关于表皮生长因子受体(EGFR)及其小分子抑制剂基因靶向药物吉 非替尼(gefitinib)，表皮生长因子受体家族是细胞信号传导系统的 门户蛋白，于1950年首次分离成功。现已知有四个亚型，即Erb-B- 1，Erb-B-2，Erb-B-3和Erb-B-4.，目前最著名的是Erb-B-1和Erb-B- 2亚型，它们分别由Her1和Her2原癌基因产生，Her1即是产生EGFR的 功能基因，Her2是产生Neu(Cerb-B2)的功能基因。EGFR在细胞内外有 三个功能域，即细胞膜外区、跨膜区和胞浆区，前者以表皮生长因子 EGF和转化生长因子-α(TGFα)为配体，后者有酪氨酸激酶活性，与 配体结合后发生自身磷酸化，从而启动细胞信号传导瀑布反应。
EGFR与癌的发生和生长关系密切：
a、跨膜区和胞浆区氨基酸序列与逆转录病毒癌基因v-erb-B同 源；
b、多数肿瘤细胞过度表达EGFR1和EGFR2，并与恶性程度呈正相 关。
c、许多肿瘤也过度表达EGFR配体TGF-α，二者共同促进肿瘤增 殖，因此美国政府FDA在2003年5月批准了美国阿斯力康 (Aotrazeneca)公司生产的小分子基因靶点药物-EGFR酪氨酸激酶抑 制剂吉非替尼(gefifinib，商品名Iressa，ZD1839)上市，我国在 2005年2月批准其上市。它可以特异性地竞争结合癌细胞EGFR激酶功 能区的ATP结合位点，从而抑制了该激酶的活性，抑制肿瘤的生长、增 殖，却无明显的化疗副作用等不良影响。中国目前尚未有检测EGFR基 因突变后进行吉非替尼治疗的文献报导，但分析中国非小细胞肺癌患者 该基因突变率明显高于欧美白人和黑人，成为该药在我国疗效明显的主 要因素。分子靶向药物的研制，是基于癌症是起因于细胞DNA结构和功 能异常的病因发病机制的认识，旨在寻找其特异的基因发病环节和靶点 而针对性的精确治疗，但在临床应用上却一波三折，脱离常规，如 Gleevec是最初针对Abl融合基因靶点而设计的治疗慢性粒细胞白血病 的药物，其疗效却未达到理想设计要求，但在难以化疗的胃肠道间质瘤 的治疗方面表现出神奇疗效，后来认识到该药物的靶点也作用于GIST 的c-kit基因，更多的临床应用发现Gleevec的疗效与GIST的c-kit 基因蛋白产物CD117的免疫组化表达阳性有关，所以现在对胃肠道间质 瘤事先检测CD117表达是否阳性，已成为Gleevec分子靶向药物治疗的 常规。而Gefitinib最初是由日本人依据其表皮生长因子受体抑制剂的 逻辑原理，应用于上皮性恶性肿瘤特别是大肠癌的EGFR基因分子靶点 和其内含子CA重复序列多变性基因治疗，但在临床应用发现，它对上 皮性恶性肿瘤治疗，以非小细胞肺癌的控制肿瘤生长、减痛、止咳、止 喘等效果明显，以后由美国、加拿大和日本临床医师们组织了更精细的 科学的临床应用调查，但基于其靶向药物的机理，必须要找出肺非小细 胞肺癌在基因水平上特别是EGFR基因靶点的发病和治疗环节的对应关 系，最终由《science》和《新英格兰杂志》前后刊文并得出了几乎一 致的结论：非小细胞肺癌的EGFR外显子18、19和21存在着突变和大 片段缺失，因而表达异常活跃，促使肿瘤增生，而Gefitinib临床作用 于EGFR胞浆内ATP功能区并阻断其促肿瘤增生的作用，诱导其凋亡。 该报告由世界最权威杂志发布，获得世界肿瘤界公认，于是很快获美国 FDA批准应用于临床，短短数月，该药通过EAP计划已积累了3万9千 人的数据。
由于吉非替尼的疗效与EGFR基因突变有关，而日本和中国人的 EGFR突变率高于欧美和黑人数十倍，《science》刊文报道欧美和黑人 非小细胞肺癌EGFR突变率仅2％，而日本达28％，美国I NTACT大规模 临床用药结果显示该药对欧美和黑人运用范围极其有限，与化疗药物相 比无疗效差异，就美国两亿人口，0.7‰的肺癌发病率计算，每年新增 肺癌不足10万人，其中2％的吉非替尼药敏率，该药适用人数不足500 人/年，而亚洲有10倍于美国的人口和10倍于美国药敏率，每年至少 5万以上的药物适用人群，如每人耗资1万美金，就达到5亿美金/年 的额度，再加之检测各种肿瘤的EGFR基因人口会达10倍于肺癌的药敏 人口，国外公司在亚洲，中国可能获取的利润空间十分惊人，可达300 亿/年人民币元之巨。吉非替尼疗效与EGFR基因突变直接相关，因此 预检基因突变实施个体化治疗能够更有针对性，《science》在2004年 4月记载，执行EAP计划的125例非小细胞肺癌患者中，选择5例有疗 效，4例无疗效者，经基因测序检测，全部5例有效者存在EGFR外显 子突变(L858R 2239-2247Del 2240-2257Del 2238-2255Del)，而 4例无效者无一例突变。体外培养的对吉非替尼50倍敏感的肺癌的细 胞株H2355也存在着L858R突变。