一种磁性纳米药物载体的制备及其负载盐酸阿霉素的方法专利检索-现有技术国际检索国际检索单位第I章专利合作条约专利权专利检索查询-专利查询网

一种 磁性纳米药物载体的制备及其负载盐酸阿霉素的方法

阅读：217发布：2020-12-01

专利汇可以提供一种磁性纳米药物载体的制备及其负载盐酸阿霉素的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明涉及一种磁性纳米药物载体的制备及其负载盐酸阿霉素的方法,它属于磁性纳米材料药物运输技术领域。本发明主要解决现有技术存在的毒性高、治疗效果差的技术问题。本发明的技术方案是：一种磁性纳米药物载体的制备方法，包括以下步骤：1)环糊精--透明质酸超分子聚合物的制备；2)磁性氧化石墨烯的制备；3)环糊精-透明质酸聚合物功能化的磁性纳米药物载体的制备。与现有技术相比，本发明生物兼容性强、毒副作用低、具有癌细胞靶向定位作用和药物可控释放特性，在生物药物载体方面有着重要的应用价值。，下面是一种磁性纳米药物载体的制备及其负载盐酸阿霉素的方法专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种磁性纳米药物载体的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)环糊精--透明质酸超分子聚合物的制备：
首先将17-19gβ-环糊精和11-12g对甲苯磺酰氯依次缓慢加入100-150mL吡啶溶剂中并进行搅拌，室温下反应5-8h；通过旋转蒸发去除吡啶溶剂，再通过水中重结晶、冷丙酮洗涤纯化制得沉淀物单-6-脱氧-6-(对甲苯磺酰基)-β-环糊精；
然后将4-6g单-6-脱氧-6-(对甲苯磺酰基)-β-环糊精和10-12g乙二胺溶于20-30mL N-N-二甲基甲酰胺中，并在氮气环境中、80℃下磁力搅拌反应18-24小时，待反应完成后，将混合物冷却至室温，然后用冷丙酮洗涤3-5次去除残余物乙二胺并在真空下进行干燥，制得白色粉末；
最后通过22-24mg 1-乙基(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和13-15mg N-羟基琥珀酰亚胺溶液活化40-42mg透明质酸，并连续搅拌2小时制得分散液，将白色粉末加入到上述分散液中，使混合液在室温下反应18-24小时，在去离子水中透析纯化，冷冻干燥后制得环糊精--透明质酸超分子聚合物；
2)磁性氧化石墨烯的制备：
通过超声处理将180-220mg氧化石墨烯在去离子水中剥离1小时制得氧化石墨烯分散液，然后将其置于三颈烧瓶中加热至60-80℃；
将氮气通入氧化石墨烯溶液10-15分钟除去其中的空气，在氮气环境中，以800r/min的速度进行机械搅拌，将2.7g FeCl3·6H2O和1.0g FeCl2·4H2O溶解于氧化石墨烯溶液中，制得反应液；
然后滴加浓氨水直到反应液的pH调至9-12；将反应物在80℃下搅拌1-3小时，得到磁性黑色沉淀；冷却至室温后，磁滞分离，将黑色沉淀物用去离子水和无水乙醇反复洗涤后冷冻干燥20-30h，得到磁性氧化石墨烯粉末；
3)环糊精-透明质酸聚合物功能化的磁性纳米药物载体的制备：
首先将180-220mg步骤2)中所获得的磁性氧化石墨烯粉末超声分散在180-220mL的乙醇中30-40分钟以确保其完全溶解，在氮气保护下加入200-400μL 3-氨丙基三乙氧基硅烷，室温下机械搅拌6-8小时；反应完成后，通过磁滞分离弃去上清液，将沉淀物分别用乙醇和去离子水洗涤3次以上，冷冻干燥后得到氨基化的磁性氧化石墨烯纳米复合物；
将48-52mg步骤1)中所获得的环糊精--透明质酸超分子聚合物在去离子水中超声处理
1-3小时，待其完全溶解后，加入22-24mg 1-乙基(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和
13-15mg N-羟基琥珀酰亚胺，连续搅拌2-4小时，用以活化环糊精-透明质酸超分子聚合物的羧基；将氨基化的磁性氧化石墨烯纳米复合物加入到活化后的环糊精--透明质酸超分子聚合物溶液中，反应物在室温下搅拌24-48小时后，冷冻干燥以制得环糊精-透明质酸聚合物功能化的磁性纳米药物载体。
2.根据权利要求1所述的磁性纳米药物载体的制备方法，其特征在于：所述步骤1)中的β-环糊精与对甲苯磺酰氯的反应过程在无水状态下进行，且反应时间为5小时。
3.根据权利要求1所述的磁性纳米药物载体的制备方法，其特征在于：所述步骤1)中在氮气环境中、80℃下磁力搅拌反应时间为18小时；冷却至室温的混合物在冷丙酮中的洗涤次数为3次；混合液在室温下的反应时间为24小时。
4.根据权利要求1所述的磁性纳米药物载体的制备方法，其特征在于：所述步骤2)中氧化石墨烯分散液置于三颈烧瓶后加热至80℃；氮气通入氧化石墨烯溶液的时间为10分钟；
滴加浓氨水至反应液pH为10；反应物在80℃下的搅拌时间为2小时；黑色沉淀物用去离子水和无水乙醇反复洗涤后冷冻干燥24h。
5.根据权利要求1所述的磁性纳米药物载体的制备方法，其特征在于：所述步骤3)中磁性氧化石墨烯粉末超声分散在乙醇中30分钟；3-氨丙基三乙氧基硅烷的加入量为300μL；加入3-氨丙基三乙氧基硅烷后室温下机械搅拌时间为7小时。
6.根据权利要求1所述的磁性纳米药物载体的制备方法，其特征在于：所述步骤3)中加入1-乙基(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺后连续搅拌2小时；氨基化的磁性氧化石墨烯纳米复合物加入到活化后的环糊精--透明质酸超分子聚合物溶液中并在室温下的搅拌时间为48小时。
7.利用权利要求1所述的磁性纳米药物载体负载盐酸阿霉素的方法，其特征在于：包括以下步骤：
向4mL浓度范围为1-300mg/L的盐酸阿霉素溶液中加入0.5mg的环糊精-透明质酸聚合物功能化的磁性纳米药物载体，常温下振荡7小时后，磁滞分离即可。

