一种检测氨苄青霉素的电化学生物传感器及其制备方法
阅读：894发布：2023-02-14
专利汇可以提供一种检测氨苄青霉素的电化学生物传感器及其制备方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种检测 氨 苄青霉素的电化学 生物 传感器 及其制备方法，所述电化学 生物传感器 ，包括： 电极 ，依次修饰在电极表面的纳米金、探针DNA和适配体DNA；所述探针DNA的序列如SEQ ID NO.1所示；所述适配体DNA的序列如SEQ ID NO.2所示。本发明利用纳米金良好的生物兼容性和 导电性 ，实现光电 信号 的扩增，提高氨苄青霉素的检测灵敏度。本发明的检测方法简单，实现了仪器小型化，且易于操作，仅对玻 碳 电极表面进行简单的处理，即可实现对氨苄青霉素的检测。，下面是一种检测氨苄青霉素的电化学生物传感器及其制备方法专利的具体信息内容。
1.一种检测氨苄青霉素的电化学生物传感器，其特征在于，包括：电极，依次修饰在电极表面的纳米金、探针DNA和适配体DNA；
所述探针DNA的序列如SEQ ID NO.1所示，探针DNA的5′端修饰有巯基；所述适配体DNA的序列如SEQ ID NO.2所示。
2.根据权利要求1所述的电化学生物传感器，其特征在于，所述电极为玻碳电极，直径为1-3mm。
3.权利要求1或2所述的电化学生物传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)对电极进行预处理；
(2)将纳米金修饰到预处理后的电极表面；
(3)通过探针DNA端位的巯基与纳米金之间的Au-S键合作用，将探针DNA修饰于步骤(2)处理后的电极表面；
(4)基于DNA杂交，将适配体DNA修饰于步骤(3)处理后的电极表面，即制备得到电化学生物传感器。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，电极预处理的方法为：将电极用30-100nm的三氧化二铝浆液打磨，再用100-300目的三氧化二铝浆液打磨；然后分别在去离子水和乙醇中超声清洗10-30分钟，氮气吹干。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，将纳米金修饰到预处理后的电极表面的方法为：将预处理后的电极浸入HAuCl4和KNO3混合溶液中，运用恒电位沉积技术，在搅拌条件下电沉积150-400秒；然后，将电极清洗3-5次，氮气吹干。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述HAuCl4和KNO3混合溶液中，HAuCl4的浓度为1.2-4.8mM，KNO3的浓度为0.05-0.3M。
7.权利要求1或2所述的电化学生物传感器在检测氨苄青霉素的应用。
8.一种利用权利要求1或2所述的电化学生物传感器检测氨苄青霉素的方法，包括以下步骤：
(1)将含有不同浓度氨苄青霉素的缓冲液滴加到权利要求1或2所述的电化学生物传感器表面，于室温和潮湿条件下反应2-4h；然后滴加含有DpnII核酸内切酶的缓冲液，于25-40℃和潮湿条件下反应2-4小时；再滴加含有核酸外切酶III的缓冲液，于25-40℃和潮湿条件下反应2-4小时；
(2)将步骤(1)处理后的电化学生物传感器作为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极、Pt丝为辅助电极组成三电极系统进行电化学信号检测，检测液为含有0.08-0.24M的铁氰化钾和0.03-0.17M KCl的磷酸盐缓冲溶液(pH为6.4-8.0)，建立电流与氨苄青霉素浓度之间的关系，对样品中氨苄青霉素含量进行检测。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所用检测方法为示差脉冲伏安法，电压扫描范围为为-0.8–0.8V。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述磷酸盐缓冲溶液的浓度为4.8-
12.4mM。
一种检测氨苄青霉素的电化学生物传感器及其制备方法
技术领域
背景技术
