用。
30.根据权利要求26所述的方法，其中所述阿霉素至少每4周施用所述个体，任选地为6个循环或小于6个循环。
31.根据前述方法权利要求中任一权利要求所述的方法，其中所述实体肿瘤表达肌肉生长抑制素、活化素A、活化素B和/或GDF-11。
32.根据前述方法权利要求中任一权利要求所述的方法，其中所述实体肿瘤是选自由以下组成的群组：卵巢癌，包括颗粒层细胞、透明细胞、浆液性、子宫内膜样以及生殖细胞肿瘤；输卵管癌、子宫内膜癌、肾上腺皮质肿瘤、胆囊癌、胰腺泡癌、头颈癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、胰脏癌、前列腺癌、小肠肿瘤、结肠癌、肾细胞癌、腺样囊性癌、胃癌、食道癌、腺样囊性癌ACC；鳞状细胞癌，包括皮肤癌；黑色素瘤、乳癌、膀胱癌、肝细胞癌以及子宫癌，包括子宫内膜、子宫颈、平滑肌瘤、外阴以及阴道癌症。
33.根据前述方法权利要求中任一权利要求所述的方法，其中所述实体肿瘤为卵巢癌。
34.根据前述方法权利要求中任一权利要求所述的方法，其中所述个体是根据至少一种标准选择或排除。
35.根据权利要求34所述的方法，其中所述标准是用于选择投药的个体，且所述标准为以下中的一或多者：≥18岁的男性和停经后女性；存在组织学确诊癌症的晚期实体肿瘤；存在视为可用于肿瘤的所有标准疗法难治疗或不耐受的复发性转移性或局部晚期疾病；或患有无标准疗法可利用的肿瘤的个体；患有视为铂难治性/耐药性的浆液性卵巢/输卵管/原发性腹膜、颗粒层细胞肿瘤或透明细胞肿瘤、定义为先前已接受至少一种基于铂的化学治疗方案、随后无铂间隔<12个月、在基于铂的疗法期间有进展或在基于铂的疗法之后患有持久性疾病的个体；定义为因毒性而不能进一步接受铂的不耐受铂的个体；使用实体肿瘤的反应评估标准RECIST 1.1可测量的疾病；东部肿瘤学合作组织ECOG活动状态为0或1；在无其它人协助的情况下能够行走至少30米(可允许使用辅助装置，如手杖或助行架)；停经后女性自发性停经12个月；停经后女性自发性停经6个月，其中FSH>40IU/L；和/或停经后女性的手术后双侧卵巢切除伴随或不伴随子宫切除术。
36.根据权利要求34所述的方法，其中所述标准用于排除投药的个体，且所述标准为以下中的一或多者：并行严重不受控制或未消退医学病状(如感染)限制方案顺应性或使个体暴露于极端风险；先前抗癌疗法的毒性未消退，如运动或感觉神经病变，CTCAE(4.03版)级≥2，秃发症除外；在开始治疗6个月内胃肠出血的病史；存在QTcF>470msec；遗传性延长QT间隔的病史，或妨碍评估QT间隔的任何心律不整(如束支传导阻滞)、心肌梗塞、第1循环的6个月内第1天出现的不稳定绞痛，或纽约心脏协会充血性心脏衰竭≥II级；肝功能测试升高，包括总胆红素>1.5×正常值上限(ULN；除非个体有文件证明吉伯氏疾病(Gilbert's disease))、天冬氨酸转胺酶AST或丙氨酸转胺酶ALT>3.0×ULN(对于已知有肝转移的个体来说，AST或ALT>5×ULN)、肌酐>1.5×ULN和估计的肌酐清除率<60mL/min(使用科克罗夫特-高尔特方程式(Cockcroft-Gault equation))、血红素<9g/dL；血小板<100×109/L；绝对嗜中性白细胞计数ANC<1.5×109/L(在开始治疗2周内无粒细胞群落刺激因子支持)；在开始治疗3周内的化学疗法、激素疗法或辐射疗法；在开始治疗的5个半衰期或4周(以较长者为准)内的抗体/生物疗法；开始治疗8周内的大手术或开始治疗4周内的小手术；当前肠阻塞；脑转移；存在需要频繁(每周超过1次)医学介入的腹水或胸膜积水；存在门静脉分流装置或广泛肝切除(超过一个区段)病史；已知人类免疫缺乏病毒HIV感染；活动性B型或C型肝炎感染；开始治疗4周内先用任何研究性产品治疗；具有生育潜力的女性；或具有生育潜力的女性伴侣的男性；不愿意使用非常有效的避孕方法(即造成每年怀孕机率小于1％的方法)一贯地且正确地使用时，如植入物、注射剂、组合的口服避孕药、一些子宫内避孕装置、禁欲或伴侣输精管结扎；对阿霉素盐酸盐(doxorubicin HCl)的习知配制物或脂质体阿霉素的组分有过敏反应；先前阿霉素盐酸盐的累积剂量>300mg/m2，或先前表柔比星
(epirubicin)的累积剂量>500mg/m2；根据MUGA扫描或超音波心电图ECHO，在开始治疗28天内减小的心脏射血分数小于正常值下限，和/或正哺乳的女性。
37.一种制备包含能够结合肌肉生长抑制素、活化素A或GDF-11的多肽的蛋白质的方
法，其中所述多肽是选自由以下组成的群组：(a)由SEQ ID NO:4、6、12和14组成的群组中所示的氨基酸序列组成的多肽；(b)与(a)具有至少90％序列一致性的多肽，且所述多肽在对应于SEQ ID NO:2中所示序列的位置28的位置具有W或Y且在对应于SEQ ID NO:2中所示序列的位置44的位置具有T；和(c)与(a)具有至少95％序列一致性的多肽，且所述多肽在对应于SEQ ID NO:2中所示序列的位置28的位置具有W或Y且在对应于SEQ ID NO:2中所示序列的位置44的位置具有T，所述方法包含：
在细胞培养物中培养经工程改造以表达所述蛋白质的CS9中国仓鼠卵巢细胞株；
自所述培养物收获所述蛋白质；以及
提纯所述蛋白质。
38.根据权利要求37所述的方法，其中所述培养步骤至少部分发生于生物反应器中。
39.根据前述制备方法权利要求中任一权利要求所述的方法，其中所述收获步骤包含澄清和/或过滤。
40.根据前述制备方法权利要求中任一权利要求所述的方法，其中所述提纯步骤包含蛋白质A色谱、低pH病毒灭活、阳离子交换色谱、疏水性相互作用色谱、病毒过滤，和/或超过滤。
41.根据前述制备方法权利要求中任一权利要求所述的方法，其中所述提纯步骤包含使用色谱、微生物灭活和/或过滤。
42.根据前述制备方法权利要求中任一权利要求所述的方法，其进一步包含将所述蛋白质配制于无菌水溶液中。
43.根据前述制备方法权利要求中任一权利要求所述的方法，其进一步包含根据前述组合物权利要求中的任一权利要求配制所述蛋白质。
44.一种抑制、减轻或治疗个体的恶病质的方法，其包含向所述个体施用至少0.1mg/kg至20mg/kg范围内的固定剂量的蛋白质，其中所述蛋白质包含能够结合肌肉生长抑制素、活化素A或GDF-11的多肽，其中所述多肽是选自由以下组成的群组：
(a)由SEQ ID NO:4、6、12和14组成的群组中所示的氨基酸序列组成的多肽；
(b)与(a)具有至少90％序列一致性的多肽，且所述多肽在对应于SEQ ID NO:2中所示序列的位置28的位置具有W或Y且在对应于SEQ ID NO:2中所示序列的位置44的位置具有T，和
(c)与(a)具有至少95％序列一致性的多肽，且所述多肽在对应于SEQ ID NO:2中所示序列的位置28的位置具有W或Y且在对应于SEQ ID NO:2中所示序列的位置44的位置具有T。
45.根据权利要求44所述的方法，其中所述剂量为至少0.1-10mg/kg、0.25-5mg/kg、1-
4mg/kg、0.25mg/kg、0.5mg/kg、1mg/kg、2mg/kg、3mg/kg、4mg/kg或5mg/kg。
46.根据前述抑制、减轻或治疗恶病质的方法权利要求中任一权利要求所述的方法，其中所述固定剂量每1-5、2-4、1、2、3或4周施用所述个体至少一次。
47.根据前述抑制、减轻或治疗恶病质的方法权利要求中任一权利要求所述的方法，其中所述固定剂量是静脉内IV施用所述个体。
48.根据前述抑制、减轻或治疗恶病质的方法权利要求中任一权利要求所述的方法，其中所述蛋白质是由SEQ ID NO:10中所示的氨基酸序列组成。
49.根据前述抑制、减轻或治疗恶病质的方法权利要求中任一权利要求所述的方法，其中所述蛋白质是根据前述组合物权利要求中的任一权利要求配制。
50.根据前述抑制、减轻或治疗恶病质的方法权利要求中任一权利要求所述的方法，其进一步包含向所述个体施用阿霉素。
51.根据权利要求50所述的方法，其中所述阿霉素是以至少40mg/m2输注施用所述个
体。
52.根据权利要求50所述的方法，其中所述阿霉素为脂质体阿霉素。
53.根据权利要求50所述的方法，其中所述阿霉素是在所述蛋白质之前、之后或同时施用。
54.根据权利要求50所述的方法，其中所述阿霉素至少每1、2、3或4周施用所述个体。
55.根据前述抑制、减轻或治疗恶病质的方法权利要求中任一权利要求所述的方法，其中所述个体患有肿瘤，任选地，其中所述肿瘤为实体肿瘤，任选地，其中所述肿瘤为卵巢癌。
56.根据权利要求55所述的方法，其中所述肿瘤表达肌肉生长抑制素、活化素A、活化素B和/或GDF-11。
57.根据权利要求55所述的方法，其中所述肿瘤为选自由以下组成的群组的实体肿瘤：
卵巢癌，包括颗粒层细胞、透明细胞、浆液性、子宫内膜样和生殖细胞肿瘤；输卵管癌、子宫内膜癌、肾上腺皮质肿瘤、胆囊癌、胰腺泡癌、头颈癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、胰脏癌、前列腺癌、小肠肿瘤、结肠癌、肾细胞癌、腺样囊性癌、胃癌、食道癌、腺样囊性癌ACC；鳞状细胞癌，包括皮肤癌；黑色素瘤、乳癌、膀胱癌、肝细胞癌，和子宫癌，包括子宫内膜、子宫颈、平滑肌瘤、外阴和阴道癌症。
58.根据权利要求55所述的方法，其中所述肿瘤为卵巢癌。
59.根据前述抑制、减轻或治疗恶病质的方法权利要求中任一权利要求所述的方法，其中所述个体是根据至少一种标准选择或排除。
60.根据前述抑制、减轻或治疗恶病质的方法权利要求中任一权利要求所述的方法，其中所述投药的功效是使用至少一种测量方法分析，所述测量方法包含测量瘦体质量、脂肪质量、骨矿物质密度、脂质概况(profile)、空腹葡萄糖和/或胰岛素、恒稳模型评估HOMA、血红素A1c HbA1c或六分钟行走距离。
61.根据前述抑制、减轻或治疗恶病质的方法权利要求中任一权利要求所述的方法，其中投药造成以下中的至少一种改善：个体的瘦体质量、脂肪质量、骨矿物质密度、脂质概况、空腹葡萄糖和/或胰岛素、恒稳模型评估HOMA、血红素A1c HbA1c或六分钟行走距离。
62.根据前述抑制、减轻或治疗恶病质的方法权利要求中任一权利要求所述的方法，其进一步包含使用至少一种测量方法，所述测量方法包含测量瘦体质量、脂肪质量、骨矿物质密度、脂质概况、空腹葡萄糖和/或胰岛素、恒稳模型评估HOMA、血红素A1c HbA1c或六分钟行走距离。
63.一种治疗个体的肥胖或肥胖相关疾病、增加或维持个体的肌肉质量或减少个体的脂肪质量的方法，其包含：向所述个体施用有效剂量的抑制活化素、肌肉生长抑制素和GDF-
11中的至少一种的蛋白质，任选地，其中所述肥胖相关疾病为以下中的至少一种：遗传性肥胖综合症、普拉德威利综合症(Prader willi syndrome)、下丘脑病症、家族性高胆固醇血症、巴德-毕德氏综合症(Bardet-Biedl syndrome)、普拉德-威利综合症(Prader-Willi syndrome)、15q11-13上的印记基因缺失所致的综合症、艾尔斯通综合症(Alstrom
syndrome)、柯亨综合症(Cohen syndrome)、艾尔伯拉特遗传性骨营养不良(Albright's hereditary osteodystrophy)(假副甲状腺低能症)、卡本特综合症(Carpenter
syndrome)、MOMO综合症、鲁宾斯坦-泰必综合症(Rubinstein-Taybi syndrome)；6q16、
1p36、2q37和9q34中的至少一种缺失所致的综合症；染色体14的母源单亲双染色体症、脆弱X染色体综合症、动脉粥样硬化、非酒精性脂肝炎、内脏脂肪沉积导致一或多种有害结果的疾病、脑血管疾病、脂肪肝，和伯吉森-佛斯曼-莱曼综合症( -Forssman-Lehman
syndrome)。
64.根据权利要求63所述的方法，其中所述个体为有需要的人类个体。
65.根据前述治疗肥胖或肥胖相关疾病、增加或维持肌肉质量或减少脂肪质量的方法权利要求中任一权利要求所述的方法，其中所述蛋白质为抗体或融合蛋白，任选地，其中所述融合蛋白为ActRIIB融合蛋白，任选地，其中所述ActRIIB融合蛋白包含与SEQ ID NO:2的氨基酸19-25、19、20、21、22、23、24或25至130-134、125、126、127、128、129、130、131、132、
133或134中所示序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的序列，任选地，其中所述融合蛋白包含Fc，任选地，其中Fc为IgG，任选地，其中IgG为人类IgG，任选地，其中ActRIIB与Fc经连接子连接。
66.根据前述治疗肥胖或肥胖相关疾病、增加或维持肌肉质量或减少脂肪质量的方法权利要求中任一权利要求所述的方法，其中所述蛋白质抑制活化素、肌肉生长抑制素和GDF-11中的至少两种，任选地，其中所述蛋白质抑制活化素、肌肉生长抑制素和GDF-11。
67.根据前述治疗肥胖或肥胖相关疾病、增加或维持肌肉质量或减少脂肪质量的方法权利要求中任一权利要求所述的方法，其中所述蛋白质抑制活化素。
68.根据前述治疗肥胖或肥胖相关疾病、增加或维持肌肉质量或减少脂肪质量的方法权利要求中任一权利要求所述的方法，其中所述剂量为至少0.1-10mg/kg、0.25-5mg/kg、1-
4mg/kg、0.25mg/kg、0.5mg/kg、1mg/kg、2mg/kg、3mg/kg、4mg/kg或5mg/kg。
69.根据前述治疗肥胖或肥胖相关疾病、增加或维持肌肉质量或减少脂肪质量的方法权利要求中任一权利要求所述的方法，其中所述剂量每1-5、2-4、1、2、3或4周施用所述个体至少一次。
70.根据前述治疗肥胖或肥胖相关疾病、增加或维持肌肉质量或减少脂肪质量的方法权利要求中任一权利要求所述的方法，其中所述剂量是静脉内IV施用所述个体。
71.根据前述治疗肥胖或肥胖相关疾病、增加或维持肌肉质量或减少脂肪质量的方法权利要求中任一权利要求所述的方法，其中所述蛋白质包含或组成为SEQ ID NO:10中所示的氨基酸序列。
72.根据前述治疗肥胖或肥胖相关疾病、增加或维持肌肉质量或减少脂肪质量的方法权利要求中任一权利要求所述的方法，其中所述蛋白质是根据前述组合物权利要求中的任一权利要求配制。
73.根据前述治疗肥胖或肥胖相关疾病、增加或维持肌肉质量或减少脂肪质量的方法权利要求中任一权利要求所述的方法，其中所述化合物用赋形剂配制成医药组合物。
74.根据前述治疗肥胖或肥胖相关疾病、增加或维持肌肉质量或减少脂肪质量的方法权利要求中任一权利要求所述的方法，其中所述个体患有以下中的至少一种：遗传性肥胖综合症、普拉德威利综合症、下丘脑病症、家族性高胆固醇血症、巴德-毕德氏综合症、普拉德-威利综合症、15q11-13上的印记基因缺失所致的综合症、艾尔斯通综合症、柯亨综合症、艾尔伯拉特遗传性骨营养不良(假副甲状腺低能症)、卡本特综合症、MOMO综合症、鲁宾斯坦-泰必综合症；6q16、1p36、2q37和9q34中的至少一种缺失所致的综合症；染色体14的母源单亲双染色体症、脆弱X染色体综合症、动脉粥样硬化、非酒精性脂肝炎、内脏脂肪沉积导致一或多种有害结果的疾病、脑血管疾病、脂肪肝和伯吉森-佛斯曼-莱曼综合症。
75.根据前述治疗肥胖或肥胖相关疾病、增加或维持肌肉质量或减少脂肪质量的方法权利要求中任一权利要求所述的方法，其中所述方法使总脂肪质量、皮下脂肪质量和内脏脂肪质量中的至少一种降低。
76.根据前述治疗肥胖或肥胖相关疾病、增加或维持肌肉质量或减少脂肪质量的方法权利要求中任一权利要求所述的方法，其中所述方法使得内脏脂肪质量降低百分比大于总脂肪质量降低百分比。
77.根据前述治疗肥胖或肥胖相关疾病、增加或维持肌肉质量或减少脂肪质量的方法权利要求中任一权利要求所述的方法，其中所述方法使瘦体质量和四肢瘦肉质量中的至少一种增加，或其中所述方法维持瘦体质量和四肢瘦肉质量中的至少一种。
78.根据前述治疗肥胖或肥胖相关疾病、增加或维持肌肉质量或减少脂肪质量的方法权利要求中任一权利要求所述的方法，其中所述方法使得瘦体质量和四肢瘦肉质量中的至少一种增加至少1-50％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、
30％、35％、40％、45％、50％或大于50％。
79.根据前述治疗肥胖或肥胖相关疾病、增加或维持肌肉质量或减少脂肪质量的方法权利要求中任一权利要求所述的方法，其中所述方法使得总脂肪质量、皮下脂肪质量和内脏脂肪质量中的至少一种降低至少1-99％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、
10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、
85％、90％、95％、99％或大于99％。
80.根据前述治疗肥胖或肥胖相关疾病、增加或维持肌肉质量或减少脂肪质量的方法权利要求中任一权利要求所述的方法，其中所述个体患有胰岛素抗性、慢性肾病、癌症和分解代谢病状中的至少一种。
81.一种试剂盒，其包含根据前述组合物权利要求中任一权利要求所述的组合物和使用说明书，任选地，其中所述使用说明书包含前述方法权利要求中任一权利要求所述的方法。
82.根据权利要求81所述的试剂盒，其进一步包含含有所述组合物的小瓶。
83.根据权利要求82所述的试剂盒，其中所述小瓶是针对在2-8℃储存所设计。
84.根据权利要求82所述的试剂盒，其中所述小瓶可在2-8℃储存。
85.根据权利要求82所述的试剂盒，其中所述小瓶具有塞子且其中所述组合物可与所述塞子接触，任选地对所述蛋白质的稳定性无实质性影响。
经配制的受体多肽和相关方法
[0001] 相关申请的交叉参考
[0002] 本申请要求2014年6月13日所提交的美国临时申请第61/012,104号、2014年9月9日所提交的美国临时申请第62/047,995号、2014年10月2日所提交的美国临时申请第62/
058,789号和2015年4月3日所提交的美国临时申请第62/142,812号的权益；所述案中的每
一个的整个揭露内容均通过全文引用结合在此以用于所有目的。
058,789号和2015年4月3日所提交的美国临时申请第62/142,812号的权益；所述案中的每
一个的整个揭露内容均通过全文引用结合在此以用于所有目的。
[0004] 本申请含有序列表，所述序列表已按ASCII格式以电子方式提交且其全部内容通过引用结合在此。所述ASCII副本创建于2015年6月10日，命名为29502PCT_CRF_
sequencelisting.txt且大小是83,907个字节。
sequencelisting.txt且大小是83,907个字节。
背景技术
[0005] 转型生长因子β(TGF-β)蛋白质家族包括转型生长因子-β(TGF-β)、活化素、促骨骼形态形成的蛋白质(BMP)、神经生长因子(NGF)、脑源神经营养因子(BDNF)和生长/分化因子(GDF)。这些家族成员涉及广泛范围的生物过程(包括细胞增殖、分化和其他功能)的调节。
[0006] 生长/分化因子8(GDF-8)(还称为肌肉生长抑制素)是大多数情况下在正发育和成熟的骨骼肌组织的细胞中受到表达的TGF-β家族成员。肌肉生长抑制素似乎起着不利地控
制骨骼肌生长的主要作用(麦克菲隆(McPherron)等人，《自然(Nature)》(伦敦)387，83-90
(1997)；Zimmers等人，《科学(Science)》296：1486-1488(2002))。拮抗肌肉生长抑制素已显示可使动物的瘦肌肉质量增加。
制骨骼肌生长的主要作用(麦克菲隆(McPherron)等人，《自然(Nature)》(伦敦)387，83-90
(1997)；Zimmers等人，《科学(Science)》296：1486-1488(2002))。拮抗肌肉生长抑制素已显示可使动物的瘦肌肉质量增加。
[0007] TGF-β蛋白质家族中的另一成员为相关生长/分化因子：生长/分化因子11(GDF-11)。GDF-11与肌肉生长抑制素的氨基酸序列具有约90％的序列一致性。GDF-11在正发育的
动物中具有轴向模式化的作用(奥(Oh)等人，《基因与发育(Genes Dev)》11：1812-26
(1997))，且还似乎在骨骼肌发育和生长中起作用。
动物中具有轴向模式化的作用(奥(Oh)等人，《基因与发育(Genes Dev)》11：1812-26
(1997))，且还似乎在骨骼肌发育和生长中起作用。
[0008] 活化素A、B和AB分别为两种多肽链βA和βB的均二聚体和杂二聚体(韦尔(Vale)等人，《自然》321，776-779(1986)；凌(Ling)等人，《自然》321，779-782(1986))。最初发现活化素为涉及调节滤泡刺激性激素合成的性腺肽，且现相信涉及多种生物活性的调节。活化素A
为活化素的主要形式。
为活化素的主要形式。
[0009] 活化素、肌肉生长抑制素、GDF-11和TGF-β超家族中的其他成员经由活化素II型与活化素IIB型受体的组合来进行结合和传导信号，活化素II型与活化素IIB型受体均为跨膜
丝氨酸/苏氨酸激酶(哈里森(Harrison)等人《，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)》279，28036-
28044(2004))。交联研究已确定，肌肉生长抑制素能够活体外结合活化素II型受体ActRIIA
和ActRIIB(李(Lee)等人，《美国科学院院报(PNAS USA)》98：9306-11(2001))。还有证据表明，GDF-11结合到ActRIIA与ActRIIB(奥等人，《基因与发育》16：2749-54(2002))。
丝氨酸/苏氨酸激酶(哈里森(Harrison)等人《，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)》279，28036-
28044(2004))。交联研究已确定，肌肉生长抑制素能够活体外结合活化素II型受体ActRIIA
和ActRIIB(李(Lee)等人，《美国科学院院报(PNAS USA)》98：9306-11(2001))。还有证据表明，GDF-11结合到ActRIIA与ActRIIB(奥等人，《基因与发育》16：2749-54(2002))。
[0011] 相关申请包括：2009年11月25日所提交的美国申请第12/626,375号；2008年3月5日所提交的美国申请第12/074,877号；2011年12月19所提交的美国申请第13/329,897号；
2006年10月31日所提交的美国申请第11/590,962号；2014年2月3日所提交的PCT/US2014/
014490；和2015年1月14日所提交的PCT/US2015/011396；所述申请各通过全文引用结合在
此以用于所有目的。
2006年10月31日所提交的美国申请第11/590,962号；2014年2月3日所提交的PCT/US2014/
014490；和2015年1月14日所提交的PCT/US2015/011396；所述申请各通过全文引用结合在
此以用于所有目的。
[0012] 发明简述
[0013] 本文揭露一种包含蛋白质、赋形剂、缓冲剂和表面活性剂的溶液的组合物，其中所述组合物包含4-12的pH，其中所述蛋白质包含能够结合肌肉生长抑制素、活化素或GDF-11
中的至少一种的多肽，任选地，其中所述多肽是选自由以下组成的群组：(a)由列举于由SEQ ID NO：4、6、12和14组成的群组中的氨基酸序列组成的多肽；(b)与(a)具有至少90％序列一致性的多肽，且所述多肽在对应于SEQ ID NO：2中所示序列的位置28的位置具有W或Y且在
对应于SEQ ID NO：2中所示序列的位置44的位置具有T；(c)与(a)具有至少95％序列一致性
的多肽，其中所述多肽在对应于SEQ ID NO：2中所示序列的位置28的位置具有W或Y且在对
应于SEQ ID NO：2中所示序列的位置44的位置具有T；和(d)序列与SEQ ID NO：2的氨基酸
19-25、19、20、21、22、23、24或25直至130-134、125、126、127、128、129、130、131、132、133或
134中所示序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％一致的多肽；且其中相对于时间段开始时(0月)的所述组合物中的蛋白质或相对于相同蛋白质在-20℃或-70℃、
在其他相同条件下保持大于1个月，所述组合物中的蛋白质在溶液中在2-8℃或5℃保存时
保持至少80％稳定性大于1个月的时间段；且任选地，其中所述组合物进一步包含化学治疗
剂或第二治疗剂。
中的至少一种的多肽，任选地，其中所述多肽是选自由以下组成的群组：(a)由列举于由SEQ ID NO：4、6、12和14组成的群组中的氨基酸序列组成的多肽；(b)与(a)具有至少90％序列一致性的多肽，且所述多肽在对应于SEQ ID NO：2中所示序列的位置28的位置具有W或Y且在
对应于SEQ ID NO：2中所示序列的位置44的位置具有T；(c)与(a)具有至少95％序列一致性
的多肽，其中所述多肽在对应于SEQ ID NO：2中所示序列的位置28的位置具有W或Y且在对
应于SEQ ID NO：2中所示序列的位置44的位置具有T；和(d)序列与SEQ ID NO：2的氨基酸
19-25、19、20、21、22、23、24或25直至130-134、125、126、127、128、129、130、131、132、133或
134中所示序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％一致的多肽；且其中相对于时间段开始时(0月)的所述组合物中的蛋白质或相对于相同蛋白质在-20℃或-70℃、
在其他相同条件下保持大于1个月，所述组合物中的蛋白质在溶液中在2-8℃或5℃保存时
保持至少80％稳定性大于1个月的时间段；且任选地，其中所述组合物进一步包含化学治疗
剂或第二治疗剂。
[0014] 本文还揭露一种抑制个体的实体肿瘤生长或治疗个体的实体肿瘤的方法，其包含向所述个体施用至少0.1mg/kg至20mg/kg范围内的固定剂量的蛋白质，其中所述蛋白质包
含能够结合肌肉生长抑制素、活化素或GDF-11中的至少一种的多肽，任选地，其中所述多肽
是选自由以下组成的群组：(a)由列举于由SEQ ID NO：4、6、12和14组成的群组中的氨基酸
序列组成的多肽；(b)与(a)具有至少90％序列一致性的多肽，且所述多肽在对应于SEQ ID
NO：2中所示序列的位置28的位置具有W或Y且在对应于SEQ ID NO：2中所示序列的位置44的
位置具有T；(c)与(a)具有至少95％序列一致性的多肽，其中所述多肽在对应于SEQ ID NO：
2中所示序列的位置28的位置具有W或Y且在对应于SEQ ID NO：2中所示序列的位置44的位
置具有T；和(d)序列与SEQ ID NO：2的氨基酸19-25、19、20、21、22、23、24或25直至130-134、
125、126、127、128、129、130、131、132、133或134中所示序列具有至少80％、85％、90％、
95％、96％、97％、98％或99％一致性的多肽。
含能够结合肌肉生长抑制素、活化素或GDF-11中的至少一种的多肽，任选地，其中所述多肽
是选自由以下组成的群组：(a)由列举于由SEQ ID NO：4、6、12和14组成的群组中的氨基酸
序列组成的多肽；(b)与(a)具有至少90％序列一致性的多肽，且所述多肽在对应于SEQ ID
NO：2中所示序列的位置28的位置具有W或Y且在对应于SEQ ID NO：2中所示序列的位置44的
位置具有T；(c)与(a)具有至少95％序列一致性的多肽，其中所述多肽在对应于SEQ ID NO：
2中所示序列的位置28的位置具有W或Y且在对应于SEQ ID NO：2中所示序列的位置44的位
置具有T；和(d)序列与SEQ ID NO：2的氨基酸19-25、19、20、21、22、23、24或25直至130-134、
125、126、127、128、129、130、131、132、133或134中所示序列具有至少80％、85％、90％、
95％、96％、97％、98％或99％一致性的多肽。
[0015] 本文还揭露一种抑制、减轻或治疗个体的恶病质的方法，其包含向所述个体施用至少0.1mg/kg至20mg/kg范围内的固定剂量的蛋白质，其中所述蛋白质包含能够结合肌肉
生长抑制素、活化素或GDF-11中的至少一种的多肽，任选地，其中所述多肽是选自由以下组
成的群组：(a)由列举于中由SEQ ID NO：4、6、12和14组成的群组的氨基酸序列组成的多肽；
(b)与(a)具有至少90％序列一致性的多肽，且所述多肽在对应于SEQ ID NO：2中所示序列
的位置28的位置具有W或Y且在对应于SEQ ID NO：2中所示序列的位置44的位置具有T；(c)
与(a)具有至少95％序列一致性的多肽，其中所述多肽在对应于SEQ ID NO：2中所示序列的
位置28的位置具有W或Y且在对应于SEQ ID NO：2中所示序列的位置44的位置具有T，和(d)
序列与SEQ ID NO：2的氨基酸19-25、19、20、21、22、23、24或25直至130-134、125、126、127、
128、129、130、131、132、133或134中所示序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的多肽。
生长抑制素、活化素或GDF-11中的至少一种的多肽，任选地，其中所述多肽是选自由以下组
成的群组：(a)由列举于中由SEQ ID NO：4、6、12和14组成的群组的氨基酸序列组成的多肽；
(b)与(a)具有至少90％序列一致性的多肽，且所述多肽在对应于SEQ ID NO：2中所示序列
的位置28的位置具有W或Y且在对应于SEQ ID NO：2中所示序列的位置44的位置具有T；(c)
与(a)具有至少95％序列一致性的多肽，其中所述多肽在对应于SEQ ID NO：2中所示序列的
位置28的位置具有W或Y且在对应于SEQ ID NO：2中所示序列的位置44的位置具有T，和(d)
序列与SEQ ID NO：2的氨基酸19-25、19、20、21、22、23、24或25直至130-134、125、126、127、
128、129、130、131、132、133或134中所示序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的多肽。
[0016] 本文还揭露一种治疗个体的肥胖或肥胖相关性疾病、增加或维持个体的肌肉质量或减少个体的脂肪质量的方法，其包含：向所述个体施用有效剂量的抑制活化素、肌肉生长
抑制素和GDF-11中的至少一种的蛋白质，任选地，其中肥胖相关性疾病为遗传性肥胖综合
症、普拉德威利综合症(Prader willi syndrome)、下丘脑病症、家族性高胆固醇血症、巴
德-毕德氏综合症(Bardet-Biedl syndrome)、普拉德-威利综合症(Prader-willi
syndrome)、15q11-13上的印记基因缺失所致的综合症、艾尔斯通综合症(Alstrom
syndrome)、柯亨综合症(Cohen syndrome)、艾尔伯拉特遗传性骨营养不良(Albright′s
hereditary osteodystrophy)(假副甲状腺低能症)、卡本特综合症(Carpenter
syndrome)、MOMO综合症、鲁宾斯坦-泰必综合症(Rubinstein-Taybi syndrome)；6q16、1p36、
2q37和9q34中的至少一种缺失所致的综合症；染色体14的母源单亲双染色体症、脆弱X染色
体综合症、动脉粥样硬化、非酒精性脂肝炎、其中内脏脂肪沉积导致一或多种有害结果的疾
病、脑血管疾病、脂肪肝和伯吉森-佛斯曼-莱曼综合症(
syndrome)，且任选地，其中所述多肽是选自由以下组成的群组：(a)由列举于由SEQ ID NO：
4、6、12和14组成的群组中的氨基酸序列组成的多肽；(b)与(a)具有至少90％序列一致性的
多肽，且所述多肽在对应于SEQ ID NO：2中所示序列的位置28的位置具有W或Y且在对应于
SEQ ID NO：2中所示序列的位置44的位置具有T；(c)与(a)具有至少95％序列一致性的多
肽，其中所述多肽在对应于SEQ ID NO：2中所示序列的位置28具有W或Y且在对应于SEQ ID
NO：2中所示序列的位置44的位置具有T；和(d)序列与SEQ ID NO：2的氨基酸19-25、19、20、
21、22、23、24或25直至130-134、125、126、127、128、129、130、131、132、133或134中所示序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的多肽。
抑制素和GDF-11中的至少一种的蛋白质，任选地，其中肥胖相关性疾病为遗传性肥胖综合
症、普拉德威利综合症(Prader willi syndrome)、下丘脑病症、家族性高胆固醇血症、巴
德-毕德氏综合症(Bardet-Biedl syndrome)、普拉德-威利综合症(Prader-willi
syndrome)、15q11-13上的印记基因缺失所致的综合症、艾尔斯通综合症(Alstrom
syndrome)、柯亨综合症(Cohen syndrome)、艾尔伯拉特遗传性骨营养不良(Albright′s
hereditary osteodystrophy)(假副甲状腺低能症)、卡本特综合症(Carpenter
syndrome)、MOMO综合症、鲁宾斯坦-泰必综合症(Rubinstein-Taybi syndrome)；6q16、1p36、
2q37和9q34中的至少一种缺失所致的综合症；染色体14的母源单亲双染色体症、脆弱X染色
体综合症、动脉粥样硬化、非酒精性脂肝炎、其中内脏脂肪沉积导致一或多种有害结果的疾
病、脑血管疾病、脂肪肝和伯吉森-佛斯曼-莱曼综合症(
syndrome)，且任选地，其中所述多肽是选自由以下组成的群组：(a)由列举于由SEQ ID NO：
4、6、12和14组成的群组中的氨基酸序列组成的多肽；(b)与(a)具有至少90％序列一致性的
多肽，且所述多肽在对应于SEQ ID NO：2中所示序列的位置28的位置具有W或Y且在对应于
SEQ ID NO：2中所示序列的位置44的位置具有T；(c)与(a)具有至少95％序列一致性的多
肽，其中所述多肽在对应于SEQ ID NO：2中所示序列的位置28具有W或Y且在对应于SEQ ID
NO：2中所示序列的位置44的位置具有T；和(d)序列与SEQ ID NO：2的氨基酸19-25、19、20、
21、22、23、24或25直至130-134、125、126、127、128、129、130、131、132、133或134中所示序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的多肽。
[0017] 本文还揭露一种制备蛋白质的方法，所述蛋白质包含能够结合肌肉生长抑制素、活化素或GDF-11中的至少一种的多肽，任选地，其中所述多肽是选自由以下组成的群组：
(a)由列举于中由SEQ ID NO：4、6、12和14组成的群组的氨基酸序列组成的多肽；(b)与(a)
具有至少90％序列一致性的多肽，且所述多肽在对应于SEQ ID NO：2中所示序列的位置28
的位置具有W或Y且在对应于SEQ ID NO：2中所示序列的位置44的位置具有T；(c)与(a)具有
至少95％序列一致性的多肽，其中所述多肽在对应于SEQ ID NO：2中所示序列的位置28的
位置具有W或Y且在对应于SEQ ID NO：2中所示序列的位置44的位置具有T，和(d)序列与SEQ
ID NO：2的氨基酸19-25、19、20、21、22、23、24或25直至130-134、125、126、127、128、129、
130、131、132、133或134中所示序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或
99％一致性的多肽，其中所述方法包含：在细胞培养液中培养经工程改造可表达所述蛋白
质的CS9中国仓鼠卵巢细胞株；自培养物中收获所述蛋白质；和提纯所述蛋白质。
附图说明
(a)由列举于中由SEQ ID NO：4、6、12和14组成的群组的氨基酸序列组成的多肽；(b)与(a)
具有至少90％序列一致性的多肽，且所述多肽在对应于SEQ ID NO：2中所示序列的位置28
的位置具有W或Y且在对应于SEQ ID NO：2中所示序列的位置44的位置具有T；(c)与(a)具有
至少95％序列一致性的多肽，其中所述多肽在对应于SEQ ID NO：2中所示序列的位置28的
位置具有W或Y且在对应于SEQ ID NO：2中所示序列的位置44的位置具有T，和(d)序列与SEQ
ID NO：2的氨基酸19-25、19、20、21、22、23、24或25直至130-134、125、126、127、128、129、
130、131、132、133或134中所示序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或
99％一致性的多肽，其中所述方法包含：在细胞培养液中培养经工程改造可表达所述蛋白
质的CS9中国仓鼠卵巢细胞株；自培养物中收获所述蛋白质；和提纯所述蛋白质。
附图说明
[0018] 这些和其他特征、方面和优点结合以下具体实施方式和附图将变得更好理解，其中：
[0019] 图1显示用于制备STM 434的细胞培养方法的概述。
[0020] 图2显示STM 434的提纯方法的概述。
[0021] 图3显示制备和封装STM 434的流程图。
[0022] 图4显示在施用以0.25mg/kg给予的STM 434之后，3位个体中有2者中的FSH含量降低。
[0023] 图5显示人体中的STM 434的期中PK分析。
[0024] 图6显示基线扫描，其中肿瘤以圆形指示。
[0025] 图7显示第4循环开始时获得的后续扫描，其中肿瘤再次以圆形指示。
[0026] 发明详述
[0027] 组合物
[0028] 本文描述一种包含稳定化人类活化素IIB受体(svActRIIB)多肽的经分离的蛋白质和相关配制物。蛋白质和多肽的特征可为其能够结合到三种TGF-β蛋白质(肌肉生长抑制
素(GDF-8)、活化素A或GDF-11)中的至少一种以抑制这些蛋白质中的至少一种的活性且与
其他ActRIIB可溶性受体相比任选地具有改善的可制造性特性。稳定化人类活化素IIB受体
多肽的特征可为相对于ActRIIB的胞外域，位置E28与S44均存在氨基酸取代，如SEQ ID NO：
2中所示。在一个实施例中，稳定化人类活化素IIB受体多肽在相对于SEQ ID NO：2的位置64
可具有丙氨酸的进一步取代。在一些方面中，蛋白质为抗体、基于ActRIIB的蛋白质，和/或
Fc融合蛋白。在一些方面中，Fc融合蛋白为ActRIIB Fc融合蛋白。在一些方面中，ActRIIB蛋白质包含与SEQ ID NO：2的氨基酸19-25、19、20、21、22、23、24或25直至130-134、125、126、
127、128、129、130、131、132、133或134中所示序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、
97％、98％或99％一致性的序列，任选地，其中Fc为IgG，任选地，其中IgG为人类IgG。在一些方面中，ActRIIB蛋白质包含或其组成为SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：10中所示序列。在一些
方面中，ActRIIB蛋白质包含与SEQ ID NO：6中所示序列具有至少80％、85％、90％、95％、
96％、97％、98％或99％一致性的序列。在一些方面中，ActRIIB蛋白质包含与SEQ ID NO：6中所示序列不同的处少于1-2、1、2、3、4或5个氨基酸的序列。在一些方面中，蛋白质抑制活化素、肌肉生长抑制素和GDF-11中的至少两种。在一些方面中，蛋白质抑制活化素、肌肉生
长抑制素和GDF-11。在一些方面中，蛋白质抑制活化素。
素(GDF-8)、活化素A或GDF-11)中的至少一种以抑制这些蛋白质中的至少一种的活性且与
其他ActRIIB可溶性受体相比任选地具有改善的可制造性特性。稳定化人类活化素IIB受体
多肽的特征可为相对于ActRIIB的胞外域，位置E28与S44均存在氨基酸取代，如SEQ ID NO：
2中所示。在一个实施例中，稳定化人类活化素IIB受体多肽在相对于SEQ ID NO：2的位置64
可具有丙氨酸的进一步取代。在一些方面中，蛋白质为抗体、基于ActRIIB的蛋白质，和/或
Fc融合蛋白。在一些方面中，Fc融合蛋白为ActRIIB Fc融合蛋白。在一些方面中，ActRIIB蛋白质包含与SEQ ID NO：2的氨基酸19-25、19、20、21、22、23、24或25直至130-134、125、126、
127、128、129、130、131、132、133或134中所示序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、
97％、98％或99％一致性的序列，任选地，其中Fc为IgG，任选地，其中IgG为人类IgG。在一些方面中，ActRIIB蛋白质包含或其组成为SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：10中所示序列。在一些
方面中，ActRIIB蛋白质包含与SEQ ID NO：6中所示序列具有至少80％、85％、90％、95％、
96％、97％、98％或99％一致性的序列。在一些方面中，ActRIIB蛋白质包含与SEQ ID NO：6中所示序列不同的处少于1-2、1、2、3、4或5个氨基酸的序列。在一些方面中，蛋白质抑制活化素、肌肉生长抑制素和GDF-11中的至少两种。在一些方面中，蛋白质抑制活化素、肌肉生
长抑制素和GDF-11。在一些方面中，蛋白质抑制活化素。
[0029] 如本文所用，术语“TGF-β家族成员”或“TGF-β蛋白质”是指包括活化素的转型生长因子家族的结构相关生长因子，以及生长和分化因子(GDF)蛋白质(金斯蕾(Kingsley)等人《，基因与发育》8：133-146(1994)；麦克菲隆等人，健康和疾病中的生长因子与细胞激素(Growth factors and cytokines in health and disease)，第1B卷，D.莱诺(D.LeRoith)
和C.邦迪(C.Bondy.)编，JAI出版社有限公司(JAI Press Inc.)，美国康涅狄格州格林威治
(Greenwich，Conn，USA)：第357-393页)。
和C.邦迪(C.Bondy.)编，JAI出版社有限公司(JAI Press Inc.)，美国康涅狄格州格林威治
(Greenwich，Conn，USA)：第357-393页)。
[0030] GDF-8，还称为肌肉生长抑制素，为骨骼肌组织的负调节剂(麦克菲隆等人，《美国科学院院报》94：12457-12461(1997))。肌肉生长抑制素经合成为长度约375个氨基酸的非
活性蛋白质，人类的肌肉生长抑制素具有基因库登记号：AAB86694。前驱蛋白通过蛋白水解
分裂而在四碱基加工位点活化，产生N末端非活性前域与约109个氨基酸的C末端蛋白质，其
二聚合而形成约25kDa的均二聚体。此均二聚体为成熟的生物活性蛋白质(辛姆(Zimmers)
等人，《科学》296，1486(2002))。
活性蛋白质，人类的肌肉生长抑制素具有基因库登记号：AAB86694。前驱蛋白通过蛋白水解
分裂而在四碱基加工位点活化，产生N末端非活性前域与约109个氨基酸的C末端蛋白质，其
二聚合而形成约25kDa的均二聚体。此均二聚体为成熟的生物活性蛋白质(辛姆(Zimmers)
等人，《科学》296，1486(2002))。
[0031] 如本文所使用，术语“前域”或“前肽”是指经裂解而释放活性C末端蛋白质的非活性N末端蛋白质。如本文所用，术语“肌肉生长抑制素”或“成熟肌肉生长抑制素”是指呈单体、二聚物或其他形式的成熟、生物活性C末端多肽，以及生物活性片段或相关多肽，包括对偶基因变体、剪接变体以及融合肽和多肽。已报道成熟肌肉生长抑制素在多种物种(包括人
类、小鼠、鸡、猪、火鸡和大鼠)中具有100％序列一致性(李等人，《美国科学院院报》98，9306(2001))。
类、小鼠、鸡、猪、火鸡和大鼠)中具有100％序列一致性(李等人，《美国科学院院报》98，9306(2001))。
[0032] 如本文所用，GDF-11是指具有Swissprot登记号O95390的BMP(促骨骼形态形成的蛋白质)，以及所述蛋白质的变体和物种同源物。GDF-11涉及轴向骨架之前/后模式化的调
节(麦克菲隆等人《，自然遗传学(Nature Genet.)》22(93)：260-264(1999)；盖姆(Gamer)等人，《发育生物学(Dev.Biol.)》208(1)，222-232(1999))，但出生后功能未知。
节(麦克菲隆等人《，自然遗传学(Nature Genet.)》22(93)：260-264(1999)；盖姆(Gamer)等人，《发育生物学(Dev.Biol.)》208(1)，222-232(1999))，但出生后功能未知。
[0033] 活化素A为多肽链βA的均二聚体。如本文所用，术语“活化素A”是指具有基因库登记号：NM_002192的活化素蛋白质。活化素A、B和AB分别为两种多肽链βA和βB的均二聚体和杂二聚体。如本文所用，“活化素”是指活化素A、B和AB，以及所述蛋白质的变体和物种同源物。
[0034] 受体多肽
[0035] 如本文所用，术语活化素IIB型受体(ActRIIB)是指具有登记号NP_001097的人类活化素受体或其变体，如位置64的精氨酸经丙氨酸取代的那些受体。术语可溶性ActRIIB
(野生型)是指ActRIIB的胞外域，例如SEQ ID NO：2的氨基酸1至134(具有信号序列)，或氨
基酸19直至134(无信号序列)，或SEQ ID NO：2的氨基酸20、21、22、23、24或25直至134(无信号序列)。
(野生型)是指ActRIIB的胞外域，例如SEQ ID NO：2的氨基酸1至134(具有信号序列)，或氨
基酸19直至134(无信号序列)，或SEQ ID NO：2的氨基酸20、21、22、23、24或25直至134(无信号序列)。
[0036] 稳定化受体多肽