说明书全文

一种磁性纳米药物载体的制备及其负载盐酸阿霉素的方法

技术领域

[0001] 本发明属于磁性纳米材料药物运输技术领域，具体涉及一种磁性纳米药物载体的制备及其负载盐酸阿霉素的方法。

背景技术

[0002] 传统抗肿瘤药物具有全身分布,细胞毒性大等缺点。蒽醌类药物作为广谱抗肿瘤药物，将药物分子嵌入DNA链中阻断其复制而达到抗肿瘤的目的。盐酸阿霉素(DOX)作为新一代蒽醌类药物,比其它蒽醌类药物毒性低、心脏抑制作用弱,但对肝脏功能会产生一定的影响。为了使DOX达到安全高效的治疗效果，研究具有靶向传输功能的药物载体以提高疗效和安全性显得尤为重要。

[0003] 石墨烯基纳米材料合成简单、比表面积大，可作为载体高效跨膜递送药物，并在肿瘤细胞中释放药物分子。由于缺乏特定肿瘤部位的靶向功能，治疗效果受限。此外，GO的亲水基团容易通过加热损失，影响纳米复合材料的进一步分散和负载量，而β-环糊精(β-CD)有环形结构，有亲水性外腔和亲油性内腔，可以与很多药物形成包合物，提高药物分子的生物利用度，溶解度和稳定性。然而，当药物/β-CD复合物在生理溶液中稀释时，发生解链复合并且药物控制和释放变得不可用。

发明内容

[0004] 本发明的目的在于克服现有技术的缺点，提供一种磁性纳米药物载体的制备及其负载盐酸阿霉素的方法，解决现有技术存在的毒性高、治疗效果差的技术问题。

[0005] 本发明是通过以下技术方案实现的：一种磁性纳米药物载体的制备方法，其中：包括以下步骤：

[0006] 1)环糊精--透明质酸超分子聚合物的制备：

[0007] 首先将17-19gβ-环糊精和11-12g对甲苯磺酰氯依次缓慢加入100-150mL吡啶溶剂中并进行搅拌，室温下反应5-8h；通过旋转蒸发去除吡啶溶剂，再通过水中重结晶、冷丙酮洗涤纯化制得沉淀物单-6-脱氧-6-(对甲苯磺酰基)-β-环糊精；

[0008] 然后将4-6g单-6-脱氧-6-(对甲苯磺酰基)-β-环糊精和10-12g乙二胺溶于20-30mL N-N-二甲基甲酰胺中，并在氮气环境中、80℃下磁力搅拌反应18-24小时，待反应完成后，将混合物冷却至室温，然后用冷丙酮洗涤3-5次去除残余物乙二胺并在真空下进行干燥，制得白色粉末；

[0009] 最后通过22-24mg 1-乙基(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和13-15mgN-羟基琥珀酰亚胺溶液活化40-42mg透明质酸，并连续搅拌2小时制得分散液，将白色粉末加入到上述分散液中，使混合液在室温下反应18-24小时，在去离子水中透析纯化，冷冻干燥后制得环糊精--透明质酸超分子聚合物；

[0010] 2)磁性氧化石墨烯的制备：

[0011] 通过超声处理将180-220mg氧化石墨烯在去离子水中剥离1小时制得氧化石墨烯分散液，然后将其置于三颈烧瓶中加热至60-80℃；

[0012] 将氮气通入氧化石墨烯溶液10-15分钟除去其中的空气，在氮气环境中，以800r/min的速度进行机械搅拌，将2.7g FeCl3·6H2O和1.0g FeCl2·4H2O溶解于氧化石墨烯溶液中，制得反应液；

