技术领域
[0001] 本
发明属于
生物医学领域，涉及一种体外重组的屏障缺陷表皮模型及构建方法。
背景技术
[0002] 随着体
外科学的发展，体外
皮肤替代模型的开发与利用取得突破性进展。目前国外已有Epiderm、Episkin两款表皮皮肤替代模型研发成功，并被多家实验室和
化妆品公司购买用于化妆品皮肤安全性评价测试。
[0003] 近年来，随着消费者对化妆品功效重视度的提高，皮肤模型不再用于单一的安全性评价，功效性验证成为未来的发展方向。与安全性评价相比，功效性验证对皮肤模型的要求更为严格，它更注重于模型与问题肌肤的真实拟合度。随着年龄的变化及环境因素的影响，人体肌肤的屏障功能逐渐下降，各种肌肤问题也会逐渐显现。导致皮肤屏障功能下降的因素有很多，最主要原因是表皮
细胞增殖分化平衡逐渐被打破，屏障相关膜套蛋白表达量发生改变，如LOR蛋白的含量随着年龄的升高，显著下降等。现有商品化的表皮模型都是模拟健康皮肤构建而成，模型的屏障功能较强，用于功效性评价，难以做到真实、客观。因此，开发新的屏障功能缺陷的体外皮肤模型更为重要。
[0004] 皮肤
角质层是人体发挥自身屏障，抵御外界环境的主战场。角质层独特的“砖灰”结构是屏障的基石。三大脂类物质(神经酰胺、胆固醇、
脂肪酸)与角质细胞膜套蛋白交联共同构建了砖灰结构。已有研究证明，角质层膜套蛋白的主要成分是兜甲蛋白(Loricrin)，其含量占膜套蛋白总含量的80％以上。并且，随着年龄的增加，人体皮肤屏障功能逐渐降低，角质层细胞形态发生变化，兜甲蛋白含量也逐步降低，间接说明兜甲蛋白对人体屏障功能的发挥，具有重要作用。基于此，如果通过分子生物学方法如(RNA干扰技术)缺陷兜甲蛋白基因(LOR)的表达，同时改变模型培养液中表皮生长因子与
钙离子的浓度，模拟老化皮肤增殖分化的类似环境，达到实现构建表皮屏障功能缺陷模型的目的。表皮生长因子(EGF)通过与细胞表面的受体结合，激活受体内在的酪
氨酸激酶的活性，启动
信号级联反应，促进DNA合成和细胞的增殖。表皮钙离子从基底层到颗粒层依次形成梯度，在颗粒层上层达到最高
水平(1.5mmol/L)。钙离子的浓度直接影响表皮细胞分化相关标记(marker)的表达，对被膜颗粒中脂质的有序运输及屏障相关的蛋白的有序稳定表达至关重要。
[0005] RNA干扰技术(RNA interference，缩写为RNAi)指一种分子生物学上由双链RNA诱发的基因沉默现象。传统的RNA干扰方法是向细胞内
转染短的双链RNA分子(double-standed RNA,dsRNA)，但在实际应用中，存在
稳定性差、可能改变其他基因正常表TM达等缺陷。Stealth RNAi是新一代的RNA干涉分子，具有更高的特异性和稳定性。其主要TM
流程是：1、引物设计与合成：设计3条Stealth siRNA和1条阴性对照(设立阴性对照的目的是用来检测RNAi的特异性。阴性对照，也称为“零乱”siRNA(scrambled siRNA)，是在打乱特异性siRNA序列
基础上设计的)，并由引物设计公司进行合成。2、将核酸导入细胞，实现转染；3、检测筛选对LOR基因有显著抑制的表皮细胞。在此基础上利用缺陷的表皮细胞进行模型构建，同时通过调节模型生发阶段关键因子的浓度，模拟问题肌肤微环境，构建屏障缺陷表皮皮肤模型，用于化妆品功效性检测。
[0006] 截止目前，曾有国外学者利用RNA干扰技术，缺陷表皮细胞保湿相关丝聚蛋白基因(FLG)的表达，构建有保湿缺陷的表皮模型。本发明所构建的缺陷模型与该模型相比，更接近于问题肌肤状态，对于开发屏障修复性化妆品及化妆品功效性验证更有意义。与本文类似的通过改变LOR基因的表达构建屏障缺陷的表皮模型,尚未见报道。
发明内容
[0007] 本发明的目的是应用RNA干扰技术，构建靶向兜甲蛋白基因(LOR)的TMStealth RNA，转染人表皮细胞，在转染验证成功的基础上，选择含有缺陷LOR基因的表皮细胞构建表皮模型，同时通过改变表皮培养液中生长因子(EGF)及钙离子的浓度，调节模型增殖分化平衡，从而构建体外重组的屏障缺陷表皮模型，适用于化妆品功效性验证试验。