[0037] 本文还提供一种经分离的蛋白质，其包含稳定化ActIIB受体多肽(在本文中称为“svActRIIB多肽”)。如本文所用，术语“svActRIIB蛋白质”是指包含稳定化ActRIIB多肽的蛋白质。这些多肽和蛋白质的特征为，除可制造性特征改善之外，还能够结合和抑制活化素
A、肌肉生长抑制素或GDF-11中任一种的活性。
A、肌肉生长抑制素或GDF-11中任一种的活性。
[0038] 稳定化ActRIIB多肽的特征可为相对于SEQ ID NO：2的位置28与44均具有氨基酸取代。出于一致性，稳定化ActRIIB多肽和蛋白质上的氨基酸位置均相对于SEQ ID NO：2中
的位置提及，不论多肽是否为成熟的或截短的。如本文所使用，术语“成熟”是指多肽或肽不具有其信号序列。如本文所使用，术语“截短”是指N末端氨基酸或C末端氨基酸已除去的多
肽。
的位置提及，不论多肽是否为成熟的或截短的。如本文所使用，术语“成熟”是指多肽或肽不具有其信号序列。如本文所使用，术语“截短”是指N末端氨基酸或C末端氨基酸已除去的多
肽。
[0039] 在一个实施例中，经分离的稳定化活化素IIB受体多肽(svActRIIB)具有SEQ ID NO：2中所示的多肽序列。在另一个实施例中，多肽具有SEQ ID NO：2的氨基酸19直至134中
所示序列。在另一个实施例中，多肽具有SEQ ID NO：2的氨基酸23直至134中所示序列。在另一个实施例中，多肽具有SEQ ID NO：2的氨基酸25直至134中所示序列。在另一个实施例中，多肽与上述多肽中的任一种具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列。在一个实施例中，多肽能够结合肌肉生长抑制素、活化素A或GDF-11。在一个实施例中，经分离的稳定化活化素IIB受体多肽(svActRIIB)包含与SEQ ID NO：2的氨基
酸19-24、19、20、21、22、23、24或25直至130-134、125、126、127、128、129、130、131、132、133或134中所示序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的序列。
所示序列。在另一个实施例中，多肽具有SEQ ID NO：2的氨基酸23直至134中所示序列。在另一个实施例中，多肽具有SEQ ID NO：2的氨基酸25直至134中所示序列。在另一个实施例中，多肽与上述多肽中的任一种具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列。在一个实施例中，多肽能够结合肌肉生长抑制素、活化素A或GDF-11。在一个实施例中，经分离的稳定化活化素IIB受体多肽(svActRIIB)包含与SEQ ID NO：2的氨基
酸19-24、19、20、21、22、23、24或25直至130-134、125、126、127、128、129、130、131、132、133或134中所示序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的序列。
[0040] 在一个实施例中，经分离的稳定化活化素IIB受体多肽(svActRIIB)具有SEQ ID NO：2中所示的多肽序列，但位置28具有氨基酸取代且位置44具有氨基酸取代，其中位置28
的取代是选自W或Y，且位置44的取代为T。在另一个实施例中，多肽具有SEQ ID NO：2的氨基酸19直至134中所示序列，但位置28具有氨基酸取代，且位置44具有氨基酸取代，其中位置
28的取代是选自W或Y，且位置44的取代为T。在另一个实施例中，多肽具有SEQ ID NO：2的氨基酸23直至134中所示序列，但位置28具有氨基酸取代，且位置44具有氨基酸取代，其中位
置28的取代是选自W或Y，且位置44的取代为T。在另一个实施例中，多肽具有SEQ ID NO：2的氨基酸25直至134中所示序列，但位置28具有氨基酸取代，且位置44具有氨基酸取代，其中
位置28的取代是选自W或Y，且位置44的取代为T。在另一个实施例中，多肽具有与上述多肽
中的任一种具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列，其中多肽具有位置28的氨基酸取代和位置44的氨基酸取代，任选地，其中位置28的取代是
选自W或Y，且位置44的取代为T，且其中多肽能够结合肌肉生长抑制素、活化素A或GDF-11。
在一个实施例中，上述多肽的位置28的取代为W，且位置44的取代为T，其中多肽能够结合肌
肉生长抑制素、活化素A或GDF-11。
的取代是选自W或Y，且位置44的取代为T。在另一个实施例中，多肽具有SEQ ID NO：2的氨基酸19直至134中所示序列，但位置28具有氨基酸取代，且位置44具有氨基酸取代，其中位置
28的取代是选自W或Y，且位置44的取代为T。在另一个实施例中，多肽具有SEQ ID NO：2的氨基酸23直至134中所示序列，但位置28具有氨基酸取代，且位置44具有氨基酸取代，其中位
置28的取代是选自W或Y，且位置44的取代为T。在另一个实施例中，多肽具有SEQ ID NO：2的氨基酸25直至134中所示序列，但位置28具有氨基酸取代，且位置44具有氨基酸取代，其中
位置28的取代是选自W或Y，且位置44的取代为T。在另一个实施例中，多肽具有与上述多肽
中的任一种具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列，其中多肽具有位置28的氨基酸取代和位置44的氨基酸取代，任选地，其中位置28的取代是
选自W或Y，且位置44的取代为T，且其中多肽能够结合肌肉生长抑制素、活化素A或GDF-11。
在一个实施例中，上述多肽的位置28的取代为W，且位置44的取代为T，其中多肽能够结合肌
肉生长抑制素、活化素A或GDF-11。
[0041] 在一个实施例中，svActRIIB多肽包括信号序列，例如SEQ ID NO：4、8、12和16中所示的序列。然而，可使用各种信号肽制备本申请的多肽。信号肽可具有例如SEQ ID NO：4的氨基酸1至19中所示序列。可使用适用于表达svActRIIB多肽的任何其他信号肽。在其他实
施例中，除去信号序列，得到成熟肽。缺乏信号序列的svActRIIB多肽的实例包括例如SEQ
ID NO：6、10、14和18中所示的序列。
施例中，除去信号序列，得到成熟肽。缺乏信号序列的svActRIIB多肽的实例包括例如SEQ
ID NO：6、10、14和18中所示的序列。
[0042] 在一个实施例中，蛋白质包含稳定化活化素IIB受体多肽，其中多肽是选自由以下组成的群组：具有由SEQ ID NO：4、6、12和14组成的群组中所示序列的多肽。这些多肽代表SEQ ID NO：2的氨基酸25至134，其中多肽具有位置28的氨基酸取代和位置44的氨基酸取
代，其中位置28的取代是选自W或Y，且位置44的取代为T，且其中多肽能够结合肌肉生长抑
制素、活化素A或GDF-11，具有和不具有不同于SEQ ID NO：2中所示的信号序列。在另一个实施例中，蛋白质包含与SEQ ID NO：4、6、12或14具有至少80-100％、90-100％、85-95％、90-
95％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的多肽，任选地，其中多肽在位置28具有W或Y且在位置44具有T，且其中多肽能够结合肌肉生长抑制素、活化素A或
GDF-11。在一个实施例中，位置28的取代为W且位置44的取代为T，其中多肽能够结合肌肉生
长抑制素、活化素A或GDF-11。
代，其中位置28的取代是选自W或Y，且位置44的取代为T，且其中多肽能够结合肌肉生长抑
制素、活化素A或GDF-11，具有和不具有不同于SEQ ID NO：2中所示的信号序列。在另一个实施例中，蛋白质包含与SEQ ID NO：4、6、12或14具有至少80-100％、90-100％、85-95％、90-
95％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的多肽，任选地，其中多肽在位置28具有W或Y且在位置44具有T，且其中多肽能够结合肌肉生长抑制素、活化素A或
GDF-11。在一个实施例中，位置28的取代为W且位置44的取代为T，其中多肽能够结合肌肉生
长抑制素、活化素A或GDF-11。
[0043] 在另一实施例中，svActRIIB蛋白质进一步包含异质蛋白质。在一个实施例中，异质蛋白质为Fc域。在另一实施例中，Fc域为人类IgG Fc域。在一个实施例中，蛋白质包含具
有由SEQ ID NO：8、10、16和18组成的群组中所示序列的多肽。在另一个实施例中，蛋白质包含与SEQ ID NO：8、10、16或18中所示序列具有至少80-100％、90-100％、85-95％、90-95％、
80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的多肽，任选地，其中多肽在位置28具有W或Y且在位置44具有T，且其中多肽能够结合肌肉生长抑制素、活化素A或GDF-11。
在一个实施例中，位置28的取代为W且位置44的取代为T，其中多肽能够结合肌肉生长抑制
素、活化素A或GDF-11。在某些方面中，蛋白质包含或其组成为SEQ ID NO：10中所示的序列。
在某些方面中，序列发生糖基化。
有由SEQ ID NO：8、10、16和18组成的群组中所示序列的多肽。在另一个实施例中，蛋白质包含与SEQ ID NO：8、10、16或18中所示序列具有至少80-100％、90-100％、85-95％、90-95％、
80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的多肽，任选地，其中多肽在位置28具有W或Y且在位置44具有T，且其中多肽能够结合肌肉生长抑制素、活化素A或GDF-11。
在一个实施例中，位置28的取代为W且位置44的取代为T，其中多肽能够结合肌肉生长抑制
素、活化素A或GDF-11。在某些方面中，蛋白质包含或其组成为SEQ ID NO：10中所示的序列。
在某些方面中，序列发生糖基化。
[0044] 在另一实施例中，svActRIIB蛋白质为实例中所述的STM 434。
[0045] 在另一实施例中，蛋白质包含上述多肽中的任一种，其中位置64的氨基酸残基为丙氨酸。
[0046] 在另一个实施例中，术语svActRIIB多肽和蛋白质涵盖包含SEQ ID NO：2、4、6、12和14的片段(包括N和C末端截短)的蛋白质，其中位置28为W或Y，且位置44为T，且其中多肽
能够结合肌肉生长抑制素、活化素A或GDF-11。
能够结合肌肉生长抑制素、活化素A或GDF-11。
[0047] 如本文所用，术语svActRIIB多肽的“衍生物”是指连接至少一种其他化学部分或至少一种其他多肽而形成共价或聚集体结合物，如糖基、脂质、乙酰基，或C末端或N末端融
合多肽；与PEG分子结合；和下文更充分描述的其他修饰。稳定化ActRIIB受体多肽还可包括
其它修饰和衍生物，包括由于在不同类型细胞(如哺乳动物细胞、大肠杆菌、酵母和其它重
组宿主细胞)表达而由加工产生的C和N末端修饰。
合多肽；与PEG分子结合；和下文更充分描述的其他修饰。稳定化ActRIIB受体多肽还可包括
其它修饰和衍生物，包括由于在不同类型细胞(如哺乳动物细胞、大肠杆菌、酵母和其它重
组宿主细胞)表达而由加工产生的C和N末端修饰。
[0048] svActRIIB蛋白质可进一步包含直接或经由连接子连接至svActRIIB多肽的异质多肽以形成融合蛋白。如本文所用，术语“融合蛋白”是指异质多肽与另一多肽(如
svActRIIB)连接的蛋白质。异质多肽包括(但不限于)Fc多肽、his标记和白氨酸拉链域以促
进稳定化ActRIIB多肽的寡聚和进一步稳定化，如例如WO 00/29581中所述，所述文献通过
引用结合在此。在一个实施例中，异质多肽为Fc多肽或域。在一个实施例中，Fc域是选自人
类IgG1 Fc(SEQ ID NO：23)、经修饰的IgG1 Fc、IgG2 Fc(SEQ ID NO：22)和IgG4 Fc(SEQ ID NO：24)域。SvActRIIB蛋白质可进一步包含IgG1、IgG2或IgG4的铰链序列的全部或一部分。
例示性svActRIIB多肽是选自由如SEQ ID NO：8、10、16和18中所示序列组成的多肽，以及与这些序列具有实质性相似度的那些多肽，其中位置28和44的取代予以保留。如本文所用，
“实质性相似度”是指与SEQ ID NO：8、10、16和18中的任一种至少80-100％、90-100％、85-
95％、90-95％、80％一致、85％一致、90％一致、95％一致、96％一致、97％一致、98％一致、
99％一致的序列，其中多肽保留位置28的W或Y和位置44的T，且其中多肽能够结合肌肉生长
抑制素、活化素A或GDF-11。在一个实施例中，位置28的取代为W且位置44的取代为T，其中多肽能够结合肌肉生长抑制素、活化素A或GDF-11。
svActRIIB)连接的蛋白质。异质多肽包括(但不限于)Fc多肽、his标记和白氨酸拉链域以促
进稳定化ActRIIB多肽的寡聚和进一步稳定化，如例如WO 00/29581中所述，所述文献通过
引用结合在此。在一个实施例中，异质多肽为Fc多肽或域。在一个实施例中，Fc域是选自人
类IgG1 Fc(SEQ ID NO：23)、经修饰的IgG1 Fc、IgG2 Fc(SEQ ID NO：22)和IgG4 Fc(SEQ ID NO：24)域。SvActRIIB蛋白质可进一步包含IgG1、IgG2或IgG4的铰链序列的全部或一部分。
例示性svActRIIB多肽是选自由如SEQ ID NO：8、10、16和18中所示序列组成的多肽，以及与这些序列具有实质性相似度的那些多肽，其中位置28和44的取代予以保留。如本文所用，
“实质性相似度”是指与SEQ ID NO：8、10、16和18中的任一种至少80-100％、90-100％、85-
95％、90-95％、80％一致、85％一致、90％一致、95％一致、96％一致、97％一致、98％一致、
99％一致的序列，其中多肽保留位置28的W或Y和位置44的T，且其中多肽能够结合肌肉生长
抑制素、活化素A或GDF-11。在一个实施例中，位置28的取代为W且位置44的取代为T，其中多肽能够结合肌肉生长抑制素、活化素A或GDF-11。
[0049] svActRIIB多肽可任选地进一步包含“连接子”。连接子主要用作多肽与第二异质多肽或其它类型融合物之间或两种或超过两种稳定化ActRIIB多肽之间的间隔子。在一个
实施例中，连接子是由经肽键连接在一起的氨基酸组成，优选由经肽键连接的1至20个氨基
酸组成，其中氨基酸是选自20种天然存在的氨基酸。这些氨基酸中的一或多者可经糖基化，
如所属领域的技术人员所了解。在一个实施例中，1至20种氨基酸可选自甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、天冬酰胺、谷酰胺和赖氨酸。在一个实施例中，连接子由大部分无空间位阻的氨基酸
(如甘氨酸和丙氨酸)组成。例示性连接子为聚甘氨酸，特定言之，(Gly)5(SEQ ID NO：51)、(Gly)8(SEQ ID NO：52)、聚(Gly-Ala)和聚丙氨酸。一种例示性适合连接子为(Gly)4Ser
(SEQ ID NO：25)。在另一实施例中，svActRIIB可包含“铰链连接子”，其为邻近于IgG的铰链区或部分铰链区提供的连接子序列，如SEQ ID NO：27中所说明。铰链序列包括IgG2Fc、
IgG1Fc和IgG4Fc。
实施例中，连接子是由经肽键连接在一起的氨基酸组成，优选由经肽键连接的1至20个氨基
酸组成，其中氨基酸是选自20种天然存在的氨基酸。这些氨基酸中的一或多者可经糖基化，
如所属领域的技术人员所了解。在一个实施例中，1至20种氨基酸可选自甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、天冬酰胺、谷酰胺和赖氨酸。在一个实施例中，连接子由大部分无空间位阻的氨基酸
(如甘氨酸和丙氨酸)组成。例示性连接子为聚甘氨酸，特定言之，(Gly)5(SEQ ID NO：51)、(Gly)8(SEQ ID NO：52)、聚(Gly-Ala)和聚丙氨酸。一种例示性适合连接子为(Gly)4Ser
(SEQ ID NO：25)。在另一实施例中，svActRIIB可包含“铰链连接子”，其为邻近于IgG的铰链区或部分铰链区提供的连接子序列，如SEQ ID NO：27中所说明。铰链序列包括IgG2Fc、
IgG1Fc和IgG4Fc。
[0050] 铰链连接子序列还可经设计以改善svActRIIB-Fc蛋白质的可制造性和稳定性。在一个实施例中，SEQ ID NO：27、38、40、42、44、45和46的铰链连接子经设计以改善IgG2 Fc(SEQ ID NO：22)当连接至svActRIIB多肽时的可制造性。在一个实施例中，铰链连接子序列
经设计以便在svActRIIB多肽连接至人类IgG1 Fc(SEQ ID NO：23)或经修饰的人类IgG1 Fc
时改善可制造性。
经设计以便在svActRIIB多肽连接至人类IgG1 Fc(SEQ ID NO：23)或经修饰的人类IgG1 Fc
时改善可制造性。
[0051] 连接子还可为非肽连接子。举例来说，可使用烷基连接子，如-NH-(CH2)s-C(O)-，其中s＝2-20。这些烷基连接子可进一步经任何无空间位阻的基团取代，如低级烷基(例如
C1-C6)、低级酰基、卤素(例如Cl、Br)、CN、NH2、苯基等。
C1-C6)、低级酰基、卤素(例如Cl、Br)、CN、NH2、苯基等。
[0052] 本文揭露的svActRIIB多肽还可连接至非多肽分子，用于赋予svActRIIB多肽所要特性的目的，如减少降解和/或延长半衰期、降低毒性、降低免疫原性和/或增强生物活性。
例示性分子包括(但不限于)线性聚合物，如聚乙二醇(PEG)、聚赖氨酸、聚葡萄糖、脂质、胆固醇族群(如类固醇)；碳水化合物，或寡醣分子。
例示性分子包括(但不限于)线性聚合物，如聚乙二醇(PEG)、聚赖氨酸、聚葡萄糖、脂质、胆固醇族群(如类固醇)；碳水化合物，或寡醣分子。
[0053] svActRIIB蛋白质和多肽相较于其它ActRIIB可溶性多肽可具有改善的可制造性特性。如本文所使用，术语“可制造性”是指特定蛋白质在所述蛋白质的重组表达和提纯期
间的稳定性。可制造性相信归因于分子在表达和提纯的条件下的固有特性。改善的可制造
性特征的实例包括蛋白质的均一糖基化、增加的细胞效价、在蛋白质的重组产生期间的生
长和蛋白质表达、改善的提纯特性，和在低pH下改善的稳定性。相较于其它可溶性ActRIIB
多肽，svActRIIB蛋白质和多肽展现改善的可制造性，以及活体外和活体内活性的保持。另
外，其它铰链连接子序列可带来其它可制造性益处。
间的稳定性。可制造性相信归因于分子在表达和提纯的条件下的固有特性。改善的可制造
性特征的实例包括蛋白质的均一糖基化、增加的细胞效价、在蛋白质的重组产生期间的生
长和蛋白质表达、改善的提纯特性，和在低pH下改善的稳定性。相较于其它可溶性ActRIIB
多肽，svActRIIB蛋白质和多肽展现改善的可制造性，以及活体外和活体内活性的保持。另
外，其它铰链连接子序列可带来其它可制造性益处。
[0054] 如本文所用，术语“svActRIIB多肽活性”或“可溶性ActRIIB多肽的生物活性”是指svActRIIB多肽的一或多种活体外或活体内活性。svActRIIB多肽活性包括(但不限于)结合到肌肉生长抑制素或活化素A或GDF-11的能力，和抑制或中和肌肉生长抑制素或活化素A或
GDF-11的活性的能力。如本文所使用，术语“能够结合”到肌肉生长抑制素、活化素A或GDF-
11是指如通过所属领域中已知的方法测量的结合，如KinExATM方法。肌肉生长抑制素、活化
素A或GDF-11的活体外抑制可使用例如基于pMARE C2C12细胞的分析进行测量。活体内活性
是依据小鼠模型的瘦肌肉质量增加来证明。svActRIIB多肽和蛋白质的活体内活性包括(但
不限于)体重增加、瘦肌肉质量增加，和瘦肌肉相对于脂肪质量的比率增加。治疗活性进一
步包括减轻或预防因某些肿瘤类型所致的恶病质、预防某些肿瘤类型的生长，和提高某些
动物模型的存活率。下文提供svActRIIB蛋白质和多肽活性的进一步论述。
GDF-11的活性的能力。如本文所使用，术语“能够结合”到肌肉生长抑制素、活化素A或GDF-
11是指如通过所属领域中已知的方法测量的结合，如KinExATM方法。肌肉生长抑制素、活化
素A或GDF-11的活体外抑制可使用例如基于pMARE C2C12细胞的分析进行测量。活体内活性
是依据小鼠模型的瘦肌肉质量增加来证明。svActRIIB多肽和蛋白质的活体内活性包括(但
不限于)体重增加、瘦肌肉质量增加，和瘦肌肉相对于脂肪质量的比率增加。治疗活性进一
步包括减轻或预防因某些肿瘤类型所致的恶病质、预防某些肿瘤类型的生长，和提高某些
动物模型的存活率。下文提供svActRIIB蛋白质和多肽活性的进一步论述。
[0055] 在另一方面中，提供包含编码svActRIIB多肽的聚核苷酸的经分离核酸分子。
[0056] 在一个实施例中，聚核苷酸编码具有SEQ ID NO：2中所示序列的多肽，但在位置28具有氨基酸取代且在位置44具有氨基酸取代，其中位置28的取代是选自W或Y，且位置44的
取代为T。在另一个实施例中，聚核苷酸编码具有SEQ ID NO：2的氨基酸19直至134中所示序
列的多肽，但在位置28具有氨基酸取代且在位置44具有氨基酸取代，其中位置28的取代是
选自W或Y，且位置44的取代为T。在另一个实施例中，聚核苷酸编码具有SEQ ID NO：2的氨基酸23直至134中所示序列的多肽，但在位置28具有氨基酸取代且在位置44具有氨基酸取代，
其中位置28的取代是选自W或Y，且位置44的取代为T。在另一个实施例中，聚核苷酸编码具
有SEQ ID NO：2的氨基酸25直至134中所示序列的多肽，但在位置28具有氨基酸取代且在位
置44具有氨基酸取代，其中位置28的取代是选自W或Y，且位置44的取代为T。在另一个实施
例中，聚核苷酸编码具有与上述多肽中的任一种至少80-100％、90-100％、85-95％、90-
95％、80％、85％、90％、95％、98％或99％一致的氨基酸序列的多肽，其中多肽具有位置28的单一氨基酸取代和位置44的氨基酸取代，任选地，其中位置28的取代是选自W或Y，且位置
44的取代为T，且其中多肽能够结合肌肉生长抑制素、活化素A或GDF-11。在一个实施例中，
上述实施例的聚核苷酸编码其中位置28的取代为W且位置44的取代为T的多肽。
取代为T。在另一个实施例中，聚核苷酸编码具有SEQ ID NO：2的氨基酸19直至134中所示序
列的多肽，但在位置28具有氨基酸取代且在位置44具有氨基酸取代，其中位置28的取代是
选自W或Y，且位置44的取代为T。在另一个实施例中，聚核苷酸编码具有SEQ ID NO：2的氨基酸23直至134中所示序列的多肽，但在位置28具有氨基酸取代且在位置44具有氨基酸取代，
其中位置28的取代是选自W或Y，且位置44的取代为T。在另一个实施例中，聚核苷酸编码具
有SEQ ID NO：2的氨基酸25直至134中所示序列的多肽，但在位置28具有氨基酸取代且在位
置44具有氨基酸取代，其中位置28的取代是选自W或Y，且位置44的取代为T。在另一个实施
例中，聚核苷酸编码具有与上述多肽中的任一种至少80-100％、90-100％、85-95％、90-
95％、80％、85％、90％、95％、98％或99％一致的氨基酸序列的多肽，其中多肽具有位置28的单一氨基酸取代和位置44的氨基酸取代，任选地，其中位置28的取代是选自W或Y，且位置
44的取代为T，且其中多肽能够结合肌肉生长抑制素、活化素A或GDF-11。在一个实施例中，
上述实施例的聚核苷酸编码其中位置28的取代为W且位置44的取代为T的多肽。
[0057] 在一个实施例中，经分离核酸分子包含编码多肽的聚核苷酸，所述多肽具有由SEQ ID NO：4、6、12和14组成的群组中所示序列。在另一个实施例中，核酸包含编码多肽的聚核苷酸，所述多肽与SEQ ID NO：4、6、12或14具有至少80-100％、90-100％、85-95％、90-95％、
80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性，任选地，其中所述多肽具有位置28的W或Y和位置44的T，且其中多肽能够结合活化素A、GDF-11或肌肉生长抑制素。在一个实施例
中，上述实施例的聚核苷酸编码其中位置28的取代为W且位置44的取代为T的多肽，其中多
肽能够结合活化素A、GDF-11或肌肉生长抑制素。
80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性，任选地，其中所述多肽具有位置28的W或Y和位置44的T，且其中多肽能够结合活化素A、GDF-11或肌肉生长抑制素。在一个实施例
中，上述实施例的聚核苷酸编码其中位置28的取代为W且位置44的取代为T的多肽，其中多
肽能够结合活化素A、GDF-11或肌肉生长抑制素。
[0058] 在另一个实施例中，经分离核酸分子进一步包含编码至少一种异质蛋白质的聚核苷酸。在一个实施例中，异质蛋白质为Fc域；在另一实施例中，Fc域为人类IgG Fc域。在另一个实施例中，核酸分子进一步包含编码例如SEQ ID NO：25、27中所示的连接子和铰链连接
子的聚核苷酸。
子的聚核苷酸。
[0059] 在一个实施例中，核酸分子包含编码多肽的聚核苷酸，所述多肽由列举于由SEQ ID NO：8、10、16和18组成的群组的序列组成。在另一个实施例中，核酸包含编码多肽的聚核苷酸，所述多肽与由SEQ ID NO：8、10、16和18组成的群组具有至少80-100％、90-100％、85-
95％、90-95％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％序列一致性，任选地，其中多肽具有位置28的W或Y和位置44的T，且其中多肽能够结合活化素A、GDF-11或肌肉生长抑制素。在一
个实施例中，上述实施例的聚核苷酸编码其中位置28的取代为W且位置44的取代为T的多
肽，其中多肽能够结合肌肉生长抑制素、活化素A或GDF-11。
95％、90-95％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％序列一致性，任选地，其中多肽具有位置28的W或Y和位置44的T，且其中多肽能够结合活化素A、GDF-11或肌肉生长抑制素。在一
个实施例中，上述实施例的聚核苷酸编码其中位置28的取代为W且位置44的取代为T的多
肽，其中多肽能够结合肌肉生长抑制素、活化素A或GDF-11。
[0060] 在一个实施例中，经分离核酸分子包含具有选自由SEQ ID NO：3、5、11或13组成的群组的序列的聚核苷酸，或其补体。在另一个实施例中，经分离核酸分子包含具有选自由序
列SEQ ID NO：7、9、15和17组成的群组的序列的聚核苷酸，或其补体。在另一实施例中，经分离核酸分子在严格或中等条件下与SEQ ID NO：3、5、7、9、11、13、15或17杂交，其中经编码的多肽与SEQ ID NO：4、6、8、10、12、14、16或18实质上相似，任选地，其中多肽包含具有位置28的W或Y和位置44的T的氨基酸序列，且其中经编码的多肽能够结合或抑制活化素A、肌肉生
长抑制素或GDF-11。
列SEQ ID NO：7、9、15和17组成的群组的序列的聚核苷酸，或其补体。在另一实施例中，经分离核酸分子在严格或中等条件下与SEQ ID NO：3、5、7、9、11、13、15或17杂交，其中经编码的多肽与SEQ ID NO：4、6、8、10、12、14、16或18实质上相似，任选地，其中多肽包含具有位置28的W或Y和位置44的T的氨基酸序列，且其中经编码的多肽能够结合或抑制活化素A、肌肉生
长抑制素或GDF-11。
[0061] 核酸分子包括DNA的单股形式与双股形式，以及其RNA互补序列。DNA包括例如cDNA、基因组DNA、合成DNA、通过PCR扩增的DNA，和其组合。基因组DNA可通过习知技术分离，如使用SEQ ID NO：3、5、11或13的DNA或其适合片段作为探针。编码ActRIIB多肽的基因组
DNA获自可用于多种物种的基因组文库。合成DNA如下获得：化学合成重迭寡核苷酸片段，随
后组装片段以重建编码区和侧接序列的一部分或全部。RNA可获自导引mRNA高量合成的原
核生物表达载体，如使用T7启动子和RNA聚合酶的载体。cDNA获自利用从表达ActRIIB的各
种组织分离的mRNA所制备的文库。DNA分子包括全长基因以及聚核苷酸和其片段。全长基因
还可包括编码N末端信号序列的序列。
DNA获自可用于多种物种的基因组文库。合成DNA如下获得：化学合成重迭寡核苷酸片段，随
后组装片段以重建编码区和侧接序列的一部分或全部。RNA可获自导引mRNA高量合成的原
核生物表达载体，如使用T7启动子和RNA聚合酶的载体。cDNA获自利用从表达ActRIIB的各
种组织分离的mRNA所制备的文库。DNA分子包括全长基因以及聚核苷酸和其片段。全长基因
还可包括编码N末端信号序列的序列。
[0062] 还提供上述核酸分子，其中聚核苷酸可操作地连接至转录或转译调节序列。
[0063] 在另一方面中，还提供含有核酸分子和聚核苷酸的表达载体，且还提供经这些载体转型的宿主细胞，和产生svActRIIB多肽的方法。术语“表达载体”是指用于表达来自聚核苷酸序列的多肽的质体、噬菌体、病毒或载体。用于表达svActRIIB多肽的载体至少含有为
载体扩增和表达所选殖插入所必需的序列。表达载体包含转录单元，所述转录单元包含(1)
对基因表达具有调节作用的基因组件，例如启动子或增强子；(2)编码svActRIIB多肽和蛋
白质的序列，以转录成mRNA且转译成蛋白质；和(3)适当的转录起始和终止序列。这些序列
可进一步包括选择标记。适于宿主细胞中表达的载体容易获得且核酸分子是使用标准重组
DNA技术插入载体中。这些载体可包括在特定组织中发挥作用的启动子，和用于在所靶向人
类或动物细胞中表达svActRIIB多肽的病毒载体。适于表达svActRIIB的例示性表达载体为
含有svActRIIB聚核苷酸的pDSRa(描述于WO 90/14363中，所述文献通过引用结合在此)和
其衍生物，以及所属领域中已知或下文描述的任何其它适合载体。
载体扩增和表达所选殖插入所必需的序列。表达载体包含转录单元，所述转录单元包含(1)
对基因表达具有调节作用的基因组件，例如启动子或增强子；(2)编码svActRIIB多肽和蛋
白质的序列，以转录成mRNA且转译成蛋白质；和(3)适当的转录起始和终止序列。这些序列
可进一步包括选择标记。适于宿主细胞中表达的载体容易获得且核酸分子是使用标准重组
DNA技术插入载体中。这些载体可包括在特定组织中发挥作用的启动子，和用于在所靶向人
类或动物细胞中表达svActRIIB多肽的病毒载体。适于表达svActRIIB的例示性表达载体为
含有svActRIIB聚核苷酸的pDSRa(描述于WO 90/14363中，所述文献通过引用结合在此)和
其衍生物，以及所属领域中已知或下文描述的任何其它适合载体。
[0064] 多肽
[0065] 在一些实施例中，本文揭露的组合物包括与本文所揭露的氨基酸序列的一致性小于100％的多肽。在一些实施例中，多肽与本文所揭露的序列的一致性为80％、85％、90％、
91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或在99％与100％之间相同。
91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或在99％与100％之间相同。
[0066] 在两个或超过两个氨基酸或核酸序列的情形下，术语“一致性百分比”是指当根据最大一致性进行比较且比对时，两个或超过两个序列或子序列具有指定百分比的相同核苷
酸或氨基酸残基，如使用下述序列比较算法之一(例如BLASTP和BLASTN或熟悉所属领域者
可获得的其它算法)或通过目测所测量。视应用而定，一致性百分比可存在于所比较的序列
区域，例如功能域，或者可替代地存在于待比较的两个序列的全长上。
酸或氨基酸残基，如使用下述序列比较算法之一(例如BLASTP和BLASTN或熟悉所属领域者
可获得的其它算法)或通过目测所测量。视应用而定，一致性百分比可存在于所比较的序列
区域，例如功能域，或者可替代地存在于待比较的两个序列的全长上。
[0067] 序列比较时，典型地，一个序列充当待与测试序列比较的参考序列。使用序列比较算法时，将测试和参考序列输入计算机，必要时指定子序列坐标，且指定序列算法程序参
数。接着，序列比较算法根据所指定的程序参数来计算测试序列相对于参考序列的序列一
致性百分比。
数。接着，序列比较算法根据所指定的程序参数来计算测试序列相对于参考序列的序列一
致性百分比。
[0068] 比较序列的最佳比对可例如如下进行：史密斯(Smith)和瓦特曼(Waterman)，《应用数学进展(Adv.Appl.Math.)》2：482(1981)的局部同源性算法；利朵曼(Needleman)和温
奇(Wunsch)，《分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)》48：443(1970)的同源性比对算法；泊松
(Pearson)和力普曼(Lipman)，《美国科学院院报(Proc.Nat′l.Acad.Sci.USA)》85：2444
(1988)的相似性搜寻方法；这些算法的计算机化实施方式(威斯康星遗传学(Wisconsin
Genetics)软件包中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，遗传学计算机集团(Genetics
Computer Group)，威斯康星州麦迪逊科学驱动园575(575 Science Dr.，Madison，Wis.)；
或目视检查(一般参见奥苏贝尔(Ausubel)等人，见下文)。
奇(Wunsch)，《分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)》48：443(1970)的同源性比对算法；泊松
(Pearson)和力普曼(Lipman)，《美国科学院院报(Proc.Nat′l.Acad.Sci.USA)》85：2444
(1988)的相似性搜寻方法；这些算法的计算机化实施方式(威斯康星遗传学(Wisconsin
Genetics)软件包中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，遗传学计算机集团(Genetics
Computer Group)，威斯康星州麦迪逊科学驱动园575(575 Science Dr.，Madison，Wis.)；
或目视检查(一般参见奥苏贝尔(Ausubel)等人，见下文)。
[0069] 适于测定序列一致性百分比和序列相似性的算法的一个实例为BLAST算法，其描述于艾尔兹乔(Altschul)等人，《分子生物学杂志》215：403-410(1990)中。用于进行BLAST分析的软件可经由国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology
Information)(www.ncbi.nlm.nih.gov/)公开获得。
Information)(www.ncbi.nlm.nih.gov/)公开获得。
[0070] 变体
[0071] 本文所述的组合物还包含本文所述的多肽的变体。如本文所使用，术语“变体”是指一或多个氨基酸残基插入、缺失或取代至原始氨基酸序列中且保留本文所述的多肽功能
的至少一部分的多肽。如本文所用，“变体”的定义内包括多肽片段。应了解，任何指定的肽或肽体可含有一种或两种或全部三种类型的变体。插入型和取代型变体可含有天然氨基酸
以及含有非天然存在的氨基酸或两者。变体可包括例如含有前导序列或信号序列的多肽；
具有其它氨基末端残基(例如Met1或Lys 2)的多肽；具有表达标记(例如组氨酸标记)的多
肽；和以融合蛋白形式表达的多肽。
的至少一部分的多肽。如本文所用，“变体”的定义内包括多肽片段。应了解，任何指定的肽或肽体可含有一种或两种或全部三种类型的变体。插入型和取代型变体可含有天然氨基酸
以及含有非天然存在的氨基酸或两者。变体可包括例如含有前导序列或信号序列的多肽；
具有其它氨基末端残基(例如Met1或Lys 2)的多肽；具有表达标记(例如组氨酸标记)的多
肽；和以融合蛋白形式表达的多肽。
[0072] 本文所述的多肽变体可包括氨基酸取代。20种习知(天然存在)的氨基酸的立体异构体(例如D-氨基酸)、非天然存在的氨基酸(如α-，α-二取代氨基酸)、N-烷基氨基酸、乳酸和其它非习知氨基酸还可为本发明的多肽的适合组分。非天然存在的氨基酸的实例包括例
如：氨基己二酸、β-丙氨酸、β-氨基丙酸、氨基丁酸、哌啶酸、氨基己酸、氨基庚酸、氨基异丁酸、氨基庚二酸、二氨基丁酸、锁链素(desmosine)、二氨基庚二酸、二氨基丙酸、N-乙基甘氨酸、N-乙基天冬酰胺、羟基赖氨酸、别羟基赖氨酸、羟基脯氨酸、异锁链素、别异白氨酸、N-甲基甘氨酸、肌氨酸、N-甲基异白氨酸、N-甲基缬氨酸、正缬氨酸、正白氨酸、鸟氨酸、4-羟基脯氨酸、γ-羧基谷氨酸、ε-N，N，N-三甲基赖氨酸、ε-N-乙酰基赖氨酸、O-磷丝氨酸、N-乙酰基丝氨酸、N-甲酰甲硫氨酸、3-甲基组氨酸、5-羟基赖氨酸、σ-N-甲基精氨酸，和其它类似氨基酸和氨基酸(例如4-羟基脯氨酸)。
如：氨基己二酸、β-丙氨酸、β-氨基丙酸、氨基丁酸、哌啶酸、氨基己酸、氨基庚酸、氨基异丁酸、氨基庚二酸、二氨基丁酸、锁链素(desmosine)、二氨基庚二酸、二氨基丙酸、N-乙基甘氨酸、N-乙基天冬酰胺、羟基赖氨酸、别羟基赖氨酸、羟基脯氨酸、异锁链素、别异白氨酸、N-甲基甘氨酸、肌氨酸、N-甲基异白氨酸、N-甲基缬氨酸、正缬氨酸、正白氨酸、鸟氨酸、4-羟基脯氨酸、γ-羧基谷氨酸、ε-N，N，N-三甲基赖氨酸、ε-N-乙酰基赖氨酸、O-磷丝氨酸、N-乙酰基丝氨酸、N-甲酰甲硫氨酸、3-甲基组氨酸、5-羟基赖氨酸、σ-N-甲基精氨酸，和其它类似氨基酸和氨基酸(例如4-羟基脯氨酸)。
[0073] 天然存在的残基可根据共同的侧链特性分类(重迭)：
[0074] 1)中性疏水性：Met、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Trp、Met、Phe；
[0075] 2)中性极性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln、Tyr、Gly；
[0076] 3)酸性：Asp、Glu；
[0077] 4)碱性：His、Lys、Arg；
[0078] 5)影响链取向的残基：Gly、Pro；以及
[0079] 6)芳族：Trp、Tyr、Phe。
[0080] 经天然存在的氨基酸取代可为保守的或非保守的。保守性氨基酸取代包括用上述类别之一的一员交换同类别的其它成员。保守性变化可涵盖非习知氨基酸残基，其典型地
通过化学肽合成而非通过在生物系统中合成来并入。这些非习知氨基酸残基包括肽模拟物
和氨基酸部分的其它逆转或反转形式。
通过化学肽合成而非通过在生物系统中合成来并入。这些非习知氨基酸残基包括肽模拟物
和氨基酸部分的其它逆转或反转形式。
[0081] 制备方法
[0082] 还提供制备svActRIIB多肽的方法。可使用多种其它表达/宿主系统。这些系统包括(但不限于)微生物，如经重组噬菌体、质体或粘质体DNA表达载体转型的细菌；经酵母表
达载体转型的酵母；感染有病毒表达载体(例如杆状病毒)的昆虫细胞；经病毒表达载体(例
如花椰菜花叶病毒，CaMV；烟草花叶病毒，TMV)转染或经细菌表达载体(例如Ti或pBR322质
体)转型的植物细胞系统；或动物细胞系统。适用于产生重组蛋白质的哺乳动物细胞包括
(但不限于)VERO细胞、海拉细胞(HeLa cells)；中国仓鼠卵巢(CHO)细胞株，或其衍生物，如生长于无血清培养基中的Veggie CHO和相关细胞株(参见拉斯穆森(Rasmussen)等人，
1998《，细胞技术学(Cytotechnology)》28：31)或缺乏DHFR的CHO株系DX-B11(参见乌尔劳伯(Urlaub)等人，1980，《美国科学院院报》77：4216-20)；COS细胞，如猴肾细胞的COS-7细胞株(ATCC CRL 1651)(参见谷兹曼(Gluzman)等人，1981，《细胞(Cell)》23：175)、W138、BHK、HepG2、3T3(ATCC CCL 163)、RIN、MDCK、A549、PC12、K562、L细胞、C127细胞、BHK(ATCC CRL
10)细胞株、衍生自非洲绿猴肾细胞株CV1的CV1/EBNA细胞株(ATCC CCL 70)(参见马克马汗
(McMahan)等人，1991，《欧洲分子生物学组织杂志(EMBO J.)》10：2821)；人类胚肾细胞，如
293、293 EBNA或MSR 293；人类表皮A431细胞；人类Colo205细胞；其它经转型的灵长类动物细胞株；正常二倍体细胞；初始组织、初始外植体的活体外培养所产生的细胞株；HL-60、
U937、HaK或杰卡特细胞(Jurkat cells)。哺乳动物表达允许产生可自生长培养基中回收的
分泌性或可溶性多肽。
达载体转型的酵母；感染有病毒表达载体(例如杆状病毒)的昆虫细胞；经病毒表达载体(例
如花椰菜花叶病毒，CaMV；烟草花叶病毒，TMV)转染或经细菌表达载体(例如Ti或pBR322质
体)转型的植物细胞系统；或动物细胞系统。适用于产生重组蛋白质的哺乳动物细胞包括
(但不限于)VERO细胞、海拉细胞(HeLa cells)；中国仓鼠卵巢(CHO)细胞株，或其衍生物，如生长于无血清培养基中的Veggie CHO和相关细胞株(参见拉斯穆森(Rasmussen)等人，
1998《，细胞技术学(Cytotechnology)》28：31)或缺乏DHFR的CHO株系DX-B11(参见乌尔劳伯(Urlaub)等人，1980，《美国科学院院报》77：4216-20)；COS细胞，如猴肾细胞的COS-7细胞株(ATCC CRL 1651)(参见谷兹曼(Gluzman)等人，1981，《细胞(Cell)》23：175)、W138、BHK、HepG2、3T3(ATCC CCL 163)、RIN、MDCK、A549、PC12、K562、L细胞、C127细胞、BHK(ATCC CRL
10)细胞株、衍生自非洲绿猴肾细胞株CV1的CV1/EBNA细胞株(ATCC CCL 70)(参见马克马汗
(McMahan)等人，1991，《欧洲分子生物学组织杂志(EMBO J.)》10：2821)；人类胚肾细胞，如
293、293 EBNA或MSR 293；人类表皮A431细胞；人类Colo205细胞；其它经转型的灵长类动物细胞株；正常二倍体细胞；初始组织、初始外植体的活体外培养所产生的细胞株；HL-60、
U937、HaK或杰卡特细胞(Jurkat cells)。哺乳动物表达允许产生可自生长培养基中回收的
分泌性或可溶性多肽。
[0083] 使用适当的宿主载体系统，通过在允许产生的条件下培养经含有核酸分子的表达载体转型的宿主细胞来重组产生svActRIIB多肽。可使用经转型的细胞进行长期高产量多
肽制备。一旦这些细胞经含有可选标记以及所要表达卡匣的载体转型，则可允许细胞在所
富集培养基中生长，随后将所富集培养基交换为例如选择性培养基。可选标记经设计以允
许成功表达所引入序列的细胞生长和回收。稳定转型的细胞的抗凝块可使用适于所用细胞
株的组织培养技术增殖。重组蛋白质表达的概述见于《酶学方法(Methods of
Enzymology)》，185版，苟德戴耳D.V.(Goeddell，D.V.)编，学术出版社(Academic Press)
(1990)。
肽制备。一旦这些细胞经含有可选标记以及所要表达卡匣的载体转型，则可允许细胞在所
富集培养基中生长，随后将所富集培养基交换为例如选择性培养基。可选标记经设计以允
许成功表达所引入序列的细胞生长和回收。稳定转型的细胞的抗凝块可使用适于所用细胞
株的组织培养技术增殖。重组蛋白质表达的概述见于《酶学方法(Methods of
Enzymology)》，185版，苟德戴耳D.V.(Goeddell，D.V.)编，学术出版社(Academic Press)
(1990)。
[0084] 在一些情况下，如在使用原核生物系统表达时，所表达的多肽可能需要“再折迭”和氧化成适当的三级结构和产生二硫键以便具生物活性。再折迭可使用所属领域中熟知的
多种程序完成。这些方法包括例如使所溶解多肽在离液剂存在下暴露于通常高于7的pH。离
液剂的选择类似于包涵体增溶所用的选择，然而离液剂典型地在较低浓度下使用。例示性
离液剂为胍和尿素。在大多数情况下，再折迭/氧化溶液还将含有特定比率的还原剂和其氧
化形式以产生特定氧化还原电位，从而允许发生二硫键改组以便形成半胱氨酸桥。一些常
用氧化还原对包括半胱氨酸/胱胺、谷胱甘肽/二硫基双GSH、氯化铜、二硫苏糖醇DTT/二噻
烷DTT，以及2-巯基乙醇(bME)/二硫基-bME。在许多情况下，可使用共溶剂提高再折迭效率。
常用的共溶剂包括丙三醇、各种分子量的聚乙二醇，以及精氨酸。
多种程序完成。这些方法包括例如使所溶解多肽在离液剂存在下暴露于通常高于7的pH。离
液剂的选择类似于包涵体增溶所用的选择，然而离液剂典型地在较低浓度下使用。例示性
离液剂为胍和尿素。在大多数情况下，再折迭/氧化溶液还将含有特定比率的还原剂和其氧
化形式以产生特定氧化还原电位，从而允许发生二硫键改组以便形成半胱氨酸桥。一些常
用氧化还原对包括半胱氨酸/胱胺、谷胱甘肽/二硫基双GSH、氯化铜、二硫苏糖醇DTT/二噻
烷DTT，以及2-巯基乙醇(bME)/二硫基-bME。在许多情况下，可使用共溶剂提高再折迭效率。
常用的共溶剂包括丙三醇、各种分子量的聚乙二醇，以及精氨酸。
[0085] 另外，多肽可根据习知技术、在溶液中或在固体载体上合成。多种自动合成器可市购且可根据已知方案使用。参见例如丝特沃特(Stewart)和杨恩(Young)，《固相肽合成
(Solid Phase Peptide Synthesis)》，第2版，皮尔斯化学公司(Pierce Chemical Co.)