[0013] 然后滴加浓氨水直到反应液的pH调至9-12；将反应物在80℃下搅拌1-3小时，得到磁性黑色沉淀；冷却至室温后，磁滞分离，将黑色沉淀物用去离子水和无水乙醇反复洗涤后冷冻干燥20-30h，得到磁性氧化石墨烯粉末；

[0014] 3)环糊精-透明质酸聚合物功能化的磁性纳米药物载体的制备：

[0015] 首先将180-220mg步骤2)中所获得的磁性氧化石墨烯粉末超声分散在180-220mL的乙醇中30-40分钟以确保其完全溶解(浓度为1mg/mL)，在氮气保护下加入200-400μL 3-氨丙基三乙氧基硅烷，室温下机械搅拌6-8小时；反应完成后，通过磁滞分离弃去上清液，将沉淀物分别用乙醇和去离子水洗涤3次以上，冷冻干燥后得到氨基化的磁性氧化石墨烯纳米复合物；

[0016] 将48-52mg步骤1)中所获得的环糊精--透明质酸超分子聚合物在去离子水中超声处理1-3小时，待其完全溶解后，加入22-24mg 1-乙基(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和13-15mg N-羟基琥珀酰亚胺，连续搅拌2-4小时，用以活化环糊精--透明质酸超分子聚合物的羧基；将氨基化的磁性氧化石墨烯纳米复合物加入到活化后的环糊精--透明质酸超分子聚合物溶液中，反应物在室温下搅拌24-48小时后，冷冻干燥以制得环糊精-透明质酸聚合物功能化的磁性纳米药物载体。

[0017] 进一步，所述步骤1)中的β-环糊精与对甲苯磺酰氯的反应过程在无水状态下进行；且反应时间为5小时。

[0018] 进一步，所述步骤1)中在氮气环境中、80℃下磁力搅拌反应时间为18小时；冷却至室温的混合物在冷丙酮中的洗涤次数为3次；混合液在室温下的反应时间为24小时。

[0019] 进一步，所述步骤2)中氧化石墨烯分散液置于三颈烧瓶后加热至80℃；氮气通入氧化石墨烯溶液的时间为10分钟；滴加浓氨水至反应液pH为10；反应物在80℃下的搅拌时间为2小时；黑色沉淀物用去离子水和无水乙醇反复洗涤后冷冻干燥24h。

[0020] 进一步，所述步骤3)中磁性氧化石墨烯粉末超声分散在乙醇中30分钟；3-氨丙基三乙氧基硅烷的加入量为300μL；加入3-氨丙基三乙氧基硅烷后室温下机械搅拌时间为7小时。

[0021] 进一步，所述步骤3)中加入1-乙基(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺后连续搅拌2小时；氨基化的磁性氧化石墨烯纳米复合物加入到活化后的环糊精--透明质酸超分子聚合物溶液中并在室温下的搅拌时间为48小时。

[0022] 一种利用磁性纳米药物载体负载盐酸阿霉素的方法，其中：包括以下步骤：

[0023] 向4mL浓度范围为1-300mg/L的盐酸阿霉素溶液中加入0.5mg的环糊精-透明质酸聚合物功能化的磁性纳米药物载体，常温下振荡7小时后，磁滞分离即可。

[0024] 本发明在氧化石墨烯(GO)大的比表面上引入磁性Fe3O4(强的超顺磁性、低毒性、优异的生物相容性和易制备)，通过引导磁场将药物载体快速聚集，运载到特定的肿瘤组织，提高了药物的杀伤效率，还原的氧化石墨烯(RGO)作为一种光热转换纳米材料，能吸收近红外光，产生自由电子发热，从而在局部导致高温，最终杀死肿瘤细胞；透明质酸(HA)是一种生物相容性好、可生物降解、非免疫性的线性多糖，并且已经证明，HA可以与肿瘤细胞表面过量表达的受体结合，有效增强其与肿瘤细胞的结合和内化能力，快速地进入肿瘤细胞，在多种生物医学应用中显示出巨大的潜力，以透明质酸为靶向载体，赋予药物包合物癌细胞靶向定位功能，能够实现药物的靶向性，减少毒副作用。将生物相容和亲水性的环糊精--透明质酸超分子聚合物(β-CD-HA)组装到磁性氧化石墨烯(MGO)纳米片上，合成环糊精-透明质酸聚合物功能化的磁性纳米复合材料(MGO-β-CD-HA)。将MGO-β-CD-HA作为靶向传输功能的药物载体，运输DOX到肿瘤细胞，产生安全高效的治疗效果。