[0002] 氨苄青霉素为半合成的广谱青霉素，抗菌机制是阻止细菌的细胞壁合成，故不仅能抑制其增殖，而且能直接杀灭细菌。对革兰阳性菌的作用与青霉素近似，对草绿色链球菌和肠球菌的作用较优，对其他菌的作用则较差，对耐青霉素的金黄色葡萄球菌无效。革兰阴性菌中淋球菌、脑膜炎球菌、流感杆菌、百日咳杆菌、大肠埃希菌、伤寒与副伤寒杆菌、痢疾杆菌、奇异变形杆菌、布氏杆菌等对本品敏感，但易产生耐药性。肺炎杆菌、吲哚阳性变形杆菌、铜绿假单胞菌对本品不敏感。然而在畜牧业中滥用氨苄青霉素造成的食品和农产品中的药物残留以及由于这些残留引发的疾病，如：过敏反应，呼吸困难和癫痫发作等。因此，确定食品及农产品中的氨苄青霉素的残留量已经变得至关重要。目前包括美国食品和药物管理局(FDA)，食品添加剂联合委员会(JECFA)，日本健康与福利等机构都建立了确定食品中氨苄青霉素是否超标的检测体系。
[0003] 目前，主要用来检测氨苄青霉素的方法包括高效液相色谱法、高效液相色谱-质谱联用技术、表面增强拉曼技术、表面等离子体共振技术、荧光技术等。但是，这些方法有检测灵敏性低、检测特异性不强，检测成本高，仪器昂贵且操作复杂，需要专业操作人员等缺点，因此，建立简单、快捷、具有高灵敏性和高选择性的方法，实现对食品中氨苄青霉素的检测是十分必要和急迫的。
发明内容
[0004] 针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种检测氨苄青霉素的电化学生物传感器及其制备方法，实现对氨苄青霉素的快速、灵敏检测。
[0005] 为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
[0007] 所述探针DNA的序列如SEQ ID NO.1所示，探针DNA的5′端修饰有巯基；所述适配体DNA的序列如SEQ ID NO.2所示。具体如下：
[0008] 5′-SH-CCG CAT TAC AAC CGC CCG CGA TCA AAA AA-3′(SEQ ID NO.1)；
[0009] 5′-TTG ATC GCG GGC GGT TGT ATA GCG G-3′(SEQ ID NO.2)。
[0011] 本发明的第二方面，提供上述电化学生物传感器的制备方法，包括以下步骤：
[0012] (1)对电极进行预处理；
[0013] (2)将纳米金修饰到预处理后的电极表面；
[0014] (3)通过探针DNA端位的巯基与纳米金之间的Au-S键合作用，将探针DNA修饰于步骤(2)处理后的电极表面；
[0015] (4)基于DNA杂交，将适配体DNA修饰于步骤(3)处理后的电极表面，即制备得到电化学生物传感器。
[0016] 优选的，步骤(1)中，电极预处理的方法为：将电极用30-100nm的三氧化二铝浆液打磨，再用100-300目的三氧化二铝浆液打磨；然后分别在去离子水和乙醇中超声清洗10-30分钟，氮气吹干。
[0017] 优选的，步骤(2)中，将纳米金修饰到预处理后的电极表面的方法为：将预处理后的电极浸入HAuCl4和KNO3混合溶液中，运用恒电位沉积技术，在搅拌条件下电沉积150-400秒；然后，将电极清洗3-5次，氮气吹干。
[0018] 更优选的，所述HAuCl4和KNO3混合溶液中，HAuCl4的浓度为1.2-4.8mM，KNO3的浓度为0.05-0.3M。
[0019] 上述电化学生物传感器在检测氨苄青霉素的应用也是本发明的保护范围。
[0020] 本发明的第三方面，提供一种利用上述电化学生物传感器检测氨苄青霉素的方法，包括以下步骤：
[0021] (1)将含有不同浓度氨苄青霉素的缓冲液滴加到上述电化学生物传感器表面，于室温和潮湿条件下反应2-4h；然后滴加含有DpnII核酸内切酶的缓冲液，于25-40℃和潮湿条件下反应2-4小时；再滴加含有核酸外切酶III的缓冲液，于25-40℃和潮湿条件下反应2-4小时；
[0022] (2)将步骤(1)处理后的电化学生物传感器作为工作电极，饱和甘汞电极(SCE)为参比电极、Pt丝为辅助电极组成三电极系统进行电化学信号检测，检测液为含有0.08-0.24M的铁氰化钾和0.03-0.17M KCl的磷酸盐缓冲溶液(pH为6.4-8.0)，建立电流与氨苄青霉素浓度之间的关系，对样品中氨苄青霉素含量进行检测。
[0024] 优选的，所述磷酸盐缓冲溶液的浓度为4.8-12.4mM。
[0025] 本发明的有益效果：
