靶向KTN1治疗皮肤鳞状细胞癌的药物
阅读：1057发布：2020-05-19
专利汇可以提供靶向KTN1治疗皮肤鳞状细胞癌的药物专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了靶向KTN1 治疗 皮肤 鳞状细胞癌的药物， 发明人 以皮肤鳞癌特征性的EGFR高表达的细胞株A431为实验对象，通过实验发现通过靶向下调KTN1，可以抑制影响 肿瘤 细胞增殖 、转移和侵袭能 力 的EGFR的表达，最终改善或治疗皮肤鳞癌。，下面是靶向KTN1治疗皮肤鳞状细胞癌的药物专利的具体信息内容。
靶向KTN1治疗皮肤鳞状细胞癌的药物
技术领域
[0001] 本发明涉及一种改善或治疗皮肤鳞状细胞癌的新技术。
背景技术
[0002] 皮肤鳞状细胞癌（SCC）是源于上皮组织中角质形成细胞的恶性肿瘤。据统计，SCC的发病率在所有皮肤恶性肿瘤中仅次于基底细胞癌，位居第二位。SCC病因复杂，UV照射，HPV感染、器官移植、化学制剂等因素均与SCC的发病密切相关。
[0003] SCC的临床表现差异很大，并且与疾病发生的位置及分型有关。SCC通常发生于皮肤暴露部位，但身体其他任何部位也可发生，约55%发生于头颈部，约18%发生于手背及前臂伸侧，13%发生于下肢，4%发生于肩背部，3%发生于上肢，唇部、肛周及生殖器等其他部位占7%。通常皮损初起表现为小而硬的红色结节，界限不清楚，容易演变为疣状或乳头瘤状，中央易发生溃疡，肿瘤可扩散至周围组织。
[0004] SCC临床表现无明显性特异性，普遍需要组织病理进行诊断。近年对SCC的研究日益增加，对其分子学机理有了一定的认识。
[0005] SCC一般首选手术治疗，其他的治疗方法包括光动力疗法、放疗、干扰素和维A酸等。然而这些方法都有一定的局限性，受到不同因素的制约。如手术治疗难以在不适合手术治疗手段的特殊人群中开展，如部分老年人和部分对外貌有较高要求的人群。手术治疗结合放化疗仍然难以彻底消灭皮肤鳞癌，有较高的复发率。鉴于皮肤鳞癌具有较强的转移和侵袭能力。有必要研究以降低皮肤鳞癌细胞增殖、转移和侵袭能力为目标的新生物药。
[0006] 驱动结合蛋白（Kinectin1，KTN1）是内质网膜上的一种膜受体蛋白，mRNA全长4.6kb基因定位于14号染色体q22.1上，主要定位在内质网上，蛋白分子量为160KD，Zhang等（Journal of Cell Science，2010，123:3901–3912）研究人员通过黏着斑 (FAs)对细胞的塑形及运动能力，发现KTN1通过介导内质网依赖FA蛋白的招募，从而参与内质网的延伸作用。
[0007] 此外，还有少部分KTN1定位在线粒体上，片段分子量为120KD，它可与驱动蛋白（kinesin）相互作用，可影响线粒体的代谢动力学功能（Journal of Cell Science，2004，117, 4537-4549）。KTN1与疾病存在相关性，但对其的研究不多，主要是对白塞病、肌肉萎缩症、肝癌、再生障碍性贫血、宫颈癌等疾病的研究。KTN1通过与kinesin结合参与细胞内囊泡的转运及膜形态与结构的维持，同时KTN1也能结合EF-1δ将EF-1复合体固定在内质网膜上，调控蛋白的翻译。对宫颈癌和急性白血病细胞研究发现，诱导细胞发生快速凋亡时均伴随着KTN1的断裂与降解，可能是由于诱导了caspase 7引起的（FEBS Letters，1998，436:51–
54）。此外，细胞内KTN1的分布也受内源性RhoG活性调节，从而影响细胞的表面特性、增殖及运动能力，进而与肿瘤的发生发展密切相关。
54）。此外，细胞内KTN1的分布也受内源性RhoG活性调节，从而影响细胞的表面特性、增殖及运动能力，进而与肿瘤的发生发展密切相关。
[0008] 综上所述，KTN1在肿瘤的发生发展及转移中具有重要作用。然而，许多对于KTN1在肿瘤中的研究尚处于初步阶段。比如，在皮肤鳞状细胞癌中KTN1是如何发挥作用的目前无研究报道。同时，其潜在的分子生物学机制尚不清楚。
发明内容
[0009] 本发明的目的在于提供一种靶向KTN1治疗皮肤鳞状细胞癌的药物。
[0011] 进一步的，靶向沉默KTN1或下调KTN1表达量的试剂为针对KTN1的siRNA。
[0012] 特别的，siRNA的序列为：siKTN1_1: GAGAUUGUGUUGAAAGAAA（SEQ ID NO：1）；
和siKTN1_2: CAGGAAAGCUACAGCAAGA（SEQ ID NO：2）中的至少一条。
和siKTN1_2: CAGGAAAGCUACAGCAAGA（SEQ ID NO：2）中的至少一条。
[0013] 更佳的，siRNA中的至少部分核酸进行修饰，以提高其结合力。siRNA中的至少部分核酸使用LNA修饰。
