丹皮酚在制备治疗急性肾损伤药物方面的应用
阅读：17发布：2020-05-12
专利汇可以提供丹皮酚在制备治疗急性肾损伤药物方面的应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及丹皮酚在制备 治疗 急性肾损伤药物方面的应用。 发明人 研究发现丹皮酚能够应用于制备治疗急性肾损伤的药物。，下面是丹皮酚在制备治疗急性肾损伤药物方面的应用专利的具体信息内容。
1.丹皮酚在制备治疗急性肾损伤药物方面的应用。
丹皮酚在制备治疗急性肾损伤药物方面的应用
技术领域
[0001] 本发明提供中药有效成分丹皮酚的新用途，具体涉及丹皮酚在制备治疗急性肾损伤药物方面的应用。
背景技术
[0002] 丹皮酚 (Paeonol,P ae)又称牡丹酚，是毛莫科植物牡丹Paeonia Suffruticosa Andr.根皮和萝藦科植物徐长卿Pycnostelma Paniculatum (Bunge) K. Schum干燥根或全草的主要有效成分。丹皮酚是一种小分子的酚类化合物，为白色或者微黄色有光泽的针状结晶，其分子量为 166.18，分子式为 C9H10O3，化学名称为 2-羟基-4-甲氧基苯乙酮。
[0003] 丹皮酚具有广泛的生物活性，如抗菌消炎、镇痛、解热、镇静、催眠、抗肿瘤、抗过敏和预防心血管系统疾病等【H. S. Chung, M. Kang, C. Cho et al., “Inhibition of nitric oxide and tumor necrosis factor-alpha by moutan cortex in activatedmouse peritoneal macrophages,” Biological and Pharmaceutical Bulletin, 2007vol. 30, no. 5, pp. 912–916. He D.Y., Dai S.M. Anti-inflammatory and immunomodulatory effects of paeonia lactiflora pall, a traditional chinese herbal medicine. Front. Pharmacol. (2011) 2 10.】。研究发现，丹皮酚可通过抑制增殖、诱导分化和凋亡、影响基因表达等机制对肿瘤细胞产生杀伤、诱导分化和凋亡、抑制侵袭和转移等作用【Sun, Guo-Ping, Wang,Hua, Xu,Shu-Ping, Shen,Yu-Xian, Wu,Qiang. Anti-tumor effects of paeonol in a HepA-hepatoma bearing mouse model via induction to tumor cell apoptosis and stimulation of IL-2 and TNF-a production. European Journal of Pharmacology,2008,584,246–252.】。临床上主要剂型为丹皮酚注射剂，在治疗痛症和皮肤科临床方面应用广泛。目前对丹皮酚的药理研究主要集中在对心脑血管的保护、抗肿瘤活性及机制以及提高免疫功能等方面。对于丹皮酚治疗急性肾损伤的作用至今未见任何报道。
[0004] 急性肾损伤是一种临床常见的危重症疾病，其起病急，病程进展快，死亡率及病死率高，且发病率呈逐年上升的趋势【Waikar SS，Curhan GC，Wald R，et a1．Declining mortality in patients with acute renal failure [J]．J Am Soe Nephrol，2006，17：1143一1150．】。急性肾损伤可由感染染、烧伤、创伤、肾动脉狭窄及休克等各种原因引起，其中脓毒血症是临床发生急性肾损伤的最重要原因之一。一般来说，急性肾损伤的病死率为45％，而合并脓毒症后病死率可骤升至70％，成为危重症急救医学中的重大难题之一【Angus DC，Linde-Zwirble WT，Lidicker J，et al，Epidemiology of severe sepsis in the United States：analysis of incidence，outcome，and associated costs of care．Crit Care Med，2001，29 (7)：1303-l310．】。