[0025] 与现有技术相比，本发明生物兼容性强、毒副作用低、具有癌细胞靶向定位作用和药物可控释放特性，在生物药物载体方面有着重要的应用价值。附图说明

[0026] 图1为GO、MGO、MGO-APTES和MGO-β-CD-HA的红外光谱图；

[0027] 图2为MNPs、MGO和MGO-β-CD-HA的热重分析图；

[0028] 图3为MGO和MGO-β-CD-HA的X-射线衍射图；

[0029] 图4为MGO的磁滞回线图；

[0030] 图5为0.0025mg/mL DOX、DOX+MGO的上清液和DOX+MGO-β-CD-HA的荧光谱图；

[0031] 图6为pH值对MGO-β-CD-HA+DOX净荧光强度的影响示意图，其中F0：0.03mg/mL DOX的荧光强度，F：MGO-CD-HA吸附DOX后上清液的荧光强度；

[0032] 图7为MGO-β-CD-HA对DOX吸附等温线曲线；

[0033] 图8为MGO-β-CD-HA纳米复合材料在不同温度和不同pH值条件下的累积释放行为图；

[0034] 图9为不同浓度(0.4和0.8mg/mL)的MGO-β-CD-HA、MGO(0.4mg/mL)和缓冲溶液PBS，经过2W·cm-2的近红外光照射后，其温度升高与时间的函数图；

[0035] 图10为MGO-β-CD-HA(1.2mg/mL)在不同功率强度下的光热曲线；

[0036] 图11为DOX负载到MGO-β-CD-HA纳米材料表面后，定时激光开/关(照射/不照射)状态DOX的释放曲线；其中两者均在pH＝5.3,37℃下，激光照射波长为808nm，强度为2Wcm-2；

[0037] 图12为DOX包合体与人肝癌细胞BEL-7402孵育不同时间后，用荧光倒置显微镜观察到的细胞图；

[0038] 图13为药物包合物在不同浓度下的细胞毒性图。

具体实施方式

[0039] 下面结合实施例对本发明作进一步说明，但实施例并不限制本发明的范围。

[0040] 实施例1：

[0041] 本实施例中一种磁性纳米药物载体的制备方法，包括以下步骤：

[0042] 1)环糊精--透明质酸超分子聚合物(β-CD-HA)的制备：

[0043] 首先将18gβ-环糊精(β-CD)和11.06g对甲苯磺酰氯(TsCl)依次缓慢加入120mL吡啶溶剂中并进行搅拌，室温下反应6h；通过旋转蒸发去除吡啶溶剂，再通过水中重结晶、冷丙酮洗涤纯化制得沉淀物单-6-脱氧-6-(对甲苯磺酰基)-β-环糊精(M-6-O-Ts-β-CD)；

[0044] 然后将5g单-6-脱氧-6-(对甲苯磺酰基)-β-环糊精和10.55g乙二胺(EDA)溶于25mL N-N-二甲基甲酰胺(DMF)中，并在氮气环境中、80℃下磁力搅拌反应18小时，待反应完成后，将混合物冷却至室温，然后用冷丙酮洗涤3次去除残余物乙二胺并在真空下进行干燥，制得白色粉末(β-CD-EDA)；

[0045] 最后通过23.23mg1-乙基(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDCI)和13.8mgN-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶液活化40.85mg透明质酸(HA)，并连续搅拌2小时制得分散液，将白色粉末加入到上述分散液中，使混合液在室温下反应24小时，在去离子水中透析纯化，冷冻干燥后制得环糊精--透明质酸超分子聚合物(β-CD-HA)；

[0046] 2)磁性氧化石墨烯(MGO)的制备：

[0047] 通过超声处理将200mg氧化石墨烯(GO)在去离子水中剥离1小时制得氧化石墨烯分散液，然后将其置于三颈烧瓶中加热至80℃；

[0048] 将氮气通入氧化石墨烯溶液10分钟除去其中的空气，在氮气环境中，以800r/min的速度进行机械搅拌，将2.7gFeCl3·6H2O和1.0g FeCl2·4H2O溶解于上述氧化石墨烯溶液中，制得反应液；

[0049] 然后滴加浓氨水直到反应液的pH调至10；将反应物在80℃下搅拌2小时，得到磁性黑色沉淀；冷却至室温后，磁滞分离，将黑色沉淀物用去离子水和无水乙醇反复洗涤后冷冻干燥24h，得到磁性氧化石墨烯(MGO)粉末；

[0050] 3)环糊精-透明质酸聚合物功能化的磁性纳米药物载体(MGO-β-CD-HA)的制备：

[0051] 首先将200mg步骤2)中所获得的磁性氧化石墨烯粉末超声分散在200mL的乙醇中30分钟以确保其完全溶解(MGO浓度为1mg/mL)，在氮气保护下加入300μL 3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)，室温下机械搅拌7小时；反应完成后，通过磁滞分离弃去上清液，将沉淀物分别用乙醇和去离子水洗涤3次以上，冷冻干燥后得到氨基化的磁性氧化石墨烯(MGO)纳米复合物；