[0014] 本发明的有益效果是：发明人以皮肤鳞癌特征性的EGFR高表达的细胞株A431为实验对象，通过实验发现通过靶向下调KTN1，可以抑制影响肿瘤细胞增殖、转移和侵袭能力的EGFR的表达，最终改善或治疗皮肤鳞癌。
附图说明
附图说明
[0015] 图1是KTN1对A431细胞增殖的影响；（A）siNC、 siKTN1_1或siKTN1_2沉默模型建立成功（B）siKTN1_1或siKTN1_2处理后0h、24h、48h和72h CCK8检测A431细胞增殖能力情况；图2是KTN1对A431细胞迁移和侵袭的影响；（A）siKTN1_1或siKTN1_2处理后48h Transwell检测A431细胞迁移能力情况（右侧为统计图）（B）siKTN1_1或siKTN1_2处理后48h Transwell检测A431细胞侵袭能力情况（右侧为统计图）；
图3是沉默KTN1下调EGFR的表达。
图3是沉默KTN1下调EGFR的表达。
具体实施方式
[0016] 靶向沉默KTN1或下调KTN1表达量的试剂在制备治疗皮肤鳞状细胞癌药物中的应用。
[0017] 进一步的，靶向沉默KTN1或下调KTN1表达量的试剂为针对KTN1的siRNA。
[0018] 特别的，siRNA的序列为：siKTN1_1: GAGAUUGUGUUGAAAGAAA（SEQ ID NO：1）；
和siKTN1_2: CAGGAAAGCUACAGCAAGA（SEQ ID NO：2）中的至少一条。
和siKTN1_2: CAGGAAAGCUACAGCAAGA（SEQ ID NO：2）中的至少一条。
[0019] 更佳的，siRNA中的至少部分核酸进行修饰，以提高其结合力。siRNA中的至少部分核酸使用LNA修饰。
[0020] 下面结合实验，进一步说明本发明的技术方案。
[0021] 材料与方法：①选取人皮肤鳞状细胞癌细胞系A431细胞，在37℃、5% CO2培养条件下，使用10% FBS DMEM培养基传代培养。A431细胞汇合度长至70%-80%时，随机将细胞分为3组：siNC组、siKTN1_1组和siKTN1_2组。siRNAs序列为：
siKTN1_1: 5’- GAGAUUGUGUUGAAAGAAA-3’；
siKTN1_2: 5’- CAGGAAAGCUACAGCAAGA-3’。用PBS洗两遍，使用15μL lipofectamine
2000脂质体包裹50nM 15μL 的siNC、siKTN1_1和siKTN1_2，无血清无抗生素DMEM培养基稀释，总体积为400μL，混合液室温放置15-20min。随后每个10cm培养皿加入体积4.4mL的无血清无抗生素DMEM培养基，将脂质体包裹后的siRNAs逐步滴加进每个培养皿，3-5hr后将每个皿中液体弃掉，加入含有血清和抗生素的DMEM培养基，37℃、5% CO2培养条件下继续培养。
siKTN1_1: 5’- GAGAUUGUGUUGAAAGAAA-3’；
siKTN1_2: 5’- CAGGAAAGCUACAGCAAGA-3’。用PBS洗两遍，使用15μL lipofectamine
2000脂质体包裹50nM 15μL 的siNC、siKTN1_1和siKTN1_2，无血清无抗生素DMEM培养基稀释，总体积为400μL，混合液室温放置15-20min。随后每个10cm培养皿加入体积4.4mL的无血清无抗生素DMEM培养基，将脂质体包裹后的siRNAs逐步滴加进每个培养皿，3-5hr后将每个皿中液体弃掉，加入含有血清和抗生素的DMEM培养基，37℃、5% CO2培养条件下继续培养。
[0022] ②48小时后收集细胞，使用PBS洗两遍，每个培养皿加入1ml PBS使用细胞刮刮下细胞后Trizol法提取细胞内总RNA，测定浓度后进行反转录反应。反转录反应体系：DNase I buffer（10x） 1μL
RNA sample 1μg
DEPC-treated H2O 7μL
Dnase I 1μL
Total 10μL
37℃， 30min；
25mM EDTA 1μL至混合液，65℃ 热激反应10min；
向混合液中加入50μM 0.5μL Oligo dT和4uM 1ul dNTP；
72℃，10min后置于冰上。
RNA sample 1μg
DEPC-treated H2O 7μL
Dnase I 1μL
Total 10μL
37℃， 30min；
25mM EDTA 1μL至混合液，65℃ 热激反应10min；
向混合液中加入50μM 0.5μL Oligo dT和4uM 1ul dNTP；
72℃，10min后置于冰上。
[0023] RNA反转录合成 cDNA5×first strand buffer 4μL
0.1 M DTT 1μL
RNase inhibitior 0.5μL
