[0001] 本发明涉及一种分离反转录转座子的方法，具体的说是分离Ty1-copia类反转录转座子长末端重复序列的方法。

[0002] 反转录转座子具有广泛存在、高拷贝数、高异质性，插入位点不可逆等特点，对基因组的大小、结构、功能和进化都具有重要的作用，近年来成为基因克隆、基因表达及其功能、生物多样性及系统发育进化研究的重要工具。但其广泛的应用受限于全长序列的分离，尤其是长末端重复序列LTR的获得；反转录转座子是真核生物中数量最丰富、分布最广泛的转座子，包括长末端重复序列，LTR和非长末端重复序列，non-LTR反转录转座子两类(Grandbastien，1992；Bennetzen，1996；Kunze，1997)，LTR类反转录转座子是自然界中分布最广泛的一类反转录转座子。

[0003] 长末端重复序列类反转录转座子根据序列相似性程度和基因编码产物的排列又分为Tyl-Copia 组和Ty3-gypsy 组，其结构中的长末端重复序列不编码任何已知蛋白, 但包含有对转座子起作用的启动子和终止子以及调控序列；LTRs通常以反向重复序列5′-TG-3′和5′-CA- 3′结束，LTR类反转录转座子编码一些蛋白，其中主要包含3个基因，种属特异抗原基因(gag)、聚合酶基因(pol)、整合酶基因(int)，种属特异抗原基因编码的蛋白质与反转录转座子RNA以特定的形式整合在基因组中，聚合酶基因编码反向复制或转座所需的反转录酶(RT和RNase H)，整合酶基因编码反转录转座子插入到新的染色体位置。

[0004] LTR序列相对保守但又存在一定程度的变异, 是目前反转录转座子分子标记中用作引物开发的理想靶位点，但反转录转座子分子标记分析中引物的获得需要预先获知核酸序列, 从特定的物种中分离反转录转座子全长或部分片段的难度较高、花费较大, 从而限制其广泛应用，目前分离LTR序列目前常用磁珠富集法、抑制 PCR 法、SiteFinding PCR法等方法，但是这些方法都存在着操作复杂，假阳性率高等缺点，同时假阳性高是巢式PCR主要问题之一，由于随机引物较短，在10—13bp之间，做PCR时通常需要在40—45℃的退火温度，低温退火容易导致引物与模板的非特异性结合，产生较高的假阳性，并且结果重复性差。

[0005] 本研究针对上述问题，提供一种新的从牡丹中分离到Ty1-copia 类反转录转座子长末端重复序列的方法，此方法具有操作简单，检测便宜，假阳性率低等特点。

[0006] 本发明的为解决上述问题提供了分离Ty1-copia 类反转录转座子长末端重复序列的方法，步骤为：步骤一、设计引物
设计Rnase H组PCR引物、退火控制引物组PCR引物、UP通用PCR引物：
巢式引物 RNaseH 1 MGNACNAARCAYATHGA
RNaseH 2 GCNGAYATNYTNACNAA
退火控制引物
ACP 1 TGTAGCGTGAAGACGACAGAA IIIII VNVNNNGGAA
ACP 2 TGTAGCGTGAAGACGACAGAA IIIII BNBNNNGGTT
ACP 3 TGTAGCGTGAAGACGACAGAA IIIII HNVNNNCCAC
ACP 4 TGTAGCGTGAAGACGACAGAA IIIII CAATGGCTACCAC
ACP 5 TGTAGCGTGAAGACGACAGAA IIIII VVNVNNNCCAA
ACP 6 TGTAGCGTGAAGACGACAGAA IIIII BDNBNNNCGGT
通用引物 UP TGTAGCGTGAAGACGACAGAA；
所述的I 代表脱氧雌黄嘌呤，M=A/C，R=A/G ，Y=C/T，V=A/G/C，H=A/C/T，D=A/G/T，B=G/C/T，N=A/G/C/T；
步骤二、牡丹基因组提取
选取牡丹品种洛阳红的叶片，捣碎，利用提取DNA试剂盒提取基因组；
步骤三、第一次PCR反应
1）第一次PCR反应体系：在1.5ml的离心管A中配制20μl的PCR反应液Ⅰ，其成分
2+
为：浓度是100ng/μl的DNA基因组1μl、1μl含Mg 的PCR 缓冲液、0.2μl的磷酸脱氧核糖核苷溶液、1μl的Taq DNA聚合酶、0.4μl的RNaseH 1引物和0.8μl的任意一条退火控制引物，余量为双蒸水，备用；
2）第一次PCR反应程序：将配制好的PCR反应液Ⅰ，放于PCR仪内，进行PCR反应，反应程序为：94℃预变性5分钟，60℃退火1分钟，72℃延伸2分钟5个循环，94℃变性50秒，
45℃退火30秒，72℃延伸2分钟1个循环，94℃变性50秒，55℃退火30秒，72℃延伸2分钟25个循环，72℃再次延伸8分钟，制得PCR产物Ⅰ，备用；
步骤二、PCR产物Ⅰ的检测
利用琼脂糖凝胶电泳对PCR产物Ⅰ进行检测；
步骤三、PCR产物Ⅰ的回收、纯化
对检测后的PCR产物Ⅰ利用GenClean琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行回收、纯化，后用超纯水稀释100倍，备用；
步骤四、第二次PCR反应
1）第二次PCR反应体系：在1.5ml的离心管B中配制20μl的PCR反应液Ⅱ，其成分
2+
为：选取稀释后的PCR产物Ⅰ1μl、1μl含Mg 的PCR 缓冲液，0.2μl的磷酸脱氧核糖核苷溶液，1μl的Taq DNA聚合酶，0.4μl的RNaseH 2引物和0.4μl的ΜP通用引物，余量为双蒸水，备用；
2）第二次PCR反应程序：将配制好的PCR反应液Ⅱ，放于PCR仪内，进行第二次PCR反应，反应程序为：94℃预变性5分钟，94℃变性50秒，55℃退火30秒，72℃延伸2分钟30个循环，72℃再次延伸10分钟，制得PCR产物Ⅱ，备用；
步骤五、PCR产物Ⅱ的检测
利用琼脂糖凝胶电泳对PCR产物Ⅱ进行检测；
步骤六、PCR产物Ⅱ的回收、纯化
对检测后的PCR产物Ⅱ利用GenClean琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行回收、纯化，备用；
步骤七、感受态细胞制备
1）挑取大肠杆菌DH5α单菌落接种于LB培养基中，37 ℃培养16 小时，备用；
2）取1 ml步骤1）中的培养物，加入到含有10 ml LB培养基的三角瓶中，在37℃条件下振荡培养至OD值为0.4～0.5止，形成菌液，备用；
3）取50μl的菌液至1.5 ml离心管C中，在0－4 ℃条件下冷却10分钟，放于冷冻离心机内，4 ℃条件下，转速4000 转/分钟离心10 min，弃去上层澄清液体，得到沉淀物Ⅰ；
4）在沉淀物Ⅰ中加入0℃100 μl 0.1 mmol/L CaCl2溶液，混合均匀使细胞悬浮止，
0℃条件下放置20 min，备用；
5）取150μl含有沉淀物Ⅰ的CaCl2溶液移至1.5 ml离心管D中，在0－4 ℃条件下冷却10分钟，放于冷冻离心机内，4 ℃条件下，转速4000 转/分钟离心10 min，弃去上层澄清液体，得到沉淀物Ⅱ；
6）在沉淀物Ⅱ中加入0℃100 μl 0.1 mmol/L CaCl2溶液，混合均匀使细胞悬浮止，
0℃条件下放置20 min，备用；
步骤八、转化
1）在含有50－100μg/ml氨苄青霉素的LB平板培养基上，涂抹4 μl浓度为200 mg/ml的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷和40μl浓度为20 mg/ml的5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷，后避光放置30—50分钟，备用；
2）在0℃的1.5 ml离心管E加入50 μl感受态细胞和10 μl连接反应液，混合混匀，
0℃条件下放置30 分钟，备用；
3）将1.5 ml离心管E放于42 ℃的水浴锅内，时间为90 分钟，取出，放于0℃冰水混合物中，时间为1－2 min，备用；
4、在1.5 ml离心管D中加入400 μl液体LB培养基，放于振荡摇床中，37 ℃条件下，转速300转/分钟，振荡培养时间45－60分钟，形成混合液A，备用；
5）取150μl混合液A，均匀涂布于LB固体培养基表层，37℃条件下倒置培养12－16小时，观察到蓝白相间的菌落，4℃保存备用；
步骤九、质粒DNA的提取
1）用灭菌环挑选白色单菌落放入含有500 μg氨苄青霉素和5 ml LB液体培养基的
50 ml离心管中，放于振荡摇床中，37 ℃条件下，转速300转/分钟，培养12－16小时，形成培养液备用；
2）吸取1.0 ml培养液放于1.5 ml离心管F中，放于离心机内，转速12000 转/分钟，时间5min，弃去上层澄清液体，收集下层沉淀菌体A，加入的0℃的溶液Ⅰ100 μl，混合均匀使菌体悬浮，21℃条件下放置5分钟，备用；
3）在1.5 ml离心管E中加入200μl溶液Ⅱ混合均匀，放与-5℃条件下静置3—5分钟，备用；
4）在1.5 ml离心管E中加入150 μl溶液Ⅲ，混合均匀，放与-5℃条件下静置3—5分钟，后放于离心机内，转速12000转/分钟，离心5分钟，取上层澄清液体500μl至1.5ml离心管G中，备用；
5）在1.5ml离心管G中加入0.5 μl 100μg/μl的RNA酶，21℃条件下放置30分钟，加入等体积的苯酚、氯仿、异戊醇的混合液，其中苯酚、氯仿、异戊醇混合液按体积比取25份的苯酚、24份的氯仿和1份的异戊醇，混合均匀，放入离心机内，转速12000转/分钟，离心5分钟，取上层澄清液体500μl放入1.5ml的离心管H中，备用；
6）在1.5ml的离心管H中加入等体积的氯仿和异戊醇混合液，其中氯仿、异戊醇的混合液按体积比取24份的氯仿和1份的异戊醇，混合均匀，放入离心机内，转速为12000 转/分钟，离心2分钟，取上层澄清液体300μl放入1.5ml的离心管I中，备用；
7）在1.5ml的离心管I中加入2.5倍体积的-4℃无水乙醇，混合均匀，放入0℃的冰水混合物中15－30分钟，置于离心机内，转速为12000转/分钟，离心时间5分钟，弃去上层澄清液体，加入500μl的70％乙醇，浸泡5小时；
8）弃去酒精，风干，在1.5ml的离心管I中加入灭菌的超纯水50μl进行溶解，－20℃储存，备用得到混合液B；
步骤十、阳性克隆菌检测
利用第二次PCR过程中所使用的引物对混合液B再次做PCR反应，通过琼脂糖凝胶电泳进行检测，得到质粒DNA，进行序列测定，后采用生物统计软件DNA Star 5.0推断RNaseH酶的氨基酸序列，得到Ty1-copia 类反转录转座子长末端重复序列，后编码蛋白。 [0007] 所述的白色菌落为含有外源插入片段的转化子，蓝色是载体自连的转化子。