(1984)；唐(Tam)等人，《美国化学学会杂志(J Am Chem Soc)》，105：6442，(1983)；梅丽菲尔德(Merrifield)，《科学》232：341-347(1986)；巴拉尼(Barany)和梅丽菲尔德，《肽(The Peptides)》，格罗斯(Gross)和梅恩霍佛(Meienhofer)编，学术出版社，纽约，1-284；巴拉尼等人，《国际肽和蛋白质研究杂志(Int J Pep Protein Res)》，30：705-739(1987)。
(Solid Phase Peptide Synthesis)》，第2版，皮尔斯化学公司(Pierce Chemical Co.)
(1984)；唐(Tam)等人，《美国化学学会杂志(J Am Chem Soc)》，105：6442，(1983)；梅丽菲尔德(Merrifield)，《科学》232：341-347(1986)；巴拉尼(Barany)和梅丽菲尔德，《肽(The Peptides)》，格罗斯(Gross)和梅恩霍佛(Meienhofer)编，学术出版社，纽约，1-284；巴拉尼等人，《国际肽和蛋白质研究杂志(Int J Pep Protein Res)》，30：705-739(1987)。
[0086] 多肽和蛋白质可根据所属领域的技术人员熟知的蛋白质提纯技术加以提纯。这些技术包括在一种层面下对蛋白质和非蛋白质溶离份进行大致的分离。在肽、多肽与其它蛋
白质已分离的情况下，可使用色谱和电泳技术进一步提纯所关注的肽或多肽以达成部分或
完全提纯(或提纯至均质)。如本文所用，术语“分离多肽”或“提纯多肽”意指可与其它组分分离的组合物，其中多肽相对于其天然可获得状态来说提纯至任何程度。因此提纯多肽还
指脱离其可天然存在于其中的环境的多肽。一般来说，“提纯”是指已进行分离以除去多种
其它组分的多肽组合物，所述组合物实质上保持其所表达的生物活性。在使用术语“实质上
提纯”的情况下，此命名是指一种肽或多肽组合物，其中多肽或肽形成组合物的主要组分，
如蛋白质在组合物中占约50％、约60％、约70％、约80％、约85％或约90％或超过90％。术语分离可包括合成组分，如多肽。
白质已分离的情况下，可使用色谱和电泳技术进一步提纯所关注的肽或多肽以达成部分或
完全提纯(或提纯至均质)。如本文所用，术语“分离多肽”或“提纯多肽”意指可与其它组分分离的组合物，其中多肽相对于其天然可获得状态来说提纯至任何程度。因此提纯多肽还
指脱离其可天然存在于其中的环境的多肽。一般来说，“提纯”是指已进行分离以除去多种
其它组分的多肽组合物，所述组合物实质上保持其所表达的生物活性。在使用术语“实质上
提纯”的情况下，此命名是指一种肽或多肽组合物，其中多肽或肽形成组合物的主要组分，
如蛋白质在组合物中占约50％、约60％、约70％、约80％、约85％或约90％或超过90％。术语分离可包括合成组分，如多肽。
[0087] 适用于提纯的多种技术将为所属领域的技术人员所熟知。这些技术包括例如用硫酸铵进行沉淀、PEG、抗体(免疫沉淀)等；或进行热变性、随后离心；色谱，如亲和色谱(蛋白质A管柱)、离子交换、凝胶过滤、逆相、羟磷灰石、疏水性相互作用色谱；等电聚焦；凝胶电泳；和这些技术的组合。如所属领域中通常所知，相信执行多个提纯步骤的次序可改变，或
可省略某些步骤，且仍不失为适用于制备实质上经提纯的多肽的方法。例示性提纯步骤提
供于下文实例中。
可省略某些步骤，且仍不失为适用于制备实质上经提纯的多肽的方法。例示性提纯步骤提
供于下文实例中。
[0088] 所属领域的技术人员根据本发明将获知用于量化多肽的提纯程度的多种方法。这些方法包括例如测定活性溶离份的特异性结合活性，或通过SDS/PAGE分析来评估溶离份内
的肽或多肽量。用于评估多肽溶离份的纯度的优选方法为计算溶离份的结合活性，将其与
初始萃取物的结合活性进行比较且由此计算提纯程度，如本文中通过“提纯倍数”所评估。
用于表示结合活性的量的实际单位当然取决于为追踪提纯所选择的特定分析技术和多肽
或肽是否展现可检测的结合活性。
的肽或多肽量。用于评估多肽溶离份的纯度的优选方法为计算溶离份的结合活性，将其与
初始萃取物的结合活性进行比较且由此计算提纯程度，如本文中通过“提纯倍数”所评估。
用于表示结合活性的量的实际单位当然取决于为追踪提纯所选择的特定分析技术和多肽
或肽是否展现可检测的结合活性。
[0089] 治疗方法
[0090] 还提供用于活体内和活体外降低或中和肌肉生长抑制素、活化素A或GDF-11中的至少一种的量或活性的方法、蛋白质和组合物。svActRIIB多肽对于肌肉生长抑制素、活化
素A和GDF-11具有高结合亲和力，且能够降低且抑制肌肉生长抑制素、活化素A和GDF-11中
的至少一种的生物活性。在一些方面中，蛋白质为抗体或Fc融合蛋白。在一些方面中，Fc融
合蛋白为ActRIIB Fc融合蛋白。在一些方面中，ActRIIB Fc融合蛋白包含与SEQ ID NO：2的
氨基酸19-25、19、20、21、22、23、24或25直至130-134、125、126、127、128、129、130、131、132、
133或134中所示序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的序列，任选地，其中Fc为IgG，任选地，其中IgG为人类IgG。在一些方面中，ActRIIB Fc融合蛋白包含或其组成为SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：10中所示序列。在一些方面中，蛋白质抑制活化素、肌肉生长抑制素和GDF-11中的至少两者。在一些方面中，蛋白质抑制活化素、肌肉生长
抑制素和GDF-11。在一些方面中，蛋白质抑制活化素。
素A和GDF-11具有高结合亲和力，且能够降低且抑制肌肉生长抑制素、活化素A和GDF-11中
的至少一种的生物活性。在一些方面中，蛋白质为抗体或Fc融合蛋白。在一些方面中，Fc融
合蛋白为ActRIIB Fc融合蛋白。在一些方面中，ActRIIB Fc融合蛋白包含与SEQ ID NO：2的
氨基酸19-25、19、20、21、22、23、24或25直至130-134、125、126、127、128、129、130、131、132、
133或134中所示序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的序列，任选地，其中Fc为IgG，任选地，其中IgG为人类IgG。在一些方面中，ActRIIB Fc融合蛋白包含或其组成为SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：10中所示序列。在一些方面中，蛋白质抑制活化素、肌肉生长抑制素和GDF-11中的至少两者。在一些方面中，蛋白质抑制活化素、肌肉生长
抑制素和GDF-11。在一些方面中，蛋白质抑制活化素。
[0091] 在一个方面中，提供用于治疗需要此治疗的个体的肌肉生长抑制素相关病症和/或活化素A相关病症的方法和试剂，其是通过向所述个体施用有效剂量的svActRIIB组合
物。如本文所用，术语“个体”是指任何动物，如哺乳动物，包括人类。
物。如本文所用，术语“个体”是指任何动物，如哺乳动物，包括人类。
[0092] 所述组合物适用于增加个体的瘦肌肉质量。所述组合物还可适用于增加瘦肌肉质量相对于脂肪质量的比例，且因此降低脂肪质量占个体体重的百分比。
[0093] 可通过svActRIIB治疗的病症包括(但不限于)多种形式的肌肉萎缩，以及代谢障碍，如糖尿病和相关病症，以及骨骼退化性疾病，如骨质疏松。
[0094] 肌肉萎缩病症还包括营养不良，如杜兴氏肌肉萎缩症(Duchenne′s muscular dystrophy)、进行性肌肉萎缩症、贝克型肌肉萎缩症(Becker′s type muscular
dystrophy)、德杰林-郎都兹肌肉萎缩症(Dejerine-Landouzy muscular dystrophy)、厄伯
氏肌肉萎缩症(Erb′s muscular dystrophy)以及婴儿神经轴索性肌肉萎缩症。其它肌肉萎
缩病症来源于慢性疾病或病症，如肌肉萎缩性侧索硬化、充血阻塞性肺病、癌症、AIDS、肾衰竭、器官萎缩、雄性激素去除和类风湿性关节炎。
dystrophy)、德杰林-郎都兹肌肉萎缩症(Dejerine-Landouzy muscular dystrophy)、厄伯
氏肌肉萎缩症(Erb′s muscular dystrophy)以及婴儿神经轴索性肌肉萎缩症。其它肌肉萎
缩病症来源于慢性疾病或病症，如肌肉萎缩性侧索硬化、充血阻塞性肺病、癌症、AIDS、肾衰竭、器官萎缩、雄性激素去除和类风湿性关节炎。
[0095] 肌肉生长抑制素和/或活化素的过度表达可导致恶病质(一种重度肌肉萎缩综合症)。恶病质由癌症产生且还因类风湿性关节炎、糖尿病性肾病变、肾衰竭、化学疗法、烧伤所致损伤以及其它原因而产生。在另一实例中，发现血清和肌肉内的肌肉生长抑制素免疫
反应性蛋白质浓度在呈现AIDS相关性肌肉萎缩的男性中增加且与无脂肪质量逆相关(贡扎
勒-卡达韦德(Gonzalez-Cadavid)等人，《美国科学院院报》95：14938-14943(1998))。还已显示作为对烧伤损伤的反应，肌肉生长抑制素含量增加，导致分解代谢型肌肉作用(郎
(Lang)等人《，美国实验生物学联合会杂志(FASEB J)》15，1807-1809(2001))。导致肌肉萎缩的其它病状可起因于因失能所致的不活动(如轮椅限制)；因中风、疾病、脊索损伤、骨折
或外伤所致的卧床休养延长；和微重力环境(太空飞行)下的肌肉萎缩。举例来说，在卧床休
养延长之后发现血浆肌肉生长抑制素免疫反应性蛋白质增加(扎奇维佳(Zachwieja)等人，
《重力生理学杂志(J Gravit Physiol.)》6(2)：11(1999)。还发现，相较于未暴露的大鼠肌肉，在宇宙飞船飞行期间暴露于微重力环境的大鼠的肌肉显示肌肉生长抑制素量增加(拉
拉尼(Lalani)等人，《内分泌学杂志(J.Endocrin)》167(3)：417-28(2000))。
反应性蛋白质浓度在呈现AIDS相关性肌肉萎缩的男性中增加且与无脂肪质量逆相关(贡扎
勒-卡达韦德(Gonzalez-Cadavid)等人，《美国科学院院报》95：14938-14943(1998))。还已显示作为对烧伤损伤的反应，肌肉生长抑制素含量增加，导致分解代谢型肌肉作用(郎
(Lang)等人《，美国实验生物学联合会杂志(FASEB J)》15，1807-1809(2001))。导致肌肉萎缩的其它病状可起因于因失能所致的不活动(如轮椅限制)；因中风、疾病、脊索损伤、骨折
或外伤所致的卧床休养延长；和微重力环境(太空飞行)下的肌肉萎缩。举例来说，在卧床休
养延长之后发现血浆肌肉生长抑制素免疫反应性蛋白质增加(扎奇维佳(Zachwieja)等人，
《重力生理学杂志(J Gravit Physiol.)》6(2)：11(1999)。还发现，相较于未暴露的大鼠肌肉，在宇宙飞船飞行期间暴露于微重力环境的大鼠的肌肉显示肌肉生长抑制素量增加(拉
拉尼(Lalani)等人，《内分泌学杂志(J.Endocrin)》167(3)：417-28(2000))。
[0096] 另外，脂肪与肌肉比率的年龄相关性增加，和年龄相关性肌肉萎缩似乎与肌肉生长抑制素相关。举例来说，在年轻(19至35岁)、中年(36至75岁)和老年(76至92岁)男性和女
性族群中，平均的血清肌肉生长抑制素免疫反应性蛋白质随着年龄增长而增加，而这些族
群中的平均肌肉质量和无脂肪质量随着年龄增长而下降(亚拉瑟斯基(Yarasheski)等人，
《营养、健康和老年学杂志(J Nutr Aging)》6(5)：343-8(2002))。另外，现已发现肌肉生长抑制素在心肌中表达量较低且在梗塞之后，心肌细胞中的表达上调(莎玛(Sharma)等人，
《细胞生物学杂志(J Cell Physiol.)》180(1)：1-9(1999))。因此，降低心肌中的肌肉生长抑制素含量可使梗塞之后的心肌恢复改善。
性族群中，平均的血清肌肉生长抑制素免疫反应性蛋白质随着年龄增长而增加，而这些族
群中的平均肌肉质量和无脂肪质量随着年龄增长而下降(亚拉瑟斯基(Yarasheski)等人，
《营养、健康和老年学杂志(J Nutr Aging)》6(5)：343-8(2002))。另外，现已发现肌肉生长抑制素在心肌中表达量较低且在梗塞之后，心肌细胞中的表达上调(莎玛(Sharma)等人，
《细胞生物学杂志(J Cell Physiol.)》180(1)：1-9(1999))。因此，降低心肌中的肌肉生长抑制素含量可使梗塞之后的心肌恢复改善。
[0097] 肌肉生长抑制素似乎还影响代谢障碍，包括2型糖尿病、非胰岛素依赖性糖尿病、高血糖症和肥胖。举例来说，缺乏肌肉生长抑制素已显示可改善两个小鼠模型的肥胖和糖
尿病表达型(耶恩(Yen)等人，《美国实验生物学联合会杂志》8∶479(1994)。本发明的
svActRIIB多肽适用于治疗这些代谢障碍。因此，施用组合物将改善适合个体的糖尿病\肥
胖和高血糖病状。另外，含有svActRIIB多肽的组合物可降低肥胖个体的摄食量。
尿病表达型(耶恩(Yen)等人，《美国实验生物学联合会杂志》8∶479(1994)。本发明的
svActRIIB多肽适用于治疗这些代谢障碍。因此，施用组合物将改善适合个体的糖尿病\肥
胖和高血糖病状。另外，含有svActRIIB多肽的组合物可降低肥胖个体的摄食量。
[0098] 施用稳定化ActRIIB多肽可提高骨骼强度且减少骨质疏松和其它退化性骨骼疾病。举例来说，已发现，缺乏肌肉生长抑制素的小鼠显示，在肌肉附着的区域处，小鼠肱骨的矿物质含量和密度增加和小梁骨与皮层骨的矿物质含量均增加，且肌肉质量增加(汉利克
(Hamrick)等人，《国际钙化组织(Calcif Tissue Int)》71(1)：63-8(2002))。另外，在如用于治疗例如前列腺癌的雄性激素去除疗法的情况下，svActRIIBs可用于治疗雄性激素去除
的影响。
(Hamrick)等人，《国际钙化组织(Calcif Tissue Int)》71(1)：63-8(2002))。另外，在如用于治疗例如前列腺癌的雄性激素去除疗法的情况下，svActRIIBs可用于治疗雄性激素去除
的影响。
[0099] 还提供用于增加食用动物的肌肉质量的方法和组合物，其是通过向所述动物施用有效剂量的svActRIIB蛋白质来达成。由于成熟C末端肌肉生长抑制素多肽在所测试的全部
物种中类似或相同，因此预期svActRIIB多肽将会有效地增加任何农业上重要的物种(包括
牛、鸡、火鸡和猪)的瘦肌肉质量和减少其脂肪。
物种中类似或相同，因此预期svActRIIB多肽将会有效地增加任何农业上重要的物种(包括
牛、鸡、火鸡和猪)的瘦肌肉质量和减少其脂肪。
[0100] 在一些方面中，本文揭露治疗个体的肥胖或肥胖相关性疾病、增加其肌肉质量或减少其脂肪质量的方法，包含：向所述个体施用有效剂量的抑制活化素、肌肉生长抑制素和
GDF-11中的至少一种的蛋白质。
GDF-11中的至少一种的蛋白质。
[0101] 在一些方面中，肥胖相关性疾病为以下中的至少一种：遗传性肥胖综合症、普拉德威利综合症、下丘脑病症、家族性高胆固醇血症、巴德-毕德氏综合症、普拉德-威利综合症、
15q11-13上的印记基因缺失所致的综合症、艾尔斯通综合症、柯亨综合症、艾尔伯拉特遗传
性骨营养不良(假副甲状腺低能症)、卡本特综合症、MOMO综合症、鲁宾斯坦-泰必综合症；
6q16、1p36、2q37和9q34中的至少一种缺失所致的综合症；染色体14的母源单亲双染色体
症、脆弱X染色体综合症、动脉粥样硬化、非酒精性脂肝炎、内脏脂肪沉积导致一或多种有害结果的疾病、脑血管疾病、脂肪肝和伯吉森-佛斯曼-莱曼综合症。
15q11-13上的印记基因缺失所致的综合症、艾尔斯通综合症、柯亨综合症、艾尔伯拉特遗传
性骨营养不良(假副甲状腺低能症)、卡本特综合症、MOMO综合症、鲁宾斯坦-泰必综合症；
6q16、1p36、2q37和9q34中的至少一种缺失所致的综合症；染色体14的母源单亲双染色体
症、脆弱X染色体综合症、动脉粥样硬化、非酒精性脂肝炎、内脏脂肪沉积导致一或多种有害结果的疾病、脑血管疾病、脂肪肝和伯吉森-佛斯曼-莱曼综合症。
[0102] 在一些方面中，个体为需要治疗或投药的人类个体。在一些方面中，个体患有以下中的至少一种：遗传性肥胖综合症、普拉德威利综合症、下丘脑病症、家族性高胆固醇血症、巴德-毕德氏综合症、普拉德-威利综合症、15q11-13上的印记基因缺失所致的综合症、艾尔
斯通综合症、柯亨综合症、艾尔伯拉特遗传性骨营养不良(假副甲状腺低能症)、卡本特综合
症、MOMO综合症、鲁宾斯坦-泰必综合症；6q16、1p36、2q37和9q34中的至少一种缺失所致的综合症；染色体14的母源单亲双染色体症、脆弱X染色体综合症、动脉粥样硬化、非酒精性脂肝炎、内脏脂肪沉积导致一或多种有害结果的疾病、脑血管疾病、脂肪肝和伯吉森-佛斯曼-
莱曼综合症。在一些方面中，个体患有胰岛素抗性、慢性肾病、癌症和分解代谢病状中的至
少一种。
斯通综合症、柯亨综合症、艾尔伯拉特遗传性骨营养不良(假副甲状腺低能症)、卡本特综合
症、MOMO综合症、鲁宾斯坦-泰必综合症；6q16、1p36、2q37和9q34中的至少一种缺失所致的综合症；染色体14的母源单亲双染色体症、脆弱X染色体综合症、动脉粥样硬化、非酒精性脂肝炎、内脏脂肪沉积导致一或多种有害结果的疾病、脑血管疾病、脂肪肝和伯吉森-佛斯曼-
莱曼综合症。在一些方面中，个体患有胰岛素抗性、慢性肾病、癌症和分解代谢病状中的至
少一种。
[0103] 在一些方面中，蛋白质为抗体或Fc融合蛋白。在一些方面中，Fc融合蛋白为ActRIIB Fc融合蛋白。在一些方面中，ActRIIB Fc融合蛋白包含与SEQ ID NO：2的氨基酸
19-25、19、20、21、22、23、24或25直至130-134、125、126、127、128、129、130、131、132、133或
134中所示序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的序列，任选地，其中Fc为IgG，任选地，其中IgG为人类IgG。在一些方面中，ActRIIB Fc融合蛋白包含或其组成为SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：10中所示序列。在一些方面中，蛋白质抑制活化素、肌肉生长抑制素和GDF-11中的至少两种。在一些方面中，蛋白质抑制活化素、肌肉生长抑制
素和GDF-11。在一些方面中，蛋白质抑制活化素。
19-25、19、20、21、22、23、24或25直至130-134、125、126、127、128、129、130、131、132、133或
134中所示序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的序列，任选地，其中Fc为IgG，任选地，其中IgG为人类IgG。在一些方面中，ActRIIB Fc融合蛋白包含或其组成为SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：10中所示序列。在一些方面中，蛋白质抑制活化素、肌肉生长抑制素和GDF-11中的至少两种。在一些方面中，蛋白质抑制活化素、肌肉生长抑制
素和GDF-11。在一些方面中，蛋白质抑制活化素。
[0104] 在一些方面中，本文揭露的方法降低总脂肪质量、皮下脂肪质量和内脏脂肪质量中的至少一种。在一些方面中，本文揭露的方法使得内脏脂肪质量的降低百分比大于总脂
肪质量的降低百分比。在一些方面中，本文揭露的方法增加瘦体质量和四肢瘦体质量中的
至少一种。在一些方面中，本文揭露的方法使得瘦体质量和四肢瘦体质量中的至少一种增
加至少1-50％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、
35％、40％、45％、50％或超过50％。在一些方面中，本文揭露的方法使得总脂肪质量、皮下脂肪质量和内脏脂肪质量中的至少一种降低至少1-99％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、
8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、
75％、80％、85％、90％、95％、99％或超过99％。
肪质量的降低百分比。在一些方面中，本文揭露的方法增加瘦体质量和四肢瘦体质量中的
至少一种。在一些方面中，本文揭露的方法使得瘦体质量和四肢瘦体质量中的至少一种增
加至少1-50％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、
35％、40％、45％、50％或超过50％。在一些方面中，本文揭露的方法使得总脂肪质量、皮下脂肪质量和内脏脂肪质量中的至少一种降低至少1-99％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、
8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、
75％、80％、85％、90％、95％、99％或超过99％。
[0105] svActRIIB多肽和组合物还拮抗活化素A的活性，如下文活体外分析中所示。活化素A已知表达于某些类型的癌症中，特定地说，性腺肿瘤，如卵巢癌，且导致重度恶病质。(思普拉诺(Ciprano)等人，《内分泌学(Endocrinol)》141(7)：2319-27(2000)；希欧(Shou)等
人，《内分泌学》138(11)：5000-5(1997)；考佛(Coerver)等人，《分子内分泌学(Mol
Endocrinol)》10(5)：534-43(1996)；艾托(Ito)等人，《英国癌症杂志(British J Cancer)》
82(8)：1415-20(2000)；郎伯特-梅瑟廉(Lambert-Messerlian)等人，《妇科肿瘤学
(Gynecologic Oncology)》74：93-7(1999)。因此，本发明的组合物可用于治疗与活化素A过度表达以及肌肉生长抑制素表达相关的病状，如某些癌症所致的恶病质，和治疗某些性腺
型肿瘤。
人，《内分泌学》138(11)：5000-5(1997)；考佛(Coerver)等人，《分子内分泌学(Mol
Endocrinol)》10(5)：534-43(1996)；艾托(Ito)等人，《英国癌症杂志(British J Cancer)》
82(8)：1415-20(2000)；郎伯特-梅瑟廉(Lambert-Messerlian)等人，《妇科肿瘤学
(Gynecologic Oncology)》74：93-7(1999)。因此，本发明的组合物可用于治疗与活化素A过度表达以及肌肉生长抑制素表达相关的病状，如某些癌症所致的恶病质，和治疗某些性腺
型肿瘤。
[0106] 另外，svActRIIB多肽适用于在多种分析中检测和定量肌肉生长抑制素、活化素A或GDF-11。一般来说，稳定化ActRIIB多肽在多种分析中作为捕捉剂用于结合和固定肌肉生
长抑制素、活化素A或GDF-11，类似于例如以下文献中所述的那些内容：浅井(Asai)编，《细胞生物学方法(Methods in Cell Biology)》，37，《细胞生物学中的抗体(Antibodies in
Cell Biology)》，学术出版社公司，纽约(1993)。多肽可以一些方式标记或可与第三种分子反应，如经标记以使得肌肉生长抑制素能够被检测到和定量的抗体。举例来说，多肽或第三
种分子可经修饰而具有可检测部分，如生物素，其接着可被第四种分子(如酶标记的抗生蛋
白链菌素，或其它蛋白质)结合。(阿克斯特郎(Akerstrom)，《免疫学杂志(J Immunol)》135：
2589(1985)；乔伯特(Chaubert)，《现代病理学(Mod Pathol)》10：585(1997))。
长抑制素、活化素A或GDF-11，类似于例如以下文献中所述的那些内容：浅井(Asai)编，《细胞生物学方法(Methods in Cell Biology)》，37，《细胞生物学中的抗体(Antibodies in
Cell Biology)》，学术出版社公司，纽约(1993)。多肽可以一些方式标记或可与第三种分子反应，如经标记以使得肌肉生长抑制素能够被检测到和定量的抗体。举例来说，多肽或第三
种分子可经修饰而具有可检测部分，如生物素，其接着可被第四种分子(如酶标记的抗生蛋
白链菌素，或其它蛋白质)结合。(阿克斯特郎(Akerstrom)，《免疫学杂志(J Immunol)》135：
2589(1985)；乔伯特(Chaubert)，《现代病理学(Mod Pathol)》10：585(1997))。
[0107] 在一些方面中，本发明的组合物可用于治疗如实体肿瘤的癌症。术语“癌症”和“癌性”是指或描述哺乳动物中典型地以不受调节的细胞生长为特征的生理病状。癌症的实例包括(但不限于)癌瘤、淋巴瘤、母细胞瘤(包括神经管胚细胞瘤和视网膜母细胞瘤)、肉瘤
(包括脂肪肉瘤和滑膜细胞肉瘤)、神经内分泌肿瘤(包括类癌瘤、胃泌素瘤和胰岛细胞癌)、
间皮瘤、神经鞘瘤(包括听神经瘤)、脑膜瘤、腺癌、黑色素瘤，和白血病或淋巴恶性疾病。这些癌症的更特定实例包括鳞状细胞癌(例如上皮鳞状细胞癌)；肺癌，包括小细胞肺癌
(SCLC)、非小细胞肺癌(NSCLC)、肺腺癌和肺鳞状癌；腹膜癌、肝细胞癌、胃癌，包括胃肠癌；
胰脏癌、神经胶母细胞瘤、子宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝癌、乳癌(包括转移性乳癌)、结肠癌、直肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜或子宫癌、唾液腺癌、肾脏或肾癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌、肛门癌、阴茎、睾丸癌、食道癌、胆道肿瘤以及头颈癌。在一些方面中，本发明的组合物可用于治疗癌症，如这些癌症或卵巢癌(颗粒层细胞、透明细胞、浆液性、子宫内膜样、生殖细胞肿瘤)、头颈癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、胰脏癌、前列腺癌、小肠肿瘤、结肠癌、肾细胞癌、腺样囊性癌症、胃癌、食道癌、鳞状细胞癌(皮肤)、黑色素瘤、乳癌、膀胱癌、肝细胞癌和/或子宫癌(子宫内膜、子宫颈、平滑肌瘤、外阴、阴道癌症)。
(包括脂肪肉瘤和滑膜细胞肉瘤)、神经内分泌肿瘤(包括类癌瘤、胃泌素瘤和胰岛细胞癌)、
间皮瘤、神经鞘瘤(包括听神经瘤)、脑膜瘤、腺癌、黑色素瘤，和白血病或淋巴恶性疾病。这些癌症的更特定实例包括鳞状细胞癌(例如上皮鳞状细胞癌)；肺癌，包括小细胞肺癌
(SCLC)、非小细胞肺癌(NSCLC)、肺腺癌和肺鳞状癌；腹膜癌、肝细胞癌、胃癌，包括胃肠癌；
胰脏癌、神经胶母细胞瘤、子宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝癌、乳癌(包括转移性乳癌)、结肠癌、直肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜或子宫癌、唾液腺癌、肾脏或肾癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌、肛门癌、阴茎、睾丸癌、食道癌、胆道肿瘤以及头颈癌。在一些方面中，本发明的组合物可用于治疗癌症，如这些癌症或卵巢癌(颗粒层细胞、透明细胞、浆液性、子宫内膜样、生殖细胞肿瘤)、头颈癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、胰脏癌、前列腺癌、小肠肿瘤、结肠癌、肾细胞癌、腺样囊性癌症、胃癌、食道癌、鳞状细胞癌(皮肤)、黑色素瘤、乳癌、膀胱癌、肝细胞癌和/或子宫癌(子宫内膜、子宫颈、平滑肌瘤、外阴、阴道癌症)。
[0108] 本文所述的蛋白质和多肽的使用剂量可为0.1-10、0.25-5、1-3、0.1、0.2、0.25、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.75、0.8、0.9、1、2、3、4、5或大于5mg/kg(包括这些值)。在一些方面中，各剂量可每小于1-10、2-9、3-8、4-7、5-6、1、1、2、3、4、5、6、7、8或大于8周(包括这些值)施用。在一些方面中，各剂量可每小于1-10、2-9、3-8、4-7、5-6、1、1、2、3、4、5、6、7天(包括这些值)施用。在一些方面中，各剂量是静脉内施用。在一些方面中，向个体施用至少1-30、5-
20、5-10、10-20、15-20、1-5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20次剂量(包括这些值)。在一些方面中，多个剂量中的至少一个的量为至少0.3、0.5、1、2、3、4、5、
6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20mg/kg(包括这些值)。在一些方面中，多个剂量中的每一个的量为至少0.1-30、0.25-20、0.25-10、1-5、1-3、0.1-1、0.3、0.5、1、2、3、4、
5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20mg/kg(包括这些值)。在一些方面中，各剂量至少每日、每周或每月施用。在一些方面中，各剂量至少每1-30、5-20、5-10、10-20、15-
20、1-5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、
27、28、29、30或31天(包括这些值)施用。在一些方面中，治疗持续至少1-30、5-20、5-10、10-
20、15-20、1-5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、
25、26、27、28、29、30或31天；至少1-30、5-20、5-10、10-20、15-20、1-5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、
10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20周；或至少1-30、5-20、5-10、10-20、15-20、1-5、1、2、
3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个月(包括这些值)。
20、5-10、10-20、15-20、1-5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20次剂量(包括这些值)。在一些方面中，多个剂量中的至少一个的量为至少0.3、0.5、1、2、3、4、5、
6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20mg/kg(包括这些值)。在一些方面中，多个剂量中的每一个的量为至少0.1-30、0.25-20、0.25-10、1-5、1-3、0.1-1、0.3、0.5、1、2、3、4、
5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20mg/kg(包括这些值)。在一些方面中，各剂量至少每日、每周或每月施用。在一些方面中，各剂量至少每1-30、5-20、5-10、10-20、15-
20、1-5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、
27、28、29、30或31天(包括这些值)施用。在一些方面中，治疗持续至少1-30、5-20、5-10、10-
20、15-20、1-5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、
25、26、27、28、29、30或31天；至少1-30、5-20、5-10、10-20、15-20、1-5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、
10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20周；或至少1-30、5-20、5-10、10-20、15-20、1-5、1、2、
3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个月(包括这些值)。
[0109] 在一些方面中，可使用某些准则(如包含准则或排除准则)来选择治疗癌症的个体。
[0110] 在一些方面中，准则为包含准则。在一些方面中，包含准则可包括：≥18岁的男性和停经后女性，存在组织学确诊癌症的晚期实体肿瘤，至少一线先前标准疗法(若可利用)
失败之后存在复发性转移性或局部晚期疾病，使用实体肿瘤的反应评估标准(RECIST 1.1)
可测量的疾病，东部肿瘤学合作组织(Eastern Cooperative Oncology Group，ECOG)活动
状态0或1，在无其它人协助的情况下能够行走至少30米(可允许使用辅助装置，如手杖或助
行架)，停经后女性自发性停经12个月，停经后女性自发性停经(FSH＞40IU/L)6个月，停经
后女性的手术后双侧卵巢切除伴随或不伴随子宫切除术，先前使用基于铂的化学疗法治
疗，和/或有不能接受基于铂的化学疗法的记录。
失败之后存在复发性转移性或局部晚期疾病，使用实体肿瘤的反应评估标准(RECIST 1.1)
可测量的疾病，东部肿瘤学合作组织(Eastern Cooperative Oncology Group，ECOG)活动
状态0或1，在无其它人协助的情况下能够行走至少30米(可允许使用辅助装置，如手杖或助
行架)，停经后女性自发性停经12个月，停经后女性自发性停经(FSH＞40IU/L)6个月，停经
后女性的手术后双侧卵巢切除伴随或不伴随子宫切除术，先前使用基于铂的化学疗法治
疗，和/或有不能接受基于铂的化学疗法的记录。
[0111] 在一些方面中，准则为排除准则。在一些方面中，排除准则可包括：严重不受控制或未消退医学病状(如感染)限制方案顺应性或使个体暴露于极端风险；先前抗癌疗法的毒
性未消退，如运动或感觉神经病变，CTCAE(4.03版)级≥2，秃发症除外；在开始治疗6个月内胃肠出血的病史；存在QTcF＞470msec；遗传性延长QT间隔的病史，或妨碍评估QT间隔的任
何心律不整(如束支传导阻滞)、心肌梗塞、第1循环的6个月第1天内出现的不稳定绞痛，或
纽约心脏协会充血性心脏衰竭≥II级；肝功能测试升高，包括总胆红素＞1.5×正常值上限
(ULN；除非个体有文件证明吉伯氏疾病(Gilbert′s disease))、天冬氨酸转胺酶(AST)或丙
氨酸转胺酶(ALT)＞3.0×ULN(对于已知有肝转移的个体来说，AST或ALT＞5×ULN)、肌酐＞
1.5×ULN和估计的肌酐清除率＜60mL/min(使用科克罗夫特-高尔特方程式(Cockcroft-
Gault equation))、血红素＜9g/dL；血小板＜100×109/L；绝对嗜中性白细胞计数(ANC)＜
1.5×109/L(在开始治疗2周内无粒细胞群落刺激因子支持)，在开始治疗8周内有大手术或
在开始治疗4周内有小手术，当前肠阻塞，脑转移，存在需要频繁(每周超过1次)医学介入的
腹水或胸膜积水；存在门静脉分流装置或广泛肝切除(超过一个区段)病史，已知人类免疫
缺乏病毒(HIV)感染，活动性B型或C型肝炎感染，开始治疗4周内先用任何研究性产品治疗，
生育潜力的女性，或具有生育潜力的女性伴侣的男性，不愿意使用非常有效的避孕方法(即
造成每年怀孕机率小于1％的方法)(一贯地且正确地使用时，如植入物、可注射剂、组合的
口服避孕药、一些子宫内避孕装置、禁欲或伴侣输精管结扎)；对阿霉素盐酸盐
(doxorubicin HCl)的习知配制物或脂质体阿霉素的组分有过敏反应；先前阿霉素盐酸盐
的累积剂量＞300mg/m2，或先前表柔比星(epirubicin)的累积剂量＞500mg/m2，在开始治
疗28天内的减小的心脏射血分数小于正常值下限(根据MUGA扫描或超音波心电图(ECHO))，
和/或正哺乳的女性。
性未消退，如运动或感觉神经病变，CTCAE(4.03版)级≥2，秃发症除外；在开始治疗6个月内胃肠出血的病史；存在QTcF＞470msec；遗传性延长QT间隔的病史，或妨碍评估QT间隔的任
何心律不整(如束支传导阻滞)、心肌梗塞、第1循环的6个月第1天内出现的不稳定绞痛，或
纽约心脏协会充血性心脏衰竭≥II级；肝功能测试升高，包括总胆红素＞1.5×正常值上限
(ULN；除非个体有文件证明吉伯氏疾病(Gilbert′s disease))、天冬氨酸转胺酶(AST)或丙
氨酸转胺酶(ALT)＞3.0×ULN(对于已知有肝转移的个体来说，AST或ALT＞5×ULN)、肌酐＞
1.5×ULN和估计的肌酐清除率＜60mL/min(使用科克罗夫特-高尔特方程式(Cockcroft-
Gault equation))、血红素＜9g/dL；血小板＜100×109/L；绝对嗜中性白细胞计数(ANC)＜
1.5×109/L(在开始治疗2周内无粒细胞群落刺激因子支持)，在开始治疗8周内有大手术或
在开始治疗4周内有小手术，当前肠阻塞，脑转移，存在需要频繁(每周超过1次)医学介入的
腹水或胸膜积水；存在门静脉分流装置或广泛肝切除(超过一个区段)病史，已知人类免疫
缺乏病毒(HIV)感染，活动性B型或C型肝炎感染，开始治疗4周内先用任何研究性产品治疗，
生育潜力的女性，或具有生育潜力的女性伴侣的男性，不愿意使用非常有效的避孕方法(即
造成每年怀孕机率小于1％的方法)(一贯地且正确地使用时，如植入物、可注射剂、组合的
口服避孕药、一些子宫内避孕装置、禁欲或伴侣输精管结扎)；对阿霉素盐酸盐
(doxorubicin HCl)的习知配制物或脂质体阿霉素的组分有过敏反应；先前阿霉素盐酸盐
的累积剂量＞300mg/m2，或先前表柔比星(epirubicin)的累积剂量＞500mg/m2，在开始治
疗28天内的减小的心脏射血分数小于正常值下限(根据MUGA扫描或超音波心电图(ECHO))，
和/或正哺乳的女性。
[0112] 医药组合物和配制物
[0113] 还提供含有本文所揭露的蛋白质和多肽的医药组合物。在一些方面中，蛋白质为抗体或Fc融合蛋白。在一些方面中，Fc融合蛋白为ActRIIB Fc融合蛋白。在一些方面中，
ActRIIB Fc融合蛋白包含与SEQ ID NO：2的氨基酸19-25、19、20、21、22、23、24或25直至
130-134、125、126、127、128、129、130、131、132、133或134中所示序列具有至少80％、85％、
90％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的序列，任选地，其中Fc为IgG，任选地，其中IgG为人类IgG。在一些方面中，ActRIIB Fc融合蛋白包含或其组成为SEQ ID NO：6或SEQ ID
NO：10中所示序列。在一些方面中，蛋白质抑制活化素、肌肉生长抑制素和GDF-11中的至少
两种。在一些方面中，蛋白质抑制活化素、肌肉生长抑制素和GDF-11。在一些方面中，蛋白质抑制活化素。
ActRIIB Fc融合蛋白包含与SEQ ID NO：2的氨基酸19-25、19、20、21、22、23、24或25直至
130-134、125、126、127、128、129、130、131、132、133或134中所示序列具有至少80％、85％、
90％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的序列，任选地，其中Fc为IgG，任选地，其中IgG为人类IgG。在一些方面中，ActRIIB Fc融合蛋白包含或其组成为SEQ ID NO：6或SEQ ID
NO：10中所示序列。在一些方面中，蛋白质抑制活化素、肌肉生长抑制素和GDF-11中的至少
两种。在一些方面中，蛋白质抑制活化素、肌肉生长抑制素和GDF-11。在一些方面中，蛋白质抑制活化素。
[0114] 这些组合物包含治疗或预防有效量的多肽或蛋白质与医药学上可接受的物质和生理学上可接受的配制物质的混合物。医药组合物可含有用于调节、维持或保持例如组合
物的pH、容积渗透浓度、粘度、透明度、颜色、等张性、气味、无菌性、稳定性、溶解或释放速率、吸附或渗透的配制物质。适合的配制物质包括(但不限于)氨基酸(如甘氨酸、谷酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸)；抗菌剂；抗氧化剂(如抗坏血酸、亚硫酸钠或亚硫酸氢钠)；缓冲剂(硼酸盐、碳酸氢盐、Tris-HCl、柠檬酸盐、磷酸盐、其它有机酸)；增积剂(如甘露糖醇或甘氨酸)；螯合剂(如乙二胺四乙酸(EDTA))；错合剂(如咖啡碱(caffeine)、聚乙烯吡咯烷酮、
β-环糊精或羟基丙基-β-环糊精)；填充剂；单醣；双醣和其它碳水化合物(如葡萄糖、甘露糖或糊精)；蛋白质(如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白)；着色剂；调味和稀释剂；乳化剂；亲水性聚合物(如聚乙烯吡咯烷酮)；低分子量多肽；成盐相对离子(如钠)；防腐剂(如苯扎氯铵、苯甲酸、水杨酸、硫柳汞、苯乙醇、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、氯己定