[0052] 将50mg步骤1)中所获得的环糊精--透明质酸超分子聚合物在去离子水中超声处理2小时，待其完全溶解后，加入23.23mg 1-乙基(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDCI)和13.8mg N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，连续搅拌2小时，用以活化环糊精--透明质酸超分子聚合物的羧基；将氨基化的磁性氧化石墨烯纳米复合物加入到活化后的环糊精--透明质酸超分子聚合物溶液中，反应物在室温下搅拌48小时后，冷冻干燥以制得环糊精-透明质酸聚合物功能化的磁性纳米药物载体(MGO-β-CD-HA)。

[0053] 一种磁性纳米药物载体负载盐酸阿霉素(DOX)的方法，包括以下步骤：

[0054] 向4mL浓度范围为1-300mg/L的盐酸阿霉素溶液中加入0.5mg的环糊精-透明质酸聚合物功能化的磁性纳米药物载体(MGO-β-CD-HA)，常温下振荡7h，磁滞分离后即可。

[0055] 实施例2：

[0056] 本实施例中一种磁性纳米药物载体的制备方法，包括以下步骤：

[0057] 1)环糊精--透明质酸超分子聚合物(β-CD-HA)的制备：

[0058] 首先将17gβ-环糊精(β-CD)和11g对甲苯磺酰氯(TsCl)依次缓慢加入100mL吡啶溶剂中并进行搅拌，室温下反应5h；通过旋转蒸发去除吡啶溶剂，再通过水中重结晶、冷丙酮洗涤纯化制得沉淀物单-6-脱氧-6-(对甲苯磺酰基)-β-环糊精(M-6-O-Ts-β-CD)；

[0059] 然后将4g单-6-脱氧-6-(对甲苯磺酰基)-β-环糊精和10g乙二胺(EDA)溶于20mL N-N-二甲基甲酰胺(DMF)中，并在氮气环境中、80℃下磁力搅拌反应18小时，待反应完成后，将混合物冷却至室温，然后用冷丙酮洗涤3次去除残余物乙二胺并在真空下进行干燥，制得白色粉末(β-CD-EDA)；

[0060] 最后通过22mg 1-乙基(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDCI)和13mg N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶液活化40mg透明质酸(HA)，并连续搅拌2小时制得分散液，将白色粉末(β-CD-EDA)加入到上述分散液中，使混合液在室温下反应18小时，在去离子水中透析纯化，冷冻干燥后制得环糊精--透明质酸超分子聚合物(β-CD-HA)；

[0061] 2)磁性氧化石墨烯(MGO)的制备：

[0062] 通过超声处理将180mg氧化石墨烯(GO)在去离子水中剥离1小时制得氧化石墨烯分散液，然后将其置于三颈烧瓶中加热至60℃；

[0063] 将氮气通入氧化石墨烯溶液10分钟除去其中的空气，在氮气环境中，以800r/min的速度进行机械搅拌，将2.7gFeCl3·6H2O和1.0g FeCl2·4H2O溶解于上述氧化石墨烯溶液中，制得反应液；

[0064] 然后滴加浓氨水直到反应液的pH调至9；将反应物在80℃下搅拌1小时，得到磁性黑色沉淀；冷却至室温后，磁滞分离，将黑色沉淀物用去离子水和无水乙醇反复洗涤后冷冻干燥20h，得到磁性氧化石墨烯(MGO)粉末；

[0065] 3)环糊精-透明质酸聚合物功能化的磁性纳米药物载体(MGO-β-CD-HA)的制备：

[0066] 首先将180mg步骤2)中所获得的磁性氧化石墨烯(MGO)粉末超声分散在180mL的乙醇中30分钟以确保其完全溶解(MGO浓度为1mg/mL)，在氮气保护下加入200μL 3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)，室温下机械搅拌6小时；反应完成后，通过磁滞分离弃去上清液，将沉淀物分别用乙醇和去离子水洗涤3次以上，冷冻干燥后得到氨基化的磁性氧化石墨烯(MGO)纳米复合物；

[0067] 将48mg步骤1)中所获得的环糊精--透明质酸超分子聚合物(β-CD-HA)在去离子水中超声处理1小时，待其完全溶解后，加入22mg 1-乙基(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDCI)和13mgN-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，连续搅拌2小时，用以活化环糊精--透明质酸超分子聚合物(β-CD-HA)的羧基；将氨基化的磁性氧化石墨烯(MGO)纳米复合物加入到活化后的环糊精--透明质酸超分子聚合物(β-CD-HA)溶液中，反应物在室温下搅拌24小时后，冷冻干燥以制得环糊精-透明质酸聚合物功能化的磁性纳米药物载体(MGO-β-CD-HA)。

[0068] 一种磁性纳米药物载体负载盐酸阿霉素(DOX)的方法，包括以下步骤：

[0069] 向4mL浓度范围为1-300mg/L的盐酸阿霉素溶液中加入0.5mg的环糊精-透明质酸聚合物功能化的磁性纳米药物载体(MGO-β-CD-HA)，常温下振荡7h，磁滞分离后即可。