《新英格兰杂志》在同期刊文对275例 服用吉非替尼的非小细胞肺癌病例临床应用分析，有25人有临床疗 效，其中9人检测EGFR全长密码子，发现8例存在突变，突变方式和 位点与《science》报导和基本相同，而7例未显疗效者无一例突变发 生。另16例有疗效者因针刺标本未能获得DNA而放弃检测。另一方 面，未进行基因检测而在欧美进行了2600例大范围的联合健择和紫杉 醇和卡铂治疗晚期非小细胞肺癌的III期临床试验(INTACT2)被证明患 者生存率无明显改善，原因在于欧美非小细胞肺癌病人存在大量EGFR 突变阴性人群(95-98％)，所以绝大多数临床工作者提出，吉非替尼 服药前需预检非小细胞肺癌组织的EGFR基因突变，如有突变则疗效超 过无突变者100倍。应视突变存在与否实施个体化治疗，因为长达16 个月以上的用药将会怡误病情，耗资巨大，且有一定的副作用。
《science》刊文记述了16位未接受吉非替尼治疗的非小细胞肺癌 患者，基因测序显示了各种EGFR基因突变，其中15位是日本人，均为 肺腺癌，10人为女性。因此认为，EGFR突变及与吉非替尼治疗反应 性，在日本和美国人间存在巨大差异，提示分子病理发病机制与种族、 性别和病理类型有着明显的关系。日本人报道101例服用吉非替尼的非 小细胞肺癌患者20人有效，总的有效率为19.8％，远高于欧美和黑人 11.8％的有效率，而中国人执行EAP计划统计的有效率为22.2％，经 过基因检测已发现在亚洲人肺腺癌和女性人群中EGFR的突变率14％- 57％不等，远高于欧美人平均2％的低突变率，而日本人对277例肺癌 EGFR基因测序，发现111例(40％)存在基因突变，其中52例19外 显子缺失，54例21和18外显子点突变，5例有复制和插入。
我国EGFR基因突变检测现状与其它EGFR检测方法分析：国际权威 杂志《science》刊文，明确指出用免疫组化方法检测EGFR表达水平与 吉非替尼治疗非小细胞肺癌无关，目前尚未见有类似的国内外文献，肯 定免疫组化和ELISA方法检测EGFR蛋白水平与吉非替尼疗效有关，因 此，用基因测序方法检测EGFR18、19和21外显子全长的DNA序列，成 为预测吉非替尼疗效的肯定的方法。现有技术存在的问题和缺点：表皮 生长因子受体基因测序检测分析技术是在2004年4月首先由美国Paez JG和Lynch TJ分别在《sci ence》和《新英格兰杂志》发布的，他们 均是采用的NCBI数据库EGFR20条外显子全长的DNA基因，以巢式PCR 方法扩增EGFR106条基因短片段，以相同的基因测序方法和仪器类型得 到检测结果。
主要是发现了检测出EGFR第18外显子、第19外显子和第21外显 子发生上述基因突变(第21外显子2497位T＞G突变，2504位A＞T 突变例外，由发明人独自首先发现)。
上述发现解释了吉非替尼和Tarciva治疗非小细胞肺癌有疗效和无 疗效的分子靶点机制，但是上述技术存在若干问题：
1、设计了EGFR外显子106条短片段可以更全面地检测序列，不至 遗漏EGFR外显子DNA全长，但不能实际应用于临床检测应用，否则仅 一例病人的EGFR基因常规外显子检测耗时将达1个月以上，耗资更相 当可观。故发明人设计了三个完整的外显子片断包括了部份内含子、剪 切子，调控区，既可完整检测上述EGFR外显子所报道的全部病变位点 和突变方式，也可使PCR程序更为优化，提高检出率，更可让该项检测 进入实际应用。
2、Paez JG和Lynch TJ公布的EGFR外显子检测方法，主要反应 欧美高加索人种和黑人的基因状态，但基因事件已公认存在人种、地域 等差异性，发明人设计的EGFR第18、19和21外显子基因片段，可以 逐个从碱基和氨基酸水平与观察分析中国人特有的该基因序列特征和突 变特点，发明人发现的第21外显子T＞G突变和A＞T及852位密码子 始插入G突变是国内外均未见报道的新的杂合性突变，用于分析中国人 靶向药物治疗具有针对性。
3、Paez JG和Lynch TG的EGFR外显子检测项目，仅是2004年新 发现的基因检测技术，主要是用于实验研究。2004年底日本人利用总 RNA提取技术进行CDNA PCR扩增，将该技术应用于临床病理科的分子 病理基因检测，但该技术人工地额外增添了RNA-DNA逆转录PCR环节， 有可能对杂合性单链基因突变事件增加假阳性污染或假阴性漏检，并增 加了检测的时间和经费，且缺乏临床基因病理申请和报告书样本以及技 术操作规范。
4、国内各医疗机构、医院部门尚未设立该项临床基因病理检测项 目，甚至未能检索到医学、生物学实验室的EGFR外显子检测报告或数 据。

本发明的目的在于针对上面所述的现有技术的不足，提供一种表皮 生长因子受体基因检测分析方法。
本发明是采取以下的技术方案来实现的：