[0027] (2)本发明的检测方法简单，实现了仪器小型化，且易于操作，仅对玻碳电极表面进行简单的处理，即可实现对氨苄青霉素的检测。
[0029] 图1：本发明的氨苄青霉素检测的原理图。
[0030] 图2：不同浓度的氨苄青霉素的电化学响应曲线；曲线a-g代表的浓度分别为1000、100、10、1、0.1、0.01、0.001nM的组蛋白乙酰转移酶。
[0031] 图3：电流与氨苄青霉素浓度的线性拟合曲线。
[0032] 图4：不同抗生素件下的电化学响应变化的柱状图。
具体实施方式
[0033] 应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
[0034] 本发明中的“室温”的范围为20-30℃。
[0035] 本发明中的“潮湿条件”为湿度大于80％；优选湿度为85-99％。
[0036] 本发明中所使用的清洗液的成分为：3-15mMTris-HCl和10-70mMKCl，pH 7.4。
[0037] 本发明中所使用的探针DNA的探针固定缓冲液的成分为：5-15mM Tris-HCl、0.35-1.25mM EDTA、0.58-1.58M NaCl、0.65-1.87mM TCEP、pH 7.4。
[0038] 本发明中所使用的适配体DNA的固体缓冲液的成分为：5-15mM Tris–HCl、20-80mM NaCl、0.25-1.69mM MgCl2、1.25-8.85mM KCl、pH 7.4。
[0039] 本发明中所使用的氨苄青霉素的缓冲液的成分为：2-12mM Tris-HCl和10-50mM NaCl，pH 7.4。
[0040] 本发明中所使用的DpnII的缓冲液成分为：50-200mM NaCl、10-50mMTris-HCl、10-60mM MgCl2、50-200μg/ml BSA、pH 7.9。
[0041] 本发明中所使用的核酸外切酶III的缓冲液成分为：5-12mM BisTris propane-HCl、3-14mM MgCl2、0.8-3.2mM二硫苏糖醇、pH 7.0。
[0042] 正如背景技术部分所介绍的，现有技术中氨苄青霉素的检测方法存在一定的不足，基于此，本发明构建了一种检测氨苄青霉素的电化学生物传感器。
[0043] 本发明的电化学生物传感器构建和检测的原理图见图1。利用纳米金修饰的玻碳电极作为基体电极，通过探针DNA端位的巯基与纳米金之间的Au-S键合作用，将探针DNA修饰于电极表面。然后，基于DNA杂交，将与探针DNA互补的适配体DNA修饰于电极表面，形成双链DNA。为防止此状态下双链DNA被核酸外切酶III水解，设计探针DNA序列长于适配体DNA且形成3’末端突出4个碱基，可以保证在此情况下不被核酸外切酶III水解。由于探针DNA与适配体DNA形成的双链DNA(dsDNA)上含有DpnII核酸内切酶的位点，dsDNA可被DpnII切割，在电极表面产生3’凹陷的dsDNA片段，其可继续被核酸外切酶III水解，将DNA从电极表面释放。由于电极表面的DNA减少，导致电极的界面阻抗减小，电极的电化学信号明显增强。在氨苄青霉素存在条件下，其可与适配体DNA形成稳定的结合物，将适配体从dsDNA双螺旋释放出来，使得留在电极表面的探针DNA不能被DpnII和核酸外切酶III水解，导致电极的界面阻抗增大，电极的电化学信号降低。基于氨苄青霉素的浓度与电化学信号的线性关系，可实现对氨苄青霉素的灵敏检测。
[0044] 在本发明的一个实施方案中，给出的电化学生物传感器的构建过程为：
[0045] (1)玻碳电极预处理：将玻碳电极用30-100nm的三氧化二铝浆液打磨，再用100-300目的三氧化二铝浆液打磨。然后，将玻碳电极分别在去离子水和乙醇中超声清洗10-30分钟。氮气吹干。
[0046] (2)纳米金的修饰：将预处理的玻碳电极浸入10mL 1.2-4.8mM HAuCl4和0.05-0.3MKNO3混合溶液中，运用恒电位沉积技术(电位为-0.4-0.2V)，在磁力搅拌下电沉积150-
400秒。然后，将电极用清洗液清洗3-5次。氮气吹干。制备的电极标记为AuNPs/GCE。
400秒。然后，将电极用清洗液清洗3-5次。氮气吹干。制备的电极标记为AuNPs/GCE。
[0047] (3)探针DNA的修饰：将2-12μL含有0.2-1.8μM的探针DNA的探针固定缓冲液滴加到AuNPs/GCE电极表面，室温和潮湿条件下反应8-16小时，用清洗液清洗3-6次。电极标记为：ssDNA/AuNPs/GCE。