(chlorhexidine)、山梨酸或过氧化氢)；溶剂(如甘油、丙二醇或聚乙二醇)；糖醇(如甘露糖醇或山梨糖醇)；悬浮剂；表面活性剂或湿润剂(如普朗尼克(pluronics)、PEG、脱水山梨糖
醇酯、聚山梨醇酯，如聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、曲拉通(triton)、缓血酸胺、卵磷脂、胆固醇、泰洛沙泊(tyloxapal))；稳定性增强剂(蔗糖或山梨糖醇)；张力增强剂(如碱金属卤
化物(优选为氯化钠或氯化钾)、甘露糖醇、山梨糖醇)；递送媒剂；稀释剂；赋形剂和/或医药佐剂。(《雷明顿医药科学(Remington′s Pharmaceutical Sciences)》，第18版，A.R.庚纳罗(A.R.Gennaro)编，马克出版公司(Mack Publishing Company)，1990)。
物的pH、容积渗透浓度、粘度、透明度、颜色、等张性、气味、无菌性、稳定性、溶解或释放速率、吸附或渗透的配制物质。适合的配制物质包括(但不限于)氨基酸(如甘氨酸、谷酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸)；抗菌剂；抗氧化剂(如抗坏血酸、亚硫酸钠或亚硫酸氢钠)；缓冲剂(硼酸盐、碳酸氢盐、Tris-HCl、柠檬酸盐、磷酸盐、其它有机酸)；增积剂(如甘露糖醇或甘氨酸)；螯合剂(如乙二胺四乙酸(EDTA))；错合剂(如咖啡碱(caffeine)、聚乙烯吡咯烷酮、
β-环糊精或羟基丙基-β-环糊精)；填充剂；单醣；双醣和其它碳水化合物(如葡萄糖、甘露糖或糊精)；蛋白质(如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白)；着色剂；调味和稀释剂；乳化剂；亲水性聚合物(如聚乙烯吡咯烷酮)；低分子量多肽；成盐相对离子(如钠)；防腐剂(如苯扎氯铵、苯甲酸、水杨酸、硫柳汞、苯乙醇、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、氯己定
(chlorhexidine)、山梨酸或过氧化氢)；溶剂(如甘油、丙二醇或聚乙二醇)；糖醇(如甘露糖醇或山梨糖醇)；悬浮剂；表面活性剂或湿润剂(如普朗尼克(pluronics)、PEG、脱水山梨糖
醇酯、聚山梨醇酯，如聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、曲拉通(triton)、缓血酸胺、卵磷脂、胆固醇、泰洛沙泊(tyloxapal))；稳定性增强剂(蔗糖或山梨糖醇)；张力增强剂(如碱金属卤
化物(优选为氯化钠或氯化钾)、甘露糖醇、山梨糖醇)；递送媒剂；稀释剂；赋形剂和/或医药佐剂。(《雷明顿医药科学(Remington′s Pharmaceutical Sciences)》，第18版，A.R.庚纳罗(A.R.Gennaro)编，马克出版公司(Mack Publishing Company)，1990)。
[0115] 如本文所用，术语“缓冲剂”欲意谓使液体pH(其酸性或碱性)稳定的物质。所述术语如其在本文中所用，意指具有缓冲物质(如酸)与其共轭碱处于平衡状态的溶液。适用于
本文所揭露的配制物中的例示性缓冲剂包括磷酸钾缓冲剂。本发明的缓冲剂可包括的缓冲
剂的例示性盐形式包括例如钠、钾、钙、有机氨基或镁盐。术语“缓冲剂”如其在本文中所用，还希望包括除磷酸钾缓冲剂外的所有缓冲剂，其已为所属领域的技术人员所熟知且适于联
合生物药剂(如治疗性多肽)使用。鉴于本文提供的教示和指导，所属领域的技术人员应理
解，除磷酸钾缓冲剂外的缓冲剂同样可在本发明的配制物中经取代以维持或增强治疗性多
肽的稳定性。所属领域中熟知的多种缓冲组分中的任一种可用于本发明的配制物中。这些
缓冲组分包括例如乙酸、谷氨酸、丁二酸、丙酸、顺丁烯二酸、葡糖酸盐、组氨酸或其它氨基酸、柠檬酸盐、磷酸盐，或其盐形式。多种其它缓冲剂(包括例如其它有机酸)在所属领域中
已熟知且可类似地用作本发明的配制物中的缓冲组分。鉴于本文提供的教示和指导，所属
领域的技术人员将了解到，在指定配制物的所要pH和配制物中所包括的赋形剂(若存在)的
情况下，可选择上述缓冲组分或所属领域中熟知的其它组分中的任一种且用于本发明的配
制物中。缓冲组分可以多种不同形式供应至缓冲系统。在一些方面中，配制物可包括1-30、
5-20、5-10、10-20、15-20、1-5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、19、20或大于20mM缓冲剂(包括这些值)。
本文所揭露的配制物中的例示性缓冲剂包括磷酸钾缓冲剂。本发明的缓冲剂可包括的缓冲
剂的例示性盐形式包括例如钠、钾、钙、有机氨基或镁盐。术语“缓冲剂”如其在本文中所用，还希望包括除磷酸钾缓冲剂外的所有缓冲剂，其已为所属领域的技术人员所熟知且适于联
合生物药剂(如治疗性多肽)使用。鉴于本文提供的教示和指导，所属领域的技术人员应理
解，除磷酸钾缓冲剂外的缓冲剂同样可在本发明的配制物中经取代以维持或增强治疗性多
肽的稳定性。所属领域中熟知的多种缓冲组分中的任一种可用于本发明的配制物中。这些
缓冲组分包括例如乙酸、谷氨酸、丁二酸、丙酸、顺丁烯二酸、葡糖酸盐、组氨酸或其它氨基酸、柠檬酸盐、磷酸盐，或其盐形式。多种其它缓冲剂(包括例如其它有机酸)在所属领域中
已熟知且可类似地用作本发明的配制物中的缓冲组分。鉴于本文提供的教示和指导，所属
领域的技术人员将了解到，在指定配制物的所要pH和配制物中所包括的赋形剂(若存在)的
情况下，可选择上述缓冲组分或所属领域中熟知的其它组分中的任一种且用于本发明的配
制物中。缓冲组分可以多种不同形式供应至缓冲系统。在一些方面中，配制物可包括1-30、
5-20、5-10、10-20、15-20、1-5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、19、20或大于20mM缓冲剂(包括这些值)。
[0116] 如本文所用，术语“赋形剂”欲意谓治疗上的非活性物质。赋形剂可包括于配制物中用于多种目的，包括例如用作稀释剂、媒剂、缓冲剂、稳定剂、张力剂、增积剂、表面活性剂、低温保护剂、冻干保护剂、抗氧化剂、金属离子源、螯合剂和/或防腐剂。赋形剂包括例如多元醇，如山梨糖醇或甘露糖醇；糖，如蔗糖、乳糖或右旋糖；聚合物，如聚乙二醇；盐，如NaCl、KCl或磷酸钙；氨基酸，如甘氨酸、甲硫氨酸或谷氨酸；表面活性剂、金属离子；缓冲盐，如丙酸盐、乙酸盐或丁二酸盐；防腐剂和多肽，如人类血清白蛋白；以及生理盐水和水。本发明的特别适用赋形剂包括糖，包括糖醇、还原糖、非还原糖和糖酸。赋形剂在所属领域中已
熟知且可发现描述于例如王W.(Wang W.)，《国际制药学杂志(Int.J.Pharm.)》185：129-88
(1999)和王W.，《国际制药学杂志》203：1-60(2000)。非还原糖含有变旋异构碳，其为缩醛且实质上不与氨基酸或多肽发生起始梅纳反应(Maillard reaction)的反应。使斐林氏溶液
(Fehling′s solution)或托伦氏试剂(Tollen′s reagent)还原的糖还称为还原糖。非还原
糖的特定实例包括蔗糖、海藻糖、山梨糖、蔗糖素(sucralose)、松三糖(melezitose)和棉子糖(raffinose)。缓冲赋形剂例如维持液体配制物的pH直至产品储存期限且维持冻干配制
物在冻干过程中和复原时的pH。一般来说，赋形剂可基于其使蛋白质稳定抵抗多种化学和
物理应力的机制来选择。
熟知且可发现描述于例如王W.(Wang W.)，《国际制药学杂志(Int.J.Pharm.)》185：129-88
(1999)和王W.，《国际制药学杂志》203：1-60(2000)。非还原糖含有变旋异构碳，其为缩醛且实质上不与氨基酸或多肽发生起始梅纳反应(Maillard reaction)的反应。使斐林氏溶液
(Fehling′s solution)或托伦氏试剂(Tollen′s reagent)还原的糖还称为还原糖。非还原
糖的特定实例包括蔗糖、海藻糖、山梨糖、蔗糖素(sucralose)、松三糖(melezitose)和棉子糖(raffinose)。缓冲赋形剂例如维持液体配制物的pH直至产品储存期限且维持冻干配制
物在冻干过程中和复原时的pH。一般来说，赋形剂可基于其使蛋白质稳定抵抗多种化学和
物理应力的机制来选择。
[0117] 如本文所述，包括某些赋形剂为有益的，以便缓解特定应力的影响或调节特异性多肽的特定敏感性。包括其它赋形剂有益的原因在于，其对蛋白质的物理和共价稳定性具
有更普遍的作用。特别适用的赋形剂包括在化学上和功能上无害或与水性缓冲剂溶液和多
肽兼容的那些物以便使配制物的稳定性特性优化。多种这些赋形剂在本文中描述为例示性
赋形剂，其展现与本发明的水性配制物的化学兼容性和与这些配制物中所包括的多肽的功
能兼容性。所属领域的技术人员将了解，本文中关于所说明的赋形剂提供的教示和指导同
样适用于所属领域中熟知的广泛范围的其它赋形剂的使用。举例来说，为增强或赋予配制
物内的多肽的稳定性所选择的最佳赋形剂包括实质上不与多肽上的官能基反应的那些物。
就此来说，还原糖与非还原糖均可用作本发明的配制物中的赋形剂。然而，由于还原糖含有
半缩醛基团，因此其可与多肽的氨基酸侧链上的氨基发生反应且形成加成物或其它修饰
(即糖基化)。类似地，如柠檬酸盐、丁二酸盐或组氨酸的赋形剂还可与氨基酸侧链形成加合
物。鉴于本文所提供的教示和指导，所属领域的技术人员将了解，增大所指定多肽的稳定性
的保持力可通过选择非还原糖而不是还原糖或其它氨基酸反应性赋形剂(如上文举例说明
的那些物)来达成。还根据本发明的水性配制物的投药方式来选择可增强或提供稳定作用
的最佳赋形剂。举例来说，当配制物的所有组分在制造、储存和投药期间时维持物理和化学
稳定性时，静脉内(IV)、皮下(SC)或肌内(IM)肠胃外投药途径可更安全且有效。所属领域的
技术人员将了解，在例如特定制造或储存条件或特定投药方式指定的情况下，使用一或多
种赋形剂维持多肽活性形式的最大稳定性。本文中举例说明用于配制物的赋形剂展现这些
和其它特征。
有更普遍的作用。特别适用的赋形剂包括在化学上和功能上无害或与水性缓冲剂溶液和多
肽兼容的那些物以便使配制物的稳定性特性优化。多种这些赋形剂在本文中描述为例示性
赋形剂，其展现与本发明的水性配制物的化学兼容性和与这些配制物中所包括的多肽的功
能兼容性。所属领域的技术人员将了解，本文中关于所说明的赋形剂提供的教示和指导同
样适用于所属领域中熟知的广泛范围的其它赋形剂的使用。举例来说，为增强或赋予配制
物内的多肽的稳定性所选择的最佳赋形剂包括实质上不与多肽上的官能基反应的那些物。
就此来说，还原糖与非还原糖均可用作本发明的配制物中的赋形剂。然而，由于还原糖含有
半缩醛基团，因此其可与多肽的氨基酸侧链上的氨基发生反应且形成加成物或其它修饰
(即糖基化)。类似地，如柠檬酸盐、丁二酸盐或组氨酸的赋形剂还可与氨基酸侧链形成加合
物。鉴于本文所提供的教示和指导，所属领域的技术人员将了解，增大所指定多肽的稳定性
的保持力可通过选择非还原糖而不是还原糖或其它氨基酸反应性赋形剂(如上文举例说明
的那些物)来达成。还根据本发明的水性配制物的投药方式来选择可增强或提供稳定作用
的最佳赋形剂。举例来说，当配制物的所有组分在制造、储存和投药期间时维持物理和化学
稳定性时，静脉内(IV)、皮下(SC)或肌内(IM)肠胃外投药途径可更安全且有效。所属领域的
技术人员将了解，在例如特定制造或储存条件或特定投药方式指定的情况下，使用一或多
种赋形剂维持多肽活性形式的最大稳定性。本文中举例说明用于配制物的赋形剂展现这些
和其它特征。
[0118] 用于本发明的配制物中的赋形剂的量或浓度将根据例如以下而改变：配制物中所包括的多肽的量、所需配制物中所包括的其它赋形剂的量、是否需要或必需稀释剂、配制物
中的其它组分的量或体积、配制物内的各组分的总量、多肽的特异活性和所需张力或欲达
成的重量摩尔渗透浓度。赋形剂浓度的特定实例进一步举例说明于下文中。此外，不同类型
的赋形剂可组合于配制物中。因此，本发明的配制物可含有赋形剂(两种、三种或四种或超
过四种不同类型的赋形剂)。就含有两种或超过两种不同多肽的配制物来说，赋形剂尤其可
组合使用。赋形剂可展现类似或不同的化学特性。鉴于本文所提供的教示和指导，所属领域
的技术人员将了解到，任何特定配制物中可包括使得本发明配制物有助于多肽保持稳定性
的量或范围的赋形剂。举例来说，本发明的配制物中所包括的盐的量和类型可根据最终溶
液的重量摩尔渗透浓度(即等张性、低张性或高张性)以及配制物中所包括的其它组分的量
和重量摩尔渗透浓度来选择。类似地，根据参照配制物中所包括的多元醇或糖的类型的举
例说明，此赋形剂的量将视其重量摩尔渗透浓度而定。包括约5％山梨糖醇可达成等张性，
而达成等张性需要约9％蔗糖赋形剂。可包括于本发明的配制物内的一或多种赋形剂的量
或浓度范围的选择已参照盐、多元醇和糖举例说明如上。然而，所属领域的技术人员应理
解，本文所述和进一步参照特定赋形剂举例说明的考虑因素同样适用于赋形剂的所有类型
和组合，包括例如盐、氨基酸、其它张力剂、表面活性剂、稳定剂、增积剂、低温保护剂、冻干保护剂、抗氧化剂、金属离子、螯合剂和/或防腐剂。
中的其它组分的量或体积、配制物内的各组分的总量、多肽的特异活性和所需张力或欲达
成的重量摩尔渗透浓度。赋形剂浓度的特定实例进一步举例说明于下文中。此外，不同类型
的赋形剂可组合于配制物中。因此，本发明的配制物可含有赋形剂(两种、三种或四种或超
过四种不同类型的赋形剂)。就含有两种或超过两种不同多肽的配制物来说，赋形剂尤其可
组合使用。赋形剂可展现类似或不同的化学特性。鉴于本文所提供的教示和指导，所属领域
的技术人员将了解到，任何特定配制物中可包括使得本发明配制物有助于多肽保持稳定性
的量或范围的赋形剂。举例来说，本发明的配制物中所包括的盐的量和类型可根据最终溶
液的重量摩尔渗透浓度(即等张性、低张性或高张性)以及配制物中所包括的其它组分的量
和重量摩尔渗透浓度来选择。类似地，根据参照配制物中所包括的多元醇或糖的类型的举
例说明，此赋形剂的量将视其重量摩尔渗透浓度而定。包括约5％山梨糖醇可达成等张性，
而达成等张性需要约9％蔗糖赋形剂。可包括于本发明的配制物内的一或多种赋形剂的量
或浓度范围的选择已参照盐、多元醇和糖举例说明如上。然而，所属领域的技术人员应理
解，本文所述和进一步参照特定赋形剂举例说明的考虑因素同样适用于赋形剂的所有类型
和组合，包括例如盐、氨基酸、其它张力剂、表面活性剂、稳定剂、增积剂、低温保护剂、冻干保护剂、抗氧化剂、金属离子、螯合剂和/或防腐剂。
[0119] 本发明的配制物中可包括浓度范围通常为约1-40％(w/v)、约5-35％(w/v)、约8-30％(w/v)、约8-25％(w/v)或浓度为约8％(w/v)的赋形剂。在某些情况下，本发明的配制物
中还可使用高达约45％(w/v)、50％(w/v)或大于50％(w/v)的浓度。举例来说，在一些情况
下，为了制备本发明的高张性配制物可能需要包括高达60％(w/v)或75％(w/v)的浓度。必
要时，这些高张性溶液可在使用前稀释以制备等张性配制物。其它适用的浓度范围包括约
1-20％，特定来说，约2-18％(w/v)，更特定来说，约4-16％(w/v)，甚至更特定来说，约6-
14％(w/v)或约8-12％(w/v)，或约10％(w/v)。小于、大于或介于这些范围之间的赋形剂浓
度和/或量还可用于本发明的配制物中。举例来说，配制物中可包括占小于约1％(w/v)的一
或多种赋形剂。类似地，配制物可含有浓度大于约40％(w/v)的一或多种赋形剂。从而可制
得含有实质上任何所需浓度或量的一或多种赋形剂的本发明配制物，此浓度或量包括例如
1-30、5-20、5-10、10-20、15-20、1-5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、
19或20％(w/v)或大于20％(w/v)(包括这些值)。
中还可使用高达约45％(w/v)、50％(w/v)或大于50％(w/v)的浓度。举例来说，在一些情况
下，为了制备本发明的高张性配制物可能需要包括高达60％(w/v)或75％(w/v)的浓度。必
要时，这些高张性溶液可在使用前稀释以制备等张性配制物。其它适用的浓度范围包括约
1-20％，特定来说，约2-18％(w/v)，更特定来说，约4-16％(w/v)，甚至更特定来说，约6-
14％(w/v)或约8-12％(w/v)，或约10％(w/v)。小于、大于或介于这些范围之间的赋形剂浓
度和/或量还可用于本发明的配制物中。举例来说，配制物中可包括占小于约1％(w/v)的一
或多种赋形剂。类似地，配制物可含有浓度大于约40％(w/v)的一或多种赋形剂。从而可制
得含有实质上任何所需浓度或量的一或多种赋形剂的本发明配制物，此浓度或量包括例如
1-30、5-20、5-10、10-20、15-20、1-5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、
19或20％(w/v)或大于20％(w/v)(包括这些值)。
[0120] 本发明的配制物中的缓冲组分可包括一或多种赋形剂。如先前所述，所包括的赋形剂的一个作用为提供多肽抵抗应力的稳定作用，应力可在制造、装运和储存期间发生。为
了实现此作用，至少一种赋形剂可充当缓冲剂、稳定剂、张力剂、增积剂、表面活性剂、冷冻保护剂、冻干保护剂抗氧化剂、金属离子源、螯合剂和/或防腐剂。此外，至少一种赋形剂还可充当稀释剂和/或媒剂或用于减小高浓度配制物的粘度以便达成其递送和/或增强患者
便利性。类似地，至少一种赋形剂另外可向本发明的配制物赋予超过一种上述功能。或者，
本发明的配制物中可包括两种或超过两种赋形剂以执行超过一种上述或其它功能。举例来
说，赋形剂作为改变、调节或优化配制物的重量摩尔渗透浓度的组分包括于本发明的配制
物中，从而充当张力剂。类似地，张力剂与表面活性剂均可包括于本发明的配制物中以调节
重量摩尔渗透浓度与控制聚集。赋形剂、其用途、配制物和特征在所属领域中已熟知且可发
现描述于例如王W.(Wang W.)，《国际制药学杂志》185：129-88(1999)和王W.，《国际制药学杂志》203：1-60(2000)。
了实现此作用，至少一种赋形剂可充当缓冲剂、稳定剂、张力剂、增积剂、表面活性剂、冷冻保护剂、冻干保护剂抗氧化剂、金属离子源、螯合剂和/或防腐剂。此外，至少一种赋形剂还可充当稀释剂和/或媒剂或用于减小高浓度配制物的粘度以便达成其递送和/或增强患者
便利性。类似地，至少一种赋形剂另外可向本发明的配制物赋予超过一种上述功能。或者，
本发明的配制物中可包括两种或超过两种赋形剂以执行超过一种上述或其它功能。举例来
说，赋形剂作为改变、调节或优化配制物的重量摩尔渗透浓度的组分包括于本发明的配制
物中，从而充当张力剂。类似地，张力剂与表面活性剂均可包括于本发明的配制物中以调节
重量摩尔渗透浓度与控制聚集。赋形剂、其用途、配制物和特征在所属领域中已熟知且可发
现描述于例如王W.(Wang W.)，《国际制药学杂志》185：129-88(1999)和王W.，《国际制药学杂志》203：1-60(2000)。
[0121] 液体配制物中所包括的张力剂和/或稳定剂可用于例如向配制物提供等张性、低张性或高张性，以使得其适于投药。这些赋形剂还可用于例如促进多肽结构的维持和/或最
小化静电性、溶液蛋白质-蛋白质相互作用。张力剂和/或稳定剂的特定实例包括多元醇、盐
和/或氨基酸。冻干配制物中所包括的张力剂和/或稳定剂可用作例如冷冻保护剂以保护多
肽免受冷冻应力的影响或用作冻干保护剂以使多肽在冷冻干燥状态下稳定化。这些冷冻保
护剂和冻干保护剂的特定实例包括多元醇、糖和聚合物。
小化静电性、溶液蛋白质-蛋白质相互作用。张力剂和/或稳定剂的特定实例包括多元醇、盐
和/或氨基酸。冻干配制物中所包括的张力剂和/或稳定剂可用作例如冷冻保护剂以保护多
肽免受冷冻应力的影响或用作冻干保护剂以使多肽在冷冻干燥状态下稳定化。这些冷冻保
护剂和冻干保护剂的特定实例包括多元醇、糖和聚合物。
[0122] 如本文所使用，术语“表面活性剂”欲意谓作用为减小其溶解于其中的液体的表面张力的物质。配制物中可包括表面活性剂用于多种目的，包括例如防止或控制液体配制物
中的聚集、颗粒形成和/或表面吸附，或防止或控制冻干配制物在冻干和/或复原过程中出
现这些现象。表面活性剂包括例如部分溶解于有机溶剂与水溶液中的两性有机化合物。表
面活性剂的一般特征包括其能够减小水的表面张力、减小油与水之间的界面张力以及形成
胶束。本发明的表面活性剂包括非离子和离子表面活性剂。表面活性剂在所属领域中已熟
知且可发现描述于例如兰朵T.W.(Randolph T.W.)和琼斯L.S.(Jones L.S.)，表面活性剂-
蛋白质相互作用(Surfactant-protein interactions)，《医药生物技术(Pharm
Biotechnol.)》13：159-75(2002)。简单来说，非离子表面活性剂包括例如烷基聚(氧化乙
烯)、烷基聚葡萄糖苷(如辛基葡糖苷和癸基麦芽糖苷)、脂肪醇(如鲸蜡基醇和油醇)、椰油
酰胺MEA、椰油酰胺DEA和椰油酰胺TEA。非离子表面活性剂的特定实例包括聚山梨醇酯，包
括例如聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯28、聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯60、聚山梨醇酯65、聚山梨醇酯80、聚山梨醇酯81、聚山梨醇酯85和其类似物；泊洛沙姆(poloxamer)，包括例如泊洛沙姆188(还称为聚羟亚烃(poloxalkol)或聚(氧化乙烯)-聚(氧化丙烯))、泊洛沙姆407或聚
乙烯-聚丙二醇和其类似物，和聚乙二醇(PEG)。聚山梨醇酯20与吐温20(TWEEN 20)、脱水山
梨糖醇单月桂酸酯和聚氧乙烯脱水山梨糖醇单月桂酸酯同义。
中的聚集、颗粒形成和/或表面吸附，或防止或控制冻干配制物在冻干和/或复原过程中出
现这些现象。表面活性剂包括例如部分溶解于有机溶剂与水溶液中的两性有机化合物。表
面活性剂的一般特征包括其能够减小水的表面张力、减小油与水之间的界面张力以及形成
胶束。本发明的表面活性剂包括非离子和离子表面活性剂。表面活性剂在所属领域中已熟
知且可发现描述于例如兰朵T.W.(Randolph T.W.)和琼斯L.S.(Jones L.S.)，表面活性剂-
蛋白质相互作用(Surfactant-protein interactions)，《医药生物技术(Pharm
Biotechnol.)》13：159-75(2002)。简单来说，非离子表面活性剂包括例如烷基聚(氧化乙
烯)、烷基聚葡萄糖苷(如辛基葡糖苷和癸基麦芽糖苷)、脂肪醇(如鲸蜡基醇和油醇)、椰油
酰胺MEA、椰油酰胺DEA和椰油酰胺TEA。非离子表面活性剂的特定实例包括聚山梨醇酯，包
括例如聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯28、聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯60、聚山梨醇酯65、聚山梨醇酯80、聚山梨醇酯81、聚山梨醇酯85和其类似物；泊洛沙姆(poloxamer)，包括例如泊洛沙姆188(还称为聚羟亚烃(poloxalkol)或聚(氧化乙烯)-聚(氧化丙烯))、泊洛沙姆407或聚
乙烯-聚丙二醇和其类似物，和聚乙二醇(PEG)。聚山梨醇酯20与吐温20(TWEEN 20)、脱水山
梨糖醇单月桂酸酯和聚氧乙烯脱水山梨糖醇单月桂酸酯同义。
[0123] 可选择本发明配制物中所包括的最佳表面活性剂，例如通过防止或减少聚集和/或吸附来增强或促进多肽保持稳定性。举例来说，脱水山梨糖醇脂肪酸酯(如聚山梨醇酯)
为展现广泛范围的亲水性和乳化特征的表面活性剂。其可个别地使用或与其它表面活性剂
组合使用以满足广泛范围的稳定化需要。这些特征由于其可经定制以涵盖多肽的广泛范围
的疏水性和亲水性特征而特别适用于多肽。用于选择表面活性剂的考虑因素包括先前参照
赋形剂一般性所述的那些因素以及表面活性剂的疏水性特征和临界胶束浓度。本文中举例
说明的表面活性剂以及所属领域中熟知的多种其它物可用于本发明的配制物中。
为展现广泛范围的亲水性和乳化特征的表面活性剂。其可个别地使用或与其它表面活性剂
组合使用以满足广泛范围的稳定化需要。这些特征由于其可经定制以涵盖多肽的广泛范围
的疏水性和亲水性特征而特别适用于多肽。用于选择表面活性剂的考虑因素包括先前参照
赋形剂一般性所述的那些因素以及表面活性剂的疏水性特征和临界胶束浓度。本文中举例
说明的表面活性剂以及所属领域中熟知的多种其它物可用于本发明的配制物中。
[0124] 本发明配制物中的表面活性剂浓度范围包括先前参照赋形剂一般性所述的那些范围，其中特别适用的浓度小于约1％(w/v)。就此来说，可使用的表面活性剂浓度的范围通
常为约0.0001-0.10％(w/v)，特定来说，约0.002-0.05％(w/v)，更特定来说，约0.003-
0.01％(w/v)，甚至更特定来说，约0.004-0.008％(w/v)或约0.005-0.006％(w/v)。本发明
的配制物还可使用小于、大于或介于这些范围之间的表面活性剂浓度和/或量。举例来说，
配制物中可包括占小于约0.001％(w/v)的一或多种表面活性剂。类似地，配制物可含有浓
度大于约0.10％(w/v)的一或多种表面活性剂。从而可制得含有基本上任何所要浓度或量
的一或多种表面活性剂的本发明配制物，此浓度或量包括例如0.001、0.002、0.003、0.004、
0.005、0.006、0.007、0.008、0.009、0.010、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09或
0.10％(w/v)或超过0.10％(w/v)(包括这些值)。适用作本发明配制物中的赋形剂的多种表
面活性剂先前已描述。适用于本发明的液体或冻干配制物中的其它表面活性剂包括例如糖
酯，如月桂酸酯(C12)、棕榈酸酯(C16)、硬脂酸酯(C18)、聚乙二醇十六烷基十八烷基醚、聚乙二醇月桂基醚、聚乙二醇油基醚、聚乙二醇油酸酯、聚乙二醇硬脂酸酯、聚乙二醇甘油蓖
麻油酸酯、聚乙二醇甘油羟基硬脂酸酯；烷基聚葡萄糖苷，如辛基葡糖苷和癸基麦芽糖苷；
脂肪醇，如鲸蜡基醇和油醇；和椰油酰胺，如椰油酰胺MEA、DEA、TEA；其它非离子表面活性剂和其它离子表面活性剂。
常为约0.0001-0.10％(w/v)，特定来说，约0.002-0.05％(w/v)，更特定来说，约0.003-
0.01％(w/v)，甚至更特定来说，约0.004-0.008％(w/v)或约0.005-0.006％(w/v)。本发明
的配制物还可使用小于、大于或介于这些范围之间的表面活性剂浓度和/或量。举例来说，
配制物中可包括占小于约0.001％(w/v)的一或多种表面活性剂。类似地，配制物可含有浓
度大于约0.10％(w/v)的一或多种表面活性剂。从而可制得含有基本上任何所要浓度或量
的一或多种表面活性剂的本发明配制物，此浓度或量包括例如0.001、0.002、0.003、0.004、
0.005、0.006、0.007、0.008、0.009、0.010、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09或
0.10％(w/v)或超过0.10％(w/v)(包括这些值)。适用作本发明配制物中的赋形剂的多种表
面活性剂先前已描述。适用于本发明的液体或冻干配制物中的其它表面活性剂包括例如糖
酯，如月桂酸酯(C12)、棕榈酸酯(C16)、硬脂酸酯(C18)、聚乙二醇十六烷基十八烷基醚、聚乙二醇月桂基醚、聚乙二醇油基醚、聚乙二醇油酸酯、聚乙二醇硬脂酸酯、聚乙二醇甘油蓖
麻油酸酯、聚乙二醇甘油羟基硬脂酸酯；烷基聚葡萄糖苷，如辛基葡糖苷和癸基麦芽糖苷；
脂肪醇，如鲸蜡基醇和油醇；和椰油酰胺，如椰油酰胺MEA、DEA、TEA；其它非离子表面活性剂和其它离子表面活性剂。
[0125] 本发明的配制物(包括本发明的液体配制物)的稳定性是指配制物内的多肽的结构和/或功能的保持力。本发明的配制物中的多肽将展现影响稳定性或功能的特性，如对变
化或变质的抗性，且因此随时间的流逝维持一致的功能特征。
化或变质的抗性，且因此随时间的流逝维持一致的功能特征。
[0126] 本发明配制物中的缓冲组分还可包括一或多种表面活性剂作为赋形剂。如先前所描述，本发明配制物中的表面活性剂的一种作用为防止或最小化聚集和/或吸附，如表面诱
发性降解。在足够的浓度下(通常约为表面活性剂的临界胶束浓度)，表面活性剂分子的表
层用以防止蛋白质分子在界面吸附。从而最小化表面诱发性降解。表面活性剂、其用途、配
制物和配制物特征在所属领域中已熟知且可发现描述于例如兰朵和琼斯，同上(2002)中。
发性降解。在足够的浓度下(通常约为表面活性剂的临界胶束浓度)，表面活性剂分子的表
层用以防止蛋白质分子在界面吸附。从而最小化表面诱发性降解。表面活性剂、其用途、配
制物和配制物特征在所属领域中已熟知且可发现描述于例如兰朵和琼斯，同上(2002)中。
[0127] 在另一个实施例中，本发明配制物内的多肽的稳定性包括例如物理和/或化学稳定性的保持。多肽稳定性可如下评估：例如测定多肽是否已经历物理降解和/或化学降解路
径，如先前所述的那些降解路径，包括其结构的化学修饰。本发明配制物中的多肽稳定性的
保持包括例如相较于多肽在初始时间点的稳定性，或相对于在低温(例如-70摄氏度)下所
保存的相同对照物，物理或化学稳定性保持约80-100％、85-99％、90-98％、92-96％或94-
95％。因此，本发明的配制物内的多肽的稳定性包括相较于多肽在初始时间点的稳定性，相
对于在低温(例如-70摄氏度)下所保存的相同对照物，稳定性保持大于99.5％、至少约
99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％、90％、89％、88％、87％、86％、85％、
84％、83％、82％、81％或80％(包括这些值)。
径，如先前所述的那些降解路径，包括其结构的化学修饰。本发明配制物中的多肽稳定性的
保持包括例如相较于多肽在初始时间点的稳定性，或相对于在低温(例如-70摄氏度)下所
保存的相同对照物，物理或化学稳定性保持约80-100％、85-99％、90-98％、92-96％或94-
95％。因此，本发明的配制物内的多肽的稳定性包括相较于多肽在初始时间点的稳定性，相
对于在低温(例如-70摄氏度)下所保存的相同对照物，稳定性保持大于99.5％、至少约
99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％、90％、89％、88％、87％、86％、85％、
84％、83％、82％、81％或80％(包括这些值)。
[0128] 在另一实施例中，本发明配制物内的多肽的稳定性包括例如保持活性。多肽活性可使用例如指示多肽功能的活体外、活体内和/或原位分析来评估。本发明配制物内的多肽
稳定性保持包括例如活性保持约50-100％或超过100％，此视分析的可变性而定。举例来
说，稳定性保持可包括相较于多肽在初始时间点的活性，活性保持约60-90％或70-80％。因
此，本发明配制物内的多肽稳定性包括相较于多肽在初始时间点的活性，活性保持至少约
50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％且可包括活性测量值大于100％，如105％、110％、115％、120％、125％或150％或超过150％(包括这些值)。一般来说，初始时间点选为本发明配制物中的多肽最初制备的时间或最初检查质量(即满足合格
规格)的时间。初始时间点还可包括将本发明配制物中的多肽再配制的时间。再配制可在例
如浓度高于、低于或同于初始制剂的情况下进行。
稳定性保持包括例如活性保持约50-100％或超过100％，此视分析的可变性而定。举例来
说，稳定性保持可包括相较于多肽在初始时间点的活性，活性保持约60-90％或70-80％。因
此，本发明配制物内的多肽稳定性包括相较于多肽在初始时间点的活性，活性保持至少约
50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％且可包括活性测量值大于100％，如105％、110％、115％、120％、125％或150％或超过150％(包括这些值)。一般来说，初始时间点选为本发明配制物中的多肽最初制备的时间或最初检查质量(即满足合格
规格)的时间。初始时间点还可包括将本发明配制物中的多肽再配制的时间。再配制可在例
如浓度高于、低于或同于初始制剂的情况下进行。
[0129] 本发明的配制物可经制备而与参考溶液或流体(即血清)具等张性。等张性溶液中所溶解的溶质的量实质上类似于其周围物质以使得其具有渗透稳定性。除非明确与特定溶
液或流体比较，否则本文中例示性参照人类血清使用等张或等张性(例如300mOsmol/kg)。
因此，本发明的等张性配制物含有浓度与人类血液实质上类似的溶质或展现与人类血液实
质上类似的渗透压。一般来说，等张性溶液含有浓度与用于人类和多种其它哺乳动物的标
准生理盐水大约相同的溶质，标准生理盐水为含有约0.9wt％(0.009g/ml)盐的水溶液(例
如0.009g/ml NaCl)。本发明的配制物还可包括低张性或高张性溶液制剂。
液或流体比较，否则本文中例示性参照人类血清使用等张或等张性(例如300mOsmol/kg)。
因此，本发明的等张性配制物含有浓度与人类血液实质上类似的溶质或展现与人类血液实
质上类似的渗透压。一般来说，等张性溶液含有浓度与用于人类和多种其它哺乳动物的标
准生理盐水大约相同的溶质，标准生理盐水为含有约0.9wt％(0.009g/ml)盐的水溶液(例
如0.009g/ml NaCl)。本发明的配制物还可包括低张性或高张性溶液制剂。
[0130] 最佳医药组合物将由所属领域的技术人员根据例如预定投药途径、递送形式和所要剂量而确定。参见例如《雷明顿医药科学》同上。所述组合物可影响多肽的物理状态、稳定性、活体内释放速率和活体内清除速率。举例来说，适合组合物可为肠胃外施用的注射用水
(生理盐水溶液)。离子表面活性剂包括例如阴离子、阳离子和两性离子表面活性剂。阴离子
表面活性剂包括例如基于磺酸盐或基于羧酸盐的表面活性剂，如肥皂、脂肪酸盐、十二烷基
硫酸钠(SDS)、月桂基硫酸铵和其它烷基硫酸盐。阳离子表面活性剂包括例如基于四级铵的
表面活性剂，如溴化十六烷基三甲基铵(CTAB)、其它烷基三甲基铵盐、氯化十六烷基吡锭、
聚乙氧基化动物脂胺(POEA)和苯扎氯铵(benzalkonium chloride)。两性离子或两性表面
活性剂包括例如十二烷基甜菜碱、十二烷基二甲胺氧化物、椰油酰氨基丙基甜菜碱和椰油
基两性甘氨酸盐。
(生理盐水溶液)。离子表面活性剂包括例如阴离子、阳离子和两性离子表面活性剂。阴离子
表面活性剂包括例如基于磺酸盐或基于羧酸盐的表面活性剂，如肥皂、脂肪酸盐、十二烷基
硫酸钠(SDS)、月桂基硫酸铵和其它烷基硫酸盐。阳离子表面活性剂包括例如基于四级铵的
表面活性剂，如溴化十六烷基三甲基铵(CTAB)、其它烷基三甲基铵盐、氯化十六烷基吡锭、
聚乙氧基化动物脂胺(POEA)和苯扎氯铵(benzalkonium chloride)。两性离子或两性表面
活性剂包括例如十二烷基甜菜碱、十二烷基二甲胺氧化物、椰油酰氨基丙基甜菜碱和椰油
基两性甘氨酸盐。
[0131] 医药组合物中的主要媒剂或载剂可实质上具有水性或非水性。举例来说，适合的媒剂或载剂可为注射用水、生理盐水溶液或人工脑脊髓液，其中可能补充有供肠胃外施用
的组合物中所常见的其它物质。中性缓冲生理盐水或与血清白蛋白混合的生理盐水为另外
的例示性媒剂。其它例示性医药组合物包含Tris缓冲剂或乙酸盐缓冲剂，其可进一步包括
山梨糖醇或其适合的替代物。在一个实施例中，可通过将具有所要纯度的所选组合物与任
选的配制剂《( 雷明顿医药科学》，同上)混合而制得呈冻干饼或水溶液形式的组合物。另外，治疗性组合物可使用适当赋形剂(如蔗糖)配制为冻干物。
的组合物中所常见的其它物质。中性缓冲生理盐水或与血清白蛋白混合的生理盐水为另外
的例示性媒剂。其它例示性医药组合物包含Tris缓冲剂或乙酸盐缓冲剂，其可进一步包括
山梨糖醇或其适合的替代物。在一个实施例中，可通过将具有所要纯度的所选组合物与任
选的配制剂《( 雷明顿医药科学》，同上)混合而制得呈冻干饼或水溶液形式的组合物。另外，治疗性组合物可使用适当赋形剂(如蔗糖)配制为冻干物。
[0132] 配制物可以多种方法递送，例如吸入疗法、经口或注射。当涵盖肠胃外投药时，治疗组合物可呈无热原质、肠胃外可接受的水溶液形式，其包含所要多肽于医药学上可接受
的媒剂中。尤其适用于肠胃外注射的媒剂为无菌蒸馏水，多肽于其中配制成经适当防腐的
无菌等张性溶液。又一种制备可包括用如以下媒介物配制所要分子：可注射微球、生物可侵
蚀颗粒、聚合物化合物(聚乳酸、聚乙醇酸)、珠粒或脂质体，从而得到控制或持续释放的产
物，其接着可经由储槽式注射剂递送。还可使用玻糖醛酸，且其可具有在循环中促进持续作
用的作用。用于引入所要分子的其它适合方式包括可植入的药物递送装置。
的媒剂中。尤其适用于肠胃外注射的媒剂为无菌蒸馏水，多肽于其中配制成经适当防腐的
无菌等张性溶液。又一种制备可包括用如以下媒介物配制所要分子：可注射微球、生物可侵
蚀颗粒、聚合物化合物(聚乳酸、聚乙醇酸)、珠粒或脂质体，从而得到控制或持续释放的产
物，其接着可经由储槽式注射剂递送。还可使用玻糖醛酸，且其可具有在循环中促进持续作
用的作用。用于引入所要分子的其它适合方式包括可植入的药物递送装置。
[0133] 在另一方面中，适用于可注射投药的医药配制物可配制于水溶液中，优选配制于生理上相容的缓冲液中，如汉克氏溶液(Hanks′solution)、林格氏溶液(Ringer′s
solution)或生理性缓冲生理盐水。水性注射悬浮液可含有增加悬浮液粘度的物质，如羧甲
基纤维素钠、山梨糖醇或聚葡萄糖。另外，适当时可将活性化合物的悬浮液制备成油性注射
悬浮液。适合亲脂性溶剂或媒剂包括脂肪油，如芝麻油；或合成脂肪酸酯，如油酸乙酯或三
酸甘油酯；或脂质体。还可使用非脂质聚阳离子氨基聚合物递送。任选地，悬浮液还可含有
适合稳定剂或提高化合物溶解性的试剂且允许制备高浓度溶液。在另一个实施例中，医药
组合物可经配制用于吸入。还可用推进剂配制吸入溶液以供气溶胶递送。在又另一个实施
例中，溶液可雾化。肺部投药进一步描述于PCT申请第PCT/US94/001875号中，其描述经化学
修饰的蛋白质的肺部递送。
solution)或生理性缓冲生理盐水。水性注射悬浮液可含有增加悬浮液粘度的物质，如羧甲
基纤维素钠、山梨糖醇或聚葡萄糖。另外，适当时可将活性化合物的悬浮液制备成油性注射
悬浮液。适合亲脂性溶剂或媒剂包括脂肪油，如芝麻油；或合成脂肪酸酯，如油酸乙酯或三
酸甘油酯；或脂质体。还可使用非脂质聚阳离子氨基聚合物递送。任选地，悬浮液还可含有
适合稳定剂或提高化合物溶解性的试剂且允许制备高浓度溶液。在另一个实施例中，医药
组合物可经配制用于吸入。还可用推进剂配制吸入溶液以供气溶胶递送。在又另一个实施
例中，溶液可雾化。肺部投药进一步描述于PCT申请第PCT/US94/001875号中，其描述经化学
修饰的蛋白质的肺部递送。
[0134] 在一些方面中，蛋白质可配制为无菌水溶液，其含有50-100、60-80、65-75、60-70、70-80、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79或80mg/mL蛋白质；1-30、5-20、5-10、10-20、15-20、1-5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、
17、19、20mM或更高磷酸钾缓冲剂；小于1-10、5-10、5、5、6、7、8、8.8、9、10％(w/v)或更高的蔗糖和/或小于0.006、0.006％(w/v)或更高的聚山梨醇酯20，pH 4-12、5-6、5-7、6-7、5、6、
6.7、7或8(包括这些值)。在一些方面中，蛋白质可配制为含有蛋白质、磷酸钾缓冲剂、蔗糖和/或聚山梨醇酯20的无菌水溶液。在一些方面中，蛋白质可用磷酸钾缓冲剂、蔗糖和/或聚
山梨醇酯20配制。在一些方面中，蛋白质可经配制用于静脉内投药。在一些方面中，蛋白质
可在中性pH下配制。在一些方面中，蛋白质可在约pH 4-12、5-6、5-7、6-7、5、6、6.7、7或8(包括这些值)下配制。在一些方面中，本文所述的蛋白质可用非天然存在的组分(如非天然存
在的赋形剂)配制。
17、19、20mM或更高磷酸钾缓冲剂；小于1-10、5-10、5、5、6、7、8、8.8、9、10％(w/v)或更高的蔗糖和/或小于0.006、0.006％(w/v)或更高的聚山梨醇酯20，pH 4-12、5-6、5-7、6-7、5、6、
6.7、7或8(包括这些值)。在一些方面中，蛋白质可配制为含有蛋白质、磷酸钾缓冲剂、蔗糖和/或聚山梨醇酯20的无菌水溶液。在一些方面中，蛋白质可用磷酸钾缓冲剂、蔗糖和/或聚