[0008] 所述的溶液Ⅰ由葡萄糖、Tris.HCl和EDTA组成，其中10ml溶液Ⅰ中按体积比取50 mM的葡萄糖、25 mM的Tris.HCl和10 mM的EDTA，余量为水。

[0009] 所述的溶液Ⅱ由NaOH和十二烷基硫酸钠组成，其中10ml溶液Ⅱ按体积比取0.2 M的NaOH和1%十二烷基硫酸钠，余量为水。

[0010] 所述的溶液Ⅲ由醋酸钾和冰乙酸组成，其中10ml溶液Ⅲ中按体积比取6ml的醋酸钾和1.15ml的冰乙酸，余量为水。

[0011] 有益效果本发明利用巢式PCR简并引物在靶序列上形成结合位点，利用抑制PCR提高扩增产物的特异性和退火控制引物来实现引物的特异结合性，通过Ty1-copia 类反转录转座子的RNase H保守序列来替代巢式-PCR中的特异引物，减少在PCR反应时特异条带的产生，节省在引物设计时出现的错配等问题。

[0012] 本发明采用巢式PCR中所用的L-乳酸去氢酵素做兼并引物，同时结合退火控制引物的技术，增加 5’端通用引物的长度，中间增加5个poly(dI)，将引物的退火温度升高至60℃，通过ACP技术可将引物在初始反应时与模板链特异性结合，扩增出真实可靠的产物，从而降低了PCR 结果的假阳性率。

[0013] 本发明中将ACP 技术和抑制PCR技术相结合显著提高了PCR 扩增的特异性和敏感性，增强PCR 产物的特异性，不需要聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检测，只需通过琼脂糖凝胶电泳就可进行结果分析，减少有毒物质对人员的伤害，同时节省生产成本。

[0014] 本方法相对于普通PCR技术具有操作简单，易直接瞄准反转录转座子长末端重复序列区, 针对性强, 与流式磁珠反向杂交法相比，免去杂交、洗脱、筛选等过程, 流程简化，且效率高，与其它的分离方法相比，减少酶切步骤，接头连接等一系列繁琐步骤，本技术除了能应用于长末端重复序列的扩增和分离，同时还用与其他已知序列的邻近未知序列扩增，减少时间消耗、快速获得目的片段，在较短时间内将长末端重复序列克隆，减少假阳性率的发生。

[0015] 本方法降低巢式PCR技术中由于随机简并引物引发的非特异扩增、增加目标侧翼序列在原始模板中的相对比例，从而提高引物的特异性，能够更有效地扩增出靶序列，是一种更为便捷、经济的分离方法。

[0016] 引物退火时能否与靶序列进行特异结合，是PCR能否成功扩增的关键因素之一，退火温度的高低决定引物是否能与其互补链进行完全结合，还是与一个或多个碱基的错配，因此通过调整退火温度就可以增加引物与模板结合的特异性，为了提高PCR扩增的特异性，设计退火控制引物，从而减少错配和非特异性结合的发生。附图说明

[0017] 图1为本发明退火控制引物组成示意图；图2为本发明扩增原理示意图；
图3为本发明Ty1-copia类反转录转座子结构示意图；
图4为本发明牡丹基因组DNA琼脂糖凝胶电泳检测图。