[0005] 革兰阴性(G-)菌感染是引起脓毒症的重要原因之一，G-菌外膜的活性成分—内毒素(endotoxin)即脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)与巨噬细胞、内皮细胞等多种细胞膜上相应受体作用后，启动胞内信号传导系统，最终激活核转录因子-κB(nuclear factor κ B，NF-κ B)，引起多种细胞因子和炎症介质(TNF、IL-1β、IL-6等)的表达和释放，导致血管通透性增加、体液渗出和淋巴细胞移行到炎症部位引发“炎症级联反应"或伴有免疫功能的严重抑制，即表现为脓毒症，危重者可发展为多器官功能障碍综合征，甚至出现多器官功能衰竭。其中肾脏是最容易受累的器官之一。北京中医医院通过采用肾衰灌肠液加连续性血液净化治疗脓毒血症致早期急性肾损伤，并对32例脓毒血症急性肾损伤患者进行观察，发现严重感染患者早期血浆中炎症介质急剧升高，通过治疗可显著降低患者血浆 IL-6、IL-8、TNF-α水平，促进脏器功能恢复，提高存活率【刘宝利，刘清泉，郭玉红.肾衰灌肠液加连续性血液净化对脓毒血症致早期急性肾损伤微炎症指标的影响.世界中医药, 2014, 9 (3) :285-287】。抑制炎性细胞因子的释放为研究治疗脓毒血症急性肾损伤药物提供了新靶点，研究表明，在LPS诱导的急性肾损伤大鼠中，使用可溶性TNF受体中和炎症因子可抑制肾功能不全【Knotek M, Rogachev B, Wang W, et al，Endotoxemic renal failure in mice: role of tumor necrosis factor independent of inducible nitric oxide synthase. Kidney Int 2001,59: 2243-2249.】。Cunnigham等通过TNF基因缺陷型小鼠证实了TNF在肾损伤中的作用【Cunnigham PN, Dyanov HM, Park P, et al，Acute renal failure in endotoxemia is caused by TNF acting directly on TNF receptor-1 in kidney. J Immunol 2002,168: 5817-5823.】。目前临床上对脓毒血症急性肾损伤尚缺乏特异性的治疗药物。因此，开发能改善肾脏功能，抑制炎性细胞因子释放的治疗急性损伤的天然药物具有重要的意义。
[0006] 现代药理学研究表明，丹皮酚能够通过ERK, p38 和NF-κB信号通路途径，抑制破骨细胞的生成和单核细胞粘附，调节炎症因子的产生，发挥抗炎作用【Nizamutdinova IT, Oh HM, Min YN, et al. “Paeonol suppresses intercellular adhesion molecule-1 expression in tumor necrosis factor-α-stimulated human umbilical vein endothelial cells by blocking p38, ERK and nuclear factor-κB signaling pathways,” International Immunopharmacology, 2007 Mar;7(3):343-50；Chae HS, Kang OH, Lee YS, et al. “Inhibition of LPS induced iNOS, COX-2 and inflammatory mediator expression by paeonol through the MAPKs inactivation in RAW 264.7 cells,” American Journal of Chinese Medicine, 2009;37(1):181-94】。
发明内容
[0007] 本发明旨在提供丹皮酚在制备治疗急性肾损伤药物方面的应用。
[0008] 技术方案：丹皮酚在制备治疗急性肾损伤药物方面的应用。
[0009] 发明人研究发现丹皮酚可改善脂多糖诱导急性肾损伤，减轻肾组织病理损伤，降低组织病理损伤评分，下调血清中BUN和SCr及炎症介质TNF-α的含量，通过降低组织中NF-κB p65, IκBα和 IKKβ的磷酸化，抑制NF-κB信号通路的活化，对脓毒素血症急性肾损伤具有明显保护作用。附图说明
[0010] 图1为丹皮酚预处理对脂多糖所致肾脏组织病理的影响显微观察组织细胞图。
[0011] 图2为丹皮酚预处理对脂多糖所致肾脏组织病理的影响观察结果统计图。
[0012] 图3为丹皮酚预处理对NF-κB信号通路活性的影响显微观察组织细胞图。
[0013] 图4为丹皮酚预处理对NF-κB信号通路活性的影响观察结果统计图。
[0014] 图5为免疫印迹法检测NF-κB信号通路中p65的表达水平和磷酸化程度结果统计图。
[0015] 图6为免疫印迹法检测NF-κB信号通路中IKKβ的表达水平和磷酸化程度结果统计图。