山梨醇酯20配制。在一些方面中，蛋白质可经配制用于静脉内投药。在一些方面中，蛋白质
可在中性pH下配制。在一些方面中，蛋白质可在约pH 4-12、5-6、5-7、6-7、5、6、6.7、7或8(包括这些值)下配制。在一些方面中，本文所述的蛋白质可用非天然存在的组分(如非天然存
在的赋形剂)配制。
[0135] 还预期某些配制物可经口施用。在一个实施例中，以此方式施用的分子可用或不用混配固体剂型(如锭剂和胶囊)所常用的那些载剂来配制。举例来说，胶囊可经设计以使
配制物的活性部分在胃肠道的某处释放，此时生物可用性最大化且到达全身前的降解最小
化。可包括促进治疗性分子吸收的其它药剂。还可使用稀释剂、调味剂、低熔点蜡、植物油、润滑剂、悬浮剂、锭剂崩解剂和粘合剂。经口施用的医药组合物还可使用所属领域中熟知的
医药学上可接受的载剂配制成适于经口施用的剂型。这些载剂使得医药组合物能够配制成
锭剂、丸剂、糖衣药丸、胶囊、液体、凝胶、糖浆、浆液、悬浮液以及其类似物，以便患者摄入。
配制物的活性部分在胃肠道的某处释放，此时生物可用性最大化且到达全身前的降解最小
化。可包括促进治疗性分子吸收的其它药剂。还可使用稀释剂、调味剂、低熔点蜡、植物油、润滑剂、悬浮剂、锭剂崩解剂和粘合剂。经口施用的医药组合物还可使用所属领域中熟知的
医药学上可接受的载剂配制成适于经口施用的剂型。这些载剂使得医药组合物能够配制成
锭剂、丸剂、糖衣药丸、胶囊、液体、凝胶、糖浆、浆液、悬浮液以及其类似物，以便患者摄入。
[0136] 经口使用的医药制剂可如下获得：合并活性化合物与固体赋形剂且加工所得颗粒混合物(任选地在研磨之后)以获得锭剂或糖衣药丸核心。必要时可添加适合助剂。适合赋
形剂包括碳水化合物或蛋白质填充剂，如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露糖醇和山梨糖醇；玉米、小麦、稻谷、马铃薯或其它植物的淀粉；纤维素，如甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素或羧甲基纤维素钠；树胶，包括阿拉伯胶和黄蓍胶；和蛋白质，如明胶和胶原蛋白。必要时，可添加崩解剂或增溶剂，如交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂和海藻酸或其盐，如海藻酸钠。
形剂包括碳水化合物或蛋白质填充剂，如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露糖醇和山梨糖醇；玉米、小麦、稻谷、马铃薯或其它植物的淀粉；纤维素，如甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素或羧甲基纤维素钠；树胶，包括阿拉伯胶和黄蓍胶；和蛋白质，如明胶和胶原蛋白。必要时，可添加崩解剂或增溶剂，如交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂和海藻酸或其盐，如海藻酸钠。
[0137] 糖衣药丸核心可结合适合包衣一起使用，如浓缩的糖溶液，其还可含有阿拉伯胶、滑石、聚乙烯吡咯烷酮、卡波莫凝胶(carbopol gel)、聚乙二醇，和/或二氧化钛、漆溶液和适合有机溶剂或溶剂混合物。可将染料或颜料添加至锭剂或糖衣药丸包衣中以鉴别或表征
活性剂的量，即剂量。
活性剂的量，即剂量。
[0138] 可经口使用的医药制剂还包括由明胶制成的配合插入式胶囊以及由明胶和包衣(如甘油或山梨糖醇)制成的密封软胶囊。配合插入式胶囊可含有活性成分与填充剂或粘合
剂(如乳糖或淀粉)、润滑剂(如滑石或硬脂酸镁)和任选的稳定剂的混合物。在软胶囊中，活
性化合物在稳定剂存在或不存在下可溶解或悬浮于适合液体中，如脂肪油、液体或液体聚
乙二醇。
剂(如乳糖或淀粉)、润滑剂(如滑石或硬脂酸镁)和任选的稳定剂的混合物。在软胶囊中，活
性化合物在稳定剂存在或不存在下可溶解或悬浮于适合液体中，如脂肪油、液体或液体聚
乙二醇。
[0139] 对于所属领域的技术人员来说，其它医药组合物将为显而易见的，包括在持续或控制递送型配制物中包含多肽的配制物。用于配制多种其它持续或控制递送工具(如脂质
体载剂)、生物可侵蚀微粒或多孔珠粒和储槽式注射剂的技术还为所属领域的技术人员所
知。参见例如PCT/US93/00829，其描述用于递送医药组合物的多孔聚合物微粒的控制释放。
持续释放型制剂的其它实例包括半渗透聚合物基质的成形对象形式，例如薄膜，或微胶囊。
持续释放型基质可包括聚酯、水凝胶、聚乳酸交酯(U.S.3,773,919、EP 58,481)、L-谷氨酸
与L-谷氨酸γ乙基酯(思德曼(Sidman)等人，《生物聚合物(Biopolymers)》，22：547-556
(1983)、聚(甲基丙烯酸2-羟基乙基酯)(郎格尔(Langer)等人，《生物医学材料研究杂志
(J.Biomed.Mater.Res.)》，15：167-277，(1981)；郎格尔等人，《化学技术(Chem.Tech.)》，
12：98-105(1982))、乙烯乙酸乙烯酯(郎格尔等人，同上)或聚-D(-)-3-羟基丁酸(EP 133,
988)。持续释放型组合物还包括可通过所属领域中已知的若干方法中的任一种制备的脂质
体。参见例如爱普斯坦(Eppstein)等人，《美国科学院院报》，82：3688(1985)；EP 36,676；EP
88,046；EP 143,949。
体载剂)、生物可侵蚀微粒或多孔珠粒和储槽式注射剂的技术还为所属领域的技术人员所
知。参见例如PCT/US93/00829，其描述用于递送医药组合物的多孔聚合物微粒的控制释放。
持续释放型制剂的其它实例包括半渗透聚合物基质的成形对象形式，例如薄膜，或微胶囊。
持续释放型基质可包括聚酯、水凝胶、聚乳酸交酯(U.S.3,773,919、EP 58,481)、L-谷氨酸
与L-谷氨酸γ乙基酯(思德曼(Sidman)等人，《生物聚合物(Biopolymers)》，22：547-556
(1983)、聚(甲基丙烯酸2-羟基乙基酯)(郎格尔(Langer)等人，《生物医学材料研究杂志
(J.Biomed.Mater.Res.)》，15：167-277，(1981)；郎格尔等人，《化学技术(Chem.Tech.)》，
12：98-105(1982))、乙烯乙酸乙烯酯(郎格尔等人，同上)或聚-D(-)-3-羟基丁酸(EP 133,
988)。持续释放型组合物还包括可通过所属领域中已知的若干方法中的任一种制备的脂质
体。参见例如爱普斯坦(Eppstein)等人，《美国科学院院报》，82：3688(1985)；EP 36,676；EP
88,046；EP 143,949。
[0140] 待用于活体内施用的医药组合物典型地必须为无菌的。此可通过无菌过滤膜过滤来完成。在冻干组合物的情况下，可在冻干和复原之前或之后使用此方法进行灭菌。肠胃外
施用的组合物可以冻干形式储存或储存于溶液中。另外，肠胃外组合物通常置放于具有无
菌接取孔的容器中，例如具有可由皮下注射针刺穿的塞子的静脉内溶液袋或小瓶。
施用的组合物可以冻干形式储存或储存于溶液中。另外，肠胃外组合物通常置放于具有无
菌接取孔的容器中，例如具有可由皮下注射针刺穿的塞子的静脉内溶液袋或小瓶。
[0141] 一旦医药组合物已配制，即可将其以溶液、悬浮液、凝胶、乳液、固体或脱水或冻干粉末形式储存于无菌小瓶中。这些配制物可以即用形式或需要在施用前复原的形式(例如冻干形式)储存。
[0142] 在一个特定实施例中，提供用于产生依剂量投药单元的试剂盒。试剂盒可各含有具有干燥蛋白质的第一容器和具有含水配制物的第二容器。本发明的范畴内还包括含有单
室和多室预填充注射器(例如液体注射器和冷冻干燥物注射器)的试剂盒。
室和多室预填充注射器(例如液体注射器和冷冻干燥物注射器)的试剂盒。
[0143] 治疗上使用的医药组合物的有效量将根据例如治疗情形和目标而定。所属领域的技术人员应了解，适用于治疗的剂量水平将部分地根据以下而变化：所递送的分子、所用多
肽所针对的适应症、投药途径和患者的体型(体重、体表面或器官大小)和状况(年龄和总体
健康状况)。因此，临床医师可滴定剂量且修改投药途径以获得最佳治疗作用。典型剂量可
在约0.1mg/kg至高达约100mg/kg或超过100mg/kg的范围内，此视上述因素而定。多肽组合
物优选可静脉内(IV)注射或施用。视特定配制物的半衰期和清除速率而定，长效医药组合
物可每三至四天、每周或每两周施用。给药频率将视所用配制物中的多肽的药物动力学参
数而定。典型地，施用组合物直至达到达成所需作用的剂量。组合物因此可随时间以单次剂
量或以多次剂量(浓度/剂量相同或不同)施用，或以连续输注形式施用。通常对适当剂量作
出进一步改进。适当剂量可经由使用适当的剂量反应数据来确定。
肽所针对的适应症、投药途径和患者的体型(体重、体表面或器官大小)和状况(年龄和总体
健康状况)。因此，临床医师可滴定剂量且修改投药途径以获得最佳治疗作用。典型剂量可
在约0.1mg/kg至高达约100mg/kg或超过100mg/kg的范围内，此视上述因素而定。多肽组合
物优选可静脉内(IV)注射或施用。视特定配制物的半衰期和清除速率而定，长效医药组合
物可每三至四天、每周或每两周施用。给药频率将视所用配制物中的多肽的药物动力学参
数而定。典型地，施用组合物直至达到达成所需作用的剂量。组合物因此可随时间以单次剂
量或以多次剂量(浓度/剂量相同或不同)施用，或以连续输注形式施用。通常对适当剂量作
出进一步改进。适当剂量可经由使用适当的剂量反应数据来确定。
[0144] 本文所述的蛋白质和多肽的使用剂量可为0.1-10、0.1-5、0.25-5、0.25-3、1-3、0.1、0.2、0.25、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.75、0.8、0.9、1、2、3、4、5mg/kg或更高(包括这些值)。在一些方面中，各剂量可每小于1-10、2-8、2-5、1-4、1、1、2、3、4、5、6、7、8周或更长(包括这些值)施用。在一些方面中，各剂量可每小于1-10、2-8、2-5、1-4、1、1、2、3、4、5、6、7天(包括这些值)施用。在一些方面中，各剂量是静脉内施用。
[0145] 医药组合物的投药途径是根据已知方法，例如经口；经由静脉内、腹膜内、脑内(实质内)、脑室内、肌肉内、眼内、动脉内、门静脉内、病灶内途径注射；髓内、鞘内、室内、经皮、皮下或腹膜内；以及鼻内、肠内、局部、舌下、尿道、阴道或直肠方式；通过持续释放系统或通过植入装置。需要时，可通过快速注射或连续输注或通过植入装置施用组合物。或者或另
外，组合物可经由已吸收或囊封所需分子的膜、海绵或另一种适当材料的植入来局部施用。
在使用植入装置的情况下，可将装置植入任何适合的组织或器官内，且所需分子可经由扩
散、定时释放型药团或连续投药来递送。
外，组合物可经由已吸收或囊封所需分子的膜、海绵或另一种适当材料的植入来局部施用。
在使用植入装置的情况下，可将装置植入任何适合的组织或器官内，且所需分子可经由扩
散、定时释放型药团或连续投药来递送。
[0146] 在一些情况下，svActRIIB多肽可通过使用如本文所述的那些方法的方法植入已经基因工程改造的某些细胞来递送，以表达和分泌多肽。这些细胞可为动物或人类细胞，且
可为自体、异质或异种细胞。任选地，细胞可为不朽化细胞。为了减小免疫反应的机率，可将细胞囊封以避免浸润周围组织。囊封材料典型地为生物兼容性、半渗透性聚合物外壳或膜，
其容许多肽产物释放，但防止患者免疫系统或来自周围组织的其它有害因子摧毁所述细
胞。
可为自体、异质或异种细胞。任选地，细胞可为不朽化细胞。为了减小免疫反应的机率，可将细胞囊封以避免浸润周围组织。囊封材料典型地为生物兼容性、半渗透性聚合物外壳或膜，
其容许多肽产物释放，但防止患者免疫系统或来自周围组织的其它有害因子摧毁所述细
胞。
[0147] 还设想活体内svActRIIB基因疗法，其中将编码svActRIIB或svActRIIB衍生物的核酸分子直接引入个体中。举例来说，编码svActRIIB的核酸序列使用或不使用适当递送载
体(如腺相关病毒载体)、经由核酸构筑体的局部注射而引入靶细胞中。替代病毒载体包括
(但不限于)逆转录病毒、腺病毒、单纯性疱疹病毒和乳头状瘤病毒载体。病毒载体的身体内
传递可通过局部注射所需核酸构筑体或含有所需核酸序列的其它适当递送载体、脂质体介
导的传递、直接注射(裸DNA)或微粒轰击(基因枪)来活体内达成。
体(如腺相关病毒载体)、经由核酸构筑体的局部注射而引入靶细胞中。替代病毒载体包括
(但不限于)逆转录病毒、腺病毒、单纯性疱疹病毒和乳头状瘤病毒载体。病毒载体的身体内
传递可通过局部注射所需核酸构筑体或含有所需核酸序列的其它适当递送载体、脂质体介
导的传递、直接注射(裸DNA)或微粒轰击(基因枪)来活体内达成。
[0148] 本发明的组合物可单独或与其它治疗剂组合使用，例如以增强其治疗作用或减少潜在副作用。在一些方面中，阿霉素可组合施用。在一些方面中，阿霉素为脂质体阿霉素。在一些方面中，阿霉素是以40mg/m2给予。在一些方面中，阿霉素是以5-200、10-150、25-100、
30-50、35-45、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140或150mg/m2(包括这些值)给予。
30-50、35-45、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140或150mg/m2(包括这些值)给予。
[0149] 本发明的配制物还可包括配制物中的多肽组合。举例来说，本发明的配制物可包括用于治疗一或多种病状的多肽。本发明的配制物还可包括两种或更多种不同多肽。本发
明配制物中的多种多肽的用途可针对例如相同或不同的适应症。类似地，多种多肽在本发
明的配制物中可用于治疗例如病理性病状与初始疗法所致的一或多种副作用。多种多肽还
可包括于本发明的配制物中以实现不同的医学目的，包括例如同时治疗和监测病理性病状
的进展。多种并行疗法(如上文举例说明的那些疗法)以及所属领域中熟知的其它组合由于
配制物对于一些或全部所提疗法和/或诊断可为足够的而特别适用于患者顺应性。所属领
域的技术人员将了解可根据广泛范围的组合疗法混合的那些多肽。类似地，本发明的配制
物还可联合小分子医药剂和一或多种多肽与一或多种小分子医药剂的组合使用。因此，本
发明提供含有1-10、2-5、1、2、3、4、5或6种或更多种不同多肽的本发明配制物且提供一或多种多肽与一或多种小分子医药剂的组合。
明配制物中的多种多肽的用途可针对例如相同或不同的适应症。类似地，多种多肽在本发
明的配制物中可用于治疗例如病理性病状与初始疗法所致的一或多种副作用。多种多肽还
可包括于本发明的配制物中以实现不同的医学目的，包括例如同时治疗和监测病理性病状
的进展。多种并行疗法(如上文举例说明的那些疗法)以及所属领域中熟知的其它组合由于
配制物对于一些或全部所提疗法和/或诊断可为足够的而特别适用于患者顺应性。所属领
域的技术人员将了解可根据广泛范围的组合疗法混合的那些多肽。类似地，本发明的配制
物还可联合小分子医药剂和一或多种多肽与一或多种小分子医药剂的组合使用。因此，本
发明提供含有1-10、2-5、1、2、3、4、5或6种或更多种不同多肽的本发明配制物且提供一或多种多肽与一或多种小分子医药剂的组合。
[0150] 本发明的配制物还可包括所属领域中熟知的一或多种防腐剂和/或添加剂。类似地，本发明的配制物可进一步配制成多种已知递送配制物中的任一种。举例来说，本发明的
配制物可包括润滑剂、乳化剂、悬浮剂、防腐剂(如甲基苯甲酸盐和丙基羟基苯甲酸盐)、甜
味剂和调味剂。这些任选的组分、其化学和功能特征在所属领域中已熟知。类似地，在投药
之后促进多肽快速、持续或延迟释放的配制物在所属领域中已熟知。本发明的配制物可经
制备而包括所属领域中熟知的这些或其它配制物组分。
配制物可包括润滑剂、乳化剂、悬浮剂、防腐剂(如甲基苯甲酸盐和丙基羟基苯甲酸盐)、甜
味剂和调味剂。这些任选的组分、其化学和功能特征在所属领域中已熟知。类似地，在投药
之后促进多肽快速、持续或延迟释放的配制物在所属领域中已熟知。本发明的配制物可经
制备而包括所属领域中熟知的这些或其它配制物组分。
[0151] 本发明的配制物还可制备成例如除含水液体外的状态。举例来说，制备成冻干配制物。冻干配制物通常含有例如增积剂或结块剂和非晶形稳定剂。
[0152] 一旦本发明的配制物如本文所述制备，则配制物内所含的一或多种多肽的稳定性可使用所属领域中熟知的方法评估。若干这些方法在下文实例中进一步举例说明且包括尺
寸排阻色谱和颗粒计数。多种功能分析(包括例如结合活性、其它生物化学活性和/或生理
学活性)中的任一种可在两个或更多个不同的时间点评估以测定本发明的缓冲配制物中的
多肽的稳定性。
寸排阻色谱和颗粒计数。多种功能分析(包括例如结合活性、其它生物化学活性和/或生理
学活性)中的任一种可在两个或更多个不同的时间点评估以测定本发明的缓冲配制物中的
多肽的稳定性。
[0153] 本发明的配制物通常根据医药标准且使用医药级试剂制备。类似地，本发明的配制物通常使用无菌试剂在无菌制造环境下制备或在制备之后灭菌。无菌可注射溶液可使用
所属领域中熟知的程序制备，包括例如将所需量的一或多种多肽与本文所述的配制物组分
的一或组合合并于本发明的乙酸、谷氨酸或丁二酸缓冲剂或赋形剂中，随后进行灭菌微过
滤。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的特定实施例中，特别适用的制备方法包括例
如真空干燥和冷冻干燥(冻干)，如先前所描述。这些干燥方法将由先前无菌过滤的溶液产
生一或多种多肽与任何其它所需组分的粉末。
所属领域中熟知的程序制备，包括例如将所需量的一或多种多肽与本文所述的配制物组分
的一或组合合并于本发明的乙酸、谷氨酸或丁二酸缓冲剂或赋形剂中，随后进行灭菌微过
滤。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的特定实施例中，特别适用的制备方法包括例
如真空干燥和冷冻干燥(冻干)，如先前所描述。这些干燥方法将由先前无菌过滤的溶液产
生一或多种多肽与任何其它所需组分的粉末。
[0154] 试剂盒
[0155] 本文中还描述试剂盒，其包含含有本文所揭露的蛋白质的小瓶和使用说明书。蛋白质可存在于如本文所述的任何适合医药组合物中，例如适于静脉内输注的液体悬浮液。
或者，蛋白质可呈适于在使用前再悬浮的冻干状态。使用说明书可包括储存说明、患者选
择、剂量、投药方法、使用时间段、临床终点和其类似说明。在一些方面中，说明书包括执行本文所揭露方法的说明。
或者，蛋白质可呈适于在使用前再悬浮的冻干状态。使用说明书可包括储存说明、患者选
择、剂量、投药方法、使用时间段、临床终点和其类似说明。在一些方面中，说明书包括执行本文所揭露方法的说明。
具体实施方式
[0158] 除非另外指明，否则本发明可使用所属领域的技能范围内的蛋白质化学、生物化学、重组DNA技术和药理学的习知方法实施。这些技术充分解释于文献中。参见例如克瑞顿
T.E.(T.E.Creighton)，《蛋白质：结构和分子特性(Proteins：Structures and Molecular Properties)》(W.H.弗里曼公司(W.H.Freeman and Company)，1993)；A.L.莱宁格
(A.L.Lehninger)，《生物化学(Biochemistry)》(沃斯出版公司(Worth Publishers，Inc.)，现行附加版(current addition))；萨姆伯鲁克(Sambrook)等人，《分子克隆：实验室手册
(Molecular Cloning：A Laboratory Manual)》(第2版，1989)；《酶学方法(Methods In
Enzymology)》(S.科罗韦克(S.Colowick)和N.卡普兰(N.Kaplan)编，学术出版社公司
(Academic Press，Inc.))；《雷明顿医药科学》第18版(宾夕法尼亚州依斯顿市(Easton，
Pennsylvania)：马克出版公司，1990)；卡雷(Carey)和森德伯格(Sundberg)，《高级有机化学(Advanced Organic Chemistry)》第3版(普莱伦出版社(Plenum Press))A和B卷(1992)。
T.E.(T.E.Creighton)，《蛋白质：结构和分子特性(Proteins：Structures and Molecular Properties)》(W.H.弗里曼公司(W.H.Freeman and Company)，1993)；A.L.莱宁格
(A.L.Lehninger)，《生物化学(Biochemistry)》(沃斯出版公司(Worth Publishers，Inc.)，现行附加版(current addition))；萨姆伯鲁克(Sambrook)等人，《分子克隆：实验室手册
(Molecular Cloning：A Laboratory Manual)》(第2版，1989)；《酶学方法(Methods In
Enzymology)》(S.科罗韦克(S.Colowick)和N.卡普兰(N.Kaplan)编，学术出版社公司
(Academic Press，Inc.))；《雷明顿医药科学》第18版(宾夕法尼亚州依斯顿市(Easton，
Pennsylvania)：马克出版公司，1990)；卡雷(Carey)和森德伯格(Sundberg)，《高级有机化学(Advanced Organic Chemistry)》第3版(普莱伦出版社(Plenum Press))A和B卷(1992)。
[0159] 实例1：STM 434的表达和提纯。
[0160] 细胞培养方法
[0161] STM 434原料药是由无血清的CS9中国仓鼠卵巢细胞株表达。STM 434的序列显示于SEQ ID NO：10中，其中STM 434为SEQ ID NO：10中所示序列的均二聚体。
[0162] 表达STM 434的主细胞库(MCB)的产生命名为AMG 434 MCB。接种扩增和细胞培养制备是使用不具有动物源原材料的化学成分确定的培养基。细胞培养方法的细节(包括过
程控制)描述如下，其中方法以图形描绘于图1中。某些参数包括通过蛋白质A HPLC、Q-PCR
测定的产物浓度，以便检测污染物MMV DNA、细菌内毒素、霉浆菌、外来病毒，以及总好氧性微生物计数。另外，预先制造两批(批次0010039909和0010039910)，由CMC生物制剂公司
(CMC Biologics)进一步处理为经配制的批量原料药(批次13-0066和13-0067)。
程控制)描述如下，其中方法以图形描绘于图1中。某些参数包括通过蛋白质A HPLC、Q-PCR
测定的产物浓度，以便检测污染物MMV DNA、细菌内毒素、霉浆菌、外来病毒，以及总好氧性微生物计数。另外，预先制造两批(批次0010039909和0010039910)，由CMC生物制剂公司
(CMC Biologics)进一步处理为经配制的批量原料药(批次13-0066和13-0067)。
[0163] 解冻和初始扩增(阶段N-7至N-4)
[0164] 将一个小瓶的AMG 434 MCB解冻，且将内容物转移至含有59±1mL生长培养基IMX 5.0、含有300nM甲胺喋呤(MTX)和100μg/L胰岛素样生长因子1(IGF-1)的250mL振荡烧瓶中，
预温热至36.0±1.0℃。所接种的振荡烧瓶接着在36.0±1.0℃、在5％CO2氛围中、使用通气
帽和搅拌、在155±5转数/分钟(rpm)下培育72±12小时。分析细胞培养物之后，如图1中所
定义，将细胞培养物的一部分接种至500mL振荡烧瓶中的预温热生长培养基中直至目标体
积为120mL和目标密度为4×105个细胞/毫升。振荡烧瓶在如上所述的相同条件下培育72±
12小时。分析细胞培养物之后，将细胞培养物的一部分接种至1L振荡烧瓶中的预温热生长
培养基中直至目标体积为240mL和目标密度为4×105个细胞/毫升，且振荡烧瓶在如上所述
的相同条件下培育72±12小时。
预温热至36.0±1.0℃。所接种的振荡烧瓶接着在36.0±1.0℃、在5％CO2氛围中、使用通气
帽和搅拌、在155±5转数/分钟(rpm)下培育72±12小时。分析细胞培养物之后，如图1中所
定义，将细胞培养物的一部分接种至500mL振荡烧瓶中的预温热生长培养基中直至目标体
积为120mL和目标密度为4×105个细胞/毫升。振荡烧瓶在如上所述的相同条件下培育72±
12小时。分析细胞培养物之后，将细胞培养物的一部分接种至1L振荡烧瓶中的预温热生长
培养基中直至目标体积为240mL和目标密度为4×105个细胞/毫升，且振荡烧瓶在如上所述
的相同条件下培育72±12小时。
[0165] 对1L烧瓶中的细胞培养物进行分析之后，使用此细胞培养物接种两个含有预温热生长培养基的2L振荡烧瓶，各烧瓶的目标体积为600mL和目标密度为4×105个细胞/毫升。
两个振荡烧瓶均使用通气帽和150-160rpm搅拌、在36.0±1.0℃、在5％CO2氛围中培育72±
12小时。2L烧瓶培育完成时，分析各烧瓶中的样品(图1)，随后将两个烧瓶的内容物合并。测量合并池的细胞密度，且接着将合并池接种至10L玻璃转移容器中的预温热生长培养基中
直至5L的目标和4×105个细胞/毫升的目标密度。此培养物在方法的下一步骤之前在90±
5rpm下持续混合，下一步骤的起始时间相距合并时间小于90分钟。
两个振荡烧瓶均使用通气帽和150-160rpm搅拌、在36.0±1.0℃、在5％CO2氛围中培育72±
12小时。2L烧瓶培育完成时，分析各烧瓶中的样品(图1)，随后将两个烧瓶的内容物合并。测量合并池的细胞密度，且接着将合并池接种至10L玻璃转移容器中的预温热生长培养基中
直至5L的目标和4×105个细胞/毫升的目标密度。此培养物在方法的下一步骤之前在90±
5rpm下持续混合，下一步骤的起始时间相距合并时间小于90分钟。
[0166] 中间接种系列(阶段N-3至N-1)
[0167] N-3中间接种系列阶段是在50L Wave生物反应袋(通用医疗(GE Healthcare))中进行。使Wave袋膨胀之后，将合并的5L细胞培养物转移至袋中。在表1中所列的条件下起始
培育。每天牵拉样品且如图1中所述分析。第3天，在评估活细胞密度和存活率百分比(最小
值分别为1.6×106个细胞/毫升和90％)之后，经由Opticap XL03无菌过滤器(密理博
(Millipore))将含有300nM MTX和100μg/L IGF-1的生长培养基IMX 5.0转移至Wave袋中以
达成4×105个细胞/毫升的细胞密度。此块团馈入之后的总细胞培养物体积通常为20-25L。
培育在相同条件(表1)下持续超过3天，每天取样用于分析，如图1中所述。收获之前，预期活细胞密度和存活率分别满足不小于1.6×106个细胞/毫升和90％的准则。
培育。每天牵拉样品且如图1中所述分析。第3天，在评估活细胞密度和存活率百分比(最小
值分别为1.6×106个细胞/毫升和90％)之后，经由Opticap XL03无菌过滤器(密理博
(Millipore))将含有300nM MTX和100μg/L IGF-1的生长培养基IMX 5.0转移至Wave袋中以
达成4×105个细胞/毫升的细胞密度。此块团馈入之后的总细胞培养物体积通常为20-25L。
培育在相同条件(表1)下持续超过3天，每天取样用于分析，如图1中所述。收获之前，预期活细胞密度和存活率分别满足不小于1.6×106个细胞/毫升和90％的准则。
[0168] 表1. 50L Wave生物反应器方法参数
[0170] 第二和第三中间接种系列阶段(N-2和N-1)分别在60L和300L生物反应器中进行。转移45.0±1.0L扩增培养基(含有100μg/L IGF-1且不含有MTX的IMX 5.0)之后，依据表2中
所述的参数设定生物反应器。生物反应器接着接种达成4×105个细胞/毫升的起始细胞密
度所需的体积(在±3％范围内)的最终Wave袋细胞培养物。60L生物反应器的内容物根据表
2中所述的条件培育3天。每天取样用于分析，如图1中所述。在培育期间，自动添加1.0M碳酸钠以控制pH。收获之前，预期活细胞密度和存活率分别满足不小于2.0×106个细胞/毫升和
90％的准则。
所述的参数设定生物反应器。生物反应器接着接种达成4×105个细胞/毫升的起始细胞密
度所需的体积(在±3％范围内)的最终Wave袋细胞培养物。60L生物反应器的内容物根据表
2中所述的条件培育3天。每天取样用于分析，如图1中所述。在培育期间，自动添加1.0M碳酸钠以控制pH。收获之前，预期活细胞密度和存活率分别满足不小于2.0×106个细胞/毫升和
90％的准则。
[0171] 表2. 60L生物反应器方法参数
[0172]参数 设定点 范围
温度 36.0℃ 35.0-37.0℃
搅拌 83rpm 78-88rpm
压力 2.0psig 1.0-3.0psig
pH 7.00 6.90-7.10
溶解氧(DO) 48.0mmHg 28.0-220.0mmHg
温度 36.0℃ 35.0-37.0℃
搅拌 83rpm 78-88rpm
压力 2.0psig 1.0-3.0psig
pH 7.00 6.90-7.10
溶解氧(DO) 48.0mmHg 28.0-220.0mmHg
[0173] 一旦60L生物反应器培育完成，则通过转移245.0±2.0L扩增培养基至生物反应器中且依据表3中所述的参数对其进行设定来制备用于接种的300L生物反应器。生物反应器
接着接种达成4×105个细胞/毫升的起始细胞密度所需的体积(在±3％范围内)的最终60L
生物反应器培养物。300L生物反应器内容物根据表3中所述的条件培育3天。每天取样用于
分析，如图1中所述。在培育期间，自动添加1.0M碳酸钠以控制pH。收获之前，预期活细胞密度和存活率分别满足不小于2.3×106个细胞/毫升和90％的准则。
接着接种达成4×105个细胞/毫升的起始细胞密度所需的体积(在±3％范围内)的最终60L
生物反应器培养物。300L生物反应器内容物根据表3中所述的条件培育3天。每天取样用于
分析，如图1中所述。在培育期间，自动添加1.0M碳酸钠以控制pH。收获之前，预期活细胞密度和存活率分别满足不小于2.3×106个细胞/毫升和90％的准则。
[0174] 表3. 300L生物反应器方法参数
[0175]参数 设定点 范围
温度 36.0℃ 35.0-37.0℃
搅拌 80rpm 75-85rpm
压力 2.0psig 1.0-3.0psig
pH 7.00 6.90-7.10
DO 48.0mmHg 28.0-220.0mmHg
温度 36.0℃ 35.0-37.0℃
搅拌 80rpm 75-85rpm
压力 2.0psig 1.0-3.0psig
pH 7.00 6.90-7.10
DO 48.0mmHg 28.0-220.0mmHg
[0176] 制备型生物反应器
[0177] STM 434的上游处理中的最终制备型生物反应器具有2000L的标称容量。为了起始此制备阶段，将1100.0±5.0L制备型培养基ABM025-004(一种化学上限定的培养基，其包括
定制的组分和表4中所发现的配方)装入生物反应器中。接着依据表5中所定义的参数来设
定生物反应器以准备用于接种。生物反应器接着接种达成5×105个细胞/毫升的起始细胞
密度所需的体积(在±3％范围内)的最终300L生物反应器培养物。2000L生物反应器内容物
根据表5中所述的条件培育11天。在培育期间，自动添加1.0M碳酸钠以控制pH。在制备型生
物反应器运作的第3、6和8天，利用8％的初始培养物制得产生培养基AFM028-001的块团馈
料(表4)。每天将1％聚二甲硅氧烷(100克的量)溶液作为消泡剂添加至生物反应器中。如图
1中所述，每天取样用于分析，包括块团馈入AFM028-001之前和之后的样品。若葡萄糖浓度
下降低于4.0g/L，则添加50％葡萄糖溶液以使得生物反应器中的浓度达成8g/L。此方法步
骤的中间测试描述于表13中。
定制的组分和表4中所发现的配方)装入生物反应器中。接着依据表5中所定义的参数来设
定生物反应器以准备用于接种。生物反应器接着接种达成5×105个细胞/毫升的起始细胞
密度所需的体积(在±3％范围内)的最终300L生物反应器培养物。2000L生物反应器内容物
根据表5中所述的条件培育11天。在培育期间，自动添加1.0M碳酸钠以控制pH。在制备型生
物反应器运作的第3、6和8天，利用8％的初始培养物制得产生培养基AFM028-001的块团馈
料(表4)。每天将1％聚二甲硅氧烷(100克的量)溶液作为消泡剂添加至生物反应器中。如图
1中所述，每天取样用于分析，包括块团馈入AFM028-001之前和之后的样品。若葡萄糖浓度
下降低于4.0g/L，则添加50％葡萄糖溶液以使得生物反应器中的浓度达成8g/L。此方法步
骤的中间测试描述于表13中。
[0178] 表4.制备型生物反应器培养基配方
[0179]
[0180]
[0181] 表5. 2000L制备型生物反应器方法参数
[0182]参数 设定点 范围
温度 36.5℃ 36.0-37.0℃
搅拌 74rpm 69-79rpm
压力 2.0psig 1.0-3.0psig
pH 7.05 7.0-7.1
DO 48.0mmHg 28.0-220.0mmHg
温度 36.5℃ 36.0-37.0℃
搅拌 74rpm 69-79rpm
压力 2.0psig 1.0-3.0psig
pH 7.05 7.0-7.1
DO 48.0mmHg 28.0-220.0mmHg
[0183] 细胞培养收获物澄清和过滤
[0184] 在制备型生物反应器运作结束时，在已取样之后，将生物反应器冷却至10-15℃，压力调节至8.0-12.0psig。输送管线置放于2000L生物反应器与CSC-20盘式堆栈离心机(威
斯法利亚(Westfalia))之间，且输出管线自离心机至离心分离液收集槽。测量生物反应器
内容物的血球容积比，且此值用于测定发射间距值，发射间距值以及如图1中所示的其它参
数包括于离心机的程序设计中。开启生物反应器与离心机之间的管线，且起始离心。一旦完
成离心，则冲洗离心机筒，且将产物排放至具有25mM Tris、100mM氯化钠pH 7.4(经Tris缓
冲的生理盐水；TBS)的离心分离液收集槽中。离心操作参数概述于表6中。
斯法利亚(Westfalia))之间，且输出管线自离心机至离心分离液收集槽。测量生物反应器
内容物的血球容积比，且此值用于测定发射间距值，发射间距值以及如图1中所示的其它参
数包括于离心机的程序设计中。开启生物反应器与离心机之间的管线，且起始离心。一旦完
成离心，则冲洗离心机筒，且将产物排放至具有25mM Tris、100mM氯化钠pH 7.4(经Tris缓
冲的生理盐水；TBS)的离心分离液收集槽中。离心操作参数概述于表6中。
[0185] 表6.收获物离心操作参数
[0186]
[0187]
[0188] 离心操作之后，经由并联的2个过滤器对收获池进行深度过滤。各系列中的第一过滤器为Sartopore 2 0.2μm Maxicap滤芯(赛多利斯(赛多利斯)；1.2m2膜面积)用于灭菌式
深度过滤。第二过滤器为Zeta Plus Maximizer 120ZA膜盒(库诺(Cuno)；1.84m2膜面积)用
于降低核酸含量的目的。过滤器用TBS冲洗之后，离心分离液收集槽的内容物根据表7中所
示的条件、经由过滤器系列抽吸至滤液收集槽中。一旦离心分离液完全转移，则添加220L
TBS至离心分离液收集槽中，随后经由各过滤器系列推入滤液收集槽中。过滤方法是通过推
动空气通过各过滤器系列、将液体收集于滤液收集槽中来完成。过滤结束时，以避免发泡的
方式使滤液池混合。滤液池在2-8℃保持不超过72小时，取样以便根据表13分析。
深度过滤。第二过滤器为Zeta Plus Maximizer 120ZA膜盒(库诺(Cuno)；1.84m2膜面积)用
于降低核酸含量的目的。过滤器用TBS冲洗之后，离心分离液收集槽的内容物根据表7中所
示的条件、经由过滤器系列抽吸至滤液收集槽中。一旦离心分离液完全转移，则添加220L
TBS至离心分离液收集槽中，随后经由各过滤器系列推入滤液收集槽中。过滤方法是通过推
动空气通过各过滤器系列、将液体收集于滤液收集槽中来完成。过滤结束时，以避免发泡的
方式使滤液池混合。滤液池在2-8℃保持不超过72小时，取样以便根据表13分析。
[0189] 表7.深度过滤操作参数
[0190]参数 设定点
流速 ≤12.3LPM
入口压力 ≤30psig
Sartopore过滤器压力差 ≤20psig
Zeta Plus过滤器压力差 ≤20psig
滤液槽搅拌 缓和；收集300L之后开始
空气推送期间的压力差 ≤20psig
滤液池混合 缓和；≥20分钟
流速 ≤12.3LPM
入口压力 ≤30psig
Sartopore过滤器压力差 ≤20psig
Zeta Plus过滤器压力差 ≤20psig
滤液槽搅拌 缓和；收集300L之后开始
空气推送期间的压力差 ≤20psig
滤液池混合 缓和；≥20分钟
[0191] 提纯方法
[0192] STM 434下游提纯方法包括三个管柱色谱步骤：低pH病毒灭活步骤、病毒过滤步骤和使用切向流过滤的最终配制步骤。此方法中的所有步骤均在环境温度下进行，除特别指
明者的外。图2描绘STM 434提纯方法。各细胞培养运作时，进行提纯方法的运作。STM 434原料药的最终配方为10mM磷酸钾、8.8％(w/v)蔗糖、0.006％(w/v)聚山梨醇酯20(pH 6.7)，靶
蛋白浓度为70mg/mL。提纯方法包括使用两种模型病毒(xMuLV和MMV)的两种稳定正交方法
用于病毒清除。
明者的外。图2描绘STM 434提纯方法。各细胞培养运作时，进行提纯方法的运作。STM 434原料药的最终配方为10mM磷酸钾、8.8％(w/v)蔗糖、0.006％(w/v)聚山梨醇酯20(pH 6.7)，靶
蛋白浓度为70mg/mL。提纯方法包括使用两种模型病毒(xMuLV和MMV)的两种稳定正交方法
用于病毒清除。
[0193] 蛋白质A色谱
[0194] 蛋白质A色谱经由蛋白质A对Fc域的亲和力而用于捕捉抗体和Fc融合蛋白，如STM 434。STM 434提纯方法系使用MabSelect SuRe蛋白质A树脂(通用医疗)。除潜在病毒的外，
蛋白质A亲和提纯步骤使宿主细胞蛋白质和DNA大幅度减少。蛋白质A色谱步骤的操作参数
描述于表8中。在两次cGMP提纯运作中，使用树脂体积为39.3L的管柱。根据20g/L负载密度，蛋白质A步骤循环运作，循环数目和各循环中所负载的澄清细胞培养收获物的体积是依据
两个生物反应器运作中的每一个的最终澄清收获物中的STM 434的总质量来测定。
蛋白质A亲和提纯步骤使宿主细胞蛋白质和DNA大幅度减少。蛋白质A色谱步骤的操作参数
描述于表8中。在两次cGMP提纯运作中，使用树脂体积为39.3L的管柱。根据20g/L负载密度，蛋白质A步骤循环运作，循环数目和各循环中所负载的澄清细胞培养收获物的体积是依据
两个生物反应器运作中的每一个的最终澄清收获物中的STM 434的总质量来测定。
[0195] 通过平衡缓冲液(TBS)冲洗来制备用于处理的蛋白质A管柱。澄清细胞培养收获物的第一块团加载至管柱上，随后用最少80L的平衡缓冲液洗涤管柱。管柱接着用最少160L
25mM Tris、500mM氯化钙pH 7.5洗涤。引入此步骤，以使得宿主细胞DNA得到额外的清除。管柱接着用最少120L平衡缓冲液洗涤以除去任何残余氯化钙。接着使用100mM乙酸钠pH 3.6
自管柱溶离STM 434。基于管柱排出物的吸光度的收集标准提供于表8中。溶离合并物保存
于在2-8℃维持的储槽中。溶离步骤之后，用最少120L的100mM磷酸将管柱洗净。重复此循环
直至所有的澄清细胞培养收获物耗尽。完成最后循环之后，管柱用最少40L的平衡缓冲液冲
洗，随后用最少120L的300mM氢氧化钠冲洗以使树脂再生。运作间期，管柱于2％苯甲醇、
50mM柠檬酸盐pH 5.0中储存。经由此单元操作收集多个样品，如表13中所述。
25mM Tris、500mM氯化钙pH 7.5洗涤。引入此步骤，以使得宿主细胞DNA得到额外的清除。管柱接着用最少120L平衡缓冲液洗涤以除去任何残余氯化钙。接着使用100mM乙酸钠pH 3.6
自管柱溶离STM 434。基于管柱排出物的吸光度的收集标准提供于表8中。溶离合并物保存
于在2-8℃维持的储槽中。溶离步骤之后，用最少120L的100mM磷酸将管柱洗净。重复此循环
直至所有的澄清细胞培养收获物耗尽。完成最后循环之后，管柱用最少40L的平衡缓冲液冲
洗，随后用最少120L的300mM氢氧化钠冲洗以使树脂再生。运作间期，管柱于2％苯甲醇、
50mM柠檬酸盐pH 5.0中储存。经由此单元操作收集多个样品，如表13中所述。
[0196] 表8.蛋白质A色谱操作参数
[0197]参数 设定点
床层高度 25±2cm
最大负载密度 20.0g STM 434/L树脂
流速 ≤6.6LPM(目标：250cm/hr)
床层高度 25±2cm
最大负载密度 20.0g STM 434/L树脂
流速 ≤6.6LPM(目标：250cm/hr)
[0198] 低pH病毒灭活
[0199] 经由使用低pH对合并的蛋白质A合并物进行病毒灭活。使合并物达成20±2℃的温度，随后通过缓慢添加10％(v/v)乙酸来将其调节至pH 3.6±0.1。经滴定的合并物在低pH
