一种鸡肠炎沙门氏菌感染抗性性状分子标记gga-miR-1662及
其检测方法
技术领域
[0001] 本
发明涉及基因工程技术领域，提供了一种鸡肠炎沙门氏菌感染抗性分子标记gga-miR-1662及其检测方法。
背景技术
[0002] 肠炎沙门氏菌(Salmonella enteritidis)为革兰氏阴性菌，是世界公认的食源性致病菌之一，不仅对蛋鸡生产造成重大影响，而且它能通过
家禽副产品给人类的健康带来很大的威胁。这种病菌主要是通过动物性产品包括禽肉，鸡蛋和奶类及奶制品等导致人中毒甚至死亡。因此如何获得抗性高的遗传个体成为亟待解决的问题之一。
[0003] 小RNA(miRNA)是一类长度约22nt的内源性非编码小RNA，与靶基因3'UTR(非翻译区)结合在转录后
水平调控靶基因的表达，在
细胞增殖、分化、凋亡、神经发育、脂肪代谢等多个
生物学过程中发挥重要作用。
发明内容
[0004] 本发明的
发明人针对上述
现有技术的情况，结合长期研究和探索，提供了一种鸡肠炎沙门氏菌感染抗性分子标记gga-miR-1662及其检测方法，该抗性分子标记为鸡miRNA gga-miR-1662，发明人经过研究发现，gga-miR-1662可以通过调控TLR1LA基因的表达调控肠炎沙门氏菌对鸡的感染，因此gga-miR-1662可以作为肠炎沙门氏菌感染抗性检测的分子标记，发明人进一步提供了其检测方法，从而为鸡的抗病遗传育种奠定
基础。
[0005] 发明人提供的具体技术方案如下：
[0006] 发明人首先提供了一种鸡肠炎沙门氏菌感染抗性分子标记，该抗性分子标记为鸡miRNA gga-miR-1662，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；
[0007] 发明人进一步给出了该分子标记的检测方法如下：
[0008] gga-miR-1662的表达量检测
[0009] miRNA反转录
[0010] 用One Step miRNA cDNA Synthesis Kit(Perfect Real Time)试剂盒，严格按
说明书进行。反转录体系为20μL(具体见表1)。反应程序为：37℃，60min；85℃，
5s；反应完成后获得的cDNA置于-20℃保存备用；
[0011] 表1 miRNA反转录体系(20μL)
[0012]
[0013] 其中所述的盲肠总RNA为鸡盲肠总RNA，采用常规方法获得，
[0014] gga-miR-1662
荧光定量PCR
[0015] 根据gga-miR-1662成熟序列设计引物(表2)，由上海生工
生物工程有限公司合成。利用所设引物，采用SYBR Green I染料法，按照TaKaRa公司的SYBR PrimeScriptTM miRNA RT-PCR Kit说明书，在Stratagene MX3000P荧光定量PCR仪上进行扩增，反应体系如表3所示。
[0016] 表2 miRNA定量检测引物
[0017]
[0018]
[0019] 其中>gga-miR-1662和U6分别作为Forward qPCR Primer，而Uni-miR qPCR Primer选用
试剂盒中自带引物；
[0020] 荧光定量PCR反应程序采用两步法：95℃预变性30s，1个循环；95℃5s，60℃30s，40个循环；最后添加溶解曲线(95℃1min，62℃30s，95℃30s)，1个循环，每个cDNA样品重复三-ΔΔCt次。以U6作为内参基因，用2 方法来计算miRNA的相对表达量，用SAS8.1
软件中单因素方差分析对miRNA表达量差异进行分析。
[0021] 表3荧光定量PCR体系(20μL)
[0022]
[0023] 发明人为了验证上述gga-miR-1662的功能采用了靶基因检测的方式，利用TargetScan及miRanda等软件预测到TLR1LA是gga-miR-1662的靶基因。结果发现通过分别比较肠炎沙门氏菌感染组与未感染组中miRNA与靶基因的调控方向，可知gga-miR-1662在感染组中显著下调，靶基因TLR1LA在感染组中的表达量显著高于未感染组(如图1所示)，即gga-miR-1662与TLR1LA调控方向相反，表现出相互作用关系。说明gga-miR-1662可以通过调控TLR1LA基因的表达调控肠炎沙门氏菌对鸡的感染。因此gga-miR-1662可以作为肠炎沙门氏菌感染抗性检测的分子标记。
[0024] 综上所述，本发明提供了一种鸡肠炎沙门氏菌感染抗性分子标记及其检测方法，该抗性分子标记为鸡gga-miR-1662，发明人经过研究发现，gga-miR-1662可以通过调控TLR1LA基因的表达调控肠炎沙门氏菌对鸡的感染，因此gga-miR-1662可以作为肠炎沙门氏菌感染抗性检测的分子标记，发明人进一步提供了其检测方法，从而为鸡的抗病遗传育种奠定基础。
附图说明
[0025] 图1为gga-miR-1662与靶基因TLR1LA在感染组相对未感染组中的表达差异倍数柱状图，
[0026] 由图可知，gga-miR-1662在感染组中显著下调，TLR1LA在感染组中的表达量显著高于未感染组，即gga-miR-1662与TLR1LA调控方向相反，表现出相互作用关系。说明gga-miR-1662可以通过调控TLR1LA基因的表达调控肠炎沙门氏菌对鸡的感染。
具体实施方式
[0027] 下述