[0018] 实施例一步骤一、设计引物
设计RnaseH组PCR引物、AＣP组PCR引物、UP通用PCR引物：
巢式引物 RNaseH 1 MGNACNAARCAYATHGA
RNaseH 2 GCNGAYATNYTNACNAA
退火控制引物(Annealing control primer，ACP)
ACP 1 TGTAGCGTGAAGACGACAGAA IIIII VNVNNNGGAA
ACP 2 TGTAGCGTGAAGACGACAGAA IIIII BNBNNNGGTT
ACP 3 TGTAGCGTGAAGACGACAGAA IIIII HNVNNNCCAC
ACP 4 TGTAGCGTGAAGACGACAGAA IIIII CAATGGCTACCAC
ACP 5 TGTAGCGTGAAGACGACAGAA IIIII VVNVNNNCCAA
ACP 6 TGTAGCGTGAAGACGACAGAA IIIII BDNBNNNCGGT
通用引物 UP TGTAGCGTGAAGACGACAGAA
所述的I 代表脱氧雌黄嘌呤，B (CGT)，D (AGT)，H (ACT)，V (ACG)，N (AGCT)步骤二、牡丹基因组提取
选取牡丹品种“洛阳红”四月份新鲜的叶片，捣碎，利用提取DNA试剂盒提取基因组；
步骤三、第一次PCR反应
1）第一次PCR反应体系：在1.5ml的离心管A中配制20μl的PCR反应液Ⅰ，其成分
2+
为：浓度是100ng/μl的DNA基因组1μl、1μl含Mg 的PCR 缓冲液、0.2μl的磷酸脱氧核糖核苷溶液、1μl的Taq DNA聚合酶、0.4μl的RNaseH 1引物和0.8μl的退火控制引物1，余量为双蒸水，备用；
2）第一次PCR反应程序：将配制好的PCR反应液Ⅰ，放于PCR仪内，进行PCR反应，反应程序为：94℃预变性5分钟，60℃退火1分钟，72℃延伸2分钟5个循环，94℃变性50秒，
45℃退火30秒，72℃延伸2分钟1个循环，94℃变性50秒，55℃退火30秒，72℃延伸2分钟25个循环，72℃再次延伸8分钟，制得PCR产物Ⅰ，备用；
步骤二、PCR产物Ⅰ的检测
利用琼脂糖凝胶电泳对PCR产物Ⅰ进行检测：
称取1.0克琼脂糖粉末加入到100ml的1倍电泳缓冲液中并在微波炉内煮沸使琼脂糖粉末充分溶解，加入5µl的溴化乙锭溶液，至混合均匀止，后倒入制胶板中，插入制胶梳，凝固后的固体称为凝胶，拔去制胶梳，在凝胶上出现一排点样孔；将凝胶放入1倍电泳缓冲液中，将PCR产物Ⅰ加入到凝胶的点样孔中，打开电泳仪开关，在电泳仪电压为120伏特时开始电泳，电泳20分钟后关闭电泳仪，在凝胶成像系统中观察到目的基因后，备用；
步骤三、PCR产物Ⅰ的回收、纯化
对检测后的PCR产物Ⅰ利用GenClean琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行回收、纯化：
取1.5ml的离心管B并称其重量，然后在紫外灯下将凝胶上含有的PCR产物Ⅰ的凝胶切下来，放在已称重的1.5ml的离心管B中，称取离心管B的总重并计算出从凝胶上切下来的PCR产物Ⅰ的重量，然后将离心管B中的PCR产物Ⅰ捣碎，加入等体积的溶液Ⅰ，混合均匀止，将离心管B放置在50ºC水浴中加热至离心管B中的物质完全融解止，将融解后的溶液加入到DNA纯化柱a上，DNA纯化柱a位于收集管a中，在21ºC条件下放置1分钟，后将收集管a放在离心机中，转速为12000转/分钟，离心1分钟，取出倒掉收集管a内的液体，再向收集管a内的DNA纯化柱a中加入700µl的溶液Ⅱ，在21ºC条件下放置1分钟，转速为12000转/分钟，离心1分钟，取出倒掉收集管a内的液体，后向DNA纯化柱a上加入
500µl的溶液Ⅱ，转速为12000转/分钟，离心1分钟，取出倒掉收集管a内的液体，将收集管a在转速为13000转/分钟，离心1分钟，取出DNA纯化柱a置于1.5ml的离心管C中，在DNA纯化柱a上加入40µl溶液Ⅲ，将离心管C在21ºC条件下放置1分钟，将离心管C在转速为13000转/分钟，离心1分钟，弃去DNA纯化柱a得到离心管C中的40µl液体，该液体就是纯化后的PCR产物Ⅰ；
取1μl的PCR产物Ⅰ用99μl的超纯水进行稀释，备用；
步骤四、第二次PCR反应
1）第二次PCR反应体系：在1.5ml的离心管D中配制20μl的PCR反应液Ⅱ，其成分
2+
为：选取稀释后的PCR产物Ⅰ1μl、1μl含Mg 的PCR 缓冲液，0.2μl的磷酸脱氧核糖核苷溶液，1μl的Taq DNA聚合酶，0.4μl的RNaseH 2引物和0.4μl的ΜP通用引物，余量为双蒸水，备用；
2）第二次PCR反应程序：将配制好的PCR反应液Ⅱ，放于PCR仪内，进行第二次PCR反应，反应程序为：94℃预变性5分钟，94℃变性50秒，55℃退火30秒，72℃延伸2分钟30个循环，72℃再次延伸10分钟，制得PCR产物Ⅱ，备用；
步骤五、PCR产物Ⅱ的检测
利用琼脂糖凝胶电泳对PCR产物Ⅱ进行检测；
称取1.0克琼脂糖粉末加入到100ml的1倍电泳缓冲液中并在微波炉内煮沸使琼脂糖粉末充分溶解，加入5µl的溴化乙锭溶液，至混合均匀止，后倒入制胶板中，插入制胶梳，凝固后的固体称为凝胶，拔去制胶梳，在凝胶上出现一排点样孔；将凝胶放入1倍电泳缓冲液中，将PCR产物Ⅱ加入到凝胶的点样孔中，打开电泳仪开关，在电泳仪电压为120伏特时开始电泳，电泳20分钟后关闭电泳仪，在凝胶成像系统中观察到目的基因后，备用；
步骤六、PCR产物Ⅱ的回收、纯化
对检测后的PCR产物Ⅱ利用GenClean琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行回收、纯化，取1.5ml的离心管E并称其重量，然后在紫外灯下将凝胶上含有的PCR产物Ⅱ的凝胶切下来，放在已称重的1.5ml的离心管E中，称取离心管E的总重并计算出从凝胶上切下来的PCR产物Ⅱ的重量，然后将离心管E中的PCR产物Ⅱ捣碎，加入等体积的溶液Ⅰ，混合均匀止，将离心管E放置在50ºC水浴中加热至离心管E中的物质完全融解止，将融解后的溶液加入到DNA纯化柱b上，DNA纯化柱b位于收集管b中，在21ºC条件下放置1分钟，后将收集管b放在离心机中，转速为12000转/分钟，离心1分钟，取出倒掉收集管b内的液体，再向收集管b内的DNA纯化柱b中加入700µl的溶液Ⅱ，在21ºC条件下放置1分钟，转速为12000转/分钟，离心1分钟，取出倒掉收集管b内的液体，后向DNA纯化柱b上加入
500µl的溶液Ⅱ，转速为12000转/分钟，离心1分钟，取出倒掉收集管b内的液体，将收集管b在转速为13000转/分钟，离心1分钟，取出DNA纯化柱b置于1.5ml的离心管F中，在DNA纯化柱b上加入40µl溶液Ⅲ，将离心管F在21ºC条件下放置1分钟，将离心管F在转速为13000转/分钟，离心1分钟，弃去DNA纯化柱b得到离心管F中的40µl液体，该液体就是纯化后的PCR产物Ⅱ，备用；
步骤七、感受态细胞制备
1）挑取大肠杆菌DH5α单菌落接种于LB培养基中，37 ℃培养16 小时，备用；
2）取1 ml步骤1）中的培养物，加入到含有10 mL LB培养基的三角瓶中，在37℃条件下振荡培养至OD值为0.4止，形成菌液，备用；
3）取50μl的菌液至1.5 ml离心管G中，在0 ℃条件下冷却10分钟，放于冷冻离心机内，4 ℃条件下，转速4000 转/分钟离心10 min，弃去上层澄清液体，得到沉淀物Ⅰ；
4）在沉淀物Ⅰ中加入0℃100 μl 0.1 mmol/L CaCl2溶液，混合均匀使细胞悬浮止，
0℃条件下放置20 min，备用；
5）取150μl含有沉淀物Ⅰ的CaCl2溶液移至1.5 ml离心管H中，在0 ℃条件下冷却
10分钟，放于冷冻离心机内，4 ℃条件下，转速4000 转/分钟离心10 min，弃去上层澄清液体，得到沉淀物Ⅱ；
6）在沉淀物Ⅱ中加入0℃100 μl 0.1 mmol/L CaCl2溶液，混合均匀使细胞悬浮止，
0℃条件下放置20 min，备用；
步骤八、转化
1）在含有50μg/ml氨苄青霉素的LB平板培养基上，涂抹4 μl浓度为200 mg/ml的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷和40μl浓度为20 mg/ml的5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷，后避光放置30分钟，备用；
2）在0℃的1.5 ml离心管I加入50 μl感受态细胞和10 μl连接反应液，混合混匀，
0℃条件下放置30 分钟，备用；
3）将1.5 ml离心管I放于42℃的水浴锅内，时间为90 分钟，取出，放于0℃冰水混合物中，时间为1 min，备用；
4、在1.5 ml离心管I中加入400 μl液体LB培养基，放于振荡摇床中，37 ℃条件下，转速300转/分钟，振荡培养时间45分钟，形成混合液A，备用；
5）取150μl混合液A，均匀涂布于LB固体培养基表层，37℃条件下倒置培养12小时，观察到蓝白相间的菌落，4℃保存备用；
步骤九、质粒DNA的提取
1）用灭菌环挑选白色单菌落放入含有500 μg氨苄青霉素和5 ml LB液体培养基的50 ml离心管中，放于振荡摇床中，37 ℃条件下，转速300转/分钟，培养12小时，形成培养液备用；
2）吸取1.0 ml培养液放于1.5 ml离心管J中，放于离心机内，转速12000 转/分钟，时间5min，弃去上层澄清液体，收集下层沉淀菌体A，加入的0℃的溶液Ⅰ100 μl，混合均匀使菌体悬浮，21℃条件下放置5分钟，备用；
3）在1.5 ml离心管K中加入200μl溶液Ⅱ混合均匀，放与-5℃条件下静置3分钟，备用；
4）在1.5 ml离心管K中加入150 μl溶液Ⅲ，混合均匀，放与-5℃条件下静置3分钟，后放于离心机内，转速12000转/分钟，离心5分钟，取上层澄清液体500μl至1.5ml离心管L中，备用；
5）在1.5ml离心管L中加入0.5 μl 100μg/μl的RNA酶，21℃条件下放置30分钟，加入等体积的苯酚、氯仿、异戊醇的混合液，其中苯酚、氯仿、异戊醇混合液按体积比取25份的苯酚、24份的氯仿和1份的异戊醇，混合均匀，放入离心机内，转速12000转/分钟，离心5分钟，取上层澄清液体500μl放入1.5ml的离心管M中，备用；
6）在1.5ml的离心管M中加入等体积的氯仿和异戊醇混合液，其中氯仿、异戊醇的混合液按体积比取24份的氯仿和1份的异戊醇，混合均匀，放入离心机内，转速为12000 转/分钟，离心2分钟，取上层澄清液体300μl放入1.5ml的离心管N中，备用；
7）在1.5ml的离心管N中加入2.5倍体积的-4℃无水乙醇，混合均匀，放入0℃的冰水混合物中15分钟，置在于离心机内，转速为12000转/分钟，离心时间5分钟，弃去上层澄清液体，加入500μl的70％乙醇，浸泡5小时；
8）弃去酒精，风干，在1.5ml的离心管N中加入灭菌的超纯水50μl进行溶解，－20℃储存，备用得到混合液B；
菌检测
1）PCR反应体系：在1.5ml的离心管O中配制20μl的PCR反应液Ⅲ，其组分为：选取
2+
混合液B做为模板，取1μl含Mg 的PCR 缓冲液，0.2μl的磷酸脱氧核糖核苷溶液，1μl的Taq DNA聚合酶，0.4μl的RNaseH 2引物和0.4μl的UP通用引物，余量为双蒸水，备用；
2）PCR反应程序：将配制好的PCR反应液Ⅲ，放于PCR仪内，进行PCR反应，反应程序为：94℃预变性5分钟，94℃变性50秒，55℃退火30秒，72℃延伸2分钟30个循环，72℃再次延伸10分钟，制得PCR产物Ⅲ，备用；
对PCR产物Ⅲ进行琼脂糖凝胶电泳检测，得到质粒DNA，进行序列测定，后采用生物统计软件DNA Star 5.0推断RNaseH酶的氨基酸序列，得到Ty1-copia 类反转录转座子长末端重复序列，利用氨基酸序列编码蛋白；
RNaseH酶的氨基酸编码的蛋白为：
RTKHIDVRYHIVRDVIEKGDISLSKVHTNENPADMLTKVVTGSKIQHHLDLLHISPC。