下保持60-90分钟。灭活期之后，通过缓慢添加2.0M Tris碱而将合并物调节至pH 5.0±
0.1。
下保持60-90分钟。灭活期之后，通过缓慢添加2.0M Tris碱而将合并物调节至pH 5.0±
0.1。
[0200] 接着使病毒灭活合并物通过包括三种不同类型的过滤器的过滤器系列。第一过滤器为Millistak+HC Pod(密理博；1.1m2薄膜面积)，其除去可在酸处理期间形成的颗粒。系
列中的第二过滤器为Sartobind Q(赛多利斯；1.98m2薄膜面积)，其中并联排列有三个30时
膜盒。此离子交换器用以进一步减少核酸和其它带负电的杂质。最后过滤器为Express SHC
Opticap XL 10 0.5μm/0.2μm膜盒(密理博；049m2薄膜面积)。过滤是在不超过6.6公升/分
钟的流速下进行。经过滤的病毒灭活合并物(FVIP)收集于储槽中。当预过滤病毒灭活合并
物靠近其保存容器的底部时，用最少40L的50mM乙酸钠、70mM氯化钠pH 5.0将剩余部分溶离
至FVIP收集槽中。经由此单元操作收集多个FVIP样品，如表13中所述。
列中的第二过滤器为Sartobind Q(赛多利斯；1.98m2薄膜面积)，其中并联排列有三个30时
膜盒。此离子交换器用以进一步减少核酸和其它带负电的杂质。最后过滤器为Express SHC
Opticap XL 10 0.5μm/0.2μm膜盒(密理博；049m2薄膜面积)。过滤是在不超过6.6公升/分
钟的流速下进行。经过滤的病毒灭活合并物(FVIP)收集于储槽中。当预过滤病毒灭活合并
物靠近其保存容器的底部时，用最少40L的50mM乙酸钠、70mM氯化钠pH 5.0将剩余部分溶离
至FVIP收集槽中。经由此单元操作收集多个FVIP样品，如表13中所述。
[0201] 在最初的两次cGMP运作中，FVIP(称为原料药中间物(DSI))储存于无菌的20L Flexboy袋(赛多利斯)中，且在-30℃将其保存。将第一批DSI(批号0010039909)的一部分储
存于聚碳酸酯瓶中且在-30℃储存，充当评估长期储存对产物质量的潜在影响的稳定性样
品。24个月和35个月稳定性研究的结果指示，在-30℃储存35个月的DSI的质量在整个储存
期得以保持，且DSI可用于评价经由Demo DS批次制造的cGMP原料药的适用性。
存于聚碳酸酯瓶中且在-30℃储存，充当评估长期储存对产物质量的潜在影响的稳定性样
品。24个月和35个月稳定性研究的结果指示，在-30℃储存35个月的DSI的质量在整个储存
期得以保持，且DSI可用于评价经由Demo DS批次制造的cGMP原料药的适用性。
[0202] 阳离子交换色谱
[0203] 使用阳离子交换色谱(CEX)进一步处理STM 434 DSI；此步骤是使用EMD Fractogel SO3树脂(默克(Merck))、以流过方式进行。除其它潜在杂质的外，开发此步骤是
用于减少宿主细胞DNA和蛋白质，且还显示能够增加STM 434的较高度唾液酸化形式的量。
CEX步骤的操作参数描述于表9中。在两次cGMP提纯运作中，使用堆积树脂高度为21.5cm、对
应管柱体积为33.6L的管柱。根据75-125g/L的负载密度范围，循环运作CEX步骤。
用于减少宿主细胞DNA和蛋白质，且还显示能够增加STM 434的较高度唾液酸化形式的量。
CEX步骤的操作参数描述于表9中。在两次cGMP提纯运作中，使用堆积树脂高度为21.5cm、对
应管柱体积为33.6L的管柱。根据75-125g/L的负载密度范围，循环运作CEX步骤。
[0204] 启动色谱操作之前，冷冻的STM 434 DSI在2-8℃静态地解冻4-6天，随后在环境温度下储存整夜。如下制备供使用的CEX管柱：首先使最少三个管柱体积(CV)的50mM乙酸钠、
500mM氯化钠pH 5.0流过，随后使最少三个CV的50mM乙酸钠、70mM氯化钠pH 5.0流过。接着
将解冻的STM 434 DSI加载至管柱上。在两次cGMP提纯运作中，将总体积不同的STM 434
DSI加载至CEX管柱上，各批次来自不同的上游程序运作。第一次运作中的STM 434 DSI批次
0010039909的总体积为260.6L(22 Flexboys)，STM 434总质量为2907克。第二次运作中的
STM 434 DSI批次0010039910的总体积为294L(25 Flexboys)，STM 434总质量为3376克。
500mM氯化钠pH 5.0流过，随后使最少三个CV的50mM乙酸钠、70mM氯化钠pH 5.0流过。接着
将解冻的STM 434 DSI加载至管柱上。在两次cGMP提纯运作中，将总体积不同的STM 434
DSI加载至CEX管柱上，各批次来自不同的上游程序运作。第一次运作中的STM 434 DSI批次
0010039909的总体积为260.6L(22 Flexboys)，STM 434总质量为2907克。第二次运作中的
STM 434 DSI批次0010039910的总体积为294L(25 Flexboys)，STM 434总质量为3376克。
[0205] 当UV吸光度在280nm达到0.50±0.1OD时，通过切换通过无菌过滤器流向无菌收集袋的溶离液流速来开始收集含有产物的溶离液。将所有DSI加载至管柱上之后，接着用50mM
乙酸钠pH 5.0洗涤CEX管柱。持续收集含有产物的溶离液(CEX合并物)直至280nm下的UV吸
光度达到0.50±0.1OD。切换回至50mM乙酸钠、500mM氯化钠pH 5.0之前，使最少三个CV的洗
涤缓冲液流过管柱以洗净管柱，随后使用最少三个CV的0.5N氢氧化钠对管柱进行卫生处
理，随后使用最少三个CV的0.1N氢氧化钠用于储存管柱。对CEX合并物进行无菌取样用于中
间测试，如表13中所述，且在环境温度下保存整夜。
乙酸钠pH 5.0洗涤CEX管柱。持续收集含有产物的溶离液(CEX合并物)直至280nm下的UV吸
光度达到0.50±0.1OD。切换回至50mM乙酸钠、500mM氯化钠pH 5.0之前，使最少三个CV的洗
涤缓冲液流过管柱以洗净管柱，随后使用最少三个CV的0.5N氢氧化钠对管柱进行卫生处
理，随后使用最少三个CV的0.1N氢氧化钠用于储存管柱。对CEX合并物进行无菌取样用于中
间测试，如表13中所述，且在环境温度下保存整夜。
[0206] 表9.阳离子交换色谱操作参数
[0207]参数 目标范围
床层高度 20±2cm
负载密度 75-125g STM 434/L树脂
流速 ≤4.7LPM(目标：250cm/hr)
加载前pH pH 4.8-5.2，17-25℃
加载前电导率 9-11mS/cm
床层高度 20±2cm
负载密度 75-125g STM 434/L树脂
流速 ≤4.7LPM(目标：250cm/hr)
加载前pH pH 4.8-5.2，17-25℃
加载前电导率 9-11mS/cm
[0208] 疏水性相互作用色谱
[0209] 对STM 434 CEX合并物进行疏水性相互作用色谱(HIC)；此步骤是使用苯基琼脂糖FF High Sub树脂(通用医疗)、以流过方式进行。开发此步骤用于减少产物聚集物和其它潜
在的工艺杂质。HIC步骤的操作参数描述于表10中。在两次cGMP提纯运作中，使用堆积树脂
高度为27.0cm、对应管柱体积为42.2L的管柱。根据50g/L的最大负荷密度，HIC步骤是以每
批两个循环进行。
在的工艺杂质。HIC步骤的操作参数描述于表10中。在两次cGMP提纯运作中，使用堆积树脂
高度为27.0cm、对应管柱体积为42.2L的管柱。根据50g/L的最大负荷密度，HIC步骤是以每
批两个循环进行。
[0210] 通过用由750mM硫酸钠、250mM乙酸钠、69.5mM Tris碱pH 10.5组成的稀释缓冲液调节合并物来制备用于HIC步骤的CEX合并物。调节比率为每四份CEX合并物一份稀释缓冲
液。将经调节的CEX合并物混合的同时，通过使最少三个CV的150mM硫酸钠、50mM乙酸钠pH
5.5流过来使HIC管柱平衡。一旦满足管柱排出物的初始pH和电导率(如表10中所注明)，则
将经调节的CEX合并物(HIC负载)的一半加载至管柱上。当280nm下的UV吸光度达到0.2±
0.1OD时，通过切换流向收集袋的溶离液流速来开始收集含有产物的溶离液(HIC合并物)。
将全部HIC负载加载至管柱上之后，接着用150mM硫酸钠、50mM乙酸钠pH 5.5洗涤HIC管柱。
继续收集HIC合并物直至280nm下的UV吸光度达到1.50±0.1OD，此时将排出模式切换回为
废弃物收集。抽吸最少三个CV的洗涤缓冲液通过管柱，随后抽吸最少三个CV的0.5N氢氧化
钠以洗净管柱。接着用最少三个CV的WFI洗涤管柱以完成第一循环。在再生步骤期间，将第
一循环HIC合并物混合以确保均一性且接着经由无菌过滤器转移至无菌生物处理袋中。
液。将经调节的CEX合并物混合的同时，通过使最少三个CV的150mM硫酸钠、50mM乙酸钠pH
5.5流过来使HIC管柱平衡。一旦满足管柱排出物的初始pH和电导率(如表10中所注明)，则
将经调节的CEX合并物(HIC负载)的一半加载至管柱上。当280nm下的UV吸光度达到0.2±
0.1OD时，通过切换流向收集袋的溶离液流速来开始收集含有产物的溶离液(HIC合并物)。
将全部HIC负载加载至管柱上之后，接着用150mM硫酸钠、50mM乙酸钠pH 5.5洗涤HIC管柱。
继续收集HIC合并物直至280nm下的UV吸光度达到1.50±0.1OD，此时将排出模式切换回为
废弃物收集。抽吸最少三个CV的洗涤缓冲液通过管柱，随后抽吸最少三个CV的0.5N氢氧化
钠以洗净管柱。接着用最少三个CV的WFI洗涤管柱以完成第一循环。在再生步骤期间，将第
一循环HIC合并物混合以确保均一性且接着经由无菌过滤器转移至无菌生物处理袋中。
[0211] WFI管柱洗涤一经完成，则重复HIC平衡程序，随后对HIC负载的剩余一半进行HIC加工，如上文所述。将第二循环HIC合并物混合且接着经由无菌过滤器转移至容纳第一循环
HIC合并物的生物处理袋中。合并的HIC合并物在环境温度下保持以便储存整夜。0.5N氢氧
化钠洗净管柱之后，通过抽吸最少三个CV通过管柱而将HIC管柱储存于0.1N氢氧化钠中。如
表13中所述，收集多个样品用于中间测试。
HIC合并物的生物处理袋中。合并的HIC合并物在环境温度下保持以便储存整夜。0.5N氢氧
化钠洗净管柱之后，通过抽吸最少三个CV通过管柱而将HIC管柱储存于0.1N氢氧化钠中。如
表13中所述，收集多个样品用于中间测试。
[0212] 表10.疏水性相互作用色谱操作参数
[0213]
[0214]
[0215] 病毒过滤
[0216] 合并的HIC合并物经由Planova 20N过滤器(旭化成生物处理公司(Asahi Kasei Bioprocess)；4.0m2薄膜面积)、以正交病毒减少步骤过滤。在处理含有产物的合并物之前，使用13.5-14.0psig的入口压力对过滤器进行泄漏测试。通过泄漏测试后，将0.2μm
Sartopore 2膜盒(赛多利斯；0.2m2薄膜面积)安装于病毒过滤器上游，且此系统根据表11
中所列的参数、通过用40kg±2kg 150mM硫酸钠、50mM乙酸钠pH 5.5冲洗来平衡。混合且取
样之后，以12±2psig的目标压力抽吸合并的HIC合并物通过病毒过滤器。经由使过滤器系
列直接连接至无菌生物处理袋来收集病毒滤液。一旦合并的HIC合并物过滤完成，则使用不
少于16kg的150mM硫酸钠、50mM乙酸钠pH 5.5自过滤器和输送管线中溶离残余产物。运作完
成之后，对0.2μm过滤器进行完整性测试(使用泡点测试)，且病毒过滤器用最少16L的0.25N
氢氧化钠、0.5％(v/v)Triton X-100、随后用最少32L的WFI来冲洗。这些冲洗之后，对病毒
过滤器进行金粒子测试，以确保孔径分布，随后进行使用后泄漏测试。将病毒滤液转移至在
无再循环空气的设备以及专用空气操纵单元中具有最高正压力的后病毒套件中，且在环境
温度下保持。如表13中所述，收集用于中间测试的样品。
Sartopore 2膜盒(赛多利斯；0.2m2薄膜面积)安装于病毒过滤器上游，且此系统根据表11
中所列的参数、通过用40kg±2kg 150mM硫酸钠、50mM乙酸钠pH 5.5冲洗来平衡。混合且取
样之后，以12±2psig的目标压力抽吸合并的HIC合并物通过病毒过滤器。经由使过滤器系
列直接连接至无菌生物处理袋来收集病毒滤液。一旦合并的HIC合并物过滤完成，则使用不
少于16kg的150mM硫酸钠、50mM乙酸钠pH 5.5自过滤器和输送管线中溶离残余产物。运作完
成之后，对0.2μm过滤器进行完整性测试(使用泡点测试)，且病毒过滤器用最少16L的0.25N
氢氧化钠、0.5％(v/v)Triton X-100、随后用最少32L的WFI来冲洗。这些冲洗之后，对病毒
过滤器进行金粒子测试，以确保孔径分布，随后进行使用后泄漏测试。将病毒滤液转移至在
无再循环空气的设备以及专用空气操纵单元中具有最高正压力的后病毒套件中，且在环境
温度下保持。如表13中所述，收集用于中间测试的样品。
[0217] 表11.病毒过滤操作参数
[0218]参数 设定点
使用前泄漏测试(病毒过滤器) 13.5-14.0psig
操作压力 12±2psig
过滤器负载极限 ≤325L/m2
平衡pH pH 5.4-5.6，17-25℃
平衡电导率 23-27mS/cm
使用后完整性测试(0.2μm过滤器) WFI泡点≥46psig
使用后泄漏测试(病毒过滤器) 13.5-14.0psig
使用前泄漏测试(病毒过滤器) 13.5-14.0psig
操作压力 12±2psig
过滤器负载极限 ≤325L/m2
平衡pH pH 5.4-5.6，17-25℃
平衡电导率 23-27mS/cm
使用后完整性测试(0.2μm过滤器) WFI泡点≥46psig
使用后泄漏测试(病毒过滤器) 13.5-14.0psig
[0219] 通过切向流过滤进行的超滤/透滤
[0220] 经由使用切向流过滤(TFF)而对STM 434病毒滤液进行超滤(UF)和透滤(DF)以相对于原料药的最终配制物来达成原料药的缓冲-交换和浓缩。使用两种关键溶液来获得经
配制的批量原料药。这些溶液为：(1)10mM磷酸钾、8.8％(w/v)蔗糖，pH 6.7，和(2)1％(w/v)Tween-20(聚山梨醇酯20)。这些溶液是依需制备。
配制的批量原料药。这些溶液为：(1)10mM磷酸钾、8.8％(w/v)蔗糖，pH 6.7，和(2)1％(w/v)Tween-20(聚山梨醇酯20)。这些溶液是依需制备。
[0221] 在TFF步骤中，根据400±50g/m2的目标负载，使用四个Pellicon 3 Ultracel TFF薄膜(密理博；10kDa标称分子量限值；各1.14m2薄膜面积)处理循环中的全部病毒滤液。新
薄膜用WFI冲洗直至滞留物电导率低于其设定点，如表12中所述，随后用0.5N氢氧化钠冲
洗，直至渗透物冲洗体积达到40L的最小值。初始薄膜冲洗之后，且在经由所用薄膜的TFF处
理开始时，用WFI自系统冲洗掉碱直至滞留物和渗透物电导率低于其设定点(表12)。执行过
滤器完整性测试(使用标准化水渗透性测试)之后，通过抽吸最少40L的0.5N氢氧化钠通过
系统来进行消毒，其中消毒溶液在系统中保持1-24小时。消毒之后，TFF系统再次用WFI冲
洗，直至滞留物和渗透物电导率低于其设定点(表12)，且滞留物冲洗体积达到40L的最小
值。
薄膜用WFI冲洗直至滞留物电导率低于其设定点，如表12中所述，随后用0.5N氢氧化钠冲
洗，直至渗透物冲洗体积达到40L的最小值。初始薄膜冲洗之后，且在经由所用薄膜的TFF处
理开始时，用WFI自系统冲洗掉碱直至滞留物和渗透物电导率低于其设定点(表12)。执行过
滤器完整性测试(使用标准化水渗透性测试)之后，通过抽吸最少40L的0.5N氢氧化钠通过
系统来进行消毒，其中消毒溶液在系统中保持1-24小时。消毒之后，TFF系统再次用WFI冲
洗，直至滞留物和渗透物电导率低于其设定点(表12)，且滞留物冲洗体积达到40L的最小
值。
[0222] 为了起始STM 434病毒滤液处理，系统用10mM磷酸钾、8.8％(w/v)蔗糖pH 6.7平衡。一旦滞留物和渗透物pH达到pH 6.5-6.9的目标范围(其中渗透物冲洗体积不小于20L)，
则平衡完成。混合病毒滤液且自滞留物容器的上部和下部取样以测量蛋白质浓度，确保完
全混合且蛋白质/表面积比率满足其目标(表12)。接着通过UF起始蛋白质浓缩，其中调节馈
料流速以达成20±5psig的跨膜压力。当达到对应于60g/L蛋白质浓度的滞留物体积时，自
滞留物容器的上部和下部获取滞留物样品以确认蛋白质浓度。滞留物接着相对于10个透滤
体积的10mM磷酸钾、8.8％(w/v)蔗糖(pH 6.7)进行透滤。透滤完成之后，恢复超滤以使滞留
物浓度达成105g/L的目标值(根据达成此浓度的滞留物体积)。将TFF系统的滞留物一侧排
入滞留物容器中之后，系统用5L 10mM磷酸钾、8.8％(w/v)蔗糖(pH 6.7)冲洗，且添加冲洗
液至滞留物容器中。混合10-15分钟之后，自滞留物的上部和下部取样用于测量蛋白质浓
度，确保充分混合和产物在透滤步骤期间的浓缩。滞留物视需要进一步用10mM磷酸钾、
8.8％(w/v)蔗糖(pH 6.7)稀释，以使最终浓度达成70.0±3.5g/L。最终TFF合并物在最后配
制且批量填充之前，无菌过滤至生物处理袋中储存。如表13中所述，收集滞留物样品用于中
间测试。
则平衡完成。混合病毒滤液且自滞留物容器的上部和下部取样以测量蛋白质浓度，确保完
全混合且蛋白质/表面积比率满足其目标(表12)。接着通过UF起始蛋白质浓缩，其中调节馈
料流速以达成20±5psig的跨膜压力。当达到对应于60g/L蛋白质浓度的滞留物体积时，自
滞留物容器的上部和下部获取滞留物样品以确认蛋白质浓度。滞留物接着相对于10个透滤
体积的10mM磷酸钾、8.8％(w/v)蔗糖(pH 6.7)进行透滤。透滤完成之后，恢复超滤以使滞留
物浓度达成105g/L的目标值(根据达成此浓度的滞留物体积)。将TFF系统的滞留物一侧排
入滞留物容器中之后，系统用5L 10mM磷酸钾、8.8％(w/v)蔗糖(pH 6.7)冲洗，且添加冲洗
液至滞留物容器中。混合10-15分钟之后，自滞留物的上部和下部取样用于测量蛋白质浓
度，确保充分混合和产物在透滤步骤期间的浓缩。滞留物视需要进一步用10mM磷酸钾、
8.8％(w/v)蔗糖(pH 6.7)稀释，以使最终浓度达成70.0±3.5g/L。最终TFF合并物在最后配
制且批量填充之前，无菌过滤至生物处理袋中储存。如表13中所述，收集滞留物样品用于中
间测试。
[0223] 表12.切向流过滤操作参数
[0224]
[0225] 原料药的最终配制和填充
[0226] 制备最终配制的STM 434原料药且在TFF步骤之后填充。向TFF合并物中添加足够体积的1％(w/v)聚山梨醇酯20溶液，以使得最终聚山梨醇酯20浓度为0.006％±0.003％
(w/v)。添加表面活性剂之后，将批量原料药混合10-15分钟。将填充套件中的层状气流罩，
且配置填充设备，包括Opticap XL5 0.22μm过滤器膜盒(密理博；0.35m2薄膜面积)。将最终配制的原料药过滤之前，过滤器用30±1L的STM 434配制缓冲液(10mM磷酸钾、8.8％[w/v]
蔗糖、0.006％[w/v]聚山梨醇酯20，pH 6.7)冲洗，以使聚山梨醇酯20浸透薄膜且避免其自
所配制的原料药中除去。用配制缓冲液冲洗之后，用340-360g所配制的原料药冲洗过滤器，
丢弃冲洗液。剩余的所配制原料药接着过滤至10L聚碳酸酯坛中，直至每个坛5500±500mL
的目标体积。过滤之后，对过滤器进行完整性测试(使用泡点测试)。最后的坛可用超过目标
体积、但通常不超过8L的所配制原料药填充。取样用于中间测试(仅供参考)和批次释放测
试，随后在80in-lb的扭力设定下确保坛封闭。对坛作出标记，且接着在-70℃储存。
(w/v)。添加表面活性剂之后，将批量原料药混合10-15分钟。将填充套件中的层状气流罩，
且配置填充设备，包括Opticap XL5 0.22μm过滤器膜盒(密理博；0.35m2薄膜面积)。将最终配制的原料药过滤之前，过滤器用30±1L的STM 434配制缓冲液(10mM磷酸钾、8.8％[w/v]
蔗糖、0.006％[w/v]聚山梨醇酯20，pH 6.7)冲洗，以使聚山梨醇酯20浸透薄膜且避免其自
所配制的原料药中除去。用配制缓冲液冲洗之后，用340-360g所配制的原料药冲洗过滤器，
丢弃冲洗液。剩余的所配制原料药接着过滤至10L聚碳酸酯坛中，直至每个坛5500±500mL
的目标体积。过滤之后，对过滤器进行完整性测试(使用泡点测试)。最后的坛可用超过目标
体积、但通常不超过8L的所配制原料药填充。取样用于中间测试(仅供参考)和批次释放测
试，随后在80in-lb的扭力设定下确保坛封闭。对坛作出标记，且接着在-70℃储存。
[0227] 在STM 434提纯过程中的中间监测
[0228] 如表13中所述，在提纯过程中收集且评估样品。
[0229]
[0230] CE-SDS＝十二烷基硫酸钠毛细电泳法；CEX＝阳离子交换色谱；CFU＝群落形成单位；CHO＝中国仓鼠卵巢；ELISA＝酶联免疫吸附分析；FVIP＝经过滤的病毒灭活合并物；HCP＝宿主细胞蛋白质；HIC＝疏水性相互作用色谱；icIEF＝成像毛细管等电聚焦；LAL＝鲎变
形细胞溶菌液；Q-PCR＝定量聚合酶链反应；TAMC＝总好氧性微生物计数；TFF＝切向流过
滤；TYMC＝总酵母和霉菌计数
形细胞溶菌液；Q-PCR＝定量聚合酶链反应；TAMC＝总好氧性微生物计数；TFF＝切向流过
滤；TYMC＝总酵母和霉菌计数
[0231] 方法步骤和总产量
[0232] STM 434 cGMP原料药制造运作的个别步骤产率提供于表14中。总体来说，所述方法可再现且为1期临床试验提供足够的材料。
[0233] 表14.STM 434步骤和总产率计算
[0234]
[0235] *Amgen所报道的产率百分比系基于各制造运作中的细胞培养收获物的初始输入量。两次运作的不同归因于不同生物反应器的产率，和Amgen将蛋白质A色谱步骤限于五个
循环、同时维持靶蛋白负载参数的决定。
循环、同时维持靶蛋白负载参数的决定。
[0236] **CMC生物制剂公司所报道的产率百分比是基于DSI的初始输入量，各制造运作的可用体积不同。此章节的表中所报道的DSI浓度值为CMC生物制剂公司所测定的那些值。
[0237] 实例2：制造方法和工艺控制的描述
[0238] 经配制的批量原料药经冷冻装运用于无菌加工成未标记药品，接着装运用于标记、封装和分配至临床地点。各STM 434注射批次包括可供临床试验中使用的最少7000个填
充小瓶。最终药品处理的方法流程图显示于图3中。
充小瓶。最终药品处理的方法流程图显示于图3中。
[0239] 组分制备和设备
[0240] 自玻璃制造商封装中移出小瓶且用热注射用水(WFI)洗涤。经洗涤的小瓶接着置放于经覆盖的不锈钢盘中且在干燥的热灭菌烘箱中去热源。灭菌烘箱空气是经HEPA过滤。
塞子用热WFI洗涤和冲洗，随后在高压釜中灭菌和干燥。所有无菌/去热源组分在使用之前
储存于受控制的环境中。
塞子用热WFI洗涤和冲洗，随后在高压釜中灭菌和干燥。所有无菌/去热源组分在使用之前
储存于受控制的环境中。
[0242] 制造方法
[0243] 来料控制包括身分测试和所配制的批量原料药分析证书的可接受性确认。STM 434原料药在2-8℃静态解冻(不少于7天)且在此温度下保存供进一步处理。将材料移至操
作区域且允许平衡至室温(30-60分钟)。对于典型的批料来说，将各含有5.5L的2个坛汇集
于13L玻璃坛中且以300rpm混合不少于10分钟。收集样品用于生物负荷测试。汇集和混合操
作在根据ISO第7类(先前为FS209E第10,000类)控制的环境区域中进行。接着将含有经合并
的所配制本体溶液的容器转移，准备进行产物过滤灭菌。此汇集的容器连接至经热压处理
的过滤器总成。过滤器总成[管道]还连接至填充缓冲容器。溶液通过膜过滤、经由串联使用
的两个灭菌级过滤器来灭菌，其中孔径等级为0.22μm。将薄膜过滤器灭菌且在使用之前和
之后进行完整性测试(使用泡点测试)。根据书面规格测试样品。
作区域且允许平衡至室温(30-60分钟)。对于典型的批料来说，将各含有5.5L的2个坛汇集
于13L玻璃坛中且以300rpm混合不少于10分钟。收集样品用于生物负荷测试。汇集和混合操
作在根据ISO第7类(先前为FS209E第10,000类)控制的环境区域中进行。接着将含有经合并
的所配制本体溶液的容器转移，准备进行产物过滤灭菌。此汇集的容器连接至经热压处理
的过滤器总成。过滤器总成[管道]还连接至填充缓冲容器。溶液通过膜过滤、经由串联使用
的两个灭菌级过滤器来灭菌，其中孔径等级为0.22μm。将薄膜过滤器灭菌且在使用之前和
之后进行完整性测试(使用泡点测试)。根据书面规格测试样品。
[0244] 含有经合并的所配制无菌本体溶液的填充缓冲容器接着无菌连接至填充器。经合并的所配制无菌本体溶液无菌填充于无菌去热源小瓶中。接着将无菌塞子和密封件置放于
RABS单元内的各小瓶上。填充操作由穿适合实验长衣且经培训的操作员执行。这些操作经
设计、配备和操作，以提供适于无菌产物处理的环境条件。
RABS单元内的各小瓶上。填充操作由穿适合实验长衣且经培训的操作员执行。这些操作经
设计、配备和操作，以提供适于无菌产物处理的环境条件。
[0245] 在填充操作期间进行填充重量检查。将小瓶填充、塞紧且密封之后，对其进行所有检验以确保无外来可见颗粒、沉淀物、可见污染、溢出迹象、小瓶破裂，或不可接受的塞子或密封件。另外，由质量部门对整批小瓶进行统计学取样且检验。
[0246] 此时收集样品小瓶用于QC测试。所有可接受的小瓶在-20±5℃至-70±10℃隔离储存置放。
[0247] 受控制的环境区域维持于经HEPA过滤的空气的正压力下以降低经空气传播的污染的可能性。定期监测过滤器的效能。接近填充室限于与填充操作有关的人员，其已完成无
菌操作方面的必要培训。
菌操作方面的必要培训。
[0248] 在无菌操作(如填充和塞紧)期间，监测ISO第5类环境中的微生物含量和非生命微粒含量。确立有生命污染物与非生命微粒的适当作用和报警级别，以确保填充环境空气和
重要表面的适当质量。
重要表面的适当质量。
[0249] 培养基填充验证
[0250] 依常规间隔时间(6个月)进行模拟填充操作的培养基填充，以另外保证人员、设施和设备的无菌处理能力。根据核准的方案进行培养基填充。
[0251] 用来验证药品制造中所用的特定过滤、填充、塞紧和加盖程序的工艺仿真(培养基填充)数据报括(但不限于)填充室标记符号、容器封闭件类型和尺寸、培养基体积、培养基
类型、所填充的单元数目、填充持续时间和容纳时间段、所培育的单元数目、阳性单元数目、培育参数、培养基填充日期、工艺干预、微生物监测和工艺参数。
类型、所填充的单元数目、填充持续时间和容纳时间段、所培育的单元数目、阳性单元数目、培育参数、培养基填充日期、工艺干预、微生物监测和工艺参数。
[0252] 初始将培养基填充样品小瓶涡旋/倒置以确保TSB已与所有内部表面接触，容器在20℃-25℃竖直培育7天(不少于168个小时)，随后在30-35℃倒置培育另外7天(不少于168
小时)。培育之后，对培养基小瓶的代表性样品进行药典(USP)生长促进测试。培育后生长促
进测试失败的结果为培养基填充运作无效。失败或无效的所有培养基填充运作之后进行研
究。设计合并最坏情形和/或挑战条件的工艺模拟。托承概念适用于最坏情形容器封闭件组
合的定义。最坏情形格式的定义是基于小瓶体积、尺寸、孔口和工艺复杂性(即液体或冷冻
干燥)。由于冻干方法的复杂性较高，因此冷冻干燥方法可为液体方法的代表。每次培养基
填充时进行常规干预。
小时)。培育之后，对培养基小瓶的代表性样品进行药典(USP)生长促进测试。培育后生长促
进测试失败的结果为培养基填充运作无效。失败或无效的所有培养基填充运作之后进行研
究。设计合并最坏情形和/或挑战条件的工艺模拟。托承概念适用于最坏情形容器封闭件组
合的定义。最坏情形格式的定义是基于小瓶体积、尺寸、孔口和工艺复杂性(即液体或冷冻
干燥)。由于冻干方法的复杂性较高，因此冷冻干燥方法可为液体方法的代表。每次培养基
填充时进行常规干预。
[0253] 标记和封装(主要容器)
[0254] 填充/修整操作之后，将STM 434注射小瓶置放于纸板箱中用于中间储存。纸箱经标记而含有产品特定信息和批次特定信息且接着冷冻储存置放。这些小瓶纸箱在-70±10
℃装运，且纸箱中的小瓶在-20±5℃储存。标记操作是在室温套房中进行。将小批量小瓶置
于套房中且在12小时内标记，接着恢复至-20±5℃。通过将外部的残余凝聚物擦掉且接着
贴附标记来备妥用于标记的各小瓶。
℃装运，且纸箱中的小瓶在-20±5℃储存。标记操作是在室温套房中进行。将小批量小瓶置
于套房中且在12小时内标记，接着恢复至-20±5℃。通过将外部的残余凝聚物擦掉且接着
贴附标记来备妥用于标记的各小瓶。
[0255] 检验所印刷的组件以确保内容根据主标记为适当的。检验完成时，释放标记用于初始容器上。标记和封装方法使用核准的书面程序。
[0256] 实例3：STM 434的分批配方
[0257] STM 434注射剂是用70mg/mL STM 434、10mM磷酸钾、8.8％(w/v)蔗糖、0.006％(w/v)聚山梨醇酯20(pH 6.7)配制。各5mL小瓶标称地填充有不少于1.0mL的STM 434原料药。对
于cGMP头两批STM 434注射剂中的每一种来说，自执行药品制造的CMC生物制剂公司接收
11L STM 434原料药。此体积在表15中用于定义每批料中各组分的量。
于cGMP头两批STM 434注射剂中的每一种来说，自执行药品制造的CMC生物制剂公司接收
11L STM 434原料药。此体积在表15中用于定义每批料中各组分的量。
[0258] 表15.STM 434注射剂的组分和典型分批量
[0259]
[0260]
[0261] 实例4：STM 434研究方案。
[0262] 研究目标
[0263] 研究的第一目标为定义患有卵巢癌或其它晚期实体肿瘤的个体对于STM 434作为单一疗法或与脂质体阿霉素化学疗法组合施用的最大耐受剂量(MTD)。
[0264] 第二目标如下：
[0265] ·在无MTD的情况下定义2期建议剂量(RP2D)
[0266] ·在用STM 434治疗期间，利用实验室测试、心电图(ECG)和生命体征评估不良事件(AE)和临床显著变化的发生率
[0267] ·评估抗STM 434抗体形成的发生率
[0268] ·收集用STM 434治疗期间的药物动力学(PK)数据
[0269] ·收集用STM 434治疗期间的ECG数据
[0270] ·收集用STM 434治疗期间的初步抗肿瘤功效数据
[0271] ·评估抗肿瘤功效数据与以下中的每一种之间的关系：血清活化素A、肿瘤INHBA/ACVR2B mRNA含量，以及透明细胞/子宫内膜/颗粒层肿瘤突变状态
[0272] ·收集瘦体质量、脂肪质量、骨矿物质密度(无骨转移的个体)、脂质分布、空腹葡萄糖、空腹胰岛素、恒稳模型评估(HOMA)、血红素A1c(HbA1c)，以及用STM 434治疗期间的6
分钟行走距离
分钟行走距离
[0273] ·收集生物标记(如癌症抗原-125[CA-125]、前列腺特异性抗原[PSA]、碳水化合物抗原19-9[CA 19-9]、癌胚抗原[CEA])、活化素A、卵泡刺激激素(FSH)、雌二醇和睾固酮的基线和治疗时数据
[0274] 研究的探索性目标为评估PK参数与PD参数之间的关系、体重、身体表面积、瘦体质量、脂肪质量、四肢瘦肉质量、骨矿物质密度(无骨转移的个体)、脂质分布、空腹葡萄糖、空腹胰岛素、6分钟行走距离、抗药物抗体形成、生物标记以及ECG数据。
[0275] 研究设计
[0276] 此为患有卵巢癌或晚期实体肿瘤的成人个体的多中心、开放标记、单一组别研究。研究分三个部分进行，如下所述。研究程序的概述显示于表16中。
[0277] 研究的第1部分
[0278] 第1部分为患有晚期实体肿瘤的个体的开放标记、剂量递增研究，其并有3+3设计。5个按计划依序给药组中募集总共15-30位个体，以评价IV STM 434在5种剂量(0.25mg/kg
IV、0.5mg/kg IV、1mg/kg IV、2mg/kg IV和4mg/kg IV)下的安全、耐受性和PK概况。在剂量限制毒性(DLT)评估窗期间，在缺乏安全信号的情况下，依计划的100％剂量增量增加STM
434。若观察到安全信号(≥2个临床上显著的STM 434相关2级AE或1个STM 434相关3级毒
性)，各群组之间的所有进一步剂量递增均以≤50％的剂量增量进行且可研究另一种适当
的剂量水平以避免过度毒性。依序评估各剂量水平，且各剂量组由3-6位个体组成(数目将
视是否观察DLT而定)。
IV、0.5mg/kg IV、1mg/kg IV、2mg/kg IV和4mg/kg IV)下的安全、耐受性和PK概况。在剂量限制毒性(DLT)评估窗期间，在缺乏安全信号的情况下，依计划的100％剂量增量增加STM
434。若观察到安全信号(≥2个临床上显著的STM 434相关2级AE或1个STM 434相关3级毒
性)，各群组之间的所有进一步剂量递增均以≤50％的剂量增量进行且可研究另一种适当
的剂量水平以避免过度毒性。依序评估各剂量水平，且各剂量组由3-6位个体组成(数目将
视是否观察DLT而定)。
[0279] 一个群组相对于下一个群组的剂量递增将由主持者联合研究者确定，且将基于治疗引发的AE、临床实验数据、身体检查结果(包括生命体征)、ECG，和群组内的所有3位个体
已完成28天治疗之后的可用PK数据。若个体在研究治疗的最初28天期间的DLT或STM 434相
关性重度AE(SAE)发生率为＜33％，则将进行剂量递增。
已完成28天治疗之后的可用PK数据。若个体在研究治疗的最初28天期间的DLT或STM 434相
关性重度AE(SAE)发生率为＜33％，则将进行剂量递增。
[0280] 在指定群组中，若3位个体在距离STM 434初始施用的28天期间均未经历DLT，则将进行剂量递增，且募集3位个体加入下一个剂量水平的群组。然而，若观察到≥2个临床上显
著的2级STM 434相关性AE或1个STM 434相关性3级AE，则所有进一步剂量递增将降低至≤
50％剂量增量。若一个群组的3位个体中有1位经历DLT，则在相同的剂量水平下募集3位其
它个体。若一个群组内的6位个体仅有1位在治疗的最初28天期间经历DLT或STM 434相关性
SAE，则可开始募集下一个群组。若观察到DLT，则所有的进一步剂量递增将降低至≤50％剂
量增量。若一个群组内的6位个体中有2位或超过2位在治疗的最初28天期间经历DLT或STM
434相关性SAE，则此剂量将视为毒性剂量。剂量递增可根据出现的毒性、PK或PD数据、依较
低剂量或不太频繁的计划表进行，直至MTD确定。若PK数据观察值低于预测水平，则可探索
每4周高于4mg/kg的剂量。
著的2级STM 434相关性AE或1个STM 434相关性3级AE，则所有进一步剂量递增将降低至≤
50％剂量增量。若一个群组的3位个体中有1位经历DLT，则在相同的剂量水平下募集3位其
它个体。若一个群组内的6位个体仅有1位在治疗的最初28天期间经历DLT或STM 434相关性
SAE，则可开始募集下一个群组。若观察到DLT，则所有的进一步剂量递增将降低至≤50％剂
量增量。若一个群组内的6位个体中有2位或超过2位在治疗的最初28天期间经历DLT或STM
434相关性SAE，则此剂量将视为毒性剂量。剂量递增可根据出现的毒性、PK或PD数据、依较
低剂量或不太频繁的计划表进行，直至MTD确定。若PK数据观察值低于预测水平，则可探索
每4周高于4mg/kg的剂量。
[0281] 研究的第2部分
[0282] 第2部分为开放标记式研究，其经设计以获得患有晚期卵巢/子宫内膜透明细胞、颗粒层和卵巢/输卵管/原发性腹膜浆液性肿瘤的个体的其它安全和探索性功效数据。在研
究的此部分中，募集总共24位个体，分成2组。一组将包括6位患有透明细胞腺癌的个体和6
位患有颗粒层细胞肿瘤的个体；第二组将包括12位患有浆液性肿瘤的个体。所有个体将静
脉内接受RP2D的STM 434。第1部分中的RP2D一经确立，则第2部分中的募集可发生。
究的此部分中，募集总共24位个体，分成2组。一组将包括6位患有透明细胞腺癌的个体和6
位患有颗粒层细胞肿瘤的个体；第二组将包括12位患有浆液性肿瘤的个体。所有个体将静
脉内接受RP2D的STM 434。第1部分中的RP2D一经确立，则第2部分中的募集可发生。
[0283] 研究的第3部分
[0284] 第3部分为STM 434与脂质体阿霉素化学疗法组合用于患有卵巢癌、输卵管癌或原发性腹膜癌的个体的开放标记式剂量递增研究，所述研究并有3+3设计，所述个体已接受基
于铂的化学疗法疗程的先前治疗或不能接受基于铂的化学疗法。第1部分完成且RP2D确立
之后，募集6至12位个体加入第3部分。第2部分和第3部分将同时募集个体。第3部分中的个
体将分成2个剂量组(各3-6位个体)评估(每组个体数目视是否观察DLT而定)。一组将接受
低于RP2D的一种剂量水平的STM 434且第二组将接受RP2D的STM 434；两组将接受40mg/m2
的脂质体阿霉素。
于铂的化学疗法疗程的先前治疗或不能接受基于铂的化学疗法。第1部分完成且RP2D确立
之后，募集6至12位个体加入第3部分。第2部分和第3部分将同时募集个体。第3部分中的个
体将分成2个剂量组(各3-6位个体)评估(每组个体数目视是否观察DLT而定)。一组将接受
低于RP2D的一种剂量水平的STM 434且第二组将接受RP2D的STM 434；两组将接受40mg/m2
的脂质体阿霉素。
[0285] 两组个体在接受STM 434之前将接受脂质体阿霉素的输注。每次施用脂质体阿霉素之前，将评估实验室研究，包括多闸控式撷取(MUGA)扫描。需要时，可根据毒性管理准则
实现40mg/m2至30mg/m2的剂量降低。
实现40mg/m2至30mg/m2的剂量降低。
[0286] 评估STM 434伴随脂质体阿霉素施用时的安全、耐受性和PK概况。首先评估STM 434的较低剂量(即低于RP2D的一种剂量水平)；剂量递增将由主持者联合研究者一起确定
且将基于治疗引发的AE、临床实验室数据、身体检查结果(包括生命体征)、ECG，和群组内的所有3位个体使用针对第1部分概述的3+3设计已完成28天治疗之后的可用PK数据。
且将基于治疗引发的AE、临床实验室数据、身体检查结果(包括生命体征)、ECG，和群组内的所有3位个体使用针对第1部分概述的3+3设计已完成28天治疗之后的可用PK数据。
[0287] 剂量限制毒性
[0288] DLT定义为任何相关的≥3级(根据不良事件的常见术语标准[Common Terminology Criteria for Adverse Events；CTCAE]4.03版)非血液学毒性(排除无关毒
性)，或任何≥4级的血液学毒性持续7天、发热性嗜中性球减少症，或3级血小板减少症伴主
动性出血。
性)，或任何≥4级的血液学毒性持续7天、发热性嗜中性球减少症，或3级血小板减少症伴主
动性出血。
[0289] 当毒性已消退至CTCAE级≤1或基线值时，且若个体尚未经历疾病进展，则希望恢复STM 434疗法的正经历DLT的个体可在研究者的判断下恢复STM 434疗法。
[0290] 最大耐受剂量
[0291] MTD定义为群组个体的DLT发生率＜33％的最高剂量水平。
[0292] 2期建议剂量
[0293] 考虑MTD、PK、药效学生物标记和抗肿瘤反应数据来定义RP2D。
[0294] 随机分组和不知情
[0295] 此为开放标记、非随机、非盲研究。个体以其在研究中合格的次序分配至剂量组。
[0296] 个体选择标准
[0297] 纳入标准
[0298] 若满足所有以下纳入标准，则个体参与此研究视为合格的：
[0299] 1.≥18岁的男性和停经后女性
[0300] 2.组织学确诊为癌症的晚期实体肿瘤
[0301] 3.患有复发性转移性或局部晚期疾病的个体视为可用于其肿瘤的所有标准疗法难治愈或不耐受可用于其肿瘤的所有标准疗法，或患有无标准疗法可供使用的肿瘤的个体
[0302] 4.患有视为铂难治愈/耐药的浆液性卵巢/输卵管/原发性腹膜颗粒层细胞肿瘤或透明细胞肿瘤、定义为先前已经历至少一种基于铂的化学治疗方案(随后无铂间隔期＜12
个月)、在基于铂的治疗期间已进展或在基于铂治疗之后患有持久性疾病的个体为合格的。
定义为因毒性而不能进一步接受铂的不耐受个体为合格的。
个月)、在基于铂的治疗期间已进展或在基于铂治疗之后患有持久性疾病的个体为合格的。
定义为因毒性而不能进一步接受铂的不耐受个体为合格的。
[0303] 5.使用实体肿瘤(RECIST 1.1)标准中的反应评估标准可度量的疾病
[0304] 6.东部肿瘤学合作组织(ECOG)活动状态为0或1
[0305] 7.在无需另一人协助的情况下能够行走至少30米(允许使用辅助装置，如手杖或助行架)
[0306] 8.愿意且能够提供书面知情同意书
[0307] 9.停经后女性必须满足以下中的一或多者：
[0308] a.自发性停经12个月
[0309] b.自发性停经6个月，其中FSH＞40IU/L
[0310] c.手术后双侧卵巢切除，伴随或不伴随子宫切除
[0311] 在研究的第2部分中，必须满足以下额外纳入标准：