[0008] 本发明是这样实现的：
[0009] 本发明所提出的体外重组的屏障缺陷表皮模型，其特点在于：兜甲蛋白基因水平的表达在转染成功的表皮细胞中，明显降低—表达量为正常细胞的40％；用该细胞构建的模型兜甲蛋白含量明显下降—表达量为正常细胞的35％。模型形态学结构方面，缺陷模型与正常模型相比，模型厚度变薄—为正常模型厚度的60％；活细胞层数变少—为3-4层。模型活
力测定OD值为0.8～1.0(正常模型OD值在1.0～2.5之间)。用缺陷模型与正常模型同时进行阳性物功效验证实验，结果显示缺陷模型对活性物的作用效果更为敏感，模型
给药前后形态学差异更为显著。
[0010] 本发明含有缺陷屏障的表皮皮肤模型的制备方法，包括兜甲蛋白基因缺陷表达的表皮细胞的制备、缺陷培养基的制备及屏障缺陷表皮模型的三维培养，具体步骤如下：
[0011] 一.兜甲蛋白基因缺陷表达的表皮细胞的制备
[0012] 步骤一、RNA干涉分子(StealthTM RNA)的设计与合成：
[0013] 本
发明人根据LOR基因序列(Gene Bank号NM_000427)，遵循EIbashir的siRNA序列设计原则，采用siRNA设计
软件设计3条siRNAs和一条scramble对照。设计3条siRNAs的目的是通过增加平行试验以期提高试验的成功率。本次实验设计的三段siRNA位点基本上分散于mRNA的全长上，目的是分散设计可以减少实验失败的
风险。本步骤设计的TMStealth RNA,由Invitrogen公司代为合成。3条siRNA和scrambled对照的具体序列如下表所示：
[0014] 表1.siRNA序列列表
[0015]TM
[0016] 步骤二、RNA干涉分子(Stealth RNA)的
细胞转染及转染后鉴定分析：
[0017] 本步骤中所选用的表皮细胞取自有细胞库中冻存的表皮第二代细胞，复苏后，传代至第4代或第5代备用。复苏后传一至两代的目的是提高表皮细胞的稳定性和均一性。TM
随后，按照转染
试剂盒Lipofectamine 2000 Reagent(Invitrogen公司生产)的操作方法，进行转染前试剂准备工作和转染操作，具体步骤如下：
[0018] (1)表皮细胞接种：按照1×104-1.5×104个细胞/cm2的接种
密度接种细胞，37℃，CO2
培养箱培养24-48小时，待细胞铺板率达到30～50％时进行转染。
[0019] 由于基因阻断的分析时间是转染后24-72小时，选择在细胞铺板率处于低密度时转染，可以延长转染和分析之间的间隙，从而避免由于培养时间过长造成的细胞过度生长、细胞老化等现象的出现。
[0020] (2)转染液的制备及细胞转染：在转染操作前，根据试剂盒
说明书制备转染液。转染液制备具体步骤及孔板每孔转染试剂具体用量如下：
[0021] ①稀释 2000 Regent：使用前遵照说明书，轻摇混匀2000 Regent，然后吸取6-15μ 2000 Regent在
150μL 低血清培养基中稀释待用( 2000 Regent的用量可
根据细胞及密度进行调节)。
[0022] ②稀释siRNA：根据siRNA的制备浓度，吸取总量为14μg的siRNA于700μL 低血清培养基稀释待用。
[0023] ③脂质体-s iRNA混合物的制备：各吸取步骤①和②配置的液体150μL,按照体积比1:1，混匀，室温静置5分钟。
[0024] ④细胞转染：按照每孔250μL的加样量将步骤③配置的脂质体-siRNA混合物添加至含有2ml表皮培养液的细胞孔中，进行转染。
[0025] ⑤观察分析转染细胞：将步骤④进行转染操作的细胞置于37℃，CO2培养箱孵育24-72h，然后显微观察并检测LOR基因的表达。
[0026] 二.缺陷培养基的制备
[0027] 步骤三、屏障缺陷的表皮皮肤模型的制备：
[0028] ①表皮细胞接种：将步骤二转染后经过PCR鉴定，LOR基因抑制率最高的siRNA12