[0048] (4)适配体DNA的杂交：将2-12μL含有0.2-1.8μM的适配体DNA的固定缓冲液滴加到ssDNA/AuNPs/GCE电极表面，于25-40℃和潮湿条件下反应2-4小时，用清洗液清洗3-6次。电极标记为：dsDNA/AuNPs/GCE。
[0049] 上述电化学生物传感器的构建过程中，各步骤相辅相成，顺序是严格限定的，每一步都为下一步的固定修饰服务，缺少上一步，可能会导致后面的修饰失败。
[0050] 在本发明的另一个实施方案中，给出了采用上述电化学生物传感器检测氨苄青霉素的过程为：
[0051] (1)将含有不同浓度的氨苄青霉素的缓冲液滴加到dsDNA/AuNPs/GCE电极表面，孵育，然后将电极用DpnII和核酸外切酶III处理；
[0052] (2)进行电化学检测，建立光电流和氨苄青霉素浓度的关系，利用该关系式对待测样品中的氨苄青霉素的含量进行检测。
[0053] 具体的，步骤(1)的处理过程为：
[0054] 将2-12μL含有不同浓度氨苄青霉素的缓冲液滴加到dsDNA/AuNPs/GCE电极表面，于室温和潮湿条件下反应2-4小时，用清洗液清洗3-6次。电极标记为：dsDNA-AP/AuNPs/GCE。
[0055] 将2-12μL含有75-163unit/mL DpnII的缓冲液滴加到dsDNA-AP/AuNPs/GCE电极表面，于25-40℃和潮湿条件下反应2-4小时，用清洗液清洗3-6次。电极标记为：dsDNA-AP-DpnII/AuNPs/GCE。然后，将2-12μL含有145-302unit/mL核酸外切酶III的缓冲液滴加到dsDNA-AP-DpnII/AuNPs/GCE电极表面，于25-40℃和潮湿条件下反应2-4小时，用清洗液清洗3-6次。电极标记为：dsDNA-AP-DpnII-ExoIII/AuNPs/GCE。
[0056] 具体的，步骤(2)的处理过程为：
[0057] 以dsDNA-AP-DpnII-ExoIII/AuNPs/GCE为工作电极、饱和甘汞电极(SCE)为参比电极、Pt丝为辅助电极组成三电极系统进行电化学信号检测，所用检测方法为示差脉冲伏安法(DPV)，应用电压为-0.2–0.6V，检测液为含有0.08-0.24M的铁氰化钾和0.03-0.17M KCl的4.8-12.4mM磷酸盐缓冲溶液(pH为6.4-8.0)。
[0058] 随着氨苄青霉素浓度的增加，电极表面剩余的探针DNA数量也随之增大，导致电极表面的阻抗增大，引起电化学信号的降低。根据氨苄青霉素浓度与电流的线性关系，可实现对氨苄青霉素的检测。
[0059] 采用本发明的电化学生物传感器对氨苄青霉素的检测范围为1pM–1000nM，检测下限为1pM。相较于现有的电分析化学的方法检测氨苄青霉素，本发明的检测方法具有更宽的检测线性范围和更高的检测灵敏度。
[0060] 为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。
[0061] 本发明实施例中所用的未进行具体说明试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。
[0062] 实施例1：玻碳电极预处理
[0063] 将玻碳电极用30nm的三氧化二铝浆液打磨，再用200目的三氧化二铝浆液打磨。然后，将玻碳电极分别在去离子水和乙醇中超声清洗15分钟。氮气吹干。
[0064] 实施例2：纳米金的修饰
[0065] 将预处理的玻碳电极浸入10mL 3mM HAuCl4和0.1M KNO3混合溶液中，运用恒电位沉积技术(电位为-0.2V)，在磁力搅拌下电沉积200秒。然后，将电极用清洗液清洗3次。氮气吹干。制备的电极标记为AuNPs/GCE。
[0066] 实施例3：探针DNA的修饰
[0067] 将10μL含有1.0μM的探针DNA的探针固定缓冲液(10mM Tris-HCl、1.0mM EDTA、1.0M NaCl、1.0mM TCEP、pH 7.4)滴加到AuNPs/GCE电极表面，室温和潮湿条件下反应12小时，用清洗液清洗3次。电极标记为：ssDNA/AuNPs/GCE。
[0068] 实施例4：适配体DNA的杂交