M-MLV 1μL
DEPC Water 1μL
Total 7.5μL
PCR: 37℃，60min；70℃，15min。
0.1 M DTT 1μL
RNase inhibitior 0.5μL
M-MLV 1μL
DEPC Water 1μL
Total 7.5μL
PCR: 37℃，60min；70℃，15min。
[0024] ③qRT-PCR反应：KTN1 引物序列：SYBR reaction buffer 5μL
cDNA 3μL
Primer（R+F） 0.2μL
DEPC Water 1.8μL
Total 10μL
④蛋白提取：每个培养皿加入100μL -130μL RIPA蛋白裂解液和25×PIC蛋白酶抑制剂，置于冰上10min后﹣80℃冻存裂解。次日，样品12,000rpm，4℃离心15min后收集上清即蛋白裂解液，测定浓度，进行Western blot蛋白免疫印迹分析。
cDNA 3μL
Primer（R+F） 0.2μL
DEPC Water 1.8μL
Total 10μL
④蛋白提取：每个培养皿加入100μL -130μL RIPA蛋白裂解液和25×PIC蛋白酶抑制剂，置于冰上10min后﹣80℃冻存裂解。次日，样品12,000rpm，4℃离心15min后收集上清即蛋白裂解液，测定浓度，进行Western blot蛋白免疫印迹分析。
[0026] 实验结果：KTN1调控皮肤鳞癌细胞增殖
首先，发明人首先在A431细胞内建立siNC、 siKTN1_1或siKTN1_2沉默模型。使用qRT-PCR方法检测转染siRNA后KTN1 mRNA水平的表达变化，图1-A所示沉默模型建立成功。使用CCK8方法检测了沉默KTN1后人皮肤鳞癌细胞A431中增殖的变化，发现与正常皮肤鳞癌细胞相比，转染siKTN1_1或siKTN1_2后，随着培养时间的延长，A431细胞增殖能力减弱，如图1-B（*p<0.05，**p<0.01，*** p<0.001）。
首先，发明人首先在A431细胞内建立siNC、 siKTN1_1或siKTN1_2沉默模型。使用qRT-PCR方法检测转染siRNA后KTN1 mRNA水平的表达变化，图1-A所示沉默模型建立成功。使用CCK8方法检测了沉默KTN1后人皮肤鳞癌细胞A431中增殖的变化，发现与正常皮肤鳞癌细胞相比，转染siKTN1_1或siKTN1_2后，随着培养时间的延长，A431细胞增殖能力减弱，如图1-B（*p<0.05，**p<0.01，*** p<0.001）。
[0027]沉默KTN1显著地抑制皮肤鳞癌细胞迁移及侵袭
其次，发明人使用Transwell技术检测了KTN1沉默模型中A431细胞的迁移和侵袭能力（图2-A/B）。转染siNC、 siKTN1_1或siKTN1_2 48h后（图2-A），将处理后的A431细胞转种在Transwell小室中，12-16h收集细胞，显微镜下观察发现，沉默KTN1后两组A431细胞迁移能力降低，与对照组相比，细胞数减少约3-4倍；同样地，图2-B显示细胞的侵袭能力， siKTN1处理组细胞侵袭能力降低，与对照组相比，侵袭过基质胶的细胞数降低5-6倍（*p<0.05，**p<0.01，*** p<0.001）。
其次，发明人使用Transwell技术检测了KTN1沉默模型中A431细胞的迁移和侵袭能力（图2-A/B）。转染siNC、 siKTN1_1或siKTN1_2 48h后（图2-A），将处理后的A431细胞转种在Transwell小室中，12-16h收集细胞，显微镜下观察发现，沉默KTN1后两组A431细胞迁移能力降低，与对照组相比，细胞数减少约3-4倍；同样地，图2-B显示细胞的侵袭能力， siKTN1处理组细胞侵袭能力降低，与对照组相比，侵袭过基质胶的细胞数降低5-6倍（*p<0.05，**p<0.01，*** p<0.001）。
[0028]皮肤鳞癌细胞中KTN1和EGFR的表达分析
发明人检测了沉默KTN1后皮肤鳞癌细胞A431中KTN1和EGFR的表达发现，图3显示， siKTN1处理后A431细胞中KTN1表达下调，同时EGFR表达也下调。结果表明KTN1有可能是通过调控EGFR来调控皮肤鳞癌的增殖、迁移、侵袭能力的。
发明人检测了沉默KTN1后皮肤鳞癌细胞A431中KTN1和EGFR的表达发现，图3显示， siKTN1处理后A431细胞中KTN1表达下调，同时EGFR表达也下调。结果表明KTN1有可能是通过调控EGFR来调控皮肤鳞癌的增殖、迁移、侵袭能力的。
[0029] 可以预见，通过靶向下调KTN1，可以抑制影响肿瘤细胞增殖、转移和侵袭能力的EGFR的表达，最终改善或治疗皮肤鳞癌。
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