[0070] 实施例3：

[0071] 本实施例中一种磁性纳米药物载体的制备方法，包括以下步骤：

[0072] 1)环糊精--透明质酸超分子聚合物(β-CD-HA)的制备：

[0073] 首先将19gβ-环糊精(β-CD)和12g对甲苯磺酰氯(TsCl)依次缓慢加入150mL吡啶溶剂中并进行搅拌，室温下反应8h；通过旋转蒸发去除吡啶溶剂，再通过水中重结晶、冷丙酮洗涤纯化制得沉淀物单-6-脱氧-6-(对甲苯磺酰基)-β-环糊精(M-6-O-Ts-β-CD)；

[0074] 然后将6g单-6-脱氧-6-(对甲苯磺酰基)-β-环糊精(M-6-O-Ts-β-CD)和12g乙二胺(EDA)溶于30mL N-N-二甲基甲酰胺(DMF)中，并在氮气环境中、80℃下磁力搅拌反应24小时，待反应完成后，将混合物冷却至室温，然后用冷丙酮洗涤5次去除残余物乙二胺(EDA)并在真空下进行干燥，制得白色粉末(β-CD-EDA)；

[0075] 最后通过24mg 1-乙基(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDCI)15mgN-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶液活化42mg透明质酸(HA)，并连续搅拌2小时制得分散液，将白色粉末(β-CD-EDA)加入到上述分散液中，使混合液在室温下反应24小时，在去离子水中透析纯化，冷冻干燥后制得环糊精--透明质酸超分子聚合物(β-CD-HA)；

[0076] 2)磁性氧化石墨烯(MGO)的制备：

[0077] 通过超声处理将220mg氧化石墨烯(GO)在去离子水中剥离1小时制得氧化石墨烯分散液，然后将其置于三颈烧瓶中加热至80℃；

[0078] 将氮气通入氧化石墨烯溶液15分钟除去其中的空气，在氮气环境中，以800r/min的速度进行机械搅拌，将2.7g FeCl3·6H2O和1.0g FeCl2·4H2O溶解于上述氧化石墨烯溶液中，制得反应液；

[0079] 然后滴加浓氨水直到反应液的pH调至12；将反应物在80℃下搅拌3小时，得到磁性黑色沉淀；冷却至室温后，磁滞分离，将黑色沉淀物用去离子水和无水乙醇反复洗涤后冷冻干燥30h，得到磁性氧化石墨烯(MGO)粉末；

[0080] 3)环糊精-透明质酸聚合物功能化的磁性纳米药物载体(MGO-β-CD-HA)的制备：

[0081] 首先将220mg步骤2)中所获得的磁性氧化石墨烯(MGO)粉末超声分散在220mL的乙醇中40分钟以确保其完全溶解(MGO浓度为1mg/mL)，在氮气保护下加入400μL3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)，室温下机械搅拌8小时；反应完成后，通过磁滞分离弃去上清液，将沉淀物分别用乙醇和去离子水洗涤3次以上，冷冻干燥后得到氨基化的磁性氧化石墨烯(MGO)纳米复合物；

[0082] 将52mg步骤1)中所获得的环糊精--透明质酸超分子聚合物(β-CD-HA)在去离子水中超声处理3小时，待其完全溶解后，加入24mg 1-乙基(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDCI)和15mg N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，连续搅拌4小时，用以活化环糊精--透明质酸超分子聚合物(β-CD-HA)的羧基；将氨基化的磁性氧化石墨烯(MGO)纳米复合物加入到活化后的环糊精--透明质酸超分子聚合物(β-CD-HA)溶液中，反应物在室温下搅拌48小时后，冷冻干燥以制得环糊精-透明质酸聚合物功能化的磁性纳米药物载体(MGO-β-CD-HA)。

[0083] 一种磁性纳米药物载体负载盐酸阿霉素(DOX)的方法，包括以下步骤：

[0084] 向4mL浓度范围为1-300mg/L的盐酸阿霉素溶液中加入0.5mg的环糊精-透明质酸聚合物功能化的磁性纳米药物载体(MGO-β-CD-HA)，常温下振荡7h，磁滞分离后即可。

[0085] 研究吸附性能后环糊精-透明质酸聚合物功能化的磁性纳米药物载体(MGO-β-CD-HA)用无水乙醇洗脱，超声振荡10min，再次磁滞分离，用二次水和无水乙醇分别洗涤三次，真空干燥后得到解离吸附的磁纳米复合体，可进行循环再利用。