表皮生长因子受体(EGFR)基因测序检测方法：
(1)检测材料和对象
各种途径获取的非小细胞癌的体细胞组织，肺癌的石蜡包埋组织的 切片，肺癌晚期转移灶组织和血液中的癌细胞、肺癌胸水和穿刺细胞、 痰细胞；
(2)使用试剂和仪器
V-gene公司、Roche公司DNA提取的市售试剂盒
promega PCR纯化市售试剂盒
ABI测序市售试剂盒
仪器：DNA定量仪  电泳仪  自动凝胶显像系统  PCR仪  冷
      冻离心机  基因测序仪  基因分析软件
(3)检测流程
①首先对检测材料进行病理学技术制片，观察，出具病理诊断报 告，备案，判断是否为非小细胞肺癌并病理分类，选定病灶区 域后取材切片纳入基因测序检测；
②组织前处理及抽提DNA，每批组设立肺癌周围组织对照；
③DNA定量仪检测样本质量(260nm吸光率大于0.05，A260/A280 比值1.6-1.8，320nm波长处吸光率接近零)；
④使用已设定的引物(EGFR外显子18、19和21全长DNA序列) 进行PCR扩增(Touchdown技术)；
⑤凝胶自显影电泳观察分析PCR效果
⑥PCR产物纯化
⑦PCR产物进行测序反应
⑧使用基因测序仪进行EGFR基因的测序和分析；如阴性结果时做 双向测序检测；
⑨依据病理诊断，临床检查治疗情况和序列分析结果进行综合评 估，完成EGFR病理基因测序报告；
(4)观察指标
依据美国国立医学图书馆(www.NCBI.NLM.NIH.GOV)提供的EGFR DNA公开序列(NM-005228)和mRNA的序列，确定EGFR第18、19和21 外显子全长片断；
①EGFR第18外显子片段长度为437bp，序列见后述
主要观察核苷酸2155G＞A突变，即氨基酸G719s改变
②EGFR第19外显子片断长度为411bp，序列见后述
主要观察核苷酸2235-2249Del，即氨基酸E746-A750del缺失现象
        核苷酸2236-2250Del，即氨基酸E746-A750del缺失现象
        核苷酸2254-2277Del，即氨基酸S752-I759del缺失现象
其它核苷酸片段缺失、插入、重复等现象，如氨基酸L747- T751insS，L747-P753insS和L747-A750del等；
③EGFR第21外显子，片段长度为399bp，序列见后述
  主要观察核苷酸2576T＞G，即氨基酸L858R突变
  核苷酸2497T＞G(L833V)2504A＞T(H835L)
其它核苷酸杂合突变等现象：如氨基酸L861Q突变；
  核苷酸第2556位插入碱基G    (Q852)
首先确定EGFR第18、19和21外显子基因碱基序列及其突变位 点：
根据美国国立图书馆(www.NCBI.NLM.NI H.gov)公开提供的EGFR 全基因序列(NM-005228)和mRNA序列，参照美国ABI公司Celerar数 据库相关基因文献和《(science》2004、304(5676)：1457-1500， Epub EGFR全基因组文献，本发明选定需要测序的EGFR基因外显子如 下：
Exon18
EGFR18外显子序列
ccgtgtcctggcacccaagcccatgccgtggctgctggtccc
cctgctgggccatgtctggcactgctttccagcatggtgagggctgaggtgacccttgtctc
tgtgttcttgtcccccccagCTTGTGGAGCCTCTTACACCCAGTGGAGAAGCTCCCAACCAA
GCTCTCTTGAGGATCTTGAAGGAAACTGAATTCAAAAAGATCAAAGTGCTGG CTCCGGTGC
GTTCGGCACGGTGTATAAGgtaaggtccctggcacaggcctctgggctgggccgcagggcct
ctcatggtctggtggggagcccagagtccttgcaagctgtatatttccatcatctactttac
tcttt
Exon19
EGFR19外显子序列
acccagatcactgggcagcatgtggcaccatctcacaattgc
cagttaacgtcttccttctctctctgtcatagGGACTCTGGATCCCAGAAGGTGAGAAAGTT
AAAATTCCCGTCGCTATCAA ACA
CTCGATgtgagtttctgctttgctgtgtgggggtccatggctctgaacctcaggcccacct
tttctcatgtctggcagctgctctgctct
Exon21
EGFR21外显子序列
atgaccctgaattcggatgcagagcttcttcccatgatgatc
tgtccctcacagcagggtcttctctgtttcagGGCATGAACTACTTGGAGGACCGTCGCTTG