实施例中除特殊说明之外，所采用的均为本领域现有技术；
[0028] 实施例1
[0029] gga-miR-1662的表达量检测
[0030] miRNA反转录
[0031] 用One Step miRNA cDNA Synthesis Kit(Perfect Real Time)试剂盒，严格按说明书进行。反转录体系为20μL(表1)。反应程序为：37℃，60min；85℃，5s；反应完成后获得的cDNA置于-20℃保存备用；
[0032] 表1 miRNA反转录体系(20μL)
[0033]
[0034] 其中所述的盲肠总RNA为鸡盲肠总RNA，采用常规方法获得，
[0035] gga-miR-1662荧光定量PCR
[0036] 根据gga-miR-1662成熟序列设计引物(表2)，由上海生工生物工程有限公司合成。利用所设引物，采用SYBR Green I染料法，按照TaKaRa公司的SYBR PrimeScriptTM miRNA RT-PCR Kit说明书，在Stratagene MX3000P荧光定量PCR仪上进行扩增，反应体系如表3所示。
[0037] 表2 miRNA定量检测引物
[0038]
[0039] 其中>gga-miR-1662和U6分别作为Forward qPCR Primer，而Uni-miR qPCR Primer选用试剂盒中自带引物；
[0040] 荧光定量PCR反应程序采用两步法：95℃预变性30s，1个循环；95℃5s，60℃30s，40个循环；最后添加溶解曲线(95℃1min，62℃30s，95℃30s)，1个循环，每个cDNA样品重复三次。以U6作为内参基因，用2-ΔΔCt方法来计算miRNA的相对表达量，用SAS8.1软件中单因素方差分析对miRNA表达量差异进行分析。
[0041] 表3荧光定量PCR体系(20μL)
[0042]
[0043] 实施例2
[0044] 靶基因TLR1LA的表达量检测
[0045] mRNA反转录
[0046] 根据试剂盒说明书要求，利用TaKaRa Primer ScriptTM RT reagent kit(Perfect Real Time)试剂盒将mRNA反转录为cDNA，放在-20℃保存备用。反转录体系如表4所示。反转录步骤：37℃，15min；85℃，5s。
[0047] 表4反转录体系
[0048]
[0049] TLR1LA荧光定量PCR
[0050] 根据NCBI
数据库mRNA序列(登录号：NM_001007488)，用Primer Premier5.0设计荧光定量PCR引物(表5所示)，引物由上海生工生物工程有限公司合成。
[0051] 表5引物序列
[0052]
[0053] 采用SYBR Green Ⅰ染料法，按照TaKaRa公司的SYBR Premix Ex TaqTM说明书，在Stratagene MX3000P荧光定量PCR仪上进行扩增，反应体系为20μL(表6)：SYBR Primer Ex TaqTM(2×)10μl，Forward Primer(10μM)0.4μl，Reverse Primer(10μM)0.4μl，ROX Reference Dye Ⅱ(50×)0.4μL，cDNA模板2μL，灭菌双蒸水(ddH2O)6.8μL，终体积20μL。反应程序为两步法：95℃预变性30s，PCR反应为：95℃，5s；60℃，30s；循环40次；添加溶解曲线：95℃，1min；61℃，30s；95℃，30s；每个样品重复3次。以β-act in作为内参，用2-ΔΔCt方法来计算mRNA的相对表达量，用SAS8.1软件中单因素方差分析对mRNA表达量差异进行分析。
[0054] 表6荧光定量PCR体系
[0055]
[0056] 实施例3
[0057] 鸡接种肠炎沙门氏菌试验
[0058] 将沙门氏菌阴性白来航蛋鸡分为感染组与未感染组，感染组每只鸡接种5.8×8
10CFU肠炎沙门氏菌，未感染组接种
磷酸盐缓冲液(PBS)，接种后第7天采集盲肠组织样品。
按照使用说明，用Trizol法提取盲肠总RNA。
[0059] gga-miR-1662与肠炎沙门氏菌感染的相关性分析
[0060] 利用实施例1所述方法，检测肠炎沙门氏菌感染后盲肠组织gga-miR-1662表达变化。定量结果显示，gga-miR-1662在感染组盲肠中的表达量显著低于未感染组(Fold change＝-2.44)。说明gga-miR-1662与肠炎沙门氏菌感染具有较强的相关性。
[0061] TLR1LA与肠炎沙门氏菌感染的相关性分析
[0062] 利用实施例2所述方法，检测盲肠TLR1LA表达与肠炎沙门氏菌感染的相关性。结果显示，感染组TLR1LA的表达量显著高于未感染组，是未感染组的1.55倍(P<0.05)。说明TLR1LA与鸡肠炎沙门氏菌感染相关。
[0063] gga-miR-1662与其靶基因TLR1LA的互作分析
[0064] 通过分别比较感染组与未感染组中miRNA与靶基因的调控方向，可知gga-miR-1662在感染组中显著下调，TLR1LA在感染组中的表达量显著高于未感染组(如图1)，即gga-miR-1662与TLR1LA调控方向相反，表现出相互作用关系。说明gga-miR-1662可以通过调控TLR1LA基因的表达调控肠炎沙门氏菌对鸡的感染。因此gga-miR-1662可以作为肠炎沙门氏菌感染抗性检测的分子标记。