[0086] 如图1所示，曲线a表示GO的红外光谱，图中3424cm-1处强的宽峰对应-OH的伸缩振动，1737cm-1附近的峰对应GO表面的羧基-C＝O-O，1250cm-1和1052cm-1附近峰分别对应环氧基和烷氧基的伸缩振动,而1650cm-1的峰则对应芳香族C＝C的伸缩振动；曲线b表示MGO的红外光谱，其中584cm-1附近的特征峰对应Fe-O键的拉伸振动，尽管与裸的Fe3O4相比峰值有所移动，但仍可以说明Fe3O4成功地结合到了GO表面上；曲线c表示MGO-APTEs的红外谱图，其中1565cm-1和1184cm-1附近的谱峰分别对应N-H的弯曲振动和C-N的伸缩振动；曲线d表示MGO-β-CD-HA的红外谱图，图中MGO 纳米粒子被β-CD进一步修饰后仍有β-CD的特征吸收峰(1200-
900cm-1)，而在1157cm-1处的谱峰对应耦合的C-O-C伸缩振动和O-H面内弯曲振动，在1040cm-1和1079cm-1处的特征峰对应耦合的C-O，C-C伸缩振动，以及O-H弯曲振动，表明β-CD-HA已经成功地复合到MGO的表面上。

[0087] 图2中曲线a为裸MNPs的热重曲线，曲线b为MGO的热重曲线，曲线c为MGO-β-CD-HA的热重曲线；如图所示，曲线a中，低于125℃时MNPs出现首次失重，这可归结为样品中吸附水的挥发和表面-OH的损失，接着在150-250℃时出现一个弱的增重过程，原因是MNPs在加热失重过程中被氧化，这样整个温度范围内的失重率约为3.5％；曲线b在低温(<100℃)下有首次失重，这可以归结为残留溶剂和水的损失，接着120-220℃范围内的失重表明去除了GO和Fe3O4上不稳定的含氧官能团；同样，曲线c中也显示出两次失重，约180-500℃范围内的失重可归结为β-CD-HA的分解，而高温区域(约600-800℃)的显著失重是由于GO的骨架破坏，这样全部温度范围内的总质量损失就约为36.5％，计算约为200mg·g-1，再次说明β-CD-HA成功地修饰到了MGO表面。

[0088] 图3a为MGO的X-射线衍射图，其中在2θ＝11.8处的衍射峰对应GO的(001)晶面，而2θ位于30.31、35.58、43.19、53.58、57.18、62.87相对应的衍射峰分别为Fe3O4面心立方的(220)、(311)、(400)、(422)、(511)和(440)衍射面，此图谱的结果与JCPDS(No.85-1436)标准卡片中赤铁矿的一致,表明MNPs修饰到了GO表面，且合成的MGO具有立方尖晶石结构；图3b为MGO-β-CD-HA的衍射图谱,对比发现MGO-β-CD-HA的强度弱于MGO的，这可能是因为β-CD-HA的吸收导致复合材料中MGO的相对含量降低。另外，通过Scherrer公式可估算得出MGO-β-CD-HA的粒径大小为14.9512nm。

[0089] D＝0.94λ/Bcosθ (1)

[0090] 综上，MGO和MGO-β-CD-HA的XRD图谱证明GO和β-CD-HA的修饰并没有引起Fe3O4结构的改变。

[0091] 图4为MGO的磁滞回线图，从图中可以看出,当外加磁场为0时,MGO的磁感应强度为0,又曲线经过原点，符合超顺磁的概念，这说明MGO是超顺磁性的，可用于靶向给药，根据磁力矩实验结果：MGO的磁化值为32.46emu/g。

[0092] 图5中，曲线a为0.0025mg/mL DOX的荧光谱图，曲线b为DOX+MGO上清液的谱图，曲线c为DOX+MGO-β-CD-HA的谱图。从图中可以看出，不同磁性纳米材料MGO和MGO-β-CD-HA都对药物DOX具有一定的负载作用，经计算MGO-β-CD-HA对DOX的净荧光强度降低了99％，而MGO对DOX却降低了80％，这说明MGO-β-CD-HA比MGO具有更好的载药效果，可归结为MGO-β-CD-HA较大的比表面和疏水空腔，使其具有优异的负载能力。

[0093] 图6为MGO-β-CD-HA与0.03mg/mL DOX相互作用后，pH值对MGO-β-CD-HA+DOX净荧光强度的影响示意图，图中可以看出，MGO-β-CD-HA对DOX的负载能力从pH 3.0到7.0逐渐上升，而当pH大于8.0时，负载能力大大降低。载药实验是一个动态平衡过程，在酸性或碱性环境中，较低或较高的pH可导致DOX的高度质子化，导致氢键的部分解离，并且负载能力表现不佳，而在pH7.0时，MGO-β-CD-HA的-OH、-COOH和药物中的-OH、-NH2之间的多个强氢键相互作用有利于MGO-β-CD-HA和药物的结合，导致负载量快速增加。

[0094] 如图7所示，为MGO-β-CD-HA对DOX的吸附等温线，从图中可以看出，去除单独DOX的影响后，MGO-β-CD-HA对DOX的负载能力随着初始DOX浓度的增加而增加(其中初始DOX浓度为0.5mg/mL)，而当吸附量达到450mg·g-1仍不饱和，通过Langmuir等温吸附曲线拟合，发现MGO-β-CD-HA对DOX的最大吸附量为485.43mg·g-1。