GTGCACCGCGACCTGGCAGCCAGGAACGTACTGGTGAAAACACCGCAGCATGTCAAGATCAC
AGATTTTGGGC GGCCAAACAGCTGGGTGCGGAAGAGAAAGAATACCATGCAGAAGGAGGCA
AAtaaggaggtggctttaggtcagccagcattttcctgacaccagggaccaggctgccttcc
cactagctgtattgttt
对上述基因片段的观察突变位点主要包括三方面：
(1)已报道的突变位点
Exon 18    核苷酸第2155位  G＞A突变          (G719S)
Exon19     核苷酸第2235-2249缺失             (E746-A750del)
           核苷酸第2236-2250缺失             (E746-A750del)
           核苷酸第2254-2277缺失             (S752-I759del)
           核苷酸缺失                        (L747-T751insS)
           核苷酸缺失                        (L747-P753insS)
           核苷酸缺失                        (L747-A750del)
Exon21     核苷酸第2573      T＞G突变        (L858R)
           核苷酸突变                        (L861Q)
(2)中国人新发现的突变位点
Exon21     核苷酸第2497位    T＞G            (L833V)
           核苷酸第2504位    A＞T            (H835L)
           核苷酸第2556位插入碱基G           (Q852)
(3)由发明人发现的EGFR18、19和21外显子新突变位点
(5)设计引物
依据上述EGFR基因片段，确定了EGFR第18、19和21外显子，利 用Oligo软件独立设计相应的引物，并参考优化的PCR条件和测序适应 性分析，合成引物序列如下：
18外显子  上游引物5’TCC AAA TGA GCT GGC AAG TG 3’
          下游引物5’TCC CAA ACA CTC AGT GAA AC 3’
19外显子  上游引物5’GTG CAT CGC TGG TAA CAT CC 3’
          下游引物5’TCT GGA GAT GAG CAG GGT CT 3’
21外显子  上游引物5’GCT CAG AGC CTG GCA TGA AC 3’
          下游引物5’CAT CCT CCC CTG CAT GTG TT 3’
(6)、提取模板DNA
新鲜组织：V-gene公司DNA提取试剂盒
固定和石蜡：Roche公司DNA提取试剂盒
血液和液体细胞：Promega公司DNA提取试剂盒
以上均按说明书指示方法操作，以凝胶电泳系统检测DNA模板和质 量，然后用eppendorf核酸定量仪测定DNA浓度，选择dsDNA为测定目 标，260nm吸光率大于0.05以上(DNA含量大于2.0ug/ul)，吸光率 A260/A280比值1.6-1.8之间，320nm波长处吸光率接近为0的样本作 为适用模板；
(7)、PCR扩增和纯化
对获取的符合条件DNA模板，以touch down技术扩增目的基因片 段，反应体系如下：
PCR体系：(总体系20μl)：10×PCR Buffer(含15mM MgCl2×)2μ l，HotStarTaq DNA Polymerase(QI AGEN公司)0.2μl ，5×Q- Solution 4μl ，dNTP mix(10mM of each)2μl ，Primer 1 1 μl ，Primer 2 1μl ，模板DNA 1μl ，Distilled water 8.8μl ；
PCR条件：置ABI-2700型扩增仪中95℃预变性15min，用 TouchdownPCR，94℃变性50sec，63℃-58℃退火1min(-0.5℃ /1min，72℃延伸1min，共循环10次，94℃变性50sec，57℃退火 1min，72℃延伸1min，共循环30次，最后于72℃延伸10min；
PCR产物质量控制：PCR反应产物要求条带单一，浓度30-100ng PCR酶应用QIAGEN公司HotStarTaq DNA Polymerase、ABI公司金牌酶 及优质的国内外其它酶；
PCR产物纯化：