[0019] 实施例二步骤一、设计引物
设计RnaseH组PCR引物、AＣP组PCR引物、UP通用PCR引物：
巢式引物 RNaseH 1 MGNACNAARCAYATHGA
RNaseH 2 GCNGAYATNYTNACNAA
退火控制引物(Annealing control primer，ACP)
ACP 1 TGTAGCGTGAAGACGACAGAA IIIII VNVNNNGGAA
ACP 2 TGTAGCGTGAAGACGACAGAA IIIII BNBNNNGGTT
ACP 3 TGTAGCGTGAAGACGACAGAA IIIII HNVNNNCCAC
ACP 4 TGTAGCGTGAAGACGACAGAA IIIII CAATGGCTACCAC
ACP 5 TGTAGCGTGAAGACGACAGAA IIIII VVNVNNNCCAA
ACP 6 TGTAGCGTGAAGACGACAGAA IIIII BDNBNNNCGGT
通用引物 UP TGTAGCGTGAAGACGACAGAA
所述的I 代表脱氧雌黄嘌呤，B (CGT)，D (AGT)，H (ACT)，V (ACG)，N (AGCT)步骤二、牡丹基因组提取
选取牡丹品种“洛阳红”四月份新鲜的叶片，捣碎，利用提取DNA试剂盒提取基因组；
步骤三、第一次PCR反应
1）第一次PCR反应体系：在1.5ml的离心管A中配制20μl的PCR反应液Ⅰ，其成分
2+
为：浓度是100ng/μl的DNA基因组1μl、1μl含Mg 的PCR 缓冲液、0.2μl的磷酸脱氧核糖核苷溶液、1μl的Taq DNA聚合酶、0.4μl的RNaseH 1引物和0.8μl的退火控制引物2，余量为双蒸水，备用；
2）第一次PCR反应程序：将配制好的PCR反应液Ⅰ，放于PCR仪内，进行PCR反应，反应程序为：94℃预变性5分钟，60℃退火1分钟，72℃延伸2分钟5个循环，94℃变性50秒，
45℃退火30秒，72℃延伸2分钟1个循环，94℃变性50秒，55℃退火30秒，72℃延伸2分钟25个循环，72℃再次延伸8分钟，制得PCR产物Ⅰ，备用；
步骤二、PCR产物Ⅰ的检测
利用琼脂糖凝胶电泳对PCR产物Ⅰ进行检测：
称取1.0克琼脂糖粉末加入到100ml的1倍电泳缓冲液中并在微波炉内煮沸使琼脂糖粉末充分溶解，加入5µl的溴化乙锭溶液，至混合均匀止，后倒入制胶板中，插入制胶梳，凝固后的固体称为凝胶，拔去制胶梳，在凝胶上出现一排点样孔；将凝胶放入1倍电泳缓冲液中，将PCR产物Ⅰ加入到凝胶的点样孔中，打开电泳仪开关，在电泳仪电压为120伏特时开始电泳，电泳20分钟后关闭电泳仪，在凝胶成像系统中观察到目的基因后，备用；
步骤三、PCR产物Ⅰ的回收、纯化
对检测后的PCR产物Ⅰ利用GenClean琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行回收、纯化：
取1.5ml的离心管B并称其重量，然后在紫外灯下将凝胶上含有的PCR产物Ⅰ的凝胶切下来，放在已称重的1.5ml的离心管B中，称取离心管B的总重并计算出从凝胶上切下来的PCR产物Ⅰ的重量，然后将离心管B中的PCR产物Ⅰ捣碎，加入等体积的溶液Ⅰ，混合均匀止，将离心管B放置在50ºC水浴中加热至离心管B中的物质完全融解止，将融解后的溶液加入到DNA纯化柱a上，DNA纯化柱a位于收集管a中，在21ºC条件下放置1分钟，后将收集管a放在离心机中，转速为12000转/分钟，离心1分钟，取出倒掉收集管a内的液体，再向收集管a内的DNA纯化柱a中加入700µl的溶液Ⅱ，在21ºC条件下放置1分钟，转速为12000转/分钟，离心1分钟，取出倒掉收集管a内的液体，后向DNA纯化柱a上加入
500µl的溶液Ⅱ，转速为12000转/分钟，离心1分钟，取出倒掉收集管a内的液体，将收集管a在转速为13000转/分钟，离心1分钟，取出DNA纯化柱a置于1.5ml的离心管C中，在DNA纯化柱a上加入40µl溶液Ⅲ，将离心管C在21ºC条件下放置1分钟，将离心管C在转速为13000转/分钟，离心1分钟，弃去DNA纯化柱a得到离心管C中的40µl液体，该液体就是纯化后的PCR产物Ⅰ；
取1μl的PCR产物Ⅰ用99μl的超纯水进行稀释，备用；
步骤四、第二次PCR反应
1）第二次PCR反应体系：在1.5ml的离心管D中配制20μl的PCR反应液Ⅱ，其成分
2+
为：选取稀释后的PCR产物Ⅰ1μl、1μl含Mg 的PCR 缓冲液，0.2μl的磷酸脱氧核糖核苷溶液，1μl的Taq DNA聚合酶，0.4μl的RNaseH 2引物和0.4μl的ΜP通用引物，余量为双蒸水，备用；
2）第二次PCR反应程序：将配制好的PCR反应液Ⅱ，放于PCR仪内，进行第二次PCR反应，反应程序为：94℃预变性5分钟，94℃变性50秒，55℃退火30秒，72℃延伸2分钟30个循环，72℃再次延伸10分钟，制得PCR产物Ⅱ，备用；
步骤五、PCR产物Ⅱ的检测
利用琼脂糖凝胶电泳对PCR产物Ⅱ进行检测；
称取1.0克琼脂糖粉末加入到100ml的1倍电泳缓冲液中并在微波炉内煮沸使琼脂糖粉末充分溶解，加入5µl的溴化乙锭溶液，至混合均匀止，后倒入制胶板中，插入制胶梳，凝固后的固体称为凝胶，拔去制胶梳，在凝胶上出现一排点样孔；将凝胶放入1倍电泳缓冲液中，将PCR产物Ⅱ加入到凝胶的点样孔中，打开电泳仪开关，在电泳仪电压为120伏特时开始电泳，电泳20分钟后关闭电泳仪，在凝胶成像系统中观察到目的基因后，备用；
步骤六、PCR产物Ⅱ的回收、纯化
对检测后的PCR产物Ⅱ利用GenClean琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行回收、纯化，取1.5ml的离心管E并称其重量，然后在紫外灯下将凝胶上含有的PCR产物Ⅱ的凝胶切下来，放在已称重的1.5ml的离心管E中，称取离心管E的总重并计算出从凝胶上切下来的PCR产物Ⅱ的重量，然后将离心管E中的PCR产物Ⅱ捣碎，加入等体积的溶液Ⅰ，混合均匀止，将离心管E放置在50ºC水浴中加热至离心管E中的物质完全融解止，将融解后的溶液加入到DNA纯化柱b上，DNA纯化柱b位于收集管b中，在21ºC条件下放置1分钟，后将收集管b放在离心机中，转速为12000转/分钟，离心1分钟，取出倒掉收集管b内的液体，再向收集管b内的DNA纯化柱b中加入700µl的溶液Ⅱ，在21ºC条件下放置1分钟，转速为12000转/分钟，离心1分钟，取出倒掉收集管b内的液体，后向DNA纯化柱b上加入
500µl的溶液Ⅱ，转速为12000转/分钟，离心1分钟，取出倒掉收集管b内的液体，将收集管b在转速为13000转/分钟，离心1分钟，取出DNA纯化柱b置于1.5ml的离心管F中，在DNA纯化柱b上加入40µl溶液Ⅲ，将离心管F在21ºC条件下放置1分钟，将离心管F在转速为13000转/分钟，离心1分钟，弃去DNA纯化柱b得到离心管F中的40µl液体，该液体就是纯化后的PCR产物Ⅱ，备用；
步骤七、感受态细胞制备
1）挑取大肠杆菌DH5α单菌落接种于LB培养基中，37 ℃培养16 小时，备用；
2）取1 ml步骤1）中的培养物，加入到含有10 mL LB培养基的三角瓶中，在37℃条件下振荡培养至OD值为0.4止，形成菌液，备用；
3）取50μl的菌液至1.5 ml离心管G中，在1℃条件下冷却10分钟，放于冷冻离心机内，4 ℃条件下，转速4000 转/分钟离心10 min，弃去上层澄清液体，得到沉淀物Ⅰ；
4）在沉淀物Ⅰ中加入0℃100 μl 0.1 mmol/L CaCl2溶液，混合均匀使细胞悬浮止，
0℃条件下放置20 min，备用；
5）取150μl含有沉淀物Ⅰ的CaCl2溶液移至1.5 ml离心管H中，在1 ℃条件下冷却
10分钟，放于冷冻离心机内，4 ℃条件下，转速4000 转/分钟离心10 min，弃去上层澄清液体，得到沉淀物Ⅱ；
6）在沉淀物Ⅱ中加入0℃100 μl 0.1 mmol/L CaCl2溶液，混合均匀使细胞悬浮止，
0℃条件下放置20 min，备用；
步骤八、转化
1）在含有60μg/ml氨苄青霉素的LB平板培养基上，涂抹4 μl浓度为200 mg/ml的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷和40μl浓度为20 mg/ml的5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷，后避光放置34分钟，备用；
2）在0℃的1.5 ml离心管I加入50 μl感受态细胞和10 μl连接反应液，混合混匀，
0℃条件下放置30 分钟，备用；
3）将1.5 ml离心管I放于42℃的水浴锅内，时间为90 分钟，取出，放于0℃冰水混合物中，时间为1 min，备用；
4、在1.5 ml离心管I中加入400 μl液体LB培养基，放于振荡摇床中，37 ℃条件下，转速300转/分钟，振荡培养时间48分钟，形成混合液A，备用；
5）取150μl混合液A，均匀涂布于LB固体培养基表层，37℃条件下倒置培养13小时，观察到蓝白相间的菌落，4℃保存备用；
步骤九、质粒DNA的提取
1）用灭菌环挑选白色单菌落放入含有500 μg氨苄青霉素和5 ml LB液体培养基的50 ml离心管中，放于振荡摇床中，37 ℃条件下，转速300转/分钟，培养13小时，形成培养液备用；
2）吸取1.0 ml培养液放于1.5 ml离心管J中，放于离心机内，转速12000 转/分钟，时间5min，弃去上层澄清液体，收集下层沉淀菌体A，加入的0℃的溶液Ⅰ100 μl，混合均匀使菌体悬浮，21℃条件下放置5分钟，备用；
3）在1.5 ml离心管K中加入200μl溶液Ⅱ混合均匀，放与-5℃条件下静置3分钟，备用；
4）在1.5 ml离心管K中加入150 μl溶液Ⅲ，混合均匀，放与-5℃条件下静置3分钟，后放于离心机内，转速12000转/分钟，离心5分钟，取上层澄清液体500μl至1.5ml离心管L中，备用；
5）在1.5ml离心管L中加入0.5 μl 100μg/μl的RNA酶，21℃条件下放置30分钟，加入等体积的苯酚、氯仿、异戊醇的混合液，其中苯酚、氯仿、异戊醇混合液按体积比取25份的苯酚、24份的氯仿和1份的异戊醇，混合均匀，放入离心机内，转速12000转/分钟，离心5分钟，取上层澄清液体500μl放入1.5ml的离心管M中，备用；
6）在1.5ml的离心管M中加入等体积的氯仿和异戊醇混合液，其中氯仿、异戊醇的混合液按体积比取24份的氯仿和1份的异戊醇，混合均匀，放入离心机内，转速为12000 转/分钟，离心2分钟，取上层澄清液体300μl放入1.5ml的离心管N中，备用；
7）在1.5ml的离心管N中加入2.5倍体积的-4℃无水乙醇，混合均匀，放入0℃的冰水混合物中18分钟，置在于离心机内，转速为12000转/分钟，离心时间5分钟，弃去上层澄清液体，加入500μl的70％乙醇，浸泡5小时；
8）弃去酒精，风干，在1.5ml的离心管N中加入灭菌的超纯水50μl进行溶解，－20℃储存，备用得到混合液B；
步骤十、阳性克隆菌检测
1）PCR反应体系：在1.5ml的离心管O中配制20μl的PCR反应液Ⅲ，其组分为：选取
2+
混合液B做为模板，取1μl含Mg 的PCR 缓冲液，0.2μl的磷酸脱氧核糖核苷溶液，1μl的Taq DNA聚合酶，0.4μl的RNaseH 2引物和0.4μl的UP通用引物，余量为双蒸水，备用；
2）PCR反应程序：将配制好的PCR反应液Ⅲ，放于PCR仪内，进行PCR反应，反应程序为：94℃预变性5分钟，94℃变性50秒，55℃退火30秒，72℃延伸2分钟30个循环，72℃再次延伸10分钟，制得PCR产物Ⅲ，备用；
对PCR产物Ⅲ进行琼脂糖凝胶电泳检测，得到质粒DNA，进行序列测定，后采用生物统计软件DNA Star 5.0推断RNaseH酶的氨基酸序列，得到Ty1-copia 类反转录转座子长末端重复序列，利用氨基酸序列编码蛋白；
RNaseH酶的氨基酸编码的蛋白为：
RTKHIDVRYHIVRDVIEKGDISLSKVHTNENPADMLTKVVTGSKIQHHLDLLHISPC。

