一种获得山羊诱导性多能干细胞的新方法
专利汇可以提供一种获得山羊诱导性多能干细胞的新方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种获得山羊诱导性多能干细胞的新方法：本方法首先从山羊睾丸组织、 皮肤 组织和小肠组织中提取总RNA，反转录获得cDNA 片段 ，并以此为 模版 克隆获得山羊的Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc多能性转录因子的编码序列。利用胰酶消化法获得山羊及小鼠的 胎儿 成 纤维 细胞 ，并制备饲养层细胞和配制细胞培养液。利用体外转录试验获得的各多能性转录因子的mRNA，经脂质体2000介导， 转染 山羊胎儿成纤维细胞，以制备山羊iPS细胞。克隆扁平、致密、核质比大、克隆边界清晰和折光性强的细胞集落判定为山羊iPS细胞集落。采用单克隆挑取，分别用胰酶消化，单独接种至新的接种有饲养层的培养孔板中继续培养，以获得山羊iPS细胞系。，下面是一种获得山羊诱导性多能干细胞的新方法专利的具体信息内容。
1.一种获得山羊诱导性多能干细胞的新方法，其特征在于：包括如下步骤：
一、多能性转录因子的克隆
①总RNA提取
利用RNA提取试剂盒分别提取山羊睾丸组织、皮肤组织和小肠组织的总RNA，提取步骤为：
(1)在用DEPC水处理过的研钵中分别加入50-100mg山羊睾丸组织、皮肤组织和小肠组织样品，加入液氮迅速研磨至粉状，分别装入1.5mL EP管中，并分别快速加入1mL的Trizol，混匀后室温静止10分钟；
(2)用标准为4℃、12000rpm的冰冻离心机离心10min，移上清至新的EP管中，加
200μL氯仿用力反复摇晃15s，25℃下放置3min后用同样标准离心15min；
(3)将EP管中上面的水相移到另外一个新管中，加400μL异丙醇，混匀，室温放置
15min，然后以相同标准离心10min；
(4)弃上清液，加1mL用DEPC水处理的75％乙醇洗涤RNA，然后以相同标准离心5min；
(5)弃去乙醇，在空气中干燥5min，加入20μL的去离子甲酰胺，轻轻吹吸几次，将RNA完全溶解，并分装后-80℃保存；
②RT-PCR反应
将上述总RNA利用反转录试剂盒反转录获得cDNA片段，并以此为模版，利用高保真primer star mix酶、上下游引物，克隆Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc多能性转录因子的编码序列，其中，扩增体系为：模板1ul，上下游引物各1ul，酶12.5ul，d2H2O 9.5ul；反应条件：
94℃预变性2min，94℃变性1min，退火30sec,其中Oct4退火温度为56℃、Sox2退火温度为56℃、Klf4退火温度为58℃、c-Myc退火温度为60℃，72℃延伸30sec，重复35个循环，
72℃延伸10min，4℃保存；
③克隆产物与T载体连接
扩增产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳分析，切胶回收目的片段后与pMD19-T simple克隆载体连接：条件为16℃，16h；
④感受态细胞的制备及转化
(1)感受态细胞制备：挑取在LB固体培养基上生长的受体菌单菌落，按照1:100的比例接种于LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜，取250uL培养过夜受体菌接种于25mL LB液体培养基中剧烈振摇培养至OD600值0.5左右，将菌液转入50mL离心管中，冰上放置
10min，在4℃，5000rpm离心10min，弃去上清，将管倒置一边液体流尽；用冰预冷的0.1mol/LCaCl2 10mL重悬沉淀，冰上放置30min；4℃，5000rpm，离心10min，弃去上清，加入2mL冰预冷的0.1mol/LCaCl2和80％甘油混合液重悬，并冰上放置。分装后-70℃保存备用；
(2)转化：取制备好的感受态细胞DH5α，迅速放于冰上融化，将10μL连接反应产物加入200μL的感受态细胞中，轻轻旋转以混匀，冰中放置45min；42℃热激45-90s，快速将离心管转移到冰浴中，细胞冷却2-3min；每管加入800μL LB液体培养基，于37℃轻微振荡培养1h；超净台中将200μL菌液涂布到含有氨苄青霉素的LB平板上，均匀涂板，37℃恒温培养12-16h；