A、过柱纯化：上海生物工程公司纯化试剂盒
Promega公司PCR纯化试剂盒
Qiagen公司PCR纯化试剂盒
B、酒精/EDTA纯化：
产物纯化后凝胶显像电泳评估纯化质量，编号、存档(-80℃)
C、测序反应及纯化
因目前所知的EGFR第18、19和21外显子均为杂合突变、缺失， 故将10um的正反向引物均稀释到1um，按下列体系添加反应物： 1ul BigDye(2.5X)+1.5 ul BigDye Seq Buffer(5X)+3ul引物+ 1ulPCR纯化产物+3.5ul ddH2O；
(8)、测序结果分析和报告
测序结果形成书面报告操作人和鉴报告人签字、注期，并附上原始 测序电泳图、序列图交给临床或患方；
(9)、档案处理登记
所有检测对象均填写登记申请单，注明病史、病理诊断、复查HE 切片；
全部DNA模板，PCR纯化产物均编号-80度超低温保存备查。
EGFR基因外显子检测，主要的发明目的和要解决的任务如下：
(一)所有的非小细胞肺癌临床药物应用疗效分析表明：吉非替尼 和Tarciva显效者均有高达70％-90％的EGFR外显子突变率，而无效 者相应的突变率几乎为零，所以临床用药前，预检EGFR基因突变存在 与否是解决针对性个体化治疗的有效方法。
(二)EGFR基因外显子检测，必须由实验研究转化、开发可操作 的临床应用性检测项目，国外Paez JG等设计的检测方法，采用28个 EGFR全部外显子，设计了106对DNA碱基短片段，进行DNA双链正向 和反向的检测，这在实验研究阶段进行系统而全面的探索是必要的，但 进行临床检测将会形成天文数字的工作量和经费，经发明人研究，综合 各方报道，已明确Exon18有G＞A突变(G719S)，Exon 19有E746- A750del，S752-I759del，L747-T751insS，L747-P753insS，L747- A750del。Exon 21有L858R、L861Q、2497位T＞G突变和2504A＞T突 变，核苷酸第2556位插入碱基G(Q852)，发明人设计的外显子片段， 包容了上述全部观察点，简缩成3对外显子片段；在单一链无阳性序列 发现后再测量另一DNA链，首先使该项目临床病理检测在技术上可行。
本申请内容属于基因检测技术方法项目，其原理是：
1、治疗非小细胞肺癌的分子靶向药物是不同于传统化疗的里程碑 式的发明，但有EGFR基因突变者用吉非替尼治疗70％-90％会有疗 效，其效率高于EGFR基因突变阴性者100倍。
2、应用吉非替尼治疗非小细胞肺癌，国内外资产显示对亚洲人疗 效最好，主要原因是亚洲人EGFR基因突变率在世界上最高。
3、该类药物2004年通过FDA申批，2005年3月即将进入中国， 而国内在应用发明之前尚未有该项检测项目的研究临床应用。
4、中国人的EGFR基因有自身的特征，国人的类似基因突变检测项 目反应中国特色。
发明应用对象和材料
1、应用对象适用于非小细胞肺癌患者肿瘤体细胞的EGFR基因突变 测序检测。
2、使用材料指离体的肿瘤新鲜组织、细胞、痰液、肿瘤蜡块，已 固定组织，血液转移细胞、穿刺组织细胞、转移灶组织细胞等可检测材 料。
工艺条件：
1、环境条件
DNA模板提取PCR扩增和测序反应必须分区或分室操作，严防 交叉污染，规范污染物处理。
2、人员条件
相关操作人员须经《国家实验室认可制度》培训班培训合格，具有 病理执业医师资格硕士研究生毕业以上，临床病理诊断从业三年以上， 有分子病理实验基础。
3、硬件条件
DNA分光光度定量仪，自动凝胶显像仪，测序级PCR扩增仪，电泳 仪，冷冻离心机，高速离心机，DNA分析仪(基因测序仪)，宽带互联 网。
4、软件条件
具有熟练的分子生物和分子病理知识技能查阅NCBI和相关文献库
会使用3100-AvantDate Collection 2.0软件运行测序仪
会分析DNA sequencing analysis 5.1软件分析原始数据
DNA seqScape软件自动比较基因突变
DNA star seqman软件手工比较基因突变
纳入标准
1、病理诊断标准
肺非小细胞癌
肠腺癌
脾癌
乳腺癌
前列腺癌
肾细胞癌
胰腺癌
食道癌
甲状腺癌
头颈部癌
2、观察基因突变纳入标准
(1)目前已报道的8个突变位点和异常现象：G719S E746- A750del S752-I759del L747-T751insS L747-P753insS L747-A750del L858R L861Q
(2)发明人发现的以下突变位点Exon21T＞G(L833V)
                                 A＞T(H835L)
               核苷酸第2556位插入碱基G(Q852)
(3)发明人发现的EGFR18、19和21外显子新突变和异常现象.