[0095] 图8为GO-β-CD-HA纳米复合材料在不同温度和不同pH值条件下的累积释放行为图；pH值为7.4时，在缓冲溶液PBS中，DOX以非常慢的速度从MGO-β-CD-HA纳米复合物中释放出来，经过10h后，只有低于总量的15％药物释放出来；然而，在酸性条件下(pH 5.3)，前5小时内，DOX从MGO-β-CD-HA的释放出来的速度急剧增加，5-10小时内逐渐下降，经估算前8小时内、pH值为5.3时，DOX的最大累积释放量约为50％，这是因为肿瘤细胞内存在酸性溶酶体；另外，图中还可以看出，温度越高药物释放越多，这说明MGO-β-CD-HA/DOX是温度敏感的载体。因此，水分散的MGO-β-CD-HA作为理想的输送载体，可以把DOX靶向输送到目标位点，然后通过内吞作用将药物运输到癌细胞。

[0096] 图9为不同浓度(0.4和0.8mg/mL)的MGO-β-CD-HA、MGO(0.4mg/mL)和缓冲溶液PBS，经过2W·cm-2的近红外光照射后，其温度升高与时间的函数图；其中曲线a是近红外激光照射缓冲溶液PBS时温度对时间的函数；曲线b是近红外激光照射MGO时温度对时间的函数；而c和d分别是近红外激光照射浓度为0.4mg/mL和0.8mg/mL的MGO-β-CD-HA时温度对时间的函数，可以看出，在相同的近红外激光照射下，MGO-β-CD-HA浓度为0.8mg/mL的温度比0.4mg/mL的温度高，且温度分别增加了19℃和17℃，从而得出0.8mg/mL的MGO-β-CD-HA光热转化效率更高。另外，在NIR区域，MGO-β-CD-HA的温度比MGO高，说明MGO-β-CD-HA的光吸收强、光热转化效率高。上述结果表明，对于近红外激光照射，MGO-β-CD-HA具有优异的光热转化能力。

[0097] 图10中曲线a、曲线b和曲线c分别表示MGO-β-CD-HA(1.2mg/mL)在激光强度分别为1.5、2.0和2.5W/cm-2下的光热曲线；从图中可以看出，在近红外激光照射下，随着激光强度的增加，MGO-β-CD-HA的光热转化效率逐渐提高。

[0098] 综上，图9和图10分别说明了MGO-β-CD-HA的浓度依赖性和激光功率强度依赖性。

[0099] 图11为DOX负载到MGO-β-CD-HA纳米材料表面后，定时激光开/关(照射/不照射)状态DOX的释放曲线；其中，曲线a为定时激光关(不照射)状态DOX的释放曲线，曲线b为定时激光开(照射)状态DOX的释放曲线，两者均在pH＝5.3,37℃下，激光照射波长为808nm，强度为2Wcm-2；由图可知，定时近红外激光照射的药物释放量明显高于不照射的，这说明近红外激光照射有利于药物释放。

[0100] 综上，MGO-β-CD-HA纳米复合材料可以实现pH和近红外激光双重刺激反应性药物释放，说明该复合材料是优异的药物运输载体。

[0101] 图12为DOX包合体与人肝癌细胞BEL-7402孵育不同时间后，用荧光倒置显微镜观察到的细胞图，其中a、b、c和d分别是DOX包合体与人肝癌细胞BEL-7402孵育0.5h、1h、2h和4h时，用荧光倒置显微镜观察到的其在细胞中的分布。由图可知：随着时间的增长，逐渐在肝癌细胞的细胞质中观察到荧光，并不断增大，证明包合体成功的进入细胞且不断释放药物。这表明MGO-β-CD-HA纳米复合材料是很好的药物载体。

[0102] 图13为药物包合物在不同浓度下的细胞毒性图，其中a柱(没有近红外光照射)和b柱(近红外光照射)是MGO-β-CD-HA在该复合体不同浓度下的相对细胞活性图，则c柱(不经近红外光照射)和d柱(经近红外光照射)为MGO-β-CD-HA+DOX在该包合物不同浓度下的相对细胞活性图。从图中可以看出，复合体没有细胞毒性，说明该载体有优越的生物相容性；当负载DOX的包合物进入BEL-7402肝癌细胞，随着DOX包合物浓度的增大，细胞活性在显著降低，此外用近红外光照射过的包合物对细胞的杀死率明显高于未照射的，这说明近红外光有利于药物释放并杀死细胞。以上结果表明MGO-β-CD-HA是一种无毒、生物相容性好、近红外可控、有效的DOX药物运载体。

[0103] 上面所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的构思和保护范围进行限定，在不脱离本发明设计构思的前提下，本领域中普通工程技术人员对本方面的技术方案作出各种的变型和改进，均应落入本发明的保护范围。

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