[0016] 图7为免疫印迹法检测NF-κB信号通路中IκBα的表达水平和磷酸化程度结果统计图。
具体实施方式
[0017] 为了更好地理解和实施本发明，下面结合具体药理实验数据说明本发明：1、建立模型及给药
昆明小鼠，雄性，体重18-22g，按体重随机分为：正常对照组、模型对照组、丹皮酚低剂量组(20mg/kg)、丹皮酚高剂量组(40mg/kg)，每组10只。正常对照组、模型对照组均分别灌胃给予相应体积的生理盐水；大黄酸组灌胃给药相应剂量的药物，每天一次，时间固定，连续给药7天。末次给药后，除正常对照组外，其余各组按50mg/kg腹腔注射内毒素建立内毒素急性肾损伤模型，正常对照组按相同剂量注射生理盐水。
昆明小鼠，雄性，体重18-22g，按体重随机分为：正常对照组、模型对照组、丹皮酚低剂量组(20mg/kg)、丹皮酚高剂量组(40mg/kg)，每组10只。正常对照组、模型对照组均分别灌胃给予相应体积的生理盐水；大黄酸组灌胃给药相应剂量的药物，每天一次，时间固定，连续给药7天。末次给药后，除正常对照组外，其余各组按50mg/kg腹腔注射内毒素建立内毒素急性肾损伤模型，正常对照组按相同剂量注射生理盐水。
[0018] 2、观察项目及方法1）组织形态学观察
小鼠自腹腔注射内毒素脂多糖LPS( E.coil O55: B5 )后观察小鼠饮食、饮水、活动、大便等一般状况并做记录。12小时后，脱颈椎处死小鼠解剖收集双侧肾脏标本大体观察：
肉眼观察肾脏形态、色泽、包膜等的改变。取肾脏经10%甲醛中固定，石蜡包埋，切片5μm 厚，HE 染色后观察，并根据肾小管病变程度进行Paller评分【Paller MS，Hoidal JR，Fen'is TF．Oxygen free radicals in ischemie acute renal failure in the rat．J Clin Invest，1984，74(4)：1156-1164．】，评分标准：肾小管明显扩张、上皮细胞扁平为1分，肾小管管腔内有脱落坏死的上皮细胞、但未成管型或细胞碎片为1分，肾小管管腔内出现管型为2分，上皮细胞颗粒变性为1分，上皮细胞空泡变性为1分，上皮细胞核固缩为1分。在400倍光镜下，随机选取5个视野，每个视野选择10个肾小管进行计分。
小鼠自腹腔注射内毒素脂多糖LPS( E.coil O55: B5 )后观察小鼠饮食、饮水、活动、大便等一般状况并做记录。12小时后，脱颈椎处死小鼠解剖收集双侧肾脏标本大体观察：
肉眼观察肾脏形态、色泽、包膜等的改变。取肾脏经10%甲醛中固定，石蜡包埋，切片5μm 厚，HE 染色后观察，并根据肾小管病变程度进行Paller评分【Paller MS，Hoidal JR，Fen'is TF．Oxygen free radicals in ischemie acute renal failure in the rat．J Clin Invest，1984，74(4)：1156-1164．】，评分标准：肾小管明显扩张、上皮细胞扁平为1分，肾小管管腔内有脱落坏死的上皮细胞、但未成管型或细胞碎片为1分，肾小管管腔内出现管型为2分，上皮细胞颗粒变性为1分，上皮细胞空泡变性为1分，上皮细胞核固缩为1分。在400倍光镜下，随机选取5个视野，每个视野选择10个肾小管进行计分。
[0019] 2）血清中BUN、SCr及TNF-α的含量检测眼内眦取血液放入小试管中，静置，血液凝固后，3000 转离心10min，吸取血清，按血尿素氮(blood tireanitrogen，BUN)和血肌肝(serum ereatinine，SCr)试剂盒说明书操作，采用全自动生化分析仪检测血浆BUN和SCr含量。采用ELISA法测定血清中TNF-α含量。
[0020] 3) 肾脏组织中NF-κB信号通路活性检测免疫组化法检测NF-κB在肾脏组织中的定位与表达。采用免疫印迹法分别检测总NF-κB p65、磷酸化的NF-κB p65，总IKKβ、磷酸化的IKKβ及总IκBα和磷酸化的IκBα。化学发光法显影后，采用DigDoc100软件系统分析光密度值，结果用总蛋白条带与相应的磷酸化蛋白条带光密度值比值表示蛋白磷酸化程度。
[0021] 3、结果1）丹皮酚预处理对脂多糖所致小鼠一般情况的影响
实验中，观察正常对照组小鼠，均活动自如，进食正常，无病态。给予脂多糖后小鼠出现烦燥不安，蜷缩萎糜，拒绝食水，懒于活动，抓取时逃避无力，毛发失去光泽并且凌乱，粪便呈稀水样；上述症状可随着时间的进展而加重。但在给予丹皮酚预处理后，小鼠的上述症状可减轻，小鼠能够进食、饮水与活动，毛发也较为整洁且有光泽，各组均无小鼠死亡。
实验中，观察正常对照组小鼠，均活动自如，进食正常，无病态。给予脂多糖后小鼠出现烦燥不安，蜷缩萎糜，拒绝食水，懒于活动，抓取时逃避无力，毛发失去光泽并且凌乱，粪便呈稀水样；上述症状可随着时间的进展而加重。但在给予丹皮酚预处理后，小鼠的上述症状可减轻，小鼠能够进食、饮水与活动，毛发也较为整洁且有光泽，各组均无小鼠死亡。