[0020] 实施例三步骤一、设计引物
设计RnaseH组PCR引物、AＣP组PCR引物、UP通用PCR引物：
巢式引物 RNaseH 1 MGNACNAARCAYATHGA
RNaseH 2 GCNGAYATNYTNACNAA
退火控制引物(Annealing control primer，ACP)
ACP 1 TGTAGCGTGAAGACGACAGAA IIIII VNVNNNGGAA
ACP 2 TGTAGCGTGAAGACGACAGAA IIIII BNBNNNGGTT
ACP 3 TGTAGCGTGAAGACGACAGAA IIIII HNVNNNCCAC
ACP 4 TGTAGCGTGAAGACGACAGAA IIIII CAATGGCTACCAC
ACP 5 TGTAGCGTGAAGACGACAGAA IIIII VVNVNNNCCAA
ACP 6 TGTAGCGTGAAGACGACAGAA IIIII BDNBNNNCGGT
通用引物 UP TGTAGCGTGAAGACGACAGAA
所述的I 代表脱氧雌黄嘌呤，B (CGT)，D (AGT)，H (ACT)，V (ACG)，N (AGCT)步骤二、牡丹基因组提取
选取牡丹品种“洛阳红”四月份新鲜的叶片，捣碎，利用提取DNA试剂盒提取基因组；
步骤三、第一次PCR反应
1）第一次PCR反应体系：在1.5ml的离心管A中配制20μl的PCR反应液Ⅰ，其成分
2+
为：浓度是100ng/μl的DNA基因组1μl、1μl含Mg 的PCR 缓冲液、0.2μl的磷酸脱氧核糖核苷溶液、1μl的Taq DNA聚合酶、0.4μl的RNaseH 1引物和0.8μl的退火控制引物3，余量为双蒸水，备用；
2）第一次PCR反应程序：将配制好的PCR反应液Ⅰ，放于PCR仪内，进行PCR反应，反应程序为：94℃预变性5分钟，60℃退火1分钟，72℃延伸2分钟5个循环，94℃变性50秒，
45℃退火30秒，72℃延伸2分钟1个循环，94℃变性50秒，55℃退火30秒，72℃延伸2分钟25个循环，72℃再次延伸8分钟，制得PCR产物Ⅰ，备用；
步骤二、PCR产物Ⅰ的检测
利用琼脂糖凝胶电泳对PCR产物Ⅰ进行检测：
称取1.0克琼脂糖粉末加入到100ml的1倍电泳缓冲液中并在微波炉内煮沸使琼脂糖粉末充分溶解，加入5µl的溴化乙锭溶液，至混合均匀止，后倒入制胶板中，插入制胶梳，凝固后的固体称为凝胶，拔去制胶梳，在凝胶上出现一排点样孔；将凝胶放入1倍电泳缓冲液中，将PCR产物Ⅰ加入到凝胶的点样孔中，打开电泳仪开关，在电泳仪电压为120伏特时开始电泳，电泳20分钟后关闭电泳仪，在凝胶成像系统中观察到目的基因后，备用；
步骤三、PCR产物Ⅰ的回收、纯化
对检测后的PCR产物Ⅰ利用GenClean琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行回收、纯化：
取1.5ml的离心管B并称其重量，然后在紫外灯下将凝胶上含有的PCR产物Ⅰ的凝胶切下来，放在已称重的1.5ml的离心管B中，称取离心管B的总重并计算出从凝胶上切下来的PCR产物Ⅰ的重量，然后将离心管B中的PCR产物Ⅰ捣碎，加入等体积的溶液Ⅰ，混合均匀止，将离心管B放置在50ºC水浴中加热至离心管B中的物质完全融解止，将融解后的溶液加入到DNA纯化柱a上，DNA纯化柱a位于收集管a中，在21ºC条件下放置1分钟，后将收集管a放在离心机中，转速为12000转/分钟，离心1分钟，取出倒掉收集管a内的液体，再向收集管a内的DNA纯化柱a中加入700µl的溶液Ⅱ，在21ºC条件下放置1分钟，转速为12000转/分钟，离心1分钟，取出倒掉收集管a内的液体，后向DNA纯化柱a上加入
500µl的溶液Ⅱ，转速为12000转/分钟，离心1分钟，取出倒掉收集管a内的液体，将收集管a在转速为13000转/分钟，离心1分钟，取出DNA纯化柱a置于1.5ml的离心管C中，在DNA纯化柱a上加入40µl溶液Ⅲ，将离心管C在21ºC条件下放置1分钟，将离心管C在转速为13000转/分钟，离心1分钟，弃去DNA纯化柱a得到离心管C中的40µl液体，该液体就是纯化后的PCR产物Ⅰ；
取1μl的PCR产物Ⅰ用99μl的超纯水进行稀释，备用；
步骤四、第二次PCR反应
1）第二次PCR反应体系：在1.5ml的离心管D中配制20μl的PCR反应液Ⅱ，其成分
2+
为：选取稀释后的PCR产物Ⅰ1μl、1μl含Mg 的PCR 缓冲液，0.2μl的磷酸脱氧核糖核苷溶液，1μl的Taq DNA聚合酶，0.4μl的RNaseH 2引物和0.4μl的ΜP通用引物，余量为双蒸水，备用；
2）第二次PCR反应程序：将配制好的PCR反应液Ⅱ，放于PCR仪内，进行第二次PCR反应，反应程序为：94℃预变性5分钟，94℃变性50秒，55℃退火30秒，72℃延伸2分钟30个循环，72℃再次延伸10分钟，制得PCR产物Ⅱ，备用；
步骤五、PCR产物Ⅱ的检测
利用琼脂糖凝胶电泳对PCR产物Ⅱ进行检测；
称取1.0克琼脂糖粉末加入到100ml的1倍电泳缓冲液中并在微波炉内煮沸使琼脂糖粉末充分溶解，加入5µl的溴化乙锭溶液，至混合均匀止，后倒入制胶板中，插入制胶梳，凝固后的固体称为凝胶，拔去制胶梳，在凝胶上出现一排点样孔；将凝胶放入1倍电泳缓冲液中，将PCR产物Ⅱ加入到凝胶的点样孔中，打开电泳仪开关，在电泳仪电压为120伏特时开始电泳，电泳20分钟后关闭电泳仪，在凝胶成像系统中观察到目的基因后，备用；
步骤六、PCR产物Ⅱ的回收、纯化
对检测后的PCR产物Ⅱ利用GenClean琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行回收、纯化，取1.5ml的离心管E并称其重量，然后在紫外灯下将凝胶上含有的PCR产物Ⅱ的凝胶切下来，放在已称重的1.5ml的离心管E中，称取离心管E的总重并计算出从凝胶上切下来的PCR产物Ⅱ的重量，然后将离心管E中的PCR产物Ⅱ捣碎，加入等体积的溶液Ⅰ，混合均匀止，将离心管E放置在50ºC水浴中加热至离心管E中的物质完全融解止，将融解后的溶液加入到DNA纯化柱b上，DNA纯化柱b位于收集管b中，在21ºC条件下放置1分钟，后将收集管b放在离心机中，转速为12000转/分钟，离心1分钟，取出倒掉收集管b内的液体，再向收集管b内的DNA纯化柱b中加入700µl的溶液Ⅱ，在21ºC条件下放置1分钟，转速为12000转/分钟，离心1分钟，取出倒掉收集管b内的液体，后向DNA纯化柱b上加入
500µl的溶液Ⅱ，转速为12000转/分钟，离心1分钟，取出倒掉收集管b内的液体，将收集管b在转速为13000转/分钟，离心1分钟，取出DNA纯化柱b置于1.5ml的离心管F中，在DNA纯化柱b上加入40µl溶液Ⅲ，将离心管F在21ºC条件下放置1分钟，将离心管F在转速为13000转/分钟，离心1分钟，弃去DNA纯化柱b得到离心管F中的40µl液体，该液体就是纯化后的PCR产物Ⅱ，备用；
步骤七、感受态细胞制备
1）挑取大肠杆菌DH5α单菌落接种于LB培养基中，37 ℃培养16 小时，备用；
2）取1 ml步骤1）中的培养物，加入到含有10 mL LB培养基的三角瓶中，在37℃条件下振荡培养至OD值为0.4止，形成菌液，备用；
3）取50μl的菌液至1.5 ml离心管G中，在2℃条件下冷却10分钟，放于冷冻离心机内，4 ℃条件下，转速4000 转/分钟离心10 min，弃去上层澄清液体，得到沉淀物Ⅰ；
4）在沉淀物Ⅰ中加入0℃100 μl 0.1 mmol/L CaCl2溶液，混合均匀使细胞悬浮止，
0℃条件下放置20 min，备用；
5）取150μl含有沉淀物Ⅰ的CaCl2溶液移至1.5 ml离心管H中，在2 ℃条件下冷却
10分钟，放于冷冻离心机内，4 ℃条件下，转速4000 转/分钟离心10 min，弃去上层澄清液体，得到沉淀物Ⅱ；
6）在沉淀物Ⅱ中加入0℃100 μl 0.1 mmol/L CaCl2溶液，混合均匀使细胞悬浮止，
0℃条件下放置20 min，备用；
步骤八、转化
1）在含有70μg/ml氨苄青霉素的LB平板培养基上，涂抹4 μl浓度为200 mg/ml的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷和40μl浓度为20 mg/ml的5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷，后避光放置38分钟，备用；
2）在0℃的1.5 ml离心管I加入50 μl感受态细胞和10 μl连接反应液，混合混匀，
0℃条件下放置30 分钟，备用；
3）将1.5 ml离心管I放于42℃的水浴锅内，时间为90 分钟，取出，放于0℃冰水混合物中，时间为1min，备用；
4、在1.5 ml离心管I中加入400 μl液体LB培养基，放于振荡摇床中，37 ℃条件下，转速300转/分钟，振荡培养时间52分钟，形成混合液A，备用；
5）取150μl混合液A，均匀涂布于LB固体培养基表层，37℃条件下倒置培养14小时，观察到蓝白相间的菌落，4℃保存备用；
步骤九、质粒DNA的提取
1）用灭菌环挑选白色单菌落放入含有500 μg氨苄青霉素和5 ml LB液体培养基的50 ml离心管中，放于振荡摇床中，37 ℃条件下，转速300转/分钟，培养14小时，形成培养液备用；
2）吸取1.0 ml培养液放于1.5 ml离心管J中，放于离心机内，转速12000 转/分钟，时间5min，弃去上层澄清液体，收集下层沉淀菌体A，加入的0℃的溶液Ⅰ100 μl，混合均匀使菌体悬浮，21℃条件下放置5分钟，备用；
3）在1.5 ml离心管K中加入200μl溶液Ⅱ混合均匀，放与-5℃条件下静置4分钟，备用；
4）在1.5 ml离心管K中加入150 μl溶液Ⅲ，混合均匀，放与-5℃条件下静置3分钟，后放于离心机内，转速12000转/分钟，离心5分钟，取上层澄清液体500μl至1.5ml离心管L中，备用；
5）在1.5ml离心管L中加入0.5 μl 100μg/μl的RNA酶，21℃条件下放置30分钟，加入等体积的苯酚、氯仿、异戊醇的混合液，其中苯酚、氯仿、异戊醇混合液按体积比取25份的苯酚、24份的氯仿和1份的异戊醇，混合均匀，放入离心机内，转速12000转/分钟，离心5分钟，取上层澄清液体500μl放入1.5ml的离心管M中，备用；
6）在1.5ml的离心管M中加入等体积的氯仿和异戊醇混合液，其中氯仿、异戊醇的混合液按体积比取24份的氯仿和1份的异戊醇，混合均匀，放入离心机内，转速为12000 转/分钟，离心2分钟，取上层澄清液体300μl放入1.5ml的离心管N中，备用；
7）在1.5ml的离心管N中加入2.5倍体积的-4℃无水乙醇，混合均匀，放入0℃的冰水混合物中22分钟，置在于离心机内，转速为12000转/分钟，离心时间5分钟，弃去上层澄清液体，加入500μl的70％乙醇，浸泡5小时；
8）弃去酒精，风干，在1.5ml的离心管N中加入灭菌的超纯水50μl进行溶解，－20℃储存，备用得到混合液B；
步骤十、阳性克隆菌检测
1）PCR反应体系：在1.5ml的离心管O中配制20μl的PCR反应液Ⅲ，其组分为：选取
2+
混合液B做为模板，取1μl含Mg 的PCR 缓冲液，0.2μl的磷酸脱氧核糖核苷溶液，1μl的Taq DNA聚合酶，0.4μl的RNaseH 2引物和0.4μl的UP通用引物，余量为双蒸水，备用；
2）PCR反应程序：将配制好的PCR反应液Ⅲ，放于PCR仪内，进行PCR反应，反应程序为：94℃预变性5分钟，94℃变性50秒，55℃退火30秒，72℃延伸2分钟30个循环，72℃再次延伸10分钟，制得PCR产物Ⅲ，备用；
对PCR产物Ⅲ进行琼脂糖凝胶电泳检测，得到质粒DNA，进行序列测定，后采用生物统计软件DNA Star 5.0推断RNaseH酶的氨基酸序列，得到Ty1-copia 类反转录转座子长末端重复序列，利用氨基酸序列编码蛋白；
RNaseH酶的氨基酸编码的蛋白为：
RTKHIDVRYHIVRDVIEKGDISLSKVHTNENPADMLTKVVTGSKIQHHLDLLHISPC。