[0069] 将10μL含有1.0μM的探针DNA的探针固定缓冲液(10mM Tris–HCl、50mM NaCl、1mM MgCl2、5mM KCl、pH 7.4)滴加到ssDNA/AuNPs/GCE电极表面，于37℃和湿度99％条件下反应3小时，用清洗液清洗3次。电极标记为：dsDNA/AuNPs/GCE。
[0070] 实施例5：氨苄青霉素温育
[0071] 将10μL含有不同浓度氨苄青霉素的缓冲液(10mM Tris-HCl和50mMNaCl，pH 7.4)滴加到dsDNA/AuNPs/GCE电极表面，于室温和湿度99％条件下反应2小时，用清洗液清洗3次。电极标记为：dsDNA-AP/AuNPs/GCE。
[0072] 实施例6：DpnII和核酸外切酶III温育
[0073] 将10μL含有100unit/mL DpnII的缓冲液(100mM NaCl、50mMTris-HCl、10mM MgCl2、100μg/ml BSA、pH 7.9)滴加到dsDNA-AP/AuNPs/GCE电极表面，于37℃和湿度99％条件下反应2小时，用清洗液清洗3次。电极标记为：dsDNA-AP-DpnII/AuNPs/GCE。然后，将10μL含有200unit/mL核酸外切酶III的缓冲液(10mM BisTris propane-HCl、10mM MgCl2、1mM二硫苏糖醇、pH 7.0)滴加到dsDNA-AP-DpnII/AuNPs/GCE电极表面，于37℃和湿度99％条件下反应2小时，用清洗液清洗3次。电极标记为：dsDNA-AP-DpnII-ExoIII/AuNPs/GCE。
[0074] 实施例7：电化学检测
[0075] 以dsDNA-AP-DpnII-ExoIII/AuNPs/GCE为工作电极、饱和甘汞电极(SCE)为参比电极、Pt丝为辅助电极组成三电极系统进行电化学信号检测，所用检测方法为示差脉冲伏安法(DPV)，应用电压为-0.2–0.6V，检测液为含有0.2M的铁氰化钾和0.1M KCl的10mM磷酸盐缓冲溶液(pH为7.4)。随着氨苄青霉素浓度的增加，电极表面剩余的探针DNA数量也随之增大，导致电极表面的阻抗增大，引起电化学信号的降低。根据氨苄青霉素浓度的对数与电流的线性关系，可实现对氨苄青霉素的检测。检测线性范围为0.001-1000nM，线性方程为Ipc(μA)＝-10.14logc(nM)+115.11(R＝0.9955)，根据线性范围的检测下限，可得到该方法的检测下限为1pM(图2和图3)。
[0076] 实施例8：检测选择性实验
[0077] 为了研究构建的传感器的特异性，12种物质(抗生素和三聚氰胺)被选择作为对比试剂，如氯霉素(chloramphenicol)、氟苯尼考(florfenicol)、甲砜霉素(thiamphenicol)、妥布霉素(tobramycin)、链霉素(streptomycin)、四环素(tetracycline)、卡那霉素(kanamycin)、氧四环素(oxytetracycline)、青霉素(penicillin)、阿莫西林(amoxicillin)、林可霉素(lincomycin)、三聚氰胺(melamine)。并对不同对比试剂参与构建的传感器的电流变化值(ΔI＝I1-I2，I1是sDNA/AuNPs/GCE电极经过DpnII和核酸外切酶III处理后的电流值，I2是dsDNA-AP-DpnII-ExoIII/AuNPs/GCE的电流值，对比试剂和氨苄青霉素的浓度均为10nM)进行了对比。结果表明，对比试剂参与构建传感器电流值变化明显低氨苄青霉素，表明构建的传感器具有很好的特异性(图4)。
[0078] 实施例9：稳定性实验
[0079] 采用相同的方法以及检测条件，制备10支dsDNA-AP-DpnII-ExoIII/AuNPs/GCE电极，氨苄青霉素浓度为10nM，得到电流的相对便准偏差为5.58％，说明该方法有很好的重现性。将dsDNA-AP-DpnII-ExoIII/AuNPs/GCE传感器在4℃下存放2周，得到电流响应为原始相应的92.47％，说明该方法有很好的稳定性。
[0080] 以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。
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