转染组细胞作为接种对象，按照7E5-1E6/cm的接种密度接种于培养小室。
[0029] ②模型培养液的制备：根据人体表皮的生发特点，模型培养液根据模型生发特点分为两种，液下培养液和气液面培养液。液下培养液的主要成分及含量具体如下：基础培养液FAD 1L,氢化可的松0.4-0.6μg/mL,胰岛素1-1.5μg/mL,腺嘌呤2.2-2.4μg/mL，EGF 0.05-0.15ng/mL；气液面培养液的主要成分及含量如下：基础液FAD 1L，
氯化钙0.47-0.6mmol/L，氢化可的松0.2-0.4μg/mL，胰岛素1-1.5μg/mL,腺嘌呤2.2-2.4μg/mL，VC 20-30ng/mL。
[0030] ③模型培养：表皮模型培养液根据小室与培养液的
接触程度分为液下培养液和气液面培养液两种。模型生发期总计10d，在模型接种后1-2天采用液下培养液培养，培养液添加量为：小室内部200μL，孔板内添加量为1.5mL。模型生发3-10天，培养液更换为气液面培养液，培养液添加量为：小室内部不添加，孔板内添加量为1.5mL，48h换液一次。模型总计培养10d后出厂，经鉴定即为缺陷的表皮皮肤模型。
[0031] 本实验所构建的屏障缺陷表皮模型与现有模型相比，能够更为真实的模拟皮肤自然老化状态，皮肤屏障功能显著降低。具体表现在以下几方面：1.LOR蛋白的表达量在缺陷模型中显著下降。2.模型自身细胞活力低于正常模型，OD值维持在0.8---1.0之间。3.模型厚度变薄，活细胞层减少，渗透实验检测发现渗透率升高，屏障功能下降。基于缺陷模型验证活性物功效表明活性物作用一定时间后，缺陷模型的形态及渗透率及活性等有显著提高，但在正常模型活性物作用一段时间后未见模型有明显改变，说明缺陷模型用于活性物功效验证更有优势。其次，本实验所采用的缺陷技术与
现有技术相比，操作更简洁，结果更稳定，同时通过调整EGF及钙离子浓度，模拟老化皮肤中细胞生存环境，构建的模型，更适合于化妆品原料筛选及成品功效验证。
附图说明：
[0032] 图1.siRNA转染细胞中LOR基因表达量柱状图
[0033] 图2.Western Blot方法显示表皮模型兜甲蛋白表达量
[0034] 图3.构建模型LOR蛋白丰度免疫组化照片
[0035] 图2、图3中,1#是正常细胞构建模型，2#为转染试剂阴性对照处理细胞构建模型，3#siRNA1转染细胞构建模型，4#为阴性对照转染细胞构建模型。
[0036] 图4.活性物作用模型后暴露时间实验(ET50)结果
[0037] 图5活性物作用模型后模型渗透率变化图
[0038] 图6.活性物作用模型后形态学变化图
[0039] 图6中,1#为正常模型，2#为正常模型给药组；3#为本发明构建模型；4#为本发明构建模型给药组。
具体实施方式
[0040] 下面结合附图和实验
实施例，对本发明作进一步说明。
[0041] 实施例1 一种屏障缺陷表皮模型及其构建方法
[0042] 1.含有缺陷LOR基因的表皮细胞制备
[0043] 1.1表皮细胞的准备：选取自有表皮细胞库中冻存的P2代细胞，37℃复温，PBS清2
洗去掉残留的细胞冻存液。将细胞接种于75cm培养瓶中，37℃、CO2培养箱培养24h。待细
2
胞的铺板率达到50-60％时进行传代操作，将细胞按1.5×104/cm的接种密度接种于2个
6孔板中，每两孔为一组，依次标记为1-6#，用途依次是：1#，作为阳性对照(对细胞不做任何处理)，
[0044] 2#，为转染阴性对照(添加 2000稀释液进行空白转染)
[0045] 3#，为阴性对照(用发明内容中步骤一设计的Scrambled control对正常细胞进行转染)
[0046] 4#，为实验组1(用发明内容中步骤一设计的siRNA1对正常细胞进行转染)[0047] 5#，为实验组2(用发明内容中步骤一设计的siRNA2对正常细胞进行转染)[0048] 6#，为实验组3(用发明内容中步骤一设计的siRNA3对正常细胞进行转染)[0049] 待细胞铺板率达到45％时进行转染操作，具体实施步骤见1.2.