⑤菌液PCR、单双酶切、测序鉴定
挑取平板上的阳性菌落，将单菌落接种到含氨苄青霉素的1ml LB培养基中，180rpm摇床培养4-6h，吸取菌液进行PCR检测，反应体系如下：菌液模板1μL,
rTaq酶0.5μL,dNTP 2μL,10×buffer 2μL,Primer F 1μL,Primer R 1μL,d2H2O
12.5μL,总体积20μL；
反应条件：94℃预变性2min；94℃变性1min，退火30sec(其中Oct4退火温度为56℃、Sox2退火温度为56℃、Klf4退火温度为58℃、c-Myc退火温度为60℃)，72℃延伸30sec，重复35个循环，72℃延伸10min，4℃保存，扩增产物用1.0％的琼脂糖凝胶电泳检测；
将菌液PCR鉴定正确的条带，根据转录因子各自引入的酶切位点，分别采用EcoR I、XhoI、XbaI进行单酶切与双酶切，将酶切鉴定正确的进行测序，将含正确插入片段的重组质粒命名为pMD19-T-Oct4、pMD19-T-Sox2、pMD19-T-Klf4和pMD19-T-c-Myc；
二、真核表达载体的构建
用EcoRI和XhoI限制性内切酶双切鉴定正确的pMD19-T-Oct4、pMD19-T-Sox2、pMD19-T-c-Myc质粒，用EcoRI和Hind III限制性内切酶双切鉴定正确的pMD19-T-Klf4质粒，胶回收目的片段，同时用相对应的限制性内切酶双切pcDNA3.0载体，胶回收目的载体，用T4 DNA连接酶16℃条件下连接16h，连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞，挑选阳性克隆经菌液PCR、单双酶切鉴定，将含正确插入片段的重组质粒命名为pcDNA3.0-Oct4、pcDNA3.0-Sox2、pcDNA3.0-Klf4和pcDNA3.0-c-Myc，并进行测序鉴定；
三、体外转录
①质粒准备
将测序正确的pcDNA3.0-Oct4、pcDNA3.0-Sox2、pcDNA3.0-Klf4、pcDNA3.0-c-Myc和pcDNA3.0-EGFP重组质粒按照1：1000的比例接种到10ml含有氨苄青霉素(50ug/ml)的LB液体培养基中，37℃，180rpm摇床培养14-16h，待菌液浑浊、发白，且OD值约为0.6时，4℃、
8000rpm离心3min收集菌体，利用质粒小提试剂盒进行小提；
②质粒线性化
利用XhoI、XbaI限制性内切酶进行线性化处理，线性化条件为37℃水浴3h，利用DNA纯化试剂盒对线性化处理后的产物进行纯化，最终获得各质粒的浓度范围为：200-500ng/uL；
③体外转录
利用mMESSAGE T7 Ultra Kit试剂盒对纯化产物进行体外转录，将
mMESSAGE T7 Ultra Kit中的试剂置于冰上解冻，以下步骤均在冰上操作：
(1)mRNA“加帽”
在PCR管中依次加入以下试剂：T7 2×NTP/ARCA 10uL,10×T7 Reaction Buffer
2uL,linear template DNA 0.1-1uG,T7 Enzyme Mix 2uL,并用无核酸酶的水补充至20uL，温和的混合上述反应溶液，在37℃条件下水浴2h；
向上述PCR管中添加1uL TURBO DNase，混合均匀，37℃条件下水浴15min；
(2)mRNA“加尾”
在PCR管中依次加入以下试剂：上述混合物20uL，Nuclease-free Water 36uL，
5×E-PAP Buffer 20uL，25mM MnCl2，10uL，ATP Solution 10uL，总体积96uL；
向上述管中添加4ul E-PAP，轻轻混合，终体积为100ul，并在37℃条件下水浴
30-45min；
(3)mRNA纯化
TM
对“加尾”和“加帽”处理后的mRNA利用MEGAclear Kit进行mRNA纯化，收集纯化后的mRNA，利用NANO DROP分光光度仪检测其浓度和OD值，最终获得各mRNA的浓度范围为：
100-500ng/uL；
四、山羊及小鼠胎儿成纤维细胞的分离
采集山羊胎儿，用含双抗的PBS溶液，青链霉素为100万单位/L，冲洗三次，置于培养皿中，去除胎儿的四肢、头部、内脏、骨骼，余下组织用含双抗的PBS冲洗数次后置于新的培养皿中，用眼科剪刀剪碎，加入上述体积2.5倍的0.25％胰酶消化，随后移至西林瓶中，并置于37℃水浴锅中消化30min，中间每隔10分钟震荡西林瓶，吸取西林瓶中上部液体，加入其体积2.5倍的含10％FBS的高糖DMEM培养基终止消化，依次用100目、200目尼龙网筛过滤消化产物，1000rpm离心5-10min，含10％FBS的高糖DMEM培养基重悬细胞，调整密度