有益效果：
(一)EGFR基因突变测序检测可以明确预报分子靶向药物治疗非 小细胞肺癌的良好疗效。
1、2004年《science》刊文在125例非小细胞肺癌患者中对吉非 替尼治疗有效的5例全部存在EGFR外显子18、19和21的突变(100 ％)，而无效的4例患者无一例存在上述突变，在体外细胞培养实验中 显示对吉非替尼抗癌疗效是50倍高敏感的非小细胞肺腺癌株H2355， 也具有EGFR第21外显子的L858R突变。
2、同期《新英格兰杂志》刊文，在275例非小细胞肺癌病例，对 选择9例有疗效者检测EGFR基因外显子18、19和21发现8例存在突 变(88％)而7例治疗无效者无一例发生上述突变。
(二)EGFR基因突变检测对亚洲人更有效
1、上述《science》和《新英格兰杂志》均报道了日本人的EGFR 基因突变率为26％，而美国人和黑人相应突变率均只有2％，而两个大 型的Iressa(易瑞沙)单药II期临床治疗非小细胞肺癌的国际大规模 研究(IDEAL I和II)对亚洲女性腺癌更有效，而随后的国际更大型 EAP计划中，日本108例和中国238例的疗效率分别是19.8％和22.2 ％，欧美人种的相应疗效率仅11.8％。227例日本人肺癌的EGFR基因突 变率为40％，远高于欧美人种。
2、相反，近期的INTACT项目对2600例非小细胞肺癌未测EGFR基 因突变和未作人种、地域的分组，仅作了吉非替尼与健择、顺铂、紫杉 醇、卡铂联合用药，与非联合用药比较，未显示出吉非替尼单药疗效的 差异性，有力说明不做这项基因检测盲目服药未见疗效。
(三)检测EGFR基因突变后再决定是否服药，可明显控制吉非替 尼的不良副作用减少不必要的经济负担。
1、各种国内外文献均显示靶向药物吉非替尼治疗非小细胞肺癌比 各种化疗药物毒副作用明显降低。一般仅有腹泻、皮疹、重症者可有间 质性肺炎，如滥用也可致死，日本曾报道滥用该药有14例间质性肺炎 死亡的病例。所以检测基因是否存在突变后用药可减少副作用。
2、吉非替尼国内尚未引进，更不能生产，用药者需耗昂贵的价格 从国外购入($80元/颗)，因该药主要是对晚期肺癌减少胸痛、咳喘 起控制病情急剧恶化的作用，故需长期服药达16-18个月，检测是否存 在基因突变后用药，可减少国家和患者巨大的经济负担。
(四)本技术方法是实验技术转化应用到临床检测的重大创新
1、无论是《science》和《新英格兰杂志》均是200多短片段进行 巢式PCR EGFR全长基因组检测，这在实验科研方法是必须的，但在临 床上是不能投入应用的，发明人设计了EGFR基因第18、19和21外显 子有针对性的观察序列，使冗长繁琐的检测变致简洁、可观察到目前各 国报道的全部突变位点，并结合了临床病理切片观察更具科学性。
2、发明人设计的基因观察序列片段，不仅可以观察已有的基因突 变情况，还能检查出中国人特有的或未曾报道的EGFR突变方式，比如 已经在一例男性肺腺癌体细胞发现EGFR基因第21外显子T＞G、A＞T 杂合性突变，未见国内外资料报道。
3、病理基因检测项目在国外发达国家已经比较普遍应用于临床， 除发明人所在单位外我国尚未见医疗机构有类似的临床应用项目进入常 规诊疗服务。
附图说明
图1是本发明的EGFR测序效果图
具体实施方式：
一、取材：核对患者姓名：某某，病理号：0406013，病理诊断 为：肺腺癌。取其肺癌标本蜡块，经常规切片HE染色后显微镜下观 察，确保病灶癌组织区域结构清晰，无自溶、坏死和大片出血后切取 10μm厚切片6片。
二、DNA的提取用Roche公司石蜡基因组DNA提取试剂盒，按说 明提取DNA。
三、DNA质量鉴定：先用eppendorf核酸定量仪测定提取后DNA浓 度。(260nm吸光率大于0.05以上(DNA含量大于2.0ug/ ul)，吸光率A260/A280比值1.6-1.8之间，320nm波长处吸光 率接近为0)，然后在1％琼脂糖凝胶电泳中进行电泳，以JD- 801凝胶电泳图象分析系统显示单一、明亮条带为合格模板。
四、PCR扩增
1、引物的设计与合成：根据NCBI相关文献提供的研究结果，确定 EGFR目的基因片断(见上述)，利用genebank上提供的序列，通过O ligo软件设计引物，并进行测序适应性评估，由上海生物工程公司 合成。序列为：
18外显子  上游引物5’TCC AAA TGA GCT GGC AAG TG 3’
          下游引物5’TCC CAA ACA CTC AGT GAA AC 3’
19外显子  上游引物5’GTG CAT CGC TGG TAA CAT CC 3’