[0021] 实施例四步骤一、设计引物
设计RnaseH组PCR引物、AＣP组PCR引物、UP通用PCR引物：
巢式引物 RNaseH 1 MGNACNAARCAYATHGA
RNaseH 2 GCNGAYATNYTNACNAA
退火控制引物(Annealing control primer，ACP)
ACP 1 TGTAGCGTGAAGACGACAGAA IIIII VNVNNNGGAA
ACP 2 TGTAGCGTGAAGACGACAGAA IIIII BNBNNNGGTT
ACP 3 TGTAGCGTGAAGACGACAGAA IIIII HNVNNNCCAC
ACP 4 TGTAGCGTGAAGACGACAGAA IIIII CAATGGCTACCAC
ACP 5 TGTAGCGTGAAGACGACAGAA IIIII VVNVNNNCCAA
ACP 6 TGTAGCGTGAAGACGACAGAA IIIII BDNBNNNCGGT
通用引物 UP TGTAGCGTGAAGACGACAGAA
所述的I 代表脱氧雌黄嘌呤，B (CGT)，D (AGT)，H (ACT)，V (ACG)，N (AGCT)步骤二、牡丹基因组提取
选取牡丹品种“洛阳红”四月份新鲜的叶片，捣碎，利用提取DNA试剂盒提取基因组；
步骤三、第一次PCR反应
1）第一次PCR反应体系：在1.5ml的离心管A中配制20μl的PCR反应液Ⅰ，其成分
2+
为：浓度是100ng/μl的DNA基因组1μl、1μl含Mg 的PCR 缓冲液、0.2μl的磷酸脱氧核糖核苷溶液、1μl的Taq DNA聚合酶、0.4μl的RNaseH 1引物和0.8μl的退火控制引物4，余量为双蒸水，备用；
2）第一次PCR反应程序：将配制好的PCR反应液Ⅰ，放于PCR仪内，进行PCR反应，反应程序为：94℃预变性5分钟，60℃退火1分钟，72℃延伸2分钟5个循环，94℃变性50秒，
45℃退火30秒，72℃延伸2分钟1个循环，94℃变性50秒，55℃退火30秒，72℃延伸2分钟25个循环，72℃再次延伸8分钟，制得PCR产物Ⅰ，备用；
步骤二、PCR产物Ⅰ的检测
利用琼脂糖凝胶电泳对PCR产物Ⅰ进行检测：
称取1.0克琼脂糖粉末加入到100ml的1倍电泳缓冲液中并在微波炉内煮沸使琼脂糖粉末充分溶解，加入5µl的溴化乙锭溶液，至混合均匀止，后倒入制胶板中，插入制胶梳，凝固后的固体称为凝胶，拔去制胶梳，在凝胶上出现一排点样孔；将凝胶放入1倍电泳缓冲液中，将PCR产物Ⅰ加入到凝胶的点样孔中，打开电泳仪开关，在电泳仪电压为120伏特时开始电泳，电泳20分钟后关闭电泳仪，在凝胶成像系统中观察到目的基因后，备用；
步骤三、PCR产物Ⅰ的回收、纯化
对检测后的PCR产物Ⅰ利用GenClean琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行回收、纯化：
取1.5ml的离心管B并称其重量，然后在紫外灯下将凝胶上含有的PCR产物Ⅰ的凝胶切下来，放在已称重的1.5ml的离心管B中，称取离心管B的总重并计算出从凝胶上切下来的PCR产物Ⅰ的重量，然后将离心管B中的PCR产物Ⅰ捣碎，加入等体积的溶液Ⅰ，混合均匀止，将离心管B放置在50ºC水浴中加热至离心管B中的物质完全融解止，将融解后的溶液加入到DNA纯化柱a上，DNA纯化柱a位于收集管a中，在21ºC条件下放置1分钟，后将收集管a放在离心机中，转速为12000转/分钟，离心1分钟，取出倒掉收集管a内的液体，再向收集管a内的DNA纯化柱a中加入700µl的溶液Ⅱ，在21ºC条件下放置1分钟，转速为12000转/分钟，离心1分钟，取出倒掉收集管a内的液体，后向DNA纯化柱a上加入
500µl的溶液Ⅱ，转速为12000转/分钟，离心1分钟，取出倒掉收集管a内的液体，将收集管a在转速为13000转/分钟，离心1分钟，取出DNA纯化柱a置于1.5ml的离心管C中，在DNA纯化柱a上加入40µl溶液Ⅲ，将离心管C在21ºC条件下放置1分钟，将离心管C在转速为13000转/分钟，离心1分钟，弃去DNA纯化柱a得到离心管C中的40µl液体，该液体就是纯化后的PCR产物Ⅰ；
取1μl的PCR产物Ⅰ用99μl的超纯水进行稀释，备用；
步骤四、第二次PCR反应
1）第二次PCR反应体系：在1.5ml的离心管D中配制20μl的PCR反应液Ⅱ，其成分
2+
为：选取稀释后的PCR产物Ⅰ1μl、1μl含Mg 的PCR 缓冲液，0.2μl的磷酸脱氧核糖核苷溶液，1μl的Taq DNA聚合酶，0.4μl的RNaseH 2引物和0.4μl的ΜP通用引物，余量为双蒸水，备用；
2）第二次PCR反应程序：将配制好的PCR反应液Ⅱ，放于PCR仪内，进行第二次PCR反应，反应程序为：94℃预变性5分钟，94℃变性50秒，55℃退火30秒，72℃延伸2分钟30个循环，72℃再次延伸10分钟，制得PCR产物Ⅱ，备用；
步骤五、PCR产物Ⅱ的检测
利用琼脂糖凝胶电泳对PCR产物Ⅱ进行检测；
称取1.0克琼脂糖粉末加入到100ml的1倍电泳缓冲液中并在微波炉内煮沸使琼脂糖粉末充分溶解，加入5µl的溴化乙锭溶液，至混合均匀止，后倒入制胶板中，插入制胶梳，凝固后的固体称为凝胶，拔去制胶梳，在凝胶上出现一排点样孔；将凝胶放入1倍电泳缓冲液中，将PCR产物Ⅱ加入到凝胶的点样孔中，打开电泳仪开关，在电泳仪电压为120伏特时开始电泳，电泳20分钟后关闭电泳仪，在凝胶成像系统中观察到目的基因后，备用；
步骤六、PCR产物Ⅱ的回收、纯化
对检测后的PCR产物Ⅱ利用GenClean琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行回收、纯化，取1.5ml的离心管E并称其重量，然后在紫外灯下将凝胶上含有的PCR产物Ⅱ的凝胶切下来，放在已称重的1.5ml的离心管E中，称取离心管E的总重并计算出从凝胶上切下来的PCR产物Ⅱ的重量，然后将离心管E中的PCR产物Ⅱ捣碎，加入等体积的溶液Ⅰ，混合均匀止，将离心管E放置在50ºC水浴中加热至离心管E中的物质完全融解止，将融解后的溶液加入到DNA纯化柱b上，DNA纯化柱b位于收集管b中，在21ºC条件下放置1分钟，后将收集管b放在离心机中，转速为12000转/分钟，离心1分钟，取出倒掉收集管b内的液体，再向收集管b内的DNA纯化柱b中加入700µl的溶液Ⅱ，在21ºC条件下放置1分钟，转速为12000转/分钟，离心1分钟，取出倒掉收集管b内的液体，后向DNA纯化柱b上加入