[0312] 10.第6组个体必须患有铂难治愈/耐药性/不耐受(如纳入标准#4中所定义)的卵巢/子宫内膜透明细胞癌瘤和卵巢颗粒层细胞肿瘤
[0313] 11.第7组个体必须患有铂难治愈/耐药性/不耐受(如纳入标准#4中所定义)的浆液性卵巢/输卵管/原发性腹膜癌
[0314] 在研究的第3部分中，必须满足以下额外纳入标准：
[0315] 12.第8组和第9组个体必须患有铂难治愈/耐药性/不耐受(如纳入标准#4中所定义)的晚期卵巢/输卵管/原发性腹膜癌
[0316] 排除标准
[0317] 若满足任一以下标准，则个体参与研究将为不合格的：
[0318] 1.同时发生的严重不受控制或未消退医学病状，如感染、限制方案顺应性或使个体暴露于极端风险
[0319] 2.先前抗癌疗法的毒性未消退，如运动或感觉神经病变，其中CTCAE(4.03版)级≥2，秃发症除外
[0320] 3.第1循环的6个月内第1天发生胃肠出血的病史
[0321] 4.存在QTcF＞470msec、遗传性延长QT间隔的病史，或妨碍评估QT间隔的任何心律不整(如束支传导阻滞)
[0322] 5.第1循环的6个月内第1天发生的心肌梗塞、不稳定绞痛，或充血性心脏衰竭(纽约心脏协会)≥II级
[0323] 6.升高的肝功能测试，包括总胆红素＞1.5×正常值上限(ULN；除非个体已有文件证明吉伯氏疾病)、天冬氨酸转胺酶(AST)或丙氨酸转胺酶(ALT)＞3.0×ULN(对于已知有肝
转移的个体来说，AST或ALT＞5×ULN)
转移的个体来说，AST或ALT＞5×ULN)
[0324] 7.肌酐＞1.5×ULN且估计的肌酐清除率＜60mL/min(科克罗夫特-高尔特方程式)
[0325] 8.血红素＜9g/dL；血小板＜100×109/L(在第1循环的4周内第1天不必接受输注)；绝对嗜中性白细胞计数(ANC)＜1.5×109/L(在第1循环的2周内第1天无粒细胞群落刺
激因子支持)
激因子支持)
[0327] 10.第1循环的5个半衰期或4周(以较长者为准)内第1天进行的抗体/生物疗法
[0328] 11.第1循环的8周内第1天进行的大手术或第1循环的4周内第1天进行的小手术
[0329] 12.当前肠阻塞(有肠阻塞病史者为合格的)
[0330] 13.脑转移
[0331] 14.存在腹水或胸膜积水，需要频繁(每周超过1次)的医学介入
[0332] 15.存在门静脉分流装置或广泛肝切除(超过一个区段)的病史
[0333] 16.已知的人类免疫缺乏病毒(HIV)感染
[0334] 17.活动性B型或C型肝炎感染
[0335] 18.第1循环的4周内第1天使用任何研究性产品的先前疗法
[0336] 19.有生育潜力的女性，或具有生育潜力的女性伴侣的男性，不愿意使用高度有效的避孕方法(即导致每年怀孕率小于1％者)(一致地且正确地使用时)，如植入物、可注射
剂、组合的口服避孕药、一些子宫内避孕装置、禁欲，或伴侣输精管结扎。男性在其与女性伴侣参与此研究期间不愿意使用高度有效的避孕措施和/或在经历STM 434治疗的同时和最
后剂量施用之后的3个月期间不愿意节制供精。
剂、组合的口服避孕药、一些子宫内避孕装置、禁欲，或伴侣输精管结扎。男性在其与女性伴侣参与此研究期间不愿意使用高度有效的避孕措施和/或在经历STM 434治疗的同时和最
后剂量施用之后的3个月期间不愿意节制供精。
[0337] 20.正哺乳的女性
[0338] 21.流鼻血病史，需要在第1循环的6个月内第1天进行医学或手术介入(如鼻填塞术)
[0339] 22.中枢神经系统出血病史
[0341] 24.遗传出血性毛细血管扩张症(HHT，奥斯勒-韦伯-任都综合症(Osler-Weber-Rendu syndrome))的病史
[0342] 25.持续需要长期使用阿司匹林(aspirin)或抗血小板药剂(噻氯匹啶(ticlopidine)或克罗匹多(clopidogrel))；若在筛选期间中断阿司匹林/抗血小板药剂，
则清除期必须为≥2周
则清除期必须为≥2周
[0343] 在研究的第3部分中，个体若其满足以下其它排除标准中的任一种，则将为不合格的：
[0344] 26.对阿霉素盐酸盐的习知配制物或脂质体阿霉素的组分的过敏反应
[0345] 27.先前阿霉素盐酸盐的累积剂量＞300mg/m2，或先前表柔比星的累积剂量＞500mg/m2
[0346] 28.在第1循环的30天内的第1天，根据MUGA扫描或超音波心电图(ECHO)，减小的心脏射血分数小于正常值下限
[0347] 个体停药标准
[0348] 个体在完成研究之前可因任一以下原因而停药：
[0349] ·个体同意停药
[0350] ·出现妨碍进一步参与的DLT或其它AE
[0351] ·在30天内经由适当医学管理不能恢复至CTCAE 1级或小于1级的与STM 434和/或脂质体阿霉素相关的持续副作用(仅对于第3部分来说)。若临床上重要的个别毒性(因
STM 434或脂质体阿霉素)持续超过30天而未恢复至CTCAE 1级或小于1级，则个体可中断研
究。
STM 434或脂质体阿霉素)持续超过30天而未恢复至CTCAE 1级或小于1级，则个体可中断研
究。
[0352] ·个体对方案的非顺应性明显
[0353] ·个体选用受禁止的疗法，如使用研究性药剂或装置
[0354] ·临床病状恶化，就研究者的观点来说，需要立即进行特定的医学疗法
[0355] ·主持者较早关闭研究
[0356] 用研究性产物治疗
[0357] 研究药物的描述和操纵
[0358] 配制物
[0359] STM 434配制为旨在静脉内投药的无菌水溶液，其含有70mg/mL STM 434、10mM磷酸钾缓冲液、8.8％(w/v)蔗糖和0.006％(w/v)聚山梨醇酯20，pH 6.7。
[0360] 包装和标记
[0361] 使用13mm氟聚合物塞子和13mm密封件，将经配制的STM 434溶液封装于5mL玻璃瓶中(递送1.0mL使用1.2mL的目标填充体积)。各小瓶旨在用于单一用途。
[0362] 储存和操纵
[0363] STM 434小瓶在非自由结霜冷冻机中、在-20℃(±5℃)的温度下储存。产物应根据标记上所提供的信息来储存。
[0364] 使用之前，产物应在冷冻机中、在2℃至8℃解冻整夜；产物可在此温度下保持长达7天。应避免使小瓶暴露于较高温度和剧烈振荡，因为这些状况可导致STM 434效能和结构
完整性降低。一经解冻，产物不应再冷冻。
完整性降低。一经解冻，产物不应再冷冻。
[0365] 关于研究药物供应的任何其它储存、操纵或更新的稳定性数据，参考药学手册(Pharmacy Manual)。
[0366] 施用研究药物
[0367] STM 434
[0368] STM 434将以各组计划剂量施用，如下文所特定说明。
[0369] 在第1部分中，计划剂量组如下：
[0370] ·第1组：每4周0.25mg/kg STM 434 IV
[0371] ·第2组：每4周0.5mg/kg STM 434 IV
[0372] ·第3组：每4周1mg/kg STM 434 IV
[0373] ·第4组：每4周2mg/kg STM 434 IV
[0374] ·第5组：每4周4mg/kg STM 434 IV
[0375] 在第2部分中，计划剂量组如下：
[0376] ·第6组：每4周向6位患有透明细胞腺癌的个体和6位患有颗粒层细胞肿瘤的个体静脉内施用RP2D的STM 434
[0377] ·第7组：每4周向12位患有浆液性卵巢瘤的个体静脉内施用RP2D的STM 434
[0378] 在第3部分中，个体将接受STM 434与脂质体阿霉素。个体首先接受阿霉素输注；此输注完成后，个体接着将静脉内接受STM 434。第3部分中的计划剂量组如下：
[0379] ·第8组：低于RP2D IV的一种剂量水平的STM 434+脂质体阿霉素(40mg/m2 IV)，每4周
[0380] ·第9组：RP2D IV的STM 434+脂质体阿霉素(40mg/m2 IV)，每4周
[0381] 第1、2和3部分中的个体将用STM 434治疗直至疾病进展，除非观察到不可接受的毒性。疾病进展将基于根据RECIST 1.1标准或肿瘤标记测量值的放射照相测量结果。
[0382] 若脂质体阿霉素因任何原因(除组合疗法的最初28天期间所观察到的DLT的外)停药或中断，则第3部分中的个体可继续接受STM 434。脂质体阿霉素的剂量修改和调节将遵
循此产物的处方信息。所施用的脂质体阿霉素循环的最大数目为6。
循此产物的处方信息。所施用的脂质体阿霉素循环的最大数目为6。
[0383] 脂质体阿霉素
[0384] 第3部分中的个体(第8组和第9组)将首先接受脂质体阿霉素(40mg/m2)输注；当此输注完成时，个体接着将接受其静脉内剂量的STM 434。
[0385] 高达90mg的脂质体阿霉素剂量在250mL 5％右旋糖溶液(D5W)中稀释。剂量≥90mg应在500mL D5W中稀释。脂质体阿霉素的首次输注应以每分钟1mg的速率施用。若未观察到
输注反应，则随后输注可施用1小时。
输注反应，则随后输注可施用1小时。
[0386] 用于具有中度致吐性的化学疗法的止吐药应根据机构准则开具处方。
[0387] 治疗持续时间
[0388] 筛选将始于给药(第1循环的第1天)之前的长达14天，但放射照相扫描可在研究药物的第一次剂量开始之前的30天内收集。第1、2和3部分中的个体将用STM 434治疗直至疾
病进展，除非观察到不可接受的毒性。疾病进展将基于根据RECIST 1.1标准或肿瘤标记测
量值的放射照相测量结果。若使用CA-125作为肿瘤标记测量手段，则根据妇科癌症协作组
织(Gynecologic Cancer Intergroup；GCIG)共同准则评价结果。若使用PSA作为肿瘤标记
测量手段，则根据前列腺癌工作组织(Prostate Cancer Working Group；PCWG)共同准则评
价结果。
病进展，除非观察到不可接受的毒性。疾病进展将基于根据RECIST 1.1标准或肿瘤标记测
量值的放射照相测量结果。若使用CA-125作为肿瘤标记测量手段，则根据妇科癌症协作组
织(Gynecologic Cancer Intergroup；GCIG)共同准则评价结果。若使用PSA作为肿瘤标记
测量手段，则根据前列腺癌工作组织(Prostate Cancer Working Group；PCWG)共同准则评
价结果。
[0389] 若脂质体阿霉素因任何原因(除组合疗法的最初28天期间所观察到的DLT的外)停药或中断，则第3部分中的个体可继续接受STM 434。
[0390] 功效和安全评估
[0391] 各功效和安全变量描述如下。
[0392] 药物动力学
[0393] 血液样品中的STM 434含量将由中央实验室测定。使用标准非隔室药物动力学方法，利用血液含量估算以下STM 434 PK参数：
[0394] ·终末半衰期(t1/2)
[0395] ·清除率(CL)
[0396] ·平均滞留时间(MRT)
[0397] ·分布体积(Vd)
[0398] ·稳态体积(Vss)
[0399] 另外，对于除STM 434的外还将接受脂质体阿霉素的第3部分中的个体(第8组和第9组)来说，收集血液样品且送至中央实验室用于测定阿霉素/阿霉素醇含量。估算如上所述
的PK参数。
的PK参数。
[0400] 功效评估
[0401] 放射照相术肿瘤进展
[0402] 使用基于CT(或MRI)和骨骼扫描(仅有骨转移的个体)的RECIST1.1标准，根据研究者的评估来测定放射照相术肿瘤进展。CT或MRI模式的选择将依据研究者。在基线测量目标
病变(若存在，每位个体至多5个)且在整个研究中追踪。放射照相反应的持续时间将以初始
观察到目标放射照相反应直至疾病进展或死亡的日期的时间来记录。放射照相无进展存活
期将以第1循环的第1天直至放射照相疾病进展或死亡的日期的时间来记录。
病变(若存在，每位个体至多5个)且在整个研究中追踪。放射照相反应的持续时间将以初始
观察到目标放射照相反应直至疾病进展或死亡的日期的时间来记录。放射照相无进展存活
期将以第1循环的第1天直至放射照相疾病进展或死亡的日期的时间来记录。
[0403] 身体组成
[0404] 瘦体质量、四肢瘦肌肉质量和脂肪质量以及脂肪分布(内脏和皮下)将通过DXA测定，如放射学手册(Radiology Manual)中所详述。DXA扫描将由中央放射学实验室分析。
[0405] 肌肉功能测试：6分钟行走测试
[0406] 描述
[0407] 6MWT是测量个体当在平坦表面上行走6分钟时间段时所涵盖的距离。在此研究中，6MWT将根据美国胸科学会(American Thoracic Society；ATS)进行。这些准则是针对可能
同时患有心脏或肺病且身体活力程度总体降低的患者(类似于晚期肿瘤患者)而开发。因
此，当前研究中的6MWT程序已根据ATS准则作出计划。
同时患有心脏或肺病且身体活力程度总体降低的患者(类似于晚期肿瘤患者)而开发。因
此，当前研究中的6MWT程序已根据ATS准则作出计划。
[0408] 人员培训
[0409] 惟由主持者/主持者代表培训的现场人员才可执行6MWT。在主持者/主持者代表评价所用面积之前，现场可不开始执行6MWT，且培训将执行测试的现场人员。在研究期间，针
对每位个别个体的所有评估必须使用相同面积。
对每位个别个体的所有评估必须使用相同面积。
[0410] 实验室功效参数
[0411] 生物标记
[0412] 肿瘤生物标记
[0413] 在基线和在整个研究中将监测血清肿瘤生物标记(如CA-125(用于患有卵巢癌的个体、PSA(用于患有前列腺癌的个体)、CA 19-9(用于患有胰脏癌的个体)，和CEA(用于患有
结肠癌的个体))。评估肿瘤标记反应和肿瘤标记进展(TTTMP)。若使用CA-125作为肿瘤标记
测量手段，则根据妇科癌症协作组织(GCIG)共同准则评价结果。若使用PSA作为肿瘤标记测
量手段，则根据前列腺癌工作组织(PCWG)共同准则评价结果。
结肠癌的个体))。评估肿瘤标记反应和肿瘤标记进展(TTTMP)。若使用CA-125作为肿瘤标记
测量手段，则根据妇科癌症协作组织(GCIG)共同准则评价结果。若使用PSA作为肿瘤标记测
量手段，则根据前列腺癌工作组织(PCWG)共同准则评价结果。
[0414] 血清肿瘤生物标记(活化素A、FSH、雌二醇、睾固酮)
[0415] 由于STM 434抑制活化素信号传导，因此将确定血清活化素含量是否为反映STM 434抑制标靶的程度的药效学生物标记。由于活化素为刺激FSH和性激素(雌二醇、睾固酮)
释放的内分泌反馈机制的一部分，因此这些内分泌生物标记还作为潜在的药效学功效生物
标记加以评估。
释放的内分泌反馈机制的一部分，因此这些内分泌生物标记还作为潜在的药效学功效生物
标记加以评估。
[0416] 活化素A将由中央实验室测定以确保个体之间的可比性。FSH、雌二醇和睾固酮将由本地实验室评估。样品操纵说明书提供于实验室手册(Laboratory Manual)中。
[0417] 组织肿瘤生物标记
[0418] 通过在筛选时和第4循环的第1天访视时使用经验证的 分析测量受体ACVR2B和配位体INHBA的mRNA(所有个体)来检查经福尔马林(Formalin)固定、经石蜡嵌
埋的肿瘤切片中的自分泌/旁分泌信号传导。在筛选时通过DNA测序来测定FOXL2基因突变
状态(针对患有颗粒层细胞肿瘤的个体)。ARID1A基因突变状态将通过下一代测序、比较肿
瘤DNA与得自全血的体细胞DNA(针对患有透明细胞/子宫内膜肿瘤的个体)来测定；此分析
还可测定存在于微芯片上的其它癌症基因的序列。由于这些数据的临床相关性尚未确立，
因此个体将不被告知突变分析结果。样品(组织切片或肿瘤包埋检体)将根据实验室手册中
的说明书装运至中央实验室。
埋的肿瘤切片中的自分泌/旁分泌信号传导。在筛选时通过DNA测序来测定FOXL2基因突变
状态(针对患有颗粒层细胞肿瘤的个体)。ARID1A基因突变状态将通过下一代测序、比较肿
瘤DNA与得自全血的体细胞DNA(针对患有透明细胞/子宫内膜肿瘤的个体)来测定；此分析
还可测定存在于微芯片上的其它癌症基因的序列。由于这些数据的临床相关性尚未确立，
因此个体将不被告知突变分析结果。样品(组织切片或肿瘤包埋检体)将根据实验室手册中
的说明书装运至中央实验室。
[0419] 循环肿瘤细胞
[0420] 活化素信号传导为维持一些肿瘤类型中的癌症干细胞群所必需的。因此，CTC含量减少可反映STM 434的药效学活性。在此研究中，将在筛选时和第2循环的第1天使用经验证
的 平台对CTC进行计数。样品将根据实验室手册中的说明书装运至中央实验
室。
的 平台对CTC进行计数。样品将根据实验室手册中的说明书装运至中央实验
室。
[0421] 血清脂质
[0422] 由于STM 434的抗活化素和抗肌肉生长抑制素药理学可引起肌肉质量增加，因此将确定所治疗个体中的血清脂质含量是否会受到影响。
[0423] 通过恒稳模型评估空腹血清葡萄糖和胰岛素
[0424] 胰岛素抗性(IR)和高血糖症为心血管并发症发展的风险因素。在临床前研究中，STM 434替代物STM 217使IR改善。尽管高胰岛素-正常血液葡萄糖钳夹技术为测量IR的黄
金标准，但此方法的复杂性限制了其使用。已利用透析个体研究更实用的方法HOMA，其使用
葡萄糖和胰岛素的空腹含量。使用HOMA所得的测量值与使用高胰岛素-正常血液葡萄糖钳
夹技术所得的测量值良好相关。
金标准，但此方法的复杂性限制了其使用。已利用透析个体研究更实用的方法HOMA，其使用
葡萄糖和胰岛素的空腹含量。使用HOMA所得的测量值与使用高胰岛素-正常血液葡萄糖钳
夹技术所得的测量值良好相关。
[0425] HbA1c由美国糖尿病协会(American Diabetes Association)推荐，用于评价血糖控制。在此研究中评价HbA1c补充空腹葡萄糖和空腹胰岛素测试且将提供葡萄糖随时间控
制的整合式测量手段。
制的整合式测量手段。
[0426] 统计分析
[0427] 端点
[0428] 初始端点
[0429] 初始端点如下：
[0430] ·第1部分：患有卵巢癌或其它晚期实体肿瘤的个体的STM 434单一疗法的MTD
[0431] ·第2部分：患有卵巢/输卵管/原发性腹膜/子宫内膜肿瘤的个体的AE在实验室测试中的发生和临床显著变化、ECG，和生命体征
[0432] ·第3部分：STM 434与脂质体阿霉素化学疗法组合施用患有卵巢/输卵管/原发性腹膜癌症的个体的MTD
[0433] 第二端点
[0434] 第二端点(第1部分、第2部分和第3部分，除非另外指明)包括以下：
[0435] ·在不存在MTD情况下的RP2D(第1部分和第3部分)
[0436] ·AE在实验室测试中的发生和临床显著变化、ECG和生命体征(第1部分和第3部分)
[0437] ·STM 434抗体形成的发生
[0438] ·STM 434的PK概况
[0439] ·阿霉素/阿霉素醇的PK概况(第3部分)
[0440] ·个体对FACT-NTX神经病变问卷的反应
[0441] ·放射照相反应率(rRR)
[0442] ·放射照相反应(dRR)的持续时间
[0443] ·放射照相无进展存活率(rPFS)
[0444] ·肿瘤标记反应率(TMRR)
[0445] ·达成肿瘤标记进展的时间(TTTMP)
[0446] ·基线和治疗时活化素A血清浓度、肿瘤INHBA/ACVR2B mRNA含量和肿瘤突变状态(患有透明细胞/子宫内膜/颗粒层细胞肿瘤的个体)与抗肿瘤功效测量值的相关性
[0447] ·瘦体质量、四肢瘦肉质量、脂肪质量(内脏和皮下)、脂质概况、空腹葡萄糖、空腹胰岛素、HOMA、HbA1c和6分钟行走距离相对于基线的变化
[0448] 探索性端点
[0449] 探索性端点(第1部分、第2部分和第3部分)如下：
[0450] ·PK参数与抗肿瘤功效、骨矿物质密度(未发生骨转移的个体)、脂质概况、空腹葡萄糖、空腹胰岛素、HbA1c、6分钟行走距离、抗药物抗体形成、生物标记或ECG数据之间的相关性
[0451] 分析群
[0452] 针对功效、安全和PK的分析群分别描述如下。
[0453] ·功效分析群将包括接受STM 434施用至少4周的所有个体。功效端点的二次分析将针对接受STM 434施用至少12周的所有个体进行。
[0454] ·安全分析群将包括接受至少1次剂量的STM 434的所有个体。
[0455] ·PK分析群将包括接受至少1次剂量的STM 434且提供至少1个PK样品的所有个体。
[0456] 功效分析
[0457] rRR、dRR和rPFS将根据RECIST 1.1定义且使用描述性统计学和卡普兰-迈耶方法(Kaplan-Meier methods)分析。对于rPFS来说，未经历疾病进展或死亡的个体在其最后成
像扫描的日检查用于疾病评估。
像扫描的日检查用于疾病评估。
[0458] TMRR和TTTMP将依据适当的共同准则定义，且使用描述性统计学和卡普兰-迈耶方法分析。
[0459] 药物动力学分析
[0460] 使用标准非隔室PK方法估算单独和与脂质体阿霉素组合的STM434的PK参数且使用描述性统计学(平均值、标准偏差、中值、最小值和最大值)概述。
[0461] 使暴露量与抗肿瘤功效、瘦体重量、脂肪质量、脂质概况、空腹葡萄糖、空腹胰岛素、HOMA、HbA1c、6MWT、抗药物抗体形成、生物标记或ECG数据相关的探索性分析可临时或事后进行。
[0462] 安全性分析
[0463] 安全性评估将包括AE、伴随药物、实验室结果和生命体征。所报道的所有AE将使用《医学监管活动辞典(Medical Dictionary for Regulatory Activities)》编码，利用患有
AE的个体的数目和百分比以及归因(严重相对于不严重和研究者所报道的关系[无关、可能
有关、有关])概述。表中仅包括治疗的第一次剂量起始之后直至最后治疗之后30天发生的
AE。抗STM 434抗体形成的发生将使用描述性统计学概述。
AE的个体的数目和百分比以及归因(严重相对于不严重和研究者所报道的关系[无关、可能
有关、有关])概述。表中仅包括治疗的第一次剂量起始之后直至最后治疗之后30天发生的
AE。抗STM 434抗体形成的发生将使用描述性统计学概述。
[0464] 样品大小确定
[0465] 研究计划募集多达总共66位个体(组成为第1部分中多达30位个体、第2部分中24位个体和第3部分中多达12位个体)。此样品大小不基于幂计算，而是基于临床判断和计划
样品大小满足研究目标的预期。
样品大小满足研究目标的预期。
[0466] 在研究的第2部分中，在罕见的卵巢癌亚型透明细胞和颗粒层细胞肿瘤的群组中，由于预期临床试验地点的个体数目少，因此各亚型仅募集6位个体，而较常见浆液性卵巢瘤
群组将募集12位个体。
群组将募集12位个体。
[0467] 结论
[0468] 作为单一疗法或与脂质体阿霉素化学疗法组合施用的STM 434配制物治疗所选个体的卵巢癌和其它晚期实体肿瘤，副作用相对有限。
[0469]
[0470]
[0471]
[0472] 实例5：STM 434研究的中期结果。
[0473] 使用上述方案选择三位人类个体以便用STM 434治疗。各个体患有晚期形式的癌症：浆液性卵巢癌、颗粒层卵巢癌或结肠癌。个体1患有浆液性卵巢癌，个体2患有颗粒层细
胞卵巢癌，且个体3患有结肠癌。个体1在2014年1月诊断患有IV期卵巢癌。其先前在2014年
接受卡铂(carboplatin)和太平洋紫杉醇(paclitaxel)之后，其浆液性腺癌肿瘤有进展。个
体2在1998年诊断患有卵巢癌且先前在2010年接受顺铂(cisplatin)、依托泊苷
(etoposide)、博莱霉素化学疗法(bleomycin chemotherapy)、在2012年接受卡铂和太平洋
紫杉醇、在2013年接受贝伐单抗(bevacizumab)、甲羟孕酮(medroxyprogesterone)、阿那曲
唑(anastrozole)且在2014年接受RX-3117(研究性胞苷类似物)之后，其颗粒层细胞肿瘤有
进展。个体3在2012年6月诊断患有IV期结肠癌。其先前在2012年接受5-氟尿嘧啶(5-
fluorouacil)、甲酰四氢叶酸(leucovorin)、奥沙利铂化学疗法(oxaliplatin
chemotherapy)、在2013年接受伊立替康(irinotecan)、5-氟尿嘧啶、甲酰四氢叶酸、贝伐单抗且在2014年接受帕尼单抗(panitumumab)之后，其结肠肿瘤有进展。
胞卵巢癌，且个体3患有结肠癌。个体1在2014年1月诊断患有IV期卵巢癌。其先前在2014年
接受卡铂(carboplatin)和太平洋紫杉醇(paclitaxel)之后，其浆液性腺癌肿瘤有进展。个
体2在1998年诊断患有卵巢癌且先前在2010年接受顺铂(cisplatin)、依托泊苷
(etoposide)、博莱霉素化学疗法(bleomycin chemotherapy)、在2012年接受卡铂和太平洋
紫杉醇、在2013年接受贝伐单抗(bevacizumab)、甲羟孕酮(medroxyprogesterone)、阿那曲
唑(anastrozole)且在2014年接受RX-3117(研究性胞苷类似物)之后，其颗粒层细胞肿瘤有
进展。个体3在2012年6月诊断患有IV期结肠癌。其先前在2012年接受5-氟尿嘧啶(5-
fluorouacil)、甲酰四氢叶酸(leucovorin)、奥沙利铂化学疗法(oxaliplatin
chemotherapy)、在2013年接受伊立替康(irinotecan)、5-氟尿嘧啶、甲酰四氢叶酸、贝伐单抗且在2014年接受帕尼单抗(panitumumab)之后，其结肠肿瘤有进展。
[0474] STM 434配制物、包装和储存
[0475] STM 434配制为旨在静脉内施用的无菌水溶液，其含有70mg/mL STM 434、10mM磷酸钾缓冲液、8.8％(w/v)蔗糖和0.006％(w/v)聚山梨醇酯20，pH 6.7。使用13mm氟聚合物塞
子和13mm密封件将所配制的STM 434溶液封装于5mL玻璃瓶中。STM 434小瓶在非自由结霜
冷冻机中、在-20℃(±5℃)的温度下储存。使用之前，STM 434在冷冻机中、在2℃至8℃解冻
整夜。
子和13mm密封件将所配制的STM 434溶液封装于5mL玻璃瓶中。STM 434小瓶在非自由结霜
冷冻机中、在-20℃(±5℃)的温度下储存。使用之前，STM 434在冷冻机中、在2℃至8℃解冻
整夜。
[0476] STM 434施用
[0477] 约每4周向各个体静脉内施用0.25mg/kg STM 434。个体1在2014年10月17日开始治疗，且在2014年11月14日和2014年12月15日接受两次额外剂量，随后在2014年12月30日
中断进一步研究治疗。个体2在2014年10月29日开始治疗，且在2014年11月24日、2014年12
月24日和2015年1月21日接受三次额外剂量，此个体继续接受STM 434直至2015年2月17日；
个体3在2014年11月6日开始治疗，且在2014年12月4日接受一次额外剂量，随后在2015年1
月05日中断进一步研究治疗。
中断进一步研究治疗。个体2在2014年10月29日开始治疗，且在2014年11月24日、2014年12
月24日和2015年1月21日接受三次额外剂量，此个体继续接受STM 434直至2015年2月17日；
个体3在2014年11月6日开始治疗，且在2014年12月4日接受一次额外剂量，随后在2015年1
月05日中断进一步研究治疗。
[0478] STM 434人类安全性和功效
[0479] 在任何个体中均未观察到视为与STM 434施用相关的不良事件。在任何个体中均未观察到与神经病变、出血事件或内分泌症状相关的不良事件。在任何个体中均未观察到
抗STM 434抗体。个体1报道食欲改善、有精力和活动状态增强。研究者认为STM 434安全且
耐受性良好。研究者建议递增至下一个剂量水平。
抗STM 434抗体。个体1报道食欲改善、有精力和活动状态增强。研究者认为STM 434安全且
耐受性良好。研究者建议递增至下一个剂量水平。
[0480] 活体内STM 434抑制活化素
[0481] 由于活化素为刺激FSH释放的内分泌反馈机制的一部分，因此FSH以潜在的药效学功效生物标记加以评估。FSH的减少
[0482] 预期可表示STM 434抑制活化素。
[0483] 使用ELISA定量免疫分析来评估FSH。已测定在施用0.25mg/kg剂量的STM 434之后，3位个体中有2者中的FSH含量降低。图4.相对于基线的变化百分比标绘于y轴上，时间标
绘于x轴上；C1D1指示第1循环的第1天(治疗之前的基线)，C1D15指示初始施用STM 434之后
的第1循环的第15、14天，且C2D1指示第2循环的第1天(给药前，第一次施用之后第4周施用
STM 434第二次剂量之前)。在C1D15观察到的FSH减少指示STM 434抑制人类中的活化素信
号传导。FSH含量恢复至约基线，表明再抑止人类中的活化素信号传导必需新剂量的STM
434。这些结果表明STM 434可抑制人类中的活化素。
绘于x轴上；C1D1指示第1循环的第1天(治疗之前的基线)，C1D15指示初始施用STM 434之后
的第1循环的第15、14天，且C2D1指示第2循环的第1天(给药前，第一次施用之后第4周施用
STM 434第二次剂量之前)。在C1D15观察到的FSH减少指示STM 434抑制人类中的活化素信
号传导。FSH含量恢复至约基线，表明再抑止人类中的活化素信号传导必需新剂量的STM
434。这些结果表明STM 434可抑制人类中的活化素。
[0484] STM 434 PK结果
[0485] 通过ELISA定量免疫分析来测定PK。相较于在猴中显示163-259小时(7-11天)的先前数据，中期PK分析显示2倍高的清除率和111、114或147小时(4-5天)的T1/2。图5.此表明
个体可受益于更频繁的STM434剂量方案，例如每2周或每3周静脉内给药。
个体可受益于更频繁的STM434剂量方案，例如每2周或每3周静脉内给药。
[0486] STM 434诱发性肿瘤梗塞
[0487] 患有颗粒层肿瘤的一位个体(个体2)在基线和在第4循环开始时(第1天)再次接受CT扫描。两次扫描之间存在12周和三次剂量。图6显示基线扫描，其中肿瘤以圆形指示。图7
显示第4循环开始时获得的后续扫描，其中肿瘤再次以圆形指示。如通过比较扫描所见，肿
瘤已经历实质性梗塞。此表明低剂量的STM 434有效治疗患有颗粒层肿瘤的个体。
显示第4循环开始时获得的后续扫描，其中肿瘤再次以圆形指示。如通过比较扫描所见，肿
瘤已经历实质性梗塞。此表明低剂量的STM 434有效治疗患有颗粒层肿瘤的个体。
[0488] 实例6：修改的STM 434方案。
[0489] 至少部分地根据实例5的结果来修改实例4的STM 434方案。修改的方案阐述于下表17、其子表和相关附录中。
[0490]
[0491]
[0492]
[0493]
[0494]
[0495]
[0496]
[0497]
[0498]
[0499]
[0500]
[0501]
[0502]
[0503]
[0504]
[0505]
[0506]
[0507]
[0508]
[0509]
[0510]
[0511]
[0512]
[0513]
[0514]
[0515] 研究程序的脚注
[0516] 1 适当时，治疗中断访视可在任何预定或非预定的访视时进行。在此访视时，需要可确认进行性疾病或不可接受的毒性的文件。
[0517] 2 EOS访视应预定于最后施用STM 434之后的第28天±3天。
[0518] 3 每次访视时记录个体体重；筛选访视时仅记录身高。
[0519] 4 大便隐血必需在筛选时进行且可在研究者的判断下在基线后重复进行。
[0521] 6 筛选访视之后，必须使用中央实验室的设备收集ECG。个体在第-1天开始连续穿戴Holter监测器直至第1循环/第2天访视，此时除去Holter监测器。在后续各循环的第1天
时和在EOS访视时，利用中央实验室设备获得12引线ECG。
时和在EOS访视时，利用中央实验室设备获得12引线ECG。
[0522] 7 若需要评估神经病变的AE，则可在非预定的访视时收集FACT/GOG-NTX。
[0523] 8 惟第3部分中的个体需要MUGA或ECHO记录心脏射血分数用于脂质体阿霉素施用。MUGA或ECHO的选择由研究者决定，但模式一经选择，则个体在整个研究期间应使用相同
方法。MUGA/ECHO仅在筛选时和第3循环第1天时进行。在第3部分中的阿霉素治疗个体在第3
循环第1天之前中断的情况下，MUGA/ECHO应在治疗中断访视时进行。
方法。MUGA/ECHO仅在筛选时和第3循环第1天时进行。在第3部分中的阿霉素治疗个体在第3
循环第1天之前中断的情况下，MUGA/ECHO应在治疗中断访视时进行。
[0524] 9 脂质体阿霉素施用限于研究的第3部分中的个体。
[0525] 10 报道自签署知情同意文件直至第1循环第1天施用研究药物时的治疗前SAE。
[0526] 11 最后施用STM 434之后的30天需要进行AE随访，以确定是否存在任何新的或进行中的AE或SAE，不论因果归因。随访可经由电话进行且必须记录于注释出处。
[0527] 12 仅在筛选和第2循环第1天时。
[0528] 13 HbA1c仅在筛选、第3循环第1天、治疗中断和EOS时收集且分析。
[0529] 14 血清肿瘤生物标记可包括CA-125、PSA、CA 19-9、CEA，或适当时基于个体肿瘤类型的其它生物标记。对于患有颗粒层细胞肿瘤的患者来说，在每一循环的第1天进行中央实验室MIS。
[0530] 15 组织肿瘤生物标记包括肿瘤切片/肿瘤包埋检体用于ACVR2B和INHBA基因表达(所有个体)以及基因突变状态(患有透明细胞/子宫内膜/颗粒层细胞肿瘤的个体)。
[0531] 16 仅具有生育潜力的女性。
[0532] 17 CTC仅在筛选和第2循环第1天时收集。
[0533] 18 第1循环第1天之前长达30天执行的扫描(DXA、CT、MRI、骨)可用于基线评估。
[0534] 19 研究的DXA、CT/MRI和骨扫描可在第1天访视之前的14天内完成。在第7循环第1天访视时进行扫描之后，若研究者认为疾病进展可能性低，则后续扫描可每四个循环进行。
[0535] 20 6分钟行走测试仅在第2循环第1天访视时完成。
[0536] 21 骨扫描评估应在研究者判断下进行，例如若个体肿瘤转移至骨。
[0537] 22 研究者应根据RECIST 1.1(附录7)评估放射照相术扫描
[0538] 23 用于PK评估的详细计划表呈现于此方案的附录4中。注意：第2、3和8天的PK评估仅在第1循环和第3循环进行。
[0539]
[0540]
[0541]
[0542] 研究程序的脚注
[0543] 1 适当时，治疗中断访视可在任何预定或非预定的访视时进行。在此访视时，需要可确认进行性疾病或不可接受的毒性的文件。
[0544] 2 EOS访视应预定于最后施用STM 434之后的第28天±3天。
[0545] 3 每次访视时记录个体体重；筛选访视时仅记录身高。
[0546] 4 大便隐血必需在筛选时进行且可在研究者的判断下在基线后重复进行。
[0547] 5 生命体征：听觉、经皮或口腔温度、坐血压、心率和呼吸速率
[0548] 6 筛选访视之后，必须使用中央实验室的设备收集ECG。个体在第-1天开始连续穿戴Holter监测器直至第1循环/第2天访视，此时除去Holter监测器。在后续各循环的第1天
时和在EOS访视时，利用中央实验室设备获得12引线ECG。
时和在EOS访视时，利用中央实验室设备获得12引线ECG。
[0549] 7 若需要评估神经病变的AE，则可在非预定的访视时收集FACT/GOG-NTX。
[0550] 8 惟第3部分中的个体需要MUGA或ECHO记录心脏射血分数用于脂质体阿霉素施用。MUGA或ECHO的选择由研究者决定，但模式一经选择，则个体在整个研究期间应使用相同
方法。MUGA/ECHO仅在筛选时和第3循环第1天时进行。在第3部分中的阿霉素治疗个体在第3
循环第1天之前中断的情况下，MUGA/ECHO应在治疗中断访视时进行。
方法。MUGA/ECHO仅在筛选时和第3循环第1天时进行。在第3部分中的阿霉素治疗个体在第3
循环第1天之前中断的情况下，MUGA/ECHO应在治疗中断访视时进行。
[0551] 9 脂质体阿霉素施用限于研究的第3部分中的个体。
[0552] 10 报道自签署知情同意文件直至第1循环第1天施用研究药物时的治疗前SAE。
[0553] 11 最后施用STM 434之后的30天需要进行AE随访，以确定是否存在任何新的或进行中的AE或SAE，不论因果归因。随访可经由电话进行且必须记录于注释出处。
[0554] 12 仅在筛选和第2循环第1天时。
[0555] 13 HbA1c仅在筛选、第3循环第1天、治疗中断和EOS时收集且分析。
[0556] 14 血清肿瘤生物标记可包括CA-125、PSA、CA 19-9、CEA，或适当时基于个体肿瘤类型的其它生物标记。对于患有颗粒层细胞肿瘤的患者来说，在每一循环的第1天进行中央
实验室MIS。
实验室MIS。
[0557] 15 组织肿瘤生物标记包括肿瘤切片/肿瘤包埋检体用于ACVR2B和INHBA基因表达(所有个体)以及基因突变状态(患有透明细胞/子宫内膜/颗粒层细胞肿瘤的个体)。
[0558] 16 仅具有生育潜力的女性。
[0559] 17 CTC仅在筛选和第2循环第1天时收集。
[0560] 18 第1循环第1天之前长达30天执行的扫描(DXA、CT、MRI、骨)可用于基线评估。
[0561] 19 研究的DXA、CT/MRI和骨扫描可在第1天访视之前的14天内完成。在第7循环第1天访视时进行扫描之后，若研究者认为疾病进展可能性低，则后续扫描可每四个循环进行。
[0562] 20 6分钟行走测试仅在第2循环第1天访视时完成。
[0563] 21 骨扫描评估应在研究者判断下进行，例如若个体肿瘤转移至骨。
[0564] 22 研究者应根据RECIST 1.1(附录7)评估放射照相术扫描
[0565] 23 用于PK评估的详细计划表呈现于此方案的附录5中。注意：第2、3和8天的PK评估仅在第1循环和第3循环进行。
[0566]
[0567]
[0568] 研究程序的脚注
[0569] 1 适当时，治疗中断访视可在任何预定或非预定的访视时进行。在此访视时，需要可确认进行性疾病或不可接受的毒性的文件。
[0570] 2 EOS访视应预定于最后施用STM 434之后的第28天±3天。
[0571] 3 每次访视时记录个体体重；筛选访视时仅记录身高。
[0572] 4 大便隐血必需在筛选时进行且可在研究者的判断下在基线后重复进行。
[0573] 5 生命体征：听觉、经皮或口腔温度、坐血压、心率和呼吸速率
[0574] 6 筛选访视之后，必须使用中央实验室的设备收集ECG。个体在第-1天开始连续穿戴Holter监测器直至第1循环/第2天访视，此时除去Holter监测器。在后续各循环的第1天
时和在EOS访视时，利用中央实验室设备获得12引线ECG。
时和在EOS访视时，利用中央实验室设备获得12引线ECG。
[0575] 7 若需要评估神经病变的AE，则可在非预定的访视时收集FACT/GOG-NTX。
[0576] 8 报道自签署知情同意文件直至第1循环第1天施用研究药物时的治疗前SAE。
[0577] 9 最后施用STM 434之后的30天需要进行AE随访，以确定是否存在任何新的或进行中的AE或SAE，不论因果归因。随访可经由电话进行且必须记录于注释出处。
[0578] 10 仅在筛选和第2循环第1天时。
[0579] 11 HbA1c仅在筛选、第3循环第1天、治疗中断和EOS时收集且分析。
[0580] 12 血清肿瘤生物标记可包括CA-125、PSA、CA 19-9、CEA，或适当时基于个体肿瘤类型的其它生物标记。对于患有颗粒层细胞肿瘤的患者来说，在每一循环的第1天进行中央
实验室MIS。
实验室MIS。
[0581] 13 组织肿瘤生物标记包括肿瘤切片/肿瘤包埋检体用于ACVR2B和INHBA基因表达(所有个体)以及基因突变状态(患有透明细胞/子宫内膜/颗粒层细胞肿瘤的个体)。
[0582] 14 仅具有生育潜力的女性。
[0583] 15 CTC仅在筛选和第2循环第1天时收集。
[0584] 16 第1循环第1天之前长达30天执行的扫描(DXA、CT、MRI、骨)可用于基线评估。
[0585] 17 研究的DXA、CT/MRI和骨扫描可在第1天访视之前的14天内完成。在第7循环第1天访视时进行扫描之后，若研究者认为疾病进展可能性低，则后续扫描可每四个循环进行。
[0586] 18 6分钟行走测试仅在第2循环第1天访视时完成。
[0587] 19 骨扫描评估应在研究者判断下进行，例如若个体肿瘤转移至骨。
[0588] 20 研究者应根据RECIST 1.1(附录7)评估放射照相术扫描
[0589] 21 用于PK评估的详细计划表呈现于此方案的附录6中。注意：第2、3和8天的PK评估仅在第1循环和第3循环进行。
[0590]
[0591]
[0592] a 所有STM 434取样时间是相对于STM 434给药来说。
[0593] b 所有阿霉素/阿霉素醇取样时间是相对于脂质体阿霉素给药来说。
[0594] 对于Q4W给药来说，给药后PK取样窗如下：
[0595] 第1循环第1天：±30分钟第2、3、8天：±4小时第15天：±1天
[0596] 第2循环第1天：±30分钟
[0597] 第3循环第1天：±30分钟第2、3、8天：±4小时第15天：±1天