          下游引物5’TCT GGA GAT GAG CAG GGT CT 3’
21外显子  上游引物5’GCT CAG AGC CTG GCA TGA AC 3’
          下游引物5’CAT CCT CCC CTG CAT GTG TT 3’
2、PCR反应体系(总体系20μl)：10×PCR Buffer(含15mM MgCl2×)2μl，HotStarTaq DNA Polymerase(QIAGEN公司)0.2μ 1，5×Q-Solution 4μl  ，dNTP mix(10mM of each)2μl ， Primer 1 1μl ，Primer 2 1μl ，模板DNA 1μl ， Distilled water 8.8μl 。
3、PCR反应条件：置ABI-2700型扩增仪中95℃预变性15min，用 TouchdownPCR，94℃变性50sec，63℃-58℃退火1min(-0.5℃ /1min，72℃延伸1min，共循环10次，94℃变性50sec，57℃退火 1min，72℃延伸1min，共循环30次，最后于72℃延伸10min。
4、PCR产物纯化：用1.5％琼脂糖凝胶电泳观察PCR扩增产物是否为 单一目的条带，根据Promega公司提供的PCR纯化试剂盒，对 PCR产物过柱纯化后，进行测序反应。
五、测序反应
1、反应体系：1ul BigDye(2.5X)+1.5ul BigDye Seq Buffer(5X) +3ul引物(1pmol/ul)+1ulPCR纯化产物(3-10ng)+3.5ul ddH2O。 (确保Bi gDye的终浓度为1X)
2、测序PCR热循环条件：96℃，10sec→(96℃10sec→50℃5 sec→60℃4min)×25个循环→60℃，4min→4℃保温
3、测序反应后纯化
1)每管加入1μL 125mM EDTA到管底，再加入1μL 3M NaAc。
2)每管加入25μL 100％酒精，铝箔封严密，震荡混匀4次，室温放 置15min。
3)1600×g离心45min，马上倒置96孔ABI板，离心至185×g停 止离心。
4)每管加入35μL 70％酒精，1650×g 4℃离心15min(JOUAN- BR4i)；马上倒置96孔板，离心至185×g停止离心。
5)重复第4步1次。
6)室温挥发净酒精，加入10μL Hi-Di Formamide溶解DNA；
7)样品在95℃变性4min，迅速置冰中冷却4min。
4、基因测序
1)测序电泳前，在数据采集(Datecollection2.0)软件中选择正 确的运行模块和分析模块。
2)样品制备，上样至3100-Avant遗传分析仪进行测序。
3)Datecollection软件自动进行数据处理和分析。
六、结果分析
将测序结果用DNA sequencing analysis5.1自动分析原始测序数 据，获取测序电泳图和序列。将样品序列用DNA star seqman与标准序 列进行比对，观察样本基因序列观察样品是否存在突变或缺失等改变。
七、测序结果：
基因检测申请单及报告表
                              省中医院
                                                                                    病理科DNA基因测序申请单
                        某某中医药大学附属医院
联号：                                                                                             检测号
G050035 姓 名   某某     年     龄     57     性     别     男     籍     贯     出     生     地     民     族     送检     单位     科     别     病     区     床     号     X10     -5     门     诊     号     住院     号     送检标本(ˇ，即送      病理科)          采取部位        病理检验号：        0406013        病理诊断：    肺腺癌      血亲病理诊断：      1.抗凝血(2ml)        2.组织(不固定)      石蜡标本      3.