[0022] 2）丹皮酚预处理对脂多糖所致肾脏组织病理的影响与正常对照组相比，模型对照组肾损害严重，肾小管显著混浊、肿胀、变性，充满蛋白管型。肾小管上皮细胞扁平，出现大量浊肿现象，细胞核淡染，部分核出现浓缩、破碎甚至溶解，肾问质水肿，有散在淋巴细胞浸润及浆细胞浸润，并有纤维素渗出；丹皮酚低剂量组肾损害和模型组比较明显减轻，可见细胞内染色质浓染，胞浆疏松化，肾间质水肿减轻，肾小囊腔略扩张；丹皮酚高剂量组病变轻微，肾小管上皮细胞水肿明显减轻，仅见少量肾小管上皮细胞空泡化，未见腔内管型，无肾间质水肿，肾小囊大致正常。通过组织病理评分，可明显看出，模型组小鼠组织病理评分较高。丹皮酚预处理后，能明显降低评分指数，其中高剂量组组织病理评分与模型组比较有显著差异（P<0.01）。显微观察图请见图1，统计图表请见图2。
[0023] 图2中丹皮酚对小鼠组织病理变化的影响与正常组比较，###P<0.001；与模型组比较，*P<0.05， **P<0.01。
[0024] 3）血清中BUN、 SCr及TNF-α含量的变化肾损伤后，血清中的尿素氮和血肌酐含量的变化与肾损伤密切相关，常作为肾损伤严重程度的重要指标用于对肾功能的进行评估。实验结果显示模型对照组与正常对照组相比，小鼠血清中BUN和SCr含量显著升高(P<0.01)，给予丹皮酚预治疗后，能显著降低BUN和SCr含量（P<0.05）。在脂多糖的诱导下，体内产生大量的炎症介质，其中认为肿瘤坏死因子（TNFα）是介导脓毒血症的关键性细胞因子之一。实验结果显示，腹腔注射脂多糖后，血清中TNF-α含量显著升高(P<0.05)，给予丹皮酚预治疗后，与模型组比较，各剂量组均能降低血清中TNF-α含量，其中高剂量组与模型组比较有显著差异（P<0.01）。（见表1）表1 丹皮酚对LPS诱导 的小鼠血清中BUN、SCr及TNF-α含量的 影响(
±SD)
与正常组比较，##P<0.01；与模型组比较，*P<0.05， **P<0.01
4）丹皮酚预处理对NF-κB信号通路活性的影响
实验中采用免疫组织化学染色的方法对切片进行染色，显微观察图请见图3。结果显示，正常对照组中仅有少量棕黄色颗粒表达，说明正常肾小管上皮细胞可表达少量NF-κB；
模型组中细胞内突出于背景的棕黄色颗粒表达明显增加，说明NF-κB在肾小管中表达明显增多；丹皮酚组肾小管中代表NF-κB的棕黄色颗粒表达较正常对照组多，但较模型组明显减少，用图像分析系统对各组免疫组化切片分析，对各组平均光度进行统计分析，统计结果请见图4。结果显示模型组的NF-κB活性在给予LPS刺激后出现明显的增高，与正常组相比有显著的差异。丹皮酚各干预组的NF-κB活性也在给予刺激后出现上升，但比模型组有明显减低（P<0.05）。
±SD)
与正常组比较，##P<0.01；与模型组比较，*P<0.05， **P<0.01
4）丹皮酚预处理对NF-κB信号通路活性的影响
实验中采用免疫组织化学染色的方法对切片进行染色，显微观察图请见图3。结果显示，正常对照组中仅有少量棕黄色颗粒表达，说明正常肾小管上皮细胞可表达少量NF-κB；
模型组中细胞内突出于背景的棕黄色颗粒表达明显增加，说明NF-κB在肾小管中表达明显增多；丹皮酚组肾小管中代表NF-κB的棕黄色颗粒表达较正常对照组多，但较模型组明显减少，用图像分析系统对各组免疫组化切片分析，对各组平均光度进行统计分析，统计结果请见图4。结果显示模型组的NF-κB活性在给予LPS刺激后出现明显的增高，与正常组相比有显著的差异。丹皮酚各干预组的NF-κB活性也在给予刺激后出现上升，但比模型组有明显减低（P<0.05）。
[0025] 图4中与正常组比较，###P<0.001；与模型组比较，*P<0.05， **P<0.01为了进一步研究丹皮酚对NF-κB信号通路的影响，采用免疫印迹法（western blot）检测NF-κB信号通路中p65、IKKβ及IκBα的表达水平和磷酸化程度。结果请见图5、图6、图7。
[0026] 图5、图6、图7中 Western Blot 检测小鼠肾组织中P65、IKKβ 和κBα 蛋白的磷酸化表达与正常组比较，##P<0.01；与模型组比较，*P<0.05。
[0027] 结果显示，模型组小鼠肾脏组织中后磷酸化的NF-κB p65、IKKβ 和 IκBα蛋白表达较正常组显著升高，磷酸化水平升高，说明NF-κB信号通路被激活，丹皮酚各剂量组较模型组有降低趋势，表明丹皮酚可抑制NF-κB信号通路的活性，减少炎症因子的释放，有效地保护内毒血症引起的肾损伤。
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