[0598] 第4循环第1天：±30分钟
[0599] 第5循环第1天：±30分钟
[0600]
[0601]
[0602]
[0603] a 所有STM 434取样时间是相对于STM 434给药来说。
[0604] b 所有阿霉素/阿霉素醇取样时间是相对于脂质体阿霉素给药来说。
[0605] 对于Q2W给药来说，给药后PK取样窗如下：
[0606] 第1循环第1天：±30分钟第2、3、8天：±4小时第15天：给药前1天内
[0607] 第2、4循环第1天：±4小时第15天：给药前1天内
[0608] 第3循环第1天：±30分钟第2、3、8天：±4小时第15天：给药前1天内
[0609] 第5循环第1天：±30分钟
[0610]
[0611] a 所有STM 434取样时间是相对于STM 434给药来说。
[0612] 对于Q3W给药来说，给药后PK取样窗如下：
[0613] 第1循环第1天：±30分钟第2、3、8天：±4小时第15天：±1天
[0614] 第2循环第1天：±4小时
[0615] 第3循环第1天：±30分钟第2、3、8天：±4小时
[0616] 第4循环第1天：±4小时
[0617] 第5循环第1天：±30分钟
[0618] 实例7：STM 434稳定性。
[0619] 经配制的STM 434的稳定性是使用多种方法、在多个时间点、在多种条件下测定。STM 434如上文所示配制(STM 434注射液是用70mg/mL STM 434、10mM磷酸钾、8.8％(w/v)
蔗糖、0.006％(w/v)聚山梨醇酯20(pH 6.7)配制)。
蔗糖、0.006％(w/v)聚山梨醇酯20(pH 6.7)配制)。
[0620] 方法
[0621] 用于评估稳定性的分析方法如下：
[0622] 利用紫外(UV)吸光度所得的浓度
[0623] 药品中STM 434的浓度是使用UV分光亮度计测量。使用280nm光(A280)的吸光度和280nm(ε280)下的1.7mg·mL-1·cm-1的消光系数来测定基于比尔定律(Becr′s law)的浓
度。
度。
[0624] 当浓度为70.0±7.0mg/mL时，一种蛋白质在指定时间点和温度下视为与所述蛋白质零时(T0)或相同蛋白质在其它相同条件下、在-70℃具有相等稳定性。指定蛋白质在指定
时间点的稳定性百分比还可相对于此数值计算。
时间点的稳定性百分比还可相对于此数值计算。
[0625] 目测外观
[0626] 此方法提供STM 434注射液的目测评估。在环境光下观察小瓶，且根据可见颗粒、着色程度和清晰性来报道一般外观。
[0627] 当外观为透明、无色至浅黄色液体且基本上不含颗粒时，一种蛋白质在指定时间点和温度下视为与所述蛋白质在零时(T0)或相同蛋白质在其它相同条件下、在-70℃具有
相等稳定性。
相等稳定性。
[0628] 重量摩尔渗透浓度
[0629] STM 434注射液的重量摩尔渗透浓度是使用冷冻点下降渗透压计测量，所述渗透压计相对于290mOsm/kg的重量摩尔渗透浓度标准校准。
[0630] 当重量摩尔渗透浓度为330.0±50.0mOsm/kg时，一种蛋白质在指定时间点和温度下视为与所述蛋白质在零时(T0)或相同蛋白质在其它相同条件下、在-70℃具有相等稳定
性。指定蛋白质在指定时间点的稳定性百分比还可相对于此数值计算。
性。指定蛋白质在指定时间点的稳定性百分比还可相对于此数值计算。
[0631] pH
[0632] STM 434注射液的pH是使用经国家科学和技术研究所(NIST)可追踪的标准校准的pH计测量。
[0633] 在25℃下pH为6.7±0.3时，一种蛋白质在指定时间点和温度视为与所述蛋白质在零时(T0)或相同蛋白质在其它相同条件下在-70℃具有相等稳定性。指定蛋白质在指定时
间点的稳定性百分比还可相对于此数值计算。
间点的稳定性百分比还可相对于此数值计算。
[0634] 容器体积
[0635] 测量小瓶中的STM 434注射溶液体积。
[0636] 当容器体积不小于1.0mL时，一种蛋白质在指定时间点和温度视为与所述蛋白质在零时(T0)或相同蛋白质在其它相同条件下在-70℃具有相等稳定性。指定蛋白质在指定
时间点的稳定性百分比还可相对于此数值计算。
时间点的稳定性百分比还可相对于此数值计算。
[0637] 尺寸排阻高效液相色谱(SE-HPLC)
[0638] SE-HPLC为一种通过蛋白质的流体动力学尺寸来分离蛋白质的方法，其流体动力学尺寸约与分子量(MW)相关。SE-HPLC可分析药品中的STM 434分子尺寸分布，尤其在聚集、
片段化和其它杂质方面。通过SE-HPLC解析单体STM 434与其它物质是在TSKgel G3000SWxl
HPLC管柱上、使用100mM磷酸钠、250mM氯化钠(pH 6.8)的等度(isocratic)移动相、以
0.5mL/min的流速进行。蛋白质是由A280nm经35分钟的分析运作时间检测。蛋白质的溶离时
间与其MW的对数成反比。分析结果是以A280峰面积相对于总A280峰面积的百分比报道。
片段化和其它杂质方面。通过SE-HPLC解析单体STM 434与其它物质是在TSKgel G3000SWxl
HPLC管柱上、使用100mM磷酸钠、250mM氯化钠(pH 6.8)的等度(isocratic)移动相、以
0.5mL/min的流速进行。蛋白质是由A280nm经35分钟的分析运作时间检测。蛋白质的溶离时
间与其MW的对数成反比。分析结果是以A280峰面积相对于总A280峰面积的百分比报道。
[0639] 当SE-HPLC主峰为≥95.0％时，一种蛋白质在指定时间点和温度视为与所述蛋白质在零时(T0)或相同蛋白质在其它相同条件下在-70℃具有相等稳定性。指定蛋白质在指
定时间点的稳定性百分比还可相对于此数值计算。
定时间点的稳定性百分比还可相对于此数值计算。
[0640] 成像毛细管等电聚焦(icIEF)
[0641] cIEF为基于蛋白质的等电点(pI)差异的高解析蛋白质分离技术。蛋白质新浦公司(Protein Simple)(前身为汇聚生物科学公司(Convergent Bioscience))iCE280 IEF分析
仪系统是使用完整毛细管区域成像检测器，其能够不用习知cIEF仪器所需的移动步骤进行
分析。对于STM 434注射液，使用icIEF作纯度测试。
仪系统是使用完整毛细管区域成像检测器，其能够不用习知cIEF仪器所需的移动步骤进行
分析。对于STM 434注射液，使用icIEF作纯度测试。
[0642] 在此icIEF方法中，STM 434样品用唾液酸酶处理以降低因产物中的唾液酸含量不同所赋予的实质性复杂度。去唾液酸化之后，将样品与载剂两性电解质混合以产生pH梯度
的甲基纤维素，从而减少电渗透流动，和吸收280nm光的已知pI的标记。将混合物引入内部
经涂布的熔融二氧化硅毛细管中，所述毛细管的滤芯中组装有位于入口与出口储集器之间
的UV可透射区段。当向毛细管区段施加电压时，溶液形成pH梯度，其中样品中的两性电解
质、pI标记和蛋白质物质聚焦于其相应pI。利用电荷耦合装置摄像机获得完整毛细管吸收
影像，从而可监测毛细管在280nm下的聚焦区域，这些聚焦区域对应于各种蛋白质物质和pI
标记。包含pI标记允许对毛细管中的pI梯度进行校准，从而对样品中的各种物质的pI值提
供可再现性测定。类似于HPLC，icIEF结果是以与毛细管中的迁移距离有关的A280峰值形式
提供。分析结果是以蛋白质物质的A280峰面积相对于总A280峰面积的百分比报道。
的甲基纤维素，从而减少电渗透流动，和吸收280nm光的已知pI的标记。将混合物引入内部
经涂布的熔融二氧化硅毛细管中，所述毛细管的滤芯中组装有位于入口与出口储集器之间
的UV可透射区段。当向毛细管区段施加电压时，溶液形成pH梯度，其中样品中的两性电解
质、pI标记和蛋白质物质聚焦于其相应pI。利用电荷耦合装置摄像机获得完整毛细管吸收
影像，从而可监测毛细管在280nm下的聚焦区域，这些聚焦区域对应于各种蛋白质物质和pI
标记。包含pI标记允许对毛细管中的pI梯度进行校准，从而对样品中的各种物质的pI值提
供可再现性测定。类似于HPLC，icIEF结果是以与毛细管中的迁移距离有关的A280峰值形式
提供。分析结果是以蛋白质物质的A280峰面积相对于总A280峰面积的百分比报道。
[0643] 当icIEF主峰为65.0±10.0％时，一种蛋白质在指定时间点和温度下视为与所述蛋白质在零时(T0)或相同蛋白质在其它相同条件下、在-70℃具有相等稳定性。指定蛋白质
在指定时间点的稳定性百分比还可相对于此数值计算。
在指定时间点的稳定性百分比还可相对于此数值计算。
[0644] 十二烷基硫酸钠毛细管电泳(CE-SDS)(非还原性CE-SDS(nrCE-SDS))
[0645] 使用非还原性十二烷基硫酸钠毛细管电泳(CE-SDS)(非还原性CE-SDS(nrCE-SDS))作为STM 434注射液的纯度测试。方法包括使蛋白质在清洁剂SDS存在下发生热变性，
从而使其以相对恒定的SDS：多肽比率结合到多肽。结合到蛋白质的带负电SDS促使其根据
MW而在电场中迁移。
从而使其以相对恒定的SDS：多肽比率结合到多肽。结合到蛋白质的带负电SDS促使其根据
MW而在电场中迁移。
[0646] 在此方法中，将STM 434样品与SDS、游离硫氢基阻断剂和内部MW标准物一起、在70℃、在非还原条件下培育10分钟。培育之后，将经处理的样品装载至自动取样器中，所述自
动取样器还承载冲洗溶液和专业化SDS凝胶。CE系统经程序化以便依序冲洗、凝胶装载，和
以电动方式将样品注射至熔融二氧化硅空毛细管中。对于各样品来说，使所注射的蛋白质
经受电场以便进行基于MW的分离，包括移动通过检测窗(其中毛细管涂层已除去)和光穿过
毛细管至光电二极管数组检测器，在此方法中，所述检测器经设定可收集220nm吸光度
(A220)。分析结果系以蛋白质物质的A220峰面积相对于总A280峰面积的百分比报道。
动取样器还承载冲洗溶液和专业化SDS凝胶。CE系统经程序化以便依序冲洗、凝胶装载，和
以电动方式将样品注射至熔融二氧化硅空毛细管中。对于各样品来说，使所注射的蛋白质
经受电场以便进行基于MW的分离，包括移动通过检测窗(其中毛细管涂层已除去)和光穿过
毛细管至光电二极管数组检测器，在此方法中，所述检测器经设定可收集220nm吸光度
(A220)。分析结果系以蛋白质物质的A220峰面积相对于总A280峰面积的百分比报道。
[0647] 当nrCE-SDS主峰为≥88.0％时，一种蛋白质在指定时间点和温度下视为与所述蛋白质在零时(TO)或相同蛋白质在其它相同条件下、在-70℃具有相等稳定性。指定蛋白质在
指定时间点的稳定性百分比还可相对于此数值计算。
指定时间点的稳定性百分比还可相对于此数值计算。
[0648] 还原性CE-SDS(rCE-SDS)
[0649] 还原性CE-SDS用作STM 434注射液的纯度测试。方法包括使指定浓度的蛋白质在清洁剂SDS和使二硫键裂解成硫氢基的还原剂存在下发生热变性，在此情况下，STM 434促
使均二聚体的两个多肽链分离。以相对恒定的SDS：多肽比率结合到多肽链的带负电SDS促
使多肽根据MW而在电场中迁移。
使均二聚体的两个多肽链分离。以相对恒定的SDS：多肽比率结合到多肽链的带负电SDS促
使多肽根据MW而在电场中迁移。
[0650] 在此方法中，将STM 434样品与SDS、还原剂β-巯基乙醇和内部MW标准物一起、在70℃、在非还原条件下培育10分钟。培育之后，将经处理的样品装载至自动取样器中，所述自
动取样器还承载冲洗溶液和专业化SDS凝胶。CE系统经程序化以便依序冲洗、凝胶装载，和
以电动方式将样品注射至熔融二氧化硅空毛细管中。对于各样品来说，使所注射的蛋白质
经受电场以便进行基于MW的分离，包括移动通过检测窗(其中毛细管涂层已除去)和光穿过
毛细管至光电二极管数组检测器，在此方法中，所述检测器经设定可收集220nm吸光度
(A220)。分析结果是以蛋白质物质的A220峰面积相对于总A280峰面积的百分比报道。
动取样器还承载冲洗溶液和专业化SDS凝胶。CE系统经程序化以便依序冲洗、凝胶装载，和
以电动方式将样品注射至熔融二氧化硅空毛细管中。对于各样品来说，使所注射的蛋白质
经受电场以便进行基于MW的分离，包括移动通过检测窗(其中毛细管涂层已除去)和光穿过
毛细管至光电二极管数组检测器，在此方法中，所述检测器经设定可收集220nm吸光度
(A220)。分析结果是以蛋白质物质的A220峰面积相对于总A280峰面积的百分比报道。
[0651] 当rCE-SDS主峰为≥90.0％时，一种蛋白质在指定时间点和温度下视为与所述蛋白质在零时(TO)或相同蛋白质在其它相同条件下、在-70℃具有相等稳定性。指定蛋白质在
指定时间点的稳定性百分比还可相对于此数值计算。
指定时间点的稳定性百分比还可相对于此数值计算。
[0652] 产物特异性ELISA
[0653] STM 434注射液身分测试中所用的方法为固相夹心式ELISA。微量滴定条用对STM 434具有高亲和性的抗STM 217单克隆抗体涂布，原因在于这些蛋白质不同的处为单一氨基
酸(STM 217中的丝氨酸-20，STM 434中的苏氨酸-20)。依序向各孔中添加样品或对照物，随
后为针对人类ActR2B产生的生物素化单克隆抗体，随后为中性链亲和素-辣根过氧化酶
(HRP)结合物。存在于样品中的STM 434结合到经固定的捕捉抗体和生物素化二次抗体，且
中性链亲和素-HRP经由抗生素蛋白对生物素的高亲和性而结合此复合物。复合物的HRP部
分催化发色受质四甲基联苯胺(TMB)转化为吸收450nm光的产物。确认样品的身分，其信杂
比(等于样品的背景校正A450除以空白孔的背景校正A450)不小于10.0。
酸(STM 217中的丝氨酸-20，STM 434中的苏氨酸-20)。依序向各孔中添加样品或对照物，随
后为针对人类ActR2B产生的生物素化单克隆抗体，随后为中性链亲和素-辣根过氧化酶
(HRP)结合物。存在于样品中的STM 434结合到经固定的捕捉抗体和生物素化二次抗体，且
中性链亲和素-HRP经由抗生素蛋白对生物素的高亲和性而结合此复合物。复合物的HRP部
分催化发色受质四甲基联苯胺(TMB)转化为吸收450nm光的产物。确认样品的身分，其信杂
比(等于样品的背景校正A450除以空白孔的背景校正A450)不小于10.0。
[0654] 当ELISA确认蛋白质身分(例如相对于阳性对照物来说)时，一种蛋白质在指定时间点和温度下视为与所述蛋白质在零时(TO)或相同蛋白质在其它相同条件下、在-70℃具
有相等稳定性。指定蛋白质在指定时间点时的稳定性百分比还可相对于通过ELISA所测定
的450nm数值来计算。
有相等稳定性。指定蛋白质在指定时间点时的稳定性百分比还可相对于通过ELISA所测定
的450nm数值来计算。
[0655] 基于细胞的生物分析(生物分析)
[0656] STM 434注射液的效能是使用C2C12 pMARE纯系#44骨骼肌细胞株、在报道基因表达分析中进行测量。鼠类C2C12细胞经人类肌肉生长抑制素/活化素反应荧光素酶构筑体稳
定转染。当经工程改造的细胞株与配位体肌肉生长抑制素一起培育时，肌肉生长抑制素结
合到活化素受体之后发生信号转导。此引起荧光素酶报道基因活化和荧光素酶的随后产
生。荧光素酶与荧光素的反应产生发光，用亮度计测量。STM 434以剂量依赖性方式抑制此
信号传导。使用4参数曲线拟合模型分析数据。一旦与参考曲线的平行性/相似性确立，则根
据曲线内推生物浓度且计算样品相对于参考标准物的相对效能。
定转染。当经工程改造的细胞株与配位体肌肉生长抑制素一起培育时，肌肉生长抑制素结
合到活化素受体之后发生信号转导。此引起荧光素酶报道基因活化和荧光素酶的随后产
生。荧光素酶与荧光素的反应产生发光，用亮度计测量。STM 434以剂量依赖性方式抑制此
信号传导。使用4参数曲线拟合模型分析数据。一旦与参考曲线的平行性/相似性确立，则根
据曲线内推生物浓度且计算样品相对于参考标准物的相对效能。
[0657] 当生物分析显示60至140％的相对效能时，一种蛋白质在指定时间点和温度下视为与所述蛋白质在零时(T0)或相同蛋白质在其它相同条件下、在-70℃具有相等稳定性或
活性。指定蛋白质在指定时间点的稳定性或活性百分比还可相对于此数值计算。
活性。指定蛋白质在指定时间点的稳定性或活性百分比还可相对于此数值计算。
[0658] 内毒素
[0659] 用于量化STM 434注射液中的细菌内毒素的方法是使用动力学发色内毒素检测系统。制备适于系统的内毒素标准物、STM 434样品和外加有内毒素标准物的STM 434样品的
系列稀释液，且与适于系统的水(作为空白参照物)一起装载至96孔盘中。在37℃培育盘10
分钟之后，向孔中添加含有经对硝基苯胺(pNA)标记的肽的鲎变形细胞溶菌液(LAL)试剂。
存在于样品和标准物中的内毒素使LAL中的前酶转化为活性酶，所述活性酶使pNA与无色肽
分裂而在405nm吸光度(A405)下产生信号。对内毒素标准物所产生的A405作图以产生标准
曲线，且根据标准曲线，利用其A405读数确定STM 434样品中的内毒素含量。测定各样品的
EU/mL且除以样品中的蛋白质浓度(mg/mL)之后，依据每毫克的内毒素单位(EU/m功来报道
结果。
系列稀释液，且与适于系统的水(作为空白参照物)一起装载至96孔盘中。在37℃培育盘10
分钟之后，向孔中添加含有经对硝基苯胺(pNA)标记的肽的鲎变形细胞溶菌液(LAL)试剂。
存在于样品和标准物中的内毒素使LAL中的前酶转化为活性酶，所述活性酶使pNA与无色肽
分裂而在405nm吸光度(A405)下产生信号。对内毒素标准物所产生的A405作图以产生标准
曲线，且根据标准曲线，利用其A405读数确定STM 434样品中的内毒素含量。测定各样品的
EU/mL且除以样品中的蛋白质浓度(mg/mL)之后，依据每毫克的内毒素单位(EU/m功来报道
结果。
[0660] 当内毒素含量为≤0.5个内毒素单位(EU)/毫克时，一种蛋白质在指定时间点和温度下视为与所述蛋白质在零时(T0)或相同蛋白质在其它相同条件下、在-70℃具有相等稳
定性。指定蛋白质在指定时间点的稳定性百分比还可相对于此数值计算。
定性。指定蛋白质在指定时间点的稳定性百分比还可相对于此数值计算。
[0661] 无菌性
[0662] 测定STM 434注射液的无菌性的方法是使用膜过滤技术滞留测试对象中的任何微生物。
[0663] 当产物无菌性满足美国药典的要求时，一种蛋白质在指定时间点和温度下视为与所述蛋白质在零时(T0)或相同蛋白质在其它相同条件下、在-70℃具有相等稳定性。指定蛋
白质在指定时间点的稳定性百分比还可相对于美国药典所提供的数值计算。
白质在指定时间点的稳定性百分比还可相对于美国药典所提供的数值计算。
[0664] 显微(Subvisible)颗粒
[0665] 存在于STM 434注射液中的显微颗粒的量是使用遮光法测定。结果是以直径为10μm或大于10μm和直径为25μm或大于25μm的颗粒数目报道。
[0666] 当每个容器中存在不超过6,000个≥10μm颗粒且每个容器中存在不超过600个≥25μm颗粒时，一种蛋白质在指定时间点和温度下视为与所述蛋白质在零时(T0)或相同蛋白
质在其它相同条件下、在-70℃具有相等稳定性。指定蛋白质在指定时间点的稳定性百分比
还可相对于这些数值计算。
质在其它相同条件下、在-70℃具有相等稳定性。指定蛋白质在指定时间点的稳定性百分比
还可相对于这些数值计算。
[0667] 聚山梨醇酯20浓度
[0668] STM 434注射液中的聚山梨醇酯20(PS20)浓度是通过一种使用混合模式HPLC管柱运作的方法测定，所述管柱以逆相模式运作以将PS20与蛋白质分离，定量检测是由电雾式
检测器(charged aerosol detection；CAD)进行。PS20标准物的依序注射得到基于基线校
正CAD反应与PS20浓度的关系的校准曲线，将其拟合二阶多项式。STM 434样品的PS20浓度
报道值是通过将其基线校正CAD反应输入多项式方程式且对PS20浓度求解来测定。
检测器(charged aerosol detection；CAD)进行。PS20标准物的依序注射得到基于基线校
正CAD反应与PS20浓度的关系的校准曲线，将其拟合二阶多项式。STM 434样品的PS20浓度
报道值是通过将其基线校正CAD反应输入多项式方程式且对PS20浓度求解来测定。
[0669] 当聚山梨醇酯20浓度为0.006±0.003％(w/v)时，一种蛋白质在指定时间点和温度下视为与所述蛋白质在零时(T0)或相同蛋白质在其它相同条件下、在-70℃具有相等稳
定性。指定蛋白质在指定时间点的稳定性百分比还可相对于此数值计算。
定性。指定蛋白质在指定时间点的稳定性百分比还可相对于此数值计算。
[0670] 结果
[0671] 下表(表18-39)显示使用上文方法所产生的经配制STM 434稳定性相关性数据，这些数据至少部分地在指定时间点和指定条件下产生。
[0672] 表18显示在5℃保存长达54月的经配制434的所测试特征类似于在-70℃保存长达54个月的经配制434。表22显示在5℃保存长达6个月的经配制434的所测试特征类似于在5
℃保存0个月的经配制434的所测试特征。表25和表30显示在2-8℃保存长达12个月的经配
制434的所测试特征类似于在2-8℃保存0个月的经配制434的所测试特征。表36显示经配制
434以直立位置在2-8℃保存长达6个月的所测试特征类似于以直立位置在2-8℃保存0个月
的所测试特征。表37显示经配制434以倒置位置在2-8℃保存长达6个月的所测试特征类似
于经配制434以倒置位置在2-8℃保存0个月的所测试特征。
℃保存0个月的经配制434的所测试特征。表25和表30显示在2-8℃保存长达12个月的经配
制434的所测试特征类似于在2-8℃保存0个月的经配制434的所测试特征。表36显示经配制
434以直立位置在2-8℃保存长达6个月的所测试特征类似于以直立位置在2-8℃保存0个月
的所测试特征。表37显示经配制434以倒置位置在2-8℃保存长达6个月的所测试特征类似
于经配制434以倒置位置在2-8℃保存0个月的所测试特征。
[0673] 此数据表明经配制STM 434在冷藏温度(例如2-8℃(2、3、4、5、6、7、8℃)；5℃)下且甚至在高浓度(如70mg/mL)下保持长达54个月的高度稳定。此稳定性程度远大于蛋白质在4℃保存的预期稳定性，预期稳定性典型地在1个月范围内。参见《皮尔斯技术资源TR0043.1
(Pierce Technical Resource TR0043.1)》，蛋白质稳定性和储存(Protein Stability
and Storage)，表1(http：//sites.bio.indiana.edu/～chenlab/protocol_files/
protein_storage.pdf)；和韦伯斯特(Webster)等人，预测治疗蛋白质的长期储存稳定性
(Predicting Long-Term Storage Stability of Therapeutic Proteins)，《制药技术
(Pharmaceutical Technology)》，第37卷，第11期(2013年11月2日)。因此，经配制STM 434为高度稳定的组合物，其在冷藏温度(例如2-8℃)下可储存大于1个月的延长时间段，例如
长达3、6、12、18、24、36、48或54个月或超过54个月。
(Pierce Technical Resource TR0043.1)》，蛋白质稳定性和储存(Protein Stability
and Storage)，表1(http：//sites.bio.indiana.edu/～chenlab/protocol_files/
protein_storage.pdf)；和韦伯斯特(Webster)等人，预测治疗蛋白质的长期储存稳定性
(Predicting Long-Term Storage Stability of Therapeutic Proteins)，《制药技术
(Pharmaceutical Technology)》，第37卷，第11期(2013年11月2日)。因此，经配制STM 434为高度稳定的组合物，其在冷藏温度(例如2-8℃)下可储存大于1个月的延长时间段，例如
长达3、6、12、18、24、36、48或54个月或超过54个月。
[0674] 表18：434 DP/DS稳定性样品测试结果
[0675]
[0676]
[0677] 表19：STM 434注射液批次0010036965稳定性数据概述：-70℃
[0678]
[0679] CL＝无色；SY＝微黄色；HMW＝高分子量；LMW＝低分子量
[0680] 表20：STM 434注射液批次0010036965稳定性数据概述：-20℃
[0681]
[0682] CL＝无色；SY＝微黄色；HMW＝高分子量；LMW＝低分子量；N.S.＝未预定
[0683] 表21：STM 434注射液批次0010036965稳定性数据概述：5次冷冻/解冻
[0684]
[0685]
[0686] CL＝无色；SY＝微黄色；HMW＝高分子量；LMW＝低分子量
[0687] 表22：STM 434注射液批次0010036965稳定性数据概述：5℃
[0688]
[0689] CL＝无色；SY＝微黄色；HMW＝高分子量；LMW＝低分子量；N.S.＝未预定
[0690] 表23：STM 434注射液批次0010036965稳定性数据概述：25℃
[0691]
[0692]
[0693] CL＝无色；SY＝微黄色；HMW＝高分子量；LMW＝低分子量；N.S.＝未预定
[0694] 表24：STM 434注射液批次EG-13-0150稳定性数据概述：-20℃(SPN-643)
[0695]
[0696]
[0697] CLR L＝透明液体；CL＝无色；LY＝淡黄色；EFOP＝基本上不含颗粒；NVP＝无可见颗粒；HMW＝高分子量；LMW＝低分子量；APG＝酸性峰组；BPG＝碱性峰组；N.D.＝未检测到；
N.S.＝未预定；NDDI＝无可检测的染料渗入
N.S.＝未预定；NDDI＝无可检测的染料渗入
[0698] *三个因偏差所致的报道值(分析者执行三次注射；方法需要一次)
[0699] 表25：STM 434注射液批次EG-13-0150稳定性数据概述：2-8℃(SPN-644)
[0700]
[0701]
[0702] CLR L＝透明液体；CL＝无色；LY＝淡黄色；EFOP＝基本上不含颗粒；NVP＝无可见颗粒；HMW＝高分子量；LMW＝低分子量；APG＝酸性峰组；BPG＝碱性峰组；N.D.＝未检测到；
N.S.＝未预定；NDDI＝无可检测的染料渗入
N.S.＝未预定；NDDI＝无可检测的染料渗入
[0703] *三个因偏差所致的报道值(分析者执行三次注射；方法需要一次)
[0704] 表26：STM 434注射液批次EG-13-0150稳定性数据概述：25℃
[0705]
[0706] CLR L＝透明液体；CL＝无色；LY＝淡黄色；EFOP＝基本上不含颗粒；NVP＝无可见颗粒；HMW＝高分子量；LMW＝低分子量；APG＝酸性峰组；BPG＝碱性峰组；N.D.＝未检测到
[0707] 表27：STM 434注射液批次EG-13-0150稳定性数据概述：5次冷冻/解冻
[0708]
[0709] CLR L＝透明液体；CL＝无色；LY＝淡黄色；EFOP＝基本上不含颗粒；NVP＝无可见颗粒；HMW＝高分子量；LMW＝低分子量；APG＝酸性峰组；BPG＝碱性峰组；N.D.＝未检测到
[0710] 表28：STM 434注射液批次FG-13-0230稳定性数据概述：-70℃(SPN-657)
[0711]
[0712]
[0713] CLR L＝透明液体；CL＝无色；LY＝淡黄色；EFOP＝基本上不含颗粒；NVP＝无可见颗粒；HMW＝高分子量；LMW＝低分子量；APG＝酸性峰组；BPG＝碱性峰组；N.D.＝未检测到；
N.S.＝未预定
N.S.＝未预定
[0714] 表29：STM 434注射液批次FG-13-0230稳定性数据概述：-20℃(SPN-648)
[0715]
[0716]
[0717] CLR L＝透明液体；CL＝无色；LY＝淡黄色；EFOP＝基本上不含颗粒；NVP＝无可见颗粒；HMW＝高分子量；LMW＝低分子量；APG＝酸性峰组；BPG＝碱性峰组；N.D.＝未检测到；
N.S.＝未预定
N.S.＝未预定
[0718] 表30：STM 434注射液批次FG-13-0230稳定性数据概述：2-8℃(SPN-649)
[0719]
[0720] CLR L＝透明液体；CL＝无色；LY＝淡黄色；EFOP＝基本上不含颗粒；NVP＝无可见颗粒；HMW＝高分子量；LMW＝低分子量；APG＝酸性峰组；BPG＝碱性峰组；N.D.＝未检测到；
N.S.＝未预定
N.S.＝未预定
[0721] 表31：STM 434注射液批次FG-13-0230稳定性数据概述：25℃(SPN-650)
[0722]
[0723] CLR L＝透明液体；CL＝无色；LY＝淡黄色；EFOP＝基本上不含颗粒；NVP＝无可见颗粒；HMW＝高分子量；LMW＝低分子量；APG＝酸性峰组；BPG＝碱性峰组；N.D.＝未检测到；
N.S.＝未预定
N.S.＝未预定
[0724] 表32：STM 434注射液批次FG-14-0056稳定性数据概述：-20℃(SPN-654)
[0725]
[0726]
[0727] CLR L＝透明液体；CL＝无色；LY＝淡黄色；EFOP＝基本上不含颗粒；NVP＝无可见颗粒；HMW＝高分子量；LMW＝低分子量；APG＝酸性峰组；BPG＝碱性峰组；N.D.＝未检测到；
N.S.＝未预定
N.S.＝未预定
[0728] 表33：STM 434注射液批次FG-14-0056稳定性数据概述：2-8℃(SPN-655)
[0729]
[0730]
[0731] CLR L＝透明液体；CL＝无色；LY＝淡黄色；EFOP＝基本上不含颗粒；NVP＝无可见颗粒；HMW＝高分子量；LMW＝低分子量；APG＝酸性峰组；BPG＝碱性峰组；N.D.＝未检测到；
N.S.＝未预定
N.S.＝未预定
[0732] 表34：STM 434注射液批次FG-14-0056稳定性数据概述：25℃(SPN-656)
[0733]
[0734] CLR L＝透明液体；CL＝无色；LY＝淡黄色；EFOP＝基本上不含颗粒；NVP＝无可见颗粒；HMW＝高分子量；LMW＝低分子量；APG＝酸性峰组；BPG＝碱性峰组；N.D.＝未检测到；
N.S.＝未预定
N.S.＝未预定
[0735] 表35：STM 434注射液批次FG-14-0109稳定性数据概述：-20℃直立(SPN-676)
[0736]
[0737]
[0738] CLR L＝透明液体；CL＝无色；LY＝淡黄色；EFOP＝基本上不含颗粒；NVP＝无可见颗粒；HMW＝高分子量；LMW＝低分子量；APG＝酸性峰组；BPG＝碱性峰组；N.D.＝未检测到；
N.S.＝未预定
N.S.＝未预定
[0739] 表36：STM 434注射液批次FG--14-0109稳定性数据概述：2-8℃直立(SPN-677)
[0740]
[0741]
[0742] CLR L＝透明液体；CL＝无色；LY＝淡黄色；EFOP＝基本上不含颗粒；NVP＝无可见颗粒；HMW＝高分子量；LMW＝低分子量；APG＝酸性峰组；BPG＝碱性峰组；N.D.＝未检测到；
N.S.＝未预定
N.S.＝未预定
[0743] 表37：STM 434注射液批次FG--14-0109稳定性数据概述：2-8℃倒置(SPN-678)
[0744]
[0745] CLR L＝透明液体；CL＝无色；LY＝淡黄色；EFOP＝基本上不含颗粒；NVP＝无可见颗粒；HMW＝高分子量；LMW＝低分子量；APG＝酸性峰组；BPG＝碱性峰组；N.D.＝未检测到；
N.S.＝未预定
N.S.＝未预定
[0746] 表38：STM 434注射液批次FG-14-0109稳定性数据概述：25℃直立(SPN-679)
[0747]
[0748] CLR L＝透明液体；CL＝无色；LY＝淡黄色；EFOP＝基本上不含颗粒；NVP＝无可见颗粒；HMW＝高分子量；LMW＝低分子量；APG＝酸性峰组；BPG＝碱性峰组；N.D.＝未检测到；
N.S.＝未预定；NDDI＝无可检测的染料渗入
N.S.＝未预定；NDDI＝无可检测的染料渗入
[0749] 表39：STM 434注射液批次FG-14-0109稳定性数据概述：25℃倒置(SPN-680)
[0750]
[0751]
[0752] CLR L＝透明液体；CL＝无色；LY＝淡黄色；EFOP＝基本上不含颗粒；NVP＝无可见颗粒；HMW＝高分子量；LMW＝低分子量；APG＝酸性峰组；BPG＝碱性峰组；N.D.＝未检测到；
N.S.＝未预定；NDDI＝无可检测的染料渗入
N.S.＝未预定；NDDI＝无可检测的染料渗入
[0753] 实例8：STM 434施用改变人体组成
[0754] 使用实例4中的上述方案选择用STM 434治疗的人类个体。个体为62岁非裔美国男性，其复发性乳头状肾细胞癌转移至对侧肾脏和骨盆淋巴结。其先前已接受使用托瑞索
(Torisel)、帕唑帕尼(Pazopanib)和研究性药剂(包括B7-H3 mAb、cMet抑制剂、CHK1抑制
剂、奥洛拉激酶抑制剂(Aurora kinase inhibitor)和重组人类介白素10)的8线抗肿瘤疗
法。
(Torisel)、帕唑帕尼(Pazopanib)和研究性药剂(包括B7-H3 mAb、cMet抑制剂、CHK1抑制
剂、奥洛拉激酶抑制剂(Aurora kinase inhibitor)和重组人类介白素10)的8线抗肿瘤疗
法。
[0755] STM 434配制物、包装和储存
[0756] STM 434配制为旨在静脉内施用的无菌水溶液，其含有70mg/mL STM 434、10mM磷酸钾缓冲液、8.8％(w/v)蔗糖和0.006％(w/v)聚山梨醇酯20，pH 6.7。使用13mm氟聚合物塞
子和13mm密封件将所配制的STM 434溶液封装于5mL玻璃瓶中。STM 434小瓶在非自由结霜
冷冻机中、在-20℃(±5℃)的温度下储存。使用之前，STM 434在冷冻机中、在2℃至8℃解冻
整夜。
子和13mm密封件将所配制的STM 434溶液封装于5mL玻璃瓶中。STM 434小瓶在非自由结霜
冷冻机中、在-20℃(±5℃)的温度下储存。使用之前，STM 434在冷冻机中、在2℃至8℃解冻
整夜。
[0757] STM 434施用和监测
[0758] 约每4周向个体静脉内施用0.25mg/kg STM 434(第2组)。
[0759] 2014年12月30日进行首次DXA扫描；2015年1月6日、2015年2月3日和2015年3月3日给药；2015年3月31日进行追踪DXA扫描。
[0760] 瘦体质量、四肢瘦肉质量和脂肪质量(内脏和皮下)相对于基线的变化
[0761] 约隔三个月获得多个身体组成测量结果，以评估STM 434对身体组成(例如肌肉和脂肪)的影响。瘦体质量、四肢瘦肉质量和脂肪质量和脂肪分布(内脏和皮下)是通过DXA扫
描来测定。DXA扫描由现场放射医师进行分析且由中央放射学实验室使用IBIS(成像生物标
记信息系统)软件确认以确保精确的个体定位和机器校准。
描来测定。DXA扫描由现场放射医师进行分析且由中央放射学实验室使用IBIS(成像生物标
记信息系统)软件确认以确保精确的个体定位和机器校准。
[0762] 表40显示个体的测量结果。结果展现，STM 434在相对较低的剂量下治疗仅约3个月之后，瘦体质量发生实质性增加且脂肪质量发生实质性降低。
[0763]
[0764] 尽管本发明已参照优选实施例和多个替代实施例进行特定显示且描述，但应理解，在不背离本发明的精神和范畴的情况下，熟习相关技术者可对其中的形式和细节进行
各种变更。
各种变更。
[0765] 本说明书正文内引用的所有参考文献、所颁予专利和专利申请均以全文引用的方式并入本文中用于所有目的。
[0766] 序列
[0767]SEQ ID NO 描述
1 ActRIIB胞外域，聚核苷酸
2 ActRIIB胞外域，多肽
3 具有信号序列的svActRIIB(E28W、S44T)聚核苷酸
4 具有信号序列的svActRIIB(E28W、s44T)多肽
5 不具有信号序列的svActRIIB(E28W、S44T)聚核苷酸
6 不具有信号序列的svActRIIB(E28W、S44T)多肽
7 具有信号序列的svActRIIB-Fc(E28W、S44T)聚核苷酸
8 具有信号序列的svActRIIB-Fc(E28W、S44T)多肽
9 不具有信号序列的svActRIIB-Fc(E28W、S44T)聚核苷酸
10 不具有信号序列(STM 434)的svActRIIB-Fc(E28W、S44T)多肽
11 具有信号序列的svActRIIB(E28Y、S44T)聚核苷酸
12 具有信号序列的svActRIIB(E28Y、S44T)多肽
13 不具有信号序列的svActRIIB(E28Y、S44T)聚核苷酸
14 不具有信号序列的svActRIIB(E28Y、S44T)多肽
15 具有信号序列的svActRIIB-Fc(E28Y、S44T)聚核苷酸
16 具有信号序列的svActRIIB-Fc(E28Y、S44T)多肽
17 不具有信号序列的svActRIIB-Fc(E28Y、S44T)聚核苷酸
18 不具有信号序列的svActRIIB-Fc(E28Y、S44T)多肽
19 不具有信号序列的ActRIIB(E28W)多肽
20 不具有信号序列的ActRIIB-Fc(E28W)聚核苷酸
21 不具有信号序列的ActRIIB-Fc(E28W)多肽
22 IgG2Fc多肽序列
23 IgG1Fc多肽序列
24 IgG4 Fc多肽序列
25 连接子氨基酸序列
26 铰链连接子#1聚核苷酸序列
27 铰链连接子#1肽序列
1 ActRIIB胞外域，聚核苷酸
2 ActRIIB胞外域，多肽
3 具有信号序列的svActRIIB(E28W、S44T)聚核苷酸
4 具有信号序列的svActRIIB(E28W、s44T)多肽
5 不具有信号序列的svActRIIB(E28W、S44T)聚核苷酸
6 不具有信号序列的svActRIIB(E28W、S44T)多肽
7 具有信号序列的svActRIIB-Fc(E28W、S44T)聚核苷酸
8 具有信号序列的svActRIIB-Fc(E28W、S44T)多肽
9 不具有信号序列的svActRIIB-Fc(E28W、S44T)聚核苷酸
10 不具有信号序列(STM 434)的svActRIIB-Fc(E28W、S44T)多肽
11 具有信号序列的svActRIIB(E28Y、S44T)聚核苷酸
12 具有信号序列的svActRIIB(E28Y、S44T)多肽
13 不具有信号序列的svActRIIB(E28Y、S44T)聚核苷酸
14 不具有信号序列的svActRIIB(E28Y、S44T)多肽
15 具有信号序列的svActRIIB-Fc(E28Y、S44T)聚核苷酸
16 具有信号序列的svActRIIB-Fc(E28Y、S44T)多肽
17 不具有信号序列的svActRIIB-Fc(E28Y、S44T)聚核苷酸
18 不具有信号序列的svActRIIB-Fc(E28Y、S44T)多肽
19 不具有信号序列的ActRIIB(E28W)多肽
20 不具有信号序列的ActRIIB-Fc(E28W)聚核苷酸
21 不具有信号序列的ActRIIB-Fc(E28W)多肽
22 IgG2Fc多肽序列
23 IgG1Fc多肽序列
24 IgG4 Fc多肽序列
25 连接子氨基酸序列
26 铰链连接子#1聚核苷酸序列
27 铰链连接子#1肽序列
[0768]
[0769]
[0770]
[0771]
[0772]
| 标题 | 发布/更新时间 | 阅读量 |
|---|---|---|
| 电泳沉积法制备结构色ITO的方法 | 2020-05-12 | 334 |
| 电泳沉积装置及其采用电泳沉积法制备薄膜的方法 | 2020-05-11 | 210 |
| 电泳沉积法制备石墨烯透明导电薄膜 | 2020-05-12 | 202 |
| 一种电泳复合沉积制备铁电、介电厚膜的方法 | 2020-05-15 | 948 |
| 一种在水相中电泳沉积制备量子点薄膜的方法 | 2020-05-15 | 410 |
| 改进的电泳沉积 | 2020-05-11 | 538 |
| 一种用于制备四氧化三锰涂层的电泳液及电泳沉积工艺 | 2020-05-14 | 15 |
| 电泳沉积的阴极电容器 | 2020-05-11 | 535 |
| 一种减少电泳液沉积结渣的系统 | 2020-05-13 | 471 |
| 电泳沉积法制备结构色ITO的方法 | 2020-05-13 | 614 |
高效检索全球专利专利汇是专利免费检索,专利查询,专利分析-国家发明专利查询检索分析平台，是提供专利分析，专利查询，专利检索等数据服务功能的知识产权数据服务商。
我们的产品包含105个国家的1.26亿组数据，免费查、免费专利分析。
分析报告
专利汇分析报告产品可以对行业情报数据进行梳理分析，涉及维度包括行业专利基本状况分析、地域分析、技术分析、发明人分析、申请人分析、专利权人分析、失效分析、核心专利分析、法律分析、研发重点分析、企业专利处境分析、技术处境分析、专利寿命分析、企业定位分析、引证分析等超过60个分析角度，系统通过AI智能系统对图表进行解读，只需1分钟，一键生成行业专利分析报告。
QQ群二维码
意见反馈
意见反馈