500µl的溶液Ⅱ，转速为12000转/分钟，离心1分钟，取出倒掉收集管b内的液体，将收集管b在转速为13000转/分钟，离心1分钟，取出DNA纯化柱b置于1.5ml的离心管F中，在DNA纯化柱b上加入40µl溶液Ⅲ，将离心管F在21ºC条件下放置1分钟，将离心管F在转速为13000转/分钟，离心1分钟，弃去DNA纯化柱b得到离心管F中的40µl液体，该液体就是纯化后的PCR产物Ⅱ，备用；
步骤七、感受态细胞制备
1）挑取大肠杆菌DH5α单菌落接种于LB培养基中，37 ℃培养16 小时，备用；
2）取1 ml步骤1）中的培养物，加入到含有10 mL LB培养基的三角瓶中，在37℃条件下振荡培养至OD值为0.5止，形成菌液，备用；
3）取50μl的菌液至1.5 ml离心管G中，在3 ℃条件下冷却10分钟，放于冷冻离心机内，4 ℃条件下，转速4000 转/分钟离心10 min，弃去上层澄清液体，得到沉淀物Ⅰ；
4）在沉淀物Ⅰ中加入0℃100 μl 0.1 mmol/L CaCl2溶液，混合均匀使细胞悬浮止，
0℃条件下放置20 min，备用；
5）取150μl含有沉淀物Ⅰ的CaCl2溶液移至1.5 ml离心管H中，在3 ℃条件下冷却
10分钟，放于冷冻离心机内，4 ℃条件下，转速4000 转/分钟离心10 min，弃去上层澄清液体，得到沉淀物Ⅱ；
6）在沉淀物Ⅱ中加入0℃100 μl 0.1 mmol/L CaCl2溶液，混合均匀使细胞悬浮止，
0℃条件下放置20 min，备用；
步骤八、转化
1）在含有80μg/ml氨苄青霉素的LB平板培养基上，涂抹4 μl浓度为200 mg/ml的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷和40μl浓度为20 mg/ml的5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷，后避光放置45分钟，备用；
2）在0℃的1.5 ml离心管I加入50 μl感受态细胞和10 μl连接反应液，混合混匀，
0℃条件下放置30 分钟，备用；
3）将1.5 ml离心管I放于42℃的水浴锅内，时间为90 分钟，取出，放于0℃冰水混合物中，时间为2 min，备用；
4、在1.5 ml离心管I中加入400 μl液体LB培养基，放于振荡摇床中，37 ℃条件下，转速300转/分钟，振荡培养时间55分钟，形成混合液A，备用；
5）取150μl混合液A，均匀涂布于LB固体培养基表层，37℃条件下倒置培养15小时，观察到蓝白相间的菌落，4℃保存备用；
步骤九、质粒DNA的提取
1）用灭菌环挑选白色单菌落放入含有500 μg氨苄青霉素和5 ml LB液体培养基的50 ml离心管中，放于振荡摇床中，37 ℃条件下，转速300转/分钟，培养15小时，形成培养液备用；
2）吸取1.0 ml培养液放于1.5 ml离心管J中，放于离心机内，转速12000 转/分钟，时间5min，弃去上层澄清液体，收集下层沉淀菌体A，加入的0℃的溶液Ⅰ100 μl，混合均匀使菌体悬浮，21℃条件下放置5分钟，备用；
3）在1.5 ml离心管K中加入200μl溶液Ⅱ混合均匀，放与-5℃条件下静置4分钟，备用；
4）在1.5 ml离心管K中加入150 μl溶液Ⅲ，混合均匀，放与-5℃条件下静置3分钟，后放于离心机内，转速12000转/分钟，离心5分钟，取上层澄清液体500μl至1.5ml离心管L中，备用；
5）在1.5ml离心管L中加入0.5 μl 100μg/μl的RNA酶，21℃条件下放置30分钟，加入等体积的苯酚、氯仿、异戊醇的混合液，其中苯酚、氯仿、异戊醇混合液按体积比取25份的苯酚、24份的氯仿和1份的异戊醇，混合均匀，放入离心机内，转速12000转/分钟，离心5分钟，取上层澄清液体500μl放入1.5ml的离心管M中，备用；
6）在1.5ml的离心管M中加入等体积的氯仿和异戊醇混合液，其中氯仿、异戊醇的混合液按体积比取24份的氯仿和1份的异戊醇，混合均匀，放入离心机内，转速为12000 转/分钟，离心2分钟，取上层澄清液体300μl放入1.5ml的离心管N中，备用；
7）在1.5ml的离心管N中加入2.5倍体积的-4℃无水乙醇，混合均匀，放入0℃的冰水混合物中25分钟，置在于离心机内，转速为12000转/分钟，离心时间5分钟，弃去上层澄清液体，加入500μl的70％乙醇，浸泡5小时；
8）弃去酒精，风干，在1.5ml的离心管N中加入灭菌的超纯水50μl进行溶解，－20℃储存，备用得到混合液B；
步骤十、阳性克隆菌检测
1）PCR反应体系：在1.5ml的离心管O中配制20μl的PCR反应液Ⅲ，其组分为：选取
2+
混合液B做为模板，取1μl含Mg 的PCR 缓冲液，0.2μl的磷酸脱氧核糖核苷溶液，1μl的Taq DNA聚合酶，0.4μl的RNaseH 2引物和0.4μl的UP通用引物，余量为双蒸水，备用；
2）PCR反应程序：将配制好的PCR反应液Ⅲ，放于PCR仪内，进行PCR反应，反应程序为：94℃预变性5分钟，94℃变性50秒，55℃退火30秒，72℃延伸2分钟30个循环，72℃再次延伸10分钟，制得PCR产物Ⅲ，备用；
对PCR产物Ⅲ进行琼脂糖凝胶电泳检测，得到质粒DNA，进行序列测定，后采用生物统计软件DNA Star 5.0推断RNaseH酶的氨基酸序列，得到Ty1-copia 类反转录转座子长末端重复序列，利用氨基酸序列编码蛋白；
RNaseH酶的氨基酸编码的蛋白为：
RTKHIDVRYHIVRDVIEKGDISLSKVHTNENPADMLTKVVTGSKIQHHLDLLHISPC。

[0022] 实施例五步骤一、设计引物
设计RnaseH组PCR引物、AＣP组PCR引物、UP通用PCR引物：
巢式引物 RNaseH 1 MGNACNAARCAYATHGA
RNaseH 2 GCNGAYATNYTNACNAA
退火控制引物(Annealing control primer，ACP)
ACP 1 TGTAGCGTGAAGACGACAGAA IIIII VNVNNNGGAA
ACP 2 TGTAGCGTGAAGACGACAGAA IIIII BNBNNNGGTT
ACP 3 TGTAGCGTGAAGACGACAGAA IIIII HNVNNNCCAC
ACP 4 TGTAGCGTGAAGACGACAGAA IIIII CAATGGCTACCAC
ACP 5 TGTAGCGTGAAGACGACAGAA IIIII VVNVNNNCCAA
ACP 6 TGTAGCGTGAAGACGACAGAA IIIII BDNBNNNCGGT
通用引物 UP TGTAGCGTGAAGACGACAGAA
所述的I 代表脱氧雌黄嘌呤，B (CGT)，D (AGT)，H (ACT)，V (ACG)，N (AGCT)步骤二、牡丹基因组提取
选取牡丹品种“洛阳红”四月份新鲜的叶片，捣碎，利用提取DNA试剂盒提取基因组；
步骤三、第一次PCR反应
1）第一次PCR反应体系：在1.5ml的离心管A中配制20μl的PCR反应液Ⅰ，其成分
2+
为：浓度是100ng/μl的DNA基因组1μl、1μl含Mg 的PCR 缓冲液、0.2μl的磷酸脱氧核糖核苷溶液、1μl的Taq DNA聚合酶、0.4μl的RNaseH 1引物和0.8μl的退火控制引物6，余量为双蒸水，备用；
2）第一次PCR反应程序：将配制好的PCR反应液Ⅰ，放于PCR仪内，进行PCR反应，反应程序为：94℃预变性5分钟，60℃退火1分钟，72℃延伸2分钟5个循环，94℃变性50秒，
45℃退火30秒，72℃延伸2分钟1个循环，94℃变性50秒，55℃退火30秒，72℃延伸2分钟25个循环，72℃再次延伸8分钟，制得PCR产物Ⅰ，备用；
步骤二、PCR产物Ⅰ的检测
利用琼脂糖凝胶电泳对PCR产物Ⅰ进行检测：
称取1.0克琼脂糖粉末加入到100ml的1倍电泳缓冲液中并在微波炉内煮沸使琼脂糖粉末充分溶解，加入5µl的溴化乙锭溶液，至混合均匀止，后倒入制胶板中，插入制胶梳，凝固后的固体称为凝胶，拔去制胶梳，在凝胶上出现一排点样孔；将凝胶放入1倍电泳缓冲液中，将PCR产物Ⅰ加入到凝胶的点样孔中，打开电泳仪开关，在电泳仪电压为120伏特时开始电泳，电泳20分钟后关闭电泳仪，在凝胶成像系统中观察到目的基因后，备用；
步骤三、PCR产物Ⅰ的回收、纯化
对检测后的PCR产物Ⅰ利用GenClean琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行回收、纯化：
取1.5ml的离心管B并称其重量，然后在紫外灯下将凝胶上含有的PCR产物Ⅰ的凝胶切下来，放在已称重的1.5ml的离心管B中，称取离心管B的总重并计算出从凝胶上切下来的PCR产物Ⅰ的重量，然后将离心管B中的PCR产物Ⅰ捣碎，加入等体积的溶液Ⅰ，混合均匀止，将离心管B放置在50ºC水浴中加热至离心管B中的物质完全融解止，将融解后的溶液加入到DNA纯化柱a上，DNA纯化柱a位于收集管a中，在21ºC条件下放置1分钟，后将收集管a放在离心机中，转速为12000转/分钟，离心1分钟，取出倒掉收集管a内的液体，再向收集管a内的DNA纯化柱a中加入700µl的溶液Ⅱ，在21ºC条件下放置1分钟，转速为12000转/分钟，离心1分钟，取出倒掉收集管a内的液体，后向DNA纯化柱a上加入
500µl的溶液Ⅱ，转速为12000转/分钟，离心1分钟，取出倒掉收集管a内的液体，将收集管a在转速为13000转/分钟，离心1分钟，取出DNA纯化柱a置于1.5ml的离心管C中，在DNA纯化柱a上加入40µl溶液Ⅲ，将离心管C在21ºC条件下放置1分钟，将离心管C在转速为13000转/分钟，离心1分钟，弃去DNA纯化柱a得到离心管C中的40µl液体，该液体就是纯化后的PCR产物Ⅰ；
取1μl的PCR产物Ⅰ用99μl的超纯水进行稀释，备用；
步骤四、第二次PCR反应
1）第二次PCR反应体系：在1.5ml的离心管D中配制20μl的PCR反应液Ⅱ，其成分
2+
为：选取稀释后的PCR产物Ⅰ1μl、1μl含Mg 的PCR 缓冲液，0.2μl的磷酸脱氧核糖核苷溶液，1μl的Taq DNA聚合酶，0.4μl的RNaseH 2引物和0.4μl的ΜP通用引物，余量为双蒸水，备用；
2）第二次PCR反应程序：将配制好的PCR反应液Ⅱ，放于PCR仪内，进行第二次PCR反应，反应程序为：94℃预变性5分钟，94℃变性50秒，55℃退火30秒，72℃延伸2分钟30个循环，72℃再次延伸10分钟，制得PCR产物Ⅱ，备用；
步骤五、PCR产物Ⅱ的检测
利用琼脂糖凝胶电泳对PCR产物Ⅱ进行检测；
称取1.0克琼脂糖粉末加入到100ml的1倍电泳缓冲液中并在微波炉内煮沸使琼脂糖粉末充分溶解，加入5µl的溴化乙锭溶液，至混合均匀止，后倒入制胶板中，插入制胶梳，凝固后的固体称为凝胶，拔去制胶梳，在凝胶上出现一排点样孔；将凝胶放入1倍电泳缓冲液中，将PCR产物Ⅱ加入到凝胶的点样孔中，打开电泳仪开关，在电泳仪电压为120伏特时开始电泳，电泳20分钟后关闭电泳仪，在凝胶成像系统中观察到目的基因后，备用；
步骤六、PCR产物Ⅱ的回收、纯化
对检测后的PCR产物Ⅱ利用GenClean琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行回收、纯化，取1.5ml的离心管E并称其重量，然后在紫外灯下将凝胶上含有的PCR产物Ⅱ的凝胶切下来，放在已称重的1.5ml的离心管E中，称取离心管E的总重并计算出从凝胶上切下来的PCR产物Ⅱ的重量，然后将离心管E中的PCR产物Ⅱ捣碎，加入等体积的溶液Ⅰ，混合均匀止，将离心管E放置在50ºC水浴中加热至离心管E中的物质完全融解止，将融解后的溶液加入到DNA纯化柱b上，DNA纯化柱b位于收集管b中，在21ºC条件下放置1分钟，后将收集管b放在离心机中，转速为12000转/分钟，离心1分钟，取出倒掉收集管b内的液体，再向收集管b内的DNA纯化柱b中加入700µl的溶液Ⅱ，在21ºC条件下放置1分钟，转速为12000转/分钟，离心1分钟，取出倒掉收集管b内的液体，后向DNA纯化柱b上加入
500µl的溶液Ⅱ，转速为12000转/分钟，离心1分钟，取出倒掉收集管b内的液体，将收集管b在转速为13000转/分钟，离心1分钟，取出DNA纯化柱b置于1.5ml的离心管F中，在DNA纯化柱b上加入40µl溶液Ⅲ，将离心管F在21ºC条件下放置1分钟，将离心管F在转速为13000转/分钟，离心1分钟，弃去DNA纯化柱b得到离心管F中的40µl液体，该液体就是纯化后的PCR产物Ⅱ，备用；
步骤七、感受态细胞制备
1）挑取大肠杆菌DH5α单菌落接种于LB培养基中，37 ℃培养16 小时，备用；
2）取1 ml步骤1）中的培养物，加入到含有10 mL LB培养基的三角瓶中，在37℃条件下振荡培养至OD值为0.5止，形成菌液，备用；
3）取50μl的菌液至1.5 ml离心管G中，在4 ℃条件下冷却10分钟，放于冷冻离心机内，4 ℃条件下，转速4000 转/分钟离心10 min，弃去上层澄清液体，得到沉淀物Ⅰ；
4）在沉淀物Ⅰ中加入0℃100 μl 0.1 mmol/L CaCl2溶液，混合均匀使细胞悬浮止，
0℃条件下放置20 min，备用；
5）取150μl含有沉淀物Ⅰ的CaCl2溶液移至1.5 ml离心管H中，在4 ℃条件下冷却
10分钟，放于冷冻离心机内，4 ℃条件下，转速4000 转/分钟离心10 min，弃去上层澄清液体，得到沉淀物Ⅱ；
6）在沉淀物Ⅱ中加入0℃100 μl 0.1 mmol/L CaCl2溶液，混合均匀使细胞悬浮止，
0℃条件下放置20 min，备用；
步骤八、转化
1）在含有100μg/ml氨苄青霉素的LB平板培养基上，涂抹4 μl浓度为200 mg/ml的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷和40μl浓度为20 mg/ml的5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷，后避光放置50分钟，备用；
2）在0℃的1.5 ml离心管I加入50 μl感受态细胞和10 μl连接反应液，混合混匀，
0℃条件下放置30 分钟，备用；
3）将1.5 ml离心管I放于42℃的水浴锅内，时间为90 分钟，取出，放于0℃冰水混合物中，时间为2 min，备用；
4、在1.5 ml离心管I中加入400 μl液体LB培养基，放于振荡摇床中，37 ℃条件下，转速300转/分钟，振荡培养时间60分钟，形成混合液A，备用；
5）取150μl混合液A，均匀涂布于LB固体培养基表层，37℃条件下倒置培养16小时，观察到蓝白相间的菌落，4℃保存备用；
步骤九、质粒DNA的提取
1）用灭菌环挑选白色单菌落放入含有500 μg氨苄青霉素和5 ml LB液体培养基的50 ml离心管中，放于振荡摇床中，37 ℃条件下，转速300转/分钟，培养16小时，形成培养液备用；
2）吸取1.0 ml培养液放于1.5 ml离心管J中，放于离心机内，转速12000 转/分钟，时间5min，弃去上层澄清液体，收集下层沉淀菌体A，加入的0℃的溶液Ⅰ100 μl，混合均匀使菌体悬浮，21℃条件下放置5分钟，备用；
3）在1.5 ml离心管K中加入200μl溶液Ⅱ混合均匀，放与-5℃条件下静置5分钟，备用；
4）在1.5 ml离心管K中加入150 μl溶液Ⅲ，混合均匀，放与-5℃条件下静置3分钟，后放于离心机内，转速12000转/分钟，离心5分钟，取上层澄清液体500μl至1.5ml离心管L中，备用；
5）在1.5ml离心管L中加入0.5 μl 100μg/μl的RNA酶，21℃条件下放置30分钟，加入等体积的苯酚、氯仿、异戊醇的混合液，其中苯酚、氯仿、异戊醇混合液按体积比取25份的苯酚、24份的氯仿和1份的异戊醇，混合均匀，放入离心机内，转速12000转/分钟，离心5分钟，取上层澄清液体500μl放入1.5ml的离心管M中，备用；
6）在1.5ml的离心管M中加入等体积的氯仿和异戊醇混合液，其中氯仿、异戊醇的混合液按体积比取24份的氯仿和1份的异戊醇，混合均匀，放入离心机内，转速为12000 转/分钟，离心2分钟，取上层澄清液体300μl放入1.5ml的离心管N中，备用；
7）在1.5ml的离心管N中加入2.5倍体积的-4℃无水乙醇，混合均匀，放入0℃的冰水混合物中30分钟，置在于离心机内，转速为12000转/分钟，离心时间5分钟，弃去上层澄清液体，加入500μl的70％乙醇，浸泡5小时；
8）弃去酒精，风干，在1.5ml的离心管N中加入灭菌的超纯水50μl进行溶解，－20℃储存，备用得到混合液B；
步骤十、阳性克隆菌检测
1）PCR反应体系：在1.5ml的离心管O中配制20μl的PCR反应液Ⅲ，其组分为：选取
2+
混合液B做为模板，取1μl含Mg 的PCR 缓冲液，0.2μl的磷酸脱氧核糖核苷溶液，1μl的Taq DNA聚合酶，0.4μl的RNaseH 2引物和0.4μl的UP通用引物，余量为双蒸水，备用；
2）PCR反应程序：将配制好的PCR反应液Ⅲ，放于PCR仪内，进行PCR反应，反应程序为：94℃预变性5分钟，94℃变性50秒，55℃退火30秒，72℃延伸2分钟30个循环，72℃再次延伸10分钟，制得PCR产物Ⅲ，备用；
对PCR产物Ⅲ进行琼脂糖凝胶电泳检测，得到质粒DNA，进行序列测定，后采用生物统计软件DNA Star 5.0推断RNaseH酶的氨基酸序列，得到Ty1-copia 类反转录转座子长末端重复序列，利用氨基酸序列编码蛋白；
RNaseH酶的氨基酸编码的蛋白为：
RTKHIDVRYHIVRDVIEKGDISLSKVHTNENPADMLTKVVTGSKIQHHLDLLHISPC。