6
至1-10×10个/ml，在100mm细胞培养皿中加入细胞悬液，然后放入37℃、5％CO2浓度培养箱中培养，待原代细胞生长至90-100％的汇合度时，用0.25％胰酶消化传代，弃去原先培养基，用PBS溶液清洗3遍，添加1.5mL 0.25％胰酶消化细胞，然后用含10％FBS的高糖DMEM培养基终止消化，将细胞吹打成单细胞悬液后1000rpm离心6-8min，收集沉淀物，含
10％FBS的高糖DMEM培养基重悬细胞，调整好细胞密度，放入37℃、5％CO2浓度培养箱中培养，小鼠胎儿成纤维细胞的分离方法同上；
五、饲养层细胞的制备
取出分离冻存的GEF细胞和MEF细胞，快速解冻并用含10％FBS的高糖DMEM培养，待细胞汇合度达90％时，用含10ug/mL丝裂霉素C的高糖DMEM培养液处理2.5-3.0h，随后用
4 -1 4 -1
0.25％的胰酶消化细胞，以血球计数板计数，将5×10mL MEF细胞和5×10mL GEF细胞混合均匀并接种于0.1％明胶包被的12孔板中，用含10％FBS的高糖DMEM培养基培养细胞，并在接种前2-3h更换为设计的山羊iPS细胞培养液；
六、细胞培养液的配制
向500mL KnockoutDMEM培养基中加入100mL血清替代物、0.293g L-谷氨酰胺、5mL
5
非必需氨基酸、1uLβ-巯基乙醇、5mg bFGF、5×10U LIF，使培养液的最终组分及浓度为：
KnockoutDMEM、20％血清替代物、1mmol/L L-谷氨酰胺、1mmol/L非必需氨基酸、0.1mmol/L β-巯基乙醇、10ng/mL bFGF、1000U/mL LIF；
七、mRNA的转染
在24孔板中，利用体外转录试验获得的各多能性转录因子的mRNA，经脂质体2000介导，按照脂质体2000：mRNA＝1：1(1uL与1uG)的比例转染接种密度为70％左右的GEF细胞，并记录此时GEF细胞的总数，间隔24h连续转染5次后，GEF细胞经0.25％胰酶消化后传至预先准备好饲养层的孔板中，用细胞培养液培养，隔天换液，直至出现山羊iPS细胞；
八、诱导效率的计算
将诱导获得的山羊iPS细胞用AKP染色试剂盒染色，记录AKP阳性克隆个数，利用以下公式计算诱导效率：诱导效率(％)＝AKP阳性克隆数(个)/转染前GEF细胞总数(个)；
九、山羊iPS细胞的形态特征识别
在显微镜下将视野内克隆扁平、致密、核质比大、克隆边界清晰和折光性强的细胞集落判定为山羊iPS细胞集落；
十、iPS细胞的挑取与传代
待培养皿或培养瓶中的细胞汇合度达80％-90％时，用胰酶消化，按照1：3-5的比例传代，传代的细胞要接种到铺有新饲养层的孔板内培养，1个iPS集落的细胞团接种1个孔，间隔1d换液，并观察集落形态，分散的iPS细胞继续培养4-6d，此时出现的iPS细胞集落记为F1，用相同的方法对其分离、传代，并接种于饲养层上，再出现的iPS细胞集落记为F2，依次类推，直至建立山羊iPS细胞系。
一种获得山羊诱导性多能干细胞的新方法
技术领域：
具体实施方式
72℃延伸10min，4℃保存；
30sec，重复35个循环，72℃延伸10min，4℃保存，扩增产物用1.0％的琼脂糖凝胶电泳检测；
6
细胞，调整密度至1-10×10个/ml，在100mm细胞培养皿中加入细胞悬液，然后放入37℃、
5％CO2浓度培养箱中培养，待原代细胞生长至90-100％的汇合度时，用0.25％胰酶消化传代，弃去原先培养基，用PBS溶液清洗3遍，添加1.5mL 0.25％胰酶消化细胞，然后用含
10％FBS的高糖DMEM培养基终止消化，将细胞吹打成单细胞悬液后1000rpm离心6-8min，收集沉淀物，含10％FBS的高糖DMEM培养基重悬细胞，调整好细胞密度，放入37℃、5％CO2浓度培养箱中培养，小鼠胎儿成纤维细胞的分离方法同上；
随后用0.25％的胰酶消化细胞，以血球计数板计数，将5×10mL MEF细胞和5×10mL GEF细胞混合均匀并接种于0.1％明胶包被的12孔板中，用含10％FBS的高糖DMEM培养基培养细胞，并在接种前2-3h更换为设计的山羊iPS细胞培养液；
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