[0050] 1.2脂质体转染液的制备与细胞转染
[0051] 1.2.1脂质体转染液的制备
[0052] ①稀释 2000 Regent：根据组数配置5管稀释液，标号为a’、b’、c’、d’、e’。具体配置方式是：使用前轻摇混匀 2000，然后按每孔10μL的量吸取 2000 Regent溶解于300μL 低血清培养基中待用( 2000 Regent的用量可根据细胞及密度进行调节，本实验中细胞铺板率45％，经过前期优化认为吸取量10μL为本实验最佳条件)。
[0053] ②siRNA的稀释：根据siRNA的制备浓度，制备终浓度为0.02μg/μL的四种siRNA稀释液(Scramble control&siRNA1-3)备用。具体操作是分别吸取14μg siRNA工作液溶于700μL 低血清培养基混匀备用，标号a、b、c、d。
[0054] ③脂质体-siRNA混合物的制备：按照字母对应的原则，各吸取步骤①中a’的液体和步骤②中a的液体300μL,按照体积比1:1混匀，室温静置5分钟。其他组配置方法相同，将配好的液体标记为A、B、C、D。
[0055] 1.2.2细胞转染
[0056] 按照每孔250μL的加样量将步骤③配置的脂质体-siRNA混合物分别添加至事先分组的六孔板培养液中。具体添加方式是：1#组中添加2mL正常细胞培养液，2#组每孔在正常培养液的基础上,添加250μL的e‘液体；3-6#组分别在正常培养液的基础上,按照250μL/孔的量分别添加A、B、C、D四种脂质体-DNA
混合液。加样完毕后，将六孔板置于37℃，CO2培养箱孵育24-72h进行转染。待转染结束后，对细胞进行RNA提取，LOR基因表达量鉴定。鉴定结果表明转染有siRNA1的表皮细胞LOR基因的表达量降至正常细胞的40％，与另外两组siRNA转染细胞相比，基因表达量抑制率最高，具体结果见附图1。通过比较，决定选用转染有siRNA1的表皮细胞构建模型。
[0057] 2、屏障缺陷表皮模型的制备：
[0058] ①表皮细胞接种：将转染有siRNA1的表皮细胞按照7E5/cm2的接种密度接种于培养小室。
[0059] ②模型培养液的制备：根据人体表皮的生发特点，模型培养液根据模型生发特点分为两种，液下培养液和气液面培养液。液下培养液的主要成分及含量具体如下：基础培养液FAD 1L,氢化可的松0.5μg/mL,胰岛素1.25μg/mL,腺嘌呤2.3μg/mL，EGF 0.1ng/mL；气液面培养液的主要成分及含量如下：基础液FAD 1L，氯化钙0.5mmol/L，氢化可的松0.3μg/mL，胰岛素1.25μg/mL,腺嘌呤2.3μg/mL，VC 25ng/mL。
[0060] ③模型培养：表皮模型培养液根据小室与培养液的接触程度分为液下培养液和气液面培养液两种。模型生发期总计10d，在模型接种后2天采用液下培养液培养，培养液添加量为：小室内部200μL，孔板内添加量为1.5mL。模型生发3-10天，培养液更换为气液面培养液，培养液添加量为：小室内部不添加，孔板内添加量为1.5mL，48h换液一次。模型总计培养10d后出厂。模型出厂后，对模型同时进行lorcrin蛋白表达量，通过western blot及免疫组化方式共同验证，结果表明屏障缺陷模型lorcrin蛋白表达部位正确，位于颗粒层，表达量较正常模型有显著降低。具体结果见附图2、图3(图3中,1#正常细胞构建模型，2#为转染试剂阴性对照处理细胞构建模型，3#siRNA1转染细胞构建模型，4#为阴性对照转染细胞构建模型)。
[0061] 3、屏障缺陷表皮模型用于功效性验证：
[0062] 对培养9d的屏障缺陷表皮模型与正常模型，进行给药刺激，验证阳性物功效。具体操作方式如下：吸取20ppm的阳性物，加入模型培养液中，采用液下给药的方式，37℃孵箱孵育培养48h。出厂后，对模型进行ET50测试，测定模型在同一耐受时间的细胞活力；
荧光素钠渗透试验测定渗透率以及H&E
染色，判定模型形态学差异；最终通过三项指标结果的综合，判定屏障缺陷表皮模型是否比正常模型更具有判定样品功效性的优势。通过实验发现屏障缺陷的模型在给药后，相同耐受时间下，细胞活力较阴性对照(屏障缺陷模型)有显著提升，正常模型给药组与对照(正常模型)间模型活力无明显变化，说明药物药效在缺陷模型上效果更明显，结果见图4。Penetration结果显示缺陷模型给药组渗透率较阴性对照有显著下降，正常模型给药组与正常模型间渗透率无显著变化，说明缺陷模型给药后屏障有所提升，缺陷模型对药物作用更加敏感，具体结果见附图5。H&E形态学结果同样也证明了缺陷模型给药后屏障有恢复迹象，具体结果见附图6(1#为正常模型，2#为正常模型给药组；3#为本发明构建模型；4#为本发明构建模型给药组)。综合三种检测结果，认为缺陷模型用于化妆品功效性验证优势明显。
[0063] 本实施例构建之屏障缺陷表皮模型，在表皮细胞中，兜甲蛋白基因水平的表达量为正常细胞的40％；用该细胞构建的模型，兜甲蛋白含量下降为正常模型的35％；该缺陷模型与正常模型相比，模型厚度为正常模型的60％；活细胞层数为3层；模型活力测定OD值维持在0.8。