其它      病历摘要及临床实验室检查、化疗、中西药治疗方案等：      个人及血缘关系病史：(ˇ)      肿瘤、癌前疾病及家族史：              高血压：          优生优育，不育，      亚健康(高血脂，肥胖，神经衰弱等)：    糖尿病：          亲子鉴定：      乳腺妇科疾病：                        过敏免疫疾病：    感染性疾病：      胃萎缩性炎，肠化：                    心脑血管疾病：    肝肾，结核疾病：      肠病，肠息肉：                        先天性疾病：      其它(如口、眼疾病，      运动选材等)：      申请目的和项目(或来病理科咨询，电话：86617141-70307)      EGFR18，19、21外显子      我已知基因测序是利用基因组学方法检测病原、肿瘤、癌前、亚健  康、药敏、血缘类别、移植和优生优育等先进的高科技病理诊断技术，  对此项检查本人已知情并同意检测。      联系电话：  签名：  临床诊断及附言： 送检医师：__________2004年月日
注意：1.取材或抽取不凝血后立即送病理科，不需固定，贴好标签。
      2.检测结果需参考病理诊断咨询医师。
      3.如对检测结果有疑问，请与病理科联系。
联号：                                联号：                    联号：
联号： 标本类型(ˇ)：新鲜组织，新鲜血液，固定组织，穿刺组织，胸腹 水，脱落细胞，体液，其它 巨检： 基因测序结果： 1、EGFR第18外显子，第2155位核苷酸未发现  G＞A突变； 2、EGFR第19外显子，第2235-2249位核苷酸和2236-2250位核苷酸   未发现缺失； 3、EGFR第21外显子，第2576位核苷酸未发现T＞G突变，第2497位 核苷酸发现T＞G突变(L833V)，第2504位核苷酸发现A＞T突变 (H835L)。 分子病理学诊断及相关临床意义： 1、病理诊断为：肺腺癌。 2、石蜡肺癌组织EGFR基因第18、19外显子未检出有临床致病意义的 突变和缺失。第21外显子发现了未曾报道的第2497位核苷酸T＞G突 变(L833V)，第2504位核苷酸A＞T突变(H835L)。提示Iressa药 物分子靶向治疗肺腺癌可能有较好疗效。 诊断医师：________________________________2004年11月4日
               江苏省中医院
                                              病理科DNA基因测序报告单
           某某中医药大学附属医院
                                                    基因测序检测号：
G050035   姓名   某某   性别   男   年龄   57   科别   送检   单位   病区   床号   X10-5   门诊   号   住院   号   检验   号   临床   诊断   病理    号及    病理    诊断        病理号：0406013肺腺癌      标本类型(ˇ)：新鲜组织，新鲜血液，固定组织，穿刺组织，胸腹水，    脱落细胞，体液，其它    巨检：石蜡标本    基因测序结果：(见背面附图)(双向测序)    3、EGFR第18外显子，第2155位核苷酸未发现G＞A突变；    4、EGFR第19外显子，第2235-2249位核苷酸和2236-2250位核苷酸未发现缺    失；    3、EGFR第21外显子，第2576位核苷酸未发现T＞G突变，第2497位核苷酸发现    T＞G突变(L833V)，第2504位核苷酸发现A＞T突变(H835L)。    分子病理学诊断及相关临床意义：    2、病理诊断为：肺腺癌。    2、石蜡肺癌组织EGFR基因第18、19外显子未检出有临床致病意义的突变和缺    失。第21外显子发现了未曾报道的第2497位核苷酸T＞G突变(L833V)，第2504    位核苷酸A＞T突变(H835L)。提示Iressa药物分子靶向治疗肺腺癌可能有较好    疗效。    诊断医师：____________________________2004年11月4日 
注：1.组织细胞基因测序结果需参考病理诊断评估。
2.测序结果可咨询